EP4652232A1 - Nouveau matériau carboné poreux, son procédé de préparation et ses utilisations - Google Patents

Nouveau matériau carboné poreux, son procédé de préparation et ses utilisations

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Publication number
EP4652232A1
EP4652232A1 EP24701317.0A EP24701317A EP4652232A1 EP 4652232 A1 EP4652232 A1 EP 4652232A1 EP 24701317 A EP24701317 A EP 24701317A EP 4652232 A1 EP4652232 A1 EP 4652232A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
porous carbon
immobilized
carbon material
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP24701317.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jullien DRONE
Nicolas Brun
Coline MATEOS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM, Universite de Montpellier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4652232A1 publication Critical patent/EP4652232A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L73/00—Compositions of macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing oxygen or oxygen and carbon in the main chain, not provided for in groups C08L59/00 - C08L71/00; Compositions of derivatives of such polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C12Y103/01031—2-Enoate reductase (1.3.1.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01077—Taurine--pyruvate aminotransferase (2.6.1.77)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
    • C12Y306/01001—Inorganic diphosphatase (3.6.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a carbonaceous polymeric material also called porous carbonaceous material, or carbon-rich airgel, comprising at least one complexed metal ion, preferably a metal cation, and a composition comprising at least one protein immobilized on said material and methods of preparation of these.
  • the invention further relates to the use of the composition comprising at least one immobilized protein in heterogeneous biocatalysis applications in particular.
  • the invention also relates to a method for the immobilization of proteins carrying an affinity tag on said porous carbon material.
  • Porous carbonaceous materials or carbon-rich aerogels known from the state of the art, are conventionally obtained by sol-gel polymerization reactions between carbon-rich organic precursors and drying of the hydrogels thus obtained.
  • a porous carbon material of the type prepared and used in the present application is described in the publication “Hydrothermal synthesis of highly porous carbon monoliths from carbohydrates and phloroglucinol”; Nicolas Brun et al.; RSC Advances, 2013, 3.
  • This document more particularly describes an original hydrothermal approach to synthesize highly porous carbon-rich cryogels and aerogels (or carbogels) from carbohydrate-based precursors (e.g. fructose, glucose or xylose) and phenolic compounds (e.g. phloroglucinol ).
  • carbohydrate-based precursors e.g. fructose, glucose or xylose
  • phenolic compounds e.g. phloroglucinol
  • these carbohydrates can be isolated from the cellulosic fraction of lignocellulosic biomass
  • phloroglucinol is the monomeric unit of phlorotannins and can be isolated from the bark of fruit trees, brown algae or through various biosynthetic pathways . Therefore, the Compounds used in this patent application can be considered renewable and sustainable.
  • State-of-the-art carbon-rich aerogels derived from biomass are obtained after further heat treatment at a temperature above 300°C and offer a wide range of potential applications, such as electrodes for batteries and cells. fuel, or adsorbents for storing hydrogen and carbon dioxide.
  • the carbon-rich aerogels or porous carbonaceous materials according to the present invention are not subjected to heat treatment at a temperature > 300°C.
  • enzymes are a specific group of proteins that serve as biological catalysts in the metabolism of all living cells.
  • enzymes are capable of specifically transforming organic and inorganic molecules into products of interest.
  • enzymes are biological molecules developed for a cellular environment, they are often unsuitable for other environments. It is therefore interesting to be able to immobilize enzymes on a solid support and to use them as catalysts in this immobilized state.
  • the immobilization of enzymes on solid support has been carried out using different techniques and different solid supports. Adsorption of enzymes onto solid surfaces can lead to undesirable interactions between the enzyme and the solid support. For example, it has been shown that adsorption of proteins onto silica nanoparticles can lead to changes in the secondary structure of the protein, which can lead to deactivation of the enzyme. It is therefore important that the solid support does not interfere with the structure and activity of the immobilized enzymes.
  • Immobilized metal ion affinity chromatography is a protein purification technique based on the affinity of proteins carrying a poly-histidine sequence for metal ions such as Fe 3+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Ni 2+ and Co 2+ .
  • the metal ions are immobilized on an agarose gel carrying IDA (imido diacetate) and/or NTA (nitrilo triacetate) functions and can be selectively complexed by proteins carrying amino acids such as histidine and/or cysteine.
  • IDA imido diacetate
  • NTA nitrilo triacetate
  • An improved version of this technique uses recombinant proteins containing a fused polyhistidine peptide.
  • gel-immobilized enzymes are less suitable as heterogeneous catalysts in organic synthesis.
  • a porous carbon material obtained by hydrothermal carbonization of at least one carbohydrate and at least one compound carrying at least one orthodiphenol function, charged with at least one metal ion makes it possible to immobilize at least a protein preferably via affinity tag binding, in an improved manner compared to other types of protein immobilization.
  • a first aim of the invention is to propose a porous carbon material complexed with at least one metal ion, preferably a metal cation.
  • a second aim of the invention is to propose a composition comprising a protein immobilized on said material or the use of said material to immobilize a protein.
  • a third object of the invention is to propose processes making it possible to prepare said materials and compositions.
  • another aim of the invention is to propose particular compositions and their uses.
  • the present application relates to a composition
  • a composition comprising: a) a porous carbonaceous material obtained by hydrothermal carbonization comprising or formed from at least one carbohydrate, preferably at least one ose, or at least one polysaccharide (biosourced precursor #1), and
  • the porous carbon material of the present invention is characterized by 13CP-MAS solid state NMR spectroscopy by a signal at 144 ppm, attributed to the carbons of the orthodiphenol functions.
  • the porous carbonaceous material of the present invention is also characterized by bands at 1200, 1280 and 1500 cm' 1 , in FTIR spectroscopy, attributed to the CC and C-0 vibrations of the aromatic nucleus of an orthodiphenol function.
  • the porous carbon material of the present invention therefore has at least one orthodiphenol function.
  • the porous carbon material of the present invention is obtained by hydrothermal carbonization of at least one carbohydrate, preferably at least one ose, or at least one polysaccharide (biosourced precursor #1) and at least one compound having an orthodiphenol or orthomethoxyphenol (biosourced precursor #2).
  • the biosourced precursor compound #1 usable according to the present invention is a carbohydrate, preferably at least one ose, or at least one polysaccharide.
  • Carbohydrates are defined by the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) as a class of organic compounds containing one carbonyl group (aldehyde or ketone) and at least two hydroxyl groups (-OH). Included in this class are substances from monosaccharides by reduction of the carbonyl group, by oxidation of at least one functional group at the end of the chain to carboxylic acid or by replacement of one or more hydroxyl groups by a hydrogen atom, an amino group, a thiol group or any similar atom. Furthermore, in the context of the present application, compounds resulting from the dehydration of carbohydrates (eg furanic aldehydes) can also be used.
  • IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
  • a monosaccharide (or monosaccharide) is a carbohydrate monomer.
  • the oses have at least 3 carbon atoms: they are polyhydroxyaldehydes or polyhydroxyketones.
  • Bones are distinguished by the length of their carbon chain, as follows:
  • trioses 3-carbon oses, C3H6O3 (glyceraldehyde, dihydroxyacetone);
  • pentoses 5-carbon oses, C5H10O5 (deoxyribose (C5HI0O4), ribose, arabinose, xylose, lyxose, ribulose, xylulose)
  • 6-carbon oses 6-carbon oses, C6H12O6 (allose, altrose, galactose, glucose, gulose, idose, mannose, talose, fructose, psicose, sorbose, tagatose);
  • deoxyhexoses 6-carbon oses, C6H12O5 (fucose, rhamnose);
  • aldose is a monosaccharide consisting of a chain of n carbon atoms with a carbonyl group on the terminal carbon atom, making it an aldehyde, and hydroxyl groups attached to all other carbon atoms.
  • a ketose is a monosaccharide consisting of a chain of n carbon atoms with a carbonyl group on the non-terminal carbon atom, making it a ketone, and hydroxyl groups attached to all other carbon atoms.
  • the at least one ose is chosen from:
  • • -an aldose chosen in particular from: glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, and talose, preferably xylose, or
  • ketose chosen in particular from: dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose, xylulose, fructose, psicose, sorbose, and tagatose, preferably fructose
  • a polysaccharide is a polymer from the carbohydrate family formed of a number n of oses (n > 2) by alpha or beta glycosidic bond.
  • the at least one polysaccharide is chosen from:
  • trehalulose sucrose, turanose, maltulose, leucrose, isomaltulose, gentiobiulose, melibiose, lactulose, lactose, and rutinose, or
  • inulobiose alpha2-mannobiose, alpha3-mannobiose, trehalose, kojibiose, nigerose, maltose , isomaltose, sophorose, laminaribiose, cellobiose, and gentiobiose, preferably maltose or sucrose.
  • the biosourced precursor compound #1 of the porous carbon material consists of a carbohydrate, preferably a saccharide, or a polysaccharide as described above.
  • the porous carbon material comprises two biosourced precursor compounds #1 which consist of two carbohydrates, preferably two oses, two polysaccharides or one ose and one polysaccharide as described above. According to another embodiment of the invention, the porous carbon material comprises more than two biosourced precursor compounds #1.
  • the at least one compound having an orthodiphenol or orthomethoxyphenol function is a biosourced precursor compound having at least one benzene ring substituted by two hydroxyl groups in the ortho position or at least one methoxy group in the ortho position.
  • biomass designates materials or compounds derived from biomass of plant or animal origin, chemically modified or not. These raw materials have the advantage of being renewable.
  • compound of “natural origin” or biosourced within the meaning of the invention we mean any compound originating from nature (biomass of plant or animal origin).
  • This compound can be extracted from renewable terrestrial and marine biomass or from living organisms (animals, micro-organisms), possibly subsequently modified for example chemically, or even obtained following the action of living micro-organisms (for example enzymes or bacteria) on a compound of natural origin according to biofermentation or biosynthesis type processes.
  • living micro-organisms for example enzymes or bacteria
  • the biosourced precursor compound #2 usable according to the present invention may be a compound having at least one orthodiphenol function.
  • the compound presenting at least one orthodiphenol or orthomethoxyphenol biosourced precursor function usable according to the present invention can be chosen from secondary metabolites of plants.
  • Phenolic compounds form the most important group of phytochemicals in plants. They present nearly 8000 molecules divided into around ten chemical classes. Each class is characterized by the presence of a benzene ring to which one or more hydroxyl groups are directly attached. These compounds are present in all parts of higher plants (roots, stems, leaves, flowers, pollen, fruits, seeds and wood). They are synthesized by plants subjected to difficult conditions (infections, wounds, UV radiation, etc.) and are involved in many physiological processes such as cell growth, rhizogenesis, seed germination or fruit ripening.
  • the at least one compound having an orthodiphenol or orthomethoxyphenol function is chosen from: catechol, pyrogallol, caffeic acid, mangiferin, quercetin, cyanidin, catechin, epicatechin , epigallocatechin, anthocyanidol, procyanidol B-3, procyanidol B-4, fuhalols (bifuhahol, trifuhahol), carmalol (diphlorethohydroxycamalol) and tannic acid.
  • the at least one compound presenting at least one orthodiphenol function is catechin.
  • the at least one compound presenting at least one orthodiphenol or orthomethoxyphenol function is contained in a natural plant extract.
  • the natural plant extract containing at least one compound presenting at least one orthodiphenol or orthomethoxyphenol function is chosen from an extract of strawberry, potato, apple, lemon, walnut, vine, grape, flowers , soy, pea, pine, tomato, garlic, quebracho wood, mimosa, chestnut or cachou.
  • the porous carbon material comprises two biosourced precursor compounds #2 which consist of two compounds having at least one orthodiphenol function as described above. According to another embodiment of the invention, the porous carbon material comprises more than two biosourced precursor compounds #2.
  • the porous carbonaceous material obtained by hydrothermal carbonization comprising or formed from:
  • maltose galactose, lactose, glucose, mannose, sucrose, arabinose, ribose, fructose, xylose, erythrose, or dihydroxyacetone
  • Cachou extract can be obtained from Acacia cachou plant fibers, said extract containing condensed tannins and flavonols.
  • porous carbon material represents a polymer material obtained or capable of being obtained by sol-gel polymerization (e.g. by hydrothermal carbonization) from at least two biosourced precursors # 1 and 2 as defined in this application.
  • the molar ratio between the at least one carbohydrate, preferably at least one ose, or at least one polysaccharide and the at least one compound presenting at least one orthodiphenol or orthomethoxyphenol function is comprised from 10/1 to 1/10 , preferably 1/2 or 1/1 or 2/1 or 3/1 or 4/1 or 5/1.
  • the porous carbon material can be obtained by a sol-gel polymerization process, known to those skilled in the art, involving at least two biosourced precursors # 1 and 2 such as defined above.
  • Sol-gel polymerization processes may use a catalyst, for example, acids and bases such as, for example, nitric acid, acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, boric acid, sodium carbonate, sodium hydroxide, ammonium hydroxide and calcium sulfate.
  • acids and bases such as, for example, nitric acid, acetic acid, ascorbic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, boric acid, sodium carbonate, sodium hydroxide, ammonium hydroxide and calcium sulfate.
  • Catalyst concentrations can be expressed as reactant-catalyst ratio (R/C) which can range, for example, from 10 to 5,000, or from 10 to 2,000, or from 10 to 1,000.
  • R/C reactant-catalyst ratio
  • the porous carbonaceous material is obtained by hydrothermal carbonization.
  • Hydrothermal carbonization is defined as being a process of thermochemical conversion of biomass or in the context of the present invention at least two biosourced precursors # 1 and 2 as defined above with the aim of obtaining a porous carbon monolith in aqueous phase. It is an exothermic process that decreases the oxygen and hydrogen levels of matter primarily through dehydration and decarboxylation reactions.
  • Sol-gel polymerization is obtained by applying temperatures ranging from 120°C to 250°C to a mixture of at least two biosourced precursors # 1 and 2 as defined above and a solvent, preferably water (generally 10% by mass of the two biosourced precursors #1 and 2).
  • the porous carbon material is prepared by the following process: a) Heating a reaction mixture comprising an aqueous solution, and at least two biosourced precursors # 1 and 2 as defined above dissolved in the solution aqueous, at a temperature below 300°C to obtain a solid porous carbon material, b) Wash the solid porous carbon material obtained by successive soaking in a polar solvent.
  • the aqueous solution comprises water, and optionally solvents, preferably in quantities miscible with water.
  • the reaction mixture comprises only one liquid phase, namely the aqueous solution, preferably water.
  • the aqueous solution comprises ethanol, preferably absolute ethanol.
  • the mass fraction of water in a water/absolute ethanol mixture is between 1 and 0.3. According to a preferred embodiment, the mass fraction of water in a water/absolute ethanol mixture is between 1 and 0.5 when the biosourced precursors #1 and 2 are respectively xylose and catechin.
  • Step (a) of the process can also be called the “hydrothermal treatment step”.
  • the preparation process of the invention is distinguished, for example, from pyrolytic processes, for the conversion of biomass or biosourced precursors # 1 and 2 , to give a coal-like material (typically in the absence of oxygen).
  • reaction temperature in the hydrothermal treatment step (a) is preferably ⁇ 300°C, more preferably 100 to 300°C, even more preferably 120 to 250°C and most preferably 160 to 200°C or preferably at 180°C.
  • Reaction temperature is intended to refer to the temperature, more specifically the average temperature, inside the reaction mixture, which can be measured with a thermocouple.
  • the hydrothermal treatment in the process for preparing the porous carbonaceous material of the present invention is preferably carried out in a pressure-resistant reactor, for example an autoclave.
  • step (a) there is no specific limitation as to the duration of step (a) in the process for preparing the porous carbonaceous material of the invention.
  • reaction medium can be introduced into a hermetically closed digestion bomb, then placed in an enclosure thermostatically controlled at 180°C for 20 hours.
  • Step (a) of the process is carried out until the entire content of the reaction mixture comprising the aqueous solution and the biosourced precursors #1 and 2 has gelled or precipitated into the porous carbonaceous material of the present invention.
  • the porous carbonaceous material is prepared by the following process: a) Heating a reaction mixture comprising:
  • the porous carbonaceous material is prepared by the following process: a) Heating a reaction mixture comprising:
  • the carbon material is formed from at least one carbohydrate, preferably an aldose or ketose, even more preferably at least one heterodiholoside, or homodiholoside (cl) and at least one compound presenting at least one orthodiphenol or orthomethoxyphenol function (c2) in a molar ratio (cl/c2) of 10/1 to 1/10, preferably 2/1.
  • the molar ratio (cl/c2) is defined by the ratio between the number of moles of carbohydrates (cl) and the number of moles of compounds presenting at least one orthodiphenol or orthomethoxyphenol function.
  • the porous carbonaceous material is prepared by the following process: a) Heating a reaction mixture comprising:
  • the porous carbonaceous material is prepared by the following process: a) Heating a reaction mixture comprising:
  • the porous carbon material is made up of
  • oxygen element (O) preferably 60% by mass of carbon element (C) and 35% by mass of oxygen element (O).
  • the porous carbon material is made up of 36% O and 60% C for the xylose/cathechin system or cachou extract.
  • the porous carbon material is formed from at least one carbohydrate (cl), preferably at least one ose, or at least one polysaccharide (cl) and at least one compound presenting at least an orthodiphenol or orthomethoxyphenol function (c2) or in a molar ratio (cl/c2) of 10/1 to 1/10, preferably 2/1.
  • the solid porous carbonaceous material is washed by soaking in either ultrapure water, deionized water or a water/polar protic solvent mixture, for example methanol, ethanol or tert-butanol for several hours.
  • the purpose of washing is to extract soluble compounds not incorporated into the structure of the porous carbon material and to prepare the gel for the drying step.
  • the carbonaceous material obtained or obtainable in the hydrothermal carbonization step (a) is typically composed of primary nanoparticles aggregated into an interconnected network forming the dispersed phase, the aqueous solution forming the dispersion phase.
  • the carbonaceous material before drying can be called solvogel.
  • the carbonaceous material obtained in step (a) can be called hydrogel.
  • a hydrogel is considered here as a special type of solvogel, in which the aqueous solution of the dispersion phase is water.
  • the solid porous carbonaceous material obtained or obtainable according to the process described above can be dried and transformed into cryogel, airgel or xerogel.
  • a dry form of a hydrogel or solvogel is obtained by subjecting the carbon material (i.e hydrogel or solvogel) to contact with a supercritical fluid, in particular acetone or carbon dioxide to transform it into an airgel.
  • a supercritical fluid in particular acetone or carbon dioxide
  • a dry form of hydrogel is obtained by subjecting the carbon material (i.e. hydrogel or solvogel) to freezing of the gel thus isolated and lyophilization of said frozen gel to transform it into a cryogel.
  • the carbon material i.e. hydrogel or solvogel
  • a dry form of hydrogel is obtained by subjecting the carbon material (i.e. hydrogel or solvogel) to evaporation of the solvent at controlled temperature and pressure to transform it into a xerogel.
  • the carbon material i.e. hydrogel or solvogel
  • a cryogel can be called an aerogel when the dried gel has largely retained the textural properties after drying.
  • Dried gels can be called aerogels regardless of the drying technique used.
