EP4652178A1 - Méthode de détection de biomarqueurs peptidiques - Google Patents

Méthode de détection de biomarqueurs peptidiques

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Publication number
EP4652178A1
EP4652178A1 EP24700829.5A EP24700829A EP4652178A1 EP 4652178 A1 EP4652178 A1 EP 4652178A1 EP 24700829 A EP24700829 A EP 24700829A EP 4652178 A1 EP4652178 A1 EP 4652178A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fpa
electrical signal
sensor system
peptide
biological
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP24700829.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Juan PELTA
Philippe Manivet
Benjamin CRESSIOT
Sandra GREIVE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dreampore
Assistance Publique - Hôpitaux de Paris
UNIVERSITE EVRY VAL D'ESSONNE
CY Cergy Paris Université
Original Assignee
Dreampore
Assistance Publique - Hôpitaux de Paris
UNIVERSITE EVRY VAL D'ESSONNE
CY Cergy Paris Université
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dreampore, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris, UNIVERSITE EVRY VAL D'ESSONNE, CY Cergy Paris Université filed Critical Dreampore
Publication of EP4652178A1 publication Critical patent/EP4652178A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2410/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving peptides of less than 20 animo acids
    • G01N2410/06—Kallidins; Bradykinins; Related peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology
    • G01N2800/224—Haemostasis or coagulation

Definitions

  • the present invention relates to the biotechnology sector. More particularly, the invention relates to the field of medical or animal diagnosis by the detection of peptide biomarkers.
  • Prior art More than 200 blood protein biomarkers are already currently used in medical biology, but the needs to improve the diagnosis and monitoring of patients are still significant.
  • techniques based on mass spectrometry allow the identification of numerous peptide biomarkers, their routine uses in the clinic still pose difficulties (https://www.inserm.fr/dossier/proteomique/).
  • methods based on antibodies pose problems of cross reactions and do not make it possible, for example, to identify the presence of peptides differing, for example, only by an amino acid, or even more difficult different conformations.
  • fibrinopeptide A although being a proven biomarker of coagulation or even certain cancers, is not implemented in the clinic due in particular to cross-reactions during use. techniques based on recognition by antibodies.
  • the principle of electrical detection of the transport of molecules through a nanopore consisting of a protein channel inserted in a lipid membrane separating two compartments is well known: the membrane is subjected to a potential difference which induces an ionic current through the nanopore in the presence of an electrolyte solution. The passage of a molecule through the nanopore, or the interaction of the molecule with the nanopore, induces a measurable drop in current.
  • Patent EP3270139 describes the electrical detection of peptides differing by their amino acid sequence by an aerolysin nanopore and this on the scale of an amino acid.
  • methods which would allow the detection, within complex biological media such as biological fluids (serum, urine, cerebrospinal fluid), of peptide biomarkers by the analysis of the electrical signal of an aerolysin nanopore are not known. of state art.
  • the target biomarker may require varying the experimental conditions (pH, temperature, etc.) to ensure a specific identification of the target biomarker.
  • the inventors have developed a method for analyzing peptide biomarkers by aerolysin nanopore in biological liquids which are complex mixtures. Compared, for example, to mass spectrometry methods, the invention allows the detection of these biomarkers in a reliable and sensitive manner, and thus a rapid “bedside” diagnostic test. This method also has the particular advantage of gains in sensitivity and specificity for biomarkers having a low half-life, and/or not achieved by methods based on the use of antibodies for the reasons mentioned above.
  • an object of the invention is to propose a diagnostic method comprising the detection of at least one peptide biomarker in a complex mixture such as a biological liquid, by analyzing the electrical signal associated with the aerolysin in the presence biological fluid, in response to the application of a potential difference.
  • a diagnostic method comprising the detection of at least one peptide biomarker in a complex mixture such as a biological liquid, by analyzing the electrical signal associated with the aerolysin in the presence biological fluid, in response to the application of a potential difference.
  • a first object of the invention is a method for detecting at least one peptide biomarker in a biological liquid comprising the following steps: - providing a sample of biological liquid, - adding the biological liquid into a sensor system comprising, in a solution of alkali metal halide, alkaline earth halide or mixtures thereof, of 2 M to 5 M and of a pH of 3 to 10, at least one aerolysin nanopore inserted in a lipid membrane, polymeric or solid defining a cis side and a trans side, said biological liquid being added to the cis side of the membrane, - apply to said sensor system comprising the liquid biological potential difference between -300 mV and +300 mV, preferably between -200 mV and +200 mV, of a nature to promote the passage of said at least one peptide biomarker, - record the electrical signal generated at a frequency of 100 kHz to 1 MHz
  • the latter may optionally include one or more of the following characteristics, alone or in combination: - the at least one peptide biomarker corresponds, for a given peptide, to the detection of the presence and/or or the absence of at least one post-translational modification and/or at least one conformation of said peptide; in fact, the method of the invention allows the effective characterization of the presence in a mixture of peptides which only present such differences, without heavy equipment and complicated handling, - the at least one peptide biomarker has a size between from 3 to 100 amino acids; - the at least one peptide biomarker is selected from: histones H1, H2A, H2B, H3 and/or H4, B-type natriuretic peptide, chemokines, interleukins, or one of their receptors or its subunit, adiponectin, NLRP3, insulin A chain, insulin B chain, cytochrome C, fibrinopeptide A (FPA),
  • FPA fibrinopeptide
  • a second object of the invention relates to a method for diagnosing a pathology associated with a coagulation disorder in a subject suspected of suffering or suffering from such a pathology comprising the detection of FPA or its derivatives such as phosphorylated FPA (FPA-P), FPA-3, FPA-6, or mixtures thereof, in a biological fluid coming from said subject, said method comprising the following steps: - provide a sample of biological fluid from said subject, - introduce the biological fluid into a sensor system comprising, in a solution of alkali metal halide, alkaline earth halide or their mixtures, from 2M to 5M and a pH of 4.1 to 10, at least one aerolysin nanopore inserted in a lipid or polymeric membrane defining a cis side and a trans side, said biological liquid being added to the cis side of the membrane, - apply to said sensor system comprising the biological liquid a potential difference between +1 mV and +300 mV,
  • a third object of the invention relates to a method of diagnosis of bradykin angioedema in a subject suspected of suffering or suffering from such a pathology comprising the following steps: - providing a sample of biological fluid from said subject, - introducing the biological fluid into a sensor system comprising, in a solution of alkali or alkaline earth metal halide of 2M to 5M and a pH of 3.1 to 10, an aerolysin nanopore inserted into a lipid or polymeric membrane, said biological liquid being added to the cis side of the membrane, - apply to said sensor system comprising the biological liquid a potential difference of between -300 mV and -1 mV, preferably between -100 mV and -10 mV, preferably -50 mV, such as to promote the
  • Figure 1 represents the different fragments resulting from the fibrinolysis of fibrinogen, which results in the release of fibrinopeptide A (FPA), which can be in the organism phosphorylated (FPA-P) or not, or cleaved in its terminal part thus generating the loss of 3 (FPA-3) or 6 amino acids (FPA-6).
  • FPA fibrinopeptide A
  • Figure 2 represents part of a sensor system used in the method according to the invention comprising the lipid bilayer in which an aerolysin nanopore is embedded, in a mixture of electrolyte (4M KCl, 25 mM Tris HCl, pH7. 5).
  • the membrane defines a cis compartment and a trans compartment, the cis compartment being that where the part of the nanopore exterior to the membrane is located.
  • the potential difference applied to the system generates a force making it possible to attract the peptides included in the electrolyte mixture into the cis compartment relative to the orientation of the nanopore.
  • Figure 3 is a representation of an electrical signal generated during the passage of a peptide biomarker through the aerolysin nanopore, in the sensor system used in the method.
  • I0 is the basic ionic current when none analyte does not pass through the nanopore.
  • the passage of the biomarker through the nanopore causes a drop in the measured current Ib.
  • ⁇ I therefore represents the blocking of the nanopore generated by the passage of the analyte.
  • the blocking time Dt is the time it takes for the analyte to disrupt the current.
  • FIG. 4 represents the analysis of the electrical signals generated by the FPA (left panel), FPA-P (middle) and their mixture (right panel).
  • the representation, for each event, of the blocking current as a function of the blocking time reveals the different populations, and makes it possible to distinguish the two species in their mixture (right panel).
  • the concentration in the cis compartment of the sensor system of FPA and FPA-P, added alone, is 40 ⁇ M.
  • the concentration of each of these species in the mixture of FPA and FPA-P is 10 ⁇ M.
  • Data is filtered at 5 kHz and recorded at 250 kHz intervals.
  • the upper panel represents the analysis of the electrical signal generated by a mixture of FPA (10 ⁇ M), FPA-P (20 ⁇ M), FPA-3 (10 ⁇ M) and FPA-6 (2.5 ⁇ M).
  • the representation of the signal of each event as a function of ⁇ Inorm as a function of Dt clearly makes it possible to differentiate and detect each of the species and their conformation.
  • the lower panel is a representation of the ⁇ Inorm as a function of the number of events for the same mixture. This representation makes it possible to estimate the average normalized blocking time for each species.
  • Figure 6 presents for each species of FPA and its derivatives, the determination of the average blocking time. A lognormal distribution is used.
  • Figure 7 represents a combinatorial analysis of the ⁇ I norm and the Dt of a recording of the electrical signal of a mixture comprising FPA (10 ⁇ M), FPA-P (20 ⁇ M), FPA-3 (10 ⁇ M) and FPA- 6 (2.5 ⁇ M), at 50 mV.
  • Figure 8 represents the determination of the different ⁇ Inorm for des-arginine 9 bradykinin (2 ⁇ M, left panel) and bradykinin (2 ⁇ M, central panel) and their equimolar mixture (1.3 ⁇ M, right panel).
  • For bradykinin as for des-arginine 9 bradykinin two conformations each characterized by a specific ⁇ Inorm are detected. A Gaussian law is used.
  • Figure 9 represents a combinatorial analysis of the ⁇ Inorm and Dt of a recording of the electrical signal of a mixture comprising their equimolar mixture 1.3 ⁇ M of bradykinin and 1.3 ⁇ M of des-arginine 9 bradykinin.
  • BK1 and BK2 the two conformations of bradykinin
  • DAB1 and DAB2 the two conformations of des-arginine 9 bradykinin
  • Figure 10 represents the analysis of a serum comprising 100 nM of des-arginine 9 bradykinin.
  • the serum was diluted one hundredth in the cis compartment of the sensor system.
  • the representation of the number of events as a function of their ⁇ I norm makes it possible to identify the two forms DAB1 and DAB2.
  • the electrical signals were recorded over 27 minutes.
  • the average ⁇ Inorm determined by assuming a Gaussian distribution of the data correspond to those determined in Figure 9.
  • the acquisitions are carried out at a potential difference of –50 mV and the electrolyte of the sensor system is 4M KCL 25 mM Tris pH 7.5.
  • Figure 11 represents the possible classification of different peptides and different conformations of these peptides depending on the shape of the electrical signal generated by the nanopore in contact with one of the peptides BK1, BK2, DAB1 and DAB2.
  • FIG. 12 represents a graph showing the proportionality of the frequency of current blocking events as a function of the concentration of peptides, equimolar mixture of BK1 and DAB1, for DAB2 and BK2 for concentrations varying from 10 nM to 1 ⁇ M.
  • Figure 13 represents the representative electrical signals generated during the passage of the oxidized (A) or reduced (B) form of the L-AVP or D-AVP peptides which are differentiated by the presence of the enantiomeric form of the asparagine present at the residue 8 of these peptides of 9 amino acids.
  • Figure 14 is another representation of an electrical signal generated during the passage of a peptide biomarker through the aerolysin nanopore, in the sensor system used in the method. Characteristics of the signal are indicated there which can be used to characterize each blockage such as the minimum, average, maximum blocking rate ( ⁇ Ibmin, ⁇ Ib, ⁇ Ibmax), the standard deviation ( ⁇ ) and occupation duration (DT).
  • the method according to the invention makes it possible to discriminate with certainty the FPA in its phosphorylated or non-phosphorylated form and also different conformations of the FPA, which is not possible by methods based on epitope/antibody recognition due to the proximity of sequences or very close or even identical molecular masses.
  • the method according to the invention makes it possible to discriminate bradykinin from des-arginine 9 bradykinin, and to identify the presence of different conformations of these molecules, directly in human serum without any particular treatment or purification.
  • the invention makes it possible to differentiate peptides distinguished solely by their conformation, for example a secondary structure or an enantiomerism, as is currently demonstrated for vasopressin and desmopressin.
  • their conformation for example a secondary structure or an enantiomerism
  • vasopressin and desmopressin we will describe more particularly for purposes of illustration the implementation of the method according to the invention for the detection of biomarkers according to their conformation, their post-transcriptional modifications or their sequence.
  • the blocking time Dt is the duration of occupation of the nanopore by the biomarker and corresponds to the duration of the current drop generated by the passage of the peptide biomarker or its interaction time with the nanopore.
  • the number of events corresponds to the number of current drops observed over a given duration in the presence of the or a mixture of peptide biomarkers, for a sensor system.
  • An event therefore corresponds to the passage of a species through the nanopore or a prolonged interaction with it: events lasting greater than or equal to 75 ⁇ s are considered within the meaning of the invention.
  • the number of events is therefore associated with the concentration of the peptide biomarker.
  • a sensor system is for example described in Figure 2. For the purposes of the method according to the invention, several sensor systems can be used independently and separately.
  • the method of the invention is particularly sensitive and makes it possible to detect concentrations of peptide biomarker of the nanomolar order
  • using several sensor systems in parallel has the advantage of increasing the number of events analyzed and consequently lowering the detection threshold of the method according to the invention even further.
