EP4680290A1 - Matrice 3d poreuse à base de complexes de polyélectrolytes et ses applications - Google Patents

Matrice 3d poreuse à base de complexes de polyélectrolytes et ses applications

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EP4680290A1
EP4680290A1 EP24710466.4A EP24710466A EP4680290A1 EP 4680290 A1 EP4680290 A1 EP 4680290A1 EP 24710466 A EP24710466 A EP 24710466A EP 4680290 A1 EP4680290 A1 EP 4680290A1
Authority
EP
European Patent Office
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macrophages
matrix
pro
healing
biomaterial
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Pending
Application number
EP24710466.4A
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German (de)
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Inventor
Agnès COSTE
Lise LEFEVRE
Maylis FARNO
Brigitte Sallerin
Sophie GIROD-FULLANA
Audrey VARIN
Ali SANOUJ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Établissement Français du Sang
Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse
Institut National Polytechnique de Toulouse
Université de Toulouse
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Établissement Français du Sang
Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Institut National Polytechnique de Toulouse
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a porous 3D matrix obtained from polyelectrolyte complexes (PEC) formed between anionic and cationic polymers, particularly suitable for cell therapy and in particular for the healing of soft tissues and tissue repair.
  • PEC polyelectrolyte complexes
  • the matrix according to the invention can be advantageously used in combination with macrophages to promote wound healing.
  • the invention also relates to a biomaterial comprising such a porous matrix and cells of interest, such as macrophages and/or mesenchymal stromal cells, and a kit comprising this matrix.
  • the present invention also relates to a method for preparing such a matrix as well as a method for preparing such a biomaterial and the use of such a hybrid biomaterial in regenerative medicine.
  • Tissue engineering or regenerative medicine, generally uses therapeutic cells, substances necessary for tissue development (signal molecules, growth factors, etc.) and/or implantable biomaterials.
  • an implantable biomaterial intended for deep cell seeding must have biocompatibility characteristics so that, once implanted, it does not generate an excessive inflammatory reaction.
  • the material must ideally allow cell adhesion, normal functioning, migration and the production of a new extracellular matrix.
  • the biomaterial must also promote the viability of therapeutic cells.
  • the biomaterial must have a highly macroporous and interconnected structure so as to allow cell colonization and the diffusion of nutrients.
  • the material must have mechanical properties related to those of the targeted tissue, so as to reproduce a biomimetic environment for the cells it hosts.
  • therapeutic cells can be used. It may be particularly interesting to administer them via an implantable biomaterial, in order to provide a protective 3D environment ensuring the local administration of viable cells at the level of the wound or more generally of the injured tissue or organ.
  • Chronic wounds, and particularly diabetic foot wounds are "stuck" in a low-intensity inflammatory phase, preventing them from accessing the subsequent stages of healing and suggesting a defective resolution of the inflammation (Miao et al., 2012).
  • the pathophysiological microenvironment of chronic wounds is itself even associated with functional deregulation of macrophages. The deregulation and loss of functionality of macrophages contribute largely to the failure of healing of chronic wounds including diabetic foot.
  • macrophages occupy a central place in the orchestration of the healing process.
  • pro-inflammatory macrophages engaged in the elimination of pathogens by phagocytosis and which secrete pro-inflammatory cytokines, toxic intermediates and reactive oxygen species, on the one hand, and pro-healing macrophages and pro-resolving macrophages, involved in tissue repair and remodeling processes, on the other hand.
  • Macrophages therefore constitute an increasingly attractive therapeutic target in regenerative medicine. Indeed, in view of the dysfunctions of macrophages in chronic wounds and the deleterious impact of the absence of transition from a pro-inflammatory phenotype to a pro-resolving phenotype, it appears essential to restore the pro-resolving and pro-repair functionality of macrophages.
  • the inventors have developed a PEC matrix based on anionic and cationic polymers that is particularly suitable for soft tissue healing and tissue repair.
  • the matrix according to the invention has mechanical and structural properties such as that it can simultaneously serve as a 3D support for cells, and in particular macrophages, and as a dressing.
  • the matrix according to the invention is particularly suitable for use in association with pro-resolving macrophages.
  • the inventors have developed a PEC alginate/chitosan matrix that can be used as a cell therapy support suitable for soft tissues.
  • the invention therefore relates to a three-dimensional biomaterial comprising a matrix of polyelectrolyte complexes (PEC) based on alginate and chitosan, modified or not, and macrophages, said matrix having an interconnected open macroporosity in which the alginate/chitosan mass ratio is between 20/80 and 80/20.
  • PEC polyelectrolyte complexes
  • the PEC matrix is based on alginate and chitosan, the alginate/chitosan mass ratio being 40/60.
  • the alginate may in particular have an M/G ratio of between 1.4 and 2.7, preferably equal to 2 +7-0.2, a molecular weight (Mw) of between 150,000 and 250,000, and a polydispersity index (PI) of less than 2, preferably around 1.5.
  • Mw molecular weight
  • PI polydispersity index
  • Chitosan advantageously has a degree of deacetylation (DD A) of between 75% and 90%, preferably between 75 and 85%, an Mw of between 130,000 and 400,000, preferably between 145,000 and 400,000, more preferably between 200,000 and 400,000, and a polydispersity index of less than 2, preferably of approximately 1.7, more preferably of approximately 1.8.
  • DD A degree of deacetylation
  • the biomaterial may be a hybrid biomaterial comprising pro-healing macrophages.
  • the pro-healing macrophages are, for example, pro-resolving macrophages.
  • the hybrid biomaterial comprises pro-healing macrophages and mesenchymal stromal cells (MSCs), the ratio of pro-healing macrophages to mesenchymal stromal cells preferably being between 1/99 and 99/1.
  • the ratio of pro-healing macrophages to mesenchymal stromal cells is 50/50.
  • the invention also relates to a method for preparing a hybrid biomaterial according to the invention, comprising the steps:
  • step (e) seeding the PEC matrix with pro-healing macrophages obtained in step (a) optionally combined with MSCs.
  • the sterilization step (d) is sterilization by irradiation with low-energy pulsed electron beams or sterilization by irradiation with low-energy continuous electron beams.
  • the matrix resulting from step (b) undergoes a drying step before the sterilization step (d).
  • the invention also relates to a skin dressing intended for regenerative medicine comprising a three-dimensional biomaterial according to the invention.
  • the invention also relates to pro-healing macrophages optionally combined with MSCs for their use in regenerative medicine in a subject, characterized in that said pro-healing macrophages and the optional MSCs are in a form suitable for their administration to said subject by means of a three-dimensional biomaterial according to the invention.
  • Such pro-healing macrophages possibly combined with MSCs can in particular be used for the treatment of a wound, in particular a chronic wound.
  • the subject has diabetes and/or is elderly.
  • the three-dimensional biomaterial is in the form of a dressing, a patch, or an implantable matrix.
  • Said pro-healing macrophages and any CSM may have been previously obtained from cells of said subject among, bone marrow cells, iPS or blood monocytes, and adipose tissue (ASC: “Adipose tissue-derived mesenchymal Stroma Cell”).
  • ASC Adipose tissue-derived mesenchymal Stroma Cell
  • the invention also relates to a kit intended for regenerative medicine, and in particular for the treatment of a wound, such as a chronic wound, said kit comprising: a PEC matrix of alginate and chitosan, said matrix having an interconnected open macroporosity in which the anionic polymer/cationic polymer mass ratio is between 20/80 and 80/20, preferably between 40/60 and 60/40; a culture medium suitable for the culture of pro-healing monocytes or macrophages and/or a culture medium suitable for the differentiation of bone marrow cells into macrophages of pro-healing phenotype.
  • the PEC matrix is sterilized.
  • FIG. 1 shows the chemical structure of sodium alginate and its monomeric units M and G (A), and an example of an alginate chain sequence (B).
  • FIG. 2 shows the chemical structure of chitin or chitosan.
  • FIG. 3A represents the distribution of the different batches studied in an in vivo murine study model of the cell therapy strategy for chronic wounds.
  • FIG. 3B shows the timeline of the test in Figure 3A and the experimental conditions.
  • FIG. 4 shows the gene expression profile of macrophage (mO) MO, Ml and M2 after 24 hours of culture or in contact with PEC 40/60 matrices.
  • A Anti- and proinflammatory cytokines.
  • B Membrane receptors. Analyses were performed with 3 replicates per condition (1-way ANOVA test; *P ⁇ 0.05; **P ⁇ 0.01; *** P ⁇ 0.001; **** P ⁇ 0.0001). For clarity on the graphs, only significant differences between m ⁇ I> in contact with matrices compared to their reference group (m ⁇ I> in culture) are indicated.
  • FIG. 5 AB shows the results of the flow cytometry study of the expression of the surface markers F4/80, CD206 (MR) and CD86 by the m ⁇ l» M2 after 24 hours of culture (A) or in contact with the PEC 40/60 matrices (B).
  • FIG. 7 is a diagram showing the luminescence monitoring of reactive oxygen species production by macrophages (m ⁇ 5) MO, Ml and M2 after 24 hours of culture or in contact with 3D matrices after stimulation with 100 mM TPA.
  • FIG 8 shows in confocal microscopy a PEC 40/60 matrix after 24 hours of culture and after differential labeling of living/dead cells.
  • the upper left insert indicates the imaged faces of the matrix.
  • the 3D matrix as a whole is presented in (A), it is a 3D reconstruction at 10X magnification with phase contrast and z-projection of the channels.
  • Images B-C-D correspond to the z-projection of a cross-section of the matrix at 10X.
  • Images E-F-G then H-I-J are z-projections of the matrix imaged longitudinally at 10X and 40X respectively.
  • FIG 9 shows the wound closure kinetics from the first day of treatment (D2).
  • the statistical analysis between the 3D matrix + m ⁇ I> M2 group and the HFD control group is indicated by * (p ⁇ 0.05).
  • FIG 10AB shows representative images of histological sections from the control group (A) and the group treated with 3D matrices + mO M2 (B).
  • FIG. 10C shows the histological scores associated with the images in Figures 10A and 10B.
  • FIG 12 shows the functionality of human M(p) and ASC seeded in the matrix in the basal state or after infectious stimuli (LPS). After 24h of culture, the concentrations of IL-10, IL-6 and IL-ip are determined by ELISA.
  • FIG 13 shows the effects of a matrix according to the invention seeded with different murine therapeutic cells on the repair of chronic wounds.
  • a 1 cm 2 wound is made on the back of diabetic male C57BL/6 mice aged over 10 months.
  • the matrices alone (A) or matrices containing pro-resolving macrophages (M2-Mcp) + associated with adipose tissue mesenchymal stromal cells (ASCs) (B) are applied to the wound.
  • the matrices are placed on the wound for 24 hours and then replaced by a new matrix for 3 days.
  • a photo of the wound is taken every day and the animals are sacrificed. when a group reaches 90% wound closure. At different times, the wound area is measured and the percentage of closure is determined relative to the wound area at D0.
  • C Area under the curve after the different treatments.
  • FIG 14 shows a comparison of the number of days required to close the wound at 25, 50, 75, 95 and 100% between untreated mice and mice treated with therapeutic cells contained in the matrix.
  • the number indicated on the histograms represents the difference in days required to close the wound at X% between untreated mice (black histogram) and mice treated with matrix alone (A), matrix containing M2-Mcp (B) or matrix containing M2-Mcp associated with ASCs (C).
  • FIG 15 shows a histological analysis of the wounds after treatment with the matrix associated with different therapeutic cells. 10 days post-injury, the animals are sacrificed, the dorsal skin is removed and a histological analysis (hemalun Eosin labeling) is performed. In order to evaluate wound closure, the distance between the paniculus camosus present on each side of the wound is measured on the histological sections of mice treated with the matrix alone (A) or with the matrix containing M2-M ⁇ p and ASCs (B). (C) Macroscopic analysis of the histological sections (hemalun Eosin labeling) of the wounds after treatment (10 days post-injury).
  • FIG 16 shows the effects of matrices containing different human pro-resolving cells on the proliferation of human skin fibroblasts.
  • M2-Mcp (A) or M2-Mcp associated with ASCs (M2Mq > + ASCs) (B) were cultured in culture plates (2D) (black dotted line) or on the matrix (3D) (black solid line) for 24 h in a-MEM + 0.1% fetal calf serum (FCS). After 24 h of culture, the supernatants were collected and added to human primary fibroblasts cultured at low density. The proliferation of fibroblasts cultured in these culture supernatants is evaluated for 7 days using a real-time imaging system (Incucyte S3, Sartorius).
  • FIG 17 shows that the matrix promotes the anti-inflammatory profile of macrophages.
  • Human macrophages are differentiated into anti-inflammatory macrophages (M2-Mcp) (IL-4 for 24h). Then the M2-Mcp are cultured in plates (2D) or on the matrix (3D). After 24h, the culture supernatants are collected and the IL-10 concentration is evaluated by ELISA.
  • M2-Mcp anti-inflammatory macrophages
  • the present invention relates to a matrix of polyelectrolyte complexes particularly suitable for use in a wound dressing in the context of tissue regeneration.
  • the matrix can be used as a biomaterial in combination with therapeutic cells, such as macrophages and/or mesenchymal stromal cells (MSCs), to aid in wound healing.
  • therapeutic cells such as macrophages and/or mesenchymal stromal cells (MSCs)
  • Biocompatible means a material, matrix or substance that does not interfere with or degrade the biological environment in which it is used.
  • biodegradable we mean a material or matrix capable of being naturally decomposed by living organisms.
  • implantable material or matrix we mean a material or matrix capable of being naturally decomposed by the organism in which it is to be implanted.
  • biomaterial is meant a non-living material, intended to interact with a biological system, with an appropriate host response in a specific application.
  • a “hybrid biomaterial” designates the combination of a matrix and therapeutic cells, which can be used in particular as a dressing or temporary skin substitute, capable of delivering therapeutic substances (bioactive molecules secreted by the cells, active ingredients) and/or of stimulating a cellular target.
  • the present invention is mainly based on a biocompatible and advantageously biodegradable polymer matrix. More precisely, the matrix is a matrix of polyelectrolyte complexes (PEC) based on anionic polymer(s) and cationic polymer(s). PECs have many advantages such as maintaining the very good biocompatibility of the polymers (here biosourced) from which they are derived. This is why PECs are already conventionally used in tissue engineering with promising results in this field (Ishihara 2019).
  • the matrix is a three-dimensional (3D) matrix. More specifically, the matrix according to the invention is a PEC matrix having interconnected open macroporosity.
  • interconnected open macroporosity is meant that the matrix more particularly comprises pores with an average diameter of between 50 and 300 pm, that said pores communicate with each other and that it is possible to access said pores from the external surface of the matrix.
  • Biocompatible anionic polymers are advantageously chosen from alginates and modified alginates.
  • Alginates form a family of linear copolymers consisting of a chain of P-D-mannuronic acid units (M unit) and a-L-guluronic acid (G unit), linked together by P (1-4) glycodisic bonds. It is possible to vary the rigidity of alginate gels by varying the M/G ratio. For example, it is possible to use sodium alginate.
  • Modified alginates are understood to be alginates whose basic structure is functionalized by one or more groups, in particular by one or more peptides. For example, it is possible to use alginate functionalized by RGD tripeptides (L-arginine, glycine, L-aspartic acid) participating in cell adhesion.
  • the alginate used may in particular have an M/G ratio of between 1.4 and 2.7, in particular between 1.5 and 2.5, for example, approximately equal to 1.5, to 1.6, to 1.7, to 1.8, to 1.9, to 2, to 2.1, to 2.2, to 2.3, to 2.4, to 2.5.
  • the alginate has a molecular weight (Mw) of between 150,000 and 250,000, +/- 10%, for example, approximately 150,000, 155,00, 160,000, 165,000, 170,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 195,000, 200,000, 210,000, 220,000, 230,000, 240,000, 250,000.
  • Mw molecular weight
  • the alginate may also have a polydispersity index (PI), preferably less than 2, in particular between 1.9 and 1, preferably approximately 1.9, approximately 1.8, approximately 1.7, approximately 1.6, approximately 1.5, approximately 1.4, approximately 1.3, approximately 1.2, approximately 1.1, approximately 1.
  • PI polydispersity index
  • the chitosan used can have a degree of deacetylation (DD A) of between 50% and 90%, in particular between 75% and 90%, preferably between 75 and 85%.
  • DD A degree of deacetylation
  • the molecular weight (Mw) of chitosan is advantageously between 100,000 and 500,000 +/- 10%, preferably between 130,000 and 400,000, between 140,000 and 350,000, between 150,000 and 300,000, between 175,000 and 270,000, between 200,000 and 250,000, in particular approximately 135,000, approximately 140,000, approximately 145,000, approximately 150,000, approximately 155,000, approximately 160,000, approximately 165,000, approximately 170,000, approximately 175,000, approximately 180,000, approximately 185,000, approximately
  • the polydispersity index (PI) of chitosan is preferably less than 2, in particular between 1.9 and 1, preferably approximately 1.9, approximately 1.8, approximately 1.7, approximately 1.6, approximately 1.5, approximately 1.4, approximately 1.3, approximately 1.2, approximately 1.1, approximately 1.
