EP4688658A2 - Procede de synthese de nanoparticules de zeolithe dans un tampon phosphate salin-nanoparticules, suspensions et composition pharmaceutique associees - Google Patents

Procede de synthese de nanoparticules de zeolithe dans un tampon phosphate salin-nanoparticules, suspensions et composition pharmaceutique associees

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EP4688658A2
EP4688658A2 EP24711575.1A EP24711575A EP4688658A2 EP 4688658 A2 EP4688658 A2 EP 4688658A2 EP 24711575 A EP24711575 A EP 24711575A EP 4688658 A2 EP4688658 A2 EP 4688658A2
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EP
European Patent Office
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equal
nanoparticles
pbs
zeolite
composition
Prior art date
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Pending
Application number
EP24711575.1A
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German (de)
English (en)
Inventor
Samuel VALABLE
Svetlana MINTOVA
Charly HÉLAINE
Abdallah AMEDLOUS
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Caen Normandie
Ecole Nationale Superieure dIngenieurs de Caen
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Caen Normandie
Ecole Nationale Superieure dIngenieurs de Caen
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Publication date
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    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
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    • C01B39/02—Crystalline aluminosilicate zeolites; Isomorphous compounds thereof; Direct preparation thereof; Preparation thereof starting from a reaction mixture containing a crystalline zeolite of another type, or from preformed reactants; After-treatment thereof
    • C01B39/32—Type L
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/0004—Preparation of sols
    • B01J13/0008—Sols of inorganic materials in water
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
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    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2006/00—Physical properties of inorganic compounds
    • C01P2006/12—Surface area
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    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2006/00—Physical properties of inorganic compounds
    • C01P2006/14—Pore volume

Definitions

  • the present invention relates to a process for the synthesis of zeolite nanoparticles, suspensions of these nanoparticles, a pharmaceutical composition containing these nanoparticles and the nanoparticles obtained according to the process of the invention.
  • suspensions and nanoparticles can be used in particular in the medical field, in particular for the treatment of hypoxic solid tumors.
  • TO4 Ti, Al or other heteroatoms
  • AIG 5 ' ions gives the framework negative charges that must be compensated by so-called compensation cations (alkaline or alkaline-earth), such as Na + , K + , Ca 2+ , Sr 2+ in order to maintain electrical neutrality.
  • compensation cations alkaline or alkaline-earth
  • the vacant space is defined by the aluminosilicate framework formed by these three-dimensional chains.
  • the vacant spaces of the tetrahedral crystal lattice are connected to each other and occupied by alkali ions and water molecules.
  • Zeolites also have a microporous network formed by cavities, channels connecting the cavities and pores connecting the channels or cavities with the outside. Zeolites can be natural or synthetic. There are currently more than 250 types of zeolites.
  • WO 2019/030200 A1 describes FAU and EMT type zeolite nanocrystals for which sodium ions have been replaced by Fe or Gd ions and which can be loaded with gaseous dioxygen. These nanocrystals can be used for the diagnosis and treatment of brain tumors, including glioblastoma.
  • the zeolite nanocrystals of these two documents are synthesized in water, which limits their medical uses. Indeed, in the long term and at high concentrations, these nanocrystals are likely to cause allergy-type problems.
  • An aim of the present invention is therefore to propose a new pharmaceutical composition containing zeolite nanoparticles which can be used in the diagnosis and/or treatment of certain pathologies, in particular hypoxic solid tumors and in particular brain tumors.
  • Another aim of the invention is to propose a new method of synthesizing such nanoparticles.
  • Another aim of the invention is to provide colloidal suspensions of these nanoparticles.
  • Another aim of the invention is to provide zeolite nanoparticles which have reduced toxicity and/or exhibit an improved oxygen adsorption and/or release capacity.
  • a first aspect of the invention relates to a method for synthesizing nanoparticles consisting of or comprising at least one zeolite nanocrystal according to which:
  • composition/solution 1 is prepared containing a source of aluminum and a source of an ion of an alkali metal M, in particular K;
  • composition/composition/solution 2 comprising a source of silicon and a source of an ion of an alkali metal M, in particular K, said compositions/suspensions 1 and 2 being free of any organic structuring agent; - mix compositions/composition/solutions 1 and 2 and leave the mixture stirring,
  • the mixture is crystallized at a temperature greater than or equal to 50C;
  • said first composition/solution 1 and said second composition/solution 2 each consist of said source and an aqueous buffer (PBS) consisting of water and 137 mM/L of NaCl, 2.7 mM/L of KCl, 10 mM/L of Na2HPO4, 1.76 mM/L of KH2PO4 and having a pH equal to 7.2 and said mixture of compositions/solutions 1 and 2 has the following molar composition (I): x1 M 2 0 : yAI 2 O 3 : 10SiO 2 : z PBS (I) in which 2.8 ⁇ x1 ⁇ 8.8,
  • the method of the invention is simple to implement and makes it possible to obtain a stable colloidal suspension of LTL-type nanoparticles in PBS.
  • compositions are suspensions.
  • compositions/solutions 1 and 2 consist of PBS, the silicon or aluminum source and the alkali metal source.
  • the first composition/solution 1 can be prepared at room temperature.
  • the second composition/solution 2 is prepared, for example, at a temperature below 30°C and in particular equal to 25°C.
  • the mixing of the two compositions/solutions can be carried out at a temperature greater than or equal to 0°C ambient or less than 30°C and in particular 25°C.
  • the mixture must be left stirring at a temperature equal to or greater than 0°C and equal to or less than 30°C and in particular equal to 25°C for at least 4 hours and in particular 16 hours.
  • the mixture can be crystallized at a temperature greater than or equal to 90°C and less than or equal to 200°C and in particular equal to 170°C.
  • the aluminum source may be chosen from any aluminum source capable of providing monomeric oxyhydroxide species.
  • any aluminum source capable of providing monomeric oxyhydroxide species is understood to mean monomeric oxyhydroxides” that this aluminum source does not provide polymeric aluminum oxyhydroxide species and allows all the aluminum to be solubilized in the clear aqueous solution 1.
  • the aluminum source can be chosen from alumina, hydrated alumina, aluminum powder, Al, Al2(SO4)3, aluminum hydroxide AI(OH)s, sodium aluminate (NaAlC ), potassium aluminate (KAIO2) and kaolin clays.
  • the silicon source can be chosen from any silicon source capable of providing monomeric or oxyhydroxide species Si2-Sie. Thus, the amount of larger [SiOOH] n units is limited in the composition/solution 2.
  • the silicon source may be selected from silica hydrogel, silicic acid, colloidal silica, fumed silica, tetraalkyl orthosilicates, silica hydroxides, precipitated silica, silica fume and clays.
  • Colloidal silica is preferred in all embodiments of the method of the invention.
  • the alkali metal source M may be selected from a Na source and an alkali metal source K. Hydroxides of these two alkali metals are preferred as alkali metal sources.
  • M K
  • said aluminum source is aluminum hydroxide
  • said mixture of compositions/solutions 1 and 2 is crystallized at a temperature greater than or equal to 90°C and less than or equal to 200°C and in particular equal to 170°C for a duration equal to or greater than 4 hours and equal to or less than 16 hours.
  • the purification/separation of said nanoparticles is carried out using a membrane, in particular a dialysis membrane.
  • a membrane in particular a dialysis membrane.
  • the operation of this method is simple, inexpensive, generally carried out using commercially available membranes (dialysis membrane), and it also saves water. It also allows the PBS ions to be retained in the porous network of the nano zeolites.
  • a second aspect of the invention relates to a method for manufacturing a colloidal suspension of nanoparticles, according to which nanoparticles are synthesized according to the method of the invention and said synthesized nanoparticles are dispersed in optionally sterile water or in a PBS buffer.
  • sterile consisting of water and 137 mM/L of NaCI, 2.7 mM/L of KCI, 10 mM/L of Na2HPO4 and 1.76 mM/L of KH2PO4 and having a pH equal to 7.2. This gives a suspension of zeolite nanoparticles in water or in PBS.
  • the present invention relates to a nanoparticle consisting of or comprising at least one LTL type zeolite nanocrystal which comprises PBS ions, in particular Na + ' K + , HPO4 2 ; HsO + , H2PO4; CT ions and in particular Na + and K + ions.