  • using a sensor system comprising several aerolysin nanopores is possible, however this configuration is less preferred.
  • Any functional aerolysin nanopore can be used for the purposes of the present invention.
  • the so-called “wild” aerolysin nanopore from Aeromonas hydrophila (uniprot reference P09167; https://www.uniprot.org/uniprotkb/P09167/entry) can be used.
  • a peptide biomarker is defined as a peptide whose presence, concentration or absence in a biological sample is associated with a pathological, physiological or metabolic state. Detected at the level of a subject's organism, the presence, concentration or absence in a biological sample is associated with the presence or an increase in the risk of the occurrence of a pathological, metabolic or physiological condition in said subject.
  • a peptide biomarker that can be detected with the method of the invention may comprise 3 to 100 amino acids, or even 3 to 25 amino acids. Also the method may include subjecting the biological sample to enzymatic digestion of the peptides and proteins it contains.
  • the method according to the invention is particularly suitable for detecting the presence and quantification of biomarkers characterized by a significant polymorphism in the population or a specific polymorphism linked to a pathological, physiological or metabolic state (this polymorphism may be linked to a conformation, a post-translational modification, a sequence polymorphism, etc. as described previously).
  • Biomarkers peptides detected by the method according to the invention can be selected from the following group of peptide biomarkers: histones H1, H2A, H2B, H3 and/or H4, B-type natriuretic peptide, chemokines such as those listed in the tables 1, 2 and 3, adiponectin, NLRP3, the A chain of insulin, the B chain of insulin, a cytochrome C, an interleukin or one of its receptors or one of the subunits of this receptor, fibrinopeptide A (FPA), phosphorylated FPA (FPA-P), FPA3, FPA6, bradykinin (BK), des-arginine 9 bradykinin (DAB), A ⁇ 1-15, A ⁇ 1-16, A ⁇ 1-17, A ⁇ 1- 40, A ⁇ 1-42, A ⁇ 11-40, A ⁇ 17-40, A ⁇ 17-42,ADA, ARTN, AXIN1, Beta-NGF, CASP-8, CD40, CDCP1, CST5, DNER
  • Chemokines are a family of small soluble proteins, 8-12 kilodaltons. Chemokines are involved in various biological processes such as hematopoiesis and angiogenesis. As such, they can be a marker for example of the proliferation of tumors or inflammation. They are for the most part characterized by the presence of four cysteine residues in conserved positions and essential to their three-dimensional structure. We distinguish 4 families of chemokine, depending, in particular, on the positioning of the two cysteines proximal to their N-terminal end.
  • the CXC chemokines (Table 1) present an amino acid between the first two cysteines, the so-called CC chemokines (see Table 2 specifying, but not limited to, human CC chemokines) present the first two adjacent cysteines, the so-called CX3C chemokines (Table 3). , specifying, but not limited to, the chemokine CX3C human), the only member of which (fractalkine) has three amino acids between the first two cysteines, the C chemokines (Lymphotactin alpha and beta) only have 2 cysteines in total (see table 3 specifying, but not limited to, the human C chemokines).
  • the method according to the invention is particularly suitable for characterizing and quantifying the presence in a biological fluid of such structural proteins and/or similar sequences whose presence is linked to a pathological, physiological or metabolic state.
  • Table 1 Chemokines CXC Name Reference Name Reference Uniprot Uniprot CXCL1 P09341 CXCL10 P02778 CXCL2 P19875 CXCL11 O14625 CXCL3 P19876 CXCL12 P48061 CXCL4 P02776 CXCL13 O43927 CXCL5 P42830 CXCL14 O 95715 CXCL6 P80162 CXCL15 Q9WVL7 CXCL7 P02775 CXCL16 Q9H2A7 CXCL8 P10145 CXCL17 Q6UXB2 CXCL9 Q07325
  • Table 2 Chemokines N om Reference Name Reference U niprot Uniprot CCL1 P22362 CCL16 O15467 CCL2 P13500 CCL17 Q925
  • Interleukins, or one of their receptors, different forms can be detected by the method of the invention are listed in Table 4 below.
  • Table 4 Name Reference uniprot Interleukin-1 alpha (IL-1 alpha) P01583 Interleukin-2 (IL-2) P60568 Interleukin-2 (receptor beta subunit, IL-2RB) P14784 Interleukin-4 (IL-4) P05112 Interleukin-5 (IL5) P05113 Interleukin-6 (IL6) P05231 Interleukin-7 (IL-7) P13232 Interleukin-8 (IL-8) P10145 Interleukin-10 (IL10) P22301 Interleukin-10 (receptor alpha subunit, IL-10RA) Q13651 Interleukin-10 (receptor beta subunit, IL-10RB) Q08334 Interleukin 11 (IL-11) A8K3F7 Interleukin-12 (beta subunit, IL-12B) P29460 Interleukin-13 (IL-13) P35225 Inter
  • the BNP precursor is secreted by cardiac muscle cells in the atria and ventricles. The synthesis is increased in the event of distension of this tissue. BNP is notably a biomarker of acute heart failure. BNP has 32 amino acids. Histones are elements of the nucleosome, which includes 2 copies of each of four histones and a 147 base pair portion of DNA. Post-translational modifications Histones are numerous such as, for example, acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitylation, sumoylation, ADP-ribosylation, deamination, and proline isomerization or citrullination.
  • Adiponectin (Uniprot reference: Q15848) is a protein whose plasma levels are inversely correlated with the risk of metabolic pathologies such as insulin resistance, diabetes or even metabolic syndrome. The adiponectin level is particularly used in the diagnostic guidance and therapeutic management of lipodystrophy syndromes and severe insulin resistance.
  • NLRP3 (Uniprot reference: Q96P20) is a protein that is part of one of the inflammasome complexes, and which is identified as a biomarker of the state of inflammation of an organism. High levels of inflammasome constituent proteins are detected in the biofluids of patients suffering from chronic inflammatory pathologies such as diabetes, HIV, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), pneumonia, psoriasis, psoriatic arthritis, macular degeneration, neurodegenerative pathologies.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • NRLP3 is described as a prognostic biomarker in sepsis, or for the diagnosis of neuroinflammatory pathologies such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis. For example, higher levels of plasma NLRP3 are detected in subjects suffering from Parkinson's disease.
  • the Uniprot references cited are commonly accessible on the site https://www.uniprot.org/ which lists sequence and functional data from international research.
  • a biological fluid means any liquid sample secreted, produced or isolated from a living organism. More particularly, such a biological fluid may comprise: blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, bronchoalveolar lavage, saliva, synovial fluid, amniotic fluid, urine, cell lysate, a medium of culture of eukaryotic or bacterial cells.
  • FPA is a 16 amino acid peptide, originating from the proteolysis of the amino-terminal end of the A ⁇ chain of fibrinogen. It can undergo various degradations at its N-terminal end, thus generating several peptides with a size of less than 16 amino acids, in particular for example the peptides FPA-3 and FPA-6. Increased FPA phosphorylation is reported in patients who have undergone surgical procedures.
  • FPA and its derivatives includes all peptides resulting from degradation, cutting or post-translational modification of the FPA.
  • FPA and its derivatives includes in particular the peptides selected from the group consisting of FPA, FPA-3, FPA-6, FPA-P illustrated in Figure 1.
  • Subject, in the context of methods for identifying at least one peptide biomarker and diagnostic methods of the invention means a mammal, preferably a human.
  • Method for detecting at least one peptide biomarker in a biological fluid means a mammal, preferably a human.
  • Method for detecting at least one peptide biomarker in a biological fluid As mentioned previously, the method for detecting at least one peptide biomarker in a biological liquid according to the invention makes it possible to detect the presence or absence of said at least one peptide biomarker, and this varies slightly in size, or in conformation or post-translational modification.
  • This method is particularly advantageous with regard to the usual methods of recognition by dedicated antibodies which do not allow or are unsatisfactory to specifically identify biomarkers of similar sequences within a sample due to cross-reactions. Furthermore, this method is particularly easy to implement and in particular does not require pretreatment of the biological liquid as may be the case for other methods such as, for example, spectrometry. Furthermore, mass spectrometry alone does not allow the characterization of peptides differing solely by their enantiomeric conformation. The aforementioned methods also do not make it possible to differentiate and quantify the statistical conformations of a peptide (the transient secondary structures of peptides), even less within a biological sample. In addition, this method can easily and quickly be implemented as close as possible to the patient and care.
  • the electrolyte is an alkali metal halide or alkaline earth solution or their mixture.
  • Said electrolyte may be chosen from the group consisting of LiCl, NaCl, KCl or KBr, RbCl, CsCl, KF, ammonium chloride, tetramethylammonium chloride, BeCl2, CaCl2, MgCl2, SrCl2, BrCl2, BaCl2 or any combination of these.
  • KCl is particularly preferred.
  • the concentration of the electrolyte is between 2M and 5M, limits included.
  • the pH of the electrolyte solution can vary, for example depending on the biomarker that it is desired to characterize and/or detect. This pH must not, however, be such as to call into question the structure or activity of the aerolysin nanopore of the sensor system.
  • the pH of the electrolyte solution is between 3 and 10.
  • the pH can be chosen to increase the driving force via changing the selectivity of the nanopore, as well as the net charge of the peptide biomarker analyzed.
  • the temperature of the at least one sensor system is such that ice crystals do not form and/or the aerolysin nanopore does not denature.
  • placing the sensor system at a low temperature for example below 15°C, or even below 10°C, has the advantage of slowing down the events and therefore making it possible to more easily characterize components of the electrical signal associated with the passage. of a peptide biomarker.
  • place the at least one sensor system at a high temperature for example a temperature greater than 40°C, greater than 45°C, or even greater than 55°C, can make it possible to denature at least in part the peptide biomarker and thus facilitate its passage through the aerolysin nanopore.
  • the at least one sensor system, in the method of the invention is at a temperature of 5°C to 55°C.
  • the membrane into which the aerolysin nanopore is inserted is: - either of lipid nature, consisting, for example, of diphytanoylphosphatidylcholine, 1,2-dilauroyl-sn-glycero- 3- phosphocholine DLPC; 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DDPPC; 1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3- phosphocholine DEPC or their mixture, - either of polymeric nature, based on diblock polymers (poly(1,2-butadiene)-b-poly(ethylene oxide) or triblock PDMS- PMOXA-PDMS which has the advantage of more easily controlling the number of nanopores formed in the system, but also having better stability than a lipid membrane over time and subjected to high electrical potential differences (> 200 mV).
  • the acquisition frequency varies from 100 kHz to 1 MHz, preferably from 250 kHz and 400 KHz.
  • the acquisition frequency can in particular be adjusted according to the size of the biomarker in fact more; the peptides are small and the adequate detection of events requires a high acquisition frequency.
  • a Bessel filter is used.
  • the Bessel filter used will also be adjusted according to the size of the biomarkers (it can be used). value a frequency varying from 1 kHz to 100 kHz). This Bessel filter makes it possible to reduce noise without modifying the information contained in the electrical signal.
  • the analytes peptide biomarkers
  • Such a sensor system is illustrated in Figure 2.
  • Said at least one peptide biomarker added in cis can be included in the biological fluid without treatment of the latter aimed at facilitating the detection of said at least one biomarker.
  • Said biological liquid may also have been subjected to a prior treatment aimed at facilitating the detection of the at least one biomarker such as, for example, filtration, fractionation, precipitation, the addition of reagent aimed at adding at least one grouping on at least one of the amino acids of said biomarker.
  • pretreatments such as filtration, fractionation, precipitation or any other treatment aimed at purification or concentration are less desirable because they often induce a loss of sensitivity.
  • This prior treatment may for example aim to modify the charge of the at least one peptide biomarker so as to facilitate its translocation from the cis side to the trans side of the membrane of the sensor system upon application of the potential difference. This is advantageous in cases where the at least one peptide biomarker that it is desired to characterize and/or detect has a neutral or insufficient charge.
  • This treatment may also include an enzymatic treatment aimed at producing peptides from a large biomarker protein, with the aim of detecting and characterizing at least one of these peptides by the sensor system of the invention.
  • This treatment may also include the use of sufficiently denaturing conditions so as to dissociate complexes involving the peptide biomarkers whose presence it is desired to detect, and/or unfold at least in part of the structures.
  • the biological fluid may be included in the group comprising blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, bronchoalveolar lavage, saliva, synovial fluid, amniotic fluid, urine, cell lysate, culture of eukaryotic or bacterial cells.
  • the method of the invention allows the identification of peptide biomarkers in a biological fluid such as serum, which is a complex biological fluid without prior treatment.
  • the method of the invention makes it possible to identify two signals for FPA-P, FPA-P1 and FPA-P2. By any theory, these two signals are believed to correspond to two different confirmations of the FPA-P peptide, induced by the phosphorylation of the peptide. As illustrated in the right panel of Figure 3, the method allows the presence of to be identified. FPA, and FPA-P in a mixture Thus the method according to the invention. makes it possible to distinguish up to a single post-translational modification of a peptide biomarker, such as for example, a phosphorylation.
  • the top panel of Figure 5 shows the specific signatures of these peptide biomarkers as determined by plotting the blocking rate versus nanopore blocking duration.
  • the lower panel of Figure 5 shows the determination of the average blocking rate for each of the inferred species as a function of the number of events. An average blocking rate of 0.64 ⁇ 0.01, 0.70 ⁇ 0.01 for FPA-P1, 0.62 ⁇ 0.01 for FPA-P2, 0.56 ⁇ 0.01 for FPA- 3 and 0.44 ⁇ 0.01 for FPA-6.
  • the method according to the invention therefore makes it possible to discriminate peptides differing by N-terminal cleavages, confirmation and/or post-translational modification, in a mixture, using for example the ⁇ Inorm or the average ⁇ I norm as defined. above.