  • the PEC matrix comprises alginate and chitosan according to the above characteristics, in an alginate/chitosan mass ratio of between 35/65 and 45/55, preferably approximately 40/60.
  • the alginates advantageously have a M/G ratio of between 1.4 and 2.7, preferably equal to 2 +7-0.2, a molecular weight (Mw) of between 150,000 and 250,000, in particular approximately 195,000, and a polydispersity index (PI) of less than 2, preferably approximately 1.5.
  • Mw molecular weight
  • PI polydispersity index
  • chitosan advantageously has a degree of deacetylation (DDA) of between 75% and 90%, preferably between 75 and 85%, an Mw of between 130,000 and 400,000, preferably between 140,000 and 250,000 or between 200,000 and 400,000, and a polydispersity index of less than 2, preferably of approximately 1.8 or approximately 1.7.
  • DDA degree of deacetylation
  • the alginate used may have a M/G ratio of 1.4 +/- 0.1, a molecular weight of about 162,000 and a polydispersity index of about 1.7.
  • the chitosan used may have a DDA of 88% +/- 5%, a molecular weight of about 146,700 and a PI of about 1.7.
  • the PEC matrix comprises an alginate/chitosan mass ratio of between 35/65 and 45/55, preferably of approximately 40/60.
  • the alginate of the matrix has a M/G ratio of 2.1 -+7-0.1, a molecular weight of approximately 193,100 and an IP of approximately 1.5, and the chitosan has a DDA of 80% +/-5%, a molecular weight of approximately 216,300 and an IP of approximately 1.8.
  • the matrix according to the invention can be prepared by any suitable method known to those skilled in the art. In particular, it is possible to implement the preparation method described in application WO2017/017379. After obtaining, the matrix can be sterilized and optionally dried or freeze-dried, this drying or freeze-drying being preferably carried out before sterilization with a view to its subsequent use as a biomaterial.
  • the polyelectrolyte complex (PEC) matrix is produced by mixing the anionic polysaccharide, such as alginate, and the cationic polymer, such as chitosan, in proportions of between 40/60 and 60/40.
  • the cationic polymers and the anionic polymer are in mass proportions of between 40/60 and 60/40.
  • the cationic polymers and the anionic polymer are in proportions allowing a maximum level of ionic interaction (+/-10%).
  • the preparation step of a PEC matrix based on chitosan and alginate includes
  • the matrix according to the invention can be dried, for example by supercritical CO2 drying, and/or freeze-dried, in order to promote its preservation and storage before use.
  • the matrix according to the invention can advantageously be sterilized, preferably dry. Sterilization can be carried out by any means, physical or chemical, known to those skilled in the art and suitable for PEC matrices. In particular, it is possible to sterilize the matrix by irradiation with low-energy pulsed electron beams or by irradiation with low-energy continuous electron beams. Low-energy irradiation means an energy of less than 500 keV.
  • the sterilization method described in Farno et al 2021 (“Low-energy electron beam sterilization of solid alginate and chitosan, and their polyelectrolyte complexes”, Carbohydrate Polymers 261 (2021) 117578) is particularly suitable.
  • the sterilization is carried out by irradiation at a dose of less than 5 kGy, in particular between 2 and 3 kGy, preferably 2.5 kGy, by pulsed technology with a beam energy of between 200 and 350 keV, preferably between 250 and 300 keV, in particular at 280 keV.
  • the sterilization is carried out by irradiation at a dose of between 10 and 25 kGy, preferably between 12 and 20 kGy, more preferably 15 kGy, by pulsed technology with a beam energy of between 350 and 550 keV, preferably between 400 and 450 keV.
  • sterilization is carried out by irradiation at a dose of 15 kGy, with a beam energy of 430 keV.
  • the invention also relates to a biomaterial combining a matrix as described above, and therapeutic cells and/or therapeutic substances.
  • the matrix according to the invention has mechanical and biological properties that are particularly suitable for cell therapy.
  • the matrix according to the invention has properties that are favorable to the seeding and survival of particular cells, such as macrophages and mesenchymal stromal cells. Indeed, the porosity generated allows deep seeding of the matrix, and the architecture recreates a biomimetic environment capable of maintaining cell viability, a particular phenotype and/or metabolic activity.
  • the matrix according to the invention is thus particularly suitable for the seeding and survival of macrophages and/or mesenchymal stromal cells (MSCs). It is thus possible to use the matrix according to the invention with macrophages, or with a combination of macrophages and MSCs.
  • MSCs mesenchymal stromal cells
  • pro-resolving macrophages are essential to stop inflammation and direct healing to the repair phase.
  • these macrophages aim to return homeostasis and mature the skin to its initial state.
  • the resolution of inflammation is partly activated by the phagocytosis of apoptotic PNNs by macrophages, which consequently secrete TGF-0 and VEGF.
  • Pro-resolving macrophages also produce IL-10 in high quantities, which is known to be immunosuppressive.
  • ECM extracellular matrix
  • these macrophages are involved in the apoptosis of myofibroblasts to minimize the risk of excessive fibrosis.
  • Proresolving macrophages are characterized by the presence of Pattern Recognition Receptors (PRRs) capable of recognizing pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and/or danger-associated molecular patterns (DAMPs).
  • PRRs Pattern Recognition Receptors
  • PAMPs pathogen-associated molecular patterns
  • DAMPs danger-associated molecular patterns
  • the matrix according to the invention advantageously comprises pro-healing macrophages.
  • pro-healing macrophages designate pro-inflammatory macrophages, pro-resolving macrophages, or a mixture thereof.
  • pro-inflammatory/anti-bacterial macrophages and/or pro-resolving macrophages is advantageously conditioned by the infectious and inflammatory status of the wound to be treated.
  • the person skilled in the art is able to decide on the type of pro-healing macrophages to be used with the matrix, depending on the wound to be treated.
  • the inventors have demonstrated that the matrix according to the invention makes it possible to maintain matrix macrophages in a pro-resolving state.
  • the matrix according to the invention comprising pro-resolving macrophages can make it possible to force endogenous macrophages, in contact with said matrix, towards a pro-resolving phenotype.
  • said matrix in the case of use of the matrix as a dressing applied to a wound, said matrix can promote healing by driving the macrophages present at the wound towards a pro-resolving phenotype.
  • the matrix according to the invention can also be used with other types of therapeutic cells, such as MSCs and/or with therapeutic molecules, and can optionally be functionalized with antibiotics, natural substances (propolis, proanthocyanidin A).
  • MSCs are particularly interesting in the context of wound treatment, in combination with macrophages, because they make it possible to induce a pro-resolving phenotype of macrophages.
  • the polarization of macrophages towards a pro-resolving phenotype by MSCs can concern both exogenous macrophages, provided by the biomaterial, and endogenous macrophages, present at the level of the wound on which the hybrid biomaterial is applied.
  • MSCs through the secretion of paracrine factors, can modulate and recruit endogenous wound cells such as fibroblasts and keratinocytes and thus accelerate wound closure (Shingyochi, Y, 2015, Exp Opinion mol Ther; Krzyszczyk, P, 2018, Front Physiol).
  • MSCs also play a central role in wound neovascularization by secreting anti-inflammatory factors but also by stimulating the production of VEGF by cells in the microenvironment (Shingyochi, Y, 2015, Exp Opinion mol Ther). MSCs therefore have a strong potential to accelerate the wound closure process through their anti-inflammatory properties, by stimulating angiogenesis as well as by producing soluble factors that improve wound healing. wound microenvironment and thus promote tissue reconstruction.
  • matrix CMSs may play a role in the different phases of healing of healthy or infected wounds.
  • the inventors demonstrated that the association between pro-resolving macrophages and ASCs significantly increases the number of viable cells in the matrix.
  • the association between pro-resolving macrophages and ASCs potentiates the pro-resolving and therapeutic activity of cells seeded in the matrix.
  • the biomaterial according to the invention comprises a matrix based on alginate and chitosan, advantageously with an alginate/chitosan mass ratio of approximately 40/60, and macrophages, preferably pro-healing macrophages, in particular pro-resolving macrophages.
  • the hybrid biomaterial according to the invention comprises a matrix based on alginate and chitosan, advantageously with an alginate/chitosan mass ratio of approximately 40/60, pro-healing macrophages and mesenchymal stromal cells.
  • the hybrid biomaterial according to the invention comprises a matrix based on alginate and chitosan, advantageously with an alginate/chitosan mass ratio of approximately 40/60, pro-healing macrophages, preferably pro-resolving macrophages, and mesenchymal stromal cells.
  • the hybrid biomaterial according to the invention consists of a matrix as described above and pro-healing macrophages, preferably pro-resolving macrophages.
  • the hybrid biomaterial according to the invention consists of a matrix as described above, pro-resolving macrophages and MSCs.
  • the volume concentration of cells in the PEC matrix is between 800 and 8000 cells/mm3 of PEC matrix, preferably between 500 cells and 4000 cells/mm3 of PEC matrix.
  • Macrophages exhibiting a pro-healing phenotype, and in particular a pro-resolving phenotype preferentially represent at least 60% in number of the macrophages contained in the PEC matrix, more preferentially at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%.
  • the volume concentration of CSM in the PEC matrix is preferably between 800 and 8000 CSM/mm3 of PEC matrix.
  • the hybrid biomaterial according to the invention can be prepared by any method known to those skilled in the art.
  • the method for preparing a hybrid biomaterial according to the invention may comprise the steps of preparing a matrix of polyelectrolyte complexes (PEC) according to the invention, optionally drying, sterilization of said PEC matrix and seeding of the PEC matrix with therapeutic cells, in particular pro-healing macrophages.
  • PEC polyelectrolyte complexes
  • said matrix is seeded with therapeutic cells, by bringing the matrix into contact with a culture medium comprising said therapeutic cells of interest.
  • a culture medium comprising said therapeutic cells of interest.
  • the method for preparing a hybrid biomaterial according to the invention can comprise the steps:
  • step (d) seeding the PEC matrix with pro-healing macrophages obtained in step (a) optionally combined with MSCs.
  • step (a) may comprise culturing the macrophages under conditions making it possible to obtain macrophages with a pro-resolving phenotype.
  • step (a) of culturing the macrophages comprises culturing bone marrow cells previously taken from a human or non-human mammal, in a culture medium making it possible to obtain naive macrophages, polarizing them towards a pro-resolving phenotype by culturing them in a culture medium supplemented with IL-4, IL-13 and dexamethasone for several days, in particular between 2 and 10 days, for example at least 4 days.
  • Polarizing the macrophages towards a pro-inflammatory phenotype is obtained by culturing them in a culture medium supplemented with Interferon- ⁇ and/or LPS for several days, in particular between 2 and 10 days, for example at least 4 days.
  • step (a) may comprise culturing macrophages under conditions that produce macrophages with a pro-inflammatory phenotype.
  • step (a) of culturing macrophages comprises a differentiation step in the presence of MSCF and a 24-hour culture step in the presence of inflammatory cytokines, such as gamma interferon, and/or bacterial cell walls in a defined medium.
  • PEC matrix preparation step (b) and sterilization step (d) can be carried out as described above.
  • cell culture step (a) and steps (b) and (d) can be carried out independently and in different time periods. For example, it is possible to prepare the matrix and sterilize it several hours, days, months, etc. before the cell culture step. Before seeding, the matrices can be stored in a lyophilized and sterilized state in a sterilization package.
  • the seeded matrices can be preserved in culture.
  • the seeded matrices are placed in multi-well cell culture dishes, in which a volume of medium is added, adapted according to the size of the wells and matrices, so as to immerse the seeded matrix.
  • the dishes are preserved in an incubator at approximately 37°C and 5% CO2.
  • the preservation period may depend on the cell type.
  • the culture medium can be renewed at a frequency depending on the cell type. The person skilled in the art knows how to adapt the culture medium, the volumes and the renewal of the medium to the cell types and to the intended final use of the biomaterial.
  • culture preservation can extend over a period of several days, including 10 days, 15 days, 20 days, 21 days or more, with a very high macrophage viability rate.
  • the invention also relates to a kit intended for regenerative medicine, and in particular for the treatment of a wound, such as a chronic wound, said kit comprising:
  • the culture medium is suitable for the culture of pro-resolving macrophages and/or MSCs.
  • macrophages are cultured in supplemented RPMI 1640, and MSCs are cultured in supplemented alpha-MEM.
  • the kit may also include a culture medium suitable for the differentiation of cells, such as bone marrow cells, iPS cells, etc. into macrophages with a pro-resolving and/or pro-inflammatory phenotype.
  • the kit may comprise a matrix as described above, shaped for use as a wound dressing, or provided with means enabling use as a wound dressing.
  • the kit may contain a strip or any adhesive, to enable the matrix to be held in position on a wound.
  • the matrix may be provided in a format enabling it to be cut to fit the size/shape of the wound.
  • the matrix according to the invention can in particular be used as a dressing to be applied to a wound.
  • a matrix is capable of promoting the polarization of endogenous macrophages, present at the level of a wound to be treated for example, towards a pro-resolving phenotype.
  • the application of a dressing comprising such a matrix can help in the healing of a wound.
  • the matrix according to the invention in combination with one or more therapeutic molecules and/or biological substances.
  • IL- 13/IL-4 for example, IL- 13/IL-4, dexamethasone, eicosanoids.
  • the matrix according to the invention can advantageously be used in combination with macrophages and more particularly pro-resolving and/or pro-inflammatory macrophages, and/or MSCs, in regenerative medicine, and more particularly in the context of the treatment of chronic wounds.
  • Regenerative medicine means the repair, replacement or regeneration of damaged cells or tissues. According to the invention, tissue repair and healing of skin wounds are mainly targeted.
  • the invention relates to pro-healing macrophages for their use in regenerative medicine in a subject, said healing macrophages being in a form suitable for their administration to said subject by means of a hybrid biomaterial according to the invention.
  • the invention relates in particular to pro-resolving macrophages, optionally in combination with MSCs, for their use in regenerative medicine in a subject, said pro-resolving macrophages being in a form suitable for their administration to said subject by means of a hybrid biomaterial according to the invention.
  • a subject is understood to be a mammal, human or non-human, in need of medical treatment, such as the treatment of a wound, in particular a chronic wound.
  • the subject is a human mammal, child, adolescent or adult.
  • the subject has a disease limiting the healing mechanisms and/or is an elderly subject.
  • the subject is a diabetic, preferably a type II diabetic.
  • elderly subject we mean a human mammal aged 70 or over.
  • the invention particularly relates to pro-resolving macrophages, optionally in combination with MSCs, in a hybrid biomaterial according to the invention, for their use in the treatment of a wound, in particular a chronic wound.
  • the invention also relates to pro-inflammatory macrophages, optionally in combination with MSCs, in a hybrid biomaterial according to the invention, for their use in the treatment of a wound, in particular a chronic wound.
  • Said pro-healing macrophages and/or MSCs can be obtained from cells of said subject such as blood monocytes, MSCs from adipose tissue, bone marrow or umbilical cord, macrophages, bone marrow cells and/or iPS.
  • the invention also relates to the use of a biomaterial according to the invention, in particular in the form of a dressing or implantable matrix, in regenerative medicine.
  • the invention relates to the use of such a biomaterial according to which said biomaterial is placed in contact with injured tissue, such as a skin wound.
  • the invention also relates to a method for treating injured tissue according to which a biomaterial as described above is applied against the injured tissue to promote the repair of said tissue.
  • the invention relates to a method for treating a wound, and particularly a chronic wound, according to which said biomaterial is applied against the wound to promote healing.
  • the hybrid biomaterial advantageously contains pro-healing macrophages and in particular pro-resolving macrophages, optionally in combination with MSCs.
  • the biomaterial can be applied in the form of a dressing capable of being held on the wound.
  • the invention also relates to the use of macrophages for the preparation of a biomaterial according to the invention, for the treatment of injured tissue.
  • the invention relates to the use of macrophages for the preparation of a biomaterial according to the invention, for the treatment of a wound, more particularly a chronic wound, such as a chronic diabetic wound.
  • the polymers used are a “medium viscosity” alginate marketed by Sigma (reference A-2033; lot 051M0054V) or by Algaia (Satialgine XPS 170NS) and a “medium molecular weight” chitosan also supplied by Sigma (reference 448877, lot STBF8484V or lot BCCJ1419).
  • M/G ratio of 2.1 was determined by the method described by Vilén et al. (Vilén et al., 2011).
  • Mw mass average molecular weight
  • Mn number average molecular weight
  • the degree of deacetylation was calculated by applying the method of Heux et al. (Heux et al., 2000) and was estimated at 80% +/-5%.
  • the Mw and Mn values obtained by size exclusion chromatography are respectively 216,300 and 120,300 g/mol with a polydispersity index of 1.8, for the alginate of batch STBF8484V.
  • the Mw and Mn values obtained by size exclusion chromatography are respectively 146,700 and 86,500 g/mol with a polydispersity index of 1.7.