  • Said nanoparticle may advantageously contain at least two species of the aforementioned ions. Depending on the pH, it may contain different quantities of the HPO4 2 ; HsO + , H2PO ions.
  • these ions are located in the porous network of the nanozeolite and/or in the interstices of its crystal network (as compensation ions) and/or on the surface of its crystal network, which may merge with the surface of the nanoparticle.
  • the Na + and K + cations are found in the interstices of the crystal network as compensation ions.
  • said nanoparticle further contains in its crystal lattice cations of a metal chosen from Fe, Gd, Cu and Ce and in particular in an amount greater than or equal to 0.2% by mass and less than or equal to 5% by mass and/or a gas contained in its pore volume and chosen from oxygen, nitrogen, carbon dioxide and mixtures thereof.
  • a metal chosen from Fe, Gd, Cu and Ce
  • a gas contained in its pore volume and chosen from oxygen, nitrogen, carbon dioxide and mixtures thereof.
  • said zeolite has the following chemical formula (II):
  • said zeolite has the following chemical formula (III):
  • said nanoparticles each have a total pore volume greater than or equal to 0.4 cm 3 /g and less than or equal to 1.5 cm 3 /g and/or a specific surface area SBET greater than or equal to 200 m 2 /g and less than or equal to 1000 m 2 /g.
  • said nanoparticles may each have a total pore volume greater than or equal to 0.5 cm 3 /g and less than or equal to 1.4 cm 3 /g and in particular equal to 0.73 or 0.85 and/or a specific surface area SBET greater than or equal to 300 m 2 /g and less than or equal to 900 m 2 /g and in particular equal to 538 m 2 /g or 490 m 2 /g.
  • the present invention relates to a colloidal suspension of nanoparticles consisting of or comprising at least one LTL type zeolite nanocrystal as defined above in a dispersant chosen in particular from alcohols, water and saline phosphate buffer and mixtures thereof.
  • a dispersant chosen in particular from alcohols, water and saline phosphate buffer and mixtures thereof.
  • PBS is chosen.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition which contains as a pharmaceutically active agent or as a contrast agent, a plurality of nanoparticles consisting of or comprising at least one LTL type zeolite nanocrystal or the suspension according to the invention.
  • the present invention relates to a combination product comprising or consisting of an anticancer agent and the pharmaceutical composition according to the invention for their simultaneous or delayed administration.
  • the anticancer agent is advantageously administered first.
  • the anticancer agent may be chosen from temozolomide® (4-methyl-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabicyclo
  • a nano zeolite according to the invention or a suspension according to the invention for its use as a medicament, in particular for the treatment of solid tumors, in particular of the brain, in particularly glioblastoma or for its use as a contrast agent, particularly in magnetic resonance imaging (MRI).
  • MRI magnetic resonance imaging
  • the inventors have demonstrated that the LTL-type nanoparticles according to the invention and which are therefore synthesized in PBS saline buffer are less cytotoxic and therefore likely to be better accepted by the body.
  • PBS has the same salt concentration as the human body; it also contains the dihydrogen phosphate/hydrogen phosphate pair which allows the maintenance of blood pH in the body. Without the inventors being linked to this explanation, it would seem that certain ions of the PBS contained in the porous network of the nanozeolites stabilize the nanoparticles and prevent them from degrading in the biological environment, which reduces their toxicity potential. In addition, the ions of the PBS can also regulate the charge on the surface of the nanoparticles, which can influence their behavior and their interaction with biological cells and tissues. The nanoparticles of the invention thus avoid or reduce the allergy phenomena described above.
  • the LTL zeolite nanocrystal may have the shape of a flake (flat parallelepiped).
  • This nanocrystal may have an average length greater than or equal to 5 nm and less than or equal to 20 nm and an average width greater than or equal to 2 and less than or equal to 15 nm.
  • the average length may be 30 nm and the average width 10 nm.
  • the nanoparticle is preferably made of a single crystal of LTL type zeolite.
  • the porous network of the zeolite can extend in only one direction.
  • composition of the invention may be formulated for oral, mucosal (intranasal) or parenteral administration.
  • average size designate for the purposes of the invention the average size (in number or in intensity) measured by dynamic light scattering.
  • the average size corresponds to the diameter of the sphere which scatters at the same speed as that of the particle being measured.
  • the fundamental size distribution obtained by DLS is an intensity distribution.
  • the operating conditions are as defined in the remainder of the application.
  • nanoparticle designates any solid particle with a maximum dimension of less than 10 Onm. It may be a single crystal or an aggregate of crystals.
  • composition means a homogeneous or inhomogeneous mixture of at least two compounds which may be in a different physical state. This term therefore includes in particular suspensions, solutions and dispersions. This term does not limit a particular physical state of matter.
  • PBS refers to phosphate buffered saline which is an aqueous solution of NaCl (0.137 M), KCl (0.0027 M), sodium phosphate dibasic (0.01 M) and potassium phosphate monobasic (0.0018 M). Its pH is 7.2.
  • LTL-type zeolite nanoparticle refers to nanoparticles comprising or consisting of a single crystal of LTL-type zeolite.
  • the LTL-type zeolite crystallizes in a hexagonal system.
  • solution means an aqueous solution having substantially the same refractive index as water, i.e., a refractive index of approximately 1.333 ⁇ 0.030, measured under standard conditions.
  • pore volume or “pore network” designate the set formed by the cavities, the channels connecting these cavities together and the pores which connect the channels and cavities to the outside of the nanoparticle.
  • pharmaceutically active means an agent which confers curative or preventive therapeutic properties to the composition which contains it and which, if it presents harmful side effects, these are not preponderant in relation to the curative and/or preventive effects.
  • pharmaceutically acceptable means any agent that can be ingested, injected or placed in contact with the skin and mucous membranes without generating an adverse effect or without generating an adverse effect of such magnitude that it disrupts the patient's state of health.
  • - Fig. 1 shows the size distribution of the K-LTL-PBS nanoparticles of the invention.
  • the nanoparticles are dispersed in a PBS solution;
  • Fig. 2A shows scanning electron microscope images of K-LTL-PBS and Gd-LTL-PBS type nanoparticles (nanocrystals) with a scale of 1 pm/500 nm and Fig. 2B shows transmission electron microscope images of K-LTL-PBS type nanoparticles (nanocrystals) with a scale of 100 nm and 40 nm;
  • - Fig. 3 represents the quantity of adsorbed nitrogen as a function of the relative pressure obtained under the operating conditions described below for K-LTL-PBS type nanoparticles;
  • Fig. 4 shows a comparison of the viability of U87-MG cells exposed to two colloidal suspensions of nanoparticles containing respectively 10 pg/mL and 100 pg/mL of K-LTL-Water or Gd-LTL-Water nanoparticles with that obtained for the same concentrations of K-LTL-PBS and Gd-LTL-PBS nanoparticles;
  • - Fig. 5 represents on the left the percentage of hemolysis as a function of the dose of nanoparticles (in pg/mL) of type K-LTL and Gd-LTL synthesized with water or PBS;
  • Fig. 6A represents the change in oxygen concentration in water obtained by contacting with K-LTL-Water and Gd-LTL-Water particles, previously loaded with O2
  • Fig. 6B represents the change in oxygen concentration in PBS obtained by contacting with K-LTL-PBS and Gd-LTL-PBS particles of the invention, previously loaded with O2.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the different zeolite materials obtained in the examples were characterized on different size scales.
  • the morphology of the nanoparticles was examined by scanning electron microscopy (SEM) using a Tescan Mira I LMH instrument at a voltage of 20 kV.
  • TEM Transmission electron microscopy
  • the hydrodynamic diameters of the zeolite material in the different suspensions were determined with a Malvern Zetasizer Nano instrument.
  • the surface charge of the samples was determined by measuring the zeta potential of the suspensions.
  • the backscattering geometry (scattering angle 173°, HeNe laser with an output power of 3 mW at a wavelength of 632.8 nm) allows measurements at a high sample concentration, since a complete penetration of the incident light through the sample is not necessary.
