EP4666053A1 - Dispositif de localisation d'une particule individualisée dans un échantillon et procédé associé - Google Patents

Dispositif de localisation d'une particule individualisée dans un échantillon et procédé associé

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EP4666053A1
EP4666053A1 EP24705491.9A EP24705491A EP4666053A1 EP 4666053 A1 EP4666053 A1 EP 4666053A1 EP 24705491 A EP24705491 A EP 24705491A EP 4666053 A1 EP4666053 A1 EP 4666053A1
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EP
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particle
sample
illumination field
intensity
temporal
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Pending
Application number
EP24705491.9A
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German (de)
English (en)
Inventor
Emmanuel Fort
Sandrine LEVÊQUE-FORT
Maximilien LENGAUER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI
Universite Paris Sciences et Lettres
Universite Paris Saclay
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI
Universite Paris Sciences et Lettres
Universite Paris Saclay
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI, Universite Paris Sciences et Lettres, Universite Paris Saclay filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Definitions

  • the present invention relates generally to the field of microscopy.
  • the invention finds a particularly advantageous application in the production of super-resolution microscopy devices.
  • An aim of the invention is therefore to enable the localization of light-emitting particles quickly and reliably.
  • the present invention provides a device for locating an individualized particle in a sample having several regions, the particle being adapted to emit photons when it receives light, the device comprising:
  • a light source arranged to produce an illumination field adapted to illuminate the sample placed on its support, an intensity of the illumination field having a temporal and spatial variation, such that said intensity has, in each region of the sample, a predetermined temporal pattern different from the temporal patterns of said intensity in the other regions;
  • a detector adapted to convert photons emitted by the particle in response to its illumination by the illumination field into a signal representative of the intensity of the illumination field received by the particle;
  • a computer programmed to determine, on the basis of a temporal evolution of the signal from the detector and the temporal and spatial variation of the intensity of the illumination field, the region of the sample in which the particle is located.
  • the localization of the particle is coded bijectively by means of the temporal patterns, that is to say by means of the illumination field which is spatially structured and which is variable in time.
  • This coding thus allows a super-localization of the entire observation field with a single detector.
  • the position information of the particle is contained in the amplitude variation of the signal that is generated by the detector.
  • the detector cannot in itself spatially determine the origin of the photons that it receives, the temporal evolution of the signal that it generates is representative of the temporal pattern that illuminates the particle. The analysis of this temporal evolution therefore makes it possible to go back to the region of the particle.
  • the invention thus advantageously makes it possible to overcome the limitations imposed by the sampling frequencies of the cameras.
  • each temporal pattern of the intensity of the illumination field produced by the light source is a periodic temporal variation of this intensity and has a specific frequency, the specific frequencies of the temporal patterns associated with all the regions being distinct from each other.
  • each region is associated with a unique specific frequency. There is therefore no ambiguity about the location of the particle, even when using a single detector instead of a camera.
  • each temporal pattern of the intensity of the illumination field produced by the light source is a periodic temporal variation of this intensity and has a specific frequency, the specific frequencies of the temporal patterns associated with all the regions being distinct from each other;
  • each specific frequency is linked by the same relationship to a distance between the position of the region associated with the corresponding time pattern and a reference position along the main direction;
  • each temporal pattern of the intensity of the illumination field produced by the light source is a sinusoidal temporal variation of this intensity
  • the illumination field is adapted to simultaneously illuminate several regions of the sample;
  • the light source comprises an optical beam splitting device and a converging element arranged to generate and interfere with two light beams with each other so as to produce interference fringes at the sample placed on its support;
  • the optical device for splitting light beams comprises at least one of the following: a corner mirror having two perpendicular reflecting surfaces, a mirror and a partially reflecting plate; a splitter cube having a partially reflecting internal diagonal surface;
  • the light source further comprises a movable optical element, the movement of which causes said interference fringes to scroll to produce each temporal pattern of the intensity of the illumination field;
  • said mobile optical element comprises a rotating device arranged to vary over time an angle of incidence of each light beam on the sample placed on its support, the angles of incidence of the light beams varying simultaneously and in opposite directions;
  • the rotating device is a rotating mirror
  • the light source comprises a polarization modulator adapted to modify the polarization of the illumination field so that the illumination field is polarized, sequentially or simultaneously, according to: a first polarization direction; and a second polarization direction distinct from the first polarization direction; the calculator being programmed to determine a position of the particle according to the first main direction and according to the second main direction as a function of the polarization of the illumination field;
  • the specific frequencies of temporal patterns associated with the first direction of polarization are distinct from the specific frequencies of temporal patterns associated with the second direction of polarization.
  • the invention also provides a method for locating an individualized particle in a sample having several regions, the particle being adapted to emit photons when it receives light, the method comprising the following steps:
  • the illumination field illuminating the sample placed on the support, an intensity of the illumination field exhibiting a variation temporal and spatial, such that said intensity exhibits, in each region of the sample, a predetermined temporal pattern different from the temporal patterns of said intensity in the other regions;
  • the particle is selected from the group comprising: diffusing particles, fluorescent particles, phosphorescent particles, quantum dots, fluorescent proteins, dye molecules;
  • the particle is fluorescent
  • the illumination field is produced by a pulsed laser at a frequency greater than 1 MHz and the detector is adapted to count single photons, the method comprising a step of determining a delay between a pulse of the laser and the emission of a photon by the particle.
  • Figure 1 is a schematic representation seen from above of a device for locating an individualized particle in a sample according to a first embodiment
  • Figure 2 is a schematic representation seen from above of a first example of an optical separation device and a movable optical element of the device of Figure 1,
  • Figure 3 is a schematic top view representation of a second example of an optical separation device and a movable optical element of the device of Figure 1
  • Figure 4 is a schematic representation of a scrolling of interference fringes over time (t) produced by the device of Figure 1 in projection along a main direction (X) at the level of the sample,
  • Figure 5 is a first example of a frequency spectrum obtained for a particle at a first position along the main direction (X) of Figure 4
  • Figure 6 is a second example of a frequency spectrum obtained for a particle at a second position along the main direction (X) of Figure 4
  • Figure 7 is a graphical representation of the localization accuracy of the device of Figure 1
  • Figure 8 is a schematic representation seen from above of a device for locating an individualized particle in a sample according to a second embodiment
  • Figure 9 is a schematic perspective representation of interference fringes produced by the device of Figure 8 at the sample level
  • Figure 10 is a schematic representation of the frequency processing of a signal from the detector in order to determine the trajectory of a particle
  • Figure 11 is a graphical representation of scrolling frequencies of interference fringes produced by the device of Figure 8 as a function of the position (x, y) of a particle in a first direction and in a second direction,
  • Figure 12 is a block diagram of a sequence of steps of a method according to the invention allowing the localization of an individualized particle in a sample according to a main direction
  • Figure 13 is a schematic representation in section in a plane (O, X, Z) of the light beams incident on the sample through an objective of a device according to the invention and of oblique interference fringes produced by these beams within the sample.
  • FIGS. 1 to 6 and 8 Two embodiments of a device 100; 300 for locating an individualized particle 2 in a sample 3 having several regions 31 according to the invention are respectively represented in FIGS. 1 to 6 and 8.
  • the device 100; 300 is an imaging device for locating the particle 2.
  • the device 100; 300 for locating the particle 2 comprises:
  • a light source arranged to produce an illumination field 200; 400 adapted to illuminate the sample 3 placed on its support 110; 310, an intensity of the illumination field 200; 400 having a temporal and spatial variation, such that said intensity has, in each region 31 of the sample 3, a predetermined temporal pattern different from the temporal patterns of said intensity in the other regions;
  • a detector 140 340 adapted to convert photons emitted by the particle 2 in response to its illumination by the illumination field 200; 400 into a signal representative of the intensity of the illumination field 200; 400 received by the particle
  • a calculator 150 programmed to determine, on the basis of a temporal evolution of the signal from the detector 140; 340 and the temporal and spatial variation of the intensity of the illumination field 200; 400, the region 31 of the sample
  • Particle 2 is for example a molecule, a group of molecules or a group of identical atoms. Particle 2 is here adapted to emit photons when it receives light. Particle 2 has for example a linear response to the light that it receives, which means that its emission of photons is proportional to the intensity of the light that it receives. Particle 2 can also have a non-linear response to the light that it receives, in particular when an excitation level of particle 2 is close to the values associated with a saturation of particle 2. This is for example the case when the particle used is a fluorophore and a photon absorption rate by particle 2 is of the same order of magnitude as the inverse of a fluorescence lifetime of particle 2.
  • the particle 2 is for example selected from the group comprising: diffusing particles (such as a gold particle), fluorescent particles, also called fluorophores, phosphorescent particles, quantum dots, fluorescent proteins, dye molecules.
  • the particle 2 here has a size of less than one micrometer.
  • the device 100 is therefore more specifically a microscopy device.
  • the particle 2 preferably has a size between 1 nm and 40 nm.
  • the particle 2 is conventionally located in the volume of the sample 3 or on the surface of the sample 3.
  • the sample 3 is at least partially transparent to light, in particular to the wavelengths generated by the device 100 and described below, so that the light reaches the particle 2.
  • sample 3 is here thin in the sense that its thickness is significantly less than its width and length.
  • sample 3 is a slice or section of a biological tissue. Sample 3 therefore extends substantially around a mean plane. Sample 3 has, for example, a thickness along the Z axis of Figure 1 of between 10 micrometers (pm) and 100 pm and a length and/or width in the plane (OXY) of Figure 1 greater than 1 centimeter (cm).
  • the regions 31 of the sample 3 are distinct portions of the sample 3, all of the portions forming the sample 3.
  • the regions 31 may be point-like or extended. They may be extended in one, two or three dimensions.
  • Each region 31 may, for example, correspond to a particular position within the sample 3.
  • the term “region” includes in particular the notion of point-like position defined by specific coordinates (x, y, z) in the reference frame (O, X, Y, Z) of FIG. 1.
  • region may also designate, for example, a plane extending in the directions Y and Z and intersecting the X axis at a particular position.
  • particle 2 is individualized here means that the particle is spatially separated from other particles by a distance greater than the resolution limit of the device according to the invention. In practice, here, this means that two neighboring particles 2 are at least 2 times, and preferably 5 times, apart from the resolution limit given by diffraction which is approximately 1 pm. Two neighboring particles 2 are therefore for example at least 2 pm apart. This means for example that region 31 containing particle 2 does not include any other particles.
  • the support 110; 310 of the device 100; 300 is adapted to receive the sample 3.
  • the support 110; 310 more specifically comprises a plate 111; 311 extending along an extension plane.
  • the support 110; 310 is also adapted to move the sample. 3 with respect to the optical elements of the device 100; 300, in particular with respect to a lens 170; 370 bringing the light produced by the light source towards the support 110; 310.
  • the support 110; 310 comprises actuators 112; 312, for example piezoelectric, adapted to move the plate 111; 311 in its extension plane.
  • the sample 3 is placed on the plate 111; 311 so that the mean plane of the sample 3 extends parallel to the extension plane of the plate 111; 311 .
  • the regions 31 of the sample 3 can be defined discretely, for example so as to divide the sample 3 into rows and columns perpendicular to its thickness.
  • Each region 31 of the sample 3 can be associated with a corresponding area of the plate 111; 311 forming the support 110; 310, which is located opposite the region 31 when the sample 3 is placed on the support.
  • the regions 31 of the sample 3 can also be defined continuously. In this case, they are for example identified by coordinates, for example Cartesian, in a reference frame linked to the support 110; 310.
  • the reference frame linked to the support 110; 310 comprises for example an orthogonal reference frame referenced OXYZ in FIGS. 1 and 8.
  • OXYZ the thickness of the sample 3 is defined as the dimension of the sample 3 along the Z axis
  • the length of the sample 3 is defined as the dimension of the sample 3 along the X axis
  • the width of the sample 3 is defined as the dimension of the sample 3 along the Y axis.
  • the origin O of the orthogonal reference frame OXYZ is for example placed at one of the corners of the plate 111; 311 when the latter has the shape of a rectangle.
  • the light source of the device 100; 300 is partially shown in FIGS. 2, 3. It is also presented in full in FIG. 8 in the context of the second embodiment of the device 300. It is arranged to produce an illumination field 200; 400 adapted to illuminate the sample 3 placed on the support 110; 310. The light source is therefore configured to illuminate the particle 2 which, in return, emits photons.
  • the expression “illumination field” 200; 400 denotes the spatial distribution of the intensity of the light (i.e. of the separate beams described later) emitted by the light source and conveyed to the sample 3.
  • the intensity of the illumination field 200; 400 produced by the light source exhibits a temporal and spatial variation.
  • Such a temporal and spatial variation of the intensity of the illumination field 200 is for example represented in FIG. 4 in the context of the first embodiment of the device according to the invention.
  • the intensity of the illumination field 200 produced by the light source of the device 100 according to the invention has different values at different locations in space corresponding here to different distances from the origin O of the orthogonal reference frame OXYZ (FIG. 1) along the X axis.
  • the intensity of the illumination field 200 has one or more maxima (represented by the white areas) and one or more minima (represented by the black areas) along this X axis.
  • the temporal variation of the intensity of the illumination field 200 is illustrated in FIG. 4 by a displacement of the maxima(s) and minima(s) over time.
  • the intensity of the illumination field 200 is for example defined at an upper surface 32 of the sample 3 which faces the light source.
  • the intensity of the illumination field 200 can also be defined at the plate 111.
  • the light source is more particularly arranged so that the intensity of the illumination field 200; 400 has, in each region 31 of the sample 3, a predetermined temporal pattern different from the temporal patterns of the intensity in the other regions 31 of the sample 3.
  • each region 31 is associated bijectively with a temporal pattern of the illumination field 200; 400.
  • the temporal variation of the illumination field 200; 400 assigns a specific temporal code to each area of the plate 111; 311 forming the support 110; 310 and therefore to each region 31 of the sample 3.
  • the light source is here arranged precisely relative to the support 110; 310 of the sample 3, for example relative to the areas of the plate 111; 311 or relative to the OXYZ reference frame.
  • the light source is then arranged relative to the sample 3 itself by the correspondence between the support 110; 310 and the sample 3.
  • Each temporal pattern is a variation of intensity according to a predetermined pattern, or structure. Each temporal pattern is thus characterized by its temporal variation. Thus, for each region 31 of the sample, the intensity of the illumination field 200; 400 varies temporally in a specific and predetermined manner.
  • Each temporal pattern comprises for example a periodic variation of the intensity.
  • each pattern may more specifically be a sinusoidal temporal variation of the intensity, as described in detail later.
  • each region 31 is illuminated by its temporal pattern, in the sense that it actually receives photons, at the same time as other regions 31 are illuminated by their respective temporal patterns.
  • the illumination field 200; 400 which means that the sample 3 is illuminated in its entirety.
  • all the regions 31 of the sample 3 located in the field of view of the objective 170; 370 are illuminated simultaneously. Localization is therefore fast since encoding is carried out in parallel for all regions.
  • the light source more particularly comprises a light emitter 130; 330 adapted to produce light and a set of optical elements arranged to generate the variation of the illumination field 200; 400 from the light produced by the light emitter 130; 330.
  • this set of optical elements notably comprises an optical device for separating light beams 122; 322 adapted to divide the beam emitted by the light emitter 130; 330 into two light beams, a movable optical element and a converging optical element adapted to superimpose the two separate beams to make them interfere.
  • the light emitter 130; 330 is for example a laser, for example a laser diode.
  • the laser here emits an initial light beam 210; 410 whose central wavelength (i.e. highest amplitude) is for example between 405 nm and 800 nm.
  • the light emitter 130: 330 can be adapted to produce light continuously with a constant intensity. It can also be a pulsed light source, producing light at regular time intervals.
  • the detector 140; 340 (FIGS. 1 and 8) of the device 100; 300 according to the invention is adapted to convert the photons emitted by the particle 2 in response to its illumination by the illumination field 200; 400, into a signal.
  • the signal is thus representative of the intensity of the illumination field 200; 400 received by the particle 2.
  • the signal is here an electrical, digital or analog signal.
  • the temporal variation of the signal includes information on the temporal pattern of the light beam which illuminated the particle 2.
  • the amplitude of the signal produced by the detector 140; 340 is more particularly representative of a number of photons emitted by the particle 2 in response to its illumination by the illumination field 200; 400 per unit of time. For example, when the particle 2 has a linear response to the light it receives, the amplitude of the signal is then proportional to the intensity of the illumination field 200; 400 received by the particle 2.
  • the detector 140; 340 here has a sampling frequency greater than 1 MHz.
  • the detector is for example selected from the group comprising: single-detectors, single-detector matrices, detectors comprising single-photon avalanche diodes, event detectors whose pixels generate signals in response to a change in received light intensity, neuromorphic detectors.
  • a single-detector is defined as a detector comprising a single photosensitive element (for example a single pixel), it therefore does not have any intrinsic spatial resolution.
  • the device 100; 300 may also comprise a set of optical elements for shaping and orienting the light beam(s).
  • the optical shaping elements comprise for example one or more diaphragms 331, as well as one or more optical lenses 332 and a beam expander 334.
  • Each diaphragm 331 makes it possible to eliminate stray light from the light beam.