  • PEC matrices are obtained by mixing an alginate solution with a fixed concentration of 3% (weight/volume) and a chitosan solution with 1.5% acetic acid and a variable chitosan concentration depending on the final polymer ratio desired in the matrices.
  • the alginate and chitosan solutions are homogenized by mechanical stirring and then mixed in equivalent mass proportions. After the addition of the two polyelectrolytes, the mixture is also mechanically stirred. The final PEC mixture is then placed in a culture plate, frozen for at least 24 hours at -20°C, and the matrices are freeze-dried for 24 hours. The PEC matrices are gelled for 1 hour with a 0.1M calcium chloride solution. The matrices are then rinsed, frozen and freeze-dried again.
  • This protocol allows the production of a family of 3D matrices with an alginate/chitosan ratio ranging from 80/20 to 20/80.
  • the murine macrophages used were derived from a primary culture. They were extracted from the bone marrow of C57BL6/JRj mice (Janvier Labs). Murine ASCs were obtained by enzymatic and mechanical digestion of the inguinal adipose tissue of C57BL6/JRj mice (Janvier Labs).
  • the femurs and tibias are removed and cleaned so as to remove the surrounding muscles.
  • the two epiphyses of each bone are removed and the medullary canal is washed by injection of PBS in order to recover the bone marrow cells.
  • Mechanical dissociation of the cell suspension is carried out with a pipette by successive pushing and the suspension is filtered at 40 pm and centrifuged for 10 minutes at 1500 rpm. The cell pellet is then taken up in 1 mL of ACK buffer in order to lyse the red blood cells.
  • the pellet is taken up in 9 mL of complete medium (DMEM glutamax, 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin and 1% L-glutamine) and centrifuged a second time. The final pellet is taken up in 5 mL; 10 pL are collected for trypan blue staining and counting on Malassez cells. On average, between 20 and 40 million bone marrow cells are recovered per mouse. The cells are taken up in their entirety in complete medium supplemented with M-CSF (30 ng/mL); they are seeded in petri dishes to obtain 300,000 cells/cm 2 . After 4 days of adhesion, MO macrophages (mO MO) are obtained (Martinez et al., 2006; Xia Zhang et al., 2008).
  • MO macrophages are not activated and can be polarized towards a pro-resolving M2 phenotype (m$ M2) with complete medium supplemented with M-CSF (30 ng/mL), IL-4 (10 ng/mL) and dexamethasone (10-7M) for 3 days, or towards a pro-inflammatory Ml phenotype (m ⁇ I> Ml) with complete medium supplemented with M-CSF (30 ng/mL), IFN-y (2 ng/mL) and LPS (100 ng/mL) for 24 hours.
  • Human ASCs are isolated from human adipose tissue obtained after abdominal dermolipectomies.
  • the adipose tissue is digested by mechanical and then enzymatic action.
  • the cell pellet represents the vascular stromal fraction of the adipose tissue that contains the ASCs.
  • the FSV is then cultured and the ASCs are obtained after 8 days of culture.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • M-CSF non-polarized macrophages
  • M2-Mcp pro-resolving phenotype
  • non-activated MO or polarized Ml (pro-inflammatory phenotype) or M2 (pro-resolving phenotype) macrophages are cultured for two hours. After adhesion of the macrophages, the matrices are placed in the well so that they are in direct contact with the cells. The cells or the culture supernatant are collected 24 hours later for the various analyses.
  • the seeding of the matrices in the lyophilized state is done by depositing a 15 pL cell pellet containing 400,000 macrophages. The matrix rapidly absorbs the cell pellet and is then centrifuged for 1 minute at 400 g to facilitate the penetration of the cells over the entire depth of the 3D matrices. Finally, complete medium is gently added to the edge of the well and the matrices are incubated (37°C, 5% CO2).
  • the first step is to cut the matrices into 4 in order to maximize the contact between the cells attached to the matrix and the detachment solution.
  • the samples are then incubated with a detachment solution, before filtration.
  • the debris is filtered successively through a 100 ⁇ m then 40 ⁇ m sieve, then the cell suspensions are centrifuged.
  • RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
  • the ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System kit (Promega) is used to extract mRNA following the protocol given by the supplier. The mRNAs are then assayed using the Nanodrop® (ND-1000).
  • Reverse transcription of mRNA into cDNA is performed with the “Superscript Vilo cDNA synthesis kit” (Invitrogen).
  • a pool of pure cDNA is constituted by mixing 2 pL of each sample.
  • the pool is then diluted with V5e, E10e, E20e and E40e to constitute a standard curve.
  • the remaining cDNAs are then diluted with ESe in RNAse/DNAse-free water.
  • PCR cDNA amplification is performed using the “SYBR Green I-based real-time PCR” kit (Roche) in a LightCycler® 480.
  • the sequences of the primers used are detailed in the Table below.
  • the relative expression of each gene in the samples is determined with respect to the standard curve and with respect to the housekeeping gene (Gapdh).
  • macrophages cultured in wells (2D control) and those detached from 3D matrices are analyzed by flow cytometry.
  • the cell suspensions are centrifuged, then the cell pellets are incubated in the dark for 20 minutes at 4°C in Fc block buffer (saturation of non-specific sites). Labeling is then carried out in the dark for 15 minutes at room temperature with the following antibodies diluted in FACS buffer: F4/80+ FITC Biolegend), CD206 APC (Biorad) and CD86 PE (Biolegend).
  • the cell suspensions are rinsed and centrifuged, before being incubated with Live/dead violet (miltenyibiotec).
  • the samples are taken up in 186 FACS buffer before their acquisition on the BD Fortessa cytometer (BD Biosciences). Analyses are performed using BD FACS DVIATM software (BD Biosciences).
  • Fc block buffer FACS buffer supplemented with 3% mouse serum, 3% rat serum and the anti-CD16/CD32 antibody pair at '/ O 6
  • FACS buffer PBS supplemented with 5% FCS and 5 mM EDTA G
  • ROS reactive oxygen species
  • ROS Reactive oxygen species
  • the measurement of arginase activity is determined from cell lysates by colorimetric assay of urea production.
  • mice All experiments on mice were carried out in compliance with current regulations concerning the use of animals for scientific purposes.
  • mice used in this in vivo assay are 8-week-old male C57B1/6NRJ mice (Janvier Labs). All animals are maintained on a daily cycle divided into 12 h of darkness, followed by 12 h of light at 22°C, with unlimited access to water and food.
  • a high-fat diet (HFD) for 4 months 260 HF diet, Safe is fed to the mice (Gâlvez et al., 2019). The mice are weighed at regular intervals and their blood glucose is measured in the fasting state to check for hyperglycemia.
  • mice are randomly divided into 4 groups of six mice (Figure 3A).
  • the protocol carried out extends over about ten days ( Figure 3B) and begins with the creation of a wound on day D0.
  • the mice are anesthetized using isoflurane.
  • the dorsal part and the flanks are shaved and disinfected then a circular excision of approximately 1 cm2 is carried out.
  • a non-invasive experimental device is implanted, developed by PharmaDev (FR2984719/FR2984722). It allows among other things the maintenance of the 3D matrices at the level of the wounds.
  • mice After surgery, mice are placed in a heated cage until they wake up and food is placed directly in their cage to facilitate feeding.
  • Control group 30 pL of culture medium (DMEM glutamax);
  • 3D Matrix Only group: 3D matrix sterilized by pulsed electron irradiation and hydrated in culture medium;
  • M2 macrophages alone group: 200,000 M2 polarized macrophages in vitro;
  • 3D Matrix with M2 Macrophages group: 3D matrix sterilized by pulsed electron irradiation, seeded with polarized M2 macrophages in vitro and hydrated.
  • HM 3 40 E Rotary Microtome HM 3 40 E Rotary Microtome, Thermo Scientific TM
  • HE stain hematoxylin and eosin
  • mice are randomly divided into 4 groups of five mice.
  • the protocol carried out extends over about ten days and begins with the creation of a wound on day D0 (see in vivo protocol Figure 3). After 48 hours (day D2), the first topical treatments are applied:
  • Control group 30 pL of culture medium (DMEM glutamax);
  • 3D Matrix Only group: 3D matrix irradiated with UV and hydrated in culture medium;
  • 3D matrix with M2 macrophages group: UV-irradiated 3D matrix, seeded with in vitro polarized M2 macrophages and hydrated.
  • 3D matrix with M2 macrophages and ASC UV-irradiated 3D matrix, seeded with in vitro polarized M2 macrophages and ASC and hydrated.
  • Human pro-resolving macrophages (M2-M (p: 2x10 5 cells) and human ASCs (2 x 10 5 cells) are seeded alone or in combination in the 3D matrix and are cultured. After 2 and 6 days of seeding, the cells present in the matrix are labeled with the kit "ReadyProbesTM Cell Viability Imaging Kit” (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. NucBlueTM Live reagent labels the nuclei of all cells while NucGreenTM Dead labels only the nuclei of dead cells. After 20 minutes of labeling, the matrices are washed 3 times with PBS and fluorescence is detected by confocal microscopy (LSM880, Zeiss). The total cell number as well as the number of dead cells are evaluated by automated photo analysis on Fidji (Macro developed at the Restore laboratory) (Analysis of 5 photos per condition).
  • Human ASCs (1x10 5 cells) and different populations of human Mcp (IxlO 5 cells) are seeded alone or associated in the 3D matrix. After 12h of seeding, the medium is changed and the matrices containing the cells are re-cultured and stimulated or not with LPS (10 ng/mL). After 24h of culture, the supernatants are recovered and the concentrations of IL-6, IL-ip and IL-10 are determined by ELISA following the supplier's instructions (Invitrogen).
  • This marking also provides information on the spatial distribution of the mO M2 in the matrices. No regionalization is observed. On the contrary, the m ⁇ I> M2 are distributed homogeneously both on the surface and in depth. Interestingly, after 21 days of culture, the M2 mOs still exhibit good viability in the 3D matrices.
  • 3D matrices combining alginate and PEC 40/60 chitosan constitute an optimal 3D support of M2 macrophages for cell therapy.
  • alginate-chitosan matrices on the polarization of activated macrophages towards a MO, Ml and M2 phenotype was studied.
  • alginate-chitosan matrices 40/60 were placed in contact with macrophages (mO MO, Ml or M2) for 24 hours and the level of expression of mRNAs coding for pro- and anti-inflammatory cytokines (Tnf-o., 11-10, Tgf-01) was studied ( Figure 4).
  • arginine metabolism is at the center of the different functions associated with the M1 and M2 phenotypes of macrophages (m ). Indeed, there is a competition between the oxide nitric oxide synthase (NOS) and arginase for the substrate L-arginine (Mills, 2012; Rath et al., 2014; Shearer et al., 1997). In particular, urea is frequently measured to assess the activity of arginase, an enzyme characteristic of M2 macrophages (Csonka et al., 2015). MO and M2 macrophages exhibit significantly higher urea production upon contact with 3D al inate-chitosan matrices, demonstrating greater arginase activity in these macrophages (Figure 6).
  • mice on HFD diet were checked. These values were compared to that of a "normal chow" control group consisting of C57B1/6 mice fed normally.
  • the average mass of mice on high-fat diet (HFD) was greater than that of control mice (51.5 ⁇ 0.5 g vs. 25.2 ⁇ 0.9 g).
  • HFD high-fat diet
  • a non-invasive experimental device (FR2984719/FR2984722) was implanted. Among other things, it allows the maintenance of 3D matrices at the level of the wounds. The treatments began 48 hours after having made the wounds, so as not to interfere with the inflammatory phase, the proper progress of which allows the activation of the subsequent phases of healing (Jetten et al., 2014).
  • Treatments consist of topically applying to the wound either culture medium (control group), 200,000 M2 macrophages (mî> M2) or a hydrated 3D matrix alone or seeded with 200,000 M2 macrophages. Thanks to the non-invasive experimental device, wound closure was monitored daily by taking standardized photographs, from the creation of the wound on D0 until the sacrifice of the mice on D15.
  • wound closure was determined by daily measurement of wound area for each mouse. Results are presented as percentage of wound closure relative to wound area on the day treatment began (D2) ( Figure 9).
  • the biomaterial according to the invention therefore makes it possible (i) to act as a barrier to infectious agents in the environment, (ii) upon contact with the wound to cause an orientation of the endogenous macrophages of the wound towards an anti-inflammatory phenotype but also (iii) to maintain the viability and pro-resolving functionality of the macrophages.
  • the score was determined based on the following parameters: the presence of inflammatory cells; the quality of the epidermis (continuity and thickness compared to healthy skin); the quality of the dermis (continuity, presence of hair follicles); the presence of a crust (if yes, detachment and/or presence of inflammatory cells).
  • Qualitative analysis of the slides was performed by two different operators, and scores ranging from 0 to 15 were assigned (the score is lower as the quality of the newly formed skin is high). The histological score is lower in mice treated with the 3D matrix seeded with pro-resolving macrophages.
  • Histological analysis of skin sections by hematoxylin and eosin staining reveals better quality of scar tissue in terms of continuity of the dermis and epidermis, as well as a lower presence of inflammatory cells in wounds treated with 3D matrices associated with pro-resolving macrophages.
  • tissue filling clearly shows greater tissue filling in the group receiving the matrix containing M2 macrophages and ASCs compared to the other groups.
  • M2-M(p) present in the matrix maintain a pro-resolving phenotype.
  • M2-Mcp cultured in the matrix (3D) produce more IL-10 than M2-Mcp cultured in culture plates (2D) (Fig. 17).
  • the culture of M2-Mcp on the matrix modifies their secretory profile.
  • the culture supernatants of M2-Mcp cultured in 2D do not induce the proliferation of fibroblasts
  • culture supernatants of M2-Mcp cultured on the matrix (3D) significantly induced the proliferation of human fibroblasts (Fig. 16A).
  • Similar results were obtained when M2-Mcp were co-cultured with ASCs (Fig. 16B).

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Abstract

La présente invention concerne une matrice poreuse de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d' alginate et de chitosan ou de leurs dérivés, particulièrement adaptée à la thérapie cellulaire et notamment à la cicatrisation des tissus mous et la réparation tissulaire. La matrice selon l'invention peut être avantageusement utilisée en combinaison avec des macrophages pour favoriser la cicatrisation des plaies. L'invention concerne également un biomatériau hybride comprenant une telle matrice poreuse et des macrophages pro-cicatrisants, et éventuellement des cellules stromales mésenchymateuses, et un kit comprenant cette matrice. La présente invention concerne aussi un procédé de préparation d'une telle matrice ainsi qu'un procédé de préparation d'un tel biomatériau hybride et l'utilisation d'un tel biomatériau hybride en médecine régénérative.

Description

Matrice 3D poreuse à base de complexes de polyélectrolytes et ses applications
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne une matrice 3D poreuse obtenue à base de complexes de polyélectrolytes (PEC) formés entre polymères anionique(s) et cationique(s) particulièrement adaptée à la thérapie cellulaire et notamment à la cicatrisation des tissus mous et la réparation tissulaire. La matrice selon l’invention peut être avantageusement utilisée en combinaison avec des macrophages pour favoriser la cicatrisation des plaies. L’invention concerne également un biomatériau comprenant une telle matrice poreuse et des cellules d’intérêt, telles que des macrophages et/ou des cellules stromales mésenchymateuses, et un kit comprenant cette matrice. La présente invention concerne aussi un procédé de préparation d’une telle matrice ainsi qu’un procédé de préparation d’un tel biomatériau et l’utilisation d’un tel biomatériau hybride en médecine régénérative.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
L’ingénierie tissulaire, ou médecine régénérative, a généralement recours à des cellules thérapeutiques, des substances nécessaires au développement tissulaire (molécules de signal, facteurs de croissance, etc.) et/ou des biomatériaux implantables.
De manière générale, un biomatériau implantable destiné à un ensemencement cellulaire en profondeur doit présenter des caractéristiques de biocompatibilité pour, une fois implanté, ne pas générer une réaction inflammatoire excessive. Au contraire, le matériau doit idéalement permettre l’adhésion des cellules, leur fonctionnement normal, leur migration et la production d’une nouvelle matrice extracellulaire. Le biomatériau doit également favoriser la viabilité des cellules thérapeutiques. De surcroît, le biomatériau doit présenter une structure hautement macroporeuse et interconnectée de manière à permettre la colonisation cellulaire et la diffusion de nutriments. Enfin, le matériau doit présenter des propriétés mécaniques en lien avec celles du tissu visé, de manière à reproduire un environnement biomimétique pour les cellules qu’il accueille.
Dans le cas du traitement des plaies, et notamment des plaies chroniques, des cellules thérapeutiques peuvent être utilisées. Il peut être particulièrement intéressant de les administrer via un biomatériau implantable, afin de fournir un environnement 3D protecteur assurant l’administration locale de cellules viables au niveau de la plaie ou plus généralement du tissu ou de l’organe lésé. Les plaies chroniques, et particulièrement les plaies du pied de diabétique, sont « bloquées » dans une phase inflammatoire de faible intensité, les empêchant d’accéder aux étapes ultérieures de cicatrisation et suggérant une résolution défectueuse de l’inflammation (Miao et al., 2012). Le microenvironnement physiopathologique des plaies chroniques est lui- même associé à des dérégulations fonctionnelles des macrophages. La dérégulation et perte de fonctionnalité des macrophages contribuent largement au défaut de cicatrisation des plaies chroniques dont le pied diabétique.