  • Figure 6 shows the determination for each of the species FPA, FPA-3, FPA-6 and FPA-P, that it is possible to determine an average occupancy time for each of these, which is specific to them, despite the similarity of these peptides. As illustrated, this is obtained by plotting the blocking time of each event as a function of the number of events and thus estimating the average occupation time by fitting to a Gaussian distribution.
  • Average occupancy times of 5.74 ⁇ 0.22 ms for FPA, 0.62 ⁇ 0.04 ms for FPA-P1, 4.41 ⁇ 0.33 ms for FPA-P2, 2.50 ⁇ 0.12 ms for FPA-3, and 0.95 ⁇ 0.04 ms for FPA-6 are thus determined.
  • the electrical signal can be used to determine characteristics such as: - the average, median, minimum and/or maximum occupation time, - the average, minimum, median and/or maximum blocking rate of the at least one aerolysin nanopore of the sensor system, - the form of the electrical signal which, being specific to the peptide biomarkers, can be used to differentiate them even if these differences consist only of a single post-translational modification or cleavage N-terminals, - the number of events which make it possible to determine the concentration of the identified peptide biomarker, or - the standard deviation of the signal measured during the passage of said peptide biomarker.
  • the inventors have identified that the analysis of the aforementioned characteristics of the electrical signal is sufficient in itself to detect the presence and/or determine the concentration or absence of peptide biomarkers differentiated by characteristics as tenuous as the presence of one or several post-translational modifications or one or more N-terminal cleavages, a conformation.
  • the determination of the concentration of peptides in a detection system with a nanopore is known in the art, it is based on the linear relationship between the frequency of events and the concentration (Pastoriza-Gallego M, Rabah L, Gibrat G, Thiebot B , van der Goot FG, Auvray L, Betton JM, Pelta J. Dynamics of unfolded protein transport through an aerolysin pore.
  • the peptide biomarkers of the method according to the invention are identified and characterized by the coupled analysis of at least two parameters of the electrical signal such as those described above, this makes it possible to increase the resolution of the method and improve the discrimination and identification of peptide biomarkers.
  • the peptide biomarkers of the method according to the invention are identified and characterized by the coupled analysis of at least two parameters of the electrical signal selected from: - the average, median, minimum and /or maximum, - the average, minimum, median and/or maximum blocking rate of the at least one aerolysin nanopore of the sensor system, - the form of the electrical signal which, being specific to the peptide biomarkers, can be used to differentiate them when even these differences consist only of a single post-translational modification or N-terminal cleavages, - the number of events which make it possible to determine the concentration of the identified peptide biomarker, or - the standard deviation of the signal measured during the passage of said peptide biomarker .
  • the peptide biomarkers of the method according to the invention are identified and characterized by the coupled analysis of: - the average, median, minimum and/or maximum occupancy time, with the average blocking rate, median minimum and/or maximum, or - the average, median, minimum and/or maximum occupancy time, with the shape of the electrical signal, or - the average, median, minimum and/or maximum occupancy time, with the standard deviation of the electrical signal, or - the average, minimum, median and/or maximum blocking rate, with the standard deviation of the electrical signal, or - the average, minimum, median and/or maximum blocking rate, with the shape of the electrical signal.
  • analyzing the generated electrical signal comprises: - determining the average blocking rate, and - determine the average blocking time as described above.
  • analyzing the generated electrical signal comprises: - determining an average, median, minimum and/or maximum occupation time of the at least one aerolysin nanopore of the sensor system, - determine an average, minimum, median and/or maximum blocking rate of the at least one aerolysin nanopore of the sensor system, - analyze the shape of the electrical signal generated, - determine the standard deviation of the measured signal during the passage of said peptide biomarker through said nanopore, and - determining the number of events.
  • the combination of these characteristics makes it possible to differentiate biomarkers according to variations in their primary sequence, the presence and/or absence of at least one post-translational modification and/or at least one conformation of said peptide.
  • FIG 8 illustrates the implementation of the method of the invention for bradykinin.
  • Bradykinin and des-arginine 9 bradykinin are each characterized by two conformations detected by the sensor system of the method according to the invention.
  • Block rates of 0.47 and 0.75 are determined for bradykinin (forms BK1 and BK2), and blocking rates of 0.69 and 0.32 for des-arginine 9 bradykinin (form DAB1 and DAB2).
  • occupation times corresponding to each of the species are determined (not shown).
  • the two-dimensional representation in Figure 9 confirms that the peptide biomarkers are effectively identified and discriminated by a coupled analysis of two parameters of the electrical signal, in this case the blocking time and the blocking rate.
  • Figure 10 confirms the characterization in a human serum of the presence of des-arginine 9 bradykinin, by the identification of two conformations characterized by an average blocking rate of 0.32 ⁇ 0.004 and 0.72 ⁇ 0.002. This is consistent with the blocking rates determined for the purified peptides (Figure 8).
  • Figure 11 shows that it is possible to assign characteristics such as the general shape of the signal to the BK1, BK2, DAB1, DAB2 forms in a biological fluid such as serum, this characteristic allowing an assignment of the signal to the peptide even at low concentration (50 nM).
  • Figure 12 shows that the analysis of the signal makes it possible to determine the concentration of the biomarker, the frequency of the latter being linear with the concentrations of the biomarker peptides tested.
  • the statistical analysis of electrical signals allowed the inventors to surprisingly identify that the standard deviation (Figure 14, ⁇ ) of the signal allows the detection, identification and differentiation of peptides such as vasopressin (L-AVP) and a synthetic enantiomer (D-AVP, precursor of desmopressin) differing by the presence of the enantiomer of arginine 8 present in the peptide.
  • L-AVP vasopressin
  • D-AVP synthetic enantiomer
  • Specific electrical signals for these proteins in their reduced or oxidized form are observed, but also depending on the enantiomer of arginine 8 present in the peptide were identified ( Figure 13 A and B).
  • the standard deviation (characteristic denoted ⁇ in Figure 14) allows the detection and differentiation of D-AVP and vasopressin L-AVP.
  • the analysis of the different characteristics of the electrical signal of the nanopore is sufficient to alone allow the characterization of biological samples by making it possible to quickly and directly detect biomarkers in a sample of biological fluid, differing by their sequence, their conformation, and/or their post-translational modification.
  • the recording duration of the events is at least one minute. The longer the recording duration, the greater the probability of detecting a biomarker poorly represented in the biological fluid; the sensitivity and specificity of the method are also improved.
  • the recording duration of events is at least 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, or even at least 120 min.
  • the method for detecting at least one peptide biomarker in a biological fluid according to the invention may comprise the use of several independent sensor systems, thus increasing the probability of detection of a peptide biomarker poorly represented in the biological fluid.
  • a membrane comprising several nanopores can be used.
  • a sensor system comprises several nanopores. Also, the greater the applied potential difference, the greater the sensitivity of the method.
  • the applied potential difference is less than or equal, in absolute value, to 300 mV, less than or equal to 250 mV, less than or equal to 200 mV, less than or equal to 150 mV, less than or equal to 100 mV, or even less or equal to 50 mV.
  • the applied potential difference is positive, and conversely when the at least one peptide biomarker sought is positively charged, the applied potential difference is negative.
  • the ratio of the volume of the electrolyte to the volume of the biological liquid in the cis compartment is greater than 10, greater than 50, greater than 75, greater than 100, greater than 500, or even greater than 1000.
  • the values of the parameters of the electrical signal characterizing a desired peptide biomarker are established beforehand.
  • the method according to the invention comprises a step of comparing the parameter values of the electrical signal obtained during the analysis of the biological fluid with the parameters characterizing the predetermined peptide biomarker, such as for example for a preparation of pure peptide biomarker or purified.
  • Said method for detecting at least one peptide biomarker in a biological liquid according to the invention can therefore be implemented in biotechnological applications, but also in diagnostic methods for measuring and the direct identification of very diverse biomarkers, in complex environments, differing by characteristics which may be minute, not detectable for example by a simple mass analysis, as demonstrated above and illustrated in the figures.
  • diagnostic methods implementing the steps of the method for detecting at least one peptide biomarker in a biological fluid as described above.
  • Methods for diagnosing at least one peptide biomarker in a biological fluid Diagnosis of pathologies linked to coagulation disorders.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the detection of FPA and its derivatives.
  • FPA is a product of the cleavage of fibrinogen by thrombin.
  • FPA and its derivatives are associated with the occurrence of coagulation in the body. FPA and its derivatives are therefore used in the diagnosis or monitoring of coagulation diseases or associated with coagulation.
  • Coagulation disorders are associated with numerous and diverse pathologies, such as venous thrombosis, disseminated intravascular coagulation which play a role in many cancers (lung, pancreas, prostate, stomach, gastrointestinal, leukemia), ischemic heart disease, COVID-19, stroke, systemic lupus erythematosus.
  • cancers lung, pancreas, prostate, stomach, gastrointestinal, leukemia
  • ischemic heart disease COVID-19
  • stroke systemic lupus erythematosus.
  • FPA or its derivatives in a biological fluid from a subject reflects the activation of fibrin and therefore a thrombotic event.
  • activation of the thrombotic cascade may be associated with a poor prognosis factor in patients suffering from cancer.
  • a second object of the invention relates to the detection of thrombogenesis in a subject comprising the detection of FPA or its derivatives such as phosphorylated FPA (FPA-P), FPA-3, FPA-6, or mixtures thereof. , in a biological fluid coming from said subject.
  • this method allows the diagnosis of a pathology associated with a coagulation disorder in a subject suspected of suffering or suffering from such a pathology comprising the detection of FPA or its derivatives such as phosphorylated FPA ( FPA-P), FPA-3, FPA-6, or mixtures thereof, in a biological fluid coming from said subject.
  • This diagnostic method of a pathology associated with a coagulation disorder of the invention comprises the method of detecting at least one peptide biomarker in a biological fluid described above and adapted in all its embodiments, to the FPA and to its derivatives.
  • a number of events detected, in a biological fluid, for one or more of the biomarkers selected from FPA, FPA-P FPA-3, and FPA-6, greater than that of a control , or a threshold value determined for subjects not experiencing a thrombotic event is the sign of an increase in thrombotic activity in the subject.
  • this detection of thrombogenesis in a subject comprises the detection of FPA or its derivatives such as phosphorylated FPA (FPA-P), FPA-3, FPA-6, or mixtures thereof, in a biological fluid coming from said subject, said method comprising the following steps: - providing a sample of biological fluid from said subject, - introduce the biological liquid into a sensor system comprising, in an alkali metal halide or alkaline earth solution of 2M to 5M and a pH of 4.1 to 10, at least one nanopore of aerolysin inserted into a lipid or polymeric membrane, said biological liquid being added to the cis side of the membrane, - apply to said sensor system comprising the biological liquid a potential difference of between +1 mV and +300 mV, between +10 mV and + 100 mV, preferably +50 mV, likely to promote the passage of the FPA and its derivatives, - record the electrical signal generated at a frequency of 100 kHz to 1 MHz, and -
  • Bradykinic angioedema is characterized by episodes of subcutaneous or submucosal edema that can be life-threatening in the case of pharyngeal localization. No emergency biological examination allows to confirm the diagnosis. The measurement of bradykinin is not possible in routine practice. This acute complication is therefore often confused with angioedema of allergic origin, which can lead to incorrect diagnosis and specific treatment and endanger the vital prognosis. Other serious conditions are abdominal pain crises responsible for a subocclusive syndrome, or even more rarely hypovolemic shock (Javaud et al, 2016). Management of serious crises involves rapid diagnosis and treatment.
  • a third subject of the invention relates to a method for diagnosing bradykin angioedema in a subject suspected of suffering or suffering from such a pathology comprising the detection of bradykinin and/or des-arginine 9 bradykinin or their mixtures, in a biological fluid coming from said subject.
  • This diagnostic method for bradykin angioedema comprises the method of detecting at least one peptide biomarker in a biological fluid set out above and adapted in all its embodiments, bradykinin and/or des-arginine 9 bradykinin or of their mixtures.
  • a number of events detected, in a biological fluid, for bradykinin and/or for des-arginine 9 bradykinin, greater to that detected in a control sample, or to a threshold value determined for subjects not suffering from bradykin angioedema or angioedema is the sign of the presence of bradykin angioedema in the subject.
  • a particular object of the invention is a diagnostic method for bradykinic angioedema in a subject suspected of suffering or suffering from such a pathology comprising the following steps: - providing a sample of biological fluid from said subject, - introducing the biological fluid into a sensor system comprising, in an alkali or alkaline earth metal halide solution of 2M to 5M and a pH of 3.1 to 10, an aerolysin nanopore inserted in a lipid or polymeric membrane, said biological liquid being added to the cis side of the membrane, - apply to said sensor system comprising the biological liquid a potential difference of between - 300 mV and -1 mV, between -100 mV and -10 mV, preferably - 50 mV, of a nature to favor the passage of bradykinin and/or des-arginine 9 bradykinin, - record the electrical signal generated at a frequency of 100 kHz to 1 MHz, - analyze the generated electrical signal, said generated electrical signal making it possible
  • Another object of the invention is a method of treating bradykinic angioedema in the subject comprising the following steps: - providing a sample of biological fluid from said subject, - introducing the biological fluid into a sensor system comprising, in a solution of an alkali or alkaline earth metal halide of 2M to 5M and a pH of 3.1 to 10, an aerolysin nanopore inserted into a lipid or polymeric membrane, said biological liquid being added to the cis side of the membrane, - apply to said sensor system comprising the biological liquid a potential difference of between - 300 mV and -1 mV, between -100 mV and -10 mV, preferably -50 mV, such as to promote the passage of bradykinin and/or of des-arginine 9 bradykinin, - record the electrical signal generated at a frequency of 100 kHz to 1 MHz, - analyze the generated electrical signal, said generated electrical signal making it possible to detect the presence and/or determine the concentration or absence

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Abstract

L'invention concerne notamment une méthode de détection d'un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique; ajouter le liquide dans un système senseur comprenant, dans une solution d'halogénure de métal alcalin, d'halogénure d'alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2 à 5 M et de pH de 3 à 10, au moins un nanopore d'aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide étant ajouté du côté cis de la membrane; appliquer audit système comprenant le liquide une différence de potentiel comprise entre -300 et +300 mv, de nature à favoriser le passage dudit au moins un biomarqueur; enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz; analyser le signal, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l'absence du biomarqueur.