  • the chemical composition of the zeolite samples was characterized by inductively coupled plasma mass spectrometry using Agilent Technologies 7900 equipment.
  • the samples were prepared according to the following procedure: (i) 50 mg of zeolite sample was dissolved in 3 mL of hydrofluoric acid (HF) (Sigma-Aldrich 40-45%), (ii) 0.5 mL solution (HNO3/HCl equals 1:3 v/v) was added and then the mixture was heated at 110°C for 1 h in a polytetrafluoroethylene (PTFE) bottle (100 mL), and subsequently (iii) 96.5 mL of distilled water and 2 g of boric acid (H3BO3) were added. The resulting solution was stirred overnight to facilitate the dissolution of boric acid. Finally, 10 mL of the solution was diluted 10 times with distilled water before analysis.
  • HF hydrofluoric acid
  • Example 1 Synthesis of K-LTL type zeolite nanocrystals in a PBS solution (K-LTL-PBS)
  • a suspension C of alumina is prepared by dissolving 2 g of KOH in 8 g of PBS followed by a slow addition of 0.496 g of aluminum hydroxide.
  • a silicate suspension D is prepared by mixing 10 g of colloidal silica (LUDOX® SM-30) with 1.1 g of KOH and 2.88 g of PBS.
  • the two suspensions C and D are mixed and then left to stir at room temperature for 24 hours.
  • the initial molar composition of the mixture is as follows:
  • the mixture obtained is crystallized for 16 hours in an oven at 170°C.
  • the obtained nanoparticle suspension is purified by dialysis membrane (Visking Dialysis Tubing, Code No. - DTV.12000.08 Size No.8 (25.4mm, 30m), Molecular weight 12-14000 Daltons), until a pH of 7.2 is reached. 80 to 100 mL (2.0 to 2.5 g) of a colloidal suspension containing 2.5% by mass of K-LTL type zeolite nanocrystals are obtained. The mass yield of crystals ranges from 66 to 76%. The final suspensions were sonicated for 2 h.
  • Formula of the K-LTL-PBS zeolite nanoparticle obtained by ICP :
  • Example 2 Synthesis of colloidal suspensions of nanoparticles according to the invention A given quantity of nanoparticles of example 1 was dispersed in 10 mL of PBS under sonication for 2 hours. Colloidal suspensions containing respectively 1%, 2%, 3% and 4% by mass of nanoparticles of type K-LTL-PBS dispersed in PBS are obtained. These nanoparticles are stable in colloidal suspension at room temperature for at least one week.
  • Example 3 Synthesis of zeolite nanoparticles charged with metal ions
  • Example 4 Incorporation of dioxygen and/or CO2 into the porous network of nanoparticles
  • Example 2 Each of the colloidal aqueous suspensions obtained in Example 2 or Example 3 was then bubbled with C>2, CO2 or carbogen at a flow rate of 800 mL/min for 30 minutes.
  • Example 5 Morphological characterization of the nanoparticles obtained in examples 1, 3, and 4.
  • the chemical formula of the zeolite material of K-LTL and Gd-LTL type nanoparticles is as follows (determined by ICP):
  • the formula in parentheses corresponds to the crystal tetrahedral lattice, between the bars are the number of moles of compensation ions and the number of moles of water.
  • Example 7 Determination of porosity by adsorption/desorption of dinitrogen
  • the porosity of the K-LTL-PBS and Gd-LTL-PBS-PBS zeolites synthesized in the above examples was characterized by nitrogen gas adsorption/desorption measurements.
  • the textural properties of the nanoparticles obtained in the above examples were determined by the adsorption/desorption isotherms of dinitrogen measured at a temperature of -196 °C using a surface characterization device "Micromeritics 3Flex". All samples were degassed at 250 °C under vacuum overnight before analysis. The external surface area of the zeolite nanoparticles and the volume of the micropores of the zeolite nanoparticles were evaluated by the t-plot method.
  • Nitrogen adsorption/desorption measurements for both zeolites resulted in hybrid isotherms of type I and IV according to the IUPAC classification (see Fig. 3).
  • the measurement of the SBET specific surface area, the total pore volume and the micropore volume of the zeolite nanoparticles are grouped in Table 1 below.
  • a micropore is defined as a pore smaller than 0.08 mm.
  • Table 2 below lists the chemical composition of the K-LTL-PBS and Gd-LTL-PBS nanoparticles of the invention.
  • Example 8 Toxicity test on human cell line.
  • the cells used were derived from a human glioblastoma cell line, U87-MG purchased from American Type Culture Collection (ATCC).
  • the cells were cultured in DMEM 1 g/L glucose (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum (Eurobio), 2 mM glutamine (Sigma-Aldrich), and penicillin (100 U/mL)/streptomycin (100 pg/mL) (Sigma-Aldrich).
  • the cells were maintained in culture at 37°C with 5% CO2 and 95% humidity.
  • Fig. 4 Cell viability was assessed 72 h after exposure to zeolite nanoparticles with the WST-1 test (Roche) according to the manufacturer's instructions. The results are visible in Fig. 4. This figure also shows the percentage of cell viability with exposure to nanoparticles synthesized in water instead of PBS. It can be seen that for the K-LT-PBS and Gd-LTL-PBS nanoparticles of the invention, the percentage of viable cells is higher than for the nanoparticles synthesized from the same mixture but with water instead of PBS (Na-LTL-Water and Gd-LTL-Water).
  • Example 9 Red blood cell viability test.
  • red blood cells were exposed to increasing concentrations of nanoparticles according to the invention (from the aforementioned examples).
  • Example 10 Study of oxygen release by zeolitic nanoparticles in aqueous and hypoxic conditions
  • a hypoxia chamber (IN VIV02 500TM, 3M) was used to obtain a stable and precisely controlled gas composition of the atmosphere with an accuracy of 0.1% O2 by adapting the amount of N2.
  • the PBS solution (Sigma-Aldrich) was equilibrated with the gas mixture contained in the hypoxia chamber for 1 h before the experiment.
  • the nanoparticles of the above examples and preloaded with oxygen were then added to the system and the dissolved oxygen in the PBS solution was continuously measured for 1 h.
  • the results are shown in Fig. 6. It is observed that the K-LTL-Water and/or Gd-LTL-Water nanoparticles exhibit excellent release capacity (respectively 4.07 and 5.12 times higher than the baseline) due to their chemical composition.
  • the O2 loading in the nanoparticles was monitored.
  • the use of PBS rather than water during the synthesis of the particle can lead to differences in the physicochemical properties of the zeolite such as the surface area of the zeolite, the pore volume and the charge distribution, which can in turn affect the interactions between the zeolite and oxygen and influence the release of oxygen.
  • a longer release kinetics over time is interesting to reoxygenate the target tissue more durably throughout the therapeutic protocol.
  • the slower release rate allows the cells to adapt durably to the reoxygenation and thus maintain the molecular processes linked to reoxygenation. This also allows for more time between the injection and the radiotherapy session. A longer reoxygenation also reduces the number of injections to be performed.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de synthèse de nanoparticules constituées ou comprenant au moins un nanocristal de zéolithe selon lequel : - on prépare une première composition/solution 1 contenant une source d'aluminium et une source d'un ion d'un métal alcalin M, notamment K; - on prépare une deuxième composition/solution 2 comprenant une source de silicium et une source d'un ion d'un métal alcalin M, notamment K, lesdites compositions/solutions 1 et 2 étant exemptes de tout agent structurant organique; - on mélange les deux compositions/solutions 1 et 2; - on cristallise le mélange; et - on sépare éventuellement lesdites nanoparticules ainsi formées; Selon l'invention, ladite première composition/solution 1 et ladite deuxième composition/solution 2 sont toutes deux constituées de ladite source et du tampon aqueux de phosphate salin. La présente invention concerne également des suspensions colloïdales des nanoparticules obtenues et une composition pharmaceutique contenant lesdites nanoparticules.

Description

PROCEDE DE SYNTHESE DE NANOPARTICULES DE ZEOLITHE DANS UN TAMPON PHOSPHATE SALIN - NANOPARTICULES, SUSPENSIONS ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE ASSOCIEES
Domaine technique
La présente invention concerne un procédé de synthèse de nanoparticules de zéolithe, des suspensions de ces nanoparticules, une composition pharmaceutique contenant ces nanoparticules et les nanoparticules obtenues selon le procédé de l’invention.