  • the optical lenses 332 make it possible to shape the beam: adjust its diameter, focus it at a precise location or create a parallel beam.
  • the optical elements for orienting the beam(s) comprise for example mirrors 333.
  • the device 100; 300 further comprises a dichroic mirror 141; 341 (FIGS. 1 and 8) arranged to, on the one hand, reflect the light produced by the light emitter 130; 330 to direct it towards the support 110; 310 and the sample 3 and, on the other hand, transmit the photons emitted by the particle 2 towards the detector 140; 340.
  • a dichroic mirror 141; 341 (FIGS. 1 and 8) arranged to, on the one hand, reflect the light produced by the light emitter 130; 330 to direct it towards the support 110; 310 and the sample 3 and, on the other hand, transmit the photons emitted by the particle 2 towards the detector 140; 340.
  • the device 100 also comprises a recovery lens 142; 342 which focuses the photons emitted by the particle 2 towards the detector 140.
  • the device 300 further comprises an optical fiber 343.
  • the recovery lens 342 focuses the photons emitted by the particle 2 at the input of this optical fiber 343, the optical fiber 343 guiding them to the detector 340.
  • the device 100; 300 finally comprises a calculator 150; 350 programmed to analyze the signals produced by the detector 140; 340.
  • the computer 150; 350 here comprises at least one memory and at least one processor.
  • the memory is a computer-readable recording medium comprising instructions which, when executed by the processor, make it possible to locate the particle 2. Locating the particle means in particular determining the region 31 of the sample 1 in which the particle 2 is located.
  • the calculator 150; 350 is more particularly programmed to determine, on the basis of a temporal evolution of the signal and of the temporal and spatial variation of the intensity of the illumination field 200; 400, that is to say on the basis of the predetermined temporal patterns, the region 31 of the sample 3 in which the particle 2 is located. [0075] Indeed, as explained above, each region 31 of the sample 3 is associated bijectively with a temporal pattern of the illumination field 200; 400.
  • the signal emitted by the detector 140; 340 is representative of the intensity of the illumination field 200; 400 received by the particle 2.
  • the temporal evolution of the signal emitted by the detector 140; 340 is therefore associated with a temporal pattern of the illumination field 200; 400 and consequently with a region 31.
  • the calculator 150; 350 is thus programmed to analyze the temporal evolution of the signal emitted by the detector 140; 340, to recognize one of the predetermined temporal patterns therein, and to determine the region 31 associated with this temporal pattern, that is to say the region 31 in which the particle 2 is located. 350 here identifies the regions 31 of the sample relative to the support 110, for example via the different zones of the plate 111; 311 of the support 110; 310, or, as in the embodiments described later, by means of the OXYZ marker linked to the support 110; 310.
  • the computer 150; 350 is also programmed to control the light source.
  • the light source comprises a dedicated computer. This dedicated computer then transmits the relevant information, in particular concerning the predetermined time patterns, to the computer so that the latter locates the particle 2.
  • this method comprises the following steps:
  • E4 - determination on the basis of the temporal evolution of the signal and the temporal and spatial variation of the intensity of the illumination field 200, of the region 31 of the sample 3 in which the particle 2 is located.
  • This main direction here corresponds to the direction of scrolling of the interference fringes which create the predetermined temporal patterns, as explained later.
  • the illumination field 200 produced by the light source has predetermined temporal patterns aligned according to the main direction.
  • the main direction is parallel to the X axis of the OXYZ reference frame.
  • the main direction is therefore substantially parallel to the mean plane of the sample 3.
  • Each region 31 thus extends over the entire width of the sample 3, i.e. over its entire dimension along Y, and over the entire thickness of the sample 3, i.e. over its entire dimension along Z.
  • the regions 31 are thus also aligned along the main direction.
  • the regions 31 are defined continuously.
  • Each region 31 corresponds to an abscissa, referenced x, along the X axis and which can take a real value.
  • Each region 31 of the sample 3 is therefore characterized by a distance between this region 31 and a reference position along the main direction.
  • the reference position is preferably the origin O of the OXYZ reference frame.
  • the location of particle 2 along a main direction corresponds here to the location of particle 2 along the X axis. Subsequently, reference is therefore made to the location of particle 2 along the X axis, i.e. to the determination of the abscissa of particle 2.
  • the length of the sample 3 (therefore along the X axis) along which the particle 2 is detectable is here greater than 500 nm and preferably greater than 1 pm.
  • the regions 31 extend over a length greater than 500 nm and preferably greater than 1 pm. This length depends in particular on the portion of the sample 3 located in the observation field of the detector 140.
  • the optical separation device 122 of the light source of the first embodiment comprises a device of the interferometer type arranged to separate the initial light beam 210 into two separate light beams 221, 222 as shown in FIG. 2. These two separate light beams 221, 222 are superimposed by means of an objective 170, to make them interfere with each other so as to form interference fringes 230. [0085] The illumination field 200 is then formed by these interference fringes 230.
  • the interference fringes 230 are schematically represented in FIG. 4. In this figure (as well as in FIGS.
  • the half-period of a given interference fringe which includes the maximum intensity of said fringe contains points while the half-period which includes the minimum intensity does not contain any points.
  • the numerical references indicating the interference fringes point to both one type of half-period and the other.
  • the interference fringes 230 here extend along the Y axis, i.e. perpendicular to the X axis. As FIG. 4 clearly shows, the illumination field 200 simultaneously illuminates several abscissas X (i.e. several regions 31).
  • the optical device for separating light beams 122 comprises a corner mirror 123 having two perpendicular reflecting surfaces, a plane mirror 124 and a semi-reflecting plate 125 which are arranged as in a Michelson interferometer used in air corner mode.
  • the initial beam 210 is divided, here in equal parts, by the semi-reflecting plate 125 to form the two separate light beams 221, 222.
  • the separate light beam 210 is, on the one hand, transmitted by the semi-reflecting plate 125 into a first separate light beam 221.
  • This first separate light beam 221 is reflected in parallel by the corner mirror 123 then by the semi-reflecting plate 125 towards the support 110.
  • the initial beam 210 is, on the other hand, reflected by the semi-reflecting plate 125 into a second separate light beam 222.
  • This second separate light beam 222 is reflected by the plane mirror 124 to be transmitted towards the support 110 by the semi-reflecting plate 125.
  • the optical device for separating light beams 122 is formed by a splitter cube 126 having a semi-reflecting internal diagonal surface 127.
  • the splitter cube 126 is for example made of glass.
  • the splitter cube 126 is oriented so that the semi-reflecting internal diagonal surface 127 is parallel to the initial beam 210 before it enters the splitter cube 126.
  • the initial beam 210 is divided, here in equal parts, by the semi-reflecting internal diagonal surface 126 to form two separate light beams 22T, 222'. The latter then emerge parallel to each other from the splitter cube 126.
  • the converging optical element of the light source here comprises the objective 170 which is provided with a converging lens 128 arranged to converge the two separate beams 221, 222; 22T, 222' towards the support 110 to cause the two separate light beams 221, 222; 22T, 222' to interfere so as to produce the interference fringes 230 (FIG. 4) at the sample 3 placed on its support 110.
  • the mobile optical element is arranged so that its movement causes the interference fringes 230 to scroll.
  • the movement of the mobile optical element is here controlled by the computer 150.
  • This scrolling of the interference fringes 230 then forms the temporal patterns.
  • the temporal variation of the illumination field 200 results from the movement of the mobile optical element.
  • the mobile optical element is here a rotating mirror and more particularly a galvanometric mirror 129.
  • the movement of the mobile optical element is therefore a rotation of the galvanometric mirror 129, which is shown diagrammatically by curved arrows in Figures 2 and 3.
  • the galvanometric mirror 129 is adapted to vary over time the angle of incidence a of each separate light beam 221, 222; 221’; 222’ on the sample 3 placed on its support 110. This is advantageous because the cost of a galvanometric mirror 129 is high.
  • the galvanometric mirror 129 is placed upstream of the beam splitter device 122.
  • the galvanometric mirror 129 makes it possible to orient, i.e. to modify the direction and/or to translate, the initial light beam 210.
  • the galvanometric mirror 129 is for example arranged so that the initial light beam 210 is incident at the level of the axis of rotation of the galvanometric mirror 129.
  • a rotation of the galvanometric mirror 129 varies the angles of incidence a of the separate light beams 221, 222; 22T, 222’ simultaneously and in opposite directions.
  • the position of the optical contact at the sample 3 is invariant over time despite the rotation of the galvanometric mirror 129.
  • a lens 143 is placed between the galvanometric mirror 129 and the splitter cube 126 to fix the angle of incidence of the initial light beam 210 on the splitter cube 126 despite the rotation of the galvanometric mirror 129.
  • the galvanometric mirror 129 rotates in the trigonometric direction, for example to pass from the position referenced R1 to the position referenced R2, the separated light beams 221, 222; 22T, 222' move away from each other symmetrically, which is represented by arrows of the same length.
  • the operation of the first embodiment of the device 100 makes it possible to implement the method of locating the particle 2 along the X axis by determining its abscissa.
  • step E2 of producing the illumination field 200 and illuminating the sample 3 by the illumination field 200 comprises the rotation of the galvanometric mirror 129.
  • This rotation causes an identical variation in the angles of incidence of the separate light beams 221, 222; 22T, 222’ on the sample 3 and therefore a scrolling of the interference fringes 230.
  • the interference fringes 230 scroll more specifically with a scrolling speed which depends on the distance from the optical contact, at which the phase shift between the separate light beams 221, 222; 22T, 222’ is zero, along the X axis. The further a region 31 is from the optical contact, the faster the interference fringes 230 which illuminate it scroll.
  • the optical contact is positioned at the abscissa referenced xo.
  • the optical contact thus defines the reference position along the X axis (therefore along the main direction).
  • the abscissa xo of the optical contact is invariant during rotation because the angles of incidence a of the separate light beams 221, 222; 22T, 222' vary simultaneously and in opposite directions.
  • This is schematically represented in Figure 4 by a maximum and constant light intensity over time at the abscissa xo of the optical contact.
  • the galvanometric mirror 129 here performs a rotation at a constant rotation speed (apart from a start phase and a stop phase). This regular rotation implies that each temporal pattern is a periodic, and more specifically sinusoidal, temporal variation of the intensity of the illumination field 200 at a specific frequency. In other words, each region 31 sees the interference fringes 230 scroll regularly. For each region 31 , the intensity of the illumination field 200 received therefore varies sinusoidally.
  • this relationship is more particularly a relationship of proportionality.
  • the intensity I varies over time t according to the formula (1): l(x,t) oc 1 +cos(at x), where a is a coefficient of proportionality which depends in particular on the speed of rotation of the galvanometric mirror 129.
  • each temporal pattern is a sinusoidal variation of the intensity of the illumination field 200 at a specific frequency which is proportional to the abscissa of the region 31 associated with said temporal pattern.
  • FIG. 4 Such scrolling is illustrated in FIG. 4 in which a first region 31 of abscissa xi is located closer to the optical contact (abscissa xo) than a second region 31 of abscissa X2, which means that X2 > xi.
  • the first region 31 sees approximately four interference fringes 230 scroll by and the second region 31 approximately six interference fringes 230.
  • the intensity I2 received by the second region 31 therefore varies at a specific frequency higher than that of the intensity I1 received by the first region 31, the specific frequencies being respectively proportional to the abscissas X2 and xi.
  • the distance measured along the X axis on which the particle 2 is detectable is here greater than the fringe spacing L at at least one given instant, during the rotation of the galvanometric mirror 129.
  • the distance measured along the X axis on which the particle 2 is detectable is greater than the interfringe L during a given time interval, for example, at all times beyond a reference time.
  • This distance is for example here greater than the distance X2-X0 along the X axis of FIG. 4.
  • the regions 31 extend over a length greater than the interfringe L at at least one given time during the rotation of the galvanometric mirror 129, preferably over a given time interval. This means that at said given time or in the given time interval, the regions 31 are illuminated by more than one interference fringe 230, preferably by several interference fringes.
  • the galvanometric mirror 129 more particularly performs oscillations, i.e. rotations in one direction and the other.
  • oscillations i.e. rotations in one direction and the other.
  • new interference fringes 230 appear on the sample 3 over time, as is the case in FIG. 4, in the other direction of rotation, interference fringes 230 emerge from the sample 3 over time. In both cases, the interference fringes 230 pass at specific frequencies.
  • the amplitude of these oscillations is for example less than 5 degrees.
  • a rotation of the galvanometric mirror 129 is for example carried out in a time interval between 10 ms and 100 ms.
  • the oscillation frequency of the galvanometric mirror 129 is then between 10 Hz and 5000 Hz.
  • the scrolling frequency of the interference fringes 230 is therefore several orders of magnitude higher than the oscillation frequency of the galvanometric mirror 129, which makes it possible to locate the particle 2 very quickly. Indeed, as appears below, it is preferable for the particle 2 to be illuminated by several periods of the time pattern to obtain a precise determination of its location.
  • the specific frequencies i.e. the scrolling frequencies of the interference fringes 230, can for example rise to 1 MHz.
  • step E3 After the conversion of the photons emitted by particle 2 to form the signal, in step E3, the computer 150 analyzes the temporal evolution of the signal in step E4.
  • step E4 more specifically comprises the performance by the computer 150 of a Fourier transform of the signal. This makes it possible to determine the frequencies contained in the signal.
  • the temporal evolution of the signal is representative of the temporal pattern which illuminated particle 2. For example, when particle 2 is located at abscissa xi, the temporal evolution of the signal is representative of intensity 11 in the sense that the signal varies mainly at the same frequency as intensity 11.
  • the Fourier transform thus makes it possible to determine the specific frequency associated with said temporal pattern.
  • the Fourier transform exhibits a peak, i.e. a maximum M1, M2, corresponding to the specific frequency of the temporal pattern which illuminates particle 2.
  • the calculator 150 determines the region 31 in which the particle 2 is located.
  • the coefficient a is for example determined by moving the sample 3, and therefore the particle 2, in translation along the X axis by means of the actuators 112. This in fact makes it possible to determine the coefficient a by solving a system of two equations with two unknowns.
  • the calculator 150 therefore recognizes the temporal pattern which illuminates the particle 2. Then, each region 31 being associated bijectively with a temporal pattern, the calculator 150 determines the region 31 in which the particle 2 is located.
  • the Fourier transform of the signal can in practice exhibit a frequency spectrum as illustrated in FIG. 5.
  • the Fourier transform of the signal can in practice exhibit a frequency spectrum as illustrated in FIG. 6.
  • the frequency spectrum of FIG. 6 exhibits a maximum M2 at a frequency approximately twice that of the maximum M1 of the spectrum of FIG. 5, which derives from the fact that abscissa X2 is approximately twice that of abscissa xi (here because the relationship between the specific frequencies and the abscissas is a relationship of proportionality).
  • the peaks at mid-height of the maxima referenced M1 and M2 correspond here to a second particle positioned at another abscissa.
  • the specific frequency can be determined very precisely thanks to the high sampling frequency of the detector 140.
  • several periods of variation of the intensity of the illumination field 200 for example more than four, are detected by the detector 140 in order to increase the determination of the specific frequency.
  • the method implemented in this first embodiment also makes it possible to locate several particles present in the sample 3 along the X axis.
  • the signal is representative of both the intensity 11 and the intensity I2.
  • the frequency spectrum of the signal then has two peaks: one at the variation frequency of 11 and the other at the variation frequency of I2.
  • the calculator 150 determines the two abscissas corresponding to the two specific frequencies detected. When the number of particles is not predetermined, the peaks are for example distinguished from the noise by appropriate thresholding.
  • the galvanometric mirror can rotate at a non-constant speed.
  • the time patterns are then not sinusoidal variations.
  • a pattern could for example be a sinusoid whose specific frequency increases over time.
  • Many temporal patterns can be achieved by adapting the rotation of the galvanometric mirror.
  • the computer is then also programmed to recognize these temporal patterns, for example by having in memory all the temporal patterns that are predetermined, in order to determine the region in which the particle is located.
  • the localization of the particle 2 is carried out in two dimensions by means of a single light source.
  • the idea of this second embodiment is to polarize the illumination field 400 according to two distinct polarization directions.
  • the secondary direction is here parallel to the Y axis of the XYZ reference frame.
  • the main and secondary directions are orthogonal.
  • each region 31 extends over the entire thickness of the sample 3, i.e. over its entire dimension along Z.
  • the regions 31 are thus distributed so as to grid the surface of the sample 3.
  • the regions 31 are defined continuously.
  • Each region 31 is characterized by an abscissa, referenced x, along the X axis and an ordinate, referenced y, along the Y axis which can take a real value.
  • the localization of particle 2 along a secondary direction is here equivalent to the localization of particle 2 along the Y axis. Subsequently, reference is therefore made to the localization of particle 2 along the Y axis, i.e. to the determination of the y-ordinate of particle 2.
  • particle 2 is therefore located in the XY plane.
  • the surface of the XY plane in which particle 2 is detectable is here greater than 500x500 nm 2 and preferably greater than 1 pm 2 . In other words, regions 31 extend over a surface greater than 500x500 nm 2 and preferably greater than 1 pm 2 . This surface depends in particular on the portion of sample 3 located in the observation field of detector 140. This surface is also here greater than the square of the fringe spacing at at least one given instant during the rotation of galvanometric mirror 129.