  • the porous carbonaceous material is prepared by the following process: a) Heating a reaction mixture comprising an aqueous solution, and at least two biosourced precursors # 1 and 2 as defined above dissolved in the solution aqueous, at a temperature below 300°C, preferably at 180°C to obtain a solid porous carbonaceous material, b) Wash the solid porous carbonaceous material obtained by successive soaking in a polar solvent (ideally in absolute ethanol or in a water/tert-butanol mixture 75/25 in percentages by weight), c) Dry the solid porous carbonaceous material using a supercritical fluid or by freeze-drying.
  • a polar solvent ideally in absolute ethanol or in a water/tert-butanol mixture 75/25 in percentages by weight
  • hydrogels placed in borosilicate glass beakers are previously placed in immersion in liquid nitrogen (77 K) for 15 minutes, then directly placed in the chamber of the lyophilizer (e.g. a COSMOS lyophilizer from Cryotec). Drying is carried out under vacuum ⁇ 50 mTorr for 48 hours with a cold trap at -80°C which ensures the condensation of water or solvent vapors.
  • lyophilizer e.g. a COSMOS lyophilizer from Cryotec
  • the solvent in the solvogel is preferably chosen from absolute ethanol or acetone (for example brought by replacement of solvent with absolute ethanol or acetone).
  • the porous carbon material obtained or obtainable in step (a) is a gelled material, in particular a solidified material composed of aggregated particles forming an interconnected network.
  • the porous carbonaceous material obtained or obtainable according to the process described above comprises micropores (pores ⁇ 2 nm), mesopores (pores of 2-50 nm) and macropores (pores > 50 nm).
  • the oxygen content is typically greater than 25% for materials directly obtained in the hydrothermal carbonization step (a).
  • the surface of the carbon material of the invention as obtained in step (a) is very hydrophilic.
  • the porous carbon material according to the present invention is composed of aggregated particles forming an interconnected network.
  • This interconnected network of aggregated particles induces interparticle gaps (or pores) with a diameter between 10 pm and 5 nm, more preferably with an average diameter of 5 to 200 nm, more preferably with an average diameter of 25 to 100 nm and again more preferably 40 to 80 nm and preferably around 60 nm.
  • the porous carbonaceous material according to the present invention is an aggregated material composed of particles, with a pore size distribution calculated from a nitrogen adsorption/desorption isotherm at 77 K (for the largest pores). narrow; ⁇ 100 nm) and a mercury intrusion porosimetry profile (for the widest pores; > 50 nm).
  • the pore size distribution and the pore diameter which corresponds to the peak of the pore size distribution can be provided by the BJH analysis of the nitrogen adsorption/desorption isotherm.
  • the pore diameter of the carbon gel according to the present invention is preferably in a range of 40 to 80 nm.
  • the pore diameter of the porous carbonaceous material according to the present invention is preferably greater than the average molecular diameter of the diameter of the adsorbed or complexed components.
  • the porous carbonaceous material according to the present invention preferably has a specific surface area of 300 to 1000 m 2 /g, more preferably has a specific surface area of 600 to 800 m 2 /g.
  • porous carbonaceous material has a specific surface area of less than 100 m 2 /g, the surface area with which the adsorbed components are in contact will be reduced, and the number of pores in which the adsorbed components are accommodated will be reduced.
  • the total pore volume of the porous carbon material according to the present invention is not particularly limited because it also varies depending on the specific surface area and the pore diameter which corresponds to the peak of the pore size distribution.
  • the porous carbonaceous material according to the present invention preferably has a total pore volume of 0.1 to 5 cm 3 /g, more preferably has a total pore volume of 0.2 to 2.5 cm 3 /g.
  • the so-called total volume was determined at a relative pressure of 0.99 on the nitrogen adsorption/desorption isotherms at -196°C.
  • the micropore surface area and volume were determined by applying the t-plot method.
  • the pore diameter distributions were evaluated by applying the BJH method on the desorption branch of the isotherms.
  • the aerogels were degassed for at least 6 h at 0.05 mbar on a Micromeritics VacPrep before analyses. Analyzes were performed on a TriStar Micromeritics.
  • the total pore volume in the materials is greater than that obtained by nitrogen sorption volumetry at -196°C, since the largest pores (>100 nm in diameter) cannot be analyzed by this method.
  • the largest pores (> 100 nm in diameter) were analyzed by mercury intrusion porosimetry.
  • the volume of these large pores is greater than 3 mL/g for catechin/xylose aerogels.
  • the specific surface area and the total pore volume of the porous carbonaceous material according to the present invention can be determined by a general volumetric measurement described below. Specifically, a porous carbonaceous material is placed in a container and cooled to the temperature of liquid nitrogen (-196°C). Then, nitrogen gas is introduced into the container and the amount of nitrogen gas adsorbed on the carbon gel is determined based on the volumetric method. Then, the pressure of nitrogen gas introduced into the container is gradually changed, and the amount of nitrogen gas adsorbed on the carbon gel is plotted against each equilibrium pressure. We thus obtain the nitrogen adsorption/desorption isotherm.
  • the specific surface area can be determined by the Brunauer Emmett Teller (BET) method, for example by the dinitrogen adsorption technique.
  • BET Brunauer Emmett Teller
  • the BET equivalent specific surface area was determined by nitrogen adsorption at 77K by carrying out isotherms at P/PO relative pressures between 0.01 and 0.99.
  • the BET method was applied over a range of relative pressures between 0.1 and 0.3 (based on the Rouquerol transform).
  • an airgel prepared from mixtures of catechin or a natural extract of cachou and a ose has a total volume of 0.5 to 0.8 cm 3 /g, an external volume of 0.5 to 0.8 cm 3 /g and a microporous volume of 0.01 to 0.05 cm 3 /g.
  • This parameter can be determined by mercury intrusion porosimetry indicating the total volume of interconnected pores.
  • porous carbonaceous materials as described above are complexed with metal ions, preferably at least one type of metal cation which is complexed on the external surfaces and the surfaces of the internal pores of the porous carbon material according to the invention.
  • the at least one metal cation is chosen from Al 3+ , Ag + , Ba 2+ , Ca 2+ , Cd 2+ , Co 2+ , Cr 3+ , Cu + , Cu 2 + , Fe 2+ , Fe 3+ , K + , Mg 2+ , Mn 2+ , Na + , Ni 2+ , Pb 2+ , Sn 2+ , Sn 4+ , Zn 2+ , preferably one or more cations transition metals Fe 3+ , Co 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ , or Ni 2+ .
  • a chelate is a type of coordination compound in which a single metal ion is attached by coordinated covalent bonds to a molecule or ion called a ligand.
  • a coordination compound is formed when groups of atoms, ions, or molecules chemically bond to each other by donating and accepting pairs of electrons. Groups that donate electron pairs are called ligands. These are generally Lewis bases. The groups accepting electron pairs are often transition metal cations.
  • hybrid material refers to the porous carbon material on which the metal ions are complexed. This is the composition within the meaning of the present invention.
  • the composition is prepared by the following process: a) Heating a reaction mixture comprising an aqueous solution, and at least two biosourced precursors # 1 and 2 as defined above dissolved in the aqueous solution, at a temperature below 300°C to obtain a solid porous carbon material, b) Wash the solid porous carbon material obtained by successive soaking in a polar solvent, c) Dry the solid porous carbon material with using a supercritical fluid or by freeze-drying, d) Impregnate the solid porous carbon material with a solution comprising metal cations to obtain a porous carbon hybrid material complexed with metal cations.
  • the adsorption process to allow the metal complex to adsorb on carbon material the adsorption conditions are not particularly limited.
  • a metal complex can be adsorbed onto a carbonaceous material by placing the porous carbonaceous material in a solution and mixing the solution for a certain period of time at approximately 10 to 100°C.
  • the hybrid material is separated from the solution by centrifugation, and the suspension thus obtained is washed and then dried.
  • the composition is prepared by the following process: a) Heating a reaction mixture comprising an aqueous solution, and at least two biosourced precursors # 1 and 2 as defined below above dissolved in the aqueous solution, with a solution comprising metal cations, at a temperature below 300°C to obtain a solid porous carbonaceous material, b) washing the solid porous carbonaceous hybrid material obtained by successive soaking in a polar solvent, c ) Dry the solid porous carbon hybrid material using a supercritical fluid or by freeze drying.
  • the amount of metal ions complexed with the porous carbon material to form the hybrid material or composition of the present invention is not particularly limited.
  • the quantity of metal ions adsorbed or complexed on a carbon material is preferably between 0.1 and 40 parts by weight relative to 100 parts by weight of the porous carbon material.
  • the composition comprises a quantity of chelated or complexed metal cations, measured by the MEB-EDX method, comprised from 0.2 to 2 mole%, preferably from 0.5 to 1 mole%.
  • the composition comprises a quantity of 1 to 5% by weight of metal cation, in particular 2 to 4% by weight.
  • the composition comprises a quantity of 20 to 40 mg of iron per gram of porous carbonaceous material.
  • the solvent used here is not particularly limited as long as it can dissolve and/or disperse metal complexes. Examples of these include: acetic acid, water, ethylene glycol, DMSO and DMF.
  • the concentration of metal complex in the solution is not particularly limited. However, the concentration is preferably about 0.1 to 500 mM.
  • the composition (solid porous carbon hybrid material) comprises: a) a porous carbon material obtained by hydrothermal carbonization comprising or formed from:
  • the composition comprises: a) a porous carbonaceous material obtained by hydrothermal carbonization comprising or formed from:
  • -the bone is chosen from
  • an aldose chosen in particular from: glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, allose, altrose, glucose, mannose, gulose 'idose, galactose, and talose, preferably xylose, or
  • a ketose chosen in particular from: dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose, xylulose, fructose, psicose, sorbose, and tagatose, preferably fructose, or - the polysaccharide is chosen from: • a heterodisaccharide chosen in particular from: trehalulose, sucrose, turanose, maltulose, leucrose, isomaltulose, gentiobiulose, melibiose, lactulose, lactose, and rutinose, or
  • a homodiholoside chosen in particular from inulobiose, alphaZ-mannobiose, alpha3-Mannobiose, trehalose, kojibiose, nigerose, maltose, isomaltose, sophorose, laminaribiose, cellobiose, and gentiobiose , preferably maltose or sucrose and
  • At least one compound presenting at least one orthodiphenol or orthomethoxyphenol function (biosourced precursor #2), and b) at least one metal cation chosen from Al 3+ , Ag + , Ba 2+ , Ca 2+ , Cd 2+ , Co 2+ , Cr 3+ , Cu + , Cu 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , K + , Mg 2+ , Mn 2+ , Na + , Ni 2+ , Pb 2+ , Sn 2+ , Sn 4+ , Zn 2+ , preferably one or more transition metal cations Fe 3+ , Co 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ , or Ni 2+ .
  • the composition comprises: a) a porous carbonaceous material obtained by hydrothermal carbonization comprising or formed from:
  • -the bone is chosen from
  • an aldose chosen in particular from: glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, allose, altrose, glucose, mannose, gulose 'idose, galactose, talose, preferably xylose, or
  • ketose chosen in particular from: dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose, xylulose, fructose, psicose, sorbose, tagatose, preferably fructose, or
  • polysaccharide is chosen from:
  • heterodiholoside chosen in particular from: trehalulose, sucrose, turanose, maltulose, leucrose, isomaltulose, gentiobiulose, melibiose, lactulose, lactose, rutinose, or • a homodiholoside chosen in particular from: inulobiose, alphaZ-mannobiose, alpha3-Mannobiose, trehalose, kojibiose, nigerose, maltose, isomaltose, sophorose, laminaribiose, cellobiose, gentiobiose , preferably maltose or sucrose,
  • the composition comprises: a) a porous carbonaceous material obtained by hydrothermal carbonization comprising or formed from:
  • the composition comprises: a) a porous carbonaceous material obtained by hydrothermal carbonization comprising or formed from:
  • the composition comprises: a) a porous carbonaceous material obtained by hydrothermal carbonization comprising or formed from:
  • the composition comprises: a) a porous carbonaceous material obtained by hydrothermal carbonization comprising or formed from:
  • compositions described above can be used to immobilize proteins, in particular at least one enzyme
  • a second aim of the invention is to provide a composition comprising a protein or an enzyme immobilized on said solid porous carbon hybrid material or composition.
  • the solid porous carbon hybrid material of the present invention comprises the solid porous carbon material described above as a support, at least one metal ion complexed with said material and at least one protein (in particular an enzyme) immobilized (on the carbon material porous charged with at least one metal cation), in which the at least one immobilized protein preferably contains an affinity tag and is immobilized by so-called weak bonds (van der Waals bonds, hydrogen bonds) and/or bonds of coordination and/or ionic bonds.
  • the protein used here is not particularly limited.
  • composition of the present invention thus comprises at least one enzyme chosen from the approved list of the nomenclature and classification of enzymes of the Union International Institute of Biochemistry (IUBMB) and examples thereof include the following proteins:
  • At least one protein chosen from the group notably consisting of a-arabinosidase, a-galactosidase, a-rhamnosidase, p-galactosidase,
  • the composition comprises a protein chosen from the group consisting in particular of an enoate reductase (EC 1.3.1.31), a transaminase (EC 2.6.1), a pyrophosphatase (EC3.6.1.1) .
  • a protein chosen from the group consisting in particular of an enoate reductase (EC 1.3.1.31), a transaminase (EC 2.6.1), a pyrophosphatase (EC3.6.1.1) .
  • the amount of protein adsorbed on the porous carbon material is not particularly limited as long as it exhibits enzymatic activity.
  • the amount of protein adsorbed on the porous carbon material is preferably 10 to 80 parts by weight relative to 100 parts by weight of the porous carbon material, preferably 10 to 50 parts by weight relative to 100 parts by weight of the porous carbon material.
  • the method for providing the porous carbon hybrid material of the present invention by causing adsorption of a protein onto porous carbon material is not particularly limited. It is possible to use, for example, the impregnation method.
  • the impregnation method described below is more preferable. That is, the protein is first dissolved in water or buffer at a concentration at which the protein is not precipitated (preferably at a concentration of 0.1 to 1000 mg/ml ).
  • a porous carbonaceous material is then suspended in the resulting solution at a temperature at which the solution does not freeze and at which the protein does not denature (preferably 0 to 50°C.)
  • the protein is contacted with the porous carbon material for at least 5 minutes or more, preferably for 30 minutes or more and thus the protein is immobilized in the pores of the carbon gel.
  • the carbon hybrid material of the present invention can be provided.
  • composition comprising at least one immobilized protein is prepared by the process comprising the steps consisting of:
  • porous carbon hybrid material loaded with metal cations is added to an aqueous solution containing a protein preferably carrying a poly-histidine tag at its N-terminal or C-terminal end.
  • affinity-tagged protein refers to a recombinant protein in which an affinity tag, as defined above, has been added to the target protein.
  • Affinity-tagged proteins can be prepared by recombinant DNA technology using methods known in the art, such as by ligation of DNA fragments or by PCR techniques. Affinity-tagged proteins may also be called “fusion-tagged proteins” or "fusion proteins”.
  • polyhistidine tag refers to a chain of at least two histidine residues, which is attached to the C or N terminus of a protein.
  • the polyhistidine tag is preferably a chain of at least six histidine residues.
  • polyhistidine-tagged enzyme refers to a recombinant enzyme in which the target enzyme is fused with a polyhistidine tag as defined above.
  • affinity tag refers to a defined group, such as an organic or organometallic molecule, protein fragment or the like, which is attached to a recombinant protein and which is capable of binding to a specific immobilized group on a matrix.
  • porous carbon hybrid material loaded with metal cations on which at least one protein is immobilized by so-called weak bonds (van der Waals bonds, hydrogen bonds) and/or coordination bonds and/or ionic bonds, is washed several times. with a buffered aqueous solution.
  • the affinity marker used in the invention can be any marker capable of specifically binding to the porous carbon material for which it has an affinity.
  • Affinity binding can be the result of, for example, van der Waals interaction, hydrogen bonding, ionic bonding or hydrophobic interaction.
  • the affinity bond must be strong enough to allow the affinity label and the porous carbon material to remain tightly bound to each other at least until certain specific conditions are applied in order to to dissociate the affinity marker from the porous carbon material.
  • the protein to be immobilized on the material can be any protein containing an affinity tag, such as a (recombinant) protein or an enzyme containing an affinity tag.
  • the protein is an enzyme containing an affinity tag.
  • the affinity tag on the protein is a polyhistidine tag and the solid material contains a chelated metal ion.
  • the buffered aqueous solution is preferably a Tris-HCl, or Phosphate, buffer.
  • an affinity marker is a marker which has a specific affinity for metal cations.
  • the present application relates to a composition
  • a composition comprising: a) a porous carbon material formed from:
  • the composition comprises a) a porous carbon material formed from:
  • the composition comprises: a) a porous carbon material formed from:
  • ose preferably at least one carbohydrate, preferably at least one ose, or at least one polysaccharide, in which the ose is chosen from:
  • an aldose chosen in particular from: glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, allose, altrose, glucose, mannose, gulose 'idose, galactose, and talose, preferably xylose, or
  • a ketose chosen in particular from: dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose, xylulose, fructose, psicose, sorbose, and tagatose, preferably fructose, or in which the polysaccharide is chosen from:
  • a heterodisaccharide chosen in particular from: trehalulose, sucrose, turanose, maltulose, leucrose, isomaltulose, gentiobiulose, melibiose, lactulose, lactose, and rutinose, or
  • a homodiholoside chosen in particular from: inulobiose, alphaZ-mannobiose, alpha3-Mannobiose, trehalose, kojibiose, nigerose, maltose, isomaltose, sophorose, laminaribiose, cellobiose, and gentiobiose, preferably maltose or sucrose, and
  • -at least one compound having an orthodiphenol or orthomethoxyphenol function chosen from: catechol, pyrogallol, caffeic acid, mangiferin, quercetin, cyanidin, catechin, epicatechin, epigallocatechin, anthocyanidol , procyanidol B-3, procyanidol B-4, fuhalols (bifuhahol, trifuhahol), carmalol (diphlorethohydroxycamalol) and tannic acid,
  • an orthodiphenol or orthomethoxyphenol function chosen from: catechol, pyrogallol, caffeic acid, mangiferin, quercetin, cyanidin, catechin, epicatechin, epigallocatechin, anthocyanidol , procyanidol B-3, procyanidol B-4, fuhalols (bifuhahol, trifuhahol), carmalol (diphlorethohydroxycam
  • a natural plant extract containing at least one of the above compounds b) at least one metal cation chosen from Al 3+ , Ag + , Ba 2+ , Ca 2+ , Cd 2+ , Co 2+ , Cr 3+ , Cu + , Cu 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , K + , Mg 2+ , Mn 2+ , Na + , Ni 2+ , Pb 2+ , Sn 2+ , Sn 4+ , Zn 2+ , preferably one or more transition metal cations Fe 3+ , Co 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ , or Ni 2+ , and c) at least one immobilized protein, preferably said at least one immobilized protein comprising a poly-histidine tag.
  • the composition comprises: a) a porous carbon material formed from:
  • the composition comprises: a) a porous carbon material formed from:
  • the composition comprises: a) a porous carbon material formed from:
  • the composition comprises: a) a porous carbon material formed from:
  • the binding of the enzyme to the support must be reversible.
  • the chelated metal ion be Fe 3+ , Ni 2+ or Co 2+ . These metal ions bind strongly enough to immobilize a polyhistidine-labeled enzyme, but are also capable of releasing the immobilized enzyme when specific conditions are applied, such as treatment with a buffered solution containing imidazole or l. ethylenediaminetetraacetate (EDTA).
