EP4638703A1 - Nouvelle souche de carnobacterium maltaromaticum et ses utilisations - Google Patents

Nouvelle souche de carnobacterium maltaromaticum et ses utilisations

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Publication number
EP4638703A1
EP4638703A1 EP23836803.9A EP23836803A EP4638703A1 EP 4638703 A1 EP4638703 A1 EP 4638703A1 EP 23836803 A EP23836803 A EP 23836803A EP 4638703 A1 EP4638703 A1 EP 4638703A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
cncm
cfu
monocytogenes
maltaromaticum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23836803.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Cécile MANGAVEL
Frédéric BORGES
Anne-Marie REVOL-JUNELLES
Marcia LEYVA-SALAS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National Polytechnique de Lorraine
Original Assignee
Institut National Polytechnique de Lorraine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National Polytechnique de Lorraine filed Critical Institut National Polytechnique de Lorraine
Publication of EP4638703A1 publication Critical patent/EP4638703A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B11/00—Preservation of milk or dairy products
    • A23B11/60—Preservation of cheese or cheese preparations
    • A23B11/65—Preservation of cheese or cheese preparations by addition of preservatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
    • A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
    • A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B2/783—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/1203—Addition of, or treatment with, enzymes or microorganisms other than lactobacteriaceae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the subject of the invention is a specific strain of Carnobacterium ma/taromaticum, a bacterial preparation comprising at least said strain and their use in the preparation of a food product.
  • Certain companies specializing in the production and marketing of microorganisms offer biopreservative/bioprotective microbial cultures with properties For example, it is known that certain strains of Lactobacillus piantarum have anti-Listeria activity.
  • a strain of L. piantarum is notably marketed under the HOLDBAC® brand as a bio-preservation/bioprotection ferment.
  • the Inventors have identified a new strain of C. mattaromaticum possessing particularly useful biopreservation properties. Unexpectedly, the presence of this strain leads to a rapid decrease in the quantity of the pathogen, indicating that this strain makes it possible to inhibit the population of L monocytogenes. Furthermore, unlike the strains of C. mattaromaticum already identified, this new strain inhibits L monocytogenes without forming an inhibition halo on agar medium in a competition test, suggesting an original mechanism of action.
  • one aspect of the invention relates to the strain C. mattaromaticum CNCM I-5804.
  • the strain CNCM 1-5804 induces quenching of luminescence, which demonstrates its ability to inhibit L. monocytogenes.
  • CNCM 1-5804 with at least one other strain of C. maitaromaticum induces inhibition of L monocytogenes that is much more effective than with the strains of C. maitaromaticum used alone.
  • This synergistic effect of strain CNCM 1-5804 with other strains of C. maltaromaticum reveals a promising potential to reduce the amount of L monocytogenes in a cheese-type food.
  • Another aspect of the invention relates to a bacterial preparation comprising the strain CNCM 1-5804.
  • bacterial preparation is meant a composition packaged for the growth of Carnobacterium maltaromaticum, said composition comprising a viable strain of C. maltaromaticum and essential components for the growth of the bacteria, such as a source of carbon and energy, a source of potassium and phosphorus, a source of calcium, a source of magnesium, lipids, proteins or amino acids.
  • Said bacterial preparation may comprise a culture medium or a culture medium extract.
  • Said medium can be the TSB-YE medium (Tryptone Soy Broth-Yeast Extract).
  • Said culture medium may be a synthetic medium.
  • synthetic medium according to the present invention is meant a medium into which characterized individual components are introduced and subjected to rigorous quantitative and qualitative control.
  • Said culture medium can also be a natural medium.
  • natural environment a medium which contains one or more natural compounds in its composition.
  • Said natural medium may be milk (whole, semi-skimmed or skimmed), in particular raw, thermized, pasteurized milk or UHT milk (sterilized at Ultra High Temperature).
  • Said bacterial preparation may be in liquid or solid form.
  • the concentration of C. maltaromaticum, in particular of the strain CNCM 1-5804, in said bacterial preparation of the invention can be from 10 2 CFU.mL- 1 to 10 11 CFU.mL 1 , in particular from 10 5 CFU.mL 1 to 10 7 CFU.mL 1 , more particularly from at least 10 5 CFU.mL 1 , or from at least 10 6 CFU.mL 1 , or from at least 10 7 CFU.mL- 1 , relative to the total volume of the bacterial preparation. In one embodiment of the invention, the concentration of C.
  • maltaromaticum in particular of the strain CNCM 1-5804, in said bacterial preparation of the invention can be 10 2 CFU.mL- 1 , 10 3 CFU.mL - 1 , 10 4 CFU.mL- 1 , 10 5 CFU.mL- 1 , 106 CFU.mL- 1 , 10 7 CFU.mL- 1 , 10 8 CFU.mL 1 , 10 9 CFU.mL 1 , 10 10 CFU.mL 1 or 10 11 CFU.mL- 1 , relative to the total volume of the bacterial preparation.
  • said bacterial preparation contains a quantity of C. maltaromaticum, in particular of the strain CNCM I-5804, of 10 2 CFU.g 1 to 10 11 CFU.g 1 , in particular of 10 5 CFU.g 1 to 10 7 CFU.g 1 , of at least 10 5 CFU.g- 1 , or of at least 10 6 CFU.g 1 , or of at least 10 7 CFU.g 1 , relative to the total weight of the bacterial preparation.
  • the concentration of C. maltaromaticum, in particular of the strain CNCM I-5804, in said bacterial preparation of the invention can be 10 2 CFU.g 1 , 10 3 CFU.g 1 , 10 4 CFU.g 1 , 10 5 CFU.g 1 , 10 6 CFU.g- 1 , 10 7 CFU.g 1 , 10 8 CFU.g 1 , 10 9 CFU.g 1 , 10 10 CFU.g 1 or 10 11 CFU.g 1 , relative to the total weight of the bacterial preparation.
  • said bacterial preparation is a liquid concentrate, a frozen concentrate or a lyophilisate.
  • concentrate means a liquid containing a quantity of bacteria greater than 10 5 CFU.mL 1 , in particular greater than 10 10 CFU.mL 1 , in particular greater than 10 11 CFU.mL 1 , relative to the total volume of the concentrate. .
  • the concentrate can be obtained by any conventional method, for example by centrifugation or by microfiltration of a culture of C. maltaromaticum after appropriate incubation.
  • lyophilisate is meant the product obtained after lyophilization of a culture of C. maltaromaticum after appropriate incubation.
  • adapted incubation is meant an incubation according to a conventional method to obtain an initial population of C. maltaromaticum close to 10 7 CFU.mL 1 , relative to the total volume of the incubation.
  • the incubation of C. maltaromaticum can be carried out at 30°C for 48 hours in pasteurized whole milk.
  • said bacterial preparation is a concentrate, optionally frozen, comprising pasteurized whole milk and at least 10 7 CFU.mL- 1 of C. maltaromaticum CNCM I-5804, relative to the total volume of the bacterial preparation .
  • said bacterial preparation is a concentrate, optionally frozen, comprising UHT whole milk and at least 10 7 CFU.mL- 1 of C. maltaromaticum CNCM I-5804, relative to the total volume of the bacterial preparation .
  • said bacterial preparation may further comprise at least one lactic ferment and/or at least one ripening ferment.
  • said bacterial preparation is a protective culture of C. maltaromaticum.
  • the term "protective culture of Carnobacterium maitaromaticurri” means a composition containing C. maltaromaticum bacteria which can be added to food products to inhibit the growth of pathogenic or toxic microorganisms for humans or animals and present in said food products, in order to reduce the risk of contamination of the food product by these pathogenic or toxic microorganisms.
  • said pathogenic or toxic microorganism is a bacterium of the Listeria genus, in particular Listeria monocytogenes.
  • Said protective culture may be in the form of a liquid concentrate or in the form of a lyophilisate.
  • the bacterial preparation further comprises at least one strain of C. maltaromaticum different from CNCM I-5804.
  • the bacterial preparation further comprises at least one strain of C. maltaromaticum exhibiting a halo of inhibition in a competition test on agar medium with L. monocytogenes.
  • the bacterial preparation further comprises at least one strain of C. maltaromaticum chosen from the strains CNCM 1-5242 and CNCM 1-5243.
  • the bacterial preparation further comprises the strain CNCM I-5242.
  • the bacterial preparation further comprises the strain CNCM I-5243.
  • the bacterial preparation further comprises the strain CNCM I-5242 and the strain CNCM I-5243.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the C. maltaromaticum strain CNCM I-5804, of a bacterial preparation described above or of a protective culture described above, in the preparation of a food product .
  • strain CNCM I-5804 the bacterial preparation described above or the protective culture described above is used to inhibit the growth of bacteria of the Listeria genus, in particular L. monocytogenes, in a food product.
  • the expression “inhibition of Listen'd' means the reduction of the growth, the blocking of the growth or the decline of bacteria of the genus Listeria.
  • Said protective culture of the invention can be used in the production of fermented or non-fermented dairy products, in particular in the production of cheeses or fermented milks.
  • said food product is a fermented dairy product, in particular cheeses, such as soft cheeses, cooked or uncooked pressed cheeses, fresh cheeses, goat cheeses, sheep cheeses, or fermented milks.