  • the illumination field 400 can be polarized according to a first polarization direction, the illumination field 400 then makes it possible to locate the particle 2 according to the X axis.
  • the illumination field 400 has a first intensity which varies spatially and temporally so as to allow the location of the particle according to the main direction in accordance with the first embodiment.
  • the illumination field 400 can also be polarized according to a second polarization direction, here orthogonal to the first, the illumination field 400 then makes it possible to locate the particle 2 according to the Y axis.
  • the illumination field 400 has a second intensity which varies spatially and temporally so as to allow the location of the particle according to the second main direction in accordance with the first embodiment.
  • the first polarization direction of the illumination field 400 is, at the level of the sample 3, orthogonal to the main direction.
  • the first polarization direction is more specifically parallel to the Y axis.
  • the second polarization direction of the illumination field 400 is, at the level of the sample 3, parallel to the main direction.
  • the second polarization direction P2' is more specifically parallel to the X axis (FIG. 9).
  • each polarization direction for example the second polarization direction P2' in FIG. 9, is orthogonal to the plane in which the separate light beams 422 propagate, i.e. the YZ plane in the case of FIG. 9.
  • the polarizations are parallel to the interference fringes 430. This makes it possible to maximize the contrast of the interference fringes.
  • the first intensity has first temporal patterns generated by a scrolling of first interference fringes 431 extending rectilinearly parallel to the first direction of polarization
  • the second intensity has second temporal patterns generated by a scrolling of second interference fringes 432 extending rectilinearly parallel to the second direction of polarization (figure 9).
  • the light source of the device 300 according to the second embodiment comprises, as in the first embodiment described above, a light emitter 330, a beam splitting device 322 and a movable optical element.
  • the light emitter 330 comprises a laser source and the movable optical element comprises a galvanometric mirror 329.
  • the optical device for separating light beams 322 comprises, as in the first embodiment, a corner mirror 323 having two perpendicular reflecting surfaces, a plane mirror 324 and a semi-reflecting plate 325 arranged in a Michelson interferometer type configuration.
  • the light source of the second embodiment further comprises:
  • the polarization modulator 360 is placed between the light emitter 330 and the galvanometric mirror 329.
  • the polarization modulator 160 is adapted to polarize the initial beam 410 according to the first polarization direction and/or the second polarization direction.
  • This modulator can be an electro-optical modulator such as a Pockels cell or a magneto-optical modulator such as a Faraday cell.
  • the first polarizing cube 361 is placed downstream of the optical light beam splitting device 322 so as to direct the separated light beams 421 polarized according to the first polarization direction towards a first optical path 371 and the separated light beams 422 polarized according to the second polarization direction towards a second optical path 375.
  • the initial beam 410 is polarized according to the first polarization direction.
  • the polarization modulator 360 makes it possible to select respectively the first optical path 371 and the second optical path 375.
  • the polarization is initially orthogonal to the interference fringes 330.
  • the light source comprises a half-wave plate 372 arranged on the first optical path 371 so as to rotate the polarization by 90 degrees perpendicular to the propagation direction.
  • the first polarization direction is parallel to the first interference fringes 431.
  • This rotation of the polarization is schematized in FIG. 8 by the passage from a horizontal polarization P1 to a vertical polarization P2.
  • the polarization and the first interference fringes 430 are vertical after the half-wave plate 372.
  • the light source comprises a Dove prism type assembly 376 arranged on the second optical path 375 so as to rotate the second interference fringes 432.
  • the polarization is rotated by the polarization modulator 360 when the latter polarizes the initial beam according to the second polarization direction.
  • This rotation of the polarization which also makes it possible to select the second optical path 375, is shown diagrammatically in FIG. 8 by the transition from a vertical polarization PT to a horizontal polarization P2'.
  • the Dove 376 prism type assembly is here a reflecting prism made by means of mirrors. This makes it possible not to introduce additional birefringence. Conventionally, two mirrors are arranged at 45 degrees to the direction of propagation and a third, between these two mirrors, is arranged parallel to the direction of propagation.
  • the second polarizing cube 362 recombines the two polarizations, i.e. the light beams from the two optical paths 371, 375, before the illumination field 400 illuminates the sample 3.
  • the operation of the second embodiment of the device 100 makes it possible to implement the method of localizing the particle 2 described previously according to the main direction and according to the secondary direction, which here amounts to determining its abscissa x according to the X axis and its ordinate y according to the Y axis.
  • the illumination field 400 can be polarized according to the first polarization direction and according to the second polarization direction sequentially or simultaneously.
  • the polarization modulator 360 makes it possible to select the direction of localization of the particle 2 in the sense that it makes it possible to choose between a localization along the X axis and a localization along the Y axis.
  • the information on an instantaneous polarization of the illumination field 400 i.e. the fact that the illumination field 400 is polarized along the first polarization direction or along the second polarization direction, is transmitted from the polarization modulator 360 to the computer 350.
  • the computer 350 is then programmed to determine, on the basis of this information on the polarization of the illumination field at time t, that the specific frequency that it detects in the frequency spectrum at time t applies to the localization along the X axis, i.e. to the determination of the abscissa of particle 2, or that the specific frequency that it detects in the frequency spectrum at time t applies to the localization along the Y axis, i.e. to the determination of the ordinate of particle 2.
  • Figure 10 illustrates a two-dimensional tracking (along the X and Y axes) of a fluorescent nanoparticle in random Brownian motion in a liquid. Specific frequencies associated with each X, Y axis are alternately extracted from the signal (referenced D at the bottom left of Figure 10) from the detector. Time sections T1, T2 of the signal alternately encode the position of the particle along each X, Y axis. In Figure 10, two successive time sections T1, T2 are framed, a first section T1 encoding the Y axis and the next T2 for the X axis (section T1 is also shown enlarged).
  • the frequency spectrum S1, S2 of each time section T1, T2 makes it possible to determine the specific frequency of this section (at the top left of Figure 10, pointed by an arrow x or y).
  • the time evolution of the specific frequencies can then be represented by time-frequency curves C1, C2.
  • the time-frequency curve referenced C1 is relative to the Y axis while the time-frequency curve referenced C2 is relative to the X axis.
  • the temporal evolution of the specific frequencies makes it possible to deduce the position of the particle over time along the X and Y axes, i.e. the trajectory of the particle, as shown at the bottom right of Figure 10.
  • the sample 3 is illuminated both by the first interference fringes 431 and the second interference fringes 432.
  • the signal detected by the detector 340 is then representative of both the scrolling of the first interference fringes 431 and the scrolling of the second interference fringes 432.
  • the frequency spectrum then comprises two peaks: a first peak corresponding to the scrolling frequency of the first interference fringes 431 (i.e. a first frequency specific to the first pattern which illuminates the particle 2) and a second peak corresponding to the scrolling frequency of the second interference fringes 432 (i.e. a second frequency specific to a second pattern which illuminates the particle 2).
  • the scrolling frequencies of the first interference fringes 431 are distinct from the scrolling frequencies of the second interference fringes 432 (i.e. the second specific frequencies of the second time patterns).
  • the scrolling frequencies of the first interference fringes 431 belong to a first frequency range f1 disjoint (here higher) from a second frequency range f2 of the scrolling frequencies of the second interference fringes 432.
  • the calculator 350 can unambiguously assign each of the two peaks of the frequency spectrum, i.e. the specific frequencies, either to a scrolling frequency of the first interference fringes 431 when the peak belongs to the first frequency range f1, or to a scrolling frequency of the second interference fringes 432 when the peak belongs to the second frequency range f2.
  • the calculator 350 can therefore determine for each peak whether the latter corresponds to an abscissa or an ordinate of the particle 2.
  • each optical path 371, 375 can be adjusted independently so as to adjust the position of the optical contact for each polarization directions. Changing the position of the optical contact allows the frequency ranges to be shifted. This is achieved, for example, by moving the sample 3 using the actuators 112 or by changing the orientation of one of the mirrors 333 of the optical elements for orienting the light beam(s).
  • the method implemented by the device 300 according to the second embodiment can also make it possible to locate several particles present in the sample 3 in the XY plane.
  • the computer 350 performs the matching of an abscissa with an ordinate on the basis of the time intervals during which the particles 2 emit photons.
  • the two particles illuminate at different times due to the stochasticity of appearance of the emission of the particles observed in sparse regime, that is to say when there is a single particle 2 in a diffraction volume which ensures that the diffraction spots corresponding to two different particles of the sample can be separated.
  • This can be obtained either spontaneously or by inducing optical and/or chemical control of the particles.
  • the emission of photons by each particle occurs with a random time shift after its illumination. The photon emissions from the particles in the sample are therefore randomly shifted relative to each other, giving the impression that they are flashing.
  • the frequency spectrum comprises only the specific frequencies of a single particle, which can therefore be located in the XY plane.
  • Each frequency spectrum that is analyzed by the computer 350 is for example obtained by Fourier transform performed over a period of 50 ms of the signal.
  • the alternation between the two polarizations is performed at a high rate to have an alternation at least once, and preferably several times, during the time interval during which a particle emits photons.
  • the alternation is for example performed every 25 ms and each frequency spectrum analyzed is for example obtained by Fourier transform performed over a period of 50 ms of the signal.
  • the sample 3 comprises a concentration of particles emitting simultaneously less than 1 particle/pm 3. With such a concentration, the particles then appear sparse in sample 3 when they emit.
  • the device 300 by redividing one of the polarizations, i.e. by redividing one of the optical paths 371, 375.
  • This makes it possible to use a single laser, a single galvanometric mirror and a single optical beam separation and convergence device.
  • the first optical path 371 comprises for example a third polarizing cube dividing the polarization of this first optical path 371 into two.
  • the two new polarizations are recombined before illuminating the sample 3. This allows localization along the Z axis (i.e. in thickness) by means of interference fringes oblique to the Z axis.
  • FIG. 13 illustrates interference fringes 631 tilted in the Z+X direction.
  • the separate light beams 621, 622 of each new polarization are spatially spaced from each other in the rear focal plane Pf of the objective 570.
  • the separate light beams 621, 622 are off-centered relative to the axis of the objective 570 in the rear focal plane Pf.
  • the angle of incidence of one of the two separate light beams 621, 622 on the sample 3 depends on its position in the plane rear focal plane Pf.
  • the interference fringes 631 are in practice inclined by a given angle (45° in Figure 13) equal to the average of the angles of incidence of the two separate light beams 621, 622.
  • the two separate light beams 621, 622 move in the rear focal plane Pf by moving away from and approaching the axis of the lens 570.
  • the device 100; 300 according to the invention can be implemented in numerous applications.
  • the device 100; 300 can be used to perform lifetime imaging of fluorescent particles.
  • the device 100; 300 then allows a more precise localization than the diffraction limit (thanks to the variation of the illumination field detailed above) of the particle(s) while measuring a relaxation time of the fluorescence of the particle 2.
  • the relaxation time of the fluorescence of the particle i.e. the time during which the particle emits fluorescence after illumination by the illumination field, provides information on its local chemical or biochemical intoxication.
  • the light emitter 130; 330 is more particularly a laser pulsed at a frequency greater than 1 MHz.
  • the detector 140; 340 is adapted to detect a single photon.
  • the envelope of the signal is then representative of the scrolling of the interference fringes, which allows localization, and the individual detections of photons which form the signal can make it possible to measure a delay between a pulse of the laser and the emission of a photon by the particle in response to this pulse, as well as the duration of emission of the photons by the particle which makes it possible to determine the fluorescence lifetime of the particle, i.e. the duration of the emission of photons by the particle 2, or in other words a relaxation time of the particle 2.
  • the device 100; 300 makes it possible to follow the movement of the particle 2, typically when the sample 3 is a biological tissue, since the particle 2 is located at a high rate which is for example greater than 20 Hz.
  • the device 100; 300 can be implemented within the framework of multiplexing, i.e. detection of photons at wavelengths different.
  • Multiplexing here means that the sample 3 comprises at least two particles of different types: a first emitting photons predominantly at a first wavelength and a second particle emitting photons predominantly at a second wavelength distinct from the first wavelength.
  • the emission spectra of the two particles may also be slightly shifted while partially overlapping, the particles preferably remaining excitable with the same wavelength.
  • the device 100; 300 comprises a single light source (the light source), which means here that the illumination field 200: 400 has a single main wavelength.
  • the device 100 then comprises a second detector adapted to detect photons at the second wavelength.
  • the detector 140; 340 is adapted to detect photons at the first wavelength.
  • the device 100; 300 comprises two light sources each adapted to produce an illumination field whose main frequency is adapted to one of the particles and a single detector (i.e. the detector 140), which is for example a spectrometer, adapted to detect photons at the first and second wavelengths.
  • a single detector i.e. the detector 140
  • the detector 140 which is for example a spectrometer, adapted to detect photons at the first and second wavelengths.
  • the device 100; 300 according to the invention can also be used to produce a confocal or multi-confocal type system.
  • the principle is then to replace the camera which is traditionally used in confocal or multi-confocal type systems by the detector 140; 340 (which is of course coupled to the light source and to the computer 150; 350).
  • the frequency localization by means of the illumination field of the sparse particles in the sample makes it possible to replace the camera with a single detector and therefore to increase the acquisition speed by at least one order of magnitude.
  • interference fringes can be circular fringes such as Newton's rings or even present other more complex profiles.
  • the variation of the illumination field can be achieved otherwise than by a scrolling of interference fringes.
  • the The light source may comprise several lasers, each illuminating a region of the sample according to its own temporal pattern.
  • This temporal pattern corresponds, for example, to a laser pulse frequency.
  • the patterns can be produced by wave-front shaping, which makes it possible to obtain arbitrary shapes. They can also be produced by the superposition of non-coherent laser beams.
  • the variation in intensity of the illumination field can vary in a manner other than sinusoidal.
  • it can have a notched structure when pulsed lasers are used.
  • the localization can be carried out in reference frames not comprising a main direction as described in the examples above. Indeed, when several lasers each illuminate a region of the sample according to a temporal pattern specific to it, the regions can be distributed in two dimensions in the plane of the sample according to various patterns which do not necessarily imply that the regions are aligned or crisscross the sample. For example, the regions can for example correspond to concentric rings. The regions can also be arranged along a curved line.
  • the main direction, as well as the secondary direction and the third direction can of course correspond to a reference frame other than the orthogonal reference frame XYZ.
  • the beams are selected on the basis of their polarization by optical means, in this case polarizing cubes. They can also be selected by mechanical means, such as galvanometric mirrors or rotating mirrors, or by acousto-optical means such as acousto-optical modulators.
  • the sample 3 in order to locate one or more particles in a large sample, the sample 3 can be moved by means of the piezoelectric actuators 112. Different areas of the sample 3 are then treated one after the other. others as is the case in Figures 1 and 8.
  • the device may comprise several detectors. Each detector is then arranged towards a particular area of the support (and therefore of the sample) to convert photons emitted by the particle(s) of this particular area.
  • the support and the sample are divided into zones, each zone being associated with a detector. Within each zone, several regions are then defined in order to carry out the localization described above.

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Abstract

L'invention concerne dispositif (100) de localisation d'une particule (2) individualisée dans un échantillon (3) présentant plusieurs régions (31), la particule étant adaptée à émettre des photons lorsqu'elle reçoit de la lumière, le dispositif comprenant : - un support (110) d'échantillon, - une source de lumière agencée pour produire un champ d'illumination adapté à éclairer l'échantillon placé sur son support, une intensité du champ d'illumination présentant une variation temporelle et spatiale, de sorte que ladite intensité présente, dans chaque région de l'échantillon, un motif temporel prédéterminé différent des motifs temporels de ladite intensité dans les autres régions; - un détecteur (140) adapté à convertir des photons émis par la particule en réponse à son éclairement par le champ d'illumination en un signal représentatif de l'intensité du champ d'illumination reçue par la particule; - un calculateur (150) programmé pour déterminer, sur la base d'une évolution temporelle du signal issu du détecteur et de la variation temporelle et spatiale de l'intensité du champ d'illumination, la région de l'échantillon dans laquelle est localisée la particule.

Description

TITRE DE L’INVENTION : DISPOSITIF DE LOCALISATION D’UNE PARTICULE INDIVIDUALISÉE DANS UN ÉCHANTILLON ET PROCÉDÉ ASSOCIÉ
DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
[0001 ] La présente invention concerne de manière générale le domaine de la microscopie.
[0002] Elle concerne plus particulièrement un dispositif de localisation d’une particule individualisée dans un échantillon.
[0003] Elle concerne également un procédé de localisation d’une particule individualisée dans un échantillon.
[0004] L’invention trouve une application particulièrement avantageuse dans la réalisation de dispositifs de microscopie à super-résolution.
ETAT DE LA TECHNIQUE
[0005] Le prix Nobel de physique de 2014 est venu couronner les idées révolutionnaires de microscopie de fluorescence super-résolue, c’est-à-dire qui permettent de dépasser la limite de diffraction pour obtenir des images avec une résolution nanométrique et ainsi, de révéler l’architecture cellulaire à l’échelle moléculaire. L’un des principes centraux de cette microscopie super-résolue s’appuie sur le contrôle temporel des marqueurs moléculaires fluorescents. Ces derniers sont activés de façon séquentielle afin de maintenir des densités d’émetteurs suffisamment faibles pour pouvoir les isoler spatialement et les localiser de façon individuelle avec une précision nanométrique. En d’autres termes, cette microscopie super-résolue permet de localiser des particules individualisées dans un échantillon de façon extrêmement précise. Ces localisations sur des images successives, sur lesquelles les particules apparaissent clairsemées, sont ensuite combinées afin reformer une image super-résolue de l’échantillon.