  • the chelated metal ion is Co 2+ or Fe 3+ , and most preferably Fe 3+ , as this results in particularly strong binding of the polyhistidine label to said material.
  • leaching of the enzyme or metal ion from a material comprising an immobilized protein in the presence of Fe 3+ as the chelated metal ion is almost negligible.
  • the absence of leaching allows the immobilized protein material (the biocatalyst) to be used in catalytic quantities.
  • the use of catalytic quantities is particularly important in continuous flow reactions.
  • Fe 3+ as a chelated metal ion is that this metal is non-toxic.
  • the high affinity of the polyhistidine tag for metal ions such as Co 2+ or Fe 3+ allows immobilization of polyhistidine-tagged proteins to be carried out from crude solutions containing the proteins without the need for a extensive purification of the solution before the immobilization step.
  • Organic material that does not contain a polyhistidine tag binds chelated metal ions only weakly, or not at all, and is easily removed from material comprising at least one protein labeled with a polyhistidine tag, by washing with, for example, water or buffered aqueous solutions.
  • the polyhistidine-tagged protein is prepared by intracellular overexpression, protein immobilization can be achieved directly from the cell lysate.
  • protein immobilization can be carried out directly from the cell culture supernatant.
  • Dissociation of the bound protein can be accomplished using standard IMAC methods.
  • the bound protein can for example be released from the support by lowering the pH or adding a competitive molecule having equal or greater affinity for chelated metal ions than the polyhistidine group, for example by applying a buffered solution containing imidazole or ethylenediaminetetraacetate (EDTA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetate
  • the polyhistidine tag can be removed from the proteins, if necessary, by techniques known in the art, for example by cleaving the affinity tag with an appropriate enzyme such as a specific protease, thereby obtaining pure, marker-free protein.
  • proteins immobilized on the support are enzymes, they contain an active site capable of catalyzing a chemical reaction.
  • the immobilized enzyme material is potentially useful as a biocatalyst in organic synthesis.
  • the invention relates to the use of an immobilized enzyme material as described herein as a heterogeneous biocatalyst, for example in synthetic organic transformations.
  • a preferred mode of the invention concerns the use of the compositions described above as heterogeneous biocatalysts.
  • the present invention further relates to a method of catalyzing an enzyme-catalyzed reaction, comprising providing a composition comprising a protein or enzyme immobilized on said porous carbonaceous material according to the invention, and contacting said composition comprising an enzyme immobilized with at least one substrate on which the enzyme, which is immobilized on said material, is capable of acting.
  • Immobilization of enzymes on said material by affinity tag binding improves the stability of the enzymes used.
  • the immobilized enzymes were found to tolerate both aqueous conditions as well as a range of organic solvents.
  • compositions comprising a protein or an enzyme immobilized on said porous carbon material under reaction conditions in which the free, non-immobilized enzymes would not have been stable.
  • composition comprising a protein or enzyme immobilized on said porous carbonaceous material can also be used in a wider pH range than free, non-immobilized enzymes would have tolerated.
  • the composition comprising a protein or an enzyme immobilized on said porous carbon material has a higher enzymatic activity per protein mass than the initial non-immobilized protein material.
  • the turnover number (TON) defined as the number of moles of product formed per mole of protein over a given time is greater for an immobilized enzyme according to the invention compared to a free enzyme.
  • the enzyme which is immobilized on said material may be any enzyme which is useful as a biocatalyst in organic synthetic transformations, including, but not limited to, enzymes acting as oxidoreductases, transferases, hydrolases, lyases, isomerases and ligases.
  • compositions comprising an enzyme immobilized on said material can be used as heterogeneous biocatalysts in any organic reaction in which the immobilized enzyme is capable of specifically catalyzing the reaction.
  • biocatalytic reactions include, but are not limited to, enzymatic oxidation and reduction reactions, enzymatic hydrolysis reactions, and enzymatic isomerization reactions.
  • biocatalytic reactions are enantioselective reactions.
  • biocatalytic reactions include the synthesis of chiral amines from prochiral ketones, the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols or from esters and alcohols, the synthesis of hydroxylated molecules or the synthesis of terpenes or terpenoids.
  • two or more different enzymes may be immobilized on the material according to the invention, wherein each of the different enzymes is capable of catalyzing a different reaction.
  • the material containing two or more different immobilized enzymes may then be possible to use the material containing two or more different immobilized enzymes as a heterogeneous biocatalyst in a multistep or cascade reaction.
  • the present application relates to a method for catalyzing an enzyme-catalyzed reaction, comprising providing a composition described above, and bringing said composition into contact with at least one substrate on which an enzyme, which is immobilized on said support of the composition, is capable of acting.
  • the immobilization yields expressed in mg of immobilized enzyme per mg of enzyme initially present in the solution, are between 90 and 100% for protein loads between 5 and 50% by weight.
  • the immobilization speeds expressed in minutes to achieve at least an immobilization rate of at least 75% are between 10 and 120 minutes.
  • the process for immobilizing a protein, in particular an enzyme on the porous carbon material is characterized in that the efficiency of the immobilization is between 90% and 100% for protein loads ranging from 5 to 50% by weight.
  • the method of immobilizing a protein, in particular an enzyme on the porous carbon material is characterized in that the speed of immobilization to achieve a yield of the immobilization of at least 75% is between 10 and 120 minutes.
  • the present application relates to the use of the composition as a heterogeneous biocatalyst. Enzymatic performance
  • the measured enzymatic performances are expressed as the number of reactions catalyzed per enzyme (Turnover number, TON) over a given time.
  • the TON represents the number of moles of substrate converted (or product formed) by the number of moles of enzyme immobilized in a given volume.
  • the specific activity (which is the quantity of substrate transformed per unit of time and per mass of enzyme) of an enzyme immobilized on the porous carbon material is greater than that of the same enzyme free, that is to say not immobilized on said porous carbon material.
  • Example 3 measurements of the enzymatic performance of several immobilized enzymes show a TON significantly higher than that of the non-immobilized enzyme.
  • Figure 1 is a scanning electron micrograph of a continuously interconnected uniform porous texture for a tannin-xylose airgel prepared in 10 mL of a 15 mass% solution of absolute ethanol in deionized water, treated at 180° C for 20 hours in hydrothermal conditions (autoclave), washed then dried by freeze-drying.
  • Figure 2 is a transmission electron micrograph which highlights a macro-mesoporous network for a tannin-xylose airgel prepared in 10 mL of a 15% solution by weight of absolute ethanol in demineralized water, treated at 180 °C for 20 hours in hydrothermal conditions (autoclave), washed then dried by freeze-drying.
  • Figures 1 and 2 show primary particles of a few nanometers, aggregated primary particles forming an interconnected network which induces interparticle gaps of a few nanometers to several micrometers.
  • Figure 3 represents the textural properties determined by volumetry by nitrogen sorption at 77K of airgel prepared from a mixture of an ose and natural extract of cachou.
  • Figure 4 represents the textural properties determined volumetrically by nitrogen sorption at 77K of airgel prepared from a mixture of an ose and catechin.
  • Figure 5A represents a 13 C CP-MAS NMR spectrum of an airgel formed by hydrothermal carbonization of a xylose-catechin mixture (top, dark) and xylose-phloroglucinol (bottom, light) and Figure 5B an FTIR spectrum of 'an airgel formed by hydrothermal carbonization of a mixture of xylose-catechin (top, dark) and xylose-phloroglucinol (bottom, light).
  • Example 1 preparation of a porous carbon material in the form of an airgel (based on xylose/catechin/Fe 3+ (FeXCat))
  • xylose 0.85 g is dissolved in 10 mL of a mixture of deionized water and absolute ethanol 50/50 m/m.
  • the mixture is stirred until a homogeneous solution is obtained.
  • Ultrasonic treatment at room temperature for an hour or less can accelerate the homogenization of the solution,
  • the resulting solution is treated by hydrothermal carbonization, that is to say introduced into a mineralization bomb (autoclave), then this is closed hermetically and placed in an enclosure thermostatically controlled at 180°C for 20 hours, at the end of this time, the autoclave and its contents are cooled to room temperature for a few hours (generally 2 hours),
  • the autoclave is then opened and its contents poured either into ultrapure water (usually 100 mL), into deionized water, or into a mixture water/polar protic solvent (methanol, ethanol, propanol, butanol or their isomers), or in a pure polar protic solvent,
  • the solid obtained is washed by successive soaking (generally 3 times 100 mL) with either ultrapure water, deionized water, or a water/polar protic solvent mixture (methanol, ethanol, propanol, butanol or their isomers), or in a pure polar protic solvent for several hours (generally 8 hours).
  • a hydrogel The hydrogel is then dried by freeze-drying or in a supercritical fluid to obtain an aerogel.
  • the suspension thus obtained is stirred for 4 hours at 20 rpm at room temperature.
  • the suspension is centrifuged (5 min at 5000 rpm). After centrifugation, the supernatant is removed.
  • Steps 1 to 4 are repeated twice.
  • the following three enzymes were prepared: pyrophosphatase from Trypanosoma brucei (TbVSPl, EC3 Hydrolase), transaminase B9L0N2 (w-TA, EC2 transferase) and old Yellow Enzyme from Galdieria sulphuraria (GsOYE, EC1 Oxydoreductase).
  • Steps 1 to 4 are repeated once.
  • GsOYE enzyme 1/2.5/5 mg of GsOYE enzyme according to the desired protein load (10/25/50% by weight) or 1/2.5 mg of B9L0N2 enzyme for a protein load of 10 and 25% by weight.
  • the suspension thus obtained is stirred at 800 rpm for 2 hours at 4°C.
  • samples are taken at 10, 20, 30, 60, 90 and 120 min. To do this, the suspension is centrifuged between 4000 and 6000 rpm for 2 to 5 min then a sample of 20 ⁇ L is taken. Stirring of the reaction mixture is resumed immediately after taking the sample.
  • the suspension is centrifuged (between 4000 and 6000 rpm for 2 to 5 min).
  • Steps 1 to 4 are repeated once.
  • the quantity of proteins present in the samples is measured by Bradford assay.
  • the FeXCat aerogels obtained under the conditions described above (50 mg) are introduced into a non-thermostat-controlled column whose end is made of a frit making it possible to retain the aerogel.
  • the solution is recovered at the outlet of the column.
  • the airgel contained in the column is then washed by percolation of buffer solution at a flow rate of 0.1 mL/min for 50 min.
  • the solution is also recovered at the outlet of the column.
  • the quantity of proteins present in these two solutions are measured by Bradford assay.
  • the FeXCat aerogels obtained under the conditions described above (50 mg) are introduced into a non-thermostat-controlled column whose end is made of a frit making it possible to retain the aerogel.
  • the quantity of proteins present in these two solutions are measured by Bradford assay.
  • Example 3 Immobilization kinetics 10 mg porous carbon material complexed with Fe 3+ ions are brought into contact with 1 mg of enzyme carrying a polyhistidine label in a total volume of lmL.
  • Conversion rates are expressed in moles of product formed per moles of substrate initially present, measured and calculated after a given reaction time.
  • the reaction studied is the hydrolysis of pyrophosphate to phosphate in the presence of the cofactor Mg 2+ .
  • the protein load used is 10% by mass.
  • the reaction mixture consists of sodium pyrophosphate (5mM), MgCl (ImM) dissolved in 50mM Tris-HCl buffer, 200mM NaCl pH 8.5.
  • the solid consisting of lmg of TbVSPl carrying a polyhistidine sequence immobilized on a hydrogel complexed with Fe 3+ ions (lOmg) is added to the reaction mixture.
  • the formation of phosphate is monitored by measuring phosphmolybdate/malachite green using visible spectroscopy at 630nm. The results are summarized in Table 5.
  • the reaction studied is the transamination of pyruvate in the presence of racemic a-methylbenzylamine to alanine and acetophenone in the presence of the cofactor pyridoxal phosphate (PLP).
  • the protein load used is 10% by mass.
  • the reaction mixture consists of pyruvate (25mM), racemic a-methylbenzylamine (25mM) PLP (0.lmM) and DMSO (1% wt) dissolved in Phosphate buffer 50mM NaCl 300mM pH 7.5.
  • the reaction studied is the reduction of cyclohexenone to cyclohexanone in the presence of the cofactor NADH which oxidizes to NAD+.
  • the protein load used is 10% by mass.
  • the reaction mixture consists of cyclohexenone (50mM), NADH (75mM) and DMSO (1% wt) dissolved in Tris-HCl 50mM NaCl 150mM buffer pH 7.5.
  • the solid consisting of lmg of GsOYE carrying a polyhistidine sequence immobilized on a hydrogel complexed with Fe 3+ ions (lOmg) is added to the reaction mixture.
  • the disappearance of NADH is followed by UV spectroscopy at 340nm.
  • Table 5 The results are summarized in Table 5.
  • Table 5 Catalytic performance (Turnover numbers, TON and conversion rate) of the 3 free or immobilized enzymes in the presence of Fe 3+ ions (Trypanosoma brucei pyrophosphatase (TbVSPl, EC3 Hydrolase), B9L0N2 transaminase (w-TA, EC2 Transferase) and the Old Yellow Enzyme of G. sulphuraria (GsOYE, EC1 Oxydoreductase).
  • the TON of the immobilized enzyme is significantly higher than that of the non-immobilized enzyme.
  • the conversions obtained with immobilized enzymes are always equal to or higher than those obtained with the respective free enzymes.
  • the measured enzymatic performances are expressed as the number of reactions catalyzed per enzyme (Turnover numbers, TON) over a given time. These activities are measured for non-immobilized (free) enzymes and for immobilized enzymes under the reaction conditions below.
  • the reaction studied is the hydrolysis of pyrophosphate to phosphate in the presence of the cofactor Mg 2+ .
  • the protein load used is 10% by mass.
  • the reaction mixture consists of sodium pyrophosphate (5mM), MgCh (ImM) dissolved in Tris-HCl 50mM NaCl 200mM buffer pH 8.5.
  • the solid consisting of lmg of TbVSPl carrying a polyhistidine sequence immobilized on a hydrogel complexed with Fe 3+ ions (lOmg) is added to the reaction mixture.
  • the formation of phosphate is followed by determination of phosphomolybdate/malachite green using visible spectroscopy at 630nm.
  • the reaction studied is the transamination of pyruvate in the presence of racemic a-methylbenzylamine to alanine and acetophenone in the presence of the cofactor pyridoxal phosphate (PLP).
  • the protein load used is 10% by mass.
  • the reaction mixture consists of pyruvate (25mM), racemic a-methyl benzylamine (25mM) and PLP (0.lmM) and DMSO (1% wt) in solution of Phosphate buffer 50mM NaCl 300mM pH 7.5.
  • the solid consisting of lmg of w-TA carrying a polyhistidine sequence immobilized on a hydrogel complexed with Fe 3+ ions (lOmg) is added to the reaction mixture.
  • the formation of acetophenone is continuously monitored by UV spectroscopy at 245nm.
  • the reaction studied is the reduction of cyclohexenone and cyclohexanone in the presence of the cofactor NADH which oxidizes to NAD+.
  • the protein load used is 10% by mass.
  • the reaction mixture consists of cyclohexenone (50mM), NADH (75mM) and DMSO (1% wt) dissolved in Tris-HCl 50mM NaCl 150mM buffer pH 7.5.
  • the solid consisting of lmg of GsOYE carrying a polyhistidine sequence immobilized on a hydrogel complexed with Fe 3+ ions (lOmg) is added to the reaction mixture. The disappearance of NADH is followed by UV spectroscopy at 340nm.
  • Step 1 The solid consists of a protein carrying a polyhistidine sequence immobilized on a hydrogel complexed with Fe 3+ ions and is added to the reaction mixture.
  • Step 2 after 10 minutes of reaction at 25°C for TbVSPl and w-TA or after 1 hour of reaction at 30°C for GsOYE, the suspension is centrifuged. The supernatant and the pellet are separated.
  • Step 3 The solid thus obtained is washed twice with a buffered aqueous solution: 1) Buffer is added (lmL). 2) The suspension thus obtained is stirred for a few minutes (generally 5 minutes) at room temperature. 3) The suspension is centrifuged. 4) After centrifugation, the supernatant is removed. Steps 1 to 4 are repeated once.
  • Steps 1, 2 and 3 are repeated successively 4 times, which corresponds to 5 cycles of use of the material consisting of a protein carrying a polyhistidine sequence immobilized on a hydrogel complexed with Fe 3+ ions.
  • Table 6 Catalytic performances (Turnover numbers, TON and conversion rate) of the 3 immobilized enzymes studied (pyrophosphatase from Trypanosoma brucei (TbVSPl, EC3 Hydrolase), B9L0N2 transaminase (w-TA, EC2 Transferase) and Old Yellow Enzyme from G. sulphuraria (GsOYE, EC1 Oxydoreductase) over 5 reaction cycles.
  • TbVSPl Trypanosoma brucei
  • w-TA B9L0N2 transaminase
  • GsOYE Gsulphuraria
  • Example 6 Leaching For each reaction cycle, the three supernatants from steps 2 and 3 of the reuse protocol are kept (i.e. the reaction mixture after 10 min or 1 hour of reaction and the buffer solutions used for the two washings of the solid). The quantity of proteins contained in these solutions is determined by the Bradford method. The mass of protein contained in the solutions is thus obtained and related to the initial quantity of protein immobilized on the solid to obtain the leaching rate. The leaching rate for each cycle represents the amount of protein contained in the supernatant and in successive washes relative to the total amount of protein immobilized on the material. This rate can be expressed in%.
  • Table 7 Leaching rate measured at each cycle of use of the 3 immobilized enzymes studied (Trypanosoma brucei pyrophosphatase (TbSVPl, EC3 Hydrolase), B9L0N2 transaminase (w-TA, EC2 Transferase) and Old Yellow G. sulphuraria enzyme (GsOYE, EC1 Oxydoreductase) over 5 reaction cycles.
  • TbSVPl Terypanosoma brucei pyrophosphatase
  • w-TA B9L0N2 transaminase
  • GsOYE EC1 Oxydoreductase
  • the leaching rates observed are very low: much lower than for other protein immobilization methods such as adsorption or encapsulation and of the same order of magnitude as for methods where a covalent bond to the support is formed via the use of a chemical grafting agent.
  • the metal itself is in very strong interaction with the support via in particular chemical functions on its surface (carboxylic acid, phenol, catechol in particular).
  • the reaction studied for the B9L0N2 enzyme is the transamination of pyruvate in the presence of racemic a-methylbenzylamine to alanine and acetophenone in the presence of the cofactor pyridoxal phosphate (PLP).
  • the reaction mixture (10 mL) is introduced into the column prepared as described previously in the “immobilization” section.
  • the flow is in recirculation, the solution recovered at the column outlet is directly reinjected into the column at a flow rate of 0.1 mL/min.
  • a sample (100 pL) is taken every 10 min for 1 hour.
  • the formation of acetophenone is followed by UV spectrophotometry at 245 nm.
  • the enzymatic activity measured at time t for the immobilized B9L0N2 is expressed in mole of acetophenone formed per mole of enzyme. To do this, the quantity of acetophenone is measured in each sample.
  • the conversion rates are expressed in moles of product formed (acetophenone) per moles of substrate (a-methylbenzylamine) initially present. 100 • Continuous flow using the B9L0N2 enzyme immobilized on Fe-XCat
  • the reaction studied for the B9L0N2 enzyme is the transamination of pyruvate in the presence of racemic a-methylbenzylamine to alanine and acetophenone in the presence of the cofactor pyridoxal phosphate (PLP).