  • Said protective culture of the invention can also be used in the production of other dairy products, such as cream, ice cream, butter, or secondary products derived from milk, such as whey, casein, or other prepared food products containing milk as an ingredient or constituents milk.
  • Said protective culture of the invention can also be used in the production of drinks, for example fruit juices, drinks obtained with mixtures of milk and fruit juices, soy milk, oat milk, almond milk, rice milk or fermented plant products.
  • Said protective culture of the invention can also be used in the production of food products based on fish, such as smoked trout or smoked salmon.
  • Said protective culture of the invention can also be used in the production of processed plant food products (vegetable sausages for example).
  • the use of the protective culture of the invention during the manufacture of food products makes it possible to inhibit bacteria of the Listeria genus which persist in a food product in small quantities and to extend the shelf life of said food product.
  • the protective culture of C. ma/taromaticum according to the present invention is added to food products depending on the type of product.
  • the protective culture is added before or at the same time as the lactic ferments or after their addition.
  • the protective culture can be added, at the start of the production line, during the production line or at the end of the production line and in particular before packaging the food product.
  • the protective culture of C. ma/taromaticum according to the present invention is added to a liquid food product to reach a level of 102 CFU.mL-i to 10" CFU.mL-i, in particular 10$ CFU.mL-i to 10 CFU.mL-1, more particularly at least 10 6 CFU.mL- 1 , in particular between 10 6 CFU.mL- 1 and 10 7 CFU.mL- 1 , relative to the total volume of said liquid food product; or added to a solid food product to reach a level of 10 2 CFU.g 1 to 10 11 CFU.g 1 , in particular from 10 5 CFU.g 1 to 10 7 CFU.g 1 , of at least 10 5 CFU. g 1 , or at least 10 6 CFU.g 1 , or at least 10 7 CFU.g 1 , relative to the total weight of said solid food product, during the storage period of said food product.
  • Another aspect of the invention relates to a process for preparing a cheese, in particular a soft cheese or an uncooked pressed cheese, using the strain CNCM I-5804 or a bacterial preparation containing said strain.
  • Said method comprises:
  • seeding with the CNCM I-5804 strain can be carried out in milk, in whey, in brine, or directly on the cheese paste.
  • seeding when the seeding is done on the cheese paste, it can be carried out by spraying or spraying a liquid preparation comprising the CNCM I-5804 strain onto the cheese paste.
  • “Inoculation during milk processing” in cheese making means inoculation during storage, pre-ripening, coagulation, draining, molding, pressing, salting, ripening, care or washing.
  • the seeding when the seeding is done in milk, the seeding can be carried out with or without cold maturation of the milk.
  • seeding into milk with the CNCM I-5804 strain can be carried out before or simultaneously with the seeding of lactic ferments.
  • the seeding of the CNCM I-5804 strain is carried out 0 to 8 hours before that of the lactic ferments.
  • the milk used in said process may be milk, whole or not, raw or pasteurized or having undergone heat treatment.
  • “Pasteurized whole milk” means whole milk. having undergone heat treatment, for example at 71.5°C for 15 seconds, then quickly cooled to 4°C.
  • the milk is inoculated with the CNCM I-5804 strain at a rate of 10 2 CFU.mL- 1 to 10 11 CFU.mL- 1 , in particular from 10 6 CFU.mL- 1 to 10 7 CFU.mL- 1 , relative to the volume of milk.
  • seeding with the CNCM I-5804 strain is carried out in conjunction with seeding of at least one bacterium different from CNCM I-5804, preferably a lactic acid bacteria.
  • the seeding is carried out by a bacterial preparation comprising the strain CNCM I-5804 and at least one bacterium different from CNCM I-5804, preferably a lactic acid bacteria.
  • the bacteria other than CNCM I-5804 is a proteobacterium.
  • the lactic acid bacteria other than CNCM I-5804 is chosen from the group comprising the genera Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus and Staphylococcus.
  • the seeding with the strain CNCM I-5804 is carried out in conjunction with a seeding of at least one strain of C. maltaromaticum different from CNCM I-5804, in particular the strain CNCM I-5242 and/or strain CNCM I-5243.
  • the seeding is carried out by a bacterial preparation comprising the strain CNCM I-5804 and at least one strain of C. maltaromaticum different from CNCM I-5804, in particular the strain CNCM I-5242 and/or the strain CNCM I-5243.
  • the inoculated milk is incubated at a temperature of at least 2°C, preferably at least 30°C.
  • the inoculated milk is incubated at a temperature of 2°C to 65°C. In one embodiment, the inoculated milk is incubated at a temperature of at least 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, 10°C, 11°C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50° C, 55°C, 60°C or 65°C.
  • the invention therefore also relates to food products, such as those described above, comprising the strain CNCM I-5804.
  • Another aspect of the invention relates to a method for reducing microbial contamination during the manufacturing process of a fermented dairy product comprising the addition of an inhibitory quantity of the CNCM I-5804 strain or of a bacterial preparation containing the strain CNCM I-5804.
  • the present invention also provides a method for reducing contamination by bacteria of the Listeria genus during the manufacturing process of a fermented dairy product, characterized in that it comprises the addition of a quantity of 10 2 CFU.mL- 1 at 10 11 CFU.mL- 1 , in particular from 10 6 to 10 7 CFU.mL 1 , relative to the volume of the dairy product, of the strain CNCM I-5804 or of a bacterial preparation comprising the strain CNCM I-5804
  • FIG.1 Demonstration of different types of mechanisms of inhibition of L. monocytogenes by strains of C. mattaromaticum: (A), C. mattaromaticum CNCM I-5804; (B), C. mattaromaticum CNCM I-5242
  • FIG.2 Growth of Listeria monocytogenes in cheese matrices previously inoculated with the strains of Carnobacterium maitaromaticum CNCM I-5804 and CNCM I-5242 alone or in a mixture: (A), at 12°C; (B), at 30°C.
  • FIG.4 Example of luminescence kinetics of the indicator strain Listeria monocytogenes EGDelux alone (EGDElux) or in the presence of the biopreservation strain C. maitaromaticum CNCM I-5804 (CNCM I-5804).
  • FIG.6 Coefficients of variation (CV) of the inhibition forces measured at the three dilution levels.
  • FIG.7 Counts of L. monocytogenes in cheese production in the absence and presence of the CNCM 1-5804 strain.
  • FIG.8 (A) Verification of a - Listeria monocytogenes activity of supernatants of bioprotection strains; (B) Search for potential incompatibilities between CNCM 1-5804 and other bioprotection strains; 1: control (TSBYE); 2: HOLDBAC®, 3: CNCM 1-5242 from culture stored at -80°C, 4: CNCM 1-5243 from culture stored at -80°C, 5: CNCM 1-5243 from freeze-dried culture .
  • CNCM I-5242 and CNCM I-5804 Pre-cultures of Carnobacterium ma/taromaticum (CNCM I-5242 and CNCM I-5804) are made from aliquots frozen at -80°C. 100 ⁇ L of these aliquots are each added to a 15 mL Falcon tube containing 10 mL of TSB-YE, then incubated at 30°C for 24 h.
  • Petri dishes containing TSA-YE agar medium are inoculated with 1.5 ⁇ L of each of the Carnobacterium maitaromaticum cultures. Seeding is carried out in the center of each box of agar medium. These boxes are incubated for 24 hours at 30°C.
  • a pre-culture of the mixture of 5 strains of Listeria monocytogenes is carried out in TSB-YE medium, at 30°C.
  • the culture is diluted in supercooled TSA-YE in order to reach an OD of approximately 0.01 (i.e. approximately 10 6 CFU/mL).
  • 15 mL of seeded liquid agar are delicately poured onto the first agar plates, so as to create a second layer.
  • the boxes are incubated at 30°C for 24 h.
  • Example 2 Monitoring L. monocytogenes in a real cheese matrix
  • CNCM I-5804 and CNCM I-5242 are made from aliquots frozen at -80°C. 100 ⁇ L of these aliquots are each added to a 15 mL Falcon tube containing 10 mL of TSB-YE, then incubated at 30°C for 24 h.
  • the aliquot is thawed at room temperature then centrifuged at 5000 g for 5 minutes. The supernatant is removed and the pellet is taken up in the same volume of sterile physiological water. These steps are carried out one second times. The mixture is then diluted in cascade to a concentration of 5.0 ⁇ 10 5 CFU/mL in sterile physiological water.
  • the cheese samples are prepared from pieces of Saint-Nectaire AOP dairy. For the same test, the cheeses belong to the same batch. These cheeses are cut into pieces of approximately 10 g (+/- 1.5 g) after removing the rind. Each piece is placed in an individual screw cap pill bottle. A well is then dug in the center of the pieces using a Durham bell.
  • the pieces of cheese are then inoculated or not with the strains of C. maltaromaticum, according to the following methods:
  • each cheese of each type is taken out of the proofer.
  • Each piece is homogenized in a Stomacher (3 X 3 min) in a bag with side filter containing 90 mL of sterile sodium citrate buffer.
  • the mixture is diluted in cascade (1 mL of mixture + 9 mL of sodium citrate buffer) until the appropriate dilution.
  • 100 or 200 ⁇ L of the dilutions are then spread on PALCAM selective medium in duplicates.