[0006] Les techniques actuelles nécessitent toutefois des caméras comprenant des matrices de capteurs (aussi appelés pixels) pour permettre la localisation des molécules en champ large. Ces caméras sont des détecteurs relativement lents et les plus rapides sont très onéreuses. Certaines applications, telles que des mesures de durée de vie de fluorescence, sont ainsi inaccessibles à cause de la trop faible fréquence d’échantillonnage de ces caméras.
PRÉSENTATION DE L'INVENTION [0007] Un but de l’invention est donc de permettre la localisation de particules émettrice de lumière de manière rapide et fiable.
[0008] Dans ce contexte, la présente invention propose un dispositif de localisation d’une particule individualisée dans un échantillon présentant plusieurs régions, la particule étant adaptée à émettre des photons lorsqu’elle reçoit de la lumière, le dispositif comprenant :
- un support d’échantillon ;
- une source de lumière agencée pour produire un champ d’illumination adapté à éclairer l’échantillon placé sur son support, une intensité du champ d’illumination présentant une variation temporelle et spatiale, de sorte que ladite intensité présente, dans chaque région de l’échantillon, un motif temporel prédéterminé différent des motifs temporels de ladite intensité dans les autres régions ;
- un détecteur adapté à convertir des photons émis par la particule en réponse à son éclairement par le champ d’illumination en un signal représentatif de l’intensité du champ d’illumination reçue par la particule ;
- un calculateur programmé pour déterminer, sur la base d’une évolution temporelle du signal issu du détecteur et de la variation temporelle et spatiale de l’intensité du champ d’illumination, la région de l’échantillon dans laquelle est localisée la particule.
[0009] Ainsi, grâce à l’invention, la localisation de la particule est codée de façon bijective au moyen des motifs temporels, c’est-à-dire au moyen du champ d’illumination qui est structuré spatialement et qui est variable dans le temps. Ce codage permet ainsi une super-localisation de l’ensemble du champ d’observation avec un détecteur unique.
[0010] En effet, l’information de position de la particule est contenue dans la variation d’amplitude du signal qui est généré par le détecteur. Ainsi, bien que le détecteur ne puisse pas en lui-même spatialement déterminer l’origine des photons qu’il reçoit, l’évolution temporelle du signal qu’il génère est représentative du motif temporel qui éclaire la particule. L’analyse de cette l’évolution temporelle permet donc de remonter à la région de la particule.
[0011 ] Il n’est donc pas nécessaire d’imager l’échantillon en champ large avec une caméra pour déterminer la position de la particule dans l’échantillon, ce qui permet d’augmenter significativement la vitesse d’acquisition.
[0012] L’invention permet ainsi avantageusement de s’affranchir des limitations imposées par les fréquences d’échantillonnage des caméras.
[0013] De plus, la demanderesse a démontré, au moyen d’un calcul de la borne de Cramèr-Rao, qu’avec un tel champ d’illumination structuré spatialement et variable dans le temps, une précision de localisation 2,4 fois meilleure selon une dimension et 1 ,7 fois meilleurs selon deux dimensions que celle obtenue par la localisation traditionnelle peut être atteinte.
[0014] En résumé, de façon remarquable, la localisation de la particule au moyen du dispositif selon l’invention est précise et rapide.
[0015] Pour illustrer le type de codage bijectif proposé dans l’invention, il est par exemple prévu, selon une caractéristique avantageuse et non-limitative de l’invention, que chaque motif temporel de l’intensité du champ d’illumination produit par la source de lumière est une variation temporelle périodique de cette intensité et présente une fréquence spécifique, les fréquences spécifiques des motifs temporels associés à toutes les régions étant distinctes les unes des autres.
[0016] Ainsi, chaque région est associée à une fréquence spécifique unique. Il n’y a donc pas d’ambiguïté sur la localisation de la particule, même en utilisant un détecteur unique à la place d’une caméra.
[0017] D’autres caractéristiques avantageuses et non limitatives du dispositif conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :
- chaque motif temporel de l’intensité du champ d’illumination produit par la source de lumière est une variation temporelle périodique de cette intensité et présente une fréquence spécifique, les fréquences spécifiques des motifs temporels associés à toutes les régions étant distinctes les unes des autres ;
- les régions de l’échantillon sont alignées le long d’une direction principale du support et ladite source de lumière est agencée pour que chaque fréquence spécifique soit liée par une même relation à une distance entre la position de la région associée au motif temporel correspondant et une position de référence selon la direction principale ;
- ladite relation est une relation de proportionnalité ;
- chaque motif temporel de l’intensité du champ d’illumination produit par la source de lumière est une variation temporelle sinusoïdale de cette intensité ;
- le champ d’illumination est adapté à éclairer simultanément plusieurs régions de l’échantillon ; - la source de lumière comprend un dispositif optique de séparation de faisceau et un élément convergent agencés pour générer et faire interférer deux faisceaux lumineux l’un avec l’autre de manière à produire des franges d’interférence au niveau de l’échantillon placé sur son support ;
- le dispositif optique de séparation de faisceaux lumineux comprend au moins l’un des suivant : un miroir en coin présentant deux surfaces réfléchissantes perpendiculaires, un miroir et une lame partiellement réfléchissante ; un cube séparateur présentant une surface diagonale interne partiellement réfléchissante ;
- la source de lumière comporte en outre un élément optique mobile dont le déplacement entraîne le défilement desdites franges d’interférence pour produire chaque motif temporel de l’intensité du champ d’illumination ;
- ledit élément optique mobile comprend un dispositif rotatif agencé pour faire varier dans le temps un angle d’incidence de chaque faisceau lumineux sur l’échantillon placé sur son support, les angles d’incidences des faisceaux lumineux variant simultanément et dans des sens opposés ;
- le dispositif rotatif est un miroir rotatif ;
- la source de lumière comprend un modulateur de polarisation adapté à modifier la polarisation du champ d’illumination de sorte que le champ d’illumination est polarisé, séquentiellement ou simultanément, selon : une première direction de polarisation ; et une seconde direction de polarisation distincte de la première direction de polarisation ; le calculateur étant programmé pour déterminer une position de la particule selon la première direction principale et selon la seconde direction principale en fonction de la polarisation du champ d’illumination ;
- lorsque le champ d’illumination est simultanément polarisé selon la première et la seconde direction, les fréquences spécifiques de motifs temporels associés à la première direction de polarisation sont distinctes des fréquences spécifiques de motifs temporels associés à la seconde direction de polarisation.
[0018] L’invention propose aussi un procédé de localisation d’une particule individualisée dans un échantillon présentant plusieurs régions, la particule étant adaptée à émettre des photons lorsqu’elle reçoit de la lumière, le procédé comprenant les étapes suivantes :
- agencement de l’échantillon sur un support ;
- production d’un champ d’illumination, le champ d’illumination éclairant l’échantillon placé sur le support, une intensité du champ d’illumination présentant une variation temporelle et spatiale, de sorte que ladite intensité présente, dans chaque région de l’échantillon, un motif temporel prédéterminé différent des motifs temporels de ladite intensité dans les autres régions ;
- conversion des photons émis par la particule en réponse à son éclairement par le champ d’illumination en un signal représentatif de l’intensité du champ d’illumination reçue par la particule ;
- détermination, sur la base d’une évolution temporelle du signal issu du détecteur et de la variation temporelle et spatiale de l’intensité u champ d’illumination, de la région de l’échantillon dans laquelle est localisée la particule.
[0019] D’autres caractéristiques avantageuses et non limitatives du procédé conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :
- la particule est sélectionnée dans le groupe comprenant : les particules diffusantes, les particules fluorescentes, les particules phosphorescentes, les boites quantiques, protéines fluorescentes, molécules de colorant ;
- la particule est fluorescente, le champ d’illumination est produit par un laser pulsé à une fréquence supérieure à 1 MHz et le détecteur est adapté à compter des photons uniques, le procédé comprenant une étape de détermination d’un délai entre un puise du laser et l’émission d’un photon par la particule.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
[0020] La description qui va suivre en regard des dessins annexés, donnés à titre d’exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l’invention et comment elle peut être réalisée.
[0021 ] Sur les dessins annexés :
[0022] Figure 1 est une représentation schématique vue de dessus d’un dispositif de localisation d’une particule individualisée dans un échantillon selon un premier mode de réalisation,
[0023] Figure 2 est une représentation schématique vue de dessus d’un premier exemple d’un dispositif optique de séparation et d’un élément optique mobile du dispositif de la figure 1 ,
[0024] Figure 3 est une représentation schématique vue de dessus d’un deuxième exemple d’un dispositif optique de séparation et d’un élément optique mobile du dispositif de la figure 1 , [0025] Figure 4 est une représentation schématique d’un défilement de franges d’interférence au cours du temps (t) produite par le dispositif de la figure 1 en projection selon une direction principale (X) au niveau de l’échantillon,
[0026] Figure 5 est un premier exemple de spectre fréquentiel obtenu pour une particule à une première position selon la direction principale (X) de la figure 4, [0027] Figure 6 est un deuxième exemple de spectre fréquentiel obtenu pour une particule à une deuxième position selon la direction principale (X) de la figure 4, [0028] Figure 7 est une représentation graphique de la précision de localisation du dispositif de la figure 1 ,
[0029] Figure 8 est une représentation schématique vue de dessus d’un dispositif de localisation d’une particule individualisée dans un échantillon selon un deuxième mode de réalisation,
[0030] Figure 9 est une représentation schématique en perspective de franges d’interférences produites par le dispositif de la figure 8 au niveau de l’échantillon, [0031 ] Figure 10 est une représentation schématique du traitement fréquentiel d’un signal issu du détecteur afin de déterminer la trajectoire d’une particule,
[0032] Figure 11 est une représentation graphique de fréquences de défilement de franges d’interférences produites par le dispositif de la figure 8 en fonction de la position (x, y) d’une particule selon une première direction et selon une deuxième direction,
[0033] Figure 12 est un schéma bloc d’une séquence d’étapes d’un procédé selon l’invention permettant la localisation d’une particule individualisée dans un échantillon selon une direction principale,
[0034] Figure 13 est une représentation schématique en coupe dans un plan (O, X, Z) des faisceaux lumineux incidents sur l’échantillon à travers un objectif d’un dispositif selon l’invention et de franges d’interférences obliques produites par ces faisceaux au sein de l’échantillon.
[0035] Dans la description qui suit, les éléments correspondants ou identiques de chaque mode de réalisation de l’invention seront repérés par les mêmes signes de référence, et ne seront pas décrits en détails à chaque fois.
[0036] Deux modes de réalisation d’un dispositif 100 ; 300 de localisation d’une particule 2 individualisée dans un échantillon 3 présentant plusieurs régions 31 selon l’invention sont respectivement représentés sur les figures 1 à 6 et 8.
[0037] Le dispositif 100 ; 300 est un dispositif d’imagerie permettant de localiser la particule 2.
[0038] Selon l’invention, le dispositif 100 ; 300 de localisation de la particule 2 comprend :
- un support 110 ; 310 d’échantillon 3,
- une source de lumière agencée pour produire un champ d’illumination 200 ; 400 adapté à éclairer l’échantillon 3 placé sur son support 110 ; 310, une intensité du champ d’illumination 200 ; 400 présentant une variation temporelle et spatiale, de sorte que ladite intensité présente, dans chaque région 31 de l’échantillon 3, un motif temporel prédéterminé différent des motifs temporels de ladite intensité dans les autres régions ;
- un détecteur 140 ; 340 adapté à convertir des photons émis par la particule 2 en réponse à son éclairement par le champ d’illumination 200 ; 400 en un signal représentatif de l’intensité du champ d’illumination 200 ; 400 reçue par la particule
2 ;
- un calculateur 150 ; 350 programmé pour déterminer, sur la base d’une évolution temporelle du signal issu du détecteur 140 ; 340 et de la variation temporelle et spatiale de l’intensité du champ d’illumination 200 ; 400, la région 31 de l’échantillon
3 dans laquelle est localisée la particule 2.
[0039] La particule 2 est par exemple une molécule, un groupe de molécules ou un groupe d’atomes identiques. La particule 2 est ici adaptée à émettre des photons lorsqu’elle reçoit de la lumière. La particule 2 présente par exemple une réponse linéaire à la lumière quelle reçoit, ce qui signifie que son émission de photons est proportionnelle à l’intensité de la lumière qu’elle reçoit. La particule 2 peut aussi présenter une réponse non-linéaire à la lumière quelle reçoit, notamment lorsqu’un niveau d’excitation de la particule 2 est proche des valeurs associées à une saturation de la particule 2. Cela est par exemple le cas lorsque la particule utilisée est un fluorophore et qu’un taux d’absorption de photons par la particule 2 est du même ordre de grandeur que l’inverse d’une durée de vie de fluorescence de la particule 2.
[0040] La particule 2 est par exemple sélectionnée dans le groupe comprenant : les particules diffusantes (telles qu’une particule d’or), les particules fluorescentes, aussi appelées fluorophores, les particules phosphorescentes, les boites quantiques, les protéines fluorescentes, les molécules de colorant. La particule 2 présente ici une taille inférieure à un micromètre. Le dispositif 100 est donc plus spécifiquement un dispositif de microscopie. De manière générale, la particule 2 présente de préférence une taille comprise entre 1 nm et 40 nm.
[0041 ] La particule 2 est classiquement située dans le volume de l’échantillon 3 ou en surface de l’échantillon 3. L’échantillon 3 est au moins partiellement transparent à la lumière, notamment aux longueurs d’ondes générées par le dispositif 100 et décrites ci-après, afin que la lumière parvienne jusqu’à la particule 2.
[0042] Comme le montrent les figures 1 et 8, l’échantillon 3 est ici mince dans le sens où son épaisseur et nettement inférieure à sa largeur et à sa longueur. A titre d’exemple l’échantillon 3 est une tranche ou une section d’un tissu biologique. L’échantillon 3 s’étend donc sensiblement autour d’un plan moyen. L’échantillon 3 présente par exemple une épaisseur selon l’axe Z de la figure 1 comprise entre 10 micromètres (pm) et 100 pm et une longueur et/ou largeur dans le plan (OXY) de la figure 1 supérieure à 1 centimètre (cm).
[0043] Les régions 31 de l’échantillon 3 sont des portions distinctes de l’échantillon 3, l’ensemble des portions formant l’échantillon 3. Les régions 31 peuvent être ponctuelles ou étendues. Elles peuvent être étendues selon une, deux ou trois dimensions. Chaque région 31 peut par exemple correspondre à une position particulière au sein de l’échantillon 3. Ainsi, le terme « région » inclut notamment la notion de position ponctuelle définie par des coordonnées spécifiques (x,y,z) dans le repère (O, X, Y, Z) de la figure 1 . Le terme « région » peut également désigner par exemple un plan s’étendant selon les directions Y et Z et coupant l’axe X à une position particulière.
[0044] Le fait que la particule 2 soit individualisée signifie ici que la particule est spatialement séparée d’autres particules d’une distance supérieure à la limite de résolution du dispositif selon l’invention En pratique, ici, cela signifie que deux particules 2 voisines sont au moins distantes de 2 fois, et de préférence 5 fois, la limite de résolution donnée par la diffraction qui est d’environ 1 pm. Deux particules 2 voisines sont donc par exemple au moins distantes de 2 pm. Cela signifie par exemple que la région 31 contenant la particule 2 ne comprend aucune autre particule.
[0045] Le support 110 ; 310 du dispositif 100 ; 300 est adapté à recevoir l’échantillon 3. Ici, le support 1 10 ; 310 comprend plus spécifiquement une plaque 111 ; 311 s’étendant le long d’un plan d’extension.
[0046] En outre, le support 110 ; 310 est également adapté à déplacer l’échantillon 3 par rapport aux éléments optiques du dispositif 100 ; 300, notamment par rapport à un objectif 170 ; 370 amenant la lumière produite par la source de lumière vers le support 110 ; 310. A cet effet, le support 110 ; 310 comprend des actionneurs 112 ; 312, par exemple piézoélectriques, adaptés à déplacer la plaque 111 ; 311 dans son plan d’extension.
[0047] L’échantillon 3 est posé sur la plaque 111 ; 311 se sorte que le plan moyen de l’échantillon 3 s’étend parallèlement au plan d’extension de la plaque 111 ; 311 . [0048] Les régions 31 de l’échantillon 3 peuvent être définies de façon discrète, par exemple de manière à quadriller l’échantillon 3 en lignes et en colonnes perpendiculairement à son épaisseur. Chaque région 31 de l’échantillon 3 peut être associée à une zone correspondante de la plaque 111 ; 311 formant le support 110 ; 310, qui se trouve en regard de la région 31 lorsque l’échantillon 3 est disposé sur le support.