Ainsi, les macrophages occupent une place centrale dans l’orchestration du processus cicatriciel. De manière pertinente et adaptée au contexte de la cicatrisation où les macrophages tiennent un rôle central, il a récemment été proposé (Krzyszczyk et al., 2018) la distinction suivante : macrophages pro-inflammatoires, engagés dans l’élimination des pathogènes par phagocytose et qui sécrètent des cytokines pro-inflammatoires, des intermédiaires toxiques et des espèces réactives de l’oxygène, d’une part, et macrophages pro-cicatrisants et macrophages pro-résolutifs, impliqués dans les processus de réparation et de remodelage tissulaire, d’autre part.
Une des hypothèses les plus étayées pour expliquer le maintien de l’inflammation au niveau des plaies chroniques est l’absence de changement de phénotype (switch) des macrophages proinflammatoires vers un phénotype pro-résolutif.
Les macrophages constituent donc une cible thérapeutique de plus en plus attrayante en médecine régénérative. En effet, aux vues des dysfonctions des macrophages au niveau des plaies chroniques et de l’impact délétère de l’absence de transition d’un phénotype proinflammatoire vers un phénotype pro-résolutif, il apparaît essentiel de rétablir la fonctionnalité pro-résolutive et pro-réparatrice des macrophages.
Des travaux ont porté sur l’élaboration de stratégies de contrôle de l’inflammation au niveau des plaies chroniques par intervention plus ou moins directe sur le phénotype et l’activité des macrophages. En particulier, plusieurs approches complémentaires ont été envisagées comme la modulation du phénotype des macrophages endogènes (par promotion d’un phénotype prorésolutif ou par atténuation du phénotype pro-inflammatoire), ou directement par apport local de macrophages pro-résolutifs au niveau de la plaie.
Cependant, jusqu’à présent, aucune des stratégies thérapeutiques de cicatrisation développées impliquant des macrophages n’a permis un retour à une intégrité anatomique et fonctionnelle satisfaisante des plaies.
RESUME DE L’INVENTION
En travaillant sur la cicatrisation des plaies et notamment des plaies chroniques chez les diabétiques, les inventeurs ont développé une matrice de PEC à base de polymères anionique(s) et cationique(s) particulièrement adaptée à la cicatrisation des tissus mous et la réparation tissulaire. La matrice selon l’invention présente des propriétés mécaniques et structurelles telles qu’elle peut servir simultanément de support 3D pour des cellules, et notamment des macrophages, et de pansement. La matrice selon l’invention est particulièrement adaptée à une utilisation en association avec des macrophages pro-résolutifs. Notamment, les inventeurs ont développé une matrice de PEC alginate/chitosan pouvant être utilisée comme support de thérapie cellulaire adapté aux tissus mous.
L’invention a donc pour objet un biomatériau tridimensionnel comprenant une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d’alginate et de chitosan modifiés ou non, et des macrophages, ladite matrice présentant une macroporosité ouverte interconnectée dans laquelle le ratio massique alginate/chitosan est compris entre 20/80 et 80/20.
Dans un mode de réalisation, la matrice de PEC est à base d’alginate et de chitosan, le ratio massique alginate / chitosan étant de 40/60.
L’alginate peut notamment présenter un ratio M/G compris entre 1,4 et 2,7, préférentiellement égal à 2 +7-0,2, un poids moléculaire (Mw) compris entre 150.000 et 250.000, et un indice de polydispersité (IP) inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,5.
Le chitosan présente avantageusement un degré de déacétylation (DD A) compris entre 75% et 90%, préférentiellement entre 75 et 85%, un Mw compris entre 130.000 et 400.000, préférentiellement entre 145.000 et 400.000, plus préférentiellement entre 200.000 et 400.000, et un indice de polydispersité inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,7, plus préférentiellement d’environ 1,8.
Selon l’invention, le biomatériau peut être un biomatériau hybride comprenant des macrophages pro-cicatrisants. Les macrophages pro-cicatrisants sont par exemple des macrophages pro-résolutifs.
Dans un mode de réalisation, le biomatériau hybride comprend des macrophages procicatrisants et des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), le ratio macrophages procicatrisants / cellules stromales mésenchymateuses étant préférentiellement compris entre 1/99 et 99/1. Par exemple, le ratio macrophages pro-cicatrisants / cellules stromales mésenchymateuses est de 50/50.
L’invention a également pour objet un procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon l’invention, comprenant les étapes :
(a) cultiver des monocytes et/ou des macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages pro-cicatrisants; (b) préparer une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d’ alginate et de chitosan, dans laquelle les deux polymères sont en proportion relative comprise entre 40/60 et 60/40;
(c) éventuellement sécher la matrice de PEC ;
(d) stériliser la matrice de PEC ;
(e) ensemencer la matrice de PEC avec des macrophages pro-cicatrisants obtenus à l’étape (a) éventuellement combinés avec des CSM.
Dans un mode de réalisation, l’étape (d) de stérilisation est une stérilisation par irradiation par faisceaux d’électrons pulsés de faible énergie ou une stérilisation par irradiation par faisceaux d’électrons continus de faible énergie.
Comme indiqué ci-dessus, dans un mode de réalisation, la matrice issue de l’étape (b) subie une étape de séchage avant l’étape de stérilisation (d).
L’invention concerne également un pansement cutané destiné à la médecine régénérative comprenant un biomatériau tridimensionnel selon l’invention.
L’invention a également pour objet des macrophages pro-cicatrisants éventuellement combinés à des CSM pour leur utilisation en médecine régénérative chez un sujet, caractérisés en ce que lesdits macrophages pro-cicatrisants et les éventuels CSM sont sous une forme adaptée à leur administration audit sujet au moyen d’un biomatériau tridimensionnel selon l’invention.
De tels macrophages pro-cicatrisants éventuellement combinés à des CSM peuvent notamment être utilisés pour le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique.
Par exemple, le sujet présente un diabète et/ou est un sujet âgé.
Dans un mode de réalisation, le biomatériau tridimensionnel est sous la forme d’un pansement, d’un patch, ou d’une matrice implantable.
Lesdits macrophages pro-cicatrisants et les éventuelles CSM peuvent avoir été préalablement obtenus à partir de cellules dudit sujet parmi, des cellules de moelle osseuse, des iPS ou monocytes sanguins, et du tissu adipeux (ASC : « Adipose tissue-derived mesenchymal Stroma Cell").
L’invention a également pour objet un kit destiné à la médecine régénérative, et notamment au traitement d’une plaie, telle qu’une plaie chronique, ledit kit comprenant : une matrice de PEC d’ alginate et de chitosan, ladite matrice présentant une macroporosité ouverte interconnectée dans laquelle le ratio massique polymère anionique / polymère cationique est compris entre 20/80 et 80/20, préférentiellement entre 40/60 et 60/40; un milieu de culture adapté à la culture des monocytes ou macrophages pro-cicatrisants et/ou un milieu de culture adapté à la différenciation de cellules de moelle osseuse en macrophages de phénotype pro-cicatrisants.
Avantageusement, la matrice de PEC est stérilisée.
DESCRIPTION DES DESSINS
[Fig. 1] montre la structure chimique de l'alginate de sodium et ses unités monomères M et G (A), et un exemple de séquence de chaîne d'alginate (B).
[Fig. 2] montre la structure chimique de la chitine ou du chitosan. Lorsque R= -COCH3 et x>50% il s’agit de la chitine, et lorsque R = H et que y>60-70% il s’agit du chitosan.
[Fig. 3A] représente la répartition des différents lots étudiés dans un modèle d’étude in vivo murin de la stratégie de thérapie cellulaire des plaies chroniques.
[Fig. 3B] représente la frise chronologique de l'essai de la figure 3A et les conditions expérimentales.
[Fig. 4] montre le profil de l’expression génique de macrophage (mO) MO, Ml et M2 après 24 heures de culture ou au contact des matrices PEC 40/60. (A) Cytokines anti- et proinflammatoires. (B) Récepteurs membranaires. Les analyses ont été faites avec 3 réplicas par condition (test ANOVA à 1 facteur ; *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; *** P < 0,001 ; **** P < 0,0001). Par souci de clarté sur les graphes, seules les différences significatives entre les m<I> au contact des matrices par rapport à leur groupe de référence (m<I> en culture) sont indiquées.
[Fig. 5 AB] montre les résultats de l’étude par cytométrie en flux de l’expression des marqueurs de surface F4/80, CD206 (MR) et CD86 par les m<l» M2 après 24 heures de culture (A) ou au contact des matrices PEC 40/60 (B).
[Fig. 5C] est l’histogramme montrant les pourcentages correspondants des différentes populations F480+CD206+ et F480+CD86+ des figures 5AB (n=3 réplicas).
[Fig 6] est un diagramme montrant les concentrations en urée pour 100 000 mO MO, mO Ml ou m<I> M2 après 24 heures de culture ou au contact des matrices PEC 40/60 (m<l> : macrophage). Les analyses ont été faites avec 3 réplicas par condition (n= 3 ; test ANOVA à 1 facteur ; *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; **** P < 0,0001)
[Fig. 7] est un diagramme montrant le suivi par luminescence de la production d’espèces réactives de l’oxygène par les macrophages (m<5) MO, Ml et M2 après 24 heures de culture ou au contact des matrices 3D après stimulation par 100 mM de TPA.
[Fig 8] montre en microscopie confocale une matrice PEC 40/60 après 24 heures de culture et après marquage différentiel des cellules vivante s/mortes. L’encart en haut à gauche indique les faces imagées de la matrice. La matrice 3D dans son ensemble est présentée en (A), il s’agit d’une reconstruction 3D au grossissement xlO (10X) avec le contraste de phase et la projection en z des canaux. Les images B-C-D correspondent à la projection en z d’une coupe transversale de la matrice au 10X. Les images E-F-G puis H-I-J sont des projections en z de la matrice imagée longitudinalement respectivement au 10X et au 40X.
[Fig 9] montre la cinétique de fermeture des plaies à partir du premier jour de traitement (J2). L’analyse statistique entre le groupe matrice 3D + m<I> M2 et le groupe contrôle HFD est indiquée par * (p<0.05).
[Fig 10AB] montre des images représentatives des coupes histologiques du groupe contrôle (A) et du groupe traité par les matrices 3D + mO M2 (B).
[Fig. 10C] montre les scores histologiques associés aux images des figures 10A et 10B.
[Fig 11] montre la viabilité des différents types cellulaires (M2-Mcp humains et ASC humaines) dans la matrice après 2 jours et 6 jours de culture après marquage avec le kit « ReadyProbes™ Cell Viability Imaging Kit » (kit d’imagerie de la viabilité cellulaire) et analyse de la fluorescence par microscopie confocale.
[Fig 12] montre la fonctionnalité des M(p et ASC humains ensemencés dans la matrice à l’état basal ou après stimuli infectieux (LPS). Après 24h de culture, les concentrations d’IL-10, d’IL- 6 et d’IL-ip sont déterminées par ELISA.
[Fig 13] montre les effets d’une matrice selon l’invention ensemencée avec différentes cellules thérapeutiques murines sur la réparation des plaies chroniques. Une plaie de 1 cm2 est réalisée sur le dos de souris C57BL/6 mâles diabétiques âgées de plus de 10 mois. Les matrices seules (A) ou des matrices contenant des macrophages pro-résolutifs (M2-Mcp) + associées à des cellules stromales mésenchymateuses de tissu adipeux (ASCs) (B) sont appliquées sur la plaie. Les matrices sont placées sur la plaie pendant 24h puis remplacées par une nouvelle matrice et cela pendant 3 jours. Une photo de la plaie est prise tous les jours et les animaux sont sacrifiés lorsqu’un groupe atteint 90% de fermeture de plaie. A différent temps, la surface de la plaie est mesurée et le pourcentage de fermeture est déterminé par rapport à la surface de la plaie à JO. (C) Aire sous la courbe après les différents traitements.
[Fig 14] montre une comparaison du nombre de jour nécessaire pour fermer la plaie à 25, 50, 75, 95 et 100% entre les souris non traitées et les souris traitées avec les cellules thérapeutiques contenues dans la matrice. Le chiffre indiqué sur les histogrammes représente la différence de jours nécessaire pour fermer à plaie à X% entre les souris non traitées (histogramme noir) et les souris traitées avec la matrice seule (A), la matrice contenant des M2-Mcp (B) ou la matrice contenant des M2-Mcp associées à des ASCs (C).
[Fig 15] montre une analyse histologique des plaies après traitement avec la matrice associée à différentes cellules thérapeutiques. 10 jours post-lésion, les animaux sont sacrifiés, la peau dorsale est prélevée et une analyse histologique (marquage hémalun Eosin) est réalisée. Afin d’évaluer la fermeture de la plaie, la distance entre le paniculus camosus présent de chaque côté de la plaie est mesurée sur les coupes histologiques des souris traitées par la matrice seule (A) or par la matrice contenant des M2-M<p et des ASCs (B). (C) Analyse macroscopiques des coupes histologiques (marquage hemalun Eosin) des plaies après traitement (10 jours postlésion).
[Fig 16] montre les effets des matrices contenant différentes cellules pro-résolutives humaines sur la prolifération de fibroblastes cutanés humains. Des M2-Mcp (A) ou des M2-Mcp associées aux ASCs (M2Mq> + ASCs) (B) sont cultivés dans des plaques de culture (2D) (ligne pointillée noire) ou sur la matrice (3D) (ligne pleine noire) pendant 24h dans de l’a-MEM + 0.1 % de sérum de veau fœtal (S VF). Après 24h de culture, les surnageants sont récupérés puis ajoutés à des fibroblastes primaires humains mis en culture à faible densité. La prolifération des fibroblastes cultivés dans ces surnageants de culture est évaluée pendant 7 jours à l’aide d’un système d’imagerie en temps réel (Incucyte S3, Sartorius) Une photo de chaque puits est prise toutes les 6 heures et le taux de prolifération est analysé en comparant le pourcentage de l’aire occupée par les cellules sur chaque image à différents temps. Contrôle négatif : 0.1% SVF (ligne grise claire-rond) contrôle positif : 10% SVF (ligne grise foncé-carré)
[Fig 17] montre que la matrice favorise le profil anti-inflammatoire des macrophages. Les macrophages humains sont différentiés en macrophages anti-inflammatoires (M2-Mcp) (IL-4 pendant 24h). Puis les M2-Mcp sont mis en culture en plaque (2D) ou sur la matrice (3D). Après 24h, les surnageants de culture sont récupérés et la concentration en IL- 10 est évaluée par ELISA. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
La présente invention a trait à une matrice de complexes de polyélectrolytes particulièrement adaptée à une utilisation dans un pansement dans le cadre de la régénération tissulaire. Notamment, la matrice peut être utilisée en tant que biomatériau en combinaison avec des cellules thérapeutiques, telles que des macrophages et/ou des cellules stromales mésenchymateuses (MSC), pour aider à la cicatrisation d’une plaie.
Définitions
Dans le cadre de la présente demande, les définitions suivantes s’appliquent.
Par « matrice », on entend une structure polymérique en trois dimensions, apte à être travaillée pour prendre la forme souhaitée, en fonction de la finalité de son utilisation. Dans le contexte de l’invention, une matrice est avantageusement biocompatible et/ou biodégradable.
On entend par « biocompatible » un matériau, une matrice ou une substance qui n’interfère pas et ne dégrade pas le milieu biologique dans lequel il ou elle est utilisée.
Par « biodégradable », on entend un matériau ou une matrice capable d’être décomposé naturellement par des organismes vivants. Dans le cas d’un matériau ou d’une matrice implantable, on entend alors un matériau ou une matrice capable d’être décomposée naturellement par l’organisme dans lequel il doit être implanté.
Par « biomatériau », on entend un matériau non vivant, destiné à interagir avec un système biologique, avec une réponse de l'hôte appropriée dans une application spécifique. Dans le contexte de l’invention, un « biomatériau hybride » désigne la combinaison d’une matrice et de cellules thérapeutiques, pouvant être utilisé notamment en tant que pansement ou substitut cutané temporaire, apte à délivrer des substances thérapeutiques (molécules bioactives sécrétées par les cellules, principes actifs) et/ou à stimuler une cible cellulaire.
Les « plaies chroniques » désignent des plaies difficiles à cicatriser ou ne suivant pas le processus physiologique classique. Généralement, une plaie est considérée comme chronique si elle n’est pas parvenue à rétablir une intégrité anatomique et fonctionnelle après trois mois. On regroupe généralement dans les plaies chroniques les ulcères vasculaires (veineux et artériels), les escarres, les pieds diabétiques.
Le terme « environ » associé à une valeur numérique signifie la valeur indiquée +/- 10%, préférentiellement +/- 5%. Sauf indication contraire, lorsque des gammes sont indiquées, les valeurs aux bornes sont comprises dans lesdites gammes.