Description

Méthode de détection de biomarqueurs peptidiques La présente invention concerne le secteur des biotechnologies. Plus particulièrement, l’invention concerne le domaine du diagnostic médical ou animal par la détection de biomarqueurs peptidiques. Art antérieur Plus de 200 biomarqueurs protéiques sanguins sont déjà utilisés actuellement en biologie médicale, mais les besoins pour améliorer le diagnostic et le suivi des patients sont encore importants. Si des techniques basées sur la spectrométrie de masse permettent l’identification de nombreux biomarqueurs peptidiques, leurs utilisations de routine en clinique posent encore des difficultés (https://www.inserm.fr/dossier/proteomique/). Par ailleurs, les méthodes basées sur les anticorps posent des problèmes de réactions croisées et ne permettent pas, par exemple, d’identifier la présence de peptides se différenciant par exemple, uniquement par un acide aminé, ou encore plus difficilement des conformations différentes. Ainsi, par exemple, la détection du fibrinopeptide A (FPA), bien qu’étant un biomarqueur avéré de la coagulation ou encore de certains cancers, n’est pas mise en œuvre en clinique du fait notamment de réactions croisées lors de l’utilisation de techniques basées sur la reconnaissance par des anticorps. Le principe de la détection électrique du transport de molécules à travers un nanopore constitué d’un canal protéique inséré dans une membrane lipidique séparant deux compartiments est bien connu : la membrane est soumise à une différence de potentiel qui induit un courant ionique à travers le nanopore en présence d’une solution d’électrolytes. Le passage d’une molécule à travers le nanopore, ou l’interaction de la molécule avec le nanopore, induit une chute du courant mesurable. Dans ce domaine, l’utilisation du nanopore d’aérolysine est connue et il a été montré que l’aérolysine forme un canal sensible au courant électrique dans une bicouche lipidique. Le brevet EP3270139 décrit la détection électrique de peptides se différenciant par leur séquence d’acide aminés par un nanopore d’aérolysine et ce à l’échelle d’un acide aminé. Néanmoins, des méthodes qui permettraient la détection, au sein de milieux biologiques complexes tels que les liquides biologiques (sérum, urine, liquide céphalorachidien), de biomarqueurs peptidiques par l’analyse du signal électrique d’un nanopore d’aérolysine ne sont pas connues de l’état l’art. En effet, identifier et quantifier directement le biomarqueur cible à partir d’un échantillon de fluide biologique contenant par définition un mélange d’un grand nombre de molécules peut nécessiter de faire varier les conditions expérimentales (pH, température, etc…) pour assurer une identification spécifique du biomarqueur cible. Les inventeurs ont mis au point une méthode d’analyse de biomarqueurs peptidiques par nanopore d’aérolysine dans des liquides biologiques qui sont des mélanges complexes. Comparée, par exemple, aux méthodes de spectrométrie de masse, l’invention permet la détection de ces biomarqueurs de manière fiable et sensible, et ainsi un test de diagnostic rapide « au lit du patient ». Cette méthode présente notamment également l’intérêt particulier des gains en sensibilité et spécificité pour des biomarqueurs présentant une demi-vie faible, et/ou non atteintes par les méthodes basées sur l’utilisation d’anticorps pour les raisons évoquées ci-dessus. Ces méthodes sont d’un intérêt particulier à mettre en œuvre dans des méthodes diagnostiques. Ainsi, un objet de l’invention est de proposer une méthode de diagnostic comprenant la détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un mélange complexe tel qu’un liquide biologique, par l’analyse du signal électrique associé à l’aérolysine en présence du liquide biologique, en réponse à l’application d’une différence de potentiel. Bref exposé de l’invention Comme évoqué ci-dessus, les inventeurs ont mis au point une méthode de caractérisation et de quantification des peptides présents dans un liquide biologique. Les inventeurs se sont notamment rendu compte que les composantes ou caractéristiques du signal électrique généré lors du passage de peptides au travers du nanopore étaient des caractéristiques de celui-ci et permettaient de différencier un même peptide avec des conformations différentes, de modifications post- traductionnelles et seulement légèrement différents dans leur séquence. Une telle méthode est d’intérêt tant dans le domaine des biotechnologies que dans le domaine médical. Partant, un premier objet de l’invention est une méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique comprenant les étapes suivantes : - fournir un échantillon de liquide biologique, - ajouter le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin, d’halogénure d’alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2 M à 5 M et d’un pH de 3 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique, polymérique ou solide définissant un côté cis et un côté trans, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, - appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre -300 mV et +300 mV, de préférence entre -200 mV et +200 mV, de nature à favoriser le passage dudit au moins un biomarqueur peptidique, - enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz, et - analyser le signal électrique généré : o en déterminant un temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, o en déterminant un taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, o en analysant la forme du signal électrique généré, o en déterminant la déviation standard du signal mesuré lors du passage dudit biomarqueur peptidique au travers dudit nanopore, et o en déterminant le nombre d’événements, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de l’au moins un biomarqueur peptidique dans ledit liquide biologique. En effet, il a été découvert que l’analyse des caractéristiques du signal électrique permet à elle seule de différencier des peptides identiques mais de conformations différentes (telle qu’une structure secondaire, une conformation statistique ou une énantiomérie particulière), ou portant des modifications post-traductionnelles ou encore des peptides ne se différenciant par des séquences de quelques acides aminés seulement, voire un seul. Ainsi cette analyse de ces caractéristiques permet d’envisager la caractérisation dans des échantillons biologiques complexes de biomarqueurs se différenciant par leur conformation des modifications post- traductionnelles ou leur séquence d’acide aminés en utilisant les caractéristiques susmentionnées des signaux électriques générés par ces biomarqueurs dans le système senseur mentionné ci-dessus. Selon d’autres caractéristiques optionnelles de la méthode, cette dernière peut inclure facultativement une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, seules ou en combinaison : - l’au moins un biomarqueur peptidique correspond, pour un peptide donné, à la détection de la présence et/ou l’absence d’au moins une modification post-traductionnelle et/ou d’au moins une conformation dudit peptide ; en effet, la méthode de l’invention permet la caractérisation efficace de la présence dans un mélange de peptides qui ne présentent que de telles différences, sans équipement lourds et de manipulation compliquées, - l’au moins un biomarqueur peptidique a une taille comprise entre de 3 à 100 acides aminés ; - l’au moins un biomarqueur peptidique est sélectionné parmi : les histones H1, H2A, H2B, H3 et/ou H4, le peptide natriurétique de type B, les chimiokines, les interleukines, ou un de leurs récepteurs ou sa sous unité, l’adiponectine, NLRP3, la chaine A de l’insuline, la chaine B de l’insuline, un cytochrome C, le fibrinopeptide A (FPA), le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, la bradykinine, la des-arginine9 bradykinine, Aβ1-15, Aβ1-16, Aβ1-17, Aβ1-40, Aβ1- 42, Aβ11-40, Aβ17-40, Aβ17-42, ADA, ARTN, AXIN1, Beta-NGF, CASP- 8, CD40, CDCP1, CST5, DNER, CCL11, 4E-BP1, FGF-21, LAP TGF- beta-1, LIF, LIF-R, CSF-1, MMP-1, MMP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, CD244, NT-3, NRTN, OSM, OPG, FGF-23, FGF-5, FGF-19, Flt3L, GDNF, HGF, IFN-gamma, PD-L1, EN-RAGE, SLAMF1, SIRT2, STAMBP, SCF, ST1A1, CD6, CD5, CD8A, TSLP, TNFB, TRANCE, TRAIL, TGF-alpha, TWEAK, TNF, TNFSF14, TNFRSF9, uPA, et VEGF-A ; ces biomarqueurs présentent un intérêt particulier en médecine et en biotechnologie, - le signal électrique est récolté sur une période de temps d’au moins 1 minute ; en effet, un temps d’acquisition suffisamment long permet d’augmenter la précision, et la probabilité de détection du biomarqueur, - le système senseur comprend au moins deux systèmes senseurs ; multiplier les systèmes senseurs permet de gagner en sensibilité, - le liquide biologique est sélectionné parmi : le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalorachidien, du lavage bronchoalvéolaire, la salive, le liquide synovial, du liquide amniotique, de l’urine, un lysat cellulaire, un milieu de culture de cellules eucaryotes ou bactériennes ; en effet la méthode de l’invention est peu ou pas sensible au liquide biologique comprenant le au moins un biomarqueur ; - le ratio du volume de liquide biologique sur le volume de l’électrolyte dans le compartiment du côté cis de la membrane de l’au moins un système senseur est inférieur ou égal à 1/50 ; en effet la méthode selon l’invention est particulièrement sensible et permet donc de détecter le au moins un biomarqueur à des dilutions du liquide biologique, ce qui limite, s’il en est besoin, les risques d’interférences inopinées de certains composés du liquide biologique avec la fonction du nanopore d’aérolysine. Un deuxième objet de l’invention concerne une méthode de diagnostic d’une pathologie associée avec un trouble de la coagulation chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA- 6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : - fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, - introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin, d’halogénure d’alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2M à 5M et d’un pH de 4,1 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique définissant un côté cis et un côté trans, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, - appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre +1 mV et +300 mV, de préférence entre +10 mV et +100 mV, de préférence +50 mV de nature à favoriser le passage du FPA et de ses dérivés, - enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz, et - analyser le signal électrique généré, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence du FPA ou de ses dérivés dans ledit liquide biologique, un nombre d’événements détectés, dans ledit liquide biologique, pour l’un ou plusieurs des biomarqueurs sélectionnés parmi FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6, supérieur à celui d’un contrôle ou d’une valeur seuil déterminée pour des sujets ne comprenant d’événement thrombotique, étant le signe d’une augmentation de l’activité thrombotique chez ledit sujet. Une telle méthode est efficace dans la caractérisation et la quantification de biomarqueurs tels que FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6 du FPA et leurs différentes conformations qui sont en lien avec les processus de coagulation en cours dans l’organisme. Un troisième objet de l’invention concerne une méthode de diagnostic d’un angioœdème bradykinique chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant les étapes suivantes : - fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, - introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 3,1 à 10, un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, - appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre -300 mV et -1 mV, de préférence entre -100 mV et -10 mV, de préférence -50 mV, de nature à favoriser le passage de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine, - enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz, - analyser le signal électrique généré, ledit signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine ou de leurs différentes conformations dans le liquide biologique, la caractérisation de la présence de niveaux de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine supérieurs au contrôle ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème étant le signe de la présence d’un angioœdème bradykinique chez ledit sujet. Une telle méthode présente un intérêt significatif, car à présent il n’existe de méthode rapide de diagnostic de ces angioœdèmes qui ont une solution thérapeutique spécifique et différente des angioœdèmes histaminiques et pour lesquels le mauvais diagnostic peut avoir des conséquences vitales pour le sujet. Brève description des dessins D’autres caractéristiques, avantages et détails de l’invention seront mieux compris à la lecture du complément de description qui va suivre des modes de réalisations à titre d’exemple en relation avec les dessins annexés sur lesquels : La figure 1 représente les différents fragments issus de la fibrinolyse du fibrinogène, qui résulte en la libération du fibrinopeptide A (FPA), qui peut être dans l’organisme phosphorylé (FPA-P) ou non, ou clivé en sa partie terminale générant ainsi la perte de 3 (FPA-3) ou de 6 acides aminés (FPA-6). Le P cerclé d’une ligne pointillée indique l’emplacement de la phosphorylation présente dans FPA-P. La figure 2 représente une partie d’un système senseur utilisé dans la méthode selon l’invention comprenant la bicouche lipidique dans laquelle est enchâssée un nanopore d’aérolysine, dans un mélange d’électrolyte (4M KCl, 25 Tris HCl mM, pH7.5). La membrane définit un compartiment cis et un compartiment trans, le compartiment cis étant celui où se situe la partie du nanopore extérieure à la membrane. La différence de potentiel appliquée au système génère une force permettant d’attirer les peptides compris dans le mélange d’électrolyte dans le compartiment en cis par rapport à l’orientation du nanopore. Le signal électrique est détecté et analysé selon différents paramètres qui permettent d’identifier la présence des peptides dans le compartiment cis, à la suite de l’ajout du liquide biologique. La figure 3 est une représentation d’un signal électrique généré lors du passage d’un biomarqueur peptidique au travers du nanopore d’aérolysine, dans le système senseur utilisé dans la méthode. I0 est le courant ionique de base quand aucun analyte ne traverse le nanopore. Le passage du biomarqueur au travers du nanopore entraine une chute du courant mesuré Ib. ΔI représente donc le blocage du nanopore engendré par le passage de l’analyte. Le temps de blocage Dt est la durée que met l’analyte à perturber le courant. Cette durée