[0049] Les régions 31 de l’échantillon 3 peuvent aussi être définies de façon continue. Dans ce cas, elles sont par exemple repérées par des coordonnées, par exemple cartésiennes, dans un référentiel lié au support 110 ; 310. Le référentiel lié au support 110 ; 310 comprend par exemple un repère orthogonal référencé OXYZ sur les figures 1 et 8. Dans ce repère orthogonal OXYZ, l’épaisseur de l’échantillon 3 est définie comme la dimension de l’échantillon 3 long de l’axe Z, la longueur de l’échantillon 3 est définie comme la dimension de l’échantillon 3 long de l’axe X et la largeur de l’échantillon 3 est définie comme la dimension de l’échantillon 3 long de l’axe Y. L’origine O du repère orthogonal OXYZ est par exemple placée à l’un des coins de plaque 111 ; 311 lorsque celle-ci présente la forme d’un rectangle.
[0050] La source de de lumière du dispositif 100 ; 300 est partiellement représentée sur les figures 2, 3. Elle est aussi présentée de façon complète sur la figure 8 dans le cadre du deuxième mode de réalisation du dispositif 300. Elle est agencée pour produire un champ d’illumination 200 ; 400 adapté à éclairer l’échantillon 3 placé sur le support 110 ; 310. La source de lumière est donc configurée pour éclairer la particule 2 qui, en retour, émet des photons.
[0051 ] On désigne ici par l’expression « champ d’illumination » 200 ; 400 la répartition spatiale de l’intensité de la lumière (i.e. des faisceaux séparés décrits ultérieurement) émise par la source de lumière et acheminée jusqu’à l’échantillon 3. L’intensité du champ d’illumination 200 ; 400 produit par la source de lumière présente une variation temporelle et spatiale. [0052] Une telle variation temporelle et spatiale de l’intensité du champ d’illumination 200 est par exemple représentée en figure 4 dans le contexte du premier mode de réalisation du dispositif selon l’invention. Comme le montre la figure 4, à chaque instant t donné, l’intensité du champ d’illumination 200 produit par la source lumineuse du dispositif 100 selon l’invention présente des valeurs différentes à différents endroits de l’espace correspondant ici à différentes distances à l’origine O du repère orthogonal OXYZ (figure 1 ) le long de l’axe X. En particulier, ici, l’intensité du champ d’illumination 200 présente un ou des maxima (représentés par les zones blanches) et un ou des minima (représentés par les zones noires) le long de cet axe X.
[0053] La variation spatiale de l’intensité du champ d’illumination est différente à chaque instant t, ce qui conduit à la variation temporelle de cette intensité.
[0054] La variation temporelle de l’intensité du champ d’illumination 200 est illustrée sur la figure 4 par un déplacement du ou des maxima et de ou des minima au cours du temps. L’intensité du champ d’illumination 200 est par exemple définie au niveau d’une surface supérieure 32 de l’échantillon 3 qui fait face à la source de lumière. L’intensité du champ d’illumination 200 peut aussi être définie au niveau de la plaque 111.
[0055] Comme mentionné précédemment, quel que soit le mode de réalisation du dispositif considéré, la source de lumière est plus particulièrement agencée pour que l’intensité du champ d’illumination 200 ; 400 présente, dans chaque région 31 de l’échantillon 3, un motif temporel prédéterminé différent des motifs temporels de l’intensité dans les autres régions 31 de l’échantillon 3. En d’autres termes, chaque région 31 est associée de façon bijective à un motif temporel du champ d’illumination 200. 400. La variation temporelle du champ d’illumination 200 ; 400 attribue un code temporel spécifique à chaque zone de la plaque 111 ; 311 formant le support 110 ; 310 et donc à chaque région 31 de l’échantillon 3.
[0056] Pour cela, la source de lumière est ici agencée précisément par rapport au support 110 ; 310 de l’échantillon 3, par exemple par rapport aux zones de la plaque 111 ; 311 ou par rapport au référentiel OXYZ. Une fois l’échantillon 3 placé sur le support 110 ; 310, la source de lumière est alors agencée par rapport à l’échantillon 3 lui-même par la correspondance entre le support 110 ; 310 et l’échantillon 3.
[0057] Chaque motif temporel est une variation de l’intensité selon un schéma, ou une structure, prédéterminé. Chaque motif temporel est ainsi caractérisé par sa variation temporelle. Ainsi, pour chaque région 31 de l’échantillon, l’intensité du champ d’illumination 200 ; 400 varie temporellement de façon spécifique et prédéterminée.
[0058] Chaque motif temporel comprend par exemple une variation périodique de l’intensité. A titre d’exemple, chaque motif peut être plus spécifiquement une variation temporelle sinusoïdale de l’intensité, comme cela est décrit en détail ultérieurement.
[0059] Avantageusement, comme cela apparait clairement par la suite, plusieurs régions 31 sont illuminées de façon concomitante par le champ d’illumination 200 ; 400, par opposition à une illumination séquentielle de chacune des régions (les unes après les autres, à la manière d’un scan). Dit autrement, chaque région 31 est illuminée par son motif temporel, dans le sens où elle reçoit effectivement des photons, en même temps que d’autres régions 31 sont illuminées par leurs motifs temporels respectifs. Lorsque la taille de l’échantillon le permet (car suffisamment petite), toutes les régions 31 de l’échantillon 3 sont éclairées simultanément par le champ d’illumination 200 ; 400, ce qui signifie que l’échantillon 3 est éclairé dans son entièreté. De manière générale, toutes les régions 31 de l’échantillon 3 situées dans le champ de vue de l’objectif 170 ; 370 sont éclairées simultanément. La localisation est donc rapide puisque l’encodage est réalisé en parallèle pour toutes les régions.
[0060] Pour produire cette variation temporelle et spatiale du champ d’illumination 200 ; 400, la source de lumière comprend plus particulièrement un émetteur de lumière 130 ; 330 adapté à produire de la lumière et un ensemble d’éléments optiques agencés pour générer la variation du champ d’illumination 200 ; 400 à partir de la lumière produite par l’émetteur de lumière 130 ; 330. Dans l’exemple des premier et deuxième modes de réalisation décrits ici, cet ensemble d’éléments optiques comprend notamment un dispositif optique de séparation de faisceaux lumineux 122 ; 322 adapté à diviser le faisceau émis par l’émetteur de lumière 130 ; 330 en deux faisceaux lumineux, un élément optique mobile et un élément optique convergent adapté à superposer les deux faisceaux séparés pour les faire interférer. [0061 ] L’émetteur de lumière 130 ; 330 (figures 2, 3 et 8) est par exemple un laser, par exemple une diode laser. Le laser émet ici un faisceau lumineux initial 210 ; 410 dont la longueur d’onde centrale (i.e. d’amplitude la plus élevée) est par exemple comprise entre 405 nm et 800 nm. L’émetteur de lumière 130 : 330 peut être adapté à produire de la lumière de manière continue avec une intensité constante. Il peut également s’agir d’une source de lumière pulsée, produisant de la lumière à intervalles de temps réguliers.
[0062] Le détecteur 140 ; 340 (figures 1 et 8) du dispositif 100 ; 300 selon l’invention est adapté à convertir les photons émis par la particule 2 en réponse à son éclairement par le champ d’illumination 200 ; 400, en un signal. Le signal est ainsi représentatif de l’intensité du champ d’illumination 200 ; 400 reçue par la particule 2. Le signal est ici un signal électrique, numérique ou analogique. La variation temporelle du signal comprend une information sur le motif temporel du faisceau lumineux qui a éclairé la particule 2.
[0063] L’amplitude du signal produit par le détecteur 140 ; 340 est plus particulièrement représentative d’un nombre de photons émis par la particule 2 en réponse à son éclairement par le champ d’illumination 200 ; 400 par unité de temps. Par exemple, lorsque la particule 2 présente une réponse linéaire à la lumière quelle reçoit, l’amplitude du signal est alors proportionnelle à l’intensité du champ d’illumination 200 ; 400 reçue par la particule 2.
[0064] Le détecteur 140 ; 340 présente ici une fréquence d’échantillonnage supérieure à 1 MHz. Le détecteur est par exemple sélectionné dans le groupe comprenant : les mono-détecteurs, les matrices de mono-détecteurs, les détecteurs comprenant des diodes à avalanche à photon unique, les détecteurs événementiels dont les pixels génèrent des signaux en réponse à un changement d’intensité lumineuse reçue, les détecteurs neuromorphiques. Un mono-détecteur est défini comme un détecteur comprenant un seul élément photosensible (par exemple un seul pixel), il ne présente donc pas de résolution spatiale intrinsèque.
[0065] Le dispositif 100 ; 300 peut comprendre également un ensemble d’éléments optiques de mise en forme et d’orientation du ou des faisceaux lumineux.
[0066] Comme le montre plus particulièrement la figure 8, les éléments optiques de mise en forme comprennent par exemple un ou plusieurs diaphragmes 331 , ainsi qu’une ou plusieurs lentilles optiques 332 et un élargisseur de faisceau 334. Chaque diaphragme 331 permet d’éliminer de la lumière parasite du faisceau lumineux. Les lentilles optiques 332 permettent de mettre en forme le faisceau : ajuster son diamètre, le focaliser en un endroit précis ou créer un faisceau parallèle. Les éléments optiques d’orientation du ou des faisceaux comprennent par exemple des miroirs 333. [0067] Ces éléments optiques étant bien connus de l’Homme du métier, ils ne seront pas décrits en détails dans la suite de la description.
[0068] Le dispositif 100 ; 300 comprend en outre un miroir dichroïque 141 ; 341 (figures 1 et 8) agencé pour, d'une part, réfléchir la lumière produite par l’émetteur de lumière 130 ; 330 pour la diriger vers le support 110 ; 310 et l’échantillon 3 et, d’autre part, transmettre les photons émis par la particule 2 vers le détecteur 140 ; 340.
[0069] Le dispositif 100 comprend également une lentille de récupération 142 ; 342 qui focalise les photons émis par la particule 2 vers le détecteur 140.
[0070] Dans le premier mode de réalisation représenté sur la figure 1 , le faisceau lumineux issu de la lentille de récupération 142 est directement reçu par le détecteur 140. Dans le deuxième mode de réalisation représenté sur la figure 8, le dispositif 300 comprend en outre une fibre optique 343. La lentille de récupération 342 focalise les photons émis par la particule 2 en entrée de cette fibre optique 343, la fibre optique 343 les guidant jusqu’au détecteur 340.
[0071 ] Sur les figures 1 et 8, le trajet des photons émis par la particule 2 jusqu’au détecteur 140 ; 340 est schématisé par un faisceau lumineux large dont l’enveloppe est représentée en pointillés courts et longs (deux courts un long) alors que les faisceaux lumineux produits par la source de lumière présente une enveloppe représentée en pointillés réguliers. Cette représentation des faisceaux lumineux allant vers l’échantillon 3 en pointillés courts et longs apparait aussi sur les figures 2, 3, 9, et 13.
[0072] Le dispositif 100 ; 300 selon l’invention comprend enfin un calculateur 150 ; 350 programmé pour analyser les signaux produits par le détecteur 140 ; 340.
[0073] Le calculateur 150 ; 350 comprend ici au moins une mémoire et au moins un processeur. La mémoire est un support d'enregistrement lisible par ordinateur comprenant des instructions qui, lorsqu'elles sont exécutées par le processeur permettent de localiser la particule 2. Localiser la particule signifie notamment déterminer la région 31 de l’échantillon 1 dans laquelle se trouve la particule 2.
[0074] Le calculateur 150 ; 350 est plus particulièrement programmé pour déterminer, sur la base d’une évolution temporelle du signal et de la variation temporelle et spatiale de l’intensité du champ d’illumination 200 ; 400, c’est-à-dire sur la base des motifs temporels prédéterminés, la région 31 de l’échantillon 3 dans laquelle est localisée la particule 2. [0075] En effet, comme expliqué supra, chaque région 31 de l’échantillon 3 est associée de façon bijective à un motif temporel du champ d’illumination 200 ; 400. Le signal émis par le détecteur 140 ; 340 est représentatif de l’intensité du champ d’illumination 200 ; 400 reçue par la particule 2. L’évolution temporelle du signal émis par le détecteur 140 ; 340 est donc associée à un motif temporel du champ d’illumination 200 ;400 et par conséquent à une région 31 . Le calculateur 150 ; 350 est ainsi programmé pour analyser l’évolution temporelle du signal émis par le détecteur 140 ; 340, y reconnaître l’un des motifs temporels prédéterminés, et déterminer la région 31 associée à ce motif temporel, c’est-à-dire la région 31 dans laquelle se trouve la particule 2. Le calculateur 150 ; 350 repère ici les régions 31 de l’échantillon par rapport au support 110, par exemple via les différentes zones de la plaque 111 ; 311 du support 110 ; 310, ou, comme dans les modes de réalisations décrits ultérieurement, au moyen du repère OXYZ lié au support 110 ; 310.
[0076] Ici, le calculateur 150 ; 350 est aussi programmé pour commander la source de lumière. En variante, la source de lumière comprend un calculateur dédié. Ce calculateur dédié transmet alors les informations pertinentes, notamment au sujet des motifs temporels prédéterminés, au calculateur pour que ce dernier localise la particule 2.
[0077] La mise en œuvre du dispositif 100 ; 300 permet ici d’implémenter un procédé de localisation de la particule 2. Comme le montre la figure 12, ce procédé selon l’invention comprend les étapes suivantes :
E1 - agencement de l’échantillon 3 sur le support 110 ;310 ;
E2 - production du champ d’illumination 200, 400 par la source de lumière, et éclairement de l’échantillon 2 par le champ d’illumination 200 ; 400 ;
E3 - conversion, par le détecteur 140 ;340, des photons émis par la particule 2 en réponse à son éclairement par le champ d’illumination 200 ; 400 de manière à générer le signal ;
E4 - détermination, sur la base de l’évolution temporelle du signal et de la variation temporelle et spatiale de l’intensité du champ d’illumination 200, de la région 31 de l’échantillon 3 dans laquelle est localisée la particule 2.
[0078] Afin de bien comprendre l’invention, un premier mode de réalisation du dispositif 100 permettant de localiser la particule 2 le long d’une direction principale est tout d’abord décrit. Ce premier mode de réalisation est décrit en référence aux figures 1 à 6.
[0079] Cette direction principale correspond ici à la direction de défilement des franges d’interférences qui créent les motifs temporels prédéterminés, comme expliqué ultérieurement. Ainsi, selon ce premier mode de réalisation, le champ d’illumination 200 produit par la source de lumière présente des motifs temporels prédéterminés alignés selon la direction principale.
[0080] Dans ce premier mode de réalisation, la direction principale est parallèle à l’axe X du repère OXYZ. La direction principale est donc sensiblement parallèle au plan moyen de l’échantillon 3. Chaque région 31 s’étend ainsi sur toute la largeur de l’échantillon 3, i.e. sur toute sa dimension selon Y, et sur toute l’épaisseur de l’échantillon 3, i.e. sur toute sa dimension selon Z.
[0081 ] Dans ce premier mode de réalisation, les régions 31 sont ainsi elles-aussi alignées le long de la direction principale. Les régions 31 sont définies de façon continues. Chaque région 31 correspond à une abscisse, référencée x, selon l’axe X et qui peut prendre une valeur réelle. Chaque région 31 de l’échantillon 3 est donc caractérisée par une distance entre cette région 31 et une position de référence selon la direction principale. La position de référence est de préférence l’origine O du repère OXYZ.
[0082] Ainsi, la localisation de la particule 2 selon une direction principale correspond ici à la localisation de la particule 2 selon l’axe X. Par la suite, il est donc fait référence à la localisation de la particule 2 selon l’axe X, i.e. à la détermination de l’abscisse de la particule 2.
[0083] La longueur de l’échantillon 3 (donc selon l’axe X) selon laquelle la particule 2 est détectable est ici supérieure à 500 nm et de préférence supérieure à 1 pm. En d’autres termes, les régions 31 s’étendent sur une longueur supérieure à 500 nm et de préférence supérieure à 1 pm. Cette longueur dépend notamment de la portion de l’échantillon 3 située dans le champ d’observation du détecteur 140.
[0084] Selon un premier exemple de réalisation du dispositif de séparation optique 122 de la source de lumière du premier mode de réalisation, celui-ci comporte un dispositif du type interféromètre agencé pour séparer le faisceau lumineux initial 210 en deux faisceaux lumineux séparés 221 , 222 comme représenté sur la figure 2. Ces deux faisceaux lumineux séparés 221 , 222 sont superposés grâce à un objectif 170, pour faire les faires interférer l’un avec l’autre de manière à former des franges d’interférence 230. [0085] Le champ d’illumination 200 est alors formé par ces franges d’interférence 230. Les franges d’interférence 230 sont schématiquement représentées sur la figure 4. Sur cette figure (ainsi que sur les figures 8, 9 et 13), la demi-période d’une frange d’interférence donné qui inclut le maximum d’intensité de ladite frange contient des points alors que la demi-période qui inclut le minimum d’intensité ne contient aucun point. Les références numériques indiquant les franges d’interférence pointent aussi bien vers un type de demi-période que l’autre. Les franges d’interférence 230 s’étendent ici selon l’axe Y, i.e. perpendiculairement à l’axe X. Comme le montre bien la figure 4, le champ d’illumination 200 éclaire simultanément plusieurs abscisses X (c’est-à-dire plusieurs régions 31 ).