Matrice
La présente invention repose principalement sur une matrice polymérique biocompatible et avantageusement biodégradable. Plus précisément, la matrice est une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base de polymère(s) anionique(s) et de polymère(s) cationique(s). Les PEC présentent de nombreux avantages comme le maintien de la très bonne biocompatibilité des polymères (ici biosourcés) dont ils sont issus. C’est pourquoi, les PEC sont déjà classiquement utilisés en ingénierie tissulaire avec des résultats prometteurs dans ce domaine (Ishihara 2019).
La matrice est une matrice en trois dimensions (3D). Plus précisément, la matrice selon l’invention est une matrice PEC présentant une macroporosité ouverte interconnectée.
Par « macroporosité ouverte interconnectée », on entend que la matrice comprend plus particulièrement des pores de diamètre moyen compris entre 50 et 300 pm, que lesdits pores communiquent entre eux et qu’il est possible d’accéder auxdits pores depuis la surface externe de la matrice.
Selon l’invention, le ratio massique polymère anionique / polymère cationique dans la matrice est compris entre 20/80 et 80/20. Notamment, ledit ratio est d’environ 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20. Préférentiellement, ledit ratio est compris entre 35/65 et 65/35, plus préférentiellement entre 35/65 et 45/55, et notamment d’environ 40/60.
Les polymères anioniques biocompatibles sont avantageusement choisis parmi les alginates et les alginates modifiés. Les alginates forment une famille de copolymères linéaires constitués de l’enchaînement d’unités d’acide P-D-mannuronique (unité M) et d’acide a-L-guluronique (unité G), liées entre elles par des liaisons glycodisiques P (1-4). Il est possible de faire varier la rigidité des gels d’ alginate, en faisant varier le ratio M/G. Par exemple, il est possible d’utiliser de l’alginate de sodium. Les alginates modifiés s’entendent des alginates dont la structure de base est fonctionnalisée par un ou plusieurs groupements, en particulier par un ou plusieurs peptides. Par exemple, il est possible d’utiliser de l’alginate fonctionnalisé par des tripeptides RGD (L-arginine, glycine, acide L-aspartique) participant à l’adhésion cellulaire.
Les polymères cationiques biocompatibles sont avantageusement choisis parmi le chitosan, et tout dérivé du chitosan possiblement fonctionnalisé mais conservant une charge globale positive. Le chitosan est un polysaccharide constitué d’un enchaînement de groupes N-acétyl- D-glucosamine liés entre eux par des liaisons P(l-4). Les propriétés du chitosan varient notamment en fonction de sa masse moléculaire et de son degré de déacétylation (DD A).
La matrice selon l’invention peut notamment être une matrice PEC à base d’ alginate et de chitosan. Le ratio massique alginate/chitosan est compris entre 20/80 et 80/20. Préférentiellement, ledit ratio est compris entre 30/70 et 70/30, plus préférentiellement entre 35/65 et 45/55, et notamment environ de 40/60.
L’alginate utilisé peut notamment présenter un ratio M/G compris entre 1,4 et 2,7, notamment entre 1,5 et 2,5, par exemple, environ égal à 1,5, à 1,6, à 1,7, à 1,8, à 1,9, à 2, à 2,1, à 2,2, à 2,3, à 2,4, à 2,5.
Avantageusement, l’alginate présente un poids moléculaire (Mw) compris entre 150.000 et 250.000, +/- 10%, par exemple, d’environ 150.000, 155.00, 160.000, 165.000, 170.000, 175.000, 180.000, 185.000, 190.000, 195.000, 200.000, 210.000, 220.000, 230.000, 240.000, 250.000.
L’alginate peut par ailleurs présenter un indice de polydispersité (IP), préférentiellement inférieur à 2, notamment compris entre 1,9 et 1, préférentiellement d’environ 1,9, environ 1,8, environ 1,7, environ 1,6, environ 1,5, environ 1,4, environ 1,3, environ 1,2, environ 1,1, environ 1.
Le chitosan utilisé peut présenter un degré de déacétylation (DD A) compris entre 50% et 90%, notamment entre 75% et 90%, préférentiellement entre 75 et 85%.
Le poids moléculaire (Mw) du chitosan est avantageusement compris entre 100.000 et 500.000 +/- 10%,, préférentiellement entre 130.000 et 400.000, entre 140.000 et 350.000, entre 150.000 et 300.000, entre 175.000 et 270.000, entre 200.000 et 250.000, notamment environ 135.000, environ 140.000, environ 145.000, environ 150.000, environ 155.000, environ 160.000, environ 165.000, environ 170.000, environ 175.000, environ 180.000, environ 185.000, environ
190.000, environ 195.000, environ 200.000, environ 210.000, environ 220.000, environ
230.000, environ 240.000, environ 250.000, environ 260.000, environ 270.000, environ
2800.000, environ 290.000, environ 300.000, environ 350.000, environ 400.000.
L’indice de polydispersité (IP) du chitosan est préférentiellement inférieur à 2, notamment compris entre 1,9 et 1, préférentiellement d’environ 1,9, environ 1,8, environ 1,7, environ 1,6, environ 1,5, environ 1,4, environ 1,3, environ 1,2, environ 1,1, environ 1. Préférentiellement, la matrice PEC comprend de 1’ alginate et du chitosan selon les caractéristiques ci-dessus, dans un ratio massique alginate/chitosan compris entre 35/65 et 45/55, préférentiellement d’environ 40/60.
Dans le contexte de l’invention, les alginates présentent avantageusement un ratio M/G compris entre 1,4 et 2,7, préférentiellement égal à 2 +7-0,2, un poids moléculaire (Mw) compris entre 150.000 et 250.000, notamment d’environ 195.000, et un indice de polydispersité (IP) inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,5.
De même, dans le contexte de l’invention, le chitosan présente avantageusement un degré de déacétylation (DDA) compris entre 75% et 90%, préférentiellement entre 75 et 85%, un Mw compris entre 130.000 et 400.000, préférentiellement entre 140.000 et 250.000 ou entre 200.000 et 400.000, et un indice de polydispersité inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,8 ou environ 1,7.
Ainsi, dans un exemple, l’alginate utilisé peut avoir un ratio M/G de 2,1 +/-0,l, un poids moléculaire d’environ 193.100 et un indice de polydispersité d’environ 1,5. De même, le chitosan utilisé peut avoir un DDA de 80% +/-5%, un poids moléculaire d’environ 216.300 et un IP d’environ 1,8.
Dans un autre exemple, l’alginate utilisé peut avoir un ratio M/G de 1,4 +/-0,l, un poids moléculaire d’environ 162.000 et un indice de polydispersité d’environ 1,7. De même, le chitosan utilisé peut avoir un DDA de 88% +/-5%, un poids moléculaire d’environ 146.700 et un IP d’environ 1,7.
Dans un mode de réalisation particulier, la matrice PEC comprend un ratio massique alginate/chitosan compris entre 35/65 et 45/55, préférentiellement d’environ 40/60. L’alginate de la matrice a un ratio M/G de 2,1 -+7-0,1, un poids moléculaire d’environ 193.100 et un IP d’environ 1,5, et le chitosan a un DDA de 80% +/-5%, un poids moléculaire d’environ 216.300 et un IP d’environ 1,8.
La matrice selon l’invention est adaptée à l’ensemencement en profondeur et à l’immobilisation des cellules thérapeutiques et présente des propriétés absorbantes, particulièrement adaptées à l’utilisation en tant que pansement pour l’absorption des exsudats.
La matrice selon l’invention peut être préparée par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. Notamment, il est possible de mettre en œuvre le procédé de préparation décrit dans la demande WO2017/017379. Après obtention, la matrice peut être stérilisée et éventuellement séchée ou lyophilisée, ce séchage ou cette lyophilisation étant réalisés préférentiellement avant la stérilisation en vue de son utilisation ultérieure en tant que biomatériau. Avantageusement, la matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) est réalisée en mélangeant le polysaccharide anionique, tel que 1’ alginate, et le polymère cationique, tel que le chitosan, dans des proportions comprises entre 40/60 et 60/40. Notamment les polymères cationiques et le polymère anionique sont dans des proportions massiques comprises entre 40/60 et 60/40. Notamment, les polymères cationiques et le polymère anionique sont dans des proportions permettant un niveau d’interaction ionique maximal (+/-10%).
Par exemple, l’étape de préparation d’une matrice de PEC à base de chitosan et alginate comprend
- mélanger une solution d’ alginate et une solution de chitosan ;
- mouler et congeler le mélange de PEC obtenu ;
- lyophiliser le mélange de PEC ;
- gélifier la matrice de PEC lyophilisée par ajout d’une solution de CaC12 à 0,lM ;
- rincer, optionnellement recongeler puis optionnellement relyophiliser ladite matrice.
La matrice selon l’invention peut être séchée, par exemple par séchage au CO2 supercritique, et/ou lyophilisée, afin de favoriser sa conservation et son stockage avant utilisation.
La matrice selon l’invention peut avantageusement être stérilisée, préférentiellement à sec. La stérilisation peut être réalisée par tout moyen, physique ou chimique, connu de l’homme du métier et adapté aux matrices de PEC. Notamment, il est possible de stériliser la matrice par irradiation par faisceaux d’électrons pulsés de faible énergie ou par irradiation par faisceaux d’électrons continus de faible énergie. Une irradiation de faible énergie s’entend d’une énergie inférieure à 500 keV. La méthode de stérilisation décrite dans Farno et al 2021 (« Low-energy electron beam sterilization of solid alginate and chitosan, and their polyelectrolyte complexes”, Carbohydrate Polymers 261 (2021) 117578) est particulièrement adaptée.
Dans un mode de réalisation, la stérilisation est réalisée par irradiation à une dose inférieure à 5 kGy, notamment comprise entre 2 et 3 kGy, préférentiellement de 2,5 kGy, par la technologie pulsée avec une énergie de faisceaux comprise entre 200 et 350 keV, préférentiellement entre 250 et 300 keV, notamment à 280 keV.
Dans un autre mode de réalisation, la stérilisation est réalisée par irradiation à une dose comprise entre 10 et 25 kGy, préférentiellement entre 12 et 20 kGy, plus préférentiellement de 15 kGy, par la technologie pulsée avec une énergie de faisceaux comprise entre 350 et 550 keV, préférentiellement entre 400 et 450 keV. Par exemple, la stérilisation est réalisée par irradiation à une dose de 15 kGy, avec une énergie de faisceaux de 430 keV.
De telles stérilisations permettent avantageusement de conserver la porosité et l’architecture de la matrice selon l’invention.
Biomatériau hybride
L’invention a également pour objet un biomatériau combinant une matrice telle que décrite ci- dessus, et des cellules thérapeutiques et/ou des substances thérapeutiques. La matrice selon l’invention présente des propriétés mécaniques et biologiques particulièrement adaptées à la thérapie cellulaire. Notamment la matrice selon l’invention présente des propriétés favorables à l’ensemencement et la survie de cellules particulières, telles que les macrophages et les cellules stromales mésenchymateuses. En effet, la porosité générée permet un ensemencement en profondeur de la matrice, et l’architecture recrée un environnement biomimétique apte au maintien de la viabilité cellulaire, d’un phénotype particulier et/ou d’une activité métabolique.
La matrice selon l’invention est ainsi particulièrement adaptée à l’ensemencement et la survie des macrophages et/ou des cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Il est ainsi possible d’utiliser la matrice selon l’invention avec des macrophages, ou avec une combinaison de macrophages et CSM.
Il est connu que l’infection de la plaie chronique engendre d’importants retards de cicatrisation. En effet, dans 90% des plaies chroniques un biofilm se développe, ce qui représente un obstacle majeur à la cicatrisation. Ainsi, le basculement dans la phase de résolution de l’inflammation ne peut se faire que si ce biofilm est éliminé. Les macrophages pro-inflammatoires, engagés dans l’élimination des pathogènes par phagocytose et en sécrétant des cytokines proinflammatoires, des intermédiaires toxiques et des espèces réactives de l’oxygène, sont donc essentiels dans le contrôle de l’infection des plaies.
Par ailleurs, dans le processus de cicatrisation des plaies, les macrophages pro-résolutifs sont essentiels pour mettre un terme à l’inflammation et pour diriger la cicatrisation vers la phase de réparation. Dans les dernières phases de la cicatrisation, ces macrophages ont pour objectif le retour à l’homéostasie et la maturation de la peau vers son état initial. La résolution de l’inflammation est en partie activée par la phagocytose des PNN apoptotiques par les macrophages qui en conséquence sécrètent du TGF-0 et du VEGF. Les macrophages prorésolutifs produisent également l’IL-10 en forte quantité, connue comme étant immunosuppressive. De plus, ils contribuent activement à la régulation de la matrice extracellulaire (MEC) et à son remodelage en sécrétant diverses protéases comme les MMP et leurs inhibiteurs les TIMP. De même, ces macrophages interviennent dans l’apoptose des myofibroblastes pour ainsi minimiser le risque de fibrose excessive. Les macrophages prorésolutifs se caractérisent par la présence de récepteurs PRR (Pattern Recognition Receptor) capables de reconnaître les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMPs) et/ou les modèles moléculaires associés aux dangers (DAMPs).
Ainsi, la matrice selon l’invention comprend avantageusement des macrophages procicatrisants. Selon l'invention, les macrophages pro-cicatrisants désignent des macrophages pro-inflammatoires, des macrophages pro-résolutifs, ou un mélange de ceux-ci.
L’ajout dans la matrice de macrophages pro-inflammatoires/anti-bactériens et/ou de macrophages pro-résolutifs est avantageusement conditionné par les statuts infectieux et inflammatoires de la plaie à traiter. L’homme du métier est à même de décider du type de macrophages pro-cicatrisants à utiliser avec la matrice, en fonction de la plaie à traiter.
De manière particulièrement surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que la matrice selon l’invention permet de maintenir des macrophages de la matrice dans un état pro-résolutif
De manière avantageuse, la matrice selon l’invention comprenant des macrophages prorésolutifs peut permettre de forcer les macrophages endogènes, en contact avec ladite matrice, vers un phénotype pro-résolutif. Ainsi, dans le cas d’une utilisation de la matrice en tant que pansement appliqué sur une plaie, ladite matrice peut favoriser la cicatrisation en entraînant les macrophages présents au niveau de la plaie vers un phénotype pro-résolutif.
La matrice selon l’invention peut également s’utiliser avec d’autres types de cellules thérapeutiques, telles que les CSM et/ou avec des molécules thérapeutiques, et peut éventuellement être fonctionnalisée avec des antibiotiques, des substances naturelles (propolis, proanthocyanidine A). Les CSM sont particulièrement intéressantes dans le cadre du traitement des plaies, en combinaison avec des macrophages, car elles permettent d’induire un phénotype pro-résolutif des macrophages. La polarisation des macrophages vers un phénotype prorésolutif par les CSM peut concerner aussi bien les macrophages exogènes, apportés par le biomatériau, que les macrophages endogènes, présents au niveau de la plaie sur laquelle le biomatériau hybride est appliqué. De plus, les CSM, par la sécrétion de facteurs paracrines, peuvent moduler et recruter les cellules endogènes de la plaie telles que les fibroblastes et les kératinocytes et donc accélérer la fermeture de la plaie (Shingyochi, Y, 2015, Exp Opinion mol Ther ; Krzyszczyk, P, 2018, Front Physiol). Les CSM jouent également un rôle central dans la néovascularisation de la plaie en sécrétant des facteurs anti -inflammatoires mais aussi en stimulant la production de VEGF par les cellules du microenvironnement (Shingyochi, Y, 2015, Exp Opinion mol Ther ). Les CSM ont donc un fort potentiel pour accélérer le processus de fermeture des plaies par leurs propriétés anti-inflammatoires, par la stimulation de l'angiogenèse ainsi que par la production de facteurs solubles qui améliorent le microenvironnement de la plaie et favorisent ainsi la reconstruction tissulaire. Ainsi, les CMS de la matrice peuvent jouer un rôle dans les différentes phases de la cicatrisation des plaies saines ou infectées.
Les CMS utilisées peuvent être issues par exemples de tissus adipeux (ASC), de moelle osseuse, de cordon ombilical, ou dérivés d’IPS
De manière intéressante, les inventeurs ont mis en évidence que l’association entre les macrophages pro-résolutifs et les ASC augmente de manière importante le nombre de cellules viables dans la matrice.
De manière avantageuse, l’association entre les macrophages pro-résolutifs et les ASC potentialise l’activité pro-résolutive et thérapeutique des cellules ensemencées dans la matrice.
Dans un mode de réalisation particulier, le biomatériau selon l’invention comprend une matrice à base d’ alginate et de chitosan, avec avantageusement un ratio massique alginate/chitosan d’environ 40/60, et des macrophages, préférentiellement des macrophages pro-cicatrisants, notamment des macrophages pro-résolutifs.