correspond donc au temps de passage de l’analyte (le biomarqueur peptidique) au travers du nanopore ou au temps d’interaction de l’analyte avec le nanopore. La figure 4 représente l’analyse des signaux électriques générés par le FPA (panneau de gauche), FPA-P (milieu) et leur mélange (panneau de droite). La représentation, pour chaque événement, du courant de blocage en fonction du temps de blocage fait apparaitre les différentes populations, et permet de distinguer les deux espèces dans leur mélange (panneau de droite). La concentration dans le compartiment en cis du système senseur du FPA et du FPA-P, ajoutés seuls, est de 40 µM. La concentration de chacune de ces espèces dans le mélange de FPA et de FPA-P est de 10 µM. Les données sont filtrées à 5 kHz et enregistrées à des intervalles de 250 kHz. Sur la figure 5, le panneau supérieur représente l’analyse du signal électrique généré par un mélange de FPA (10 µM), FPA-P (20 µM), FPA-3 (10 µM) et FPA-6 (2.5 µM). La représentation du signal de chaque événement en fonction de ΔInorm en fonction de Dt permet clairement de différencier et détecter chacune des espèces et leur conformation. Le panneau inférieur est une représentation du ΔInorm en fonction du nombre d’événement pour le même mélange. Cette représentation permet d’estimer pour chaque espèce le temps de blocage normalisé moyen. La figure 6 présente pour chaque espèce de FPA et ses dérivés, la détermination du temps de blocage moyen. Une loi log-normale est utilisée. La figure 7 représente une analyse combinatoire des ΔInorm et des Dt d’un enregistrement du signal électrique d’un mélange comprenant du FPA (10 µM), FPA-P (20 µM), FPA-3 (10 µM) et FPA-6 (2.5 µM), à 50 mV. La figure 8 représente la détermination des différents ΔInorm pour la des-arginine9 bradykinine (2 µM, panneau de gauche) et la bradykinine (2 µM, panneau central) et leur mélange équimolaire (1,3 µM, panneau de droite). Pour la bradykinine comme pour la des-arginine9 bradykinine, deux conformations caractérisées chacune par un ΔInorm spécifique sont détectées. Une loi gaussienne est utilisée. Les acquisitions sont effectuées à une différence de potentiel de –50 mV et l’électrolyte du système senseur est du 4M KCL 25 mM Tris pH 7.5. La figure 9 représente une analyse combinatoire du ΔInorm et de Dt d’un enregistrement du signal électrique d’un mélange comprenant leur mélange équimolaire 1,3 µM de bradykinine et 1,3 µM de des-arginine9 bradykinine. On distingue sur cette représentation les deux conformations de la bradykinine (BK1 et BK2) et les deux conformations de la des-arginine9 bradykinine (DAB1 et DAB2). Les acquisitions sont effectuées à une différence de potentiel de –50 mV et l’électrolyte du système senseur est du 4M KCL 25 mM Tris pH 7.5. La figure 10 représente l’analyse d’un sérum comprenant 100 nM de des-arginine9 bradykinine. Le sérum a été dilué au centième dans le compartiment cis du système senseur. La représentation du nombre d’événements en fonction de leurs ΔInorm permet d’identifier les deux formes DAB1 et DAB2. Les signaux électriques ont été enregistrés sur 27 minutes. Les ΔInorm moyens déterminés en assumant une répartition gaussienne des données correspondent à ceux déterminés à la figure 9. Les acquisitions sont effectuées à une différence de potentiel de –50 mV et l’électrolyte du système senseur est du 4M KCL 25 mM Tris pH 7.5. La figure 11 représente la classification possible des peptides différents et de différentes conformations de ces peptides en fonction de la forme du signal électrique généré par le nanopore au contact de l’un des peptides BK1, BK2, DAB1 et DAB2. A) forme des signaux identifiées ; B) la représentation pour chaque événement de ΔInorm en fonction de Dt permet clairement de différencier des espèces. C) Diagramme d’analyse en d’analyse de composante principale après classification des blocages observés dans un mélange équimolaire de peptides de 100 nM ou 50 nM dans des conditions sans sérum (losange) montre que la forme du signal permet une classification des événements. La figure 12 représente un graphique montrant la proportionnalité de la fréquence des évènements de blocage de courant en fonction de la concentration en peptides, mélange équimolaire de BK1 et DAB1, pour DAB2 et BK2 pour des concentrations variant de 10 nM à 1 µM. La figure 13 représente les signaux électriques représentatifs générés lors du passage de la forme oxydée (A) ou réduite (B) des peptides L-AVP ou D-AVP qui se différentient par la présence par la forme énantiomérique de l’asparagine présente au résidu 8 de ces peptides de 9 acides aminés. La figure 14 est une autre représentation d’un signal électrique généré lors du passage d’un biomarqueur peptidique au travers du nanopore d’aérolysine, dans le système senseur utilisé dans la méthode. Des caractéristiques du signal y sont indiquées qui peuvent être utilisées pour caractériser chaque blocage telles que le taux de blocage minimum, moyen, maximum (ΔIbmin, ΔIb, ΔIbmax), l’écart-type (σ) et durée d’occupation (Dt). Description de modes de réalisation de l’invention Comme il ressort de ce qui précède, il est possible maintenant, suivant la méthode selon l’invention, de détecter à partir d’une mesure électrique et l’analyse de ses différentes composantes, de distinguer et caractériser directement dans un liquide biologique la présence de biomarqueurs peptidiques, qui se distinguent, par exemple, uniquement par au moins une modification post-traductionnelle ou leur conformation, et ce pour une même séquence primaire, et/ou une différence aussi faible d’un seul acide aminé. Cela est illustré par les données expérimentales accumulées par les chercheurs. Par exemple, la méthode selon l’invention permet de discriminer de manière certaine le FPA dans sa forme phosphorylée ou non et également différentes conformations du FPA, ce qui n’est pas possible par des méthodes basées sur la reconnaissance épitope/anticorps du fait de la proximité des séquences ou de masses moléculaires très proches voire identiques. Selon un autre exemple, la méthode selon l’invention permet de discriminer la bradykinine de la des-arginine9 bradykinine, et d’identifier la présence de différentes conformations de ces molécules, et ce directement dans du sérum humain sans traitement ou purification particulière. Selon encore un autre exemple, l’invention permet de différencier des peptides se distinguant uniquement par leur conformation, par exemple une structure secondaire ou une énantiomérie, tel que cela est démontré présentement pour la vasopressine et la desmopressine. Dans la suite de la description ci-après, on va décrire plus particulièrement à des fins d’illustration la mise en œuvre de la méthode selon l’invention pour la détection de biomarqueurs en fonction de leur conformation, leurs modifications post- transcriptionnelles ou leur séquence. Le courant de blocage normalisé ΔInorm, ou taux de blocage, se définit selon la formule suivante: ΔInorm=(I0-Ib)/I0 Dans laquelle - I0 est le courant passant au travers du nanopore quand le nanopore est libre, - Ib est le courant de blocage qui passe au travers du nanopore lorsque celui est obturé transitoirement lors du passage d’une molécule de biomarqueur peptidique au travers du nanopore. Le temps de blocage Dt est la durée d’occupation du nanopore par le biomarqueur et correspond à la durée de la chute de courant engendrée par le passage du biomarqueur peptidique ou de son temps d’interaction avec le nanopore. Le nombre d’événements correspond au nombre de chutes de courant observées sur une durée donnée en présence du ou d’un mélange de biomarqueurs peptidiques, pour un système senseur. Un événement correspond donc au passage d’une espèce au travers du nanopore ou une interaction prolongée avec celui-ci : sont considérés au sens de l’invention les événements d’une durée supérieure ou égale à 75 µs. Le nombre d’événements est donc associé à la concentration du biomarqueur peptidique. Un système senseur est par exemple décrit à la figure 2. Aux fins de la méthode selon l’invention, plusieurs systèmes senseurs peuvent être utilisés indépendamment et séparément. Bien que la méthode de l’invention soit particulièrement sensible et permet de détecter des concentrations en biomarqueur peptidique de l’ordre du nanomolaire, utiliser plusieurs systèmes senseurs en parallèle présente l’avantage d’augmenter le nombre d’événements analysés et par voie de conséquence de baisser encore plus le seuil de détection de la méthode selon l’invention. Egalement, utiliser un système senseur comprenant plusieurs nanopores d’aérolysine est possible, cependant cette configuration est moins préférée. Tout nanopore d’aérolysine fonctionnel est utilisable aux fins de la présente invention. Le nanopore d’aérolysine de Aeromonas hydrophila (référence uniprot P09167 ; https://www.uniprot.org/uniprotkb/P09167/entry) dit « sauvage » peut être utilisé. Un biomarqueur peptidique se définit comme un peptide dont la présence, la concentration ou l’absence dans un échantillon biologique est associée à un état pathologique, physiologique ou métabolique. Détectée au niveau d’un organisme d’un sujet, la présence, la concentration ou l’absence dans un échantillon biologique est associée avec la présence ou une augmentation du risque de l’occurrence d’un état pathologique, métabolique ou physiologique chez ledit sujet. Selon un mode de réalisation particulier, un biomarqueur peptidique pouvant être détecté avec la méthode de l’invention peut comprendre 3 à 100 acides aminés, voire 3 à 25 acides aminés. Aussi la méthode peut comprendre la soumission de l’échantillon biologique à une digestion enzymatique des peptides et protéines qu’il contient. La méthode selon l’invention est particulièrement adaptée à la détection de la présence et la quantification de biomarqueurs caractérisés par un polymorphisme important dans la population ou un polymorphisme spécifique en lien avec un état pathologique, physiologique ou métabolique (ce polymorphisme pouvant être en lien avec une conformation, une modification post-traductionnelle, un polymorphisme de séquence, etc… tels que décrit précédemment). Les biomarqueurs peptidiques détectés par la méthode selon l’invention peuvent être sélectionnés parmi le groupe de biomarqueurs peptidiques suivants : les histones H1, H2A, H2B, H3 et/ou H4, le peptide natriurétique de type B, les chimiokines telles que celles listées dans les tableaux 1, 2 et 3, l’adiponectine , NLRP3, la chaine A de l’insuline, la chaine B de l’insuline, un cytochrome C, une interleukine ou une de ses récepteurs ou une des sous unités de ce récepteur, le fibrinopeptide A (FPA), le FPA phosphorylé (FPA-P), le FPA3, le FPA6, la bradykinine (BK), la des-arginine9 bradykinine (DAB), Aβ1-15, Aβ1-16, Aβ1-17, Aβ1-40, Aβ1-42, Aβ11-40, Aβ17-40, Aβ17-42,ADA, ARTN, AXIN1, Beta-NGF, CASP- 8, CD40, CDCP1, CST5, DNER, CCL11, 4E-BP1, FGF-21, LAP TGF- beta-1, LIF, LIF-R, CSF-1, MMP-1, MMP-10, MCP-1, MCP-2, MCP- 3, MCP-4, CD244, NT-3, NRTN, OSM, OPG, FGF-23, FGF-5, FGF-19, Flt3L, GDNF, HGF, IFN-gamma, PD-L1, EN-RAGE, SLAMF1, SIRT2, STAMBP, SCF, ST1A1, CD6, CD5, CD8A, TSLP, TNFB, TRANCE, TRAIL, TGF-alpha, TWEAK, TNF, TNFSF14, TNFRSF9, uPA, VEGF-A. Les chimiokines sont une famille de petites protéines solubles, de 8-12 kilodaltons. Les chimiokines sont impliquées dans divers processus biologiques comme l’hématopoïèse et l’angiogenèse. A ce titre, elles peuvent être marqueur par exemple de la prolifération des tumeurs ou de l’inflammation. Elles sont pour la plupart caractérisées par la présence de quatre résidus cystéine en des positions conservées et essentiels à leur structure tridimensionnelle. On distingue 4 familles de chimiokine, en fonction, notamment, du positionnement des deux cystéines proximales de leur extrémité N-terminale. Les chimiokines CXC (tableau 1) présentent un acide aminé entre les deux premières cystéines, les chimiokines dites CC (cf tableau 2 spécifiant, mais non limitativement, les chimiokines CC humaines) présentent les deux premières cystéines adjacentes, les chimiokines dites CX3C (tableau 3, spécifiant, mais non limitativement, la chimiokine CX3C humaine), dont l'unique membre (la fractalkine) possède trois acides aminés entre les deux premières cystéines, les chimiokines C (la Lymphotactine alpha et beta) ne possèdent que 2 cystéines au total (cf tableau 3 spécifiant, mais non limitativement, les chimiokines C humaines). La méthode selon l’invention est particulièrement adaptée à caractériser et quantifier la présence dans un liquide biologique de telles protéines de structure et/ou séquences proches dont la présence est en lien avec un état pathologique, physiologique ou métabolique. Tableau 1 Chimiokines CXC Nom Référence Nom Référence Uniprot Uniprot CXCL1 P09341 CXCL10 P02778 CXCL2 P19875 CXCL11 O14625 CXCL3 P19876 CXCL12 P48061 CXCL4 P02776 CXCL13 O43927 CXCL5 P42830 CXCL14 O95715 CXCL6 P80162 CXCL15 Q9WVL7 CXCL7 P02775 CXCL16 Q9H2A7 CXCL8 P10145 CXCL17 Q6UXB2 CXCL9 Q07325 Tableau 2 Chimiokines CC Nom Référence Nom Référence Uniprot Uniprot CCL1 P22362 CCL16 O15467 CCL2 P13500 CCL17 Q92583 CCL3 P10147 CCL18 P55774 CCL4 P13236 CCL19 Q99731 CCL5 P13501 CCL20 P78556 CCL6 P27784 CCL21 O00585 CCL7 P80098 CCL22 O00626 CCL8 P80075 CCL23 P55773 CCL9/CCL10 P51670 CCL24 O00175 CCL11 P51671 CCL25 O15444 CCL12 Q62401 CCL26 Q9Y258 CCL13 Q99616 CCL27 Q9Y4X3 CCL14 Q16627 CCL28 Q9NRJ3 CCL15 Q16663 Tableau 3 Chimiokines C Référence nom Uniprot XCL1 P47992 XCL2 Q9UBD3 Chimiokines CX3C Référence nom Uniprot CX3CL1 P78423 Également, les interleukines (et certains de leurs récepteurs) sont des protéines connaissant un polymorphisme important dans la population et d’un intérêt tout particulier dans le cadre de l’étude des états inflammatoires des individus, du diagnostic de pathologies et de la compréhension des mécanismes inflammatoires sous-jacents à certaines pathologies (telle que par exemple la COVID-19). Des interleukines, ou un de leur récepteur, des formes différentes peuvent être détectées par la méthode de l’invention sont listées dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 Nom Référence uniprot Interleukine-1 alpha (IL-1 alpha) P01583 Interleukine-2 (IL-2) P60568 Interleukine-2 (sous unité beta du récepteur, IL-2RB) P14784 Interleukine-4 (IL-4) P05112 Interleukine-5 (IL5) P05113 Interleukine-6 (IL6) P05231 Interleukine-7 (IL-7) P13232 Interleukine-8 (IL-8) P10145 Interleukine-10 (IL10) P22301 Interleukine-10 (sous unité alpha du récepteur, IL-10RA) Q13651 Interleukine-10 (sous unité beta du récepteur, IL-10RB) Q08334 Interleukine 11 (IL-11) A8K3F7 Interleukine-12 (sous unité beta, IL-12B) P29460 Interleukine-13 (IL-13) P35225 Interleukine-15 (sous unité alpha du