[0086] Dans l’exemple représenté en figure 2, le dispositif optique de séparation de faisceaux lumineux 122 comprend un miroir en coin 123 présentant deux surfaces réfléchissantes perpendiculaires, un miroir plan 124 et une lame semi- réfléchissante 125 qui sont agencés comme dans un interféromètre de Michelson utilisé en mode coin d’air.
[0087] Comme le montre la figure 2, le faisceau initial 210 est divisé, ici à parts égales, par la lame semi-réfléchissante 125 pour former les deux faisceaux lumineux séparés 221 , 222. Le faisceau lumineux séparé 210 est, d’une part, transmis par la lame semi-réfléchissante 125 en un premier faisceau lumineux séparé 221. Ce premier faisceau lumineux séparé 221 est réfléchi de manière parallèle par le miroir en coin 123 puis par la lame semi-réfléchissante 125 vers le support 110. Le faisceau initial 210 est, d’autre part, réfléchi par la lame semi- réfléchissante 125 en un second faisceau lumineux séparé 222. Ce second faisceau lumineux séparé 222 est réfléchi par le miroir plan 124 pour être transmis vers le support 110 par la lame semi-réfléchissante 125.
[0088] Dans l’exemple représenté en figure 3, le dispositif optique de séparation de faisceaux lumineux 122 est formé par un cube séparateur 126 présentant une surface diagonale interne semi-réfléchissante 127. Le cube séparateur 126 est par exemple réalisé en verre. Comme le montre la figure 3, le cube séparateur 126 est orienté de sorte que la surface diagonale interne semi-réfléchissante 127 est parallèle au faisceau initial 210 avant son entrée dans le cube séparateur 126. Le faisceau initial 210 est divisé, ici à parts égales, par la surface diagonale interne semi-réfléchissante 126 pour former deux faisceaux lumineux séparés 22T, 222’. Ces derniers ressortent ensuite parallèlement l’un à l’autre du cube séparateur 126. [0089] Dans tous les cas, l’élément optique convergent de la source de lumière comprend ici l’objectif 170 qui est muni d’une lentille convergente 128 agencée pour faire converger les deux faisceaux séparés 221 , 222 ; 22T, 222’ vers le support 110 pour faire interférer les deux faisceaux lumineux séparés 221 , 222 ; 22T, 222’ de manière à produire les franges d’interférence 230 (figure 4) au niveau de l’échantillon 3 placé sur son support 110.
[0090] L’élément optique mobile est agencé pour que son déplacement entraîne le défilement des franges d’interférence 230. Le déplacement de l’élément optique mobile est ici commandé par le calculateur 150.
[0091 ] Ce défilement des franges d’interférence 230 forme alors les motifs temporels. Ainsi, la variation temporelle du champ d’illumination 200 résulte du déplacement de l’élément optique mobile.
[0092] L’élément optique mobile est ici un miroir rotatif et plus particulièrement un miroir galvanométrique 129. Le déplacement de l’élément optique mobile est donc une rotation du miroir galvanométrique 129, ce qui est schématisée par des flèches courbes sur les figures 2 et 3.
[0093] Le miroir galvanométrique 129 est adapté à faire varier dans le temps l’angle d’incidence a de chaque faisceau lumineux séparé 221 , 222 ; 221 ’ ; 222’ sur l’échantillon 3 placé sur son support 110. Cela est avantageux car le coût d’un miroir galvanométrique 129 est élevé.
[0094] Pour cela, le miroir galvanométrique 129 est placé en amont du dispositif séparateur de faisceau 122. En d’autres termes, comme illustré sur les figures 2 et 3, le miroir galvanométrique 129 permet d’orienter, i.e. de modifier la direction et/ou de translater, le faisceau lumineux initial 210. Le miroir galvanométrique 129 est par exemple agencé de sorte que le faisceau lumineux initial 210 soit incident au niveau de l’axe de rotation du miroir galvanométrique 129.
[0095] De façon particulièrement avantageuse, une rotation du miroir galvanométrique 129 fait varier les angles d’incidences a des faisceaux lumineux séparés 221 , 222 ; 22T, 222’ simultanément et dans des sens opposés. Ainsi, la position du contact optique au niveau de l’échantillon 3 est invariante dans le temps malgré la rotation du miroir galvanométrique 129.
[0096] Dans l’exemple de la figure 2, cet effet est notamment obtenu grâce au miroir en coin qui permet de retourner le premier faisceau lumineux séparés 221. Dans cet exemple, lorsque le miroir galvanométrique 129 tourne dans le sens horaire, les faisceaux lumineux séparés 221 , 222 ; 22T, 222’ s’écartent l’un de l’autre de façon symétrique.
[0097] Dans l’exemple de la figure 3, une lentille 143 est placée entre le miroir galvanométrique 129 et le cube séparateur 126 pour fixer l’angle d’incidence du faisceau lumineux initial 210 sur le cube séparateur 126 malgré la rotation du miroir galvanométrique 129. Dans cet exemple, lorsque le miroir galvanométrique 129 tourne dans le sens trigonométrique, par exemple pour passer de la position référencée R1 à la position référencée R2, les faisceaux lumineux séparés 221 , 222 ; 22T, 222’ s’écartent l’un de l’autre de façon symétrique, ce qui est représenté par des flèches de même longueur.
[0098] Le fonctionnement du premier mode de réalisation du dispositif 100 permet d’implémenter le procédé de localisation la particule 2 selon l’axe X en déterminant son abscisse.
[0099] Dans ce premier mode de réalisation, l’étape E2 de production du champ d’illumination 200 et d’éclairement de l’échantillon 3 par le champ d’illumination 200 comprend la rotation du miroir galvanométrique 129.
[0100] Cette rotation entraine une variation identique des angles d’incidence a des faisceaux lumineux séparés 221 , 222 ; 22T, 222’ sur l’échantillon 3 et donc un défilement des franges d’interférence 230. A une vitesse de rotation donnée, les franges d’interférences 230 défilent plus spécifiquement avec une vitesse de défilement qui dépend de la distance avec le contact optique, auquel le déphasage entre les faisceaux lumineux séparés 221 , 222 ; 22T, 222’ est nul, selon l’axe X. Plus une région 31 est loin du contact optique, plus les franges d’interférences 230 qui l’éclairent défilent rapidement.
[0101 ] Sur la figure 4, le contact optique est positionné à l’abscisse référencée xo. Le contact optique définie ainsi la position de référence selon l’axe X (donc selon la direction principale). Comme expliqué précédemment, l’abscisse xo du contact optique est invariante au cours de la rotation car les angles d’incidences a des faisceaux lumineux séparés 221 , 222 ; 22T, 222’ varient simultanément et dans des sens opposés. Cela est schématiquement représenté sur la figure 4 par une intensité lumineuse maximum et constante au cours du temps à l’abscisse xo du contact optique.
[0102] Le miroir galvanométrique 129 effectue ici une rotation à une vitesse de rotation constante (mis à part une phase de démarrage et une phase d’arrêt). Cette rotation régulière implique que chaque motif temporel est une variation temporelle périodique, et plus spécifiquement sinusoïdale, de l’intensité du champ d’illumination 200 à une fréquence spécifique. En d’autres termes, chaque région 31 voit les franges d’interférence 230 défiler régulièrement. Pour chaque région 31 , l’intensité du champ d’illumination 200 reçue varie donc sinusoïdalement.
[0103] Toutes les fréquences spécifiques sont liées par une même relation à la distance entre la position de leur motif temporel associée, i.e. l’abscisse x de leur région 31 associée, et le contact optique selon la direction principale. Les fréquences spécifiques sont donc ici toutes liées par une même relation à la valeur X-Xo.
[0104] Ici, cette relation est plus particulièrement une relation de proportionnalité. Cela signifie que chaque région 31 voit les franges d’interférence 230 défiler à une fréquence spécifique qui est proportionnelle à l’abscisse x de ladite région 31 . Ainsi, en notant I l’intensité du champ d’illumination 200, et en attribuant la valeur zéro à l’abscisse xO, pour une région 31 donnée d’abscisse x, l’intensité I varie au cours du temps t selon la formule (1 ) : l(x,t) oc 1 +cos(a t x), où a est un coefficient de proportionnalité qui dépend notamment de la vitesse de rotation du miroir galvanométrique 129.
[0105] Ainsi, la rotation du miroir galvanométrique 129 à une vitesse de rotation constante implique que chaque motif temporel est une variation sinusoïdale de l’intensité du champ d’illumination 200 à une fréquence spécifique qui est proportionnelle à l’abscisse de la région 31 associée audit motif temporel.
[0106] Un tel défilement est illustré en figure 4 sur laquelle une première région 31 d’abscisse xi est située plus proche du contact optique (abscisse xo) qu’une deuxième région 31 d’abscisse X2, ce qui signifie que X2 > xi. Dans l’intervalle de temps représenté sur la figure 4, la première région 31 voit défiler environs quatre franges d’interférence 230 et la deuxième région 31 environs six franges d’interférence 230. L’intensité I2 reçue par la deuxième région 31 varie donc à une fréquence spécifique supérieure à celle de l’intensité 11 reçue par la première région 31 , les fréquences spécifiques étant respectivement proportionnelles aux abscisses X2 et xi .
[0107] Comme illustré en figure 4, la distance mesurée selon l’axe X sur laquelle la particule 2 est détectable est ici supérieure à l’interfrange L à au moins un instant donné, au cours de la rotation du miroir galvanométrique 129. De préférence, la distance mesurée selon l’axe X sur laquelle la particule 2 est détectable est supérieure à l’interfrange L pendant un intervalle de temps donné, par exemple, à tous les instants au-delà d’un instant de référence. Cette distance est par exemple ici supérieure à la distance X2-X0 selon l’axe X de la figure 4. En d’autres termes, les régions 31 s’étendent sur une longueur supérieure à l’interfrange L à au moins un instant donné au cours de la rotation du miroir galvanométrique 129, de préférence sur un intervalle de temps donné. Cela signifie qu’audit instant donné ou dans l’intervalle de temps donné, les régions 31 sont illuminées par plus qu’une frange d’interférence 230, de préférence par plusieurs franges d’interférence.
[0108] Ici, au cours de l’étape E2, le miroir galvanométrique 129 effectue plus particulièrement des oscillations, c’est-à-dire des rotations dans un sens et dans l’autre. Dans un sens de rotation, de nouvelles franges d’interférence 230 apparaissent sur l’échantillon 3 au cours du temps, comme c’est le cas sur la figure 4, dans l’autre sens de rotation, des franges d’interférence 230 sortent de l’échantillon 3 au cours du temps. Dans les deux cas, les franges d’interférence 230 défilent aux fréquences spécifiques.
[0109] L’amplitude de ces oscillations est par exemple inférieure à 5 degrés. Une rotation du miroir galvanométrique 129 est par exemple effectuée dans un intervalle de temps compris entre 10 ms et 100 ms. La fréquence d’oscillation du miroir galvanométrique 129 est alors comprise entre 10 Hz et 5000 Hz.
[0110] La fréquence de défilement des franges d’interférence 230 est donc de plusieurs ordres de grandeurs plus élevée que la fréquence d’oscillation du miroir galvanométrique 129, ce qui permet de localiser la particule 2 très rapidement. En effet, comme cela apparait ci-dessous, il est préférable que la particule 2 soit éclairée par plusieurs périodes du motif temporel pour obtenir une détermination précise de sa localisation.
[0111 ] Les fréquences spécifiques, c’est-à-dire les fréquences de défilement des franges d’interférence 230, peuvent par exemple s’élever jusqu’à 1 MHz.
[0112] Après la conversion des photons émis par la particule 2 pour former le signal, à l’étape E3, le calculateur 150 analyse l’évolution temporelle du signal à l’étape E4.
[0113] Ici, l’étape E4 comprend plus spécifiquement la réalisation par le calculateur 150 d’une transformée de Fourier du signal. Cela permet de déterminer les fréquences contenues dans le signal. [0114] Pour rappel, l’évolution temporelle du signal est représentative du motif temporel qui a éclairé la particule 2. A titre d’exemple, lorsque la particule 2 est située à l’abscisse xi, l’évolution temporelle du signal est représentative de l’intensité 11 dans le sens où le signal varie principalement à la même fréquence que l’intensité 11 .
[0115] La transformée de Fourier permet ainsi de déterminer la fréquence spécifique associée audit motif temporel.
[0116] En pratique, la transformée de Fourier présente un pic, i.e. un maximum M1 , M2, correspondant à la fréquence spécifique du motif temporel qui éclaire la particule 2.
[0117] Le calculateur 150 détermine ensuite la région 31 dans laquelle se situe la particule 2. Dans ce premier mode de réalisation, il peut être déduit de la formule (1 ) que la fréquence spécifique, notée f, du motif qui éclaire la particule située à l’abscisse x est donnée par : f = a x. L’abscisse x de la région 31 dans laquelle se situe la particule 2 est donc donnée par x = f/a. Le coefficient a est par exemple déterminé en déplaçant l’échantillon 3, et donc la particule 2, en translation selon l’axe X au moyen des actionneurs 112. Cela permet en effet de déterminer le coefficient a par résolution d’un système de deux équations à deux inconnus.
[0118] Dit autrement, sur la base de la fréquence spécifique, le calculateur 150 reconnaît donc le motif temporel qui éclaire la particule 2. Ensuite, chaque région 31 étant associée de façon bijective à un motif temporel, le calculateur 150 détermine la région 31 dans laquelle se situe la particule 2.
[0119] A titre d’exemple, lorsque la particule 2 est située à l’abscisse xi sur la figure 4, la transformée de Fourier du signal peut en pratique présenter un spectre fréquentiel tel qu’illustré sur la figure 5. En comparaison, lorsque la particule 2 est située à l’abscisse X2 sur la figure 4, la transformée de Fourier du signal peut en pratique présenter un spectre fréquentiel tel qu’illustré sur la figure 6. Le spectre fréquentiel de la figure 6 présente un maximum M2 à une fréquence environs deux fois supérieure à celle du maximum M1 du spectre de la figure 5, ce qui dérive du fait que l’abscisse X2 est environs deux fois supérieure à l’abscisse xi (ici car la relation entre les fréquences spécifiques et les abscisses est une relation de proportionnalité). Sur les figures 5 et 6, les pics à mi-hauteur des maximums référencés M1 et M2 correspondent ici à une deuxième particule positionnée à une autre abscisse. [0120] La fréquence spécifique peut être déterminée très précisément grâce à la fréquence d’échantillonnage élevé du détecteur 140. De préférence, plusieurs périodes de variation de l’intensité du champ d’illumination 200, par exemple plus de quatre, sont détectées par le détecteur 140 afin de d’augmenter la détermination de la fréquence spécifique. Ainsi, plus les franges d’interférence 230 défilent rapidement plus la détermination de la fréquence spécifique en un temps donné est précise (puisque plus de périodes sont détectées).
[0121 ] Cette détermination très précise de la fréquence spécifique permet donc une détermination près précise de l’abscisse x de la particule 2 par la formule x = f/a précitée. En ce sens, le procédé de localisation de la particule 2 est donc bien un procédé de super-résolution.
[0122] Sur la figure 7, on compare graphiquement des précisions de localisation d’une particule obtenues expérimentalement, exprimées par des déviations standards o en fonction du nombre de photons N détectés, à la limite théorique de Cramer-Rao (trait plein) pour un rapport signal à bruit égal à celui des mesures expérimentales (ici de un). Les précisions expérimentales sont représentées par des ronds ou des étoiles en fonction de l’angle de collection utilisé pour capter la lumière réfléchie par l’échantillon 3 (voir en haut à droite de la figure 7). Comme le montre la figure 7, les précisons expérimentales sont très proches de la limite inférieure théorique, ce qui illustre bien la super-résolution du procédé de localisation.
[0123] Le procédé mis en œuvre dans ce premier mode de réalisation permet aussi de localiser selon l’axe X plusieurs particules présentent dans l’échantillon 3. Par exemple, dans le cas où deux particule 2 sont positionnées aux abscisses xi et X2, tel que cela est représenté sur la figure 4, le signal est représentatif à la fois de l’intensité 11 et de l’intensité I2. Le spectre fréquentiel du signal présente alors deux pics : un à la fréquence de variation de 11 et l’autre à la fréquence de variation de I2. Le calculateur 150 détermine alors les deux abscisses correspondant aux deux fréquences spécifiques détectées. Lorsque le nombre de particules n’est pas prédéterminé, les pics sont par exemple distingués du bruit par un seuillage approprié.
[0124] En variante de ce premier mode de réalisation, le miroir galvanométrique peut effectuer une rotation à une vitesse non-constante. Les motifs temporels ne sont alors pas des variations sinusoïdales. Un motif pourrait par exemple être une sinusoïde dont la fréquence spécifique augmente au cours du temps. De nombreux motifs temporels sont réalisables en adaptant la rotation du miroir galvanométrique. Le calculateur est alors aussi programmé pour reconnaître ces motifs temporels, par exemple en ayant en mémoire l’ensemble des motifs temporels qui sont prédéterminées, afin de déterminer la région dans laquelle se situe la particule.
[0125] Jusqu’à présent il a été décrit comment localiser la particule 2 dans une dimension (ici selon l’axe X). Le dispositif 100 permet toutefois de localiser la particule en deux dimensions, i.e. selon la direction principale et selon une direction secondaire distincte de la direction principale.