  • the boxes are incubated for 24 to 48 hours at 30°C.
  • Results growth of L. monocytogenes in cheese matrix
  • the results obtained highlight the inhibitory effect of the CNCM 1-5804 strain, used alone or in mixture with the CNCM 1-5242 strain ( Figure 2A, Figure 2B).
  • the addition of the CNCM I-5804 strain alone allows a reduction in the quantity of L. monocytogenes of approximately 0.7 log in the cheese matrix after 27 days ( Figure 2A).
  • the addition of the CNCM I-5804 strain allows a reduction in the quantity of L monocytogenes whatever the incubation duration ( Figure 2B): this reduction is very clearly greater than 1 log for all durations. incubation tested and the quantity of L monocytogenes counted in the cheese matrix then never exceeds 1.5.10 4 CFU/g.
  • This first microplate is then replicated by transferring 5 pL from each well to a new microplate containing 145 ⁇ L of TSBYE per well.
  • 10 mL of TSBYE are inoculated with a starter culture of the C. maltaromaticum strain CNCM I-5804. All of these cultures (microplate and culture of the biopreservative strain) are incubated for 22 hours at 30°C.
  • the microplate containing the collection of Listeria monocytogenes strains is diluted by decimal dilutions in a microplate up to 1/1000.
  • the inoculated agar plates are then incubated at 37°C for 48 h before counting the L. monocytogenes colonies.
  • This experiment is also carried out without addition of biopreservative strain C. maltaromaticum CNCM I-5804 in order to produce controls.
  • the reduction factor in the density of L. monocytogenes by the strain C. maltaromaticum CNCM I-5804 is obtained by calculating the ratio of the population densities of L. monocytogenes in the presence of the strain C. maltaromaticum CNCM I-5804 to those obtained in the witnesses.
  • the co-culture experiment is repeated 3 times.
  • Example 4 Anti-Z.. monocytogenes activity of C. mattaromaticumC C 1-5804 in different food matrices
  • the objective of this work is to determine whether the C. ma/taromaticum strain CNCM I-5804 is capable of inhibiting the growth of an indicator strain of L. monocytogenes (L monocytogenes EGDelux) in preparations from different food matrices. of interest.
  • L. monocytogenes L monocytogenes EGDelux
  • These matrices include matrices of animal and plant origin, including alternatives to animal products. A recent study suggests that these alternatives constitute particularly favorable environments for the growth of different food pathogens, including L monocytogenes. These data motivate the choice of these matrices for the present study.
  • matrices are of animal or vegetable origin: smoked trout, vegetable sausage, UHT almond milk, UHT oat drink and UHT soy milk.
  • Laboratory media consist of trypticase soy broth (TSB) (Biokar Diagnostics, Paris, France) supplemented with 6 gL 1 of yeast extract (YE) (Biokar Diagnostics, Paris, France), without or with addition of 2 .5 gL 1 of glucose.
  • the liquid matrices (laboratory broths and drinks) were used as is for the tests, while the solid matrices were subject to the preparation of juice, by cutting in sterile conditions, adding physiological water and grinding in a stomacher. .
  • 140 g was used with a physiological water proportion of 1:1 (w/w).
  • 180 g was used with a physiological water proportion of 2:1 (w/w).
  • the homogenized matrices are distributed in the wells of different microplates (Corning) at a rate of 135 pL per well, and stored at -80°C until the tests.
  • the C. maltaromaticum strain CNCM I-5804 is streaked on trypticase-soy agar with yeast extract (TSAYE) consisting of TSBYE broth amended with 15 gL 1 of bacteriological agar (BD), then incubated for 48 h at 30°C. An isolate is then transferred into the wells of a microplate (Corning 3370, Corning Inc., NY, USA) denoted GO (generation 0) containing 150 pL of TSBYE each before incubation for 24 h at 30°C.
  • TAYE yeast extract
  • GO generation 0
  • G1 generation 1
  • glycerol at the end of the incubation, 10 pL from each well are transferred into the wells of new microplates (Corning 3370) denoted G1 (generation 1) containing 110 pL of TSBYE per well.
  • G1 generation 1
  • these G1 microplates are supplemented with glycerol at a rate of 30 ⁇ L per well to reach a final concentration of 10% (v/v).
  • These microplates containing glycerol cultures of C. maltaromaticum CNCM I-5804 serve as working collections and are stored at -80°C until testing.
  • the bioluminescent strain L monocytogenes EGDelux (Riedel et al., 2007) is streaked on agar with PALCAM selective supplement (Biokar Diagnostics, Allonne, France) incubated at 30°C for 24 h. An isolate is then transferred to 10 mL of TSBYE incubated at 30°C for 24 h. Glycerol is added to the starter culture obtained to reach a final concentration of 10% (v/v). The homogeneous mixture is distributed in 1.5 mL aliquots frozen at -80°C until use.
  • the measurement of the anti-Z.. monocytogenes activity of C. maltaromaticum CNCM I-5804 is based on its co-culture with the bioluminescent strain L monocytogenes GGe ⁇ . 48 hours before co-culture, a G1 microplate (generation 1) is thawed and 15 pL of cultures are transferred to the wells of a microplate (Corning 3370) containing 135 pL per well of selected matrix. This pre-culture microplate marked G2 is incubated for 48 hours at 30°C. After incubation, the G2 microplates containing C.
  • CNCM I-5804 are diluted by decimal dilution up to 1/10,000, by transferring 15 ⁇ L of cultures into microplates noted G3) containing 120 pL per well of selected matrix. These different dilutions make it possible to evaluate the magnitudes of the inhibitory effects exerted by the biopreservation strain at different inoculum levels.
  • the microplates corresponding to the dilutions of factors 10 2 (D2), 10 3 (D3) and 10 4 (D4) are opaque white microplates (Corning 3917) suitable for reading luminescence by limiting the diffusion of inter-well light, and are those that are the subject of co-cultures.
  • L. monocytogenes EGDelux is cultured by transferring 100 ⁇ L of starter into 10 mL of TSBYE and incubation at 30 °C. This culture is washed twice before use for co-culture. Each wash is done by centrifugation at 5000 g for 5 min, removal of the supernatant and resuspension of the pellet in sterile physiological water. This culture is then diluted 1/10,000 in physiological water and 15 ⁇ L of this dilution are transferred to the wells of the G3 microplates (D2, D3 and D4) immediately after preparation.
  • the measurement of anti-Z.. monocytogenes activity is carried out by kinetic monitoring of luminescence.
  • the co-cultures are incubated with axial shaking at 30°C for 36 h and their luminescence is measured every 20 min using an Infinite 200 plate reader (Tecan).
  • the experiment was the subject of 3 independent repetitions for each matrix.
  • L. monocytogenes EGDelux by C. mattaromaticum CNCM I-5804 is done by calculating the luminescence disturbance indicator (LDI, Luminescence Disturbance Indicator):
  • n designates the number of measurements
  • l the luminescence expressed in an arbitrary unit and t the time in seconds.
  • a derived relative measure, the luminescence inhibition indicator LDIr, is calculated as follows:
  • LDIc Where LDI designates a value obtained under any condition and LDIc the value obtained in the absence of inhibition, that is to say the LDI of the bioluminescence control strain L. monocytogenes EGDelux alone.
  • the index used is 100-LD/r.
  • this value is 0 for the L. monocytogenes EGDelux control and a positive value indicates inhibition of luminescence.
  • Figure 4 presents an example of luminescence kinetics of the indicator strain L. monocytogenes EGDelux in the absence or presence of biopreservation strain C. mattaromaticum CNCM I-5804.
  • the level of luminescence produced by the indicator strain reflects its specific growth rate.
  • the decrease in the level of luminescence of the indicator strain compared to the control (EGDelux) when it was cultivated in the presence of the biopreservation strain (C. mattaromaticum CNCM I-5804) indicates an inhibition of its growth.
  • the relative luminescence disturbance indicator (LDIr) was calculated in order to summarize the measured luminescence kinetics.
  • a derived measurement, 100-LDIr makes it possible to obtain a strength value of the inhibition of luminescence exerted by the biopreservation strain.
  • the results show that at the D3 inoculum level, and in all the matrices tested, the C. mattaromaticum strain CNCM I-5804 exerted an inhibitory effect on the indicator strain L. monocytogenes EGDelux ( Figure 5). The highest level of inhibition measured was in the TSB control medium without glucose, where the C. maitaromaticum strain CNCM I-5804 inhibited 96.6% ⁇ 2.4% of the luminescence of the indicator strain.
  • the levels of luminescence quenching of the indicator strain by C. maitaromaticum CNCM I-5804 were particularly high in the vegetable sausage matrices (91.3% ⁇ 3.5%), smoked trout (90.3% ⁇ 3. 4%) and soy drink (87.8% ⁇ 4.9%), and comparable to the level of inhibition observed in the TSBYE laboratory environment with glucose (88.3 ⁇ 7.8%).
  • the inhibition levels of the luminescent strain were high, although to a lesser extent, in oat drink 72.6% ⁇ 3.1%) and in almond milk (59.6% ⁇ 3.2%). %).