récepteur, IL-15RA) Q13261 Interleukine-17A (IL-17A) Q16552 Interleukine-17C (IL-17C) Q9P0M4 Interleukine-18 (IL-18) Q14116 Interleukine-18 receptor 1 (IL-18R1) Q13478 Interleukine-20 (IL-20) Q9NYY1 Interleukine-20 (sous unité alpha du récepteur, IL-20RA) Q9UHF4 Interleukine-22 (sous unité alpha 1 du récepteur,IL-22 RA1) Q8N6P7 Interleukine-24 (IL-24) Q13007 Interleukine-33 (IL-33) O95760 Plus généralement, la méthode est également particulièrement adaptée pour l’identification de biomarqueurs en lien avec les autres protéines de l’inflammation listées dans le tableau 5 ci-dessous. Tableau 5 Nom Référence Référence uniprot Nom uniprot Adenosine Deaminase Fibroblast growth (ADA) P00813 factor 23 (FGF-23) Q9GZV9 Artemin (ARTN) Q5T4W7 Fibroblast growth factor 5 (FGF-5) Q8NF90 Axin-1 (AXIN1) O15169 Fibroblast growth factor 19 (FGF-19) O95750 Fms-related Beta-nerve growth factor (Beta-NGF) P01138 tyrosine kinase 3 P49771 ligand (Flt3L) Caspase-8 (CASP-8) Q14790 Glial cell line- P39905 derived neurotrophic factor (GDNF) CD40L receptor Hepatocyte growth (CD40) P25942 factor (HGF) P14210 CUB domain- containing protein 1 Q9H5V8 Interferon gamma P01579 (IFN-gamma) (CDCP1) Programmed cell Cystatin D (CST5) P28325 death 1 ligand 1 Q9NZQ7 (PD-L1) Delta and Notch-like epidermal growth Q8NFT8 Protein S100-A12 P80511 factor-related (EN-RAGE) receptor (DNER) Signaling lymphocytic Eotaxin (CCL11) P51671 Q13291 activation molecule (SLAMF1) Eukaryotic translation initiation factor Q13541 SIR2-like protein Q8IXJ6 2 (SIRT2) 4E-binding protein 1 (4E-BP1) Fibroblast growth STAM-binding factor 21 (FGF-21) Q9NSA1 protein (STAMBP) O95630 Latency-associated peptide transforming growth P01137 Stem cell factor P21583 (SCF) factor beta-1 (LAP TGF-beta-1) Leukemia inhibitory Sulfotransferase factor (LIF) P15018 1A1 (ST1A1) P50225 Leukemia inhibitory T cell surface factor receptor P42702 glycoprotein CD6 Q8WWJ7 (LIF-R) isoform (CD6) Macrophage colony- T-cell surface stimulating factor 1 P09603 glycoprotein CD5 P06127 (CSF-1) (CD5) Matrix T-cell surface metalloproteinase-1 P03956 glycoprotein CD8 P01732 (MMP-1) alpha chain (CD8A) Matrix Thymic stromal metalloproteinase- P09238 lymphopoietin Q969D9 10 (MMP-10) (TSLP) Monocyte chemotactic protein P13500 TNF-beta (TNFB) P01374 1 (MCP-1) TNF-related Monocyte activation- chemotactic protein P80075 O14788 induced cytokine 2 (MCP-2) (TRANCE) TNF-related Monocyte apoptosis- chemotactic protein P80098 P50591 inducing ligand 3 (MCP-3) (TRAIL) Monocyte Transforming chemotactic protein Q99616 growth factor P01135 4 (MCP-4) alpha (TGF-alpha) Tumor necrosis Natural killer cell factor (Ligand) receptor 2B4 (CD244) Q9BZW8 O43508 superfamily, member 12 (TWEAK) Neurotrophin-3 (NT- Tumor necrosis 3) P20783 factor (TNF) P01375 Tumor necrosis factor ligand Neurturin (NRTN) Q99748 superfamily O43557 member 14 (TNFSF14) Tumor necrosis factor receptor Oncostatin-M (OSM) P13725 Q07011 superfamily member 9 (TNFRSF9) Urokinase-type Osteoprotegerin (OPG) O00300 plasminogen P00749 activator (uPA) Vascular endothelial P15692 growth factor A (VEGF-A) Le peptide natriurétique de type B (BNP) est un marqueur bien connu de l’insuffisance cardiaque. Le précurseur du BNP est sécrété par les cellules musculaires cardiaques des oreillettes et des ventricules. La synthèse en est augmentée en cas de distension de ce tissu. Le BNP est notamment un biomarqueur de l’insuffisance cardiaque aiguë. Le BNP compte 32 acides aminés. Les histones sont des éléments du nucléosome, qui comprend 2 copies de chacun des quatre histones et une portion d’ADN de 147 paires de bases. Les modifications post-traductionnelles des histones sont nombreuses telles que, par exemple, l’acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitylation, sumoylation, ADP-ribosylation, déamination, et proline isomérisation ou citrullination. Ces modifications sont fortement impliquées dans les mécanismes épigénétiques de régulation des gènes, et constituent autant de biomarqueurs de certaines pathologies telles que la sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer, le sepsis. La méthode selon l’invention est particulièrement adaptée à caractériser et quantifier la présence dans un liquide biologique de telles protéines de structure et/ou séquences proches présentant des modifications post-traductionnelles, dont la présence est en lien avec un état pathologique, physiologique ou métabolique. L’adiponectine (référence Uniprot : Q15848) est une protéine dont les niveaux plasmatiques sont inversement corrélés avec le risque de pathologies métaboliques telles que l’insulino-résistance, le diabète ou encore le syndrome métabolique. Le niveau d’adiponectine est notamment utilisé dans l’orientation diagnostique et la prise en charge thérapeutique des syndromes de lipodystrophie et de résistance sévère à l’insuline. NLRP3 (référence Uniprot : Q96P20) est une protéine faisant partie d’un des complexes inflammasomes, et qui est identifiée comme biomarqueur de l’état d’inflammation d’un organisme. Des niveaux élevés des protéines constituants des inflammasomes sont détectées dans les biofluides des patients souffrant de pathologies inflammatoires chroniques telles que le diabète, HIV, la Bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), la pneumonie, le psoriasis l’arthrite psoriasique, la dégénérescence maculaire, les pathologies neurodégénératives. Plus particulièrement, NRLP3 est décrite comme biomarqueur de pronostic dans la septicémie, ou de diagnostic des pathologies neuroinflammatoires telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, la sclérose latérale amyotrophique. Par exemple, des niveaux supérieurs de NLRP3 plasmatique sont détectés chez des sujets souffrant de la maladie de Parkinson. Les références Uniprot citées sont communément accessibles sur le site https://www.uniprot.org/ qui recense les données de séquences et fonctionnelles issues de la recherche internationale. Aβ1-15, Aβ1-16, Aβ1-17, Aβ1-40, Aβ1-42, Aβ11-40, Aβ17-40, Aβ17-42 correspondent aux différents peptides issus du peptide amyloïdes retrouvés notamment dans le liquide céphalo rachidien des sujets atteints de la maladie d’Alzheimer. Un liquide biologique s’entend de tout échantillon liquide sécrété, produit ou isolé d’un organisme vivant. Plus particulièrement, un tel liquide biologique peut comprendre : le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalorachidien, du lavage bronchoalvéolaire, la salive, le liquide synovial, le liquide amniotique, de l’urine, un lysat cellulaire, un milieu de culture de cellules eucaryotes ou bactériennes. Bien que cela ne soit pas nécessaire, ledit liquide biologique peut- être traité avant son application au système senseur, le prétraitement visant à faciliter la détection, ou l'identification du ou des biomarqueur(s) peptidique(s) présents dans le liquide biologique. Le FPA est un peptide de 16 acides aminés, provenant de la protéolyse de l’extrémité amino-terminale de la chaîne Aα du fibrinogène. Il peut subir diverses dégradations en son extrémité N-terminale générant ainsi plusieurs peptides d’une taille inférieure à 16 acides aminés, notamment par exemple les peptides FPA-3 et FPA-6. Une augmentation de la phosphorylation de FPA est rapportée chez les patients ayant subi des interventions chirurgicales. Ainsi, « FPA et ses dérivés » comprend tous les peptides issus d’une dégradation, coupure ou modification post-traductionnelle du FPA. « FPA et ses dérivés » comprend notamment les peptides sélectionnés dans le groupe constitué de FPA, FPA-3, FPA-6, FPA-P illustrés figure 1. Sujet, dans le cadre des méthodes d’identification d’au moins un biomarqueur peptidique et des méthodes diagnostiques de l’invention s’entend d’un mammifère, de préférence un humain. Méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique. Comme évoqué précédemment la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique selon l’invention permet de détecter la présence ou l’absence dudit au moins un biomarqueur peptidique, et ce que celui-ci varie faiblement en taille, ou en conformation ou en modification post-traductionnelle. Cette méthode est particulièrement avantageuse au regard des méthodes usuelles de reconnaissance par des anticorps dédiés qui ne permettent pas ou de manière insatisfaisante d’identifier spécifiquement au sein d’un échantillon des biomarqueurs de séquences proches du fait des réactions croisées. En outre cette méthode est particulièrement aisée à mettre en œuvre et ne nécessite notamment pas de prétraitement du liquide biologique comme cela peut être le cas pour d’autres méthodes telles que par exemple la spectrométrie. En outre la spectrométrie de masse, ne permet pas à elle seule la caractérisation de peptides se différenciant uniquement par leur conformation énantiomérique. Les méthodes susmentionnées ne permettent pas non plus de différencier et de quantifier les conformations statistiques d’un peptide (les structures secondaires transitoires des peptides), encore moins au sein d’un échantillon biologique. En outre cette méthode peut facilement et rapidement être mise en œuvre au plus proche du patient et des soins. Dans la méthode d’identification d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique selon l’invention, l’électrolyte est une solution d’halogénure de métal alcalin ou d’alcalino-terreux ou leur mélange. Ledit électrolyte peut être choisi parmi le groupe constitué par LiCl, NaCl, KCl ou KBr, RbCl, CsCl, KF, le chlorure d’ammonium, le chlorure de tétraméthylammonium, BeCl2, CaCl2, MgCl2, SrCl2, BrCl2, BaCl2 ou toute combinaison de ceux-ci. KCl est particulièrement préféré. La concentration de l’électrolyte est comprise entre 2M et 5M, bornes comprises. Le pH de la solution d’électrolyte peut varier, par exemple en fonction du biomarqueur que l’on souhaite caractériser et/ou détecter. Ce pH ne doit pas cependant être de nature à remettre en cause la structure ou l’activité du nanopore d’aérolysine du système senseur. Ainsi, le pH de la solution d’électrolyte est compris entre de 3 à 10. Avantageusement, le pH peut être choisi pour augmenter la force motrice via le changement de la sélectivité du nanopore, ainsi que la charge nette du biomarqueur peptidique analysé. La température de l’au moins un système senseur est telle qu’il n’y a pas formation de cristaux de glace et/ou que le nanopore d’aérolysine ne se dénature pas. Dans certaines instances, placer le système senseur à température basse, par exemple inférieure à 15°C, voire inférieure à 10°C présente l’avantage de ralentir les événements et donc de permettre de caractériser plus aisément des composantes du signal électrique associé au passage d’un biomarqueur peptidique. Inversement, placer le au moins système senseur à une température élevée, par exemple une température supérieure à 40°C, supérieure à 45 °C, voire supérieure à 55 °C, peut permettre de dénaturer au moins en partie le biomarqueur peptidique et ainsi de faciliter son passage au travers du nanopore d’aérolysine. Ainsi, l’au moins un système senseur, dans la méthode de l’invention, est à une température de 5 °C à 55 °C. Dans le système senseur utilisé dans la méthode de l’invention, la membrane dans laquelle est inséré le nanopore d’aérolysine est : - soit de nature lipidique, constituée, par exemple, de diphytanoylphosphatidylcholine, 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3- phosphocholine DLPC ; 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3- phosphocholine DDPPC ; 1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3- phosphocholine DEPC ou leur mélange, - soit de nature polymérique, à base de polymères diblock (poly(1,2-butadiène)-b-poly(éthylène oxide) ou triblock PDMS- PMOXA-PDMS qui présente l’avantage de contrôler plus facilement le nombre de nanopores formés dans le système, mais également présentant une meilleure stabilité qu’une membrane lipidique dans le temps et soumise à des différences de potentiel électrique élevées (> 200 mV). Dans la méthode de l’invention, la fréquence d’acquisition varie de 100 kHz à 1 MHz, de préférence de 250 kHz et 400 KHz. La fréquence d’acquisition peut notamment être ajustée en fonction de la taille du biomarqueur ; en effet plus les peptides sont de petite taille plus la détection adéquate des événements nécessite une fréquence d’acquisition importante. Avantageusement, un filtre de Bessel est utilisé. Le filtre de Bessel utilisé sera lui aussi ajusté en fonction de la taille des biomarqueurs (il peut avoir pour valeur une fréquence variant de 1 kHz à 100 kHz). Ce filtre Bessel permet de diminuer le bruit sans modifier l’information contenue dans le signal électrique. Dans la méthode de l’invention, les analytes (biomarqueurs peptidiques) sont directement ajoutés dans le compartiment cis de la membrane de l’au moins un système censeur. Un tel système senseur est illustré à la figure 2. Ledit au moins un biomarqueur peptidique ajouté en cis peut être compris dans le liquide biologique sans traitement de ce dernier visant à faciliter la détection dudit au moins un biomarqueur. Ledit liquide biologique peut également avoir été soumis à un traitement préalable visant à faciliter la détection de l’au moins un biomarqueur tel que, par exemple, une filtration, un fractionnement, une précipitation, l’ajout de réactif visant à rajouter au moins un groupement sur au moins un des acides aminés dudit biomarqueur. Comme mentionné précédemment, néanmoins, les prétraitements tels qu’une filtration, un fractionnement, une précipitation ou tout autre traitement visant à une purification ou une concentration sont moins souhaitables car ils induisent souvent une perte en sensibilité. Ce traitement préalable peut par exemple viser à modifier la charge de l’au moins un biomarqueur peptidique de manière à faciliter sa translocation du côté cis au côté trans de la membrane du système senseur à l’application de la différence de potentiel. Cela est avantageux dans les cas où l’au moins un biomarqueur peptidique que l’on souhaite caractériser et/ou détecter présente une charge neutre ou insuffisante. Ce traitement peut également comprendre un traitement enzymatique visant à produire des peptides à partir d’une protéine biomarqueur de grande taille, dans le but de détecter et caractériser au moins un de ces peptides par le système senseur de l’invention. Ce traitement peut également comprendre l’utilisation de conditions suffisamment dénaturantes de manière à dissocier des complexes impliquant les biomarqueurs peptidiques dont on souhaite détecter la présence, et/ou déplier au moins en partie des structures secondaires ou tertiaires. Le liquide biologique peut être compris dans le groupe comprenant le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalorachidien, du lavage bronchoalvéolaire, la salive, le liquide synovial, le liquide amniotique, de l’urine, un lysat cellulaire, un milieu de culture de cellules eucaryotes ou bactériennes. Comme le montre la figure 9, la méthode de l’invention permet l’identification de biomarqueurs peptidiques dans un liquide biologique tel que le sérum, qui est un liquide biologique complexe sans traitement préalable. Ainsi, cela peut éviter une perte en sensibilité, en raison de la perte de biomarqueurs du fait de ces traitements, notamment la filtration, un fractionnement, une précipitation et contribue également à la rapidité de mise en œuvre de la méthode. La digestion enzymatique des peptides dans le liquide biologique est moins sujette à une perte en sensibilité en lien avec la perte de biomarqueurs, et présente l’avantage de pouvoir s’intéresser à la caractérisation de la présence de grosses molécules (e.g. les peptides de 25 acides aminés ou plus (soit environ plus de 2,75 kDa). A la figure 4, on a utilisé le FPA et le FPA-P dans un système senseur selon la méthode de l’invention. La représentation pour chaque événement du ΔInorm en fonction de la durée de blocage permet d’identifier une signature spécifique pour FPA et FPA-P. La méthode de l’invention permet de mettre au jour deux signaux pour FPA-P, FPA-P1 et FPA-P2. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, on pense que ces deux signaux correspondent à deux confirmations différentes du peptide FPA-P, induite par la phosphorylation du peptide. Comme illustré dans le panneau de droite de la figure 3, la méthode permet d’identifier la présence de FPA, et FPA-P dans un mélange. Ainsi la méthode selon l’invention permet de distinguer jusqu’à une unique modification post- traductionnelle d’un biomarqueur peptidique, telle que par exemple, une phosphorylation. En outre, la distinction de plusieurs conformations pour une même espèce permet d’inférer un gain en sensibilité et spécificité pour ladite méthode. En effet une telle information additionnelle augmente la probabilité de la détection et l’identification correcte du biomarqueur peptidique. La représentation de ΔInorm en fonction du nombre d’événements permet d’aboutir, en ce qui concerne FPA, à la détermination d’un taux de blocage moyen de 0,64±0,01, 0,70±0,01 pour FPA-P1 et 0,61±0,01 pour FPA-P2. La méthode de l’invention est ainsi suffisamment puissante pour permettre la détection de modifications post- traductionnelles uniques et/ou des conformations différentes d’un même biomarqueur peptidique. Ces performances sont confirmées par les données présentées à la figure 5, où l’on voit que l’analyse du signal électrique d’un mélange de FPA, FPA-P, FPA-3 et FPA-6, permet d’identifier la présence de ces espèces sans ambigüité dans ce mélange. Le panneau supérieur de la figure 5 montre les signatures spécifiques de ces biomarqueurs peptidiques telles que déterminées par la représentation du taux de blocage en fonction de la durée de blocage du nanopore. Le panneau inférieur de la figure 5 montre la détermination du taux de blocage moyen pour chacune des espèces déduites en fonction du nombre d’événements. Un taux de blocage moyen de 0,64±0,01, 0,70±0,01 pour FPA-P1, de 0,62±0,01 pour FPA-P2, de 0,56±0,01 pour FPA-3 et de 0,44±0,01 pour FPA-6. La méthode selon l’invention permet donc de discriminer des peptides se différenciant par des clivages en N-terminal, une confirmation et/ou une modification post- traductionnelle, en mélange, en utilisant par exemple le ΔInorm ou le ΔInorm moyen tels que définis ci-dessus. La figure 6 montre la détermination pour chacune des espèces FPA, FPA-3, FPA-6 et FPA-P, qu’il est possible de déterminer un temps d’occupation moyen pour chacune de celles- ci, qui leur est spécifique, malgré la similitude de ces peptides. Comme illustré, celui-ci est obtenu en reportant le temps de blocage de chaque événement en fonction du nombre d’événements et en estimant ainsi le temps d’occupation moyen par l’ajustement à une distribution gaussienne. Des temps d’occupation moyens de 5,74±0.22 ms pour FPA, de 0,62±0,04 ms pour FPA-P1, de 4,41±0.33 ms pour FPA-P2, de 2,50±0,12 ms pour FPA-3, et de 0,95±0.04 ms pour FPA-6 sont ainsi déterminés. Ainsi, il est déterminé que le signal électrique peut être utilisé pour déterminer des caractéristiques telles que : - le temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, - le taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, - la forme du signal électrique qui, étant spécifique des biomarqueurs peptidiques, peut être utilisée pour les différencier quand bien même ces différences consistent seulement en une unique modification post- traductionnelle ou des clivage N-terminaux, - le nombre d’événements qui permettent de déterminer la concentration du biomarqueur peptidique identifié, ou - la déviation standard du signal mesuré lors du passage dudit biomarqueur peptidique. Ces données du signal électrique, étant trouvées spécifiques des biomarqueurs peptidiques, peuvent être utilisées pour les différencier, et en caractériser la présence et la concentration, quand bien même ces différences consistent seulement en une unique modification post-traductionnelle ou des clivages N-terminaux. Comme expliqué par la suite, ces données permettent également de différencier des conformations différentes d’un même biomarqueur peptidique, en rapport avec structure secondaire (par exemple due à un pont disulfure, mais également une conformation statistique particulière) voire même un ou des énantiomères. Les inventeurs ont identifié que l’analyse des caractéristiques susmentionnées du signal électrique suffit à elle seule à détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de biomarqueurs peptidiques se différenciant par des caractéristiques aussi ténues que la présence d’une ou plusieurs modifications post- traductionnelles ou d’un ou plusieurs clivages N-terminaux, une conformation. La détermination de la concentration des peptides dans un système de détection avec un nanopore est connue de l’art, elle est basée sur la relation linéaire entre la fréquence des événements la concentration (Pastoriza-Gallego M, Rabah L, Gibrat G, Thiebot B, van der Goot FG, Auvray L, Betton JM, Pelta J. Dynamics of unfolded protein transport through an aerolysin pore. J Am Chem Soc. 2011 Mar 9;133(9):2923-31). Dans un mode de réalisation particulier, les biomarqueurs peptidiques de la méthode selon l’invention sont identifiés et caractérisés par l’analyse couplée d’au moins deux paramètres du signal électrique tels que ceux décrits ci-dessus, cela permet d’augmenter la résolution de la méthode et d’améliorer la discrimination et l’identification des biomarqueurs peptidiques. Dans un mode de réalisation particulier, les biomarqueurs peptidiques de la méthode selon l’invention sont identifiés et caractérisés par l’analyse couplée d’au moins deux paramètres du signal électrique sélectionnés parmi : - le temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, - le taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, - la forme du signal électrique qui, étant spécifique des biomarqueurs peptidiques, peut être utilisée pour les différencier quand bien même ces différences consistent seulement en une unique modification post- traductionnelle ou des clivages N-terminaux, - le nombre d’événements qui permettent de déterminer la concentration du biomarqueur peptidique identifié, ou - la déviation standard du signal mesuré lors du passage dudit biomarqueur peptidique. Dans un mode de réalisation particulier, les biomarqueurs peptidiques de la méthode selon l’invention sont identifiés et caractérisés par l’analyse couplée : - du temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, avec le taux de blocage moyen, minimum médian et/ou maximum, ou - du temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, avec la forme du signal électrique, ou - du temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, avec la déviation standard du signal électrique, ou - du taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum, avec la déviation standard du signal électrique, ou - du taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum, avec la forme du signal électrique. Dans un mode de réalisation encore plus particulier de la méthode selon l’invention, analyser le signal électrique généré comprend : - déterminer le taux de blocage moyen, et - déterminer le temps de blocage moyen tel que décrit ci-dessus. Ainsi, ces données peuvent être utilisées dans des représentations bidimensionnelles telles qu’illustrées à la figure 7 qui montrent que chaque population d’événements, et donc chaque biomarqueur peptidique peut clairement être caractérisé et identifié au sein d’un mélange de biomarqueurs peptidiques. Dans un mode de réalisation encore plus particulier de la méthode selon l’invention, analyser le signal électrique généré comprend : - déterminer un temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, - déterminer un taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, - analyser la forme du signal électrique généré, - déterminer la déviation standard du signal mesuré lors du passage dudit biomarqueur peptidique au travers dudit nanopore, et - déterminer le nombre d’événements. Comme le montre la partie expérimentale, la combinaison de ces caractéristiques permet de différencier les biomarqueurs selon des variations de leur séquence primaire, la présence et/ou l’absence d’au moins une modification post- traductionnelle et/ou d’au moins une conformation dudit peptide. La figure 8 illustre la mise en œuvre de la méthode de l’invention pour la bradykinine. La bradykinine et la des- arginine9 bradykinine sont caractérisées chacune par deux conformations détectées par le système senseur de la méthode selon l’invention. Des taux de blocage de 0,47 et 0,75 sont déterminés pour la bradykinine (formes BK1 et BK2), et des taux de blocage de 0,69 et de 0,32 pour la des-arginine9 bradykinine (forme DAB1 et DAB2). De la même manière, des temps d’occupation correspondant à chacune des espèces sont déterminés (non montré). La représentation bidimensionnelle de la figure 9 confirme que les biomarqueurs peptidiques sont efficacement identifiés et discriminés par une analyse couplée de deux paramètres du signal électrique, en l’occurrence ici le temps de blocage et le taux de blocage. La figure 10 confirme la caractérisation dans un sérum humain de la présence de des-arginine9 bradykinine, par l’identification de deux conformations caractérisées par un taux de blocage moyen de 0,32±0,004 et de 0,72±0,002. Cela est cohérent avec les taux de blocage déterminés pour les peptides purifiés (figure 8). La figure 11 montre qu’il est possible d’assigner des caractéristiques telles que la forme générale du signal aux formes BK1, BK2, DAB1, DAB2 dans un fluide biologique tel que le sérum, cette caractéristique permettant une assignation du signal au peptide même à faible concentration (50 nM). La figure 12 montre que l’analyse du signal permet de déterminer la concentration du biomarqueur, la fréquence de celui-ci étant linéaire avec les concentrations des peptides biomarqueurs testés. Dans un autre cas, l’analyse statistique des signaux électriques a permis aux inventeurs d’identifier de manière surprenante que la déviation standard (figure 14, σ) du signal permet la détection, l’identification et la différenciation de peptides tels que la vasopressine (L-AVP) et un énantiomère synthétique (D-AVP, précurseur de la desmopressine) se différenciant par la présence l’énantiomère de l’arginine 8 présent dans le peptide. Des signaux électriques spécifiques pour ces protéines dans leur forme réduite ou oxydée sont observées, mais également en fonction de l’énantiomère de l’arginine 8 présent dans le peptide ont été identifiés (figure 13 A et B). Outre la simple observation d’une différence de signal, il a également été déterminé par analyse des composantes principales et une analyse statistique des données que la déviation standard (caractéristique notée σ figure 14) permet la détection et la différenciation de D-AVP et de la vasopressine L-AVP. Ainsi, de manière tout à fait inattendue, l’analyse des différentes caractéristiques du signal électrique du nanopore est suffisante pour permettre à elle seule la caractérisation des échantillons biologiques en permettant de détecter de manière rapide et directe des biomarqueurs dans un échantillon de liquide biologique, se différenciant par leur séquence, leur conformation, et/ou leur modification post- traductionnelle. Dans la méthode selon l’invention la durée d’enregistrement des événements est au moins d’une minute. Plus la durée d’enregistrement est longue et plus la probabilité de détecter un biomarqueur faiblement représenté dans le liquide biologique est importante ; la sensibilité et la spécificité de la méthode s’en trouvent également améliorées. Ainsi la durée d’enregistrement des événements est au moins de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, voire au moins 120 min. Également, la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique selon l’invention peut comprendre l’utilisation de plusieurs systèmes senseurs indépendants, démultipliant ainsi la probabilité de détection d’un biomarqueur peptidique faiblement représenté dans le liquide biologique. Alternativement, une membrane comprenant plusieurs nanopores peut être utilisée. Ainsi dans ce mode de réalisation un système senseur comprend plusieurs nanopores. Egalement, plus la différence de potentiel appliquée est importante, plus la sensibilité de la méthode est importante. Ainsi la différence de potentiel appliquée est inférieure ou égale, en valeur absolue, à 300 mV, inférieure ou égale à 250 mV, inférieure ou égale à 200 mV, inférieure ou égale à 150 mV, inférieure ou égale à 100 mV, ou encore inférieure ou égale à 50 mV. De manière évidente, lorsque l’au moins un biomarqueur peptidique recherché est chargé négativement, la différence de potentiel appliquée est positive, et inversement lorsque l’au moins un biomarqueur peptidique recherché est chargé positivement, la différence de potentiel appliquée est négative. Dans la méthode selon l’invention, le ratio du volume de l’électrolyte sur le volume du liquide biologique dans le compartiment cis est supérieur à 10, supérieur à 50, supérieur à 75, supérieur à 100, supérieur à 500, voire supérieur à 1000. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode selon l’invention, les valeurs des paramètres du signal électrique caractérisant un biomarqueur peptidique recherché sont préalablement établies. Par exemple par l’analyse du biomarqueur peptidique purifié par le système senseur de l’invention. Ainsi, la méthode selon l’invention comprend une étape de comparaison des valeurs de paramètres du signal électrique obtenues lors de l’analyse du liquide biologique avec les paramètres caractérisant le biomarqueur peptidique prédéterminés, tels que par exemple pour une préparation de biomarqueur peptidique pur ou purifié. Ladite méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique selon l’invention peut donc être implémentée dans des applications biotechnologiques, mais également dans des méthodes diagnostiques pour la mesure et l’identification directe de biomarqueurs très divers, dans des milieux complexes, se différenciant par des caractéristiques pouvant être infimes, non détectables par exemple par une simple analyse de masse, comme démontré ci- dessus et illustré dans les figures. Ainsi d’autres objets de la présente invention sont des méthodes diagnostiques implémentant les étapes de la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique telle que décrite ci-dessus. Méthodes de diagnostic d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique. Diagnostic de pathologies en lien avec les troubles de la coagulation. Comme le montrent les données expérimentales illustrées notamment par les figures présentées ici, la méthode selon l’invention est particulièrement adaptée à la détection de FPA et de ses dérivés. Le FPA est un produit du clivage du fibrinogène par la thrombine. Le FPA et ses dérivés sont associés à l’occurrence d’une coagulation dans l’organisme. Le FPA et ses dérivés sont donc utilisés dans le diagnostic ou le suivi des maladies de la coagulation ou associés à la coagulation. Les troubles de la coagulation sont associés avec de nombreuses et diverses pathologies, telles que les thromboses veineuses, la coagulation intravasculaire disséminée qui jouent un rôle dans de nombreux cancers (du poumon, pancréas, prostate, de l'estomac, gastro-intestinal, la leucémie), la cardiopathie ischémique, la COVID-19, l’AVC, le lupus érythémateux disséminé. Ainsi la détection de FPA ou de ses dérivés dans un liquide biologique issu d’un sujet reflète l’activation de la fibrine et donc un événement thrombotique. Également, pour certains cancers, l’activation de la cascade thrombotique peut être associée à un facteur de mauvais pronostic chez le patient souffrant de cancer. Ainsi un deuxième objet de l’invention concerne la détection d’une thrombogénèse chez un sujet comprenant la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet. Dans un mode de réalisation particulier cette méthode permet le diagnostic d’une pathologie associée avec un trouble de la coagulation chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet. Cette méthode diagnostique d’une pathologie associée avec un trouble de la coagulation de l’invention comprend la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique exposée ci-dessus et adaptée dans tous ses modes de réalisation, au FPA et à ses dérivés. Dans un mode de réalisation particulier, un nombre d’événements détectés, dans un liquide biologique, pour l’un ou plusieurs des biomarqueurs sélectionnés parmi FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6, supérieur à celui d’un contrôle, ou d’une valeur seuil déterminée pour des sujets ne comprenant d’événement thrombotique est le signe d’une augmentation de l’activité thrombotique chez le sujet. Dans un mode de réalisation particulier, cette détection d’une thrombogénèse chez un sujet comprend la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA- 6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : - fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, - introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou d’alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 4,1 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, - appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre +1 mV et +300 mV, entre +10 mV et +100 mV, de préférence de +50 mV, de nature à favoriser le passage du FPA et de ses dérivés, - enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz, et - analyser le signal électrique généré, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence du FPA ou de ses dérivés dans ledit liquide biologique, un nombre d’événements détectés, dans ledit liquide biologique, pour l’un ou plusieurs des biomarqueurs sélectionnés parmi FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6, supérieur à celui d’un contrôle ou d’une valeur seuil déterminée pour des sujets ne comprenant d’événement thrombotique, étant le signe d’une augmentation de l’activité thrombotique chez ledit sujet. Diagnostic des angioedèmes bradykiniques. Les angioedèmes (AE) bradykiniques (BK) sont caractérisés par des épisodes d’œdèmes sous-cutanés ou sous-muqueux pouvant mettre en jeu le pronostic vital en cas de localisation pharyngée. Aucun examen biologique en urgence ne permet d’affirmer le diagnostic. Le dosage de la bradykinine n’est pas réalisable en pratique courante. Cette complication aigüe est donc souvent confondue avec l’angiœdème d’origine allergique, ce qui peut faire errer le diagnostic et la prise en charge spécifique et mettre en jeu le pronostic vital. D’autres atteintes graves sont les crises douloureuses abdominales responsables d’un syndrome subocclusif, voire plus rarement d’un choc hypovolémique (javaud et al, 2016). La prise en charge des crises graves implique un diagnostic et un traitement rapide. Il existe donc un besoin non satisfait concernant un test diagnostic permettant : - de caractériser la bradykinine dans un liquide biologique, et de - détecter et quantifier la présence de la bradykinine et de la des-arginine9 bradykinine Comme illustré figures 8 et 9 la méthode selon l’invention permet d’identifier et de quantifier la bradykinine ainsi que la des-arginine9 bradykinine dans un liquide biologique. Ainsi un troisième objet de l’invention concerne une méthode de diagnostic d’un angioœdème bradykinique chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant la détection de la bradykinine et/ou de la des- arginine9 bradykinine ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet. Cette méthode diagnostique d’un angioœdème bradykinique comprend la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique exposée ci-dessus et adaptée dans tous ses modes de réalisation, la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine ou de leurs mélanges. Dans un mode de réalisation particulier, un nombre d’événements détectés, dans un liquide biologique, pour la bradykinine et/ou pour la des-arginine9 bradykinine, supérieur à celui détecté dans un échantillon contrôle, ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème, est le signe de la présence d’un angioœdème bradykinique chez le sujet. Un objet particulier de l’invention est une méthode diagnostique d’un angioœdème bradykinique chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant les étapes suivantes : - fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, - introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 3,1 à 10, un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, - appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre - 300 mV et -1 mV, entre -100 mV et -10mV, de préférence - 50 mV, de nature à favoriser le passage de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine, - enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz, - analyser le signal électrique généré, ledit signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine ou de leurs différentes conformations dans le liquide biologique, la caractérisation de la présence de niveaux de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine supérieurs au contrôle ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème étant le signe de la présence d’un angioœdème bradykinique chez ledit sujet. Un autre objet de l’invention est une méthode de traitement d’un angioœdème bradykinique chez le sujet comprenant les étapes suivantes : - fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, - introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 3,1 à 10, un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, - appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre - 300 mV et -1 mV, entre -100 mV et -10 mV, de préférence -50 mV, de nature à favoriser le passage de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine, - enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz, - analyser le signal électrique généré, ledit signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine ou de leurs différentes conformations dans le liquide biologique, et - administrer au sujet un traitement spécifique des angioœdèmes bradykiniques en cas de la caractérisation de la présence de niveaux de la bradykinine et/ou de la des- arginine9 bradykinine supérieurs au contrôle ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème.

Claims

REVENDICATIONS 1. Méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique comprenant les étapes suivantes : - fournir un échantillon de liquide biologique, - ajouter le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin, d’halogénure d’alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2 M à 5 M et d’un pH de 3 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique définissant un côté cis et un côté trans, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, - appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre -300 mV et +300 mV, de préférence entre -200 mV et +200 mV, de nature à favoriser le passage dudit au moins un biomarqueur peptidique, - enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz, et - analyser le signal électrique généré : o en déterminant un temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, o en déterminant un taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, o en analysant la forme du signal électrique généré, o en déterminant la déviation standard du signal mesuré lors du passage dudit biomarqueur peptidique au travers dudit nanopore, et o en déterminant le nombre d’événements, - ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de l’au moins un biomarqueur peptidique dans ledit liquide biologique. 2. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’au moins un biomarqueur peptidique correspond, pour un peptide donné, à la présence et/ou l’absence d’au moins une modification post- traductionnelle et/ou d’au moins une conformation dudit peptide. 3. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle l’au moins un biomarqueur peptidique a une taille comprise entre de 3 à 100 acides aminés. 4. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle l’au moins un biomarqueur peptidique est sélectionné parmi : les histones H1, H2A, H2B, H3 et/ou H4, le peptide natriurétique de type B, les chimiokines, les interleukines ou un de leurs récepteurs ou sa sous unité, l’adiponectine, NLRP3, la chaine A de l’insuline, la chaine B de l’insuline, un cytochrome C, le fibrinopeptide A (FPA), le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, la bradykinine, la des- arginine9 bradykinine, Aβ1-15, Aβ1-16, Aβ1-17, Aβ1-40, Aβ1-42, Aβ11-40, Aβ17-40, Aβ17-42,ADA, ARTN, AXIN1, Beta-NGF, CASP-8, CD40, CDCP1, CST5, DNER, CCL11, 4E-BP1, FGF-21, LAP TGF-beta-1, LIF, LIF- R, CSF-1, MMP-1, MMP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, CD244, NT-3, NRTN, OSM, OPG, FGF-23, FGF-5, FGF-19, Flt3L, GDNF, HGF, IFN-gamma, PD-L1, EN-RAGE, SLAMF1, SIRT2, STAMBP, SCF, ST1A1, CD6, CD5, CD8A, TSLP, TNFB, TRANCE, TRAIL, TGF-alpha, TWEAK, TNF, TNFSF14, TNFRSF9, uPA, VEGF-A. 5. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le signal électrique est récolté sur une période de temps d’au moins 1 minute. 6. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le système senseur comprend au moins deux systèmes senseurs. 7. Méthode selon l’une des revendications précédentes dans laquelle le liquide biologique est sélectionné parmi : le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalorachidien, du lavage bronchoalvéolaire, la salive, le liquide synovial, du liquide amniotique, de l’urine, un lysat cellulaire, un milieu de culture de cellules eucaryotes ou bactériennes. 8. Méthode selon l’une des revendications précédentes dans laquelle le ratio du volume de liquide biologique sur le volume de l’électrolyte dans le compartiment du côté cis de la membrane de l’au moins un système senseur est inférieur ou égal à 1/50. 9. Méthode de diagnostic d’une pathologie associée avec un trouble de la coagulation chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : - fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, - introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin, d’halogénure d’alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2M à 5M et d’un pH de 4,1 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique définissant un côté cis et un côté trans, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, - appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre +1 mV et +300 mV, de préférence entre +10 mV et +100 mV, de préférence +50 mV, de nature à favoriser le passage du FPA et de ses dérivés, - enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz, et - analyser le signal électrique généré, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence du FPA ou de ses dérivés dans ledit liquide biologique, un nombre d’événements détectés, dans ledit liquide biologique, pour l’un ou plusieurs des biomarqueurs sélectionnés parmi FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6, supérieur à celui d’un contrôle ou d’une valeur seuil déterminée pour des sujets ne comprenant d’événement thrombotique, étant le signe d’une augmentation de l’activité thrombotique chez ledit sujet. 10. Méthode de diagnostic d’un angioœdème bradykinique chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant les étapes suivantes : - fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, - introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 3,1 à 10, un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, - appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre - 300 mV et -1 mV, de préférence entre -100 mV et -10 mV, de préférence de -50 mV, de nature à favoriser le passage de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine, - enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 MHz, - analyser le signal électrique généré, ledit signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine ou de leurs différentes conformations dans le liquide biologique, la caractérisation de la présence de niveaux de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine supérieurs au contrôle ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème étant le signe de la présence d’un angioœdème bradykinique chez ledit sujet.
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