Ces suspensions et nanoparticules sont notamment utilisables dans le domaine médical, en particulier pour le traitement des tumeurs solides hypoxiques.
Etat de la technique
Les zéolithes sont une classe de matériaux microporeux cristallins. Ils sont formés par un agencement tridimensionnel de TO4 (T= Si, Al ou d’autres hétéroatomes) liés les uns aux autres en partageant un atome d'oxygène. Dans les zéolithes aluminosilicatées, la présence des ions AIG 5' confère à la charpente des charges négatives qui doivent être compensées par des cations (alcalins ou alcalino-terreux) dits de compensation, comme Na+, K+, Ca2+, Sr2+ dans le but de maintenir une neutralité électrique. L'espace vacant est défini par la charpente aluminosilicate formée par ces chaînes tridimensionnelles. Les espaces vacants du réseau cristallin tétraédrique sont connectés entre eux et occupés par des ions alcalins et des molécules d’eau. La déshydratation des zéolithes permet de retirer les molécules d’eau présentes. Les zéolithes comportent également un réseau microporeux formé de cavités, de canaux reliant les cavités et de pores reliant les canaux ou cavité avec l’extérieur. Les zéolithes peuvent être naturelles ou synthétiques. Il existe à l’heure actuelle plus de 250 types de zéolithes.
Le document WO 2019/030200 A1 décrit des nanocristaux de zéolithes de type FAU et EMT pour lesquels des ions sodium ont été remplacés par des ions Fe ou Gd et qui peuvent être chargés de dioxygène gazeux. Ces nanocristaux peuvent être utilisés pour le diagnostic et le traitement des tumeurs du cerveau, y compris le glioblastome. Les nanocristaux de zéolite de ces deux documents sont synthétisés dans de l’eau ce qui restreint leurs usages médicaux. En effet, sur le long terme et à des concentrations élevées, ces nanocristaux sont susceptibles d’engendrer des problèmes de type allergie. La publication de Kharchenko et al intitulée « formation of copper nanoparticles in LTL nanosized zeolithe : kinetics study » et publiée dans la revue The journal of physical chemistry C, volume 120, n°46 le 5 novembre 2016 décrit une méthode de synthèse de nanoparticules de type LTL. La composition du mélange qui sert à la cristallisation est la suivante : 5K2O : 10SiÛ2 :0,5 AI2O3 : 200 H2O. Cette solution est une solution aqueuse et ne comporte pas de PBS.
La publication de F. Mayer et al intitulée « nanozeolite-LTL with GdIH deposited in the large and EU111 in the small cavities as a magnetic résonnance optical imaging probe » et publiée dans la revue Chemistry - A European Journal, John Wiley & sons, Inc, DE volume 20, n°12 le 12 février 2014 ne décrit pas de synthèse de nano zéolithes de type LTL. Ce document indique qu’il est possible de faire migrer des ions présents dans la nano zéolithe vers l’extérieur et de les remplacer.
Un but de la présente invention est donc de proposer une nouvelle composition pharmaceutique contenant des nanoparticules de zéolithe utilisables dans le diagnostic et/ou le traitement de certaines pathologies, notamment les tumeurs solides hypoxiques et notamment les tumeurs du cerveau.
Un autre but de l’invention est de proposer une nouvelle méthode de synthèse de telles nanoparticules.
Un autre but de l’invention est de proposer des suspensions colloïdales de ces nanoparticules.
Un autre but de l’invention est de proposer des nanoparticules de zéolithe qui ont une toxicité amoindrie et/ou présentent une capacité d’adsorption et/ou de relargage de l’oxygène améliorée.
Résumé de l’invention
Un premier aspect de l’invention concerne un procédé de synthèse de nanoparticules constituées ou comprenant au moins un nanocristal de zéolithe selon lequel :
- on prépare une première composition/solution 1 contenant une source d’aluminium et une source d’un ion d’un métal alcalin M, notamment K;
- on prépare une deuxième composition/ composition/ solution 2 comprenant une source de silicium et une source d’un ion d’un métal alcalin M, notamment K, lesdites compositions/suspensions 1 et 2 étant exemptes de tout agent structurant organique ; - on mélange les compositions/ composition/ solutions 1 et 2 et on laisse le mélange sous agitation,
- on cristallise le mélange à une température supérieure ou égale à 50C ; et
- on sépare éventuellement lesdites nanoparticules ainsi formées,
De manière caractéristique, selon l’invention ladite première composition/ solution 1 et ladite deuxième composition/solution 2 sont chacune constituées de ladite source et d’un tampon aqueux (PBS) constitué d’eau et de 137 mM/L de NaCI, 2,7 mM/L de KCI, 10 mM/L de Na2HPO4, 1 ,76 mM/L de KH2PO4 et ayant un pH égal 7,2 et ledit mélange des compositions/solutions 1 et 2 présente la composition molaire suivante (I): x1 M20 : yAI2O3 : 10SiO2 : z PBS (I) dans laquelle 2,8 <x1 < 8,8,
0,3 <y< 1 ,5 et 40 <z< 300.
Le procédé de l’invention est simple à mettre en œuvre et permet d’obtenir une suspension colloïdale stable de nanoparticules de type LTL dans du PBS.
De préférence, les compositions sont des suspensions.
Les compositions/solutions 1 et 2 précitées sont constituées du PBS, de la source de silicium ou d’aluminium et de la source de métal alcalin.
Selon le mode de mise en œuvre, il est parfois nécessaire de chauffer le mélange de tampon PBS et des autres réactifs pour obtenir une suspension claire.
S’agissant des températures, la première composition/solution 1 peut être préparée à température ambiante. La deuxième composition/solution 2 est préparée, par exemple, à une température inférieure à 30°C et notamment égale à 25°C. Le mélange des deux compositions/solutions peut être réalisé à une température supérieure ou égale à 0 °C ambiante ou inférieure à 30 °C et notamment à 25 °C. Ensuite, le mélange doit être laissé sous agitation à une température égale ou supérieure à 0°C et égale ou inférieure à 30°C et notamment égale à 25°C pendant au moins 4h et notamment 16h. Le mélange peut être cristallisé à une température supérieure ou égale à 90°C et inférieure ou égale à 200 °C et notamment égale à 170 °C.
Description détaillée
La source d'aluminium peut être choisie parmi toute source d'aluminium capable de fournir des espèces oxyhydroxydes monomères. Au sens de la présente invention, on entend par "toute source d'aluminium susceptible d'apporter des espèces oxyhydroxydes monomères" que cette source d'aluminium n'apporte pas d'espèces oxyhydroxydes d'aluminium polymères et permet de solubiliser tout l'aluminium dans la solution aqueuse limpide 1. En particulier, la source d'aluminium peut être choisie parmi l'alumine, l'alumine hydratée, la poudre d'aluminium, Al, Al2(SO4)3, l'hydroxyde d'aluminium AI(OH)s, l'aluminate de sodium (NaAlC ), l’aluminate de potassium (KAIO2) et les argiles de kaolin.
La source de silicium peut être choisie parmi toutes les sources de silicium susceptibles d'apporter des espèces monomères ou oxyhydroxydes Si2-Sie. Ainsi, la quantité d'unités [SiOOH]n plus grosses est limitée dans la composition/ solution 2.
En particulier, la source de silicium peut être choisie parmi l'hydrogel de silice, l'acide silicique, la silice colloïdale, la silice pyrogénée, les orthosilicates de tétraalkyle, les hydroxydes de silice, la silice précipitée, la fumée de silice et les argiles. La silice colloïdale est préférée dans tous les modes de mise en œuvre du procédé de l’invention.
La source de métal alcalin M peut être choisie parmi une source de Na et une source de métal alcalin K. Les hydroxydes de ces deux métaux alcalins sont préférés comme sources de métal alcalin.
Selon un mode de mise en œuvre particulier, M = K, ladite source d’aluminium est de l’hydroxyde d’aluminium, on cristallise ledit mélange des compositions/solutions 1 et 2 à une température supérieure ou égale à 90°C et inférieure ou égale à 200°C et en particulier égale à 170°C pendant une durée égale ou supérieure à 4h et égale ou inférieure à 16h.