  • Sensitivity of the inhibitory properties of the C. maitaromaticum strain CNCM I-5804 at the inoculum level The use of three dilution levels of the C. maltaromaticum strain C CM 1-5804, namely 10 2 (D2), 10 3 (D3) and 10 4 (D4) made it possible to calculate, for each matrix, the coefficient of variation in inhibition forces at all dilutions ( Figure 6). These coefficients of variation provide information on the sensitivity of the inhibitory activity to the level of inoculation of the biopreservative strain. The results show that the inhibition properties of the C. maltaromaticum strain CNCM I-5804 vary significantly depending on the level of almond milk inoculum (99.1% variation).
  • the co-cultures of the indicator strain with C. maltaromaticum CNCM I-5804 show on the one hand that the biopreservation strain has a high capacity for inhibiting L monocytogenes EGDelux in all the matrices selected and more particularly in matrices derived from vegetable sausage, smoked trout and soy drinks.
  • the inoculation of the C. maltaromaticum strain CNCM I-5804 at different levels (1/100, 1/1000 and 1/10000) showed that its inhibitory capacities were little affected by these levels for the matrices derived smoked trout, vegetable sausage (25% ⁇ CV ⁇ 50%), and soy drink (CV ⁇ 25%).
  • the objective of this work is to evaluate the anti-Z.. monocytogenes effect of a strain of C. maltaromaticum (CNCM I-5804) in a soft cheese model. These challenge tests were carried out at UMRF (Aurillac).
  • a production included 2 vats of 5 L of milk (2 cheeses of 250g/vat) including 1 test vat with L monocytogenes and C. maltaromaticum CNCM I-5804, and 1 control vat with L. monocytogenes alone without protective culture.
  • the ferments used for soft dough technology were Flora Danica and RNA ferment.
  • the surface ferments were Geotrichum candidum (LIP Jacynthe ferment) and Penicillium candidum (LIP Edelweiss ferment). Two productions were carried out on the same day, with the same milk.
  • the CNCM I-5804 strain was precultured for 24 hours at 30°C in TSB-YE medium (10 mL). The preculture was washed twice: centrifugation at 5000 g for 10 minutes then reusing the pellet in the same volume of physiological water. After the second wash, the pellet is taken up in 10 mL of UHT whole milk. These 10 mL are used to inoculate a culture of 100 mL of UHT whole milk which is incubated for 48 hours at 30°C before being frozen at -20°C until use. For L. monocytogenes, a mixture of 5 strains was used, including the strains Scott A, CA2165 Fromage-CA Wisconsin E.
  • Listeria monocytogenes was counted on PALCAM agar at each sample (mixture of dough and rind for cheeses). For the 10° (milk) and 10 1 (cheese) dilutions, the seeding conditions were 1 mL on 3 boxes. The dry extracts of the dough were measured on the cheese samples at T40d.
  • the objective of this work is to verify the absence of inhibition halo indicators of a competition phenomenon by interference between a selection of bioprotective strains and C. mattaromaticum CNCM 1-5804.
  • the transmitter strains selected for this test are C. mattaromaticum CNCM 1-5242, Lactobacillus plantarum (HOLDBAC®) and C. maltaromaticum CNCM 1-5243.
  • the indicator strain is C. maltaromaticum CNCM 1-5804, allowing compatibility with other biopreservation strains to be assessed.
  • Listeria monocytogenes EGDe is used as a control indicator strain to verify the production of a diffusible inhibitory substance by the selected emitting strains.
  • TAB trypticase-soy broth
  • YE yeast extract
  • TBYE yeast extract
  • Another TSBYE broth is inoculated with the C. maltaromaticum strain CNCM I-5243 from a freeze-dried culture (Lallemand Specialty Cultures). The inoculated broths are incubated at 30°C for 24 h.
  • TSAYE agar (TSBYE supplemented with 12 gL 1 of bacteriological agar) is inoculated with the culture of C. maltaromaticum CNCM I-5804 or L. monocytogenes EGDe diluted 1/100.
  • the agar plates thus prepared are placed at 4°C for 30 min.
  • the emitting cultures are centrifuged at 5000 g for 10 min.
  • the culture supernatants are heat treated for 30 min at 80°C in order to destroy any cells in suspension.
  • Wells are drilled in the agar plates using a sterile Durham bell, then 25 ⁇ L of the treated supernatants are deposited there.
  • the agar plates are then incubated for 48 hours at 30°C before reading.

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Abstract

L'invention a pour objet une souche spécifique de Carnobacterium maltaromaticum, une préparation bactérienne comprenant au moins ladite souche de C. maltaromaticum et leur utilisation dans la préparation d'un produit alimentaire.

Description

Description
Titre de l'invention : Nouvelle souche de Carnobacterium ma/taromaticum et ses utilisations
L’invention a pour objet une souche spécifique de Carnobacterium ma/taromaticum, une préparation bactérienne comprenant au moins ladite souche et leur utilisation dans la préparation d'un produit alimentaire.
La présence de bactéries pathogènes dans les aliments est une problématique de santé publique majeure. Dans le secteur de la fromagerie, la présence potentielle de Listeria monocytogenes est une préoccupation constante. La présence de ce pathogène dans les produits laitiers transformés fait régulièrement l'objet d'incidents mettant en jeu la santé du consommateur et la stabilité économique des acteurs de la filière. A titre d'exemple, il est possible de citer le retrait de la commercialisation de plusieurs lots de fromage contaminés par L. monocytogenes fortement médiatisé en décembre 2015. En conséquence, les acteurs de la filière sont activement à la recherche de solutions permettant de mieux maîtriser le danger Listeria.
Certaines sociétés spécialisées dans la production et la commercialisation de microorganismes proposent des cultures microbiennes biopréservatrices / bioprotectrices présentant des propriétés Par exemple, il est connu que certaines souches de Lactobacillus piantarum possèdent une activité anti- Listeria. Une souche de L. piantarum est notamment commercialisée sous la marque HOLDBAC® en tant que ferment de bio-préservation / bioprotection.
Toutefois, malgré l'utilisation de ces cultures biopréservatrices, la présence de L. monocytogenes subsiste, vraisemblablement parce que les cultures biopréservatrices proposées sont des bactéries lactiques classiques ne permettant pas d'apporter une protection optimale et durable tout au long de la vie du produit alimentaire.
L'activité a - Listeria de souches de bactéries lactiques de l'espèce Carnobacterium maitaromaticum a également été décrite dans l'art antérieur. Par exemple, les Inventeurs ont précédemment identifié les souches de C. maitaromaticum CNCM I- 5242 et CNCM I-5243 possédant des propriétés d’inhibition remarquables vis-à-vis de L. monocytogenes en matrice fromagère (FR 3102489 B1). Cependant, même si ces souches inhibent efficacement la croissance de L monocytogenes, celles-ci ne permettent pas d’induire sa décroissance.
Il existe donc un réel besoin de disposer de moyens permettant de réduire la présence, et en particulier d’induire la décroissance, de L monocytogenes dans les produits alimentaires.
Dans ce contexte, les Inventeurs ont identifié une nouvelle souche de C. mattaromaticum possédant des propriétés de biopréservation particulièrement utiles. De manière inattendue, la présence de cette souche conduit à une diminution rapide de la quantité du pathogène, indiquant que cette souche permet d’inhiber la population de L monocytogenes. De plus, contrairement aux souches de C. mattaromaticum déjà identifiées, cette nouvelle souche inhibe L monocytogenes sans former de halo d’inhibition sur milieu gélosé en test de compétition, suggérant un mécanisme d’action original.
Aussi, un aspect de l’invention a pour objet la souche C. mattaromaticum CNCM I- 5804.
Cette souche isolée a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS, France) le 6 janvier 2022 sous le numéro CNCM 1-5804, conformément au Traité de Budapest.
En co-culture avec la souche de L. monocytogenes \\Avn \esc&n\.e EGDelux, la souche CNCM 1-5804 induit une extinction de la luminescence, ce qui démontre sa capacité à inhiber L. monocytogenes.
En test de compétition classique sur milieu gélosé avec L. monocytogenes, la souche CNCM 1-5804 ne génère pas de halo d’inhibition, ce qui indique un mécanisme d’inhibition de L monocytogenes différent et complémentaire de celui des souches de C. maitaromaticum déjà identifiées.
De plus, la combinaison de CNCM 1-5804 avec au moins une autre souche de C. maitaromaticum induit une inhibition de L monocytogenes bien plus efficace qu’avec les souches de C. maitaromaticum utilisées seules. Cet effet synergique de la souche CNCM 1-5804 avec d’autres souches de C. maltaromaticum révèle un potentiel prometteur pour réduire la quantité de L monocytogenes dans un aliment de type fromage.
Un autre aspect de l’invention concerne une préparation bactérienne comprenant la souche CNCM 1-5804.
On entend par "préparation bactérienne" une composition conditionnée pour la croissance de Carnobacterium maltaromaticum, ladite composition comprenant une souche de C. maltaromaticum viable et des composants essentiels pour la croissance des bactéries, tels qu'une source de carbone et d'énergie, une source de potassium et de phosphore, une source de calcium, une source de magnésium, des lipides, des protéines ou des acides aminés.