Dans un mode de réalisation particulier, le biomatériau hybride selon l’invention comprend une matrice à base d’ alginate et de chitosan, avec avantageusement un ratio massique alginate/chitosan d’environ 40/60, des macrophages pro-cicatrisants et des cellules stromales mésenchymateuses.
Dans un mode de réalisation particulier, le biomatériau hybride selon l’invention comprend une matrice à base d’ alginate et de chitosan, avec avantageusement un ratio massique alginate/chitosan d’environ 40/60, des macrophages pro-cicatrisants, préférentiellement des macrophages pro-résolutifs, et des cellules stromales mésenchymateuses.
Dans un mode de réalisation, le biomatériau hybride selon l’invention est constitué d’une matrice telle que décrite ci-dessus et de macrophages pro-cicatrisants, préférentiellement des macrophages pro-résolutifs. Alternativement, le biomatériau hybride selon l’invention est constitué d’une matrice telle que décrite ci -dessus, de macrophages pro-résolutifs et de CSM.
Lorsque le biomatériau hybride selon l’invention contient des macrophages, la concentration volumique en cellules dans la matrice de PEC est comprise entre 800 et 8000 cellules / mm3 de matrice PEC, préférentiellement comprise entre 500 cellules et 4000 cellules / mm3 de matrice PEC. Les macrophages présentant un phénotype pro-cicatrisant, et notamment un phénotype prorésolutif, représentent préférentiellement au moins 60% en nombre des macrophages contenus dans la matrice de PEC, plus préférentiellement au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95%.
Lorsque le biomatériau hybride selon l’invention contient des cellules stromales mésenchymateuses, la concentration volumique en CSM dans la matrice de PEC est préférentiellement comprise entre 800 et 8000 CSM / mm3 de matrice PEC
Lorsque le biomatériau hybride selon l’invention contient des macrophages et des CSM, le ratio macrophages / cellules mésenchymateuses est avantageusement compris entre 1/99 et 99/1 . Par exemple, le ratio macrophages / cellules mésenchymateuses peut être de 50/50.
Le biomatériau hybride selon l’invention peut être préparé par tout procédé connu de l’homme du métier.
D’une manière générale, le procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon l’invention peut comprendre les étapes de préparation d’une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) selon l’invention, éventuellement un séchage, stérilisation de ladite matrice de PEC et ensemencement de la matrice de PEC avec les cellules thérapeutiques, notamment des macrophages pro-cicatrisants.
Notamment, une fois que la matrice telle que décrite ci-dessus est fabriquée, séchée et stérilisée, ladite matrice est ensemencée avec des cellules thérapeutiques, par mise en contact de la matrice avec un milieu de culture comprenant lesdites cellules thérapeutiques d’intérêt. Bien entendu, il est possible d’ensemencer directement la matrice selon l’invention, sans passer par une étape de séchage.
Ainsi, le procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon l’invention peut comprendre les étapes :
(a) cultiver des monocytes et/ou des macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages pro-cicatrisants ;
(b) préparer une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) alginate-chitosan, dans laquelle les deux polymères sont en proportions relatives comprises entre 40/60 et 60/40 ;
(c) éventuellement le séchage de la matrice de PEC ;
(d) avantageusement stériliser la matrice de PEC ; Y1
(d) ensemencer la matrice de PEC avec des macrophages pro-cicatrisants obtenus à l’étape (a) éventuellement combinés avec des CSM.
En fonction de l’utilisation envisagée, et notamment en fonction du stade de cicatrisation de la plaie à traiter, l’étape (a) peut comprendre la culture des macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages de phénotype pro-résolutif Par exemple, l’étape (a) de culture des macrophages comprend la culture de cellules de moelle osseuse préalablement prélevées sur un mammifère humain ou non humain, dans un milieu de culture permettant d’obtenir des macrophages naïfs, la polarisation vers un phénotype pro-résolutif en les cultivant dans un milieu de culture supplémenté en IL-4, IL- 13 et dexamethasone pendant plusieurs jours, notamment entre 2 et 10 jours, par exemple au moins 4 jours. La polarisation des macrophages vers un phénotype pro-inflammatoire est obtenue en les cultivant dans un milieu de culture supplémenté en Interféron-y et/ou LPS pendant plusieurs jours, notamment entre 2 et 10 jours, par exemple au moins 4 jours.
De manière alternative, il est possible de cultiver des iPS, des monocytes sanguins, etc., dans un milieu de culture adapté pour différencier lesdites cellules en macrophages et les polariser vers un phénotype pro-résolutif (Douthwaite H. et al. 2022 Bio Protoc.). L’homme du métier est à même d’adapter cette étape de préparation des cellules, en fonction de l’origine des cellules et de l’utilisation finale envisagée.
Si la matrice doit être ensemencée avec des macrophages pro-inflammatoires, l’étape (a) peut comprendre la culture de macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages de phénotype pro-inflammatoire. Par exemple, l’étape (a) de culture des macrophages comprend une étape de différentiation en présence de MSCF et une étape de culture de 24h en présence de cytokines inflammatoires, comme l’interféron gamma, et/ou de parois bactériennes dans un milieu défini.
Dans le cas où les cellules à ensemencer sont des CSM, l’étape (a) peut comprendre l’isolement de cellules du tissu adipeux, de moelle osseuse ou de cordon ombilical d’un mammifère humain ou non humain et leur culture dans un milieu de culture adapté. Les CSM sont obtenues après une étape de digestion du tissu. Les cellules obtenues sont mises en culture dans du milieu alpha MEM complémenté par du lysat plaquettaire humain ou du sérum de veau fœtal. Les cellules seront utilisées après au moins un passage en culture.
Bien entendu, il est possible de procéder à plusieurs étapes (a), de manière à ensemencer plusieurs types cellulaires dans la matrice.
L’étape (b) de préparation de la matrice PEC et l’étape (d) de stérilisation peuvent être réalisées comme décrit ci-dessus. Bien entendu, l’étape (a) de culture cellulaire et les étapes (b) et (d) peuvent être réalisées indépendamment et dans des périodes de temps différentes. Par exemple, il est possible de préparer la matrice et de la stériliser plusieurs heures, jours, mois, etc. avant l’étape de culture cellulaire. Avant ensemencement, les matrices peuvent être conservées à l’état lyophilisé et stérilisé dans un emballage de stérilisation.
Avantageusement, l’étape (e) d’ensemencement comprend la mise en contact la matrice de PEC lyophilisée et stérilisée avec un culot cellulaire (par exemple un culot cellulaire de macrophages et/ou de cellules mésenchymateuses) puis la centrifugation de ladite matrice avant d’ajouter du milieu complet.
Les matrices ensemencées peuvent être conservées en culture. Par exemple, les matrices ensemencées sont placées dans des boîtes de culture cellulaire multipuits, dans lesquelles on ajoute un volume de milieu, adapté selon la taille des puits et des matrices, de façon à immerger la matrice ensemencée Les boîtes sont conservées dans un incubateur à environ 37°C et 5% CO2. La durée de conservation peut dépendre du type cellulaire. Le milieu de culture peut être renouvelé à une fréquence dépendant du type cellulaire. L’homme du métier sait adapter le milieu de culture, les volumes et le renouvellement du milieu aux types cellulaires et à l’utilisation finale envisagée du biomatériau.
Dans le cas d’une matrice ensemencée de macrophages pro-résolutifs, la conservation en culture peut s’étendre sur une période de plusieurs jours, et notamment 10 jours, 15 jours, 20 jours, 21 jours ou plus, avec un taux de viabilité des macrophages très élevé.
D est également possible de congeler la matrice après ensemencement
Kit
L’invention a également pour objet un kit destiné à la médecine régénérative, et notamment au traitement d’une plaie, telle qu’une plaie chronique, ledit kit comprenant :
- une matrice de PEC à base d’ alginate et de chitosan ou leurs dérivés, telle que décrite ci- dessus ;
- un milieu de culture adapté aux cellules destinées à ensemencer la matrice.
Par exemple, le milieu de culture est adapté à la culture des macrophages pro-résolutifs et/ou des CSM.
Par exemples, les macrophages sont cultivées en RPMI 1640 complémenté, et les CSM sont cultivées dans de l’alpha-MEM complémenté. Le kit peut également comprendre un milieu de culture adapté la différenciation de cellules, telle que des cellules de moelle osseuse, des iPS, etc. en macrophages de phénotype prorésolutif et/ou pro-inflammatoire.
Avantageusement, la matrice de PEC est une matrice à base d’ alginate et de chitosan, telle que décrite ci-dessus.
La matrice de PEC est avantageusement stérilisée, et éventuellement emballée dans un emballage de stérilisation, dans lequel elle peut être conservée jusqu’à utilisation pour l’ensemencement cellulaire.
Le kit selon l’invention peut également comprendre une matrice telle que décrite ci-dessus, déjà ensemencée avec des macrophages pro-cicatrisants et éventuellement des CSM. Une telle matrice ensemencée peut être fournie congelée. Le kit peut alors comprendre un milieu adapté à la décongélation de la matrice et la survie des cellules thérapeutiques.
Selon l’invention, le kit peut comprendre une matrice telle que décrite ci-dessus, mise en forme pour être utilisée comme pansement, ou fournie avec des moyens permettant une utilisation en tant que pansement. Ainsi, le kit peut contenir une bande ou tout adhésif, pour permettre de maintenir la matrice en position sur une plaie. Dans un autre mode de réalisation, la matrice peut être fournie dans un format permettant sa découpe afin de l’adapter à la taille/la forme de la plaie.
Utilisations
La matrice selon l’invention peut être utilisée seule, ou sous forme de biomatériau, en combinaison avec des macrophages pro-cicatrisants et/ou des molécules thérapeutiques.
La matrice selon l’invention peut notamment être utilisée en tant que pansement à appliquer sur une plaie. En effet, comme indiqué ci-dessus, une telle matrice est apte à favoriser la polarisation des macrophages endogènes, présents au niveau d’une plaie à traiter par exemple, vers un phénotype pro-résolutif. Ainsi, l’application d’un pansement comprenant une telle matrice peut aider à la cicatrisation d’une plaie.
De même, il est possible d’utiliser la matrice selon l’invention en combinaison avec une ou plusieurs molécules thérapeutiques et/ou substances biologiques. Par exemple, il est possible de charger la matrice d’antibiotiques ou de substances naturelles, destinés à diminuer les risques d’infection d’une plaie sur laquelle ladite matrice est destinée à être appliquée. Il est également possible de charger la matrice de molécules aptes à favoriser un phénotype cellulaire, et notamment à favoriser le phénotype pro-résolutif pour les macrophages (par exemples, IL- 13/IL-4, dexamethasone, eicosanoides). Ainsi, lorsque la matrice est appliquée sur une plaie, lesdites molécules vont aider à la cicatrisation en favorisant la polarisation des macrophages endogènes vers un phénotype pro-résolutif.
La matrice selon l’invention peut avantageusement être utilisée en combinaison avec des macrophages et plus particulièrement des macrophages pro-résolutifs et/ou pro-inflammatoires, et/ou des CSM, en médecine régénérative, et plus particulièrement dans le cadre du traitement des plaies chroniques.
Par médecine régénérative, on entend la réparation, le remplacement ou la régénération de cellules ou tissus lésés. Selon l’invention, la réparation tissulaire et la cicatrisation des plaies cutanées sont principalement visées.
Ainsi, l’invention porte sur des macrophages pro-cicatrisants pour leur utilisation en médecine régénérative chez un sujet, lesdits macrophages cicatrisants étant sous une forme adaptée à leur administration audit sujet au moyen d’un biomatériau hybride selon l’invention. L’invention porte notamment sur des macrophages pro-résolutifs, éventuellement en combinaison avec des CSM, pour leur utilisation en médecine régénérative chez un sujet, lesdits macrophages prorésolutifs étant sous une forme adaptée à leur administration audit sujet au moyen d’un biomatériau hybride selon l’invention.
Un sujet s’entend d’un mammifère, humain ou non humain, en besoin de traitement médical, tel que le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique. Préférentiellement, le sujet est un mammifère humain, enfant, adolescent ou adulte. Préférentiellement le sujet présente une maladie limitant les mécanismes de cicatrisation et/ou est un sujet âgé. Notamment, le sujet est un diabétique, préférentiellement un diabétique de type II. Par sujet âge, on entend un mammifère humain de 70 ans ou plus.
L’invention vise particulièrement des macrophages pro-résolutifs, éventuellement en combinaison avec des CSM, dans un biomatériau hybride selon l’invention, pour leur utilisation pour le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique.
L’invention vise également des macrophages pro-inflammatoires, éventuellement en combinaison avec des CSM, dans un biomatériau hybride selon l’invention, pour leur utilisation pour le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique.
Une telle utilisation est particulièrement adaptée pour les sujets présentant une maladie limitant les mécanismes de cicatrisation, telle qu’un diabète. Lesdits macrophages pro-cicatrisants et/ou CSM peuvent être obtenus à partir de cellules dudit sujet telles que des monocytes sanguins, des CSM du tissu adipeux, de la moelle osseuse ou de cordon ombilical, des macrophages, des cellules de la moelle osseuse et/ou des iPS.
Avantageusement, le biomatériau tridimensionnel est sous la forme d’un pansement d’un patch, ou d’une matrice implantable.
L’invention vise également l’utilisation d’un biomatériau selon l’invention, notamment sous forme de pansement ou de matrice implantable, en médecine régénérative. Notamment, l’invention vise l’utilisation d’un tel biomatériau selon laquelle ledit biomatériau est mis en contact avec un tissu lésé, tel qu’une plaie cutanée.
L’invention vise également une méthode de traitement d’un tissu lésé selon laquelle un biomatériau tel que décrit ci -dessus est appliqué contre le tissu lésé pour favoriser la réparation dudit tissu. Notamment, l’invention vise une méthode de traitement d’une plaie, et particulièrement d’une plaie chronique, selon laquelle ledit biomatériau est appliqué contre la plaie pour favoriser la cicatrisation. Dans un tel cas, le biomatériau hybride contient avantageusement des macrophages pro-cicatrisants et notamment des macrophages prorésolutifs, éventuellement en combinaison avec des CSM. Le biomatériau peut être appliqué sous la forme d’un pansement apte à être maintenu sur la plaie.
L’invention vise également l’utilisation de macrophages pour la préparation d’un biomatériau selon l’invention, pour le traitement d’un tissu lésé. Notamment, l’invention vise l’utilisation de macrophages pour la préparation d’un biomatériau selon l’invention, pour le traitement d’une plaie, plus particulièrement d’une plaie chronique, telle qu’une plaie chronique de diabétique.
EXEMPLES
MATERIEL ET METHODES
A) Matrice
Les polymères utilisés sont un alginate « medium viscosity » commercialisé chez Sigma (référence A-2033 ; lot 051M0054V) ou chez Algaia (Satialgine XPS 170NS) et un chitosan « medium molecular weight » également fourni par Sigma (référence 448877 , lot STBF8484V ou lot BCCJ1419).
Pour 1’ alginate de chez Sigma, un ratio M/G de 2,1 a été déterminé par la méthode décrite par Vilén et al. (Vilén et al., 2011). La masse moléculaire moyenne en masse (Mw) et en nombre (Mn) de l’alginate ont été déterminées par chromatographie d’exclusion stérique et sont respectivement de 193 100 et 126 900 g/mol avec un indice de polydispersité de 1,5.
Pour le chitosan, le degré de déacétylation (DD A) a été calculé en appliquant la méthode de Heux et al. (Heux et al., 2000) et a été estimé à 80% +/-5%. Les valeurs Mw et Mn obtenues par chromatographie d’exclusion stérique sont respectivement de 216 300 et 120 300 g/mol avec un indice de polydispersité de 1,8, pour l’alginate du lot STBF8484V. Pour le second alginate, les valeurs Mw et Mn obtenues par chromatographie d’exclusion stérique sont respectivement de 146 700 et 86 500 g/mol avec un indice de polydispersité de 1,7.
Les matrices de PEC sont obtenues par mélange d’une solution d’ alginate de concentration fixe de 3% (poids/volume) et d’une solution de chitosan avec 1,5% d’acide acétique et de concentration en chitosan variable selon le ratio de polymère final voulu dans les matrices.
Brièvement, les solutions d’ alginate et de chitosan sont homogénéisées par agitation mécanique puis sont mélangées en proportions massiques équivalentes. Après l’ajout des deux polyélectrolytes, le mélange est également mis sous agitation mécanique. Le mélange final de PEC est alors mis en plaque de culture, congelé au moins 24 heures à -20°C, puis les matrices sont lyophilisées 24 heures. Les matrices de PEC sont gélifiées pendant 1 heure avec une solution de chlorure de calcium 0, lM. Les matrices sont ensuite rincées, congelées et de nouveau lyophilisées.
Ce protocole permet l’obtention d’une famille de matrices 3D de ratio alginate/chitosan allant de 80/20 à 20/80.
B) Cellules
Les macrophages murins utilisés sont issus d’une culture primaire. Ils sont extraits de la moelle osseuse de souris C57BL6/JRj (Janvier Labs). Les ASC murines sont obtenues par digestion enzymatique et mécanique du tissu adipeux inguinal des souris C57BL6/JRj (Janvier Labs).