  • the reaction mixture is introduced into the column prepared as described previously in the “immobilization” section.
  • the flow is continuous with a flow rate of 0.1 mL/min, the solution leaving the column is recovered in the form of a fraction of 1 mL for 5 hours.
  • the formation of acetophenone is followed by UV spectrophotometry at 245 nm.
  • the enzymatic activity measured at time t for the immobilized B9L0N2 is expressed in mole of acetophenone formed per mole of enzyme. To do this, the quantity of acetophenone is measured in each sample.
  • the conversion rates are expressed in moles of product formed (acetophenone) per moles of substrate (a-methylbenzylamine) initially present. 100
  • the reaction studied is the reduction of cyclohexenone to cyclohexanone in the presence of the cofactor NADH which oxidizes to NAD+.
  • the reaction mixture (10 mL) is introduced into the column prepared as described previously in the “immobilization” section.
  • the flow is recirculating, the solution recovered at the column outlet is directly reinjected into the column at a flow rate of 1 mL/min.
  • a sample (100 pL) is taken every 10 min for 2 h (Day 1), then the column is stored overnight at 4°C and a new reaction mixture (10 mL) is prepared to be introduced into the column again. (day 2).
  • the disappearance of NADH is followed by UV spectrophotometry at 340 nm.
  • the enzymatic activity measured for immobilized GsOYE is expressed as moles of NADH consumed per mole of GsOYE enzyme. To do this, the quantity of residual NADH is measured in each sample.
  • Conversion rates are expressed in moles of cofactor (NADH) consumed per moles of cofactor (NADH) initial.
  • Table 8 Flow performance with recirculation using the B9L0N2 enzyme immobilized on Fe-XCat Table 9: Flow performance without recirculation (continuous flow) using the enzyme
  • B9L0N2 immobilized on Fe-XCat Table 10 Performance in flow with recirculation using the GsOYE enzyme immobilized on Fe-XCat.
  • the experimental results with B9L0N2 in flow with recirculation, in continuous flow (without recirculation) and with GsOYE in flow with recirculation make it possible to demonstrate the possibility of use the Fe-XCat material to immobilize different enzymes and use them in flow.
  • the low leaching rates ( ⁇ 5%) indicate that the enzymes mainly remain in interaction with the immobilization support material.

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Abstract

La présente invention concerne un matériau polymérique carboné également appelé matériau carboné poreux complexé avec au moins un ion métallique, de préférence un cation métallique, et une composition comprenant une protéine immobilisée sur ledit matériau et des procédés de préparation de ceux-ci. L'invention concerne en outre l'utilisation de la composition comprenant une protéine immobilisée dans des applications de biocatalyse hétérogène notamment.

Description

DESCRIPTION
Nouveau matériau carboné poreux, son procédé de préparation et ses utilisations
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un matériau polymérique carboné également appelé matériau carboné poreux, ou aérogel riche en carbone, comprenant au moins un ion métallique complexé, de préférence un cation métallique, et une composition comprenant au moins une protéine immobilisée sur ledit matériau et des procédés de préparation de ceux- ci.
L'invention concerne, en outre, l'utilisation de la composition comprenant au moins une protéine immobilisée dans des applications de biocatalyse hétérogène notamment.
L'invention concerne également un procédé pour l'immobilisation de protéines portant un marqueur d'affinité sur ledit matériau carboné poreux.
CONTEXTE DE L'INVENTION
Les matériaux carbonés poreux ou aérogels riches en carbone, connus de l'état de la technique, sont classiquement obtenus par des réactions de polymérisation sol-gel entre des précurseurs organiques riches en carbone et un séchage des hydrogels ainsi obtenus.
Un matériau carboné poreux du type de celui préparé et utilisé dans la présente demande est décrit dans la publication «Hydrothermal synthesis of highly porous carbon monoliths from carbohydrates and phloroglucinol»; Nicolas Brun et al.; RSC Advances, 2013, 3.
Ce document décrit plus particulièrement une approche hydrothermale originale pour synthétiser des cryogels et des aérogels riches en carbone (ou carbogels) hautement poreux à partir de précurseurs à base de glucides (par exemple fructose, glucose ou xylose) et de composés phénoliques (par exemple phloroglucinol). Il faut mentionner que ces glucides peuvent être isolés de la fraction cellulosique de la biomasse lignocellulosique, tandis que le phloroglucinol est l'unité monomère des phlorotannins et peut être isolé de l'écorce des arbres fruitiers, des algues brunes ou par diverses voies de biosynthèse. Par conséquent, les composés utilisés dans la présente demande de brevet peuvent être considérés comme renouvelables et durables.
Les aérogels riches en carbone de l'état de la technique, dérivés de la biomasse sont obtenus après un traitement thermique supplémentaire à une température supérieure à 300°C et offrent un large éventail d'applications potentielles, telles que des électrodes pour batteries et piles à combustible, ou des adsorbants pour le stockage de l'hydrogène et du dioxyde de carbone. Les aérogels riches en carbone ou matériaux carbonés poreux selon la présente invention ne sont pas soumis à un traitement thermique à une température > à 300°C.
Par ailleurs, les enzymes sont un groupe spécifique de protéines qui servent de catalyseurs biologiques dans le métabolisme de toutes les cellules vivantes. Ainsi, des enzymes sont capables de transformer spécifiquement des molécules organiques et inorganiques en produits d'intérêt.
Cependant, puisque les enzymes sont des molécules biologiques développées pour un environnement cellulaire, elles sont souvent inadaptées à d'autres environnements. Il est donc intéressant de pouvoir immobiliser des enzymes sur un support solide et de les utiliser comme catalyseurs dans cet état immobilisé.
L'immobilisation d'enzymes sur support solide a été réalisée en utilisant différentes techniques et différents supports solides. L'adsorption d'enzymes sur des surfaces solides peut conduire à des interactions indésirables entre l'enzyme et le support solide. Par exemple, il a été montré que l'adsorption de protéines sur des nanoparticules de silice peut conduire à des changements de structure secondaire de la protéine, ce qui peut conduire à une désactivation de l'enzyme. Il est donc important que le support solide n'interfère pas avec la structure et l'activité des enzymes immobilisées.
La chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) est une technique de purification de protéines basée sur l'affinité de protéines porteuses d'une séquence poly-histidine » pour des ions métalliques telles que Fe3+, Cu2+, Zn2+, Ni2+ et Co2+.
Ainsi, par exemple, les ions métalliques sont immobilisés sur un gel d'agarose porteur de fonctions IDA (imido diacétate) et/ou NTA (nitrilo triacétate) et peuvent être complexés sélectivement par des protéines porteuses d'acides aminés tels que de l'histidine et/ou de la cystéine. Une version améliorée de cette technique utilise des protéines recombinantes contenant un peptide de polyhistidine fusionné. Bien que cette technique puisse être appliquée avec succès dans des procédures chromatographiques pour la purification et l'isolement de protéines, les enzymes immobilisées sur un gel sont moins appropriées en tant que catalyseurs hétérogènes dans une synthèse organique.
Dans des tentatives de préparation de catalyseurs hétérogènes, le principe basé sur la technique IMAC de liaison de marqueur d'affinité a été appliqué à l'immobilisation d'enzymes marquées par polyhistidine sur de la silice modifiée. Des résultats encourageants ont été obtenus pour la lipase B de Candida antarctica (CalB), mais d'autres enzymes moins stables se sont avérées désactivées en présence de silice, notamment en présence de solvants organiques. Il est connu dans la littérature que les nanoparticules de silice ont un effet déstabilisant sur les protéines.
Les coûts élevés concernant la préparation d'enzymes et la perte d'activité fréquemment observée lors de l'immobilisation de l'enzyme sur un support solide sont des obstacles dans ce développement. Une procédure standardisée et généralement utilisable pour l'immobilisation d'enzyme, qui permettrait à l'enzyme d'être réutilisée, serait hautement souhaitable. Il n'existe toujours aucun procédé général et simple pour la préparation de catalyseurs hétérogènes par immobilisation d'enzymes.
Il existe donc un besoin pour de nouveaux supports et des procédés améliorés d'immobilisation d'enzymes sur ces supports, et pour des biocatalyseurs hétérogènes stables qui peuvent être appliqués en synthèse organique dans des conditions de réactions aqueuse ou organique.
Il a été découvert de manière surprenante qu'un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale d'au moins un glucide et au moins un composé porteur d'au moins une fonction orthodiphénol, chargé avec au moins un ion métallique permet d'immobiliser au moins une protéine de préférence par l'intermédiaire d'une liaison d'étiquette d'affinité, de façon améliorée par rapport à d'autres types d'immobilisation de protéines.
BREF APERÇU DE L'INVENTION
Dans ce contexte d'une recherche d'outils de biocatalyse adaptés et efficaces, un premier but de l'invention est de proposer un matériau carboné poreux complexé avec au moins un ion métallique, de préférence un cation métallique. Un second but de l'invention est de proposer une composition comprenant une protéine immobilisée sur ledit matériau ou l'utilisation dudit matériau pour immobiliser une protéine. Un troisième but de l'invention est de proposer des procédés permettant de préparer lesdits matériaux et compositions. Enfin, un autre but de l'invention est de proposer des compositions particulières et leurs utilisations.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Selon un premier aspect de l'invention, la présente demande concerne une composition comprenant : a) un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir d'au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside (précurseur biosourcé #1), et
-d'au moins un composé présentant une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol (précurseur biosourcé #2), et b) au moins un cation métallique.
Le matériau carboné poreux de la présente invention est caractérisé en spectroscopie RMN à l'état solide 13CP-MAS par un signal à 144 ppm, attribué aux carbones des fonctions orthodiphénols.
Le matériau carboné poreux de la présente invention est également caractérisé par des bandes à 1200, 1280 et 1500 cm’1, en spectroscopie FTIR, attribuées aux vibrations C-C et C-0 du noyau aromatique d'une fonction orthodiphénol.
Le matériau carboné poreux de la présente invention présente donc au moins une fonction orthodiphénol.
Le matériau carboné poreux de la présente invention est obtenu par carbonisation hydrothermale d'au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside (précurseur biosourcé #1) et d'au moins un composé présentant une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol (précurseur biosourcé #2).
Le composé précurseur biosourcé #1 utilisable selon la présente invention est un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside.
Les glucides sont définis par l'Union internationale de chimie pure et appliquée (IUPAC) comme une classe de composés organiques contenant un groupe carbonyle (aldéhyde ou cétone) et au moins deux groupes hydroxyle (-OH). On inclut dans cette classe les substances issues des monosaccharides par réduction du groupe carbonyle, par oxydation d'au moins un groupe fonctionnel à l'extrémité de la chaîne en acide carboxylique ou par remplacement d'un ou plusieurs groupes hydroxyle par un atome d'hydrogène, un groupe amino, un groupe thiol ou par tout atome similaire. Par ailleurs, dans le cadre de la présente demande, les composés issus de la déshydratation des glucides, (p.e les aldéhydes furaniques) peuvent également être utilisés.
Un ose (ou monosaccharide) est un monomère de glucide. Les oses possèdent au moins 3 atomes de carbone : ce sont des polyhydroxyaldéhydes ou des polyhydroxycétones.
On distingue les oses par la longueur de leur chaîne carbonée, comme suit :
• les trioses : oses à 3 carbones, C3H6O3 (glycéraldéhyde, dihydroxyacétone) ;
• les tétroses : oses à 4 carbones, C4H8O4 (érythrose, thréose, érythrulose) ;
• les pentoses : oses à 5 carbones, C5H10O5 (désoxyribose (C5HI0O4), ribose, arabinose, xylose, lyxose, ribulose, xylulose)
• les hexoses : oses à 6 carbones, C6H12O6 (allose, altrose, galactose, glucose, gulose, idose, mannose, talose, fructose, psicose, sorbose, tagatose) ;
• les désoxyhexoses : oses à 6 carbones, C6H12O5 (fucose, rhamnose) ;
• les heptoses : oses à 7 carbones, C7H14O7 (sédoheptulose, mannoheptulose)
• les octoses : oses à 8 carbones, CsHieOs (heptahydroxyoctanal) ;
• les nonoses : oses à 9 carbones, C9H17N1O8 (acide neuraminique ou acide sialique).
Un aldose est un monosaccharide constitué d'une chaîne de n atomes de carbone comportant un groupe carbonyle sur l'atome de carbone terminal, ce qui en fait un aldéhyde, et des groupes hydroxyle reliés à tous les autres atomes de carbone. Les aldoses ont la formule chimique générale Cn(H2O)n. Étant donné que le formaldéhyde (n=l) et le glycolaldéhyde (n=2) ne sont généralement pas considérés comme des glucides, l'aldose le plus simple possible est le glycéraldéhyde ( n=3), qui ne contient que trois atomes de carbone.
Un cétose est un monosaccharide constitué d'une chaîne de n atomes de carbone comportant un groupe carbonyle sur l'atome de carbone non terminal, ce qui en fait une cétone, et des groupes hydroxyle reliés à tous les autres atomes de carbone. Selon un mode préféré de l'invention, le au moins un ose est choisi parmi :
• -un aldose notamment choisi parmi : le glycéraldéhyde, l'érythrose, le thréose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, l'allose, l'altrose, le glucose, le mannose, le gulose, l'idose, le galactose, et le talose, de préférence le xylose, ou
• -un cétose notamment choisi parmi : la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose, le xylulose, le fructose, le psicose, le sorbose, et le tagatose, de préférence le fructose
Un polyoside est un polymère de la famille des glucides formés d'un nombre n d'oses (n > 2) par liaison glycosidique alpha ou beta.
Selon un mode préféré de l'invention, le au moins un polyoside est choisi parmi :
• -un hétérodiholoside (un polyoside pour lequel n=2 constitué de 2 unités osidiques différentes) notamment choisi parmi le tréhalulose, le saccharose, le turanose, le maltulose, le leucrose, l'isomaltulose, le gentiobiulose, le mélibiose, le lactulose, le lactose, et le rutinose, ou
• -un homodiholoside (un polyoside pour lequel n=2 constitué de 2 unités osidiques identiques) notamment choisi parmi : l'inulobiose, I'alpha2-mannobiose, I'alpha3-mannobiose, le tréhalose, le kojibiose, le nigerose, le maltose, l'isomaltose, le sophorose, le laminaribiose, le cellobiose, et le gentiobiose, de préférence le maltose ou le saccharose.
Selon un autre mode de l'invention, le composé précurseur biosourcé #1 du matériau carboné poreux consiste en un glucide, de préférence un ose, ou un polyoside tels que décrits ci-dessus.
Selon un autre mode de l'invention, le matériau carboné poreux comprend deux composés précurseurs biosourcés #1 qui consistent en deux glucides, de préférence deux oses, deux polyosides ou un ose et un polyoside tels que décrits ci-dessus. Selon un autre mode de l'invention, le matériau carboné poreux comprend plus de deux composés précurseurs biosourcés #1.
Selon un mode préféré de l'invention, le au moins un composé présentant une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol est un composé précurseur biosourcé ayant au moins un noyau benzénique substitué par deux groupes hydroxyle en position ortho ou au moins un groupe méthoxy en position ortho.
Dans la présente demande, le terme "biosourcé" désigne des matériaux ou composés issus de la biomasse d'origine végétale ou animale, modifiés chimiquement ou non. Ces matières premières présentent l'avantage d'être renouvelables.
On entend par composé "d'origine naturelle" ou biosourcé au sens de l'invention, tout composé en provenance de la nature (biomasse d'origine végétale ou animale). Ce composé peut être extrait de la biomasse terrestre et marine renouvelable ou d'organismes vivants (animaux, micro-organismes), éventuellement ultérieurement modifié par exemple chimiquement, ou encore obtenu suite à l'action de micro-organismes vivants (par exemple des enzymes ou bactéries) sur un composé d'origine naturelle selon des procédés de type biofermentation ou biosynthèse. Les composés issus du pétrole, d'origine fossile, n'entrent pas dans cette catégorie.
Le composé précurseur biosourcé #2 utilisable selon la présente invention peut être un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol.
Le composé présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol précurseur biosourcé utilisable selon la présente invention peut être choisi parmi les métabolites secondaires des végétaux. Les composés phénoliques forment le groupe des composés phytochimiques le plus important des plantes. Ils présentent près de 8000 molécules divisées en une dizaine de classes chimiques. Chaque classe est caractérisée par la présence d'un noyau benzénique auquel un ou plusieurs groupes hydroxyles sont directement liés. Ces composés sont présents dans toutes les parties des végétaux supérieurs (racines, tiges, feuilles, fleurs, pollen, fruits, graines et bois). Ils sont synthétisés par les plantes soumises à des conditions difficiles (infections, blessures, radiation UV, ...) et sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques comme la croissance cellulaire, la rhizogenèse, la germination des graines ou la maturation des fruits.
Les composés orthodiphénol ou orthomethoxyphénol préférés sont indiqués dans le Tableau ci-dessous :
Selon un mode préféré de l'invention, le au moins un composé présentant une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol est choisi parmi : le catéchol, le pyrogallol, l'acide caféique, la mangiférine, la quercétine, la cyanidine, la catéchine, l'épicatéchine, l'épigallocatéchine, l'anthocyanidol, le procyanidol B-3, le procyanidol B-4, les fuhalols (bifuhahol, trifuhahol), le carmalol (diphloréthohydroxycamalol) et l'acide tannique.
Selon un mode préféré de l'invention, le au moins un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol est la catéchine.
Selon un mode préféré de l'invention, le au moins un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthomethoxyphénol est contenu dans un extrait naturel végétal. Selon un mode préféré de l'invention, l'extrait naturel végétal contenant au moins un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthomethoxyphénol est choisi parmi un extrait de fraise, pomme de terre, pomme, citron, noix, vigne, raisin, fleurs, soja, pois, pin, tomate, ail, bois de quebracho, mimosa, châtaigner ou cachou.
Selon un autre mode de l'invention, le matériau carboné poreux comprend deux composés précurseurs biosourcés #2 qui consistent en deux composés présentant au moins une fonction orthodiphénol tels que décrits ci-dessus. Selon un autre mode de l'invention, le matériau carboné poreux comprend plus de deux composés précurseurs biosourcés #2.
Selon un mode préféré de l'invention, le matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir de :
• maltose, galactose, lactose, glucose, mannose, sucrose, arabinose, ribose, fructose, xylose, érythrose, ou dihydroxyacétone, et
• catéchine, ou d'un extrait de cachou.
L'extrait de cachou peut être obtenu à partir de fibres végétales d'Acacia à cachou, ledit extrait contenant des tanins condensés et des flavonols.
Selon l'invention, le terme «matériau carboné poreux» représente un matériau polymère obtenu ou susceptible d'être obtenu par polymérisation sol-gel (p.e par carbonisation hydrothermale) à partir d'au moins deux précurseurs biosourcé # 1 et 2 tels que définis dans la présente demande.
Selon l'invention le rapport molaire entre le au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside et le au moins un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthomethoxyphénol est compris de 10/1 à 1/10, de préférence 1/2 ou 1/1 ou 2/1 ou 3/1 ou 4/1 ou 5/1.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le matériau carboné poreux est susceptible d'être obtenu par un procédé de polymérisation sol-gel, connu de l'homme du métier, faisant intervenir au moins deux précurseurs biosourcés # 1 et 2 tels que définis ci-dessus.