Ladite préparation bactérienne peut comprendre un milieu de culture ou un extrait de milieu de culture. Ledit milieu peut être le milieu TSB-YE (Bouillon Tryptone Soja- Extrait de Levure).
Ledit milieu de culture peut être un milieu synthétique. Par milieu synthétique, on entend selon la présente invention un milieu dans lequel sont introduits des composants individuels caractérisés et soumis à un contrôle quantitatif et qualitatif rigoureux.
Ledit milieu de culture peut être aussi un milieu naturel. Par milieu naturel, on entend selon la présente invention un milieu qui contient un ou plusieurs composés naturels dans sa composition. Ledit milieu naturel peut être du lait (entier, demi-écrémé ou écrémé), notamment du lait cru, thermisé, pasteurisé ou du lait UHT (stérilisé à Ultra Haute Température).
Ladite préparation bactérienne peut être sous forme liquide ou solide.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la concentration de C. maltaromaticum, notamment de la souche CNCM 1-5804, dans ladite préparation bactérienne de l'invention peut être de 102 UFC.mL-1 à 1011 UFC.mL 1, notamment de 105 UFC.mL 1 à 107 UFC.mL 1, plus particulièrement d'au moins 105 UFC.mL 1, ou d'au moins 106 UFC.mL 1, ou d'au moins 107 UFC.mL-1, par rapport au volume total de la préparation bactérienne. Dans un mode de réalisation de l'invention, la concentration de C. maltaromaticum, notamment de la souche CNCM 1-5804, dans ladite préparation bactérienne de l'invention peut être de 102 UFC.mL-1, 103 UFC.mL-1, 104 UFC.mL-1, 105 UFC.mL-1, 106 UFC.mL-1, 107 UFC.mL-1, 108 UFC.mL 1, 109 UFC.mL 1, 1010 UFC.mL 1 ou 1011 UFC.mL-1, par rapport au volume total de la préparation bactérienne.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, ladite préparation bactérienne contient une quantité de C. maltaromaticum, notamment de la souche CNCM I-5804, de 102 UFC.g 1 à 1011 UFC.g 1, notamment de 105 UFC.g 1 à 107 UFC.g 1, d'au moins 105 UFC.g-1, ou d'au moins 106 UFC.g 1, ou d'au moins 107 UFC.g 1, par rapport au poids total de la préparation bactérienne.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la concentration de C. maltaromaticum, notamment de la souche CNCM I-5804, dans ladite préparation bactérienne de l'invention peut être de 102 UFC.g 1, 103 UFC.g 1, 104 UFC.g 1, 105 UFC.g 1, 106 UFC.g- 1, 107 UFC.g 1, 108 UFC.g 1, 109 UFC.g 1, 1010 UFC.g 1 ou 1011 UFC.g 1, par rapport au poids total de la préparation bactérienne.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite préparation bactérienne est un concentrât liquide, un concentrât congelé ou un lyophilisât.
On entend par "concentrât" un liquide contenant une quantité de bactérie supérieure à 105 UFC.mL 1, en particulier supérieure à 1010 UFC.mL 1, notamment supérieure à 1011 UFC.mL 1, par rapport au volume total du concentrât.
Le concentrât peut être obtenu par toute méthode conventionnelle, par exemple par centrifugation ou par microfiltration d'une culture de C. maltaromaticum après l'incubation adaptée.
On entend par "lyophilisât" le produit obtenu après lyophilisation d'une culture de C. maltaromaticum après l'incubation adaptée.
On entend par "incubation adaptée" une incubation selon une méthode conventionnelle pour obtenir une population initiale de C. maltaromaticum proche de 107 UFC.mL 1, par rapport au volume total de l'incubation.
A titre d'exemple, l'incubation de C. maltaromaticum peut être effectuée à 30°C pendant 48 heures dans du lait entier pasteurisé. Dans un mode de réalisation particulier, ladite préparation bactérienne est un concentrât, éventuellement congelé, comprenant du lait entier pasteurisé et au moins 107 UFC.mL-1 de C. maltaromaticum CNCM I-5804, par rapport au volume total de la préparation bactérienne.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite préparation bactérienne est un concentrât, éventuellement congelé, comprenant du lait entier UHT et au moins 107 UFC.mL-1 de C. maltaromaticum CNCM I-5804, par rapport au volume total de la préparation bactérienne.
Dans un mode de réalisation de l'invention, ladite préparation bactérienne peut comprendre en outre au moins un ferment lactique et/ou au moins un ferment d'affinage.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite préparation bactérienne est une culture protectrice de C. maltaromaticum.
On entend par "culture protectrice de Carnobacterium maitaromaticurri' une composition contenant des bactéries C. maltaromaticum \i\\iar es qui peut être ajoutée dans les produits alimentaires pour inhiber la croissance des microorganismes pathogènes ou toxiques pour l'homme ou l'animal et présents dans lesdits produits alimentaires, afin de réduire le risque de contamination de produit alimentaire par ces microorganismes pathogènes ou toxiques.
Au sens de la présente invention, ledit microorganisme pathogène ou toxique est une bactérie du genre Listeria, notamment Listeria monocytogenes.
Ladite culture protectrice peut être sous forme de concentrât liquide ou sous forme de lyophilisât.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la préparation bactérienne comprend en outre au moins une souche de C. maltaromaticum différente de CNCM I-5804.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la préparation bactérienne comprend en outre au moins une souche de C. maltaromaticum présentant un halo d’inhibition en test de compétition sur milieu gélosé avec L. monocytogenes.
Le test d’inhibition en milieu gélosé peut être effectué aisément par l’homme du métier selon le protocole décrit dans les exemples. Selon un mode de réalisation de l’invention, la préparation bactérienne comprend en outre au moins une souche de C. maltaromaticum choisie parmi les souches CNCM 1-5242 et CNCM 1-5243.
Ces deux souches isolées ont été déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS, France) le 26 septembre 2017 respectivement sous les numéros CNCM I-5242 et CNCM I-5243, conformément au Traité de Budapest.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la préparation bactérienne comprend en outre la souche CNCM I-5242.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la préparation bactérienne comprend en outre la souche CNCM I-5243.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la préparation bactérienne comprend en outre la souche CNCM I-5242 et la souche CNCM I-5243.
Un autre aspect de l’invention concerne l'utilisation de la souche C. maltaromaticum CNCM I-5804, d’une préparation bactérienne décrite ci-dessus ou d’une culture protectrice décrite ci-dessus, dans la préparation d'un produit alimentaire.
Plus particulièrement, la souche CNCM I-5804, la préparation bactérienne décrite ci- dessus ou la culture protectrice décrite ci-dessus est utilisée pour inhiber la croissance des bactéries du genre Listeria, notamment L. monocytogenes, dans un produit alimentaire.
Selon l’invention, l’expression "inhibition de Listen'd' (ou "inhibition de la croissance de Listen'd') signifie la réduction de la croissance, le blocage de la croissance ou la décroissance des bactéries du genre Listeria.
Ladite culture protectrice de l'invention peut être utilisée dans la production des produits laitiers fermentés ou non fermentés, notamment dans la production de fromages ou de laits fermentés.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit produit alimentaire est un produit laitier fermenté, notamment les fromages, tels que les fromages à pâte molle, fromages à pâte pressée cuites ou non cuite, fromages frais, fromages de chèvre, fromages de brebis, ou des laits fermentés. Ladite culture protectrice de l'invention peut être aussi utilisée dans la production des autres produits laitiers, tels la crème, la crème glacée, le beurre, ou les produits secondaires dérivés du lait, comme le lactosérum, la caséine, ou d'autres produits alimentaires préparés contenant comme ingrédient du lait ou des constituants du lait.
Ladite culture protectrice de l'invention peut être aussi utilisée dans la production de boisson, par exemple les jus de fruits, les boissons obtenues avec les mélanges de lait et de jus de fruits, le lait de soja, le lait d'avoine, le lait d’amande, le lait de riz ou de produits végétaux fermentés.
Ladite culture protectrice de l'invention peut être aussi utilisée dans la production industrielle de produits de salaisons et charcuterie, ou produits de boucherie, tels que les saucisses ou les steaks hachés.
Ladite culture protectrice de l'invention peut être aussi utilisée dans la production de produits alimentaires à base de poissons, tels que la truite fumée ou le saumon fumé.
Ladite culture protectrice de l'invention peut être aussi utilisée dans la production de produits alimentaires végétaux transformés (saucisses végétales par exemple).
L'utilisation de la culture protectrice de l'invention pendant la fabrication des produits alimentaires permet l’inhibition des bactéries du genre Listeria qui subsistent dans un produit alimentaire en faible quantité et de prolonger la période de conservation dudit produit alimentaire.
La culture protectrice de C. ma/taromaticum selon la présente invention est ajoutée dans les produits alimentaires selon le type de produit.
Pour les produits laitiers fermentés, tels que les fromages ou les laits fermentés, la culture protectrice est ajoutée avant ou en même temps que les ferments lactiques ou après leur addition.
Pour les autres produits alimentaires, la culture protectrice peut être ajoutée, en début de ligne de production, en cours de ligne de production ou en fin de ligne de production et notamment avant le conditionnement du produit alimentaire.