Selon une variante particulière, 2.8 <x1 < 8, 0,3<y< 1.5 et 100<z<300 et selon une variante plus particulière x1 = 5, y = 0,5 et z = 200.
Avantageusement, la purification/séparation desdites nanoparticules est réalisée à l'aide d'une membrane, notamment d’une membrane de dialyse. Le fonctionnement de cette méthode est simple, peu coûteux, généralement effectué à l'aide de membranes commercialement disponibles (membrane de dialyse), et il permet également d’économiser de l’eau. Il permet également de conserver les ions du PBS dans le réseau poreux des nano zéolites.
Selon un second aspect de l’invention, elle concerne un procédé de fabrication d’une suspension colloïdale de nanoparticules, selon lequel on synthétise des nanoparticules selon le procédé de l’invention et l’on disperse lesdites nanoparticules synthétisées dans de l’eau éventuellement stérile ou dans un tampon PBS éventuellement stérile, constitué d’eau et de 137 mM/L de NaCI, 2,7 mM/L de KCI, 10 mM/L de Na2HPO4 et 1 ,76 mM/L de KH2PO4 et ayant un pH égal 7,2. On obtient ainsi une suspension de nanoparticules de zéolithes dans de l’eau ou dans du PBS.
Il est à noter que le procédé de synthèse de l’invention permet également directement l’obtention de suspensions de nanoparticules de type LTL dans du PBS.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une nanoparticule constituée ou comprenant au moins un nanocristal de zéolithe de type LTL qui comprend des ions du PBS, en particulier des ions Na+’ K+, HPO42; HsO+, H2PO4; CT et notamment des ions Na+ et K+. Ladite nanoparticule peut contenir avantageusement au moins deux espèces des ions précités. En fonction du pH elle peut contenir des quantités différentes des ions HPO42; HsO+, H2PO . Ces ions quels qu’ils soient, sont localisés dans le réseau poreux de la nano zéolithe et/ou dans les interstices de son réseau cristallin (en tant qu’ions de compensation) et/ou à la surface de son réseau cristallin, lequel peut se confondre avec la surface de la nanoparticule. De préférence les cations Na+ et K+ se trouvent dans les interstices du réseau cristallin en tant qu’ions de compensation.
Avantageusement, ladite nanoparticule contient en outre dans son réseau cristallin des cations d’un métal choisi parmi Fe, Gd, Cu et Ce et en particulier en une quantité supérieure ou égale à 0,2 % massique et inférieure ou égale à 5 % massique et/ou un gaz contenu dans son volume poreux et choisi parmi l’oxygène, le diazote, le dioxyde de carbone et leurs mélanges. Lorsqu’elle contient un ion tel que précité, elle peut servir de produit de contraste dans le diagnostic, notamment des tumeurs solides en particulier du cerveau. Lorsqu’elle contient un gaz tel que précité, elle peut avoir une action thérapeutique en libérant de l’oxygène ; cet effet thérapeutique est particulièrement marqué en présence d’un anticancéreux. Cet anticancéreux peut être choisi parmi les anticancéreux ultérieurement décrits en référence au produit de combinaison de l’invention.
Selon un mode de réalisation particulier combinable à chacun des modes de réalisation précités, ladite zéolithe présente la formule chimique suivante (II) :
|Ka Nab (H2O)C | (Alx SiyO72) (II) dans laquelle x est supérieur à 9 et/ou y est inférieur à 27 et/ou a est supérieur à 6. Avantageusement, a est supérieur à 6 et y est inférieur à 27. Avantageusement, a est inférieur ou égal à 10 et y est inférieur ou égal à 26. La formule entre les barres montre les ions de compensation (K+ et Na+) et les molécules d’eau présentes dans la nano zéolithe.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, combinable avec les modes de réalisation précités, ladite zéolithe présente la formule chimique (III) suivante :
IK9.04 Na2.57 (H2O)24.46 | (Al .12 Si25.5lO?2) (III)
Avantageusement, lesdites nanoparticules présentent chacune un volume poreux total supérieur ou égal à 0,4 cm3/g et inférieur ou égal à 1 ,5 cm3/g et/ou une surface spécifique SBET supérieure ou égale à 200 m2/g et inférieure ou égale à 1000 m2/g. En particulier, lesdites nanoparticules peuvent présenter chacune un volume poreux total supérieur ou égal à 0,5 cm3/g et inférieur ou égal à 1 ,4 cm3/g et notamment égal à 0,73 ou 0,85 et/ou une surface spécifique SBET supérieure ou égale à 300 m2/g et inférieure ou égale 900 m2/g et notamment égale à 538 m2/g ou 490 m2/g.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une suspension colloïdale de nanoparticules constituées ou comprenant au moins un nanocristal de zéolithe de type LTL telles que définies ci-dessus dans un dispersant choisi notamment parmi les alcools, l’eau et le tampon phosphate salin et leurs mélanges. De préférence, le PBS est choisi.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique qui contient en tant qu’agent pharmaceuticalement actif ou en tant qu’agent de contraste, une pluralité de nanoparticules constituées ou comprenant au moins un nanocristal de zéolithe de type LTL ou la suspension selon l’invention.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un produit de combinaison comprenant ou constitué d’un anticancéreux et de la composition pharmaceutique selon l’invention pour leur administration simultanée ou différée. L’anticancéreux est avantageusement administré en premier. L’anticancéreux peut être choisi parmi le temozolomide® (4-méthyl-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabicyclo
[4.3.0]nona-2,7,9-triène-9-carboxamide methazolastone), la doxorubicine (8S, 10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-méthyl-tétrahydro-2H-pyran-2-yloxy)-6,8, 11 - trihydroxy-8-(2-hydroxyacétyl)-1-méthoxy-7,8,9,10-tétrahydrotétracène-5,12-dione), cisplatine (cis-diamminedichloroplatine(ll)).
Selon un autre aspect de l’invention, elle concerne une nano zéolithe selon l’invention ou une suspension selon l’invention pour son utilisation en tant que médicament, notamment pour le traitement des tumeurs solides en particulier du cerveau, en particulier le glioblastome ou pour son utilisation en tant qu’agent de contraste, notamment en imagerie par résonance magnétique (IRM).
Les inventeurs ont mis en évidence que les nanoparticules de type LTL selon l’invention et qui sont donc synthétisées dans du tampon salin PBS sont moins cytotoxiques et par conséquent susceptibles d’être mieux acceptées par l’organisme. Le PBS présente la même concentration en sels que le corps humain ; il comporte également le couple dihydrogénophosphate/hydrogénophosphate lequel permet le maintien du pH sanguin dans le corps. Sans que les inventeurs soient liés à cette explication, il semblerait que certains ions du PBS contenu dans le réseau poreux des nano zéolithes stabilisent les nanoparticules et les empêchent de se dégrader dans l’environnement biologique, ce qui réduit leur potentiel de toxicité. De plus, les ions du PBS peuvent également réguler la charge sur la surface des nanoparticules, ce qui peut influencer leur comportement et leur interaction avec les cellules et les tissus biologiques. Les nanoparticules de l’invention évitent ou diminuent ainsi les phénomènes d’allergie décrits précédemment.
Quel que soit le mode de réalisation et l’aspect de l’invention, le nanocristal de zéolithe LTL peut avoir la forme d’une paillette (parallélépipède plat). Ce nanocristal peut avoir une longueur moyenne supérieure ou égale à 5nm et inférieure ou égale à 20nm et une largeur moyenne supérieure ou égale à 2 et inférieure ou égale à 15nm. En particulier, la longueur moyenne peut être de 30nm et la largeur moyenne de 10nm. Dans toute la demande, la nanoparticule est de préférence constituée d’un monocristal de zéolithe de type LTL.
Le réseau poreux de la zéolithe peut s’étendre selon une seule direction.
La composition pharmaceutique de l’invention peut être formulée pour être administrée par voie orale, mucosale (intranasale) ou parentérale.