Après euthanasie des souris par surdose de gaz carbonique, les fémurs et les tibias sont prélevés et nettoyés de telle sorte à retirer les muscles environnants. Après une désinfection des os dans de l’éthanol 70%, les deux épiphyses de chaque os sont enlevées puis le canal médullaire est lavé par injection de PBS afin de récupérer les cellules de la moelle osseuse. Une dissociation mécanique de la suspension cellulaire est effectuée à la pipette par refoulages successifs puis la suspension est filtrée à 40pm et centrifugée 10 minutes à 1500 rpm. Le culot cellulaire est alors repris dans 1 mL de tampon ACK afin de lyser les globules rouges. Le culot est repris dans 9 mL de milieu complet (DMEM glutamax, 10% SVF, 1% pénicilline/streptomycine et 1% L- glutamine) et centrifugé une seconde fois. Le culot final est repris dans 5 mL ; 10 pL sont prélevés pour le marquage au bleu trypan et comptage sur cellule de Malassez. En moyenne, on récupère entre 20 et 40 millions de cellules de la moelle osseuse par souris. Les cellules sont reprises en totalité dans du milieu complet supplémenté en M-CSF (30 ng/mL) ; elles sont ensemencées en boîte de pétri de manière à avoir 300 000 cellules/cm2. Après 4 jours d’adhésion, on obtient des macrophages MO (mO MO) (Martinez et al., 2006 ; Xia Zhang et al., 2008).
Quatre jours après leur isolation et différenciation, les macrophages MO ne sont pas activés et peuvent être polarisés vers un phénotype pro-résolutif M2 (m$ M2) avec un milieu complet supplémenté en M-CSF (30 ng/mL), IL-4 (10 ng/mL) et dexamethasone (10-7M) pendant 3 jours, ou vers un phénotype pro-inflammatoire Ml (m<I> Ml) avec un milieu complet supplémenté en M-CSF (30 ng/mL), IFN-y (2 ng/mL) et LPS (100 ng/mL) pendant 24 heures.
Les ASCs humaines sont isolées à partir de tissu adipeux humain obtenu après dermolipectomies abdominales. Le tissu adipeux est digéré par action mécanique puis enzymatique. Le culot cellulaire représente la fraction stromale vasculaire du tissu adipeux qui contient les ASCs. La FSV est mise ensuite en culture et les ASC sont obtenues après 8 jours de culture.
Les monocytes humains sont isolés à partir de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) obtenus à partir de concentrés leucocytaires obtenus de différents donneurs sains. Les PB MC sont isolés par centrifugation sur gradient de Ficoll. L’anneau de PBMC est collecté et les monocytes sont isolés par adhérence ou après tri magnétique. Après une semaine de culture, les macrophages obtenus sont stimulés pendant 24 heures soit avec 100 ng/mL de M-CSF pour obtenir des macrophages non polarisés (MO-Mcp) ou 20 ng/mL d’IL-4 pour induire un phénotype pro-résolutif (M2-Mcp).
C) Ensemencement
Pour récupérer les macrophages, le milieu de culture est retiré et remplacé par du PB S froid contenant 2 mM d’EDTA, un chélateur de calcium. Après 5 minutes sur glace, les macrophages sont délicatement décollés à l’aide d’un râteau. La suspension est centrifugée 5 minutes à 1500 rpm, avant d’être marquée au bleu trypan pour le comptage sur cellule de Malassez.
Dans les expériences de mise au contact des matrices 3D, les macrophages non activés MO ou polarisés Ml (phénotype pro-inflammatoire) ou M2 (phénotype pro-résolutif) sont mis en culture pendant deux heures. Après adhésion des macrophages, les matrices sont déposées dans le puits de manière à ce qu’elles soient en contact direct avec les cellules. Les cellules ou le surnageant de culture sont récupérés 24 heures après pour les différentes analyses. Pour l’essai in vitro, l’ensemencement des matrices à l’état lyophilisé se fait par dépôt d’un culot cellulaire de 15 pL contenant 400 000 macrophages. La matrice absorbe rapidement le culot cellulaire puis est centrifugée 1 minute à 400 g afin de faciliter la pénétration des cellules sur toute la profondeur des matrices 3D. Enfin, du milieu complet est rajouté délicatement sur le bord du puits et les matrices sont incubées (37°C, 5% CO2).
D) Récupération des macrophages après ensemencement dans les matrices 3D
La première étape consiste à découper les matrices en 4 afin de maximiser le contact entre les cellules attachées à la matrice et la solution de détachement.
Les échantillons sont ensuite incubés avec une solution de détachement, avant filtration. La filtration des débris successivement sur un tamis de 100 pm puis de 40 pm, puis la centrifugation des suspensions cellulaires.
E) Étude de l’expression génique par RT -PCR
La Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT -PCR) se déroule en trois étapes successives : l’extraction de l’ARN messager des cellules, la transcription inverse de l’ARNm en ADNc puis la réaction d’amplification de l’ ADNc par PCR. Au préalable, les macrophages ensemencés dans les matrices 3D ont été détachés. Le culot de macrophages détachés ainsi que les macrophages cultivés en puits (contrôles dits « 2D ») sont congelés à -80°C dans lOOpl de tampon de lyse (Promega).
Extraction de l’ARNm
Le kit « ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System » (Promega) est utilisé pour extraire l’ARNm en suivant le protocole donné par le fournisseur. Les ARNm sont ensuite dosés au Nanodrop® (ND-1000).
Transcription inverse
La transcription inverse des ARNm en ADNc est réalisée avec le kit «Superscript Vilo cDNA synthesis kit» (Invitrogen). Pour chaque expérience, un pool d’ADNc pur est constitué en mélangeant 2 pL de chaque échantillon. Le pool est ensuite dilué au V5e, É10e, É20e et É40e pour constituer une courbe standard. Les ADNc restants sont alors dilués au ÉSe dans de l’eau sans RNAse/DNAse.
PCR L’amplification des ADNc est effectuée à l’aide du kit « SYBR Green I-based real-time PCR » (Roche) dans un LightCycler® 480. Les séquences des amorces utilisées sont détaillées dans le Tableau ci-dessous. L’expression relative de chaque gène dans les échantillons est déterminée par rapport à la courbe standard et par rapport au gène de ménage (Gapdh).
[Table 1]
F) Étude des marqueurs de surface par cytométrie en flux
Afin d’étudier l’expression de certains marqueurs de surface, les macrophages cultivés en puits (contrôle 2D) et ceux détachés des matrices 3D sont analysés par cytométrie en flux. Les suspensions cellulaires sont centrifugées, puis les culots cellulaires sont incubés à l’obscurité 20 minutes à 4°C dans du tampon Fc block (saturation des sites non spécifiques). Le marquage est ensuite réalisé à l’obscurité pendant 15 minutes à température ambiante avec les anticorps suivants dilués dans du tampon FACS : F4/80+ FITC Biolegend), CD206 APC (Biorad) et CD86 PE (Biolegend). Puis les suspensions cellulaires sont rincées et centrifugées, avant d’être incubées avec du Live/dead violet (miltenyibiotec). Enfin les échantillons sont repris dans du 186 tampon FACS avant leur acquisition au cytomètre BD Fortessa (BD Biosciences). Les analyses sont réalisées à partir du logiciel BD FACS DVIA™ (BD Biosciences).
Tampon Fc block : tampon FACS supplémenté par 3% de sérum de souris, 3% de sérum de rat et le couple d’anticorps anti-CD16/CD32 au '/ O6
Tampon FACS : PBS supplémenté par 5% SVF et 5 mM EDTA G) Quantification de la production des espèces réactives de l’oxygène (ROS)
La production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les macrophages ensemencés ou non dans les matrices de PEC 40/60 a été mesurée par chimioluminescence en présence de 5-amino- 2,3-dihydro-l,4- phtalazinedione (luminol) à l’aide d’un luminomètre (Envision, PerkinElmer). La génération de la chimioluminescence a été surveillée en continu pendant 30 minutes après l’incubation des cellules et/ou des matrices biopolymériques avec du luminol (66 pM) puis pendant 1 heure après stimulation à l’acétate de tétradécanoylphorbol (TPA ; 100 nM). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide de l’aire sous la courbe exprimée en nombre x secondes.
H) Etude de l’activité de 1’ arginase
La mesure de l’activité de l’arginase est déterminée à partir des lysats cellulaires par dosage colorimétrique de la production d’urée.
I) Protocole expérimental in vivo
Toutes les expériences sur les souris ont été réalisées dans le respect de la règlementation en vigueur concernant l’utilisation des animaux à des fins scientifiques.
Les souris utilisées dans cet essai in vivo sont des souris C57B1/6NRJ mâles âgées de 8 semaines (Janvier Labs). Tous les animaux sont maintenus selon un cycle journalier divisé en 12 heures d’obscurité, suivies de 12h de luminosité à 22°C, avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture. Afin d’induire un diabète de type II, un régime hyperlipidique (HFD) pendant 4 mois (régime 260 HF, Safe) est donné aux souris (Gâlvez et al., 2019). Les souris sont pesées à intervalles réguliers et leur glycémie est mesurée à jeun afin de vérifier leur hyperglycémie.
Pour le premier protocole, les souris sont réparties aléatoirement en 4 groupes de six souris (Figure 3A). Le protocole réalisé s’étend sur une dizaine de jours (Figure 3B) et commence par la réalisation d’une plaie au jour J0. Pour ce faire, les souris sont anesthésiées à l’aide d’isoflurane. La partie dorsale et les flancs sont tondus et désinfectés puis une excision circulaire d’environ 1 cm2 est réalisée. Immédiatement après, un dispositif expérimental non invasif est implanté, mis au point par PharmaDev (FR2984719/FR2984722). Il permet entre autre le maintien des matrices 3D au niveau des plaies.
Après l’opération, les souris sont placées dans une cage chauffée jusqu’à leur réveil et de la nourriture est placée directement dans leur cage pour faciliter la prise de nourriture.
Après 48 heures (jour J2), les premiers traitements topiques sont appliqués : Groupe contrôle : 30 pL de milieu de culture (DMEM glutamax) ;
Groupe « Matrice 3D seule » : matrice 3D stérilisée par irradiation par électrons pulsés et hydratée dans du milieu de culture ;
Groupe « Macrophages M2 seuls » : 200 000 macrophages polarisés M2 in vitro ;
Groupe « Matrice 3D avec macrophages M2 » : matrice 3D stérilisée par irradiation par électrons pulsés, ensemencée de macrophages polarisés M2 in vitro et hydratée.
Ces traitements sont laissés 24 heures et sont renouvelés deux fois, aux jours J3 et J4.
Le jour du sacrifice des souris, des expiants de peau sont prélevés puis inclus en paraffine. Après coupe au microtome (HM 340E Rotary Microtome, Thermo Scientific ™), les coupes sont colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (coloration HE). Enfin, les lames sont scannées pour analyse (NanoZoomer Digital Pathology, Hamamatsu).
Pour le deuxième protocole in vivo, les souris sont réparties aléatoirement en 4 groupes de cinq souris. Le protocole réalisé s’étend sur une dizaine de jours et commence par la réalisation d’une plaie au jour J0 (cf protocole in vivo Figure 3). Après 48 heures (jour J2), les premiers traitements topiques sont appliqués :
Groupe contrôle : 30 pL de milieu de culture (DMEM glutamax) ;
Groupe « Matrice 3D seule » : matrice 3D irradiée aux UV et hydratée dans du milieu de culture ;
Groupe « Matrice 3D avec macrophages M2 » : matrice 3D irradiée aux UV, ensemencée de macrophages polarisés M2 in vitro et hydratée.
Groupe « Matrice 3D avec macrophages M2 et ASC » : matrice 3D irradiée aux UV, ensemencée de macrophages polarisés M2 in vitro et d’ ASC et hydratée.
Ces traitements sont laissés 24 heures et sont renouvelés deux fois, aux jours J3 et J4.
Viabilité des macrophages humains et des ASC humaines dans la matrice
Des macrophages pro-résolutifs humains (M2-M(p : 2xl05 cellules) et des ASCs humaines (2 x 105 cellules) sont ensemencées seuls ou en combinaison dans la matrice 3D et sont mises en culture. Après 2 et 6 jours d’ensemencement, les cellules présentes dans la matrice sont marquées avec le kit un « ReadyProbes™ Cell Viability Imaging Kit » (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Le réactif NucBlue™ Live marque les noyaux de toutes les cellules alors que le NucGreen™ Dead marque uniquement les noyaux des cellules mortes. Après 20 minutes de marquage, les matrices sont lavées 3 fois au PBS et la fluorescence est détectée par microscopie confocale (LSM880, Zeiss). Le nombre de cellules total ainsi que le nombre de cellules mortes sont évaluées par une analyse automatisée des photos sur Fidji (Macro développée au laboratoire Restore) (Analyse de 5 photos par condition).
Mesure de la production de cytokines par les macrophages humains et des ASC humaines ensemencés dans la matrice
Des ASC humaines (1x105 cellules) et différentes populations de Mcp humains (IxlO5 cellules) sont ensemencées seules ou associées dans la matrice 3D. Après 12h d’ensemencement, le milieu est changé et les matrices contenant les cellules sont remises en culture et stimulées ou non avec du LPS (10 ng/mL). Après 24h de culture, les surnageants sont récupérés et les concentrations d’IL-6, d’IL-ip et d’IL-10 sont déterminées par ELISA suivant les instructions du fournisseur (Invitrogen).
RESULTATS
A) Analyse de la rétention, de la viabilité et répartition des macrophages dans les matrices 3D
Pour valider les matrices 3D comme supports de macrophages M2 pro-résolutifs pour la thérapie cellulaire, la rétention, la viabilité et la répartition de ces macrophages au sein des matrices 3D ont été étudiés. Le taux de rétention des mO M2 après ensemencement a été évalué par quantification des protéines totales extraites.
Les résultats montrent que le taux de rétention est élevée (environ 85%).
L’étude de la viabilité des macrophages M2 au sein de la matrice 3D PEC40/60 a été suivie qualitativement par microscopie confocale en « live imaging ». Les matrices 3D hydratées ont été imagées longitudinalement et transversalement (Figure 8). L’analyse des reconstructions a permis de montrer une viabilité des macrophages M2 de 89±3% après 24 heures d’ensemencement dans la matrice 3D.
Ce marquage informe également sur la répartition spatiale des mO M2 dans les matrices. Aucune régionalisation n’est constatée. Bien au contraire, les m<I> M2 se répartissent de manière homogène autant en surface qu’en profondeur. De façon intéressante, après 21 jours de culture, les mO M2 présentent toujours une bonne viabilité dans les matrices 3D.
En conclusion, les matrices 3D associant l’alginate et le chitosan PEC 40/60 constituent un support 3D optimal de macrophages M2 pour la thérapie cellulaire.
B) Effet de la matrice selon l’invention sur le phénotype des macrophages
L’effet des matrices 3D alginate-chitosan (sur la polarisation de macrophages activés vers un phénotype MO, Ml et M2 a été étudié. Pour ce faire des matrices alginate-chitosan (40/60) ont été mises au contact de macrophages (mO MO, Ml ou M2) pendant 24 heures et le niveau d’expression des ARNm codant pour les cytokines pro- et anti-inflammatoires (Tnf-o., 11-10, Tgf-01) a été étudié (Figure 4). L’expression génique et protéique de récepteurs membranaires caractéristiques des phénotypes Ml (Cd86) et M2 (Cd206, Cd36) a également été étudiée (Figure 4 et Figure 5).
Cette première caractérisation phénotypique a ensuite été complétée par des analyses fonctionnelles comme l’étude du métabolisme de l’arginine ou encore la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS).
Tout d’abord, ces analyses ont permis de valider la polarisation MO, Ml ou M2 des macrophages en culture après leur isolation de la moelle osseuse et traitement par différents inducteurs. De plus, elles montrent qu’au contact des matrices 3D alginate-chitosan les macrophages s’orientent vers un phénotype M2. En effet, les matrices 3D alginate-chitosan semblent d’une part potentialiser le phénotype des macrophages M2 en augmentant l’expression de marqueurs M2 (11-10, Tgf-pi, Cd206, Cd36) et en diminuant l’expression de marqueurs Ml (Tnf-a, Cd86) ; et d’autre part orienter les macrophages non activés MO vers un phénotype M2. De manière tout aussi intéressante, les macrophages Ml au contact des matrices présentent une expression plus faible des marqueurs pro-inflammatoires caractéristiques des macrophages Ml (Tnf-a et le Cd86).
L’ensemble de ces résultats démontre que le contact des macrophages M2 avec les matrices 3D alginate-chitosan ne modifie pas leur phénotype. De plus, les matrices semblent orienter les macrophages MO et Ml vers un phénotype M2 et potentialiser le phénotype M2 des macrophages M2.