A titre d'exemple, la culture protectrice de C. ma/taromaticum selon la présente invention est additionnée dans un produit alimentaire liquide pour atteindre un niveau de 102 UFC.mL-i à 10" UFC.mL-i, notamment de 10$ UFC.mL-i à 10 UFC.mL-1, plus particulièrement d'au moins 106 UFC.mL-1, notamment entre 106 UFC.mL-1 et 107 UFC.mL-1 , par rapport au volume total dudit produit alimentaire liquide ; ou additionnée dans un produit alimentaire solide pour atteindre un niveau de 102 UFC.g 1 à 1011 UFC.g 1, notamment de 105 UFC.g 1 à 107 UFC.g 1, d'au moins 105 UFC. g 1, ou d'au moins 106 UFC.g 1, ou d'au moins 107 UFC.g 1, par rapport au poids total dudit produit alimentaire solide, pendant la période de conservation dudit produit alimentaire.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un fromage, notamment un fromage à pâte molle ou un fromage à pâte pressée non cuite, utilisant la souche CNCM I-5804 ou une préparation bactérienne contenant ladite souche.
Ledit procédé comprend :
- l'ensemencement par la souche CNCM I-5804 ou par une préparation bactérienne décrite ci-dessus comprenant au moins la souche CNCM I-5804 dans le lait ou pendant la transformation du lait.
Selon le procédé de l'invention, l'ensemencement par la souche CNCM I-5804 peut être effectué dans le lait, dans le lactosérum, dans la saumure, ou directement sur la pâte de fromage. Selon le procédé de l'invention, lorsque l'ensemencement est fait sur la pâte de fromage, il peut être effectué par pulvérisation ou par spray d'une préparation liquide comprenant la souche CNCM I-5804 sur la pâte de fromage.
On entend par "ensemencement pendant la transformation du lait" dans la fabrication du fromage, l'ensemencement pendant le stockage, la pré-maturation, la coagulation, l'égouttage, le moulage, le pressage, le salage, l'affinage, les soins ou le lavage.
Selon le procédé de l'invention, lorsque l'ensemencement est fait dans le lait, l'ensemencement peut être effectué avec ou sans maturation froide du lait.
Par ailleurs, l'ensemencement dans le lait par la souche CNCM I-5804 peut être effectué avant ou simultanément avec l'ensemencement des ferments lactiques.
Dans un autre mode de réalisation, l'ensemencement de la souche CNCM I-5804 est effectué de 0 à 8 heures avant celui des ferments lactiques.
Le lait utilisé dans ledit procédé peut être du lait, entier ou non, cru ou pasteurisé ou ayant subi un traitement thermique. On entend par "lait entier pasteurisé" du lait entier ayant subi un traitement thermique, par exemple à 71 ,5°C pendant 15 secondes, puis rapidement refroidi à 4°C.
Dans un mode de réalisation du procédé, le lait est ensemencé par la souche CNCM I-5804 à un taux de 102 UFC.mL-1 à 1011 UFC.mL-1, notamment de 106 UFC.mL-1 à 107 UFC.mL-1, par rapport au volume du lait.
Dans un mode de réalisation, l’ensemencement par la souche CNCM I-5804 est effectué conjointement à un ensemencement d’au moins une bactérie différente de CNCM I-5804, de préférence une bactérie lactique.
Dans un mode de réalisation, l’ensemencement est effectué par une préparation bactérienne comprenant la souche CNCM I-5804 et au moins une bactérie différente de CNCM I-5804, de préférence une bactérie lactique.
Dans un mode de réalisation, la bactérie différente de CNCM I-5804 est une protéobactérie.
Dans un mode de réalisation, la bactérie lactique différente de CNCM I-5804 est choisie parmi le groupe comprenant les genres Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus et Staphylococcus.
Dans un mode de réalisation préféré, l’ensemencement par la souche CNCM I-5804 est effectué conjointement à un ensemencement d’au moins une souche de C. maltaromaticum différente de CNCM I-5804, notamment la souche CNCM I-5242 et/ou la souche CNCM I-5243.
Dans un mode de réalisation préféré, l’ensemencement est effectué par une préparation bactérienne comprenant la souche CNCM I-5804 et au moins une souche de C. maltaromaticum différente de CNCM I-5804, notamment la souche CNCM I- 5242 et/ou la souche CNCM I-5243.
Dans un mode de réalisation, le lait ensemencé est incubé à une température d’au moins 2°C, de préférence d’au moins 30°C.
Dans un mode de réalisation, le lait ensemencé est incubé à une température de 2°C à 65°C. Dans un mode de réalisation, le lait ensemencé est incubé à une température d’au moins 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, 10°C, 11 °C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C ou 65°C.
Dans un aspect, l’invention concerne donc également des produits alimentaires, tels que ceux décrits ci-dessus, comprenant la souche CNCM I-5804.
Un autre aspect de l’invention concerne un procédé pour réduire la contamination microbienne lors du processus de fabrication d'un produit laitier fermenté comprenant l'addition d'une quantité inhibitrice de la souche CNCM I-5804 ou d’une préparation bactérienne contenant la souche CNCM I-5804.
La présente invention propose également un procédé pour réduire la contamination par des bactéries du genre Listeria lors du processus de fabrication d'un produit laitier fermenté caractérisé en ce qu'il comprend l'addition d'une quantité de 102 UFC.mL-1 à 1011 UFC.mL-1, notamment de 106 à 107 UFC.mL 1, par rapport au volume du produit laitier, de la souche CNCM I-5804 ou d’une préparation bactérienne comprenant la souche CNCM I-5804
Les figures annexées illustrent l’invention :
[Fig.1] Mise en évidence de différents types de mécanismes d’inhibition de L. monocytogenes par des souches de C. mattaromaticum : (A), C. mattaromaticum CNCM I-5804 ; (B), C. mattaromaticum CNCM I-5242
[Fig.2] Croissance de Listeria monocytogenes dans des matrices fromagères préalablement ensemencées avec les souches de Carnobacterium maitaromaticum CNCM I-5804 et CNCM I-5242 seules ou en mélange : (A), à 12°C ; (B), à 30°C.
[Fig.3], Facteurs de réduction moyens des densités de population de différentes souches de Listeria monocytogenes par Carnobacterium maitaromaticum CNCM I- 5804. Les barres d’erreur représentent les erreurs standard de la moyenne (n=3).
[Fig.4] Exemple de cinétique de luminescence de la souche indicatrice Listeria monocytogenes EGDelux seule (EGDElux) ou en présence de la souche de biopréservation C. maitaromaticum CNCM I-5804 (CNCM I-5804).
[Fig.5] Niveaux de force d’inhibition (100-LDIr) moyens de la souche indicatrice L. monocytogenes EGDelux par la souche C. maitaromaticum CNCM I-5804 dans les matrices retenues pour le niveau d’inoculation D3. Les barres d’erreur représentent les erreurs standards des moyennes (n=3).
[Fig.6] Coefficients de variation (CV) des forces d’inhibition mesurées aux trois niveaux de dilution. [Fig.7] Dénombrements de L. monocytogenes dans les fabrications fromagères en l'absence et en présence de la souche CNCM 1-5804.
[Fig.8] (A) Vérification de l’activité a - Listeria monocytogenes de surnageants de souches de bioprotection ; (B) Recherche de potentielles incompatibilités entre CNCM 1-5804 et d’autres souches de bioprotection ; 1 : témoin (TSBYE) ; 2 : HOLDBAC®, 3 : CNCM 1-5242 à partir de culture conservée à -80°C, 4 : CNCM 1-5243 à partir de culture conservée à -80°C, 5 : CNCM 1-5243 à partir de culture lyophilisée.
La présente invention sera décrite ci-après de façon plus détaillée et à l’aide d’un ou plusieurs exemples qui ne limitent nullement l’invention.
Exemple 1 - Inhibition de L. monocytogenes sur gélose
Matériel et méthodes
Préparation des inocula de Camobacterium ma/taromaticum
Des pré-cultures de Carnobacterium ma/taromaticum (CNCM I-5242 et CNCM I-5804) sont réalisées à partir d’aliquots congelés à -80°C. 100 pL de ces aliquots sont ajoutés chacun dans un tube Falcon de 15 mL contenant 10 mL de TSB-YE, puis incubés à 30°C pendant 24 h.
Préparation des inocula de Listeria monocytogenes
Cinq souches de Listeria monocytogenes (Scott A, PL1447, CA2165, Lal65 et SN167) sont striées sur TSA-YE et incubées 72 h à 30°C. Une culture liquide dans 10 mL de TSB-YE est ensuite réalisée à partir d’une colonie, pour chaque souche. Ces cultures sont incubées 24 h à 30°C, puis mélangées de façon équivolumique. Une mesure de DO permet d’estimer la concentration grâce à un rapport préétabli. Du glycérol 50 % est ajouté au mélange de cultures pour atteindre une concentration finale de 10 %. Le mélange de cultures glycérolé est ensuite aliquoté en cryotubes de 1 mL, puis congelé à - 80°C.
Croissance en double couche et halo d’inhibition
Des boites de Petri contenant du milieu gélosé TSA-YE sont inoculées avec 1 ,5 pL de chacune des cultures de Carnobacterium maitaromaticum. Les ensemencements sont réalisés au centre de chaque boite de milieu gélosé. Ces boites sont incubées 24 h à 30°C.