Les procédés de polymérisation sol-gel peuvent utiliser un catalyseur, par exemple, des acides et des bases tels que, par exemple, l'acide nitrique, l'acide acétique, l'acide ascorbique, l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide borique, le carbonate de sodium, l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde d'ammonium et le sulfate de calcium.
Les concentrations de catalyseur peuvent être exprimées en rapport réactif-catalyseur (R/C) qui peut aller, par exemple, de 10 à 5 000, ou de 10 à 2 000, ou de 10 à 1 000.
Selon un mode préféré de l'invention, le matériau carboné poreux est obtenu par carbonisation hydrothermale.
La carbonisation hydrothermale est définie comme étant un processus de conversion thermochimique de la biomasse ou dans le cadre de la présente invention au moins deux précurseurs biosourcés # 1 et 2 tels que définis ci-dessus dans le but d'obtenir un monolithe de carbone poreux en phase aqueuse. Il s'agit d'un processus exothermique qui diminue les taux d'oxygène et d'hydrogène de la matière principalement par des réactions de déshydratation et de décarboxylation. La polymérisation sol-gel est obtenue en appliquant des températures comprises de 120°C à 250°C à un mélange d'au moins deux précurseurs biosourcé # 1 et 2 tels que définis ci-dessus et d'un solvant, de préférence d'eau (en général 10% en masse des deux précurseurs biosourcé # 1 et 2).
Dans un mode de réalisation particulier, le matériau carboné poreux est préparé par le procédé suivant : a) Chauffer un mélange réactionnel comprenant une solution aqueuse, et, au moins deux précurseurs biosourcés # 1 et 2 tels que définis ci-dessus dissous dans la solution aqueuse, à une température inférieure à 300°C pour obtenir un matériau carboné poreux solide, b) Laver le matériau carboné poreux solide obtenu par trempage successifs dans un solvant polaire.
La solution aqueuse comprend de l'eau, et éventuellement des solvants, de préférence en quantités miscibles avec l'eau.
Selon un mode de réalisation préféré, le mélange réactionnel ne comprend qu'une seule phase liquide, à savoir la solution aqueuse, de préférence de l'eau.
Par exemple et sans limitation, la solution aqueuse comprend de l'éthanol, de préférence de l'éthanol absolu.
Selon un mode de réalisation préféré la fraction massique en eau dans un mélange eau/éthanol absolu est comprise de 1 à 0,3. Selon un mode de réalisation préféré la fraction massique en eau dans un mélange eau/éthanol absolu est comprise de 1 à 0.5 lorsque les précurseurs biosourcés # 1 et 2 sont respectivement le xylose et la catéchine.
L'étape (a) du procédé peut également être appelée « étape de traitement hydrothermal ».
Grâce à la présence d'eau (dans la solution aqueuse) dans l'étape (a), le procédé de préparation de l'invention se distingue par exemple des procédés pyrolytiques, pour la conversion de biomasse ou des précurseurs biosourcés # 1 et 2, pour donner un matériau de type charbon (typiquement en l'absence d'oxygène).
La température de réaction dans l'étape de traitement hydrothermal (a) est de préférence <300°C, plus préférablement de 100 à 300°C, encore plus préférablement de 120 à 250°C et le plus préférablement de 160 à 200°C ou encore de préférence à 180°C. La température de réaction est destinée à désigner la température, plus spécifiquement la température moyenne, à l'intérieur du mélange réactionnel, qui peut être mesurée avec un thermocouple.
Le traitement hydrothermal dans le procédé de préparation du matériau carboné poreux de la présente invention est de préférence effectué dans un réacteur résistant à la pression, par exemple un autoclave.
Il n'y a pas de limitation spécifique quant à la durée de l'étape (a) dans le procédé de préparation du matériau carboné poreux de l'invention.
Par exemple, le milieu réactionnel peut être introduit dans une bombe de minéralisation fermée hermétiquement, puis placé dans une enceinte thermostatée à 180°C pendant 20 heures.
L'étape (a) du procédé est mise en œuvre jusqu'à ce que la totalité du contenu du mélange réactionnel comprenant la solution aqueuse et les précurseurs biosourcés # 1 et 2 se soit gélifié ou précipité en matériau carboné poreux de la présente invention.
Dans un mode de réalisation particulier, le matériau carboné poreux est préparé par le procédé suivant : a) Chauffer un mélange réactionnel comprenant :
-une solution aqueuse constituée d'eau et d'éthanol absolu avec une fraction massique en eau comprise de 0,7 à 0,4, et, -du xylose et de la catéchine dissous dans la solution aqueuse, à une température inférieure à 300°C (de préférence à 180°C) pour obtenir un matériau carboné poreux solide, b) Laver le matériau carboné poreux solide obtenu par trempage successifs dans un solvant polaire.
Dans un mode de réalisation particulier, le matériau carboné poreux est préparé par le procédé suivant : a) Chauffer un mélange réactionnel comprenant :
-une solution aqueuse constituée d'eau et d'éthanol absolu avec une fraction massique en eau comprise de 1 à 0,5, et,
-du xylose et de la catéchine ou un extrait de cachou dissous dans la solution aqueuse, à une température inférieure à 300°C (de préférence à 180°C) pour obtenir un matériau carboné poreux solide, b) Laver le matériau carboné poreux solide obtenu par trempage successifs dans un solvant, de préférence un solvant polaire.
Selon un mode de réalisation préférée, le matériau carboné est formé à partir d'au moins un glucide, de préférence un aldose ou cétose, encore plus de préférence au moins un hétérodiholoside, ou homodiholoside (cl) et d'au moins un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthomethoxyphénol (c2) dans un rapport molaire (cl/c2) compris de 10/1 à 1/10, de préférence 2/1. Pour les extraits naturels complexes et tanins condensés, le rapport molaire (cl/c2) est défini par le rapport entre le nombre de moles de glucides (cl) et le nombre de moles de composés présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthomethoxyphénol
Dans un mode de réalisation particulier, le matériau carboné poreux est préparé par le procédé suivant : a) Chauffer un mélange réactionnel comprenant :
-une solution aqueuse constituée d'eau et d'éthanol absolu avec une fraction massique en eau comprise de 0,7 à 0,4, et, -du xylose et de la catéchine ou un extrait de cachou dissous dans la solution aqueuse, à une température inférieure à 300°C (de préférence à 180°C) pour obtenir un matériau carboné poreux solide, b) Laver le matériau carboné poreux solide obtenu par trempage successifs dans un solvant, de préférence un solvant polaire.
Dans un mode de réalisation particulier, le matériau carboné poreux est préparé par le procédé suivant : a) Chauffer un mélange réactionnel comprenant :
-une solution aqueuse constituée d'eau et d'éthanol absolu avec une fraction massique en eau comprise de 1 à 0,5, et,
-du xylose et de la catéchine (ratio molaire 2/1) dissous dans la solution aqueuse, à une température inférieure à 300°C (de préférence à 180°C) pour obtenir un matériau carboné poreux solide, b) Laver le matériau carboné poreux solide obtenu par trempage successifs dans un solvant, de préférence un solvant polaire.
Selon un mode de réalisation préférée, le matériau carboné poreux est constitué de
• 40-70% massique en élément carbone (C)
• 30-40% massique en élément oxygène (O) de préférence 60% massique en élément carbone (C) et 35% massique en élément oxygène (O).
Selon un mode de réalisation préférée, le matériau carboné poreux est constitué de 36% O et 60% C pour le système xylose/cathéchine ou extrait de cachou.
Selon un mode de réalisation préférée, le matériau carboné poreux est formé à partir d'au moins un glucide (cl), de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside (cl) et d'au moins un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol (c2) ou dans un rapport molaire (cl/c2) compris de 10/1 à 1/10, de préférence 2/1. Le matériau carboné poreux solide est lavé par trempage soit dans de l'eau ultrapure, soit désionisée soit dans un mélange eau/solvant protique polaire, par exemple le méthanol, l'éthanol ou le tert-butanol pendant plusieurs heures.
Le lavage a pour but d'extraire des composés solubles non incorporés dans la structure du matériau carboné poreux et de préparer le gel à l'étape de séchage.
Le matériau carboné obtenu ou pouvant être obtenu dans l'étape de carbonisation hydrothermale (a) est typiquement composé de nanoparticules primaires agrégées en un réseau interconnecté formant la phase dispersée, la solution aqueuse formant la phase de dispersion.
Le matériau carboné avant séchage peut être appelé solvogel. Lorsque la solution aqueuse est de l'eau, le matériau carboné obtenu à l'étape (a) peut être appelé hydrogel.
Par conséquent, un hydrogel est considéré ici comme un type spécial de solvogel, dans lequel la solution aqueuse de la phase de dispersion est de l'eau.
Le matériau carboné poreux solide obtenu ou pouvant être obtenu selon le procédé décrit ci-dessus peut être séché et transformé en cryogel, en aérogel ou en xérogel.
Selon une première variante, une forme sèche d'un hydrogel ou solvogel est obtenue en soumettant le matériau carboné (i.e hydrogel ou solvogel) au contact d'un fluide- supercritique, notamment de l'acétone ou du dioxyde de carbone pour le transformer en un aérogel.
Selon une seconde variante, une forme sèche d'hydrogel est obtenue en soumettant le matériau carboné (i.e hydrogel ou solvogel) à une congélation du gel ainsi isolé et une lyophilisation dudit gel congelé pour le transformer en un cryogel.
Selon une troisième variante, une forme sèche d'hydrogel est obtenue en soumettant le matériau carboné (i.e hydrogel ou solvogel) à une évaporation du solvant à température et pression contrôlées pour le transformer en un xérogel.
Par ailleurs, un cryogel peut être nommé aérogel lorsque le gel séché a largement conservé les propriétés texturales après séchage.
Les gels séchés peuvent être nommés aérogels indépendamment de la technique de séchage utilisée.
Selon le procédé de séchage du gel, il est possible de contrôler la taille des pores et la structure des matériaux carbonés poreux obtenus selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, le matériau carboné poreux est préparé par le procédé suivant : a) Chauffer un mélange réactionnel comprenant une solution aqueuse, et, au moins deux précurseurs biosourcé # 1 et 2 tels que définis ci-dessus dissous dans la solution aqueuse, à une température inférieure à 300°C, de préférence à 180°C pour obtenir un matériau carboné poreux solide, b) Laver le matériau carboné poreux solide obtenu par trempage successifs dans un solvant polaire (idéalement dans de l'éthanol absolu ou dans un mélange eau/tert-butanol 75/25 en pourcentages massiques), c) Sécher le matériau carboné poreux solide à l'aide d'un fluide supercritique ou par lyophilisation.
Les hydrogels disposés dans des béchers en verre borosilicaté sont préalablement placés en immersion dans de l'azote liquide (77 K) pendant 15 minutes, puis directement placé dans la chambre du lyophilisateur (p.e un lyophilisateur COSMOS de Cryotec). Le séchage est effectué sous vide < 50 mTorr pendant 48h avec un piège de froid à -80°C qui assure la condensation des vapeurs d'eau ou de solvants.
Le séchage supercritique et la lyophilisation sont préférés pour maintenir le système de pores. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le solvant est éliminé par extraction avec du CO2 supercritique pour ce procédé, le solvant dans le solvogel est de préférence choisi parmi l'éthanol absolu ou l'acétone (par exemple amené par remplacement de solvant par l'éthanol absolu ou l'acétone).
Texture du matériau carboné poreux
Le matériau carboné poreux obtenu ou pouvant être obtenu dans l'étape (a), est un matériau gélifié, en particulier une matière solidifiée composée de particules agrégées formant un réseau interconnecté. Le matériau carboné poreux obtenu ou pouvant être obtenu selon le procédé décrit ci-dessus comprend des micropores (pores < 2 nm), mésopores (pores de 2-50 nm) et macropores (pores > 50 nm).
En outre, par opposition aux charbons actifs classiques (par exemple ceux produits par pyrolyse), la teneur en oxygène est typiquement supérieure à 25 % pour les matériaux directement obtenus dans l'étape de carbonisation hydrothermale (a).
La surface du matériau carboné de l'invention telle qu'obtenue à l'étape (a) est très hydrophile.
Propriétés texturales du matériau carboné poreux
Diamètre des pores
Le matériau carboné poreux selon la présente invention est composé de particules agrégées formant un réseau interconnecté. Ce réseau interconnecté de particules agrégées induit des interstices interparticulaires (ou pores) avec un diamètre compris entre 10 pm et 5 nm, plus préférablement avec un diamètre moyen de 5 à 200 nm, plus préférablement avec un diamètre moyen de 25 à 100 nm et encore plus préférable de 40 à 80 nm et de préférence autour de 60 nm.
De plus, le matériau carboné poreux selon la présente invention est une matière agrégée composée des particules, avec une distribution de taille de pore calculée à partir d'une isotherme d'adsorption/désorption d'azote à 77 K (pour les pores les plus étroits ; < 100 nm) et un profil de porosimétrie par intrusion de mercure (pour les pores les plus larges ; > 50 nm).
De plus, la distribution de la taille des pores et le diamètre des pores qui correspond au pic de la distribution de la taille des pores peuvent être fournis par l'analyse BJH de l'isotherme d'adsorption/désorption d'azote.
Le diamètre des pores du gel de carbone selon la présente invention, correspondant au pic de la distribution de taille des pores, est de préférence dans une gamme de 40 à 80 nm.
Il convient de noter que, dans le but d'empêcher la réduction de la quantité de composants adsorbés, le diamètre des pores du matériau carboné poreux selon la présente invention, correspondant au pic de la distribution de la taille des pores, est de préférence supérieur au diamètre moléculaire moyen du diamètre des composants adsorbés ou complexés.
Surface spécifique
Le matériau carboné poreux selon la présente invention présente de préférence une surface spécifique de 300 à 1000 m2/g, plus préférablement présente une surface spécifique de 600 à 800 m2/g.
Si le matériau carboné poreux a une surface spécifique inférieure à 100 m2/g, la surface avec laquelle les composants adsorbés sont en contact sera réduite, et le nombre de pores dans lesquels les composants adsorbés sont logés sera réduit.
Volume poreux
De plus, le volume poreux total du matériau carboné poreux selon la présente invention n'est pas particulièrement limité car il varie également en fonction de la surface spécifique et du diamètre des pores qui correspond au pic de la distribution de taille des pores. Cependant, le matériau carboné poreux selon la présente invention a de préférence un volume total de pores de 0,1 à 5 cm3/g, plus préférablement a un volume total de pores de 0,2 à 2,5 cm3/g.
Le volume dit total a été déterminé à une pression relative de 0,99 sur les isothermes d'adsorption/désorption d'azote à -196°C. La surface et le volume de micropore ont été déterminés en appliquant la méthode t-plot. Les distributions des diamètres de pores ont été évaluées en appliquant la méthode BJH sur la branche de désorption des isothermes. Les aérogels ont été dégazés pendant au moins 6 h à 0,05 mbar sur un VacPrep Micromeritics avant analyses. Les analyses ont été réalisées sur un TriStar Micromeritics. Le volume total de pores dans les matériaux est supérieur à celui obtenu par volumétrie de sorption d'azote à - 196°C, puisque les pores les plus larges (> 100 nm de diamètre) ne peuvent pas être analysés par cette méthode. Les pores les plus larges (> 100 nm de diamètre) ont été analysés par porosimétrie par intrusion de mercure. Le volume de ces pores larges est supérieur à 3 mL/g pour des aérogels catéchine/xylose. La surface spécifique et le volume poreux total du matériau carboné poreux selon la présente invention peuvent être déterminés par une mesure volumétrique générale décrite ci-dessous. Plus précisément, un matériau carboné poreux est placé dans un récipient et refroidi à la température de l'azote liquide (-196°C). Ensuite, de l'azote gazeux est introduit dans le récipient et la quantité d'azote gazeux adsorbée sur le gel de carbone est déterminée sur la base de la méthode volumétrique. Ensuite, la pression d'azote gazeux introduite dans le récipient est progressivement modifiée et la quantité d'azote gazeux adsorbée sur le gel de carbone est tracée en fonction de chaque pression d'équilibre. On obtient ainsi l'isotherme d'adsorption/désorption d'azote.
Par ailleurs, la surface spécifique peut être déterminée par la méthode de Brunauer Emmett Teller (BET), par exemple par la technique d'adsorption de diazote.
La surface spécifique équivalent BET a été déterminée par adsorption d'azote à 77K en réalisant des isothermes à des pressions relatives P/PO comprises entre 0,01 et 0,99. La méthode BET a été appliquée sur une gamme de pressions relatives comprises entre 0,1 et 0,3 (en se basant sur la transformée de Rouquerol).
Selon la présente invention, un aérogel préparé à partir de mélanges catéchine ou d'un extrait naturel de cachou et un ose (voir la Figures 3 et 4) présente un volume total compris de 0,5 à 0, 8 cm3/g, un volume externe compris de 0,5 à 0,8 cm3/g et un volume microporeux compris de 0,01 à 0,05 cm3/g.
Porosité interconnectée
Ce paramètre peut être déterminé par porosimétrie par intrusion de mercure indiquant le volume total de pores interconnectés.
Complexation d'ions
Les matériaux carbonés poreux tels que décrits ci-dessus sont complexés avec des ions métalliques de préférence au moins un type de cation métallique qui est complexé sur les surfaces externes et les surfaces des pores internes du matériau carboné poreux selon l'invention.
Selon un mode préféré de l'invention, le au moins un cation métallique est choisi parmi Al3+, Ag+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Cu+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Mg2+, Mn2+, Na+, Ni2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Zn2+, de préférence un ou des cations de métaux de transition Fe3+, Co2+, Zn2+, Cu2+, ou Ni2+.
Le cation métallique est complexé ou chélaté au matériau carboné poreux. Un chélate est un type de composé de coordination dans lequel un ion métallique unique est fixé par des liaisons covalentes coordonnées à une molécule ou à un ion appelé ligand. Un composé de coordination est formé lorsque des groupes d'atomes, d'ions ou de molécules se lient chimiquement les uns aux autres en donnant et en acceptant des paires d'électrons. Les groupes qui donnent des paires d'électrons sont appelés ligands. Ce sont généralement des bases de Lewis. Les groupes acceptant des paires d'électrons sont souvent des cations de métaux de transition.
Selon la présente invention, le terme « matériau hybride » fait référence au matériau carboné poreux sur lequel est complexé les ions métalliques. Il s'agit de la composition au sens de la présente invention.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition (matériau hybride carboné poreux) est préparée par le procédé suivant : a) Chauffer un mélange réactionnel comprenant une solution aqueuse, et, au moins deux précurseurs biosourcé # 1 et 2 tels que définis ci-dessus dissous dans la solution aqueuse, à une température inférieure à 300°C pour obtenir un matériau carboné poreux solide, b) Laver le matériau carboné poreux solide obtenu par trempage successifs dans un solvant polaire, c) Sécher le matériau carboné poreux solide à l'aide d'un fluide supercritique ou par lyophilisation, d) Imprégner le matériau carboné poreux solide avec une solution comprenant des cations métalliques pour obtenir un matériau hybride carboné poreux complexé avec des cations métalliques.
Le processus d'adsorption pour permettre au complexe métallique de s'adsorber sur un matériau carboné, les conditions d'adsorption ne sont pas particulièrement limitées. Par exemple, un complexe métallique peut être adsorbé sur un matériau carboné en plaçant le matériau carboné poreux dans une solution et en mélangeant la solution pendant une certaine période de temps à environ 10 à 100°C. Le matériau hybride est séparé de la solution par centrifugation, et la suspension ainsi obtenue est lavée puis séchée.