Dans un but d’explorer l’impact des matrices alginate-chitosan sur les fonctions effectrices des macrophages le métabolisme de l’arginine (Figure 6) et le stress oxydant (Figure 7) ont été évalués. Le métabolisme de l’arginine est au centre des différentes fonctions associées aux phénotypes Ml et M2 des macrophages (m ). En effet, il existe une compétition entre l’oxyde nitrique synthase (NOS) et l’arginase pour le substrat L-arginine (Mills, 2012 ; Rath et al., 2014 ; Shearer et al., 1997). Notamment, l’urée est fréquemment dosée pour évaluer l’activité de l’arginase, enzyme caractéristique des macrophages M2 (Csonka et al., 2015). Les macrophages MO et M2 présentent une production d’urée significativement plus forte au contact des matrices 3D al inate-chitosan, démontrant une activité plus importante de l’arginase au niveau de ces macrophages (Figure 6).
Concernant la production de ROS, comme attendu, la capacité des macrophages Ml à produire des ROS est plus importante que celle des macrophages MO et M2 après stimulation au TPA. Cette capacité à produire des ROS est fortement diminuée dans les macrophages Ml et M2 mis en contact avec les matrices (Figure 7). Ces résultats montrent que les matrices 3D alginate- chitosan sont capables d’orienter les fonctions des macrophages MO et Ml vers des fonctions caractéristiques des macrophages M2 et de potentialiser les fonctions spécifiques des macrophages M2.
Pour conclure, l’ensemble de ces premiers résultats ont permis de mettre en évidence le maintien du phénotype et des fonctions des macrophages M2 par les matrices 3D selon l’invention. De plus, les matrices 3D semblent orienter les macrophages MO vers un phénotype M2 et atténuer la polarisation Ml .
C) Étude in vivo de l’association macrophages pro-résolutifs / matrices 3D sur un modèle murin de plaie dans un contexte de diabète de type 2 selon le premier protocole
Avant la réalisation des plaies, la glycémie à jeun ainsi que le poids des souris mises sous régime HFD ont été vérifiées. Ces valeurs ont été comparées à celle d’un groupe contrôle « normal chow » constitué de souris C57B1/6 alimentées normalement. La masse moyenne des souris sous régime hyperlipidique (HFD) est plus importante que celle des souris contrôles (51,5 ± 0,5 g vs 25,2 ± 0,9 g). Quant à leur glycémie à jeun, elle atteint une valeur significativement plus élevée que celle du groupe contrôle (183,2 ± 6,3 mg/dl vs 128,3 ± 4,5 mg/dl). Une fois ce modèle validé, des plaies cutanées ont été réalisées sur partie dorsale par excision circulaire d’environ 1 cm2. Immédiatement après, un dispositif expérimental non invasif (FR2984719/FR2984722) a été implanté. Il permet entre autres le maintien des matrices 3D au niveau des plaies. Les traitements ont débuté 48 heures après avoir réalisé les plaies, de manière à ne pas interférer avec la phase inflammatoire, dont le bon déroulement permet l’activation des phases ultérieures de la cicatrisation (Jetten et al., 2014).
Les traitements consistent à appliquer topiquement sur la plaie soit du milieu de culture (groupe contrôle), 200 000 macrophages M2 (mî> M2) ou une matrice 3D hydratée seule ou ensemencée avec 200 000 macrophages M2. Grace au dispositif expérimental non invasif, la fermeture des plaies a été suivie quotidiennement par prise de photographies standardisées, depuis la réalisation de la plaie à JO jusqu’au sacrifice des souris à J15.
D’un point de vue quantitatif, la fermeture des plaies a été déterminée par mesure quotidienne de la surface des plaies pour chaque souris. Les résultats sont présentés en pourcentage de fermeture des plaies par rapport à la surface de celles-ci le jour où le traitement est commencé (J2) (Figure 9).
On peut ainsi constater que l’ajout local de macrophages M2 au niveau des plaies n’améliore pas la fermeture de la plaie. De façon intéressante, l’application des matrices 3D seules hydratées accélère la fermeture de la plaie avec un effet significatif plutôt aux stades précoces (J4 à J7). Ce résultat corréle avec l’orientation des macrophages MO vers un phénotype M2 et l’atténuation du profil Ml constatés lors de la mise en contact des macrophages avec les matrices 3D. Dès J4 et jusqu’à J15, l’application des matrices 3D ensemencées de macrophages M2 accélère significativement la fermeture des plaies par rapport au groupe contrôle.
Ainsi, l’effet bénéfique pro-cicatrisant des matrices seules est potentialisé par l’ajout de macrophages M2. Ces résultats montrent que l’association des matrices PEC 40/60 à des macrophages pro-résolutifs permet une fermeture des plaies plus rapide. L’association de la matrice selon l’invention à des macrophages pro-résolutifs montre un effet synergique sur la fermeture des plaies.
Le biomatériau selon l’invention permet donc (i) < ’agir comme une barrière aux agents infectieux de l’environnement, (ii) au contact de la plaie d’entrainer une orientation des macrophages endogènes de la plaie vers un phénotype anti-inflammatoire mais aussi (iii) de maintenir la viabilité et la fonctionnalité pro-résolutive des macrophages.
D) Evaluation de la qualité cicatricielle
Afin d’investiguer la qualité de la peau néoformée, des colorations à l’hématoxyline et à l’éosine sur des coupes histologiques réalisée à J15 ont été réalisées. Plusieurs scores ont été mis au point afin d’ homogénéiser l’analyse qualitative des coupes de peau après cicatrisation (Gantwerker & Horn, 2011 ; Gupta & Kumar, 2015) (Figure 10).
Le score a été déterminé sur la base des paramètres suivants : la présence de cellules inflammatoires ; la qualité de l’épiderme (continuité et épaisseur par rapport à la peau saine) ; la qualité du derme (continuité, présence de follicules pileux) ; la présence d’une croûte (si oui, détachement et/ou présence de cellules inflammatoires). L’analyse qualitative des lames a été réalisée par deux opérateurs différents, et des scores allant de 0 à 15 ont été attribués (le score est d’autant plus faible que la qualité de la peau néoformée est élevée). Le score histologique est plus faible chez les souris ayant été traitées par la matrice 3D ensemencée par les macrophages pro-résolutifs.
L’analyse histologique des coupes de peau par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine révèle une meilleure qualité du tissu cicatriciel en termes de continuité du derme et de l’épiderme, ainsi qu’une moindre présence de cellules inflammatoires au niveau des plaies traitées par les matrices 3D associées à des macrophages pro-résolutifs.
E) Viabilité et fonctionnalité des différents types cellulaires associés (M2-Mcp humains et ASC humaines) dans la matrice
Les résultats montrent que, bien que les macrophages et les ASC aient été ensemencés en quantité identique, dès J2 les ASC sont présentes en plus grand nombre, révélant ainsi une viabilité un peu plus importante que les M2-M<I>. De manière très intéressante, l’association entre les deux types cellulaires augmente de manière significative le nombre des deux types cellulaires ainsi que leur viabilité dans la matrice (Figure 11).
De manière très intéressante, les résultats montrent que l’association entre les ASCs et les différents types de macrophages induit une production plus importante d’IL-10 et une production explosive d’IL-6, deux cytokines jouant un rôle central dans la résolution de l’inflammation et dans la réparation tissulaire. En présence de LPS, l’induction de la production d’IL-lbeta par les macrophages de la matrice est fortement inhibée par le co-ensemencement avec les ASC (Figure 12).
L’ensemble de ces résultats démontrent l’intérêt d’associer les macrophages et les ASC dans la matrice pour augmenter leur viabilité et promouvoir un environnement pro-résolutif et réparateur.
F) Etude in vivo de l’association macrophages pro-résolutifs / ASC dans la matrice 3D sur un modèle murin de plaie dans un contexte de diabète de type 2
Suite aux résultats obtenus précédemment (C-E), un deuxième protocole in vivo murin a été réalisé pour évaluer l’effet de l‘association des Macrophages M2 avec les ASC dans la matrice sur la cicatrisation dans un contexte de diabète de type 2. Grâce au dispositif expérimental non invasif utilisé précédemment, la fermeture des plaies a été suivie quotidiennement par prise de photographies standardisées, depuis la réalisation de la plaie à JO jusqu’au sacrifice des souris à J14. D’un point de vue quantitatif, la fermeture des plaies a été déterminée par mesure quotidienne de la surface des plaies pour chaque souris. Les résultats sont présentés en pourcentage de fermeture des plaies à J14 (jour du sacrifice) par rapport à la surface de celles-ci le jour où la plaie est réalisée. Comme attendu (Figure 9), l’application des matrices 3D ensemencées de macrophages M2 améliore la fermeture des plaies par rapport au groupe contrôle. De façon intéressante, l’association des macrophages M2 avec les ASC augmente significativement le pourcentage de fermeture de la plaie à J14 par rapport aux souris n’ayant reçu aucun traitement.
De plus, la quantification du tissu de comblement montre clairement un tissu de comblement plus important dans le groupe ayant reçu la matrice contenant les macrophages M2 et les ASC par rapport aux autres groupes.
Ainsi, l’effet bénéfique pro-cicatrisant des matrices ensemencées de macrophages M2 semble être potentialisé par l’ajout d’ASC. Ces résultats montrent que l’association des matrices PEC 40/60 à des macrophages pro-résolutifs et des ASC permet un comblement des plaies et une fermeture plus rapide.
G) Étude in vivo de l’effet de la matrice 3D selon l’invention ensemencée avec différentes cellules thérapeutiques sur la réparation (fermeture) de plaies chroniques selon le second protocole
Le traitement des plaies de souris diabétiques avec la matrice seule ne modifie pas la vitesse de fermeture de la plaie (Fig. 13A) ni la taille de la plaie par rapport aux souris non traitées (Fig. 15A. Par contre, l’association des M2-M(p avec les ASCs dans la matrice induit une amélioration significative de la vitesse de fermeture de la plaie (Fig 13B), une diminution de la taille de la plaie (Fig. 15B) et une amélioration la qualité du tissu reconstruit (Fig.l5C). En effet, ce traitement induit la présence d’un tissu de granulation stable, très vascularisé avec une inflammation réduite. De plus, on constate un pontage du tissu superficiel mais également en profondeur (Fig 15C).
Le temps nécessaire pour que la plaie soit complètement refermée en fonction des traitements a également été comparé. La fermeture complète des plaies traitées avec les matrices contenant des M2-M(p a lieu 4 jours plus tôt que les plaies non traitées. Le traitement des plaies avec les matrices contenant les M2-Mcp et des ASCs induisent leur fermeture complète 6 jours plus tôt que les plaies non traitées (Fig.14).
Les M2-M(p présents dans la matrice conservent un phénotype pro-résolutifs. En effet, les M2- Mcp cultivées dans la matrice (3D) produisent plus d’IL-10 que les M2-Mcp cultivés en plaque de culture (2D) (Fig.17). De plus, la culture des M2-Mcp sur la matrice modifie leur profil sécrétoire. En effet, les surnageants de culture des M2-Mcp cultivés en 2D n’induisent pas la prolifération de fibroblastes, alors que les surnageants de culture des M2-Mcp cultivés sur la matrice (3D) induisent de manière significative la prolifération de fibroblastes humains (Fig.16A). Des résultats similaires sont obtenus lorsque les M2-Mcp sont co-cultivés avec les ASCs (Fig.lôB). Ces résultats montrent que les cellules cultivées dans la matrice changent de profil sécrétoire et produisent des molécules favorisant la prolifération des fibroblastes (Fig.16), la résolution de l’inflammation (Fig.17) et donc la réparation tissulaire (Fig.13).

Claims

REVENDICATIONS
1. Biomatériau tridimensionnel comprenant une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d’ alginate et de chitosan modifiés ou non, et des macrophages, ladite matrice présentant une macroporosité ouverte interconnectée dans laquelle le ratio massique alginate/chitosan est compris entre 20/80 et 80/20.
2. Biomatériau selon la revendication 1, dans lequel le ratio massique alginate/chitosan est de 40/60.
3. Biomatériau selon la revendication 1 ou 2, dans lequel T alginate présente un ratio M/G compris entre 1,4 et 2,7, et/ou un poids moléculaire (Mw) compris entre 150.000 et 250.000, et/ou un indice de polydispersité (IP) inférieur à 2.
4. Biomatériau selon la revendication 3, dans lequel l’alginate présente un ratio M/G compris entre 1,4 et 2,7, préférentiellement égal à 2 +/-0,2, un poids moléculaire (Mw) compris entre 150.000 et 250.000, et un indice de polydispersité (IP) inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,5.
5. Biomatériau selon Tune des revendications précédentes, dans lequel le chitosan présente un degré de déacétylation (DDA) compris entre 75% et 90% et/ou un Mw compris entre 130.000 et 400.000, et/ou un indice de polydispersité inférieur à 2.
6. Biomatériau selon la revendication 5, dans lequel le chitosan présente un degré de déacétylation (DDA) compris entre 75% et 90%, préférentiellement entre 75 et 85%, un Mw compris entre 130.000 et 400.000, préférentiellement entre 145.000 et 400.000, plus préférentiellement entre 200.000 et 400.000, et un indice de polydispersité inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,7, plus préférentiellement environ 1,8.
7. Biomatériau hybride selon Tune des revendications précédentes, comprenant des macrophages pro-cicatrisants.
8. Biomatériau hybride selon la revendication 7, dans lequel les macrophages pro-cicatrisants sont des macrophages pro-résolutifs.
9. Biomatériau hybride selon Tune des revendications précédentes, comprenant des macrophages pro-cicatrisants et des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), le ratio macrophages pro-cicatrisant / cellules stromales mésenchymateuses étant préférentiellement compris entre 1/99 et 99/1, notamment environ de 50/50.
10. Procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon l’une des revendications 1 à 9, comprenant les étapes :
(a) cultiver des monocytes et/ou des macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages pro-cicatrisant ;
(b) préparer une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d’ alginate et de chitosan dans des proportions relatives comprises entre 40/60 et 60/40 ;
(c) éventuellement sécher la matrice de PEC ;
(d) stériliser la matrice de PEC ;
(e) ensemencer la matrice de PEC avec des macrophages pro-cicatrisants obtenus à l’étape (a) éventuellement combinés avec des CSM.
11. Procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon la revendication 10, dans lequel l’étape (d) de stérilisation est une stérilisation par irradiation par faisceaux d’électrons pulsés de faible énergie ou une stérilisation par irradiation par faisceaux d’électrons continus de faible énergie.
12. Pansement cutané destiné à la médecine régénérative comprenant un biomatériau tridimensionnel selon l’une des revendications 1 à 9.
13. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation en médecine régénérative chez un sujet, caractérisés en ce que lesdits macrophages pro-cicatrisants et les éventuels CSM sont sous une forme adaptée à leur administration audit sujet au moyen d’un biomatériau tridimensionnel selon l’une des revendications 1 à 9.
14. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation selon la revendication 13, pour le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique.
15. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation selon la revendication 14, caractérisés en ce que le sujet présente un diabète et/ou est un sujet âgé.
16. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation selon l’une des revendications 13 à 15, caractérisés en ce que le biomatériau tridimensionnel est sous la forme d’un pansement, d’un patch, ou d’une matrice implantable.
17. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation selon l’une des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que lesdits macrophages procicatrisants et les éventuelles CSM ont été préalablement obtenus à partir de cellules dudit sujet parmi, des cellules de moelle osseuse, des iPS ou monocytes sanguins, et ASC du tissu adipeux.
18. Kit destiné à la médecine régénérative, et notamment au traitement d’une plaie, telle qu’une plaie chronique, ledit kit comprenant :
- une matrice de PEC alginate et de chitosan, ladite matrice présentant une macroporosité ouverte interconnectée dans laquelle le ratio massique polymère anionique / polymère cationique est compris entre 20/80 et 80/20, préférentiellement de 40/60 ;
- un milieu de culture adapté à la culture des monocytes ou macrophages pro-cicatrisants et/ou un milieu de culture adapté à la différenciation de cellules de moelle osseuse en macrophages de phénotype pro-cicatrisants.
19. Kit selon la revendication 18, dans lequel la matrice de PEC est stérilisée.
20. Méthode de traitement d’un tissu lésé selon laquelle un biomatériau hybride selon l’une des revendications 1 à 9 est appliqué sur le tissu lésé pour favoriser la réparation dudit tissu.
21. Méthode de traitement selon la revendication 20, selon laquelle le tissu lésé est une plaie chronique, notamment une plaie chronique de diabétique.
22. Méthode de traitement selon la revendication 20 ou 21, selon laquelle ledit biomatériau hybride contient des macrophages pro-cicatrisants, notamment des macrophages pro-résolutifs.
23. Méthode de traitement selon la revendication 22, selon laquelle le biomatériau comprend en outre des CSM.
24. Méthode de traitement selon l’une des revendications 20 à 23, selon laquelle le biomatériau est appliqué sous la forme d’un pansement sur le tissu lésé.
25. Utilisation de macrophages pour la préparation d’un biomatériau selon l’une des revendications 1 à 9, pour le traitement d’un tissu lésé, notamment d’une plaie, plus particulièrement d’une plaie chronique.
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