Le même jour, une pré-culture du mélange de 5 souches de Listeria monocytogenes est réalisée en milieu TSB-YE, à 30°C. Après croissance, la culture est diluée dans du TSA-YE en surfusion afin d’atteindre une DO d’environ 0,01 (soit environ 106 UFC/mL). 15 mL de gélose liquide ensemencée sont délicatement coulés sur les premières géloses, de manière à réaliser une seconde couche. Les boites sont incubées à 30°C pendant 24 h.
Résultats d’inhibition sur gélose
Les résultats obtenus montrent que la souche CNCM I-5804 ne présente pas de halo d’inhibition envers le mélange des 5 souches de Listeria monocytogenes, alors que la souche CNCM 1-5242 présente un halo (Figure 1). Il en va de même pour la souche CNCM I-5243 (résultats non montrés). Ceci suggère que le mécanisme d’action de la souche CNCM I-5804 pour inhiber Listeria monocytogenes est différent de celui des deux autres souches.
Exemple 2 - Suivi de L. monocytogenes dans une matrice fromagère réelle
Matériel et méthodes
Préparation des inocula de Carnobacterium mattaromaticum
Des pré-cultures de Camobacterium mattaromaticum CNCM I-5804 et CNCM I-5242 sont réalisées à partir d’aliquots congelés à -80°C. 100 pL de ces aliquots sont ajoutés chacun dans un tube Falcon de 15 mL contenant 10 mL de TSB-YE, puis incubés à 30°C pendant 24 h.
500 pL de pré-culture sont prélevés afin de mesurer la densité optique (DO). Cette mesure est utilisée afin d’estimer la concentration de chacune grâce à un rapport DO/(UFC/mL) préétabli. Les cultures sont ensuite centrifugées à 5000 g pendant 5 min et les culots repris dans un volume de 9,5 mL d’eau physiologique stérile. Cette opération est répétée une seconde fois afin de laver les cultures. Les cultures lavées sont ensuite diluées en cascade jusqu’à 5,0.108 UFC/mL.
Préparation des inocula de Listeria monocytogenes
Cinq souches de Listeria monocytogenes (Scott A, PL1447, CA2165, Lal65 et SN167) sont striées sur TSA-YE à partir de starters. Après incubation pendant 72 h à 30°C, une culture liquide dans 10 mL de TSB-YE est réalisée à partir d’une colonie, pour chaque souche. Ces cultures sont incubées 24 h à 30°C, puis mélangées après mesure de la DO. Cette mesure permet d’estimer la concentration grâce à un rapport préétabli. Du glycérol 50 % est ajouté au mélange de cultures pour atteindre une concentration finale de 10 %. Le mélange de cultures glycérolé est ensuite aliquoté en cryotubes de 1 mL, puis congelé à - 80°C.
Avant utilisation, l’aliquot est décongelé à température ambiante puis centrifugé à 5000 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé et culot est repris dans de le même volume d’eau physiologique stérile. Ces étapes sont réalisées une seconde fois. Le mélange est ensuite dilué en cascade jusqu’à une concentration de 5,0.105 UFC/mL dans de l’eau physiologique stérile.
Préparation des échantillons de Saint-nectaire
Les échantillons de fromages sont préparés à partir de morceaux de Saint-Nectaire laitier AOP. Pour un même essai, les fromages appartiennent au même lot. Ces fromages sont découpés en morceaux d’environ 10 g (+/- 1.5 g) après avoir retiré la croûte. Chaque morceau est déposé dans un pilulier à bouchon à vis individuel. Un puits est ensuite creusé au centre des morceaux à l’aide d’une cloche de Durham.
Les morceaux de fromages sont ensuite inoculés ou non avec les souches de C. maltaromaticum, selon les modalités suivantes :
- Un fromage témoin négatif, non inoculé
- Un fromage témoin positif, non inoculé
- Un fromage inoculé avec 20 pL de C. maltaromaticum CNCM I-5804
- Un fromage inoculé avec 20 pL de C. maltaromaticum CNCM I-5242
- Un fromage inoculé avec 20 pL de C. maltaromaticum CNCM I-5804 et 20 pL de C. maltaromaticum CNCM I-5242
La moitié de ces morceaux de fromages est incubée à 30°C et l’autre à 12°C pendant 6 jours. Au bout de ces 6 jours, 20 pL du mélange dilué de Listeria monocytogenes sont ajoutés dans tous les fromages sauf les témoins négatifs. Les pots contenant les fromages sont ensuite réincubés à leurs températures respectives. Pour chaque température, il y a autant de pots de chaque modalité que de points de dénombrement.
Dénombrement des Listeria monocytogenes
A chaque point de dénombrement, un fromage de chaque modalité est sorti de l’étuve. Chaque morceau est homogénéisé au Stomacher (3 X 3 min) dans un sachet avec filtre latéral contenant 90 mL de tampon citrate de sodium stérile. Le mélange est dilué en cascade (1 mL de mélange + 9 mL de tampon citrate de sodium) jusqu’à la dilution appropriée. 100 ou 200 pL des dilutions sont ensuite étalés sur milieu sélectif PALCAM en duplicats. Les boites sont incubées 24 à 48 h à 30°C.
Résultats : croissance de L. monocytogenes en matrice fromagère Les résultats obtenus mettent en évidence l’effet inhibiteur de la souche CNCM 1-5804, utilisée seule ou en mélange avec la souche CNCM 1-5242 (Figure 2A, Figure 2B). A 12°C, l’ajout de la souche CNCM I-5804 seule permet une réduction de la quantité de L. monocytogenes d’environ 0,7 log dans la matrice fromagère après 27 jours (Figure 2A). A 30°C, l’ajout de la souche CNCM I-5804 permet une diminution de la quantité de L monocytogenes quelle que soit la durée d’incubation (Figure 2B) : cette réduction est très nettement supérieure à 1 log pour toutes les durées d’incubation testées et la quantité de L monocytogenes dénombrée dans la matrice fromagère ne dépasse alors jamais 1.5.104 UFC/g.
Par ailleurs, il est observé un comportement complémentaire des deux souches de C. mattaromaticum C CM I-5804 et CNCM I-5242, lorsqu’elles sont ajoutées en mélange à la matrice fromagère : dans ce cas, la réduction de la population de L monocytogenes est très importante et atteint 1 ,4 log après 27 jours d’incubation à 12°C, et 2,5 log après 27 jours d’incubation à 30°C. A 30°C et en présence des deux souches de C. mattaromaticum, la population de L. monocytogenes atteint 1 ,9.105 UFC/g à 6 jours de croissance, puis une phase de décroissance continue se produit et permet de retrouver un niveau de population finale de 5,7.102 UFC/g après 27 jours, soit un niveau inférieur au niveau initial (8,7.102 UFC/g).
Exemple 3 - Spectre d’activité ar\ \- Listeria monocytogenes de C. mattaromaticum CNCM I-5804
Matériel et méthodes
Co-culture de la souche C. mattaromaticum CNCM I-5804 avec une collection de souches de L. monocytogenes et dénombrements
43 souches de L monocytogenes sont isolées sur gélose TSAYE consistant en bouillon trypticase-soja (TSB, bioMérieux, Marcy-L’Etoile, France) supplémenté de 6 g.L 1 d’extrait de levure (YE, Biokar Diagnostics, Paris, France) et 15 g.L 1 d’agar bactériologique (BD), puis incubées 24 h à 30°C. Après incubation, les isolats sont transférés dans les puits d’une microplaque (Corning 3370, Corning Inc., NY, USA) contenant 145 pL de TSBYE chacun, avant incubation pendant 24 h à 30°C. Cette première microplaque est ensuite répliquée par transfert de 5 pL de chaque puits à une nouvelle microplaque contenant 145 pL de TSBYE par puits. En parallèle, 10 mL de TSBYE sont inoculés avec une culture starter de la souche C. maltaromaticum CNCM I-5804. L’ensemble de ces cultures (microplaque et culture de la souche biopréservatrice) est incubé pendant 22 h à 30°C. Le jour de l’essai, la microplaque contenant la collection de souches de Listeria monocytogenes est diluée par dilutions décimales en microplaque jusqu’au 1/1000. Cinq microlitres de chaque puits de cette microplaque sont alors transférés à une nouvelle microplaque, contenant 135 pL de TSBYE et 10 pL de culture de C. maltaromaticum CNCM I-5804 par puits. Le niveau de dilution final de la collection de Listeria monocytogenes est ainsi de 1/30000. Cette microplaque de co-cultures est incubée pendant 24 h à 30°C. Après incubation, la microplaque de co-cultures est diluée en cascade en bouillon Tryptone-Sel (TS, Biokar Diagnostics, Paris, France) jusqu’à un facteur de dilution de 107. Chaque microplaque permet de déposer 2,5 pL de culture diluée sur gélose avec supplément sélectif PALCAM (Biokar Diagnostics, Paris, France). Les géloses inoculées sont ensuite incubées à 37°C pendant 48 h avant dénombrement des colonies de L. monocytogenes. Cette expérience est également réalisée sans ajout de souche biopréservatrice C. maltaromaticum CNCM I-5804 afin de produire des témoins. Le facteur de réduction de la densité de L. monocytogenes par la souche C. maltaromaticum CNCM I-5804 est obtenu par le calcul du rapport des densités de population de L. monocytogenes en présence de la souche C. maltaromaticum CNCM I-5804 à celles obtenues dans les témoins. L’expérience de co-culture est répétée 3 fois.