Selon une autre variante de l'invention la composition (matériau hybride carboné poreux) est préparée par le procédé suivant : a) Chauffer un mélange réactionnel comprenant une solution aqueuse, et, au moins deux précurseurs biosourcé # 1 et 2 tels que définis ci-dessus dissous dans la solution aqueuse, avec une solution comprenant des cations métalliques, à une température inférieure à 300°C pour obtenir un matériau carboné poreux solide, b) Laver le matériau hybride carboné poreux solide obtenu par trempage successifs dans un solvant polaire, c) Sécher le matériau hybride carboné poreux solide à l'aide d'un fluide supercritique ou par lyophilisation.
La quantité d'ions métalliques complexé au matériau carboné poreux pour former le matériau hybride ou la composition de la présente invention n'est pas particulièrement limitée. Cependant, la quantité d'ions métalliques adsorbés ou complexés sur un matériau carboné est de préférence comprise de 0,1 à 40 parties en poids par rapport à 100 parties en poids du matériau carboné poreux.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend une quantité de cations métalliques chélatés ou complexés, mesurée par la méthode MEB-EDX, comprise de 0,2 à 2% molaire, de préférence de 0,5 à 1% molaire.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend une quantité de 1 à 5 % massique de cation métallique en particulier de 2 à 4% massique.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend une quantité de 20 à 40 mg de Fer par gramme de matériau carboné poreux. Le solvant utilisé ici n'est pas particulièrement limité tant qu'il peut dissoudre et/ou disperser des complexes métalliques. Des exemples de ceux-ci comprennent : l'acide acétique, l'eau, l'éthylène glycol, le DMSO et le DMF.
La concentration de complexe métallique dans la solution n'est pas particulièrement limitée. Cependant, la concentration est de préférence d'environ 0,1 à 500 mM.
Selon un mode préféré de l'invention, la composition (matériau hybride carboné poreux solide) comprend : a) un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir :
• -d'au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside (précurseur biosourcé #1), et
• -d'au moins un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthomethoxyphénol (précurseur biosourcé #2), et b) au moins un cation métallique choisi parmi Al3+, Ag+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Cu+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Mg2+, Mn2+, Na+, Ni2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Zn2+, de préférence un ou des cations de métaux de transition Fe3+, Co2+, Zn2+, Cu2+, ou Ni2+.
Selon un mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir :
-d'au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside, dans laquelle
-l'ose est choisi parmi
• un aldose notamment choisi parmi : le glycéraldéhyde, l'érythrose, le thréose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, l'allose, l'altrose, le glucose, le mannose, le gulose 'idose, le galactose, et le talose, de préférence le xylose, ou
• un cétose notamment choisi parmi : la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose, le xylulose, le fructose, le psicose, le sorbose, et le tagatose, de préférence le fructose, ou -le polyoside est choisi parmi : • un hétérodiholoside notamment choisi parmi : le tréhalulose, le saccharose , le turanose , le maltulose, le leucrose, l'isomaltulose, le gentiobiulose, le mélibiose, le lactulose, le lactose, et le rutinose, ou
• un homodiholoside notamment choisi parmi l'inulobiose, l'alphaZ- mannobiose, I'alpha3-Mannobiose, le tréhalose, le kojibiose, le nigerose, le maltose, l'isomaltose, le sophorose, le laminaribiose, le cellobiose, et le gentiobiose, de préférence maltose ou saccharose et
-d'au moins un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthomethoxyphénol (précurseur biosourcé #2), et b) au moins un cation métallique choisi parmi Al3+, Ag+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Cu+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Mg2+, Mn2+, Na+, Ni2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Zn2+, de préférence un ou des cations de métaux de transition Fe3+, Co2+, Zn2+, Cu2+, ou Ni2+.
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir :
-d'au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside, dans laquelle
-l'ose est choisi parmi
• un aldose notamment choisi parmi : le glycéraldéhyde, l'érythrose, le thréose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, l'allose, l'altrose, le glucose, le mannose, le gulose 'idose, le galactose, le talose, de préférence le xylose, ou
• un cétose notamment choisi parmi : la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose, le xylulose, le fructose, le psicose, le sorbose, le tagatose, de préférence le fructose, ou
-le polyoside est choisi parmi :
• un hétérodiholoside notamment choisi parmi: le tréhalulose, le saccharose , le turanose , le maltulose, le leucrose, l'isomaltulose, le gentiobiulose, le mélibiose, le lactulose, le lactose, le rutinose, ou • un homodiholoside notamment choisi parmi: l'inulobiose, l'alphaZ- mannobiose, I'alpha3-Mannobiose, le tréhalose, le kojibiose, le nigerose, le maltose, l'isomaltose, le sophorose, le laminaribiose, le cellobiose, le gentiobiose, de préférence maltose ou saccharose,
• -d'au moins un composé présentant une fonction orthodiphénol ou ou orthométhoxyphénol choisi parmi : le catéchol, le pyrogallol, l'acide caféique, la mangiférine, la quercétine, la cyanidine, la catéchine, l'épicatéchine, l'épigallocatéchine, l'anthocyanidol, le procyanidol B-3, le procyanidol B-4, les fuhalols (bifuhahol, trifuhahol), le carmalol (diphloréthohydroxycamalol) et l'acide tannique ou un extrait naturel végétal contenant au moins un des composés ci-dessus et b) au moins un cation métallique choisi parmi Al3+, Ag+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Cu+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Mg2+, Mn2+, Na+, Ni2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Zn2+, de préférence un ou des cations de métaux de transition Fe3+, Co2+, Zn2+, Cu2+, ou Ni2+.
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir :
-de xylose, ou de dihydroxyacétone,
- de catéchine, et b) au moins un cation métallique choisi parmi Fe3+, Co2+, Zn2+, Cu2+, ou Ni2+.
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir :
-de xylose,
- de catéchine, et b) au moins un cation métallique qui est Fe3+
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir :
-de xylose,
- de catéchine, et b) au moins un cation métallique qui est Co2+
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir :
-de dihydroxyacétone,
- de catéchine, et b) au moins un cation métallique qui est Fe3+
Selon la présente l'invention, toutes les compositions décrites ci-dessus peuvent être utilisées pour immobiliser des protéines, en particulier au moins une enzyme
Immobilisation d'une protéine
Un second but de l'invention est de proposer une composition comprenant une protéine ou une enzyme immobilisée sur ledit matériau hybride carboné poreux solide ou composition. Le matériau hybride carboné poreux solide de la présente invention comprend le matériau carboné poreux solide décrit ci-dessus en tant que support, au moins un ion métallique complexé audit matériau et au moins une protéine (en particulier une enzyme) immobilisée (sur le matériau carboné poreux chargé en au moins un cation métallique), dans laquelle la au moins une protéine immobilisée contient de préférence une étiquette d'affinité et est immobilisée par des liaisons dites faibles (liaisons de van der Waals, liaisons hydrogène) et/ou des liaisons de coordination et/ou des liaisons ioniques.
La protéine utilisée ici n'est pas particulièrement limitée.
La composition de la présente invention comprend ainsi au moins une enzyme choisie dans la liste approuvée de la nomenclature et de la classification des enzymes de l'Union internationale de biochimie (IUBMB) et des exemples de celle-ci comprennent les protéines suivantes :
EC 1 Oxydo-réductases, EC 2 Transférases, EC 3 Hydrolases, EC 4 Lyases, EC 5 Isomérases, EC 6 Ligases et EC 7 Translocases.
Parmi ces protéines, au moins une protéine choisie dans le groupe notamment constitué par, l'a-arabinosidase, l'a-galactosidase, l'a-rhamnosidase, la p-galactosidase, la |3- glucanase, la -glucosidase, la -glucanase, la p-mannanase, I' y-lactamase, l'acétolactate décarboxylase, l'activase, l'adénosine désaminase, l'aminoacylase, l'aminopeptidase, l'amylase, l'amyloglucosidase, l'asparginase, l'aspartase, la bromélaïne, anhydrase carbonique, la catalase, la cellulase, la chitinase, la chymosine, la collagénase, la cyclodextrinase, la désoxyribonucléase I, la dextranase, la enoate-reductase, l'épimérase, l'estérase, la formiate déshydrogénase, la galactinol synthase, la glucanotransférase, la glucoamylase, la glucose isomérase, la glucose oxydase, la glutenase, l'hémicellulase, l'hexose oxydase, l'inulinase, l'invertase, la laccase, la lactase, la lactate déshydrogénase, la leucine déshydrogénase, la levanase, la lipase, la lipoxygénase, le lysozyme, la méthane monooxygénase, la monoamine oxydase, la muramidase, la naphtalène dioxygénase, la naphtalène monooxygénase, la naringinase, la nattokinase, la nitrile hydratase, la papaïne, la pectinase, la pectinestérase, la pénicilline G, l'acylase, la pentosanase, la phénoloxydase, la phénylalanine déshydrogénase, la phytase, la polyéthylestérase, la polygalacturonase, la protéase, la protopectinase, la pullulanase, la pyrophosphatase, la pyruvate transaminase, la raffinose synthase, la raffinose synthase, la présure, la sacrosidase, la serratiopeptidase, la sphingosine kinase, la stachyose synthase, la tannase, la taxolase, la thermolysine, la transaminase, la transglutimases, la trypsine, l'uréase, la xylanase, la xylose isomérase.
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend une protéine choisie dans le groupe notamment constitué par une enoate reductase (EC 1.3.1.31), une transaminase (EC 2.6.1), une pyrophosphatase (EC3.6.1.1).
Charges protéiques
En ce qui concerne le matériau hybride carboné poreux de la présente invention, la quantité de protéine adsorbée sur le matériau carboné poreux n'est pas particulièrement limitée tant qu'elle présente une activité enzymatique. Cependant, la quantité de protéine adsorbée sur le matériau carboné poreux est de préférence de 10 à 80 parties en poids par rapport à 100 parties en poids du matériau carboné poreux, de préférence de 10 à 50 parties en poids par rapport à 100 parties en poids du matériau carboné poreux.
De plus, le procédé pour fournir le matériau hybride carboné poreux de la présente invention en provoquant l'adsorption d'une protéine sur matériau carboné poreux n'est pas particulièrement limité. Il est possible d'utiliser, par exemple, la méthode d'imprégnation. Le procédé d'imprégnation décrit ci-dessous est plus préférable. C'est-à-dire que la protéine est d'abord dissoute dans de l'eau ou un tampon à une concentration à laquelle la protéine n'est pas précipitée (de préférence à une concentration de 0,1 à 1000 mg/ml). Un matériau carboné poreux est ensuite mis en suspension dans la solution résultante à une température à laquelle la solution ne gèle pas et à laquelle la protéine ne se dénature pas (de préférence 0 à 50°C.) Ainsi, la protéine est mise en contact avec le matériau carboné poreux pendant au moins 5 minutes ou plus, de préférence pendant 30 minutes ou plus et ainsi la protéine est immobilisée dans les pores du gel de carbone. De cette manière, le matériau hybride carboné de la présente invention peut être fourni.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprenant au moins une protéine immobilisée est préparée par le procédé comprenant les étapes consistant à :
- Mettre en suspension le matériau carboné poreux séché dans une solution contenant des cations métalliques, pour obtenir un matériau hybride carboné poreux chargé en cations métalliques
- Laver le matériau hybride carboné poreux chargé en cations métalliques
- Immobiliser une protéine (enzyme) sur le matériau hybride carboné poreux chargé en cations métalliques en faisant réagir le matériau carboné poreux chargé en cations métalliques avec ladite protéine portant de préférence un marqueur d'affinité, de préférence une étiquette poly-histidine ;
-laver la suspension et récupérer la protéine immobilisée sur le matériau hybride carboné poreux chargé en cations métalliques.
Plus spécifiquement, le matériau hybride carboné poreux chargé en cations métalliques est ajouté à une solution aqueuse contenant une protéine portant de préférence une étiquette poly-histidine en son extrémité N-terminale ou C-terminale. Tl
Tel qu'utilisé ici, le terme « protéine marquée par affinité » fait référence à une protéine recombinante dans laquelle un marqueur d'affinité, tel que défini ci-dessus, a été ajouté à la protéine cible.
Les protéines marquées par affinité peuvent être préparées par une technologie d'ADN recombinant en utilisant des procédés connus dans la technique, tels que Par ligation de fragments d'ADN ou par des techniques de PCR. Les protéines marquées par affinité peuvent également être appelées "protéines marquées par fusion" ou "protéines de fusion".
Le terme « étiquette polyhistidine » fait référence à une chaîne d'au moins deux résidus histidine, qui est attachée à l'extrémité C ou N d'une protéine.
Le marqueur polyhistidine est de préférence une chaîne d'au moins six résidus histidine.
Le terme « enzyme marquée par une polyhistidine » fait référence à une enzyme recombinante dans laquelle l'enzyme cible est fusionnée avec une étiquette polyhistidine telle que définie ci-dessus.
Le terme « marqueur d'affinité » fait référence à un groupe défini, tel qu'une molécule organique ou organométallique, un fragment de protéine ou autre, qui est attaché à une protéine recombinante et qui est capable de se lier à un groupe spécifique immobilisé sur une matrice.
Le matériau hybride carboné poreux chargé en cations métalliques sur lequel est immobilisé au moins une protéine par des liaisons dites faibles (liaisons de van der Waals, liaisons hydrogène) et/ou des liaisons de coordination et/ou des liaisons ioniques, est lavé plusieurs fois avec une solution aqueuse tamponnée.
Le marqueur d'affinité utilisé dans l'invention peut être tout marqueur capable de se lier spécifiquement au matériau carboné poreux pour lequel il a une affinité.
La liaison par affinité peut être le résultat, par exemple, de l'interaction de van der Waals, de la liaison hydrogène, de la liaison ionique ou de l'interaction hydrophobe.
Dans tous les cas, la liaison d'affinité doit être suffisamment forte pour permettre au marqueur d'affinité et au matériau carboné poreux de rester étroitement liés l'un à l'autre au moins jusqu'à ce que certaines conditions spécifiques soient appliquées afin de dissocier le marqueur d'affinité du matériau carboné poreux. La protéine à immobiliser sur le matériau peut être n'importe quelle protéine contenant un marqueur d'affinité, telle qu'une protéine (recombinante) ou une enzyme contenant un marqueur d'affinité.
De préférence, la protéine est une enzyme contenant un marqueur d'affinité.
Un certain nombre d'étiquettes d'affinité et de matrices correspondantes sont connues dans la technique.
Dans un mode de réalisation préféré, le marqueur d'affinité sur la protéine est un marqueur polyhistidine et le matériau solide contient un ion métallique chélaté.
La solution aqueuse tamponnée est de préférence un tampon Tris-HCI, ou Phosphate.
Au sens de la présente invention, un marqueur d'affinité est un marqueur qui possède une affinité spécifique pour les cations métalliques.
Selon un deuxième aspect de l'invention, la présente demande concerne une composition comprenant : a) un matériau carboné poreux formé à partir :
-d'au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside (précurseur biosourcé #1), et
-d'au moins un composé présentant une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol (précurseur biosourcé #2), b) au moins un cation métallique, et c) au moins une protéine de préférence comprenant une étiquette poly-histidine
Selon un mode préféré de l'invention, la composition comprend a) un matériau carboné poreux formé à partir :
-d'au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside (précurseur biosourcé #1), et
-d'au moins un composé présentant une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol (précurseur biosourcé #2), b) au moins un cation métallique, et c) au moins une protéine immobilisée, de préférence ladite au moins une protéine immobilisée comprenant une étiquette poly-histidine. Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux formé à partir :
-d'au moins un glucide de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside, dans laquelle l'ose est choisi parmi :
• un aldose notamment choisi parmi : le glycéraldéhyde, l'érythrose, le thréose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, l'allose, l'altrose, le glucose, le mannose, le gulose 'idose, le galactose, et le talose, de préférence le xylose, ou
• un cétose notamment choisie parmi: la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose, le xylulose, le fructose, le psicose, le sorbose, et le tagatose, de préférence le fructose, ou dans laquelle le polyoside est choisi parmi :
• un hétérodiholoside notamment choisi parmi : le tréhalulose, le saccharose , le turanose , le maltulose, le leucrose, l'isomaltulose, le gentiobiulose, le mélibiose, le lactulose, le lactose, et le rutinose, ou
• un homodiholoside notamment choisi parmi : l'inulobiose, l'alphaZ- mannobiose, I'alpha3-Mannobiose, le tréhalose, le kojibiose, le nigerose, le maltose, l'isomaltose, le sophorose, le laminaribiose, le cellobiose, et le gentiobiose, de préférence maltose ou saccharose, et
-d'au moins un composé présentant une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol choisi parmi : le catéchol, le pyrogallol, l'acide caféique, la mangiférine, la quercétine, la cyanidine, la catéchine, l'épicatéchine, l'épigallocatéchine, l'anthocyanidol, le procyanidol B-3, le procyanidol B-4, les fuhalols (bifuhahol, trifuhahol), le carmalol (diphloréthohydroxycamalol) et l'acide tannique,
• ou
• un extrait naturel végétal contenant au moins un des composés ci- dessus, b) au moins un cation métallique choisi parmi Al3+, Ag+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Cu+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Mg2+, Mn2+, Na+, Ni2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Zn2+, de préférence un ou des cations de métaux de transition Fe3+, Co2+, Zn2+, Cu2+, ou Ni2+, et c) au moins une protéine immobilisée, de préférence ladite au moins une protéine immobilisée comprenant une étiquette poly-histidine.
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux formé à partir :
-de xylose, ou de dihydroxyacétone,
- de catéchine, et b) au moins un cation métallique choisi parmi Fe3+, Co2+, Zn2+, Cu2+, ou Ni2+ et c) au moins une protéine immobilisée, de préférence ladite au moins une protéine immobilisée comprenant une étiquette poly-histidine.
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux formé à partir :
-de xylose,
- de catéchine, et b) au moins un cation métallique qui est Fe3+, et c) au moins une protéine immobilisée, de préférence ladite au moins une protéine immobilisée comprenant une étiquette poly-histidine.
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux formé à partir :
-de xylose,
- de catéchine, et b) au moins un cation métallique qui est Co2+, et c) au moins une protéine immobilisée, de préférence ladite au moins une protéine immobilisée comprenant une étiquette poly-histidine.
Selon un autre mode préféré de l'invention, la composition comprend : a) un matériau carboné poreux formé à partir :
-de dihydroxyacétone,
- de catéchine, et b) au moins un cation métallique qui est Fe3+, et c) au moins une protéine immobilisée, de préférence ladite au moins une protéine immobilisée comprenant une étiquette poly-histidine.
Par exemple, si le matériau solide selon l'invention est utilisé pour la purification et l'isolement d'une protéine marquée par affinité, la liaison de l'enzyme au support doit être réversible. Dans de tels cas, il est préféré que l'ion métallique chélaté soit Fe3+, Ni2+ ou Co2+. Ces ions métalliques se lient suffisamment fort pour immobiliser une enzyme marquée par une polyhistidine, mais sont également capables de libérer l'enzyme immobilisée lorsque des conditions spécifiques sont appliquées, telles qu'un traitement avec une solution tamponnée contenant de l'imidazole ou de l'éthylènediaminetétraacétate (EDTA).