[0126] Pour cela, il est par exemple possible d’implémenter une autre source de lumière fonctionnant en alternance avec la source de lumière, ce qui signifie qu’elles éclairent l’échantillon 3 à tour de rôle. L’autre source de lumière étant adapté à localiser la particule 2 selon la direction secondaire au moyen d’un autre champ d’illumination présentant une autre variation spatiale et temporelle.
[0127] De manière avantageuse, il est aussi possible de localiser la particule 2 selon deux dimensions, sans utiliser deux sources de lumière éclairant alternativement l’échantillon.
[0128] Selon le second mode de réalisation du dispositif 300 représenté en figure 8, la localisation de la particule 2 est réalisées en deux dimensions au moyen d’une unique source de lumière.
[0129] L’idée de ce second mode de réalisation est de polariser le champ d’illumination 400 selon deux directions de polarisation distinctes.
[0130] Dans ce second mode de réalisation, la direction secondaire est ici parallèle à l’axe Y du repère XYZ. Ainsi, les directions principale et secondaire sont orthogonales.
[0131 ] Dans ce second mode de réalisation, chaque région 31 s’étend sur toute l’épaisseur de l’échantillon 3, i.e. sur toute sa dimension selon Z. Les régions 31 sont ainsi réparties de sorte à quadriller la surface de l’échantillon 3. Les régions 31 sont définies de façon continue. Chaque région 31 est caractérisée par une abscisse, référencé x, selon l’axe X et une ordonnée, référencé y, selon l’axe Y qui peut prendre une valeur réelle.
[0132] La localisation de la particule 2 selon une direction secondaire est ici équivalente à la localisation de la particule 2 selon l’axe Y. Par la suite, il est donc fait référence à localisation de la particule 2 selon l’axe Y, i.e. à la détermination de l’ordonnée y de la particule 2. Ici, la particule 2 est donc localisée dans le plan XY. [0133] La surface du plan XY dans laquelle la particule 2 est détectable est ici supérieure à 500x500 nm2 et de préférence supérieure à 1 pm2. En d’autres termes, les régions 31 s’étendent sur une surface supérieure à 500x500 nm2 et de préférence supérieure à 1 pm2. Cette surface dépend notamment de la portion de l’échantillon 3 située dans le champ d’observation du détecteur 140. Cette surface est aussi ici supérieure au carrée de l’interfrange à au moins un instant donné au cours de la rotation du miroir galvanométrique 129.
[0134] Dans ce second mode de réalisation, le champ d’illumination 400 peut être polarisé selon une première direction de polarisation, le champ d’illumination 400 permet alors de localiser la particule 2 selon l’axe X. Cela signifie que, selon la première direction de polarisation, le champ d’illumination 400 présente une première intensité qui varie spatialement et temporellement de manière à permettre la localisation de la particule selon la direction principale conformément au premier mode de réalisation.
[0135] Le champ d’illumination 400 peut aussi être polarisé selon une deuxième direction de polarisation, ici orthogonale à la première, le champ d’illumination 400 permet alors de localiser la particule 2 selon l’axe Y. Cela signifie que, selon la deuxième direction de polarisation, le champ d’illumination 400 présente une deuxième intensité qui varie spatialement et temporellement de manière à permettre la localisation de la particule selon la deuxième principale conformément au premier mode de réalisation.
[0136] Ici, la première direction de polarisation du champ d’illumination 400 est, au niveau de l’échantillon 3, orthogonale à la direction principale. La première direction de polarisation est plus spécifiquement parallèle à l’axe Y. La deuxième direction de polarisation du champ d’illumination 400 est quant à elle, au niveau de l’échantillon 3, parallèle à la direction principale. La deuxième direction de polarisation P2’ est plus spécifiquement parallèle à l’axe X (figure 9). Ainsi, chaque direction de polarisation, par exemple la deuxième direction de polarisation P2’ sur la figure 9, est orthogonale au plan dans lequel se propage les faisceaux lumineux séparés 422, c’est-à-dire le plan YZ dans le cas de la figure 9.
[0137] Ainsi, les polarisations sont parallèles aux franges d’interférences 430. Cela permet de maximiser le contraste des franges d’interférences. En d’autres termes, la première intensité présente des premiers motifs temporels générés par un défilement de premières franges d’interférence 431 s’étendant rectilignement parallèlement à la première direction de polarisation, et, réciproquement, la deuxième intensité présente des deuxièmes motifs temporels générés par un défilement de deuxièmes franges d’interférence 432 s’étendant rectilignement parallèlement à la deuxième direction de polarisation (figure 9).
[0138] Pour cela, en pratique, la source de lumière du dispositif 300 selon le deuxième mode de réalisation comprend, comme dans le premier mode de réalisation décrit précédemment, un émetteur de lumière 330, un dispositif de séparation de faisceau 322 et un élément optique mobile.
[0139] L’émetteur de lumière 330 comprend une source laser et l’élément optique mobile comprend un miroir galvanométrique 329.
[0140] Le dispositif optique de séparation de faisceaux lumineux 322 comprend, comme dans le premier mode de réalisation, un miroir en coin 323 présentant deux surfaces réfléchissantes perpendiculaires, un miroir plan 324 et une lame semi- réfléchissante 325 agencés dans une configuration du type interféromètre de Michelson.
[0141 ] Ces éléments sont similaires à ceux du premier mode de réalisation et ne seront pas décrits plus en détails ici.
[0142] Comme le montre la figure 8, la source de lumière du deuxième mode de réalisation comprend en outre :
- un modulateur de polarisation 360 ; et
- premier cube polarisant 361 et un second cube polarisant 362.
[0143] Le modulateur de polarisation 360 est placé entre l’émetteur de lumière 330 et le miroir galvanométrique 329. Le modulateur de polarisation 160 est adapté à polariser le faisceau initial 410 selon la première direction de polarisation et/ou la deuxième direction de polarisation. Ce modulateur peut être un modulateur électrooptique tel qu’une cellule de Pockels ou magnéto-optique tel qu’une cellule de Faraday.
[0144] Le premier cube polarisant 361 est placé en aval du dispositif optique de séparation de faisceaux lumineux 322 de manière à diriger les faisceaux lumineux séparés 421 polarisés selon la première direction de polarisation vers un premier chemin optique 371 et les faisceaux lumineux séparés 422 polarisés selon la deuxième direction de polarisation vers un deuxième chemin optique 375. En faisant tourner la polarisation du faisceau initial 410 entre la première direction de polarisation et la deuxième direction de polarisation, le modulateur de polarisation 360 permet de sélectionner respectivement le premier chemin optique 371 et le deuxième chemin optique 375.
[0145] Le long du le premier chemin optique 371 , la polarisation est initialement orthogonale aux franges d'interférence 330. La source de lumière comprend une lame demi-onde 372 disposée sur le premier chemin optique 371 de manière à tourner la polarisation de 90 degrés perpendiculairement à la direction de propagation. Ainsi, au niveau de l’échantillon 3, la première direction de polarisation est parallèle aux premières franges d’interférence 431. Cette rotation de la polarisation est schématisée en figure 8 par le passage d’une polarisation horizontale P1 à une polarisation verticale P2. Comme le montre aussi la figure 8, le long du premier chemin optique 371 , la polarisation et les premières franges d’interférences 430 sont verticales après la lame demi-onde 372.
[0146] Le long du deuxième chemin optique 375, il est nécessaire de tourner les deuxièmes franges d’interférences 432 de 90 degrés pour qu’elles s’étendent perpendiculairement aux premières franges d’interférences 431 de manière à permettre la localisation selon l’axe Y. Pour cela, la source de lumière comprend un montage de type prisme de Dove 376 disposé sur le deuxième chemin optique 375 de manière à faire tourner les deuxièmes franges d'interférence 432. La polarisation est quant à elle tournée par le modulateur de polarisation 360 lorsque celui-ci polarise le faisceau initial selon la deuxième direction de polarisation. Cette rotation de la polarisation, qui permet aussi de sélectionner le deuxième chemin optique 375, est schématisée en figure 8 par le passage d’une polarisation verticale PT à une polarisation horizontale P2’.
[0147] Le montage de type prisme de Dove 376 est ici un prisme en réflexion réalisé au moyen de miroirs. Cela permet de ne pas introduire de biréfringence supplémentaire. Classiquement, deux miroirs sont disposés à 45 degrés de la direction de propagation et un troisième, entre ces deux miroirs, est disposé parallèlement à la direction de propagation.
[0148] Enfin, le deuxième cube polarisant 362 recombine les deux polarisations, i.e. les faisceaux lumineux issus des deux chemins optiques 371 , 375, avant que le champ d’illumination 400 éclaire l’échantillon 3.
[0149] Le fonctionnement du deuxième mode de réalisation du dispositif 100 permet d’implémenter le procédé de localisation de la particule 2 décrit précédemment selon la direction principale et selon la direction secondaire, ce qui revient ici à déterminer son abscisse x selon l’axe X et son ordonnée y selon l’axe Y.
[0150] Pour cela, le champ d’illumination 400 peut être polarisé selon la première direction de polarisation et selon la deuxième direction de polarisation séquentiellement ou simultanément.
[0151 ] Lorsque les polarisations du champ d’illumination 400 sont mises en œuvre de façon séquentielle, i.e. en alternance, l’échantillon 3 est éclairé soit par les premières franges d’interférence 431 , soit par les deuxièmes franges d’interférence 432. Le modulateur de polarisation 360 permet donc de sélectionner la direction de localisation de la particule 2 dans le sens où il permet de choisir entre une localisation selon l’axe X et une localisation selon l’axe Y. L’information sur une polarisation instantanée du champ d’illumination 400, c’est-à-dire le fait que le champ d’illumination 400 est polarisé selon la première direction de polarisation ou selon la deuxième direction de polarisation, est transmise du modulateur de polarisation 360 au calculateur 350. Le calculateur 350 est alors programmé pour déterminer, sur la base de cette information sur la polarisation du champ d’illumination à l’instant t, que la fréquence spécifique qu’il détecte dans le spectre fréquentiel à l’instant t s’applique à la localisation selon l’axe X, i.e. à la détermination de l’abscisse de la particule 2, ou que la fréquence spécifique qu’il détecte dans le spectre fréquentiel à l’instant t s’applique à la localisation selon l’axe Y, i.e. à la détermination de l’ordonnée de la particule 2.
[0152] La figure 10 illustre un suivi bidimensionnel (suivant les axes X et Y) d’une nanoparticule fluorescente en mouvement aléatoire brownien dans un liquide. Des fréquences spécifiques associées à chaque axe X, Y sont alternativement extraites du signal (référencé D en bas à gauche de la figure 10) issu du détecteur. Des sections temporelles T1 , T2 du signal codent en effet alternativement la position de la particule selon chaque axe X, Y. Sur la figure 10, deux sections temporelles T1 , T2 successives sont encadrées, une première section T1 codant pour l’axe Y et la suivante T2 pour l’axe X (la section T1 est aussi représentée agrandie). Le spectre fréquentiel S1 , S2 de chaque section temporelle T1 , T2 permet de déterminer la fréquence spécifique de cette section (en haut à gauche de la figure 10, pointée par une flèche x ou y). L’évolution temporelle des fréquences spécifiques peut alors être représentée par des courbes temps-fréquence C1 , C2. En haut à droite de la figure 10, la courbe temps-fréquence référencée C1 est relative à l’axe Y tandis que la courbe temps-fréquence référencée C2 est relative à l’axe X. L’évolution temporelle des fréquences spécifiques permet de déduire la position de la particule au cours du temps selon les axes X et Y, c’est-à-dire la trajectoire de la particule, comme cela est représenté en bas à droite de la figure 10.
[0153] Lorsque les polarisations du champ d’illumination 400 sont mises en œuvre simultanément, l’échantillon 3 est éclairé à la fois par les premières franges d’interférence 431 et les deuxièmes franges d’interférence 432.
[0154] Le signal détecté par le détecteur 340 est alors représentatif à la fois du défilement des première franges d’interférence 431 et du défilement des deuxièmes franges d’interférence 432. Le spectre fréquentiel comprend alors deux pics : un premier pic correspondant à la fréquence de défilement des premières franges d’interférence 431 (c’est-à-dire une première fréquence spécifique du premier motif qui éclaire la particule 2) et un deuxième pic correspondant à la fréquence de défilement des deuxièmes franges d’interférence 432 (c’est-à-dire une deuxième fréquence spécifique d’un deuxième motif qui éclaire la particule 2).
[0155] De préférence, les fréquences de défilement des premières franges d’interférence 431 (c’est-à-dire des premières fréquences spécifiques des premiers motifs temporels) sont distinctes les fréquences de défilement des deuxièmes franges d’interférence 432 (c’est-à-dire des deuxièmes fréquences spécifiques des deuxièmes motifs temporels). Ainsi, comme le montre la figure 11 , les fréquences de défilement des premières franges d’interférence 431 appartiennent à une première plage de fréquences f1 disjointe (ici supérieure) d’une deuxième plage de fréquences f2 des fréquences de défilement des deuxièmes franges d’interférence 432
[0156] Ainsi, le calculateur 350 peut attribuer sans ambigüité chacun des deux pics du spectre fréquentiel, c’est-à-dire les fréquences spécifiques, soit à une fréquence de défilement des premières franges d’interférence 431 lorsque le pic appartient à la première plage de fréquences f1 , soit à une fréquence de défilement des deuxièmes franges d’interférence 432 lorsque le pic appartient à la deuxième plage de fréquences f2. Le calculateur 350 peut donc déterminer pour chaque pic, si ce dernier correspond à une abscisse ou une ordonnée de la particule 2.
[0157] Pour cela, chaque chemin optique 371 , 375 peut être réglé indépendamment de manière à ajuster la position du contact optique pour chacune des directions de polarisation. Modifier la position du contact optique permet en effet de décaler les plages de fréquences. Cela est par exemple réalisé en déplaçant l’échantillon 3 grâce aux actionneurs 112 ou en modifiant l’orientation d’un des miroirs 333 des éléments optiques d’orientation du ou des faisceaux lumineux.
[0158] Le procédé mis en œuvre par le dispositif 300 conforme au deuxième mode de réalisation peut permettre aussi de localiser plusieurs particules présentes dans l’échantillon 3 dans le plan XY. Par exemple, avec deux particules, le calculateur 350 effectue l’appariement d’une abscisse avec une ordonnée sur la base des intervalles de temps pendant lesquels les particules 2 émettent des photons. En effet, les deux particules s’illuminent à des instants différents de par la stochasticité d’apparition de l’émission des particules observées en régime clairsemé, c’est-à- dire lorsque qu’il y a une unique particule 2 dans un volume de diffraction ce qui assure que les taches de diffraction correspondant à deux particules différentes de l’échantillon peuvent être séparées. Ceci peut être obtenu soit spontanément, soit en induisant un contrôle optique et/ou chimique des particules. En d’autres termes, l’émission de photons par chaque particule intervient avec un décalage dans le temps aléatoire après son illumination. Les émissions de photons des particules de l’échantillon sont donc décalées les unes par rapport aux autres de manière aléatoire, ce qui donne l’impression qu’elles clignotent.
[0159] Ainsi, lorsque les polarisations du champ d’illumination 400 sont mises en œuvre simultanément, à un instant donné, le spectre fréquentiel comprend uniquement les fréquences spécifiques d’une seule particule, qui peut donc être localisée dans le plan XY. Chaque spectre fréquentiel qui est analysé par le calculateur 350 est par exemple obtenu par transformée de Fourier effectuée sur une période de 50 ms du signal. Lorsque les polarisations du champ d’illumination 400 sont mises en œuvre séquentiellement, l’alternance entre les deux polarisations est effectuée à une cadence élevée pour avoir une alternance au moins une fois, et de préférence plusieurs fois, pendant l’intervalle de temps pendant lequel une particule émet des photons. L’alternance est par exemple effectuée toutes les 25 ms et chaque spectre fréquentiel analysé est par exemple obtenu par transformée de Fourier effectué sur une période de 50 ms du signal.
[0160] De préférence, pour individualiser les particules dans l’échantillon 3, l’échantillon 3 comprend une concentration de particules émettant simultanément inférieure à 1 particules/pm3 Avec une telle concentration, les particules apparaissent alors clairsemées dans l’échantillon 3 lorsqu’elles émettent.
[0161 ] Jusqu’à présent il a été décrit comment localiser la particule 2 dans une dimension (premier mode de réalisation) ou deux dimensions (deuxième mode de réalisation). L’invention permet toutefois également de localiser la particule en trois dimensions, i.e. selon la direction principale et la direction secondaire et selon une troisième direction non-coplanaire avec les deux autres. La troisième direction est ici parallèle à l’axe Z du repère XYZ. Ainsi, la direction principale, la direction secondaire et la troisième direction sont orthogonales. Ici, la particule 2 est donc localisée dans le repère XYZ.
[0162] Pour cela, il est par exemple possible d’implémenter un système combinant le dispositif 300 selon le deuxième mode de réalisation, de manière à localiser la particule 2 dans le plan XY, avec le dispositif 100 selon le premier mode de réalisation mais orienté de sorte que sa direction principale soit parallèle à l’axe Z, ce qui signifie ici que ce dernier éclaire l’échantillon 3 au travers de sa tranche avec des faisceaux incidents parallèle au plan XY.