Définitions
Les termes « taille moyenne » désignent au sens de l’invention la taille moyenne (en nombre ou en intensité) mesurée par diffusion dynamique de la lumière. La taille moyenne correspond au diamètre de la sphère qui diffuse à la même vitesse que celle de la particule que l’on mesure. La distribution fondamentale de taille obtenue par DLS est une distribution en intensité. Les conditions opératoires sont telles que définies dans la suite de la demande. Au sens de l’invention, le terme « nanoparticule » désigne toute particule solide de dimension maximale inférieure à 10Onm. Il peut s’agir d’un monocristal ou d’un agrégat de cristaux.
Le terme « composition » désigne un mélange homogène ou inhomogène d’au moins deux composés pouvant être dans un état physique différent. Ce terme englobe donc notamment les suspensions, les solutions et les dispersions. Ce terme ne limite pas un état physique particulier de la matière.
Le terme PBS désigne le tampon phosphate salin lequel est une solution aqueuse de NaCI (0,137 M), KCI (0,0027 M), phosphate de sodium dibasique (0,01 M) et phosphate de potassium monobasique (0,0018 M). Son pH est de 7,2.
Le terme « nanoparticule de zéolithe de type LTL » désigne des nanoparticules comprenant ou constituées d’ un monocristal de zéolithe de type LTL. La zéolithe de type LTL cristallise dans un système hexagonal. La formule chimique d’un nanocristal de zéolithe de type LTL est la suivante : IKaNab(H2O)cl [AlxSiyO72] avec x+y< 36, les ions Na+ et K+ étant présents en tant qu’ions de compensation, de manière à assurer la neutralité électrique du nanocristal. Les molécules d’eau peuvent être absentes du nanocristal (c=0).
Le terme « solution » désigne une solution aqueuse ayant sensiblement le même indice de réfraction que l'eau, c'est-à-dire un indice de réfraction d'environ 1 ,333 ± 0,030, mesuré dans les conditions standard.
Les termes « volume poreux » ou « réseau poreux » désignent l’ensemble formé des cavités, des canaux reliant ces cavités entre elles et des pores qui relient les canaux et cavités à l’extérieur de la nanoparticule.
Les termes « pharmaceuticalement actif » désigne un agent qui confère des propriétés thérapeutiques curatives ou préventives à la composition qui le contient et qui s’il présente des effets secondaires néfastes ceux-ci ne sont pas prépondérants par rapport aux effets curatifs et/ou préventifs.
Les termes « pharmaceuticalement acceptable » désignent tout agent susceptible d’être ingéré, injecté ou mis en contact avec la peau et les muqueuses sans qu’il ne génère d’effet indésirable ou sans qu’il ne génère d’effet indésirable d’une ampleur telle qu’il perturbe l’état de santé du patient. Brève description des figures
Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description suivante s’appuyant sur les figures annexées, parmi lesquelles :
-la Fig. 1 représente la distribution de taille des nanoparticules K-LTL-PBS de l’invention ; Les nanoparticules sont dispersées dans une solution de PBS;
-la Fig. 2A représente des images obtenues au microscope électronique à balayage des nanoparticules (nanocristaux) de type K-LTL-PBS et Gd-LTL-PBS avec une échelle de 1 pm/500 nm et la Fig. 2B représente des images obtenues au microscope électronique en transmission des nanoparticules (nanocristaux) de type K-LTL-PBS avec une échelle de 100 nm et 40 nm ;
-la Fig. 3 représente la quantité de diazote adsorbée en fonction de la pression relative obtenue dans les conditions opératoires décrites ci-après pour les nanoparticules de type K-LTL-PBS;
-la Fig. 4 représente une comparaison de la viabilité des cellules U87-MG exposées à deux suspensions colloïdales de nanoparticules contenant respectivement 10 pg/mL et 100 pg/mL de nanoparticules K-LTL-Eau ou Gd-LTL-Eau avec celle obtenue pour les mêmes concentrations de nanoparticules K-LTL-PBS et Gd-LTL-PBS ;
-la Fig. 5 représente à gauche le pourcentage d’hémolyse en fonction de la dose de nanoparticules (en pg/mL) de type K-LTL et Gd-LTL synthétisées avec de l’eau ou du PBS ;
-la Fig. 6A représente le changement de la concentration en oxygène dans l’eau obtenu par mise en contact avec des particules K-LTL-Eau et Gd-LTL-Eau, préalablement chargées en O2 , et la Fig. 6B représente le changement de la concentration en oxygène dans le PBS obtenu par mise en contact avec des particules K-LTL-PBS et Gd-LTL-PBS de l’invention, préalablement chargées en O2.
EXEMPLES
SYNTHESE ET CARACTERISATION DES NANOPARTICULES
Les matières premières utilisées dans les exemples qui suivent, sont listées ci- dessous :
- Hydroxyde de sodium (Sigma Aldrich, 98%)
- Hydroxyde de potassium (Sigma Aldrich, 90%)
- Hydroxyde d’aluminium (type A2100, Alfa Aesar, 76,5 % en masse AI(OH)s, 23,5 % en masse H2O) - Poudre d’aluminium (325 mesh, Alfa Aesar 99,5%)
- Silice colloïdale (SiÛ2 (Ludox HS-30, 30 wt.% SiC>2, pH=9,5-10,2 Sigma Aldrich)
- Silice colloïdale (SiÛ2 (Ludox SM-30, 30 wt.% SiC>2, pH=9,7-10,3 Sigma Aldrich)
- Nitrate de gadolinium Gd(NOs)3, 6H2O (Aldrich, 99,9%)
- Tampon de phosphate saline (PBS) (Sigma Aldrich, pH=7, 15-7,25)
Ces réactifs de départ ont été utilisés tels que reçus des fabricants, sans purification supplémentaire.
Méthodes d’analyse utilisées et conditions opératoires
Les différents matériaux zéolithiques obtenus dans les exemples ont été caractérisés sur différentes échelles de tailles.
Imagerie par microscopie électronique à balayage et en transmission (MEB/MET) :
La morphologie des nanoparticules a été examinée par microscopie électronique à balayage (MEB) utilisant un appareil Tescan Mira I LMH à une tension de 20 kV.
Microscopie électronique à transmission (MET) : les suspensions colloïdales sont soniquées pendant 15 minutes, puis 2 à 3 gouttes de suspensions de particules fines sont séchées sur des grilles de microscope électronique en cuivre de 300 mesh recouvertes d'un film de carbone. Les images ont été obtenus à l'aide d'un microscope FEI Tecnai G2 30 (Vacc = 300 kV, LaB6).
Analyse par diffusion dynamique de la lumière (DLS) :
Les diamètres hydrodynamiques du matériau zéolithique dans les différentes suspensions ont été déterminés avec un appareil Malvern Zetasizer Nano. La charge de surface des échantillons a été déterminée par mesure du potentiel zêta des suspensions. Les analyses ont été effectuées sur des échantillons après purification avec une concentration en solide de 1 % en poids dispersés dans une solution de PBS à pH = 7,2. La géométrie de rétrodiffusion (angle de diffusion 173°, laser HeNe avec une puissance de sortie de 3 mW à une longueur d'onde de 632,8 nm) permet des mesures à une concentration d'échantillon élevée, car une pénétration complète de la lumière incidente à travers l'échantillon n'est pas nécessaire.
Analyse chimique par ICP-MS (spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif)
La composition chimique des échantillons de zéolithe a été caractérisée par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif en utilisant l’équipement Agilent Technologies 7900. Les échantillons ont été préparés selon la procédure suivante: (i) 50 mg d'échantillon de zéolithe ont été dissous dans 3 mL d'acide fluorhydrique (HF) (Sigma-Aldrich 40-45%), (ii) une solution de 0,5 mL (HNO3 / HCl équivaut à 1 :3 v/v) a été ajoutée puis le mélange a été chauffé à 110°C pendant 1 h dans une bouteille en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (100 mL), et par la suite (iii) 96,5 mL d'eau distillée et 2 g d'acide borique (H3BO3) ont été ajoutés. La solution obtenue a été agitée pendant une nuit pour faciliter la dissolution de l'acide borique. Enfin, 10 mL de la solution ont été dilués 10 fois avec de l'eau distillée avant analyse.