Pour l'utilisation d'enzymes immobilisées dans une biocatalyse hétérogène, une forte liaison de l'enzyme au support est souhaitable.
Dans de tels cas, il est préféré que l'ion métallique chélaté soit Co2+ ou Fe3+, et de manière préférée entre toutes Fe3+, étant donné que ceci entraîne une liaison particulièrement forte du marqueur polyhistidine audit matériau. Comme cela est démontré dans les exemples, la lixiviation de l'enzyme ou de l'ion métallique à partir d'un matériau comprenant une protéine immobilisée en présence de Fe3+ en tant qu'ion métallique chélaté est presque négligeable. L'absence de lixiviation permet d'utiliser le matériau protéique immobilisé (le biocatalyseur) en quantités catalytiques. L'utilisation de quantités catalytiques est particulièrement importante dans les réactions à écoulement continu.
Un autre avantage de Fe3+ en tant qu'ion métallique chélaté est que ce métal est non toxique.
L'affinité élevée du marqueur polyhistidine pour les ions métalliques tels que Co2+ ou Fe3+ permet à l'immobilisation des protéines marquées par une étiquette polyhistidine d'être réalisée à partir de solutions brutes contenant les protéines sans avoir besoin d'une purification extensive de la solution avant l'étape d'immobilisation. La matière organique qui ne contient pas de marqueur polyhistidine ne se lie aux ions métalliques chélatés que faiblement, ou pas du tout, et est facilement éliminée du matériau comprenant au moins une protéine marquée par une étiquette polyhistidine, par lavage avec, par exemple, de l'eau ou des solutions aqueuses tamponnées. Ainsi, si la protéine marquée à la polyhistidine est préparée par surexpression intracellulaire, l'immobilisation des protéines peut être réalisée directement à partir du lysat cellulaire. En variante, si la protéine marquée à la polyhistidine est sécrétée par l'organisme hôte, l'immobilisation des protéines peut être réalisée directement à partir du surnageant de culture cellulaire.
La dissociation de la protéine liée peut être réalisée en utilisant des procédés IMAC standard.
La protéine liée peut par exemple être libérée du support en abaissant le pH ou en ajoutant une molécule compétitive ayant une affinité égale ou supérieure pour les ions métalliques chélatés par rapport au groupe polyhistidine, par exemple en appliquant une solution tamponnée contenant de l'imidazole ou de l'éthylènediaminetétraacétate (EDTA).
Après dissociation des protéines purifiées du support, le marqueur polyhistidine peut être éliminé des protéines, si nécessaire, par des techniques connues dans la technique, par exemple en clivant le marqueur d'affinité avec une enzyme appropriée telle qu'une protéase spécifique, obtenant ainsi la protéine pure et sans marqueur.
Si les protéines immobilisées sur le support, telles que décrites ci-dessus, sont des enzymes, elles contiennent un site actif capable de catalyser une réaction chimique.
Ainsi, la matière d'enzyme immobilisée est potentiellement utile comme biocatalyseur dans la synthèse organique.
Par conséquent, dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un matériau d'enzyme immobilisé tel que décrit ici en tant que biocatalyseur hétérogène, par exemple dans des transformations organiques synthétiques.
Un mode préféré de l'invention, concerne l'utilisation des compositions décrites ci- dessus en tant que biocatalyseurs hétérogènes.
La présente invention concerne en outre un procédé de catalyse d'une réaction catalysée par une enzyme, comprenant la fourniture d'une composition comprenant une protéine ou une enzyme immobilisée sur ledit matériau carboné poreux selon l'invention, et la mise en contact de ladite composition comprenant une enzyme immobilisée avec au moins un substrat sur lequel l'enzyme, qui est immobilisée sur ledit matériau, est capable d'agir.
L'immobilisation d'enzymes sur le ledit matériau par liaison d'étiquette d'affinité, comme décrit ici, améliore la stabilité des enzymes utilisées. On a trouvé que les enzymes immobilisées tolèrent à la fois des conditions aqueuses ainsi qu'une gamme de solvants organiques.
Ceci permet d'utiliser les compositions comprenant une protéine ou une enzyme immobilisée sur ledit matériau carboné poreux dans des conditions réactionnelles dans lesquelles les enzymes libres, non immobilisées n'auraient pas été stables.
Il est possible que la composition comprenant une protéine ou une enzyme immobilisée sur ledit matériau carboné poreux puisse également être utilisée dans une plage de pH plus large que les enzymes libres, non immobilisées n'auraient tolérée.
Etant donné que l'activité native de l'enzyme est conservée, la composition comprenant une protéine ou une enzyme immobilisée sur ledit matériau carboné poreux présente une activité enzymatique par masse protéique plus élevée que la matière protéique initiale non immobilisée. Par exemple le turnover number (TON) défini comme le nombre de mole de produit formé par mole de protéine sur un temps donné est supérieur pour une enzyme immobilisée selon l'invention par rapport à une enzyme libre.
L'enzyme qui est immobilisée sur ledit matériau peut être n'importe quelle enzyme qui est utile comme biocatalyseur dans des transformations synthétiques organiques, y compris, mais sans s'y limiter, des enzymes agissant comme des oxydoréductases, des transférases, des hydrolases, des lyases, des isomérases et des ligases.
Ainsi, les compositions comprenant une enzyme immobilisée sur ledit matériau peuvent être utilisés comme biocatalyseurs hétérogènes dans toute réaction organique dans laquelle l'enzyme immobilisée est capable de catalyser spécifiquement la réaction.
Des exemples de telles réactions biocatalytiques comprennent, mais sans s'y limiter, des réactions d'oxydation et de réduction enzymatiques, des réactions d'hydrolyse enzymatique et des réactions d'isomérisation enzymatique.
Des réactions biocatalytiques particulièrement utiles sont des réactions énantiosélectives.
Des exemples spécifiques de réactions biocatalytiques comprennent la synthèse d'amines chirales à partir de cétones prochirales, la synthèse d'esters à partir d'acides carboxyliques et d'alcools ou à partir d'esters et d'alcools, la synthèse de molécules hydroxylées ou encore la synthèse des terpènes ou des terpénoïdes. Dans un mode de réalisation, deux enzymes différentes ou plus peuvent être immobilisées sur le matériau selon l'invention, dans lequel chacune des enzymes différentes est capable de catalyser une réaction différente.
Il peut alors être possible d'utiliser le matériau contenant deux enzymes immobilisées différentes ou plus en tant que biocatalyseur hétérogène dans une réaction en plusieurs étapes ou en cascade.
Selon un autre aspect de l'invention, la présente demande concerne un procédé pour catalyser une réaction catalysée par une enzyme, comprenant la fourniture d'une composition décrite ci-dessus, et mise en contact de ladite composition avec au moins un substrat sur lequel une enzyme, qui est immobilisée sur ledit support de la composition, est susceptible d'agir.
Rendement et vitesse d'immobilisation
Les rendements d'immobilisation, exprimés en mg d'enzyme immobilisée par mg d'enzyme initialement présente dans la solution sont compris de 90 à 100% pour des charges protéiques comprises de 5 à 50% massique.
Les vitesses d'immobilisation exprimée en minutes pour atteindre au moins un taux d'immobilisation d'au moins 75% sont comprises de 10 à 120 minutes.
Selon un mode préféré de l'invention, le procédé d'immobilisation d'une protéine, en particulier d'une enzyme sur le matériau carboné poreux est caractérisé en ce que le rendement de l'immobilisation est compris de 90% à 100% pour des charges protéiques comprises de 5 à 50% massique.
Selon un mode préféré de l'invention, le procédé d'immobilisation d'une protéine, en particulier d'une enzyme sur le matériau carboné poreux est caractérisé en ce que la vitesse d'immobilisation pour atteindre un rendement de l'immobilisation d'au moins 75% est comprise de 10 à 120 minutes.
Selon un dernier aspect de l'invention, la présente demande concerne l'utilisation de la composition comme biocatalyseur hétérogène. Performances enzymatiques
Les performances enzymatiques mesurées sont exprimées en nombre de réactions catalysées par enzyme (Turnover number, TON) sur un temps donné. Le TON représente le nombre de moles de substrat converties (ou de produit formé) par le nombre de moles d'enzyme immobilisées dans un volume donné.
Selon un mode préféré de l'invention, l'activité spécifique (qui est la quantité de substrat transformée par unité de temps et par masse d'enzyme) d'une enzyme immobilisée sur le matériau carboné poreux est supérieure à celle de la même enzyme libre, c'est-à-dire non immobilisée sur ledit matériau carboné poreux.
Dans l'exemple 3, les mesures des performances enzymatiques de plusieurs enzymes immobilisées montre un TON significativement supérieur à celui de l'enzyme non immobilisée.
Ces résultats sont meilleurs que ceux décrits à ce jour dans la littérature où l'on observe que dans la plupart des cas l'activité de l'enzyme est fortement réduite après immobilisation.
Liste des figures
La figure 1 est une micrographie électronique à balayage d'une texture poreuse uniforme continuellement interconnectée pour un aérogel tannin-xylose préparé dans 10 mL d'une solution à 15% massique d'éthanol absolu dans de l'eau déminéralisée, traité à 180°C pendant 20 heures en conditions hydrothermales (autoclave), lavé puis séché par lyophilisation.
La figure 2 est une micrographie électronique à transmission qui met en évidence un réseau macro-mésoporeux pour un aérogel tannin-xylose préparé dans 10 mL d'une solution à 15% massique d'éthanol absolu dans de l'eau déminéralisée, traité à 180°C pendant 20 heures en conditions hydrothermales (autoclave), lavé puis séché par lyophilisation.
Les figures 1 et 2 montrent des particules primaires de quelques nanomètres, particules primaires agrégées formant un réseau interconnecté qui induit des interstices interparticulaires de quelques nanomètres à plusieurs micromètres. La figure 3 représente les propriétés texturales déterminées par volumétrie par sorption d'azote à 77K d'aérogel préparés à partir d'un mélange d'un ose et d'extrait naturel de cachou.
La figure 4 représente les propriétés texturales déterminées par volumétrie par sorption d'azote à 77K d'aérogel préparés à partir d'un mélange d'un ose et de catéchine.
La figure 5A représente un spectre RMN 13C CP-MAS, d'un aérogel formé par carbonisation hydrothermale d'un mélange xylose-catéchine (haut, foncé) et xylose- phloroglucinol (bas, clair) et la figure 5B un spectre FTIR d'un aérogel formé par carbonisation hydrothermale d'un mélange xylose-catéchine (haut, foncé) et xylose-phloroglucinol (bas, clair).
Partie expérimentale
Exemple 1 : préparation d'un matériau carboné poreux sous la forme d'un aérogel (à base de xylose /catéchine/ Fe3+ (FeXCat))
0,85 g de xylose est dissout dans 10 mL d'un mélange d'eau désionisée et d'éthanol absolu 50/50 m/m.
0,35 g de catéchine est ajoutée à la solution précédente.
Le mélange est agité jusqu'à obtenir une solution homogène. Un traitement aux ultrasons à température ambiante pendant une heure ou moins peut permettre d'accélérer l'homogénéisation de la solution,
La solution résultante est traitée par carbonisation hydrothermale c'est-à-dire introduite dans une bombe de minéralisation (autoclave), puis celle-ci est fermée hermétiquement et placée dans une enceinte thermostatée à 180°C pendant 20h, A l'issue de ce délai, l'autoclave et son contenu sont refroidis à température ambiante pendant quelques heures (généralement 2h),
L'autoclave est ensuite ouvert et son contenu versé soit dans de l'eau ultrapure (généralement 100 mL), soit dans de l'eau désionisée, soit dans un mélange eau/solvant protique polaire (méthanol, éthanol, propanol, butanol ou leurs isomères), soit dans un solvant protique polaire pur,
Le solide obtenu est lavé par trempage successifs (généralement 3 fois 100 mL) avec soit dans de l'eau ultrapure, soit dans de l'eau désionisée, soit dans un mélange eau/solvant protique polaire (méthanol, éthanol, propanol, butanol ou leurs isomères), soit dans un solvant protique polaire pur pendant plusieurs heures (généralement 8 heures). On obtient ainsi un hydrogel. L'hydrogel est ensuite séché par lyophilisation ou dans un fluide supercritique pour obtenir un aérogel.
Les aérogels obtenus dans les conditions décrites ci-dessus (200 mg) sont ajoutés à 10 mL d'une solution aqueuse contenant 400 mmol/L de FeCH
La suspension ainsi obtenue est agitée pendant 4 heures à 20rpm à température ambiante.
Après agitation, la suspension est centrifugée (5min à 5000rpm). Après centrifugation, le surnageant est éliminé.
Le solide ainsi obtenu est lavé à l'eau 3 fois:
1) De l'eau est ajoutée (lOmL),
2) La suspension ainsi obtenue est agitée quelques minutes (généralement 5 minutes) à température ambiante,
3) La suspension est centrifugée (5min à 5000rpm),
4) Après centrifugation, le surnageant est éliminé.
Les étapes 1 à 4 sont recommencées 2 fois.
Exemple 2 : Immobilisation d'une protéine
10 mg aérogel complexé aux ions Fe3+ obtenus dans les conditions décrites ci-dessus est ajouté à une solution aqueuse contenant (lmg) de protéine porteuse d'une étiquette polyhistidine en son extrémité N-terminale.
Les trois enzymes suivantes ont été préparées : la pyrophosphatase de Trypanosoma brucei (TbVSPl, EC3 Hydrolase), la transaminase B9L0N2 (w-TA, EC2 transférase) et la old Yellow Enzyme de Galdieria sulphuraria (GsOYE, EC1 Oxydoréductase).
La suspension ainsi obtenue est agitée à 750rpm pendant quelques heures
(généralement 2 heures) à 4°C. Après agitation, la suspension est centrifugée (entre 4000 et 6000rpm pendant 2 à 5 min). Après centrifugation, la surnageant est éliminé. Le solide ainsi obtenu est lavé avec une solution aqueuse tamponnée 2 fois :
1) Du tampon est ajouté (lmL),
2) La suspension ainsi obtenue est agitée pendant quelques minutes (généralement 5 minutes) à température ambiante,
3) La suspension est centrifugée (entre 4000 et 6000rpm pendant 2 à 5 min),
4) Après centrifugation, le surnageant est éliminé.
Les étapes 1 à 4 sont recommencées 1 fois.
On obtient ainsi une protéine porteuse d'une séquence polyhistidine immobilisée sur le matériau carboné poreux complexé avec des ions Fe3+.
Charges protéiques variables
Les aérogels obtenus dans les conditions décrites précédemment (10 mg) sont ajoutés à une solution tampon (Tris HCl 50 mM NaCI 150 mM pH=7,5, 1 mL) contenant 1 / 2,5 / 5 mg d'enzyme GsOYE selon la charge protéique souhaitée (10 / 25 / 50 % massique) ou 1 / 2,5 mg d'enzyme B9L0N2 pour une charge protéique de 10 et 25% massique.
La suspension ainsi obtenue est agitée à 800 rpm pendant 2 heures à 4°C.
Pour le suivi cinétique de l'immobilisation des prélèvements sont réalisés à 10, 20, 30, 60, 90 et 120 min. Pour de faire, la suspension est centrifugée entre 4000 et 6000 rpm pendant 2 à 5 min puis un prélèvement de 20 pL est réalisé. L'agitation du mélange réactionnel est reprise immédiatement après la réalisation du prélèvement.
Après le dernier prélèvement, l'ensemble du surnageant est éliminé.
Le solide ainsi obtenu est lavé 2 fois avec une solution tampon :
1) 1 mL de tampon est ajouté.
2) La suspension ainsi obtenue est agitée pendant quelques minutes (généralement 5 minutes) à température ambiante.
3) La suspension est centrifugée (entre 4000 et 6000 rpm pendant 2 à 5 min).
4) Après centrifugation, le surnageant est éliminé. Les étapes 1 à 4 sont recommencées une fois.
La quantité de protéines présentes dans les prélèvements est mesurée par dosage Bradford. On obtient ainsi la protéine GsOYE immobilisée sur un hydrogel (aérogel) avec une charge protéique variant de 10 à 50 % en masse et la protéine B9L0N2 immobilisée sur un hydrogel (aérogel) avec une charge protéique variant de 10% à 25% en masse.
Immobilisation en flux continu :
• B9L0N2
Les aérogels FeXCat obtenus dans les conditions décrites précédemment (50 mg) sont introduits dans une colonne non thermostatée dont l'extrémité est constituée dans un fritté permettant de retenir l'aérogel.
Une solution tampon (Phosphate 50 mM NaCI 300 mM pH=7,5, 5 mL) contenant 5 mg d'enzyme B9L0N2 percole à un débit 0,1 mL/min dans la colonne par le biais d'une pompe. La solution est récupérée à la sortie de la colonne. L'aérogel contenu dans la colonne est ensuite lavée par percolation de solution tampon à un débit de 0,1 mL/min pendant 50 min. La solution est aussi récupérée à la sortie de la colonne.
La quantité de protéines présentes dans ces deux solutions sont mesurée par dosage Bradford.
On obtient ainsi la protéine B9L0N2 immobilisée sur un hydrogel FeXCat (avec une charge protéique de 10 % en masse) dans une colonne pour être utilisée en flux continu et en recirculation.
• GsOYE
Les aérogels FeXCat obtenus dans les conditions décrites précédemment (50 mg) sont introduits dans une colonne non thermostatée dont l'extrémité est constituée dans un fritté permettant de retenir l'aérogel.
Une solution tampon (Tris HCl 50 mM NaCI 150 mM pH=7,5, 5 mL) contenant 5 mg d'enzyme GsOYE4 percole à un débit 0,1 mL/min dans la colonne par le biais d'une pompe. La solution est récupérée à la sortie de la colonne. L'aérogel contenu dans la colonne est ensuite lavée par percolation de solution tampon à un débit de 0,1 mL/min pendant 50 min. La solution est aussi récupérée à la sortie de la colonne.
La quantité de protéines présentes dans ces deux solutions sont mesurée par dosage Bradford.
On obtient ainsi la protéine GsOYE immobilisée sur un hydrogel FeXCat (avec une charge protéique de 10 % en masse) dans une colonne pour être utilisée en recirculation.
Exemple 3 Cinétiques d'immobilisation 10 mg matériau carboné poreux complexé avec des ions Fe3+ sont mis en présence avec 1 mg d'enzyme portant une étiquette polyhistidine dans un volume total de lmL.
L'immobilisation de la transaminase B9L0N2 se fait en présence du cofacteur pyridoxal phosphate (PLP).
L'immobilisation de la pyrophosphatase TbVSPl se fait en présence du cofacteur Mg2+.
Les échantillons 0, 10, 20 et 30 min (10 pL) sont dilués au demi et les échantillons lh et 2h (20 pL) ne sont pas dilués. 20 pL d'échantillon (Echl à 4) mélangé à 1 mL de réactif de Bradford, à l'obscurité pendant 15 min.
Résultats Tableau 2 : Cinétique d'immobilisation de TbVSPl (lmg) sur un aérogel
Xylose/Catéchine complexé avec des ions Fe3+ (lOmg) préparé dans les conditions décrites ci- dessus. Tableau 3 : Cinétique d'immobilisation de B9L0N2 (lmg) sur un aérogel Xylose/Catéchine complexé avec des ions Fe3+ (lOmg) préparé dans les conditions décrites ci- dessus.