Résultats : réduction des densités des souches de L. monocytogenes n présence de C. maltaromatic 5804
Les résultats montrent que la souche C. maltaromaticum CNCM I-5804 présente une capacité à réduire la densité de population de toutes les souches de L. monocytogenes testées (Figure 3). Cette propriété varie selon les souches, allant d’une réduction d’un facteur 1 ,2 logio ± 0,4 log pour la souche CIP 7818 à un facteur 4,7 logio ± 0,4 logio pour la souche CIP 12510. Hormis ces valeurs extrêmes, la capacité de C. maltaromaticum CNCM I-5804 à réduire les populations de L. monocytogenes lors de co-cultures en milieu TSBYE s’étage de manière continue entre des facteurs de réduction de 2,1 logio ± 0,2 logio et 4,0 logio ± 0,2 logio, avec une moyenne de 2,9 log ± 0,1 logio. Ces résultats montrent que la souche de biopréservation CNCM I-5804 présente une large capacité d’inhibition avec des niveaux moyens de réduction de la population de pathogène d’environ 3 logio.
Exemple 4 - Activité anti-Z.. monocytogenes de C. mattaromaticumC C 1-5804 dans différentes matrices alimentaires
L’objectif de ces travaux est de déterminer si la souche C. ma/taromaticum CNCM I- 5804 est capable d’inhiber la croissance d’une souche indicatrice de L. monocytogenes (L monocytogenes EGDelux) dans des préparations issues de différentes matrices alimentaires d’intérêt. Ces matrices comprennent des matrices d’origine animale et végétale, dont des alternatives aux produits animaux. Une étude récente suggère que ces alternatives constituent des milieux particulièrement favorables à la croissance de différents pathogènes alimentaires, dont L monocytogenes. Ces données motivent le choix de ces matrices pour la présente étude.
Matériel et méthodes
Description des matrices
En plus de 2 milieux de laboratoire servant de témoins (TSBYE et TSBYE sans glucose), 5 matrices alimentaires ont été sélectionnées. Ces matrices sont d’origine animale ou végétale : truite fumée, saucisse végétale, lait d’amande UHT, boisson à l’avoine UHT et lait de soja UHT.
Préparation des matrices
Les milieux de laboratoire consistent en des bouillons trypticase-soja (TSB) (Biokar Diagnostics, Paris, France) supplémentés de 6 g.L 1 d’extrait de levure (YE) (Biokar Diagnostics, Paris, France), sans ou avec ajout de 2,5 g.L 1 de glucose. Les matrices liquides (bouillons de laboratoire et boissons) ont été utilisées telles quelles pour les essais, tandis que les matrices solides ont fait l’objet de la préparation de jus, par découpage en conditions stériles, ajout d’eau physiologique et broyage au stomacher. Pour la matrice saucisse végétale, 140 g ont été utilisés avec une proportion d’eau physiologique de 1 :1 (w/w). Dans le cas de la truite fumée, 180 g ont été utilisés avec une proportion d’eau physiologique de 2:1 (w/w). Les matrices homogénéisées sont distribuées dans les puits de différentes microplaques (Corning) à raison de 135 pL par puits, et conservées à -80°C jusqu’aux essais.
Préparation des souches
La souche C. maltaromaticum CNCM I-5804 est striée sur gélose trypticase-soja avec extrait de levure (TSAYE) consistant en bouillon TSBYE amendé de 15 g.L 1 d’agar bactériologique (BD), puis incubée 48 h à 30°C. Un isolat est ensuite transféré dans les puits d’une microplaque (Corning 3370, Corning Inc., NY, USA) notée GO (génération 0) contenant 150 pL de TSBYE chacun avant incubation pendant 24 h à 30°C. A l’issue de l’incubation, 10 pL de chaque puits sont transférés dans les puits de nouvelles microplaques (Corning 3370) notées G1 (génération 1) contenant 110 pL de TSBYE par puits. Après 24 h d’incubation à 30 °C, ces microplaques G1 sont supplémentées de glycérol à raison de 30 pL par puits pour atteindre une concentration finale de 10% (v/v). Ces microplaques contenant des cultures glycérolées de C. maltaromaticum CNCM I-5804 servent de collections de travail et sont conservées à -80 °C jusqu’aux essais.
La souche bioluminescente L monocytogenes EGDelux (Riedel et al., 2007) est striée sur gélose avec supplément sélectif PALCAM (Biokar Diagnostics, Allonne, France) incubée à 30°C pendant 24 h. Un isolat est ensuite transféré dans 10 mL de TSBYE incubé à 30°C pendant 24 h. A la culture starter obtenue est ajouté du glycérol pour atteindre une concentration finale de 10 % (v/v). Le mélange homogène est distribué en aliquots de 1 ,5 mL congelés à -80°C jusqu’à utilisation.
Mesure de l’activité anti-Z.. monocytogenes de la souche C. maltaromaticum CNCM I- 5804 dans les matrices sélectionnées
La mesure de l’activité anti-Z.. monocytogenes de C. maltaromaticum CNCM I-5804 repose sur sa co-culture avec la souche bioluminescente L monocytogenes GGe\ . 48 heures avant la co-culture, une microplaque G1 (génération 1) est décongelée et 15 pL de cultures sont transférés dans les puits d’une microplaque (Corning 3370) contenant 135 pL par puits de matrice sélectionnée. Cette microplaque de pré-culture notée G2 est incubée pendant 48 h à 30°C. Après incubation, les microplaques G2 contenant C. maltaromaticum CNCM I-5804 sont diluées par dilution décimale jusqu’au 1/10 000, par transfert de 15 pL de cultures dans des microplaques notées G3) contenant 120 pL par puit de matrice sélectionnée. Ces différentes dilutions permettent d’évaluer les magnitudes des effets inhibiteurs exercés par la souche de biopréservation à différents niveaux d’inoculum. Les microplaques correspondant aux dilutions de facteurs 102 (D2), 103 (D3) et 104 (D4) sont des microplaques blanches opaques (Corning 3917) adaptées à la lecture de la luminescence en limitant la diffusion de lumière inter-puits, et sont celles faisant l’objet de co-cultures.
24 heures avant la co-culture, L. monocytogenes EGDelux est cultivée par transfert de 100 pL de starter dans 10 mL de TSBYE et incubation à 30 °C. Cette culture est lavée à deux reprises avant utilisation pour la co-culture. Chaque lavage se fait par centrifugation à 5000 g pendant 5 min, retrait du surnageant et remise en suspension du culot dans de l’eau physiologique stérile. Cette culture est alors diluée au 1/10 000 dans de l’eau physiologique et 15 pL de cette dilution sont transférés aux puits des microplaques G3 (D2, D3 et D4) immédiatement après préparation.
La mesure de l’activité anti-Z.. monocytogenes est effectuée par suivi cinétique de luminescence. Les co-cultures sont incubées sous agitation axiale à 30°C pendant 36 h et leur luminescence est mesurée toutes les 20 min à l’aide d’un lecteur de plaque Infinite 200 (Tecan). L’expérience a fait l’objet de 3 répétitions indépendantes pour chaque matrice.
Indicateur de perturbation de la luminescence (LDI)
La mesure de l’inhibition de L. monocytogenes EGDelux par C. mattaromaticum CNCM I-5804 se fait par le calcul de l’indicateur de perturbation de la luminescence (LDI, Luminescence Disturbance Indicator):
1 y 1 LDI = - > - n j t
Où n désigne le nombre de mesures, l la luminescence exprimée dans une unité arbitraire et t le temps en secondes.
Une mesure relative dérivée, l’indicateur d’inhibition de luminescence LDIr, est calculée ainsi :
LDI
LDIr = 100 x
LDIc Où LDI désigne une valeur obtenue dans n’importe quelle condition et LDIc la valeur obtenue en l’absence d’inhibition, c’est-à-dire le LDI de la souche témoin de bioluminescence L. monocytogenes EGDelux seule. Pour ces travaux, l’indice utilisé est 100-LD/r. Ainsi, cette valeur vaut 0 pour le témoin L. monocytogenes EGDelux et une valeur positive indique une inhibition de la luminescence.
Résultats :
La Figure 4 présente un exemple de cinétique de luminescence de la souche indicatrice L. monocytogenes EGDelux en l’absence ou en présence de souche de biopréservation C. mattaromaticum CNCM I-5804. Le niveau de luminescence produit par la souche indicatrice reflète son taux de croissance spécifique. La diminution du niveau de luminescence de la souche indicatrice par rapport au témoin (EGDelux) lorsque celle-ci était cultivée en présence de la souche de biopréservation (C. mattaromaticum CNCM I-5804) indique une inhibition de sa croissance.
L’indicateur de perturbation de la luminescence relatif (LDIr) a été calculé de manière à synthétiser les cinétiques de luminescence mesurées. Une mesure dérivée, 100- LDIr, permet d’obtenir une valeur de force de l’inhibition de la luminescence exercée par