Exemple 1 : Synthèse de nanocristaux de zéolithe de type K-LTL dans une solution du PBS (K-LTL-PBS)
Une suspension C d’alumine est préparée par dissolution de 2 g de KOH dans 8 g de PBS suivi par un ajout lent de 0,496 g d’hydroxyde d’aluminium.
Une suspension D de silicate est préparée par mélange de 10 g de silice colloïdale (LUDOX® SM-30) avec 1 ,1 g de KOH et 2,88 g de PBS.
Les deux suspensions C et D sont mélangées puis laissées sous agitation à température ambiante pendant 24h.
La composition molaire initiale du mélange est la suivante :
5K2O : 0,5AI2O3 : 10SiO2 : 200 (PBS)
Le mélange obtenu est cristallisé pendant 16h dans une étuve à 170°C.
La suspension de nanoparticules obtenue est purifiée par membrane de dialyse (Visking Dialysis Tubing, Code No. - DTV.12000.08 Size No.8 (25,4mm, 30m), Poids moléculaire 12-14000 Daltons), jusqu'à ce qu'un pH de 7,2 soit atteint. On obtient 80 à 100 mL (de 2,0 à 2,5 g) d’une suspension colloïdale contenant 2,5% en masse de nanocristaux de zéolithes de type K-LTL. Le rendement massique en cristaux va de 66 à 76%. Les suspensions finales ont été soumis à une sonication pendant 2h. Formule de la nanoparticule de zéolithe K-LTL-PBS obtenue par ICP:
|Na2.57K9.04(H2O)24.46 | (Si25.5lAI-10.12O72)
La formule entre parenthèses correspond au réseau cristallin, entre les barres figurent le nombre de moles d’ions de compensation et le nombre de moles d’eau.
Exemple 2 : Synthèse de suspensions colloïdales de nanoparticules selon l’invention Une quantité donnée de nanoparticules de l’exemple 1 a été dispersée dans 10 mL de PBS sous sonication pendant 2h. On obtient des suspensions colloïdales contenant respectivement 1 %, 2%, 3% et 4% en masse de nanoparticules de type K-LTL-PBS dispersées dans du PBS. Ces nanoparticules sont stables en suspension colloïdale à température ambiante pendant au moins une semaine.
Exemple 3 : Synthèse des nanoparticules de zéolithes chargées par des ions métalliques
5 mL de chacune des deux suspensions colloïdales obtenues à l’exemple 2, contenant chacune 2,5% en masse de nanoparticules ont été ajoutées séparément à 25 mL d’une solution de nitrate de gadolinium (III) hexahydraté (Gd(NO3)3.6H2O) avec une concentration de 0,03 mM). La suspension est ensuite maintenue sous agitation à température ambiante pendant 1 h. Ce processus d'échange d'ions a été effectué deux fois. La suspension finale a ensuite été lavée 3 fois avec du PBS pour obtenir finalement respectivement une suspension de zéolithe Gd-LTL-PBS dans du PBS et donc à pH=7,2.
Exemple 4 : Incorporation de dioxyqène et/ou de CO2 dans le réseau poreux des nanoparticules
Chacune des suspensions aqueuses colloïdales obtenues dans l’exemple 2 ou dans l’exemple 3 a ensuite été mise à barboter avec de l'C>2 ,du CO2 ou du carbogène à un débit de 800 mL/min pendant 30 minutes.
On obtient ainsi des nanoparticules dont le réseau poreux est au moins partiellement rempli d’Û2 et/ou de CO2.
Exemple 5 : Caractérisation morphologique des nanoparticules obtenues aux exemples 1 , 3, et 4.
La microscopie électronique à balayage/en transmission (MEB)/(MET) ont été utilisées pour déterminer la morphologie et la taille des nanoparticules synthétisées K-LTL-PBS et Gd-LTL-PBS.
La courbe donnant la distribution de taille des nanoparticules K-LTL-PBS dispersées dans le PBS est représentée sur la Fig. 1 . ;
Les images de microscopie électronique à balayage des nanoparticules de zéolithes K-LTL et Gd-LTL (voir Fig. 2A) montrent de petits amas de nanoparticules agglomérées ; cependant, les images obtenues par la microscopie en transmission (voir Fig. 2B) montrent que ces nanoparticules sont de petits nanocristaux individuels de forme rectangulaire avec une largeur de 10 nm et une longueur de 30 nm.
De plus, les images de microscopie électronique à transmission haute résolution montrent que les nanoparticules sont hautement crystallines. Il s’agit de nanoparticules formées chacune d’un unique nanocristal. Exemple 6 : Analyse chimique des nanoparticules K-LTL méthode et résultats
La formule chimique du matériau zéolitique des nanoparticules de type K-LTL et Gd- LTL est la suivante (déterminée par ICP) :
| Na2.57K9.04(H2O)24.46 | (Si25.5lAll0.12O72)
|Nai.1oK9.0lGdo.4(H20)24.32 | (Si25.42All O.34O72)
La formule entre parenthèses correspond au réseau tétraédrique cristallin, entre les barres figurent le nombre de moles d’ions de compensation et le nombre de moles d’eau.
Exemple 7 : Détermination de la porosité par adsorption/désorption de diazote
La porosité des zéolithes K-LTL-PBS et Gd-LTL-PBS-PBS synthétisées dans les exemples précités a été caractérisée par des mesures d’adsorption/désorption d’azote gazeux.
Les propriétés texturales des nanoparticules obtenues au exemples précités ont été déterminées par les isothermes d’adsorption/désorption de diazote mesurées à une température de -196°C à l'aide d'un dispositif de caractérisation de surface «Micromeritics 3Flex». Tous les échantillons ont été dégazés à 250°C sous vide pendant une nuit avant l'analyse. La surface externe des nanoparticules de zéolithes et le volume des micropores des nanoparticules de zéolithe ont été évalués par la méthode t-plot.
Les mesures adsorption/désorption d’azote pour les des deux zéolithes ont donné lieu à des isothermes hybrides de type I et IV selon la classification de l’IUPAC (voir Fig. 3). La mesure de la surface spécifique SBET, le volume poreux total et le volume des micropores des nanoparticules de zéolithe sont regroupés dans le tableau 1 ci- dessous. On définit un micropore comme étant un pore de taille inférieure à 0,08mm.
Tableau 1
Le tableau 2 ci-dessous regroupe la composition chimique des nanoparticules K-LTL- PBS et Gd-LTL-PBS de l’invention. Tableau 2
Les propriétés pharmacologiques des nanoparticules de l’invention ont été étudiées. Les résultats figurent dans les exemples suivants.
Exemple 8 : test de toxicité sur lignée de cellules humaines.
Les cellules utilisées proviennent d’une lignée cellulaire de glioblastome humain, U87-MG achetée chez American Type Culture Collection (ATCC). Les cellules ont été cultivées dans du DMEM 1 g/L de glucose (Sigma-Aldrich) supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (Eurobio), de glutamine 2 mM (Sigma-Aldrich) et de pénicilline (100 U/mL)/streptomycine (100 pg/mL) (Sigma-Aldrich). Les cellules ont été maintenues en culture à 37°C avec 5% de CO2 et 95% d'humidité.
La viabilité cellulaire a été évaluée 72h après l'exposition aux nanoparticules de zéolithe avec le test WST-1 (Roche) selon les instructions du fabricant. Les résultats sont visibles sur la Fig. 4. Cette figure montre également le pourcentage de viabilité des cellules avec une exposition à des nanoparticules synthétisées dans de l’eau en lieu et place du PBS. On constate que pour les nanoparticules K-LT-PBS et Gd-LTL- PBS de l’invention, le pourcentage de cellules viables est plus élevé que pour les nanoparticules synthétisées à partir du même mélange mais avec de l’eau à la place du PBS (Na-LTL-Eau et Gd-LTL-Eau).
Exemple 9 : Test de viabilité des globules rouges.
Pour confirmer l’absence de toxicité des nanoparticules de l’invention, des globules rouges ont été exposés à des concentrations croissantes de nanoparticules selon l’invention (issues des exemples précités).
Les résultats sont visibles sur la Fig.5. On constate ainsi que pour les nanoparticules synthétisées dans de l’eau, le pourcentage maximal d’hémolyse est de 1 ,12%; 0,649%; 0,00% et 0,00% respectivement pour les nanoparticules K-LTL-Eau, Gd-LTL- Eau, K-LTL-PBS et Gd-LTL-PBS.