[0163] Avantageusement, il est ici prévu d’adapter le dispositif 300 selon le deuxième mode de réalisation en redivisant une des polarisations, i.e. en redivisant un des chemins optiques 371 , 375. Cela permet d’utiliser un seul laser, un seul miroir galvanométrique et un seul dispositif optique de séparation de faisceau et de convergence.
[0164] Pour cela, le premier chemin optique 371 comprend par exemple un troisième cube polarisant divisant en deux la polarisation de ce premier chemin optique 371. Les deux nouvelles polarisations sont recombinées avant d’éclairer l’échantillon 3. Cela permet la localisation selon l’axe Z (i.e. en épaisseur) au moyen de franges d’interférence obliques par rapport à l’axe Z.
[0165] L’idée est par exemple d’incliner des franges d’interférences dans la direction Z+X et d’autres franges d’interférence dans la direction Z-X. La figure 13 illustre des franges d’interférence 631 inclinées dans la direction Z+X. Pour cela, les faisceaux lumineux séparés 621 , 622 de chaque nouvelle polarisation (celle selon Z+X sur la figure 13) sont spatialement écartés l’un de l’autre dans le plan focal arrière Pf de l’objectif 570. En pratique, les faisceaux lumineux séparés 621 , 622 sont décentrés par rapport à l’axe de l’objectif 570 dans le plan focal arrière Pf. En effet, comme illustré sur la figure 13, l’angle d’incidence de l’un des deux faisceaux lumineux séparés 621 , 622 sur l’échantillon 3 dépend de sa position dans le plan focal arrière Pf. Son écart par rapport à l’axe de l’objectif 570 est plus particulièrement proportionnel au sinus de cet angle d’incidence. Les franges d’interférence 631 sont en pratique inclinées d’un angle donné (45° sur la figure 13) égal la moyenne des angles d’incidence des deux faisceaux lumineux séparés 621 , 622. Pour maintenir une modulation suivant un axe donné (par exemple selon X+Z sur la figure 13), les deux faisceaux lumineux séparés 621 , 622 bougent dans le plan focal arrière Pf en s’éloignant et se rapprochant de l’axe de l’objectif 570.
[0166] Le dispositif 100 ; 300 selon l’invention peut être mis en œuvre dans de nombreuses applications.
[0167] A titre d’exemple, le dispositif 100 ; 300 selon l’invention peut être utilisé pour réaliser de l’imagerie de temps de vie de particules fluorescentes. En d’autres termes, le dispositif 100 ; 300 permet alors une localisation plus précise que la limite de diffraction (grâce à la variation du champ d’illumination détaillée ci-dessus) de la ou des particules plus tout en mesurant une durée de relaxation de la fluorescence de la particule 2. La durée de relaxation de la fluorescence de la particule 2, i.e. la durée pendant laquelle la particule émet de la fluorescence après illumination par le champ d’illumination, renseigne sur son enivrement local chimique ou biochimique.
[0168] Pour cela, l’émetteur de lumière 130 ; 330 est plus particulièrement un laser pulsé à une fréquence supérieure à 1 MHz. Le détecteur 140 ; 340 est quant à lui adapté à détecter un photon unique. L’enveloppe du signal est alors représentative du défilement des franges d’interférences, ce qui permet la localisation, et les détections individuelles de photons qui forment le signal peuvent permettent de mesurer un délai entre un puise du laser et l’émission d’un photon par la particule en réponse à ce puise, ainsi que la durée d’émission des photons par la particule ce qui permet de déterminer la durée de vie de fluorescence de la particule, c’est- à-dire la durée de l’émission de photons par la particule 2, ou en d’autres termes un temps de relaxation de la particule 2.
[0169] Encore en exemple, le dispositif 100 ; 300 permet de suivre le déplacement de la particule 2, typiquement lorsque l’échantillon 3 est un tissu biologique, puisque la particule 2 est localisée à une cadence élevée qui est par exemple supérieure 20 Hz.
[0170] Le dispositif 100 ; 300 selon l’invention peut être mis en œuvre dans le cadre d’un multiplexage, i.e. une détection de photons à des longueurs d’ondes différentes. Le multiplexage signifie ici l’échantillon 3 comprend au moins deux particules de différents types : une première émettant des photons majoritairement à une première longueur d’onde et une deuxième particule émettant des photons majoritairement à une deuxième longueur d’onde distincte de la première longueur d’onde. Les spectres d’émission des deux particules peuvent aussi être légèrement décalés tout en se recoupant partiellement, les particules restant de préférence excitables avec la même longueur d’onde.
[0171 ] Dans un premier type de multiplexage, le dispositif 100 ; 300 comprend une seule source de lumière (la source de lumière), ce qui signifie ici que le champ d’illumination 200 : 400 présente une seule longueur d’onde principale. Le dispositif 100 comprend alors un deuxième détecteur adapté à détecter des photons à la deuxième longueur d’onde. Le détecteur 140 ; 340 est quant à lui adapté à détecter des photons à la première longueur d’onde.
[0172] Dans un deuxième type de multiplexage, le dispositif 100 ; 300 comprend deux sources de lumière chacune adaptée à produire un champ d’illumination dont la fréquence principale est adaptée à une des particules et un seul détecteur (i.e. le détecteur 140), qui est par exemple un spectromètre, adapté à détecter des photons à la première et à la deuxième longueur d’onde.
[0173] Le dispositif 100 ; 300 selon l’invention peut aussi être utilisé pour réaliser un système de type confocal ou multi-confocal. Le principe est alors de remplacer la caméra qui est traditionnellement utilisée dans les systèmes de type confocal ou multi-confocal par le détecteur 140 ; 340 (qui est bien entendu couplé à la source de lumière et au calculateur 150 ; 350). Avantageusement, la localisation fréquentielle au moyen du champ d’illumination des particules clairsemées dans l’échantillons permet de remplacer la caméra par un mono-détecteur et donc d’accroitre la vitesse d’acquisition d’au moins un ordre de grandeur.
[0174] La présente invention n’est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés, mais l’homme du métier saura y apporter toute variante conforme à l’invention.
[0175] Par exemple, les franges d’interférence peuvent être des franges circulaires telles que des anneaux de Newton voire même présenter d’autres profils plus complexes.
[0176] Par exemple, la variation du champ d’illumination peut être réalisée autrement que par un défilement de franges d’interférence. A titre d’exemple, la source de lumière peut comprendre plusieurs lasers, chacun illuminant une région de l’échantillon selon un motif temporel qui lui est propre. Ce motif temporel correspond par exemple une fréquence de pulsation du laser. Ainsi, en utilisant des lasers avec des fréquences de pulsation distinctes les unes des autres, il est possible d’attribuer un code fréquentiel spécifique à chaque région, ce qui permet donc de localiser la particule. Encore en exemple, les motifs peuvent être produits par façonnage de front d’onde (wave-front shaping) qui permet d’obtenir les formes arbitraires. Ils peuvent également être produits par la superposition de faisceaux lasers non-cohérents.
[0177] Ainsi, il apparait également que la variation d’intensité du champ d’illumination peut varier autrement que sinusoïdalement. Elle peut par exemple présenter une structure en créneaux lorsque des lasers pulsés sont utilisés.
[0178] Consécutivement, il apparait aussi que la localisation peut être réalisée dans des référentiels ne comportant pas une direction principale telle que décrite dans les exemples ci-dessus. En effet, lorsque plusieurs lasers illuminent chacun une région de l’échantillon selon un motif temporel qui lui est propre, les régions peuvent être réparties en deux dimensions dans le plan de l’échantillon selon des schémas variées qui n’impliquent pas nécessairement que les régions soient alignées ou quadrillent l’échantillon. A titre d’exemple, les régions peuvent par exemple correspondre à des anneaux concentriques. Les régions peuvent aussi être disposées le long d’une ligne courbe.
[0179] La direction principale, ainsi que la direction secondaire et la troisième direction peuvent bien entendus correspondre à un autre repère que le repère orthogonal XYZ.
[0180] D’autres dispositifs de séparation de faisceaux, d’autre éléments optiques mobiles et d’autre éléments optiques convergents peuvent être mis en œuvre.
[0181 ] Dans le deuxième mode de réalisation, les faisceaux sont sélectionnés sur la base de leur polarisation par des moyens optiques, en l’espèce des cubes polarisant. Ils peuvent aussi être sélectionnés par des moyens mécaniques, tels que des miroirs galvanométriques ou des miroirs tournants, ou par des moyens acousto- optiques tels que des modulateurs acousto-optiques.
[0182] Ici, afin de localiser une ou des particules dans un échantillon de grande taille, l’échantillon 3 peut être déplacé au moyen des actionneurs piézoélectriques 112. Différentes zones de l’échantillons 3 sont alors traitées les unes après les autres comme cela est le cas sur les figures 1 et 8. Toutefois, en variante, le dispositif peut comprendre plusieurs détecteurs. Chaque détecteur est alors agencé en direction d’une zone particulière du support (et donc de l’échantillon) pour convertir des photons émis par la ou les particules de cette zone particulière. En d’autres termes, le support et l’échantillon sont divisés en zones, chaque zone étant associée à un détecteur. Au sein de chaque zone, plusieurs régions sont alors définies afin d’effectuer la localisation décrite précédemment.
[0183] Enfin, le procédé de localisation représenté en figure 12 peut bien entendu être mis en œuvre par tout dispositif approprié et non pas exclusivement par celui représenté sur les figures.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1 ] Dispositif (100 ; 300) de localisation d’une particule (2) individualisée dans un échantillon (3) présentant plusieurs régions (31 ), la particule (2) étant adaptée à émettre des photons lorsqu’elle reçoit de la lumière, le dispositif (100 ; 300) comprenant :
- un support (110 ; 310) d’échantillon (3),
- une source de lumière agencée pour produire un champ d’illumination (200 ; 400) adapté à éclairer l’échantillon (3) placé sur son support (110 ; 310), une intensité (11 , I2) du champ d’illumination (200 ; 400) présentant une variation temporelle et spatiale, de sorte que ladite intensité (11 , I2) présente, dans chaque région (31 ) de l’échantillon (3), un motif temporel prédéterminé différent des motifs temporels de ladite intensité (11 , I2) dans les autres régions (31 ) ;
- un détecteur (140 ; 340) adapté à convertir des photons émis par la particule (2) en réponse à son éclairement par le champ d’illumination (200 ; 400) en un signal représentatif de l’intensité (11 , I2) du champ d’illumination (200 ; 400) reçue par la particule (2) ;
- un calculateur (150 ; 350) programmé pour déterminer, sur la base d’une évolution temporelle du signal issu du détecteur (140 ; 340) et de la variation temporelle et spatiale de l’intensité (11 , I2) du champ d’illumination (200 ; 400), la région (31 ) de l’échantillon (3) dans laquelle est localisée la particule (2).
[Revendication 2] Dispositif (100 ; 300) selon la revendication 1 , dans lequel chaque motif temporel de l’intensité (11 , I2) du champ d’illumination (200 ; 400) produit par la source de lumière est une variation temporelle périodique de cette intensité (11 , I2) et présente une fréquence spécifique, les fréquences spécifiques des motifs temporels associés à toutes les régions (31 ) étant distinctes les unes des autres.
[Revendication 3] Dispositif (100 ; 300) selon la revendication 2, dans lequel les régions (31 ) de l’échantillon (3) sont alignées le long d’une direction principale (X) du support (110) et dans lequel ladite source de lumière est agencée pour que chaque fréquence spécifique soit liée par une même relation à une distance entre la position de la région associée au motif temporel correspondant et une position de référence selon la direction principale (X).
[Revendication 4] Dispositif (100 ; 300) selon la revendication 3, dans lequel ladite relation est une relation de proportionnalité.
[Revendication 5] Dispositif (100 ; 300) selon l’une des revendications 1 à 4, dans lequel le champ d’illumination (200 ; 400) est adapté à éclairer simultanément plusieurs régions (31 ) de l’échantillon (3).
[Revendication 6] Dispositif (100 ; 300) selon l’une des revendications 1 à 5, dans lequel chaque motif temporel de l’intensité (11 , I2) du champ d’illumination (200 ; 400) produit par la source de lumière est une variation temporelle sinusoïdale de cette intensité (11 , I2).
[Revendication 7] Dispositif (100 ; 300) selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel la source de lumière comprend un dispositif optique de séparation de faisceau (122 ; 322) et un élément convergent (170 ; 370) agencés pour générer et faire interférer deux faisceaux lumineux (221 , 222, 22T, 222’ ; 421 , 422 ; 621 , 622) l’un avec l’autre de manière à produire des franges d’interférence (230 ; 430, 431 , 432 ; 631 ) au niveau de l’échantillon (3) placé sur son support (110 ; 310).
[Revendication 8] Dispositif (100 ; 300) selon la revendication 7, dans lequel le dispositif optique de séparation de faisceaux lumineux (122 ; 322) comprend au moins l’un des suivant :
- un miroir en coin (123 ; 323) présentant deux surfaces réfléchissantes perpendiculaires, un miroir (124 ; 324) et une lame partiellement réfléchissante (125 ; 325) ;
- un cube séparateur (126) présentant une surface diagonale interne partiellement réfléchissante (127).
[Revendication 9] Dispositif (100 ; 300) selon la revendication 7 ou 8, dans lequel la source de lumière comporte en outre un élément optique mobile dont le déplacement entraîne le défilement desdites franges d’interférence (230 ; 430, 431 , 432 ; 631 ) pour produire chaque motif temporel de l’intensité (11 , I2) du champ d’illumination (200 ; 400).
[Revendication 10] Dispositif (100 ; 300) selon la revendication 9, dans lequel ledit élément optique mobile comprend un dispositif rotatif (129 ; 329) agencé pour faire varier dans le temps un angle d’incidence (a) de chaque faisceau lumineux (221 , 222, 221 222’ ; 421 , 422 ; 621 , 622) sur l’échantillon (3) placé sur son support (110 ; 310), les angles d’incidences (a) des faisceaux lumineux (221 , 222, 22T, 222’ ; 421 , 422 ; 621 , 622) variant simultanément et dans des sens opposés.
[Revendication 11 ] Dispositif (100 ; 300) selon la revendication 10, dans lequel le dispositif rotatif (129 ; 329) est un miroir rotatif.
[Revendication 12] Dispositif (300) selon l’une des revendications 1 à 11 , dans lequel la source de lumière comprend un modulateur de polarisation (360) adapté à modifier la polarisation du champ d’illumination (400) de sorte que le champ d’illumination (400) est polarisé, séquentiellement ou simultanément, selon :
- une première direction de polarisation ; et
- une seconde direction de polarisation distincte de la première direction de polarisation ; le calculateur (350) étant programmé pour déterminer une position de la particule (2) selon la première direction principale et selon la seconde direction principale en fonction de la polarisation du champ d’illumination (400).
[Revendication 13] Dispositif (300) selon les revendications 2 et 12, dans lequel, lorsque le champ d’illumination (400) est simultanément polarisé selon la première et la seconde direction, les fréquences spécifiques de motifs temporels associés à la première direction de polarisation sont distinctes des fréquences spécifiques de motifs temporels associés à la seconde direction de polarisation.
[Revendication 14] Procédé de localisation d’une particule (2) individualisée dans un échantillon (3) présentant plusieurs régions (31 ), la particule (2) étant adaptée à émettre des photons lorsqu’elle reçoit de la lumière, le procédé comprenant les étapes suivantes :
- agencement de l’échantillon (3) sur un support (110 ; 310) ;
- production d’un champ d’illumination (200 ; 400), le champ d’illumination (200 ; 400) éclairant l’échantillon (3) placé sur le support (110 ; 310), une intensité (11 , I2) du champ d’illumination (200 ; 400) présentant une variation temporelle et spatiale, de sorte que ladite intensité (11 , I2) présente, dans chaque région (31 ) de l’échantillon (3), un motif temporel prédéterminé différent des motifs temporels de ladite intensité (11 , I2) dans les autres régions (31 ) ;
- conversion des photons émis par la particule (2) en réponse à son éclairement par le champ d’illumination (200 ; 400) en un signal représentatif de l’intensité (11 , I2) du champ d’illumination (200 ; 400) reçue par la particule (2) ;
- détermination, sur la base d’une évolution temporelle du signal issu du détecteur (140 ; 340) et de la variation temporelle et spatiale de l’intensité (11 , I2) du champ d’illumination (200 ; 400), de la région (31 ) de l’échantillon (3) dans laquelle est localisée la particule (2).
[Revendication 15] Procédé selon la revendication 14, selon lequel la particule (2) est sélectionnée dans le groupe comprenant : les particules diffusantes, les particules fluorescentes, les particules phosphorescentes, les boites quantiques, protéines fluorescentes, molécules de colorant.
[Revendication 16] Procédé selon la revendication 14, selon lequel :
- la particule (2) est fluorescente,
- le champ d’illumination (200 ; 400) est produit par un laser pulsé à une fréquence supérieure à 1 MHz, et
- le détecteur (140 ; 340) est adapté à compter des photons uniques, le procédé comprenant une étape de détermination d’un délai entre un puise du laser et l’émission d’un photon par la particule (2).
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