Tableau 4 : Cinétique d'immobilisation de GsOYE (lmg) sur un aérogel Xylose/Catéchine complexé avec des ions Fe3+ (lOmg) préparé dans les conditions décrites ci- dessus.
Les résultats des tableaux 2-4 montrent que les vitesses d'immobilisation pour atteindre un taux d'immobilisation d'au moins 75% sont comprises entre 10 et 120 minutes. Ces résultats montrent que l'immobilisation d'une enzyme sur le matériau carboné poreux complexé avec des ions Fe3+ est simple, rapide et efficace.
Exemple 4 : Performances
Les taux de conversion sont exprimés en moles de produit formé par moles de substrat initialement présent, mesurés et calculés après un temps de réaction donné.
Pour TbVSPl, la réaction étudiée est l'hydrolyse du pyrophosphate en phosphate en présence du cofacteur Mg2+. La charge protéique utilisée est de 10% en masse. Le mélange réactionnel est constitué de pyrophosphate de sodium (5mM), de MgCI (ImM) en solution dans du tampon Tris-HCI 50mM NaCI 200 mM pH 8,5. Le solide constitué de lmg de TbVSPl porteuse d'une séquence polyhistidine immobilisée sur un hydrogel complexé avec des ions Fe3+ (lOmg) est ajouté au mélange réactionnel. La formation du phosphate est suivie par dosage du phosphmolybdate/vert de malachite en spectroscopie visible à 630nm. Les résultats sont résumés dans le Tableau 5.
Pour w-TA, la réaction étudiée est la transamination du pyruvate en présence de a- methylbenzylamine racémique en alanine et acétophénone en présence du cofacteur pyridoxal phosphate (PLP). La charge protéique utilisée est de 10% en masse. Le mélange réactionnel est constitué de pyruvate (25mM), d'a-methylbenzylamine racémique (25mM) de PLP (0,lmM) et de DMSO (1% wt) en solution dans du tampon Phosphate 50mM NaCI 300mM pH 7,5. Le solide constitué de lmg de w-TA porteuse d'une séquence polyhistidine immobilisée sur un hydrogel complexé avec des ions Fe3+ (lOmg) est ajouté au mélange réactionnel. La formation de l'acétophénone est suivie en continu en spectroscopie UV à 245nm. Les résultats sont résumés dans le Tableau 5.
Pour GsOYE, la réaction étudiée est la réduction de la cyclohexenone et en cyclohexanone en présence du cofacteur NADH qui s'oxyde en NAD+. La charge protéique utilisée de 10% en masse. Le mélange réactionnel est constitué de cyclohexenone (50mM), de NADH (75mM) et de DMSO (l%wt) en solution dans du tampon Tris-HCI 50mM NaCI 150mM pH 7,5. Le solide constitué de lmg de GsOYE porteuse d'une séquence polyhistidine immobilisée sur un hydrogel complexé avec des ions Fe3+ (lOmg) est ajouté au mélange réactionnel. La disparition du NADH est suivie en spectroscopie UV à 340nm. Les résultats sont résumés dans le Tableau 5.
Tableau 5 : Performances catalytique (Turnover numbers, TON et Taux de conversion) des 3 enzymes libres ou immobilisées en présence d'ions Fe3+ (la pyrophosphatase de Trypanosoma brucei (TbVSPl, EC3 Hydrolase), la transaminase B9L0N2 (w-TA, EC2 Transférase) et la Old Yellow Enzyme de G. sulphuraria (GsOYE, EC1 Oxydoréductase).
Dans les 3 cas, le TON de l'enzyme immobilisée est significativement supérieur à celui de l'enzyme non immobilisée. Les conversions obtenues avec les enzymes immobilisées sont toujours égales ou supérieures à celles obtenues avec les enzymes libres respectives.
Un aérogel complexé aux ions Co2+ obtenus dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus en présence d'ions Fe3+ et une transaminase B9L0N2 (w-TA, EC2 transférase) porteuse d'une étiquette polyhistidine en son extrémité N-terminale a été préparé. Le ratio TON enzyme immobilisée vs TON enzyme non immobilisée (libre) est de 764/520.
Ces résultats sont meilleurs que ceux décrits à ce jour dans la littérature où l'on observe que dans la plupart des cas l'activité de l'enzyme est fortement réduite après immobilisation. La structure macroporeuse interconnectée (pores entre 50 nm et 2 microns) facilite donc bien le transfert de masse des réactifs et des produits dans tout le matériau.
Exemple 5 : Réutilisation
Les performances enzymatiques mesurées sont exprimées en nombre de réactions catalysées par enzyme (Turnover numbers, TON) sur un temps donné. Ces activités sont mesurées pour les enzymes non immobilisées (libres) et pour les enzymes immobilisées dans les conditions réactionnelles ci-dessous.
Pour TbVSPl, la réaction étudiée est l'hydrolyse du pyrophosphate en phosphate en présence du cofacteur Mg2+. La charge protéique utilisée est de 10% en masse. Le mélange réactionnel est constitué de pyrophosphate de sodium (5mM), de MgCh (ImM) en solution dans du tampon Tris-HCI 50mM NaCI 200mM pH 8,5. Le solide constitué de lmg de TbVSPl porteuse d'une séquence polyhistidine immobilisée sur un hydrogel complexé avec des ions Fe3+ (lOmg) est ajouté au mélange réactionnel. La formation du phosphate est suivie par dosage du phosphomolybdate/vert de malachite en spectroscopie visible à 630nm.
Pour w-TA, la réaction étudiée est la transamination du pyruvate en présence de a- methylbenzylamine racémique en alanine et acétophénone en présence du cofacteur pyridoxal phosphate (PLP). La charge protéique utilisée est de 10% en masse. Le mélange réactionnel est constitué de pyruvate (25mM), d'a-methyl benzylamine racémique (25mM) et de PLP (0,lmM) et de DMSO (l%wt) en solution du tampon Phosphate 50mM NaCI 300mM pH 7,5. La solide constitué de lmg de w-TA porteuse d'une séquence polyhistidine immobilisée sur un hydrogel complexé avec des ions Fe3+ (lOmg) est ajouté au mélange réactionnel. La formation de l'acétophénone est suivie en continu en spectroscopie UV à 245nm.
Pour GsOYE, la réaction étudiée est la réduction de cyclohexenone et en cyclohexanone en présence du cofacteur NADH qui s'oxyde en NAD+. La charge protéique utilisée de 10% en masse. Le mélange réactionnel est constitué de cyclohexenone (50mM), de NADH (75mM) et de DMSO (l%wt) en solution dans du tampon Tris-HCI 50mM NaCI 150mM pH 7,5. Le solide constitué de lmg de GsOYE porteuse d'une séquence polyhistidine immobilisée sur un hydrogel complexé avec des ions Fe3+ (lOmg) est ajouté au mélange réactionnel. La disparition du NADH est suivie en spectroscopie UV à 340nm. Etape 1 : Le solide est constitué d'une protéine porteuse d'une séquence polyhistidine immobilisée sur un hydrogel complexé avec des ions Fe3+ est ajouté au mélange réactionnel.
Etape 2 : après 10 minutes de réaction à 25°C pour TbVSPl et w-TA ou après lh de réaction à 30°C pour GsOYE, la suspension est centrifugée. Le surnageant et le culot sont séparés.
Etape 3 : Le solide ainsi obtenu est lavé 2 fois avec une solution aqueuse tamponnée : 1) Du tampon est ajouté (lmL). 2) La suspension ainsi obtenue est agitée pendant quelques minutes (généralement 5 minutes) à température ambiante. 3) La suspension est centrifugée. 4) Après centrifugation, le surnageant est éliminé. Les étapes 1 à 4 sont recommencées 1 fois.
Les étapes 1, 2 et 3 sont recommencées successivement 4 fois, ce qui correspond à 5 cycles d'utilisation du matériau constitué d'une protéine porteuse d'une séquence polyhistidine immobilisée sur un hydrogel complexé avec des ions Fe3+.
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 6.
Tableau 6 : Performances catalytiques (Turnover numbers, TON et Taux de conversion) des 3 enzymes immobilisées étudiées (la pyrophosphatase de Trypanosoma brucei (TbVSPl, EC3 Hydrolase), la transaminase B9L0N2 (w-TA, EC2 Transférase) et la Old Yellow Enzyme de G. sulphuraria (GsOYE, EC1 Oxydoréductase) sur 5 cycles réactionnels.
Ces résultats démontrent qu'il est possible d'utiliser les protéines porteuses d'une séquence polyhistidine immobilisée sur un hydrogel complexé avec des ions Fe3+au moins 5 fois de suite sans perte significative d'activité.
Exemple 6: Lixiviation Pour chaque cycle réactionnel, les trois surnageants issus de l'étape 2 et 3 du protocole de réutilisation sont conservés (soit le mélange réactionnel après 10 min ou lh de réaction et les solutions tampons utilisées pour les deux lavages du solide). La quantité de protéines contenue dans ces solutions est dosée par la méthode de Bradford. La masse de protéine contenue dans les solutions est ainsi obtenues et rapportée à la quantité initiale de protéine immobilisée sur le solide pour obtenir le taux de lixiviation. Le taux de lixiviation pour chaque cycle représente la quantité de protéines contenue dans le surnageant et dans les lavages successifs par rapport à la quantité totale de protéine immobilisée sur le matériau. Ce taux est exprimable en %.
Les résultats sont résumés dans le Tableau 7.
Tableau 7 : Taux de lixiviation mesurée à chaque cycle d'utilisation des 3 enzymes immobilisées étudiées des 3 enzymes étudiées (la pyrophosphatase de Trypanosoma brucei (TbSVPl, EC3 Hydrolase), la transaminase B9L0N2 (w-TA, EC2 Transférase) et la Old Yellow Enzyme de G. sulphuraria (GsOYE, EC1 Oxydoréductase) sur 5 cycles réactionnels.
Les taux de lixiviation observés sont très faibles. Ceci signifie que les protéines adhèrent fortement à la surface des matériaux étudiés. Cette observation est consistante avec la forte affinité entre l'étiquette polyhistidine et le métal immobilisé.
Les taux de lixiviation observés sont très faibles : beaucoup plus faibles que pour les autres méthodes d'immobilisation de protéines telles que l'adsorption ou l'encapsulation et du même ordre de grandeur que pour les méthodes où une liaison covalente au support est formée via l'utilisation d'un agent chimique de greffage. Or, nous n'avons pas besoin de ce dernier puisque la liaison entre la protéine immobilisée et le support est obtenue grâce à la très forte affinité entre le métal immobilisé et la protéine porteuse d'une étiquette polyhistidine. Le métal étant lui-même en interaction très forte avec le support via notamment des fonctions chimiques à sa surface (acide carboxylique, phénol, catéchol notamment).
EXPERIENCES EN FLUX (avec et sans recirculation ; sans recirculation = flux continu)
• Flux avec recirculation en utilisant l'enzyme B9L0N2 immobilisée sur Fe-XCat
La réaction étudiée pour l'enzyme B9L0N2 est la transamination du pyruvate en présence de a-méthylbenzylamine racémique en alanine et acétophénone en présence du cofacteur pyridoxal phosphate (PLP). Le mélange réactionnel est constitué de pyruvate (50 mM), d'a-méthylbenzylamine racémique (50 mM), de PLP (0,1 mM) et de DMSO (1% wt) en solution dans du tampon Phosphate 50 mM NaCI 300 mM pH=7,5.
Le mélange réactionnel (10 mL) est introduit dans la colonne préparée comme décrit précédemment dans la partie « immobilisation ». Le flux est en recirculation, la solution récupérée en sortie de colonne est directement réinjectée dans la colonne à une débit de 0,1 mL/min. Un prélèvement (100 pL) est réalisé toutes les 10 min pendant lh. La formation de l'acétophénone est suivie par spectrophotométrie UV à 245 nm.
L'activité enzymatique mesurée au temps t pour la B9L0N2 immobilisée est exprimée en mole d'acétophénone formée par mole d'enzyme. Pour ce faire la quantité d'acétophénone est dosée dans chaque prélèvement.
Les taux de conversion sont exprimés en moles de produit formé (acétophénone) par moles de substrat (a-methylbenzylamine) initialement présent. 100 • Flux continu en utilisant l'enzyme B9L0N2 immobilisée sur Fe-XCat
La réaction étudiée pour l'enzyme B9L0N2 est la transamination du pyruvate en présence de a-méthylbenzylamine racémique en alanine et acétophénone en présence du cofacteur pyridoxal phosphate (PLP). Le mélange réactionnel est constitué de pyruvate (25 mM), d'a-méthylbenzylamine racémique (25 mM), de PLP (0,1 mM) et de DMSO (1% wt) en solution dans du tampon Phosphate 50 mM NaCI 300 mM pH=7,5.
Le mélange réactionnel est introduit dans la colonne préparée comme décrit précédemment dans la partie « immobilisation ». Le flux est continu avec un débit de 0,1 mL/min, la solution en sortie de colonne est récupérée sous forme de fraction de 1 mL pendant 5h. La formation de l'acétophénone est suivie par spectrophotométrie UV à 245 nm.
L'activité enzymatique mesurée au temps t pour la B9L0N2 immobilisée est exprimée en mole d'acétophénone formée par mole d'enzyme. Pour ce faire la quantité d'acétophénone est dosée dans chaque prélèvement.
Les taux de conversion sont exprimés en moles de produit formé (acétophénone) par moles de substrat (a-methylbenzylamine) initialement présent. 100
• Flux avec recirculation en utilisant l'enzyme GsOYE immobilisée sur Fe-XCat
La réaction étudiée est la réduction de la cyclohexenone en cyclohexanone en présence du cofacteur NADH qui s'oxyde en NAD+. Le mélange réactionnel est constitué de cyclohexenone (50 mM), de NADH (50 mM) et de DMSO (1% wt) en solution dans du tampon Tris-HCI 50 mM NaCI 150mM pH=7,5.
Le mélange réactionnel (10 mL) est introduit dans la colonne préparée comme décrit précédemment dans la partie « immobilisation ». Le flux est en recirculation, la solution récupérée en sortie de colonne est directement réinjectée dans la colonne à un débit de 1 mL/min. Un prélèvement (100 pL) est réalisé toutes les 10 min pendant 2 h (Jour 1), puis la colonne est stockée une nuit à 4°C et un nouveau mélange réactionnel (10 mL) est préparé pour être à nouveau introduit dans la colonne (jour 2). La disparition du NADH est suivie par spectrophotométrie UV à 340 nm.
L'activité enzymatique mesurée pour la GsOYE immobilisée est exprimée en mole de NADH consommée par mole d'enzyme GsOYE. Pour ce faire la quantité de NADH résiduel est dosée dans chaque prélèvement.
Les taux de conversion sont exprimés en moles de cofacteur (NADH) consommées par moles de cofacteur (NADH) initiales.
Résultats :
Tableau 8 : Performances en flux avec recirculation en utilisant l'enzyme B9L0N2 immobilisée sur Fe-XCat Tableau 9 : Performances en flux sans recirculation (flux continu) en utilisant l'enzyme
B9L0N2 immobilisée sur Fe-XCat Tableau 10 : Performances en flux avec recirculation en utilisant l'enzyme GsOYE immobilisée sur Fe-XCat Les résultats expérimentaux avec B9L0N2 en flux avec recirculation, en flux continu (sans recirculation) et avec GsOYE en flux avec recirculation permettent de démontrer la possibilité d'utiliser le matériau Fe-XCat pour immobiliser des enzymes différentes et les utiliser en flux. Les faibles taux de lixiviation (<5%) indiquent que les enzymes restent très majoritairement en interaction avec le matériau support d'immobilisation.

Claims

Revendications
1. Composition comprenant :
• Un matériau carboné poreux obtenu par carbonisation hydrothermale comprenant ou formé à partir:
-d'au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside,
-d'au moins un composé présentant une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol , et
• Au moins un cation métallique, ledit matériau carboné poreux présente au moins une fonction orthodiphénol.
2. Composition selon la revendication 1 dans laquelle
-l'ose est:
• un aldose notamment choisi parmi : le glycéraldéhyde, l'érythrose, le thréose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, l'allose, l'altrose, le glucose, le mannose, le gulose, l'idose, le galactose, et le talose, de préférence le xylose, ou
• un cétose notamment choisi parmi : la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose, le xylulose, le fructose, le psicose, le sorbose, et le tagatose, de préférence le fructose, ou
-le polyoside est :
• un hétérodiholoside notamment choisi parmi : le tréhalulose, le saccharose , le turanose , le maltulose, le leucrose, l'isomaltulose, le gentiobiulose, le mélibiose, le lactulose, le lactose, et le rutinose, ou
• un homodiholoside notamment choisi parmi : l'inulobiose, I'alpha2-mannobiose, I'alpha3-mannobiose, le tréhalose, le kojibiose, le nigerose, le maltose, l'isomaltose, le sophorose, le laminaribiose, le cellobiose, et le gentiobiose, de préférence le maltose ou le saccharose
3. Composition selon la revendication 1 dans laquelle le composé présentant une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol est choisi parmi : le catéchol, le pyrogallol, l'acide caféique, la mangiférine, la quercétine, la cyanidine, la catéchine, l'épicatéchine, l'épigallocatéchine, l'anthocyanidol, le procyanidol B-3, le procyanidol B-4, les fuhalols (bifuhahol, trifuhahol), le carmalol (diphloréthohydroxycamalol) et l'acide tannique, ou un extrait naturel végétal contenant au moins un de ces composés.
4. Composition selon la revendication 3, dans laquelle le composé présentant une fonction orthodiphénol est la catéchine.
5. Composition selon la revendication 1, dans laquelle le matériau carboné poreux est formé à partir de :
-maltose, galactose, lactose, glucose, mannose, sucrose, arabinose, ribose, fructose, xylose, érythrose, dihydroxyacétone, et
- catéchine, ou d'un extrait de cachou.
6. Composition selon la revendication 1, dans laquelle le matériau carboné poreux présente un rapport molaire entre le au moins un glucide, de préférence au moins un ose, ou au moins un polyoside et le au moins un composé présentant au moins une fonction orthodiphénol ou orthométhoxyphénol de 1/2 ou 1/1 ou 2/1 ou 3/1 ou 4/1 ou 5/1.
7. Composition selon la revendication 1, dans laquelle le au moins un cation métallique est choisi parmi Al3+, Ag+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Cu+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Mg2+, Mn2+, Na+, Ni2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Zn2+, de préférence un ou des cations de métaux de transition Fe3+, Co2+, Zn2+, Cu2+, ou Ni2+.
8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, comprenant en outre au moins une protéine immobilisée, ladite au moins une protéine immobilisée de préférence comprenant une étiquette poly-histidine et ladite au moins une protéine immobilisée est de préférence une enoate reductase (EC 1.3.1.31), une transaminase (EC 2.6.1), une pyrophosphatase (EC3.6.1.1).
9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle la quantité de protéine adsorbée sur le matériau carboné poreux est de 10 à 80 parties en poids par rapport à
100 parties en poids du matériau carboné poreux, encore plus de préférence de 10 à 50 parties en poids par rapport à 100 parties en poids du matériau carboné poreux, encore plus de préférence de 25 à 50 parties en poids par rapport à 100 parties en poids du matériau carboné poreux.
10. Composition selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle l'activité spécifique de l'enzyme immobilisée sur le matériau carboné poreux est supérieure à celle de la même enzyme libre.
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