Par ailleurs, en présence d’une grande quantité de nanoparticules (500 pg/mL), le pourcentage d’hémolyse le plus élevé obtenu pour les nanoparticules est de 0,0% pour les particules Gd-LTL-PBS. Ces résultats confirment que l’utilisation de PBS lors de la synthèse des nanoparticules décroît leur toxicité.
Exemple 10 : Etude du relarqaqe d'oxygène par les nanoparticules zéolitiques en conditions aqueuses et hypoxiques
Une chambre à hypoxie (IN VIV02 500™, 3M) a été utilisée pour obtenir une composition gazeuse stable et précisément contrôlée de l'atmosphère avec une précision de 0,1 % O2 en adaptant la quantité de N2.
La solution de PBS (Sigma-Aldrich) a été équilibrée avec le mélange gazeux contenu dans la chambre d'hypoxie pendant 1 h avant l'expérience.
Un tube fermé contenant 12 mL de PBS équilibré à 37°C et un capteur d'oxygène dissous (SevenGo (Duo) pro™ / OptiOx™, Mettler Toledo) ont été utilisé à l'intérieur de la chambre à hypoxie. Avant l'expérience, la ligne de base a été établie en mesurant la teneur en oxygène du PBS pendant 30 min.
Les nanoparticules des exemples précités et préalablement chargées en oxygène ont ensuite été ajoutées au système et l'oxygène dissous dans la solution de PBS a été mesuré en continu pendant 1 h. Les résultats sont visibles sur La Fig. 6. On constate que les nanoparticules K-LTL-Eau et/ou Gd-LTL-Eau présentent une excellente capacité de relargage (respectivement 4,07 et 5,12 fois supérieure à la ligne de base) du fait de leur composition chimique. Dans le cas des nanoparticules K-LTL-PBS et/ou Gd-LTL-PBS, la charge en O2 dans les nanoparticules a été contrôlée. Dans le cas du réseau s’étendant selon une direction, l’utilisation de PBS plutôt que d'eau lors de la synthèse de la particule peut entraîner des différences dans les propriétés physicochimiques de la zéolithe telles que la surface de la zéolithe, le volume de pores et la distribution de charges, ce qui peut à son tour affecter les interactions entre la zéolithe et l'oxygène et influencer la libération d'oxygène. Une cinétique de relargage plus longue dans le temps est intéressante pour réoxygéner plus durablement le tissu cible tout au long du protocole thérapeutique. La vitesse de relargage plus lente permet aux cellules de s’adapter durablement à la réoxygénation et ainsi maintenir les processus moléculaires liés à réoxygénation. Cela permet également d’avoir plus de temps entre l’injection et la séance de radiothérapie. Une réoxygénation plus longue permet également de réduire le nombre d’injections à réaliser.

Claims

Revendications
1 . Procédé de synthèse de nanoparticules constituées ou comprenant au moins un nanocristal de zéolithe selon lequel :
- on prépare une première composition/solution 1 contenant une source d’aluminium et une source d’un ion d’un métal alcalin M, notamment K;
- on prépare une deuxième composition/solution 2 comprenant une source de silicium et une source d’un ion d’un métal alcalin M, notamment K, lesdites compositions/solutions 1 et 2 étant exemptes de tout agent structurant organique ;
- on mélange les compositions/solutions 1 et 2 et on laisse le mélange sous agitation,
- on cristallise le mélange à une température supérieure ou égale à 50°C ; et éventuellement
- on sépare lesdites nanoparticules ainsi formées, caractérisé en ce que ladite première composition/solution 1 et ladite deuxième composition/solution 2 sont toutes deux constituées de ladite source et d’un tampon constitué d’eau et de 137mM/L de NaCI, 2,7 mM/L de KCI , 10 mM/L de Na2HPO4, 1 ,76 mM/L de KH2PO4 et ayant un pH égal 7,2 (PBS) et en ce que ledit mélange des compositions/suspensions 1 et 2 présente la composition molaire suivante (I):
XI M2O : YAI2O3 : 10SiO2 : Z PBS (I) dans laquelle 2.8 <X1 < 8,8
0,3<Y< 1 ,5,
40<Z<300.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu’on sépare lesdites nanoparticules à l'aide d'une membrane.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que M = K, en ce que ladite source d’aluminium est de l’hydroxyde d’aluminium et en ce que l’on cristallise ledit mélange à une température supérieure ou égale à 90°C et inférieure ou égale à 200°C et en particulier égale à 170°C pendant une durée égale ou supérieure à 4h et égale ou inférieure à 16h.
4. Nano zéolithe comprenant ou constituée d’un nanocristal de zéolithe de type LTL, caractérisée en ce qu’elle comprend des ions du PBS, en particulier des ions Na+, K+, HPO42; H2PO4; H3O+ et CI’.
5. Nano zéolithe selon la revendication 4, caractérisée en ce qu’elle contient, en outre, dans son réseau cristallin des cations d’un métal choisi parmi Fe, Gd, Cu et Ce et en particulier en une quantité supérieure ou égale à 0,2 % massique et inférieure ou égale à 5 % massique et/ou un gaz contenu dans son volume poreux et choisi parmi l’oxygène, le diazote, le dioxyde de carbone et leurs mélanges.
6. Nano zéolithe selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que ladite zéolithe de type LTL présente la formule chimique suivante (II) : |Ka Nab (H2O)C | (Alx SiyO72) (II) dans laquelle x est supérieur à 9 et/ou y est inférieur à 27 et/ou a est supérieur à 6.
7. Nano zéolithe selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite zéolithe présente la formule chimique (III) suivante IK9.04 Na2.57 (H2O)24.46 | (AI10.12 Si25.5iO?2) (III) ou la formule chimique suivante : |Nai.ioK9.oiGdo.4(H20)24.321 (Si25.42Alio.34072).
8. Nano zéolithe selon l’une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce qu’elle présente un volume poreux total supérieur ou égal à 0,5 cm3/g et inférieur ou égal à 1 ,4 cm3/g et notamment égal à 0,73 ou 0,85 et/ou une surface spécifique SBET supérieure ou égale à 300 m2/g et inférieure ou égale 900 m2/g et notamment égale à 538 m2/g ou 490 m2/g.
9. Nano zéolithe selon l’une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisée en ce qu’elle a la forme d’une paillette ou d’un parallélépipède plat.
10. Nano zéolithe selon l’une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisée en ce qu’elle présente longueur moyenne supérieure ou égale à 5nm et inférieure ou égale à 20nm et une largeur moyenne supérieure ou égale à 2 et inférieure ou égale à 15nm.
11. Nano zéolithe selon l’une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisée en ce que son réseau poreux s’étend selon une seule direction.
12. Suspension colloïdale de nanoparticules caractérisée en ce qu’elle contient les nanoparticules selon l’une quelconque des revendications 4 à 11 dans un dispersant choisi parmi les alcools, l’eau, le tampon phosphate salin (PBS) et leurs mélanges.
13. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle contient en tant que produit pharmaceuticalement actif ou en tant qu’agent de contraste, une pluralité de nanoparticules constituées ou comprenant au moins une nano zéolithe selon l’une quelconque des revendications 4 à 11 ou la suspension selon la revendication 12.
14. Produit de combinaison comprenant ou constitué d’un anticancéreux et de la composition pharmaceutique selon la revendication 13 pour leur administration simultanée ou différée.
15. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 4 à 11 pour son utilisation en tant que médicament, notamment pour le traitement des tumeurs solides en particulier du cerveau, en particulier le glioblastome.
16. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 4 à 11 pour son utilisation en tant qu’agent de contraste, notamment en imagerie par résonance magnétique (IRM).
17. Suspension selon la revendication 12, notamment dans du PBS, pour son utilisation en tant que médicament, notamment pour le traitement des tumeurs solides en particulier du cerveau, en particulier le glioblastome.
18. Suspension selon la revendication 12, notamment dans du PBS, pour son utilisation en tant qu’agent de contraste, notamment en imagerie par résonance magnétique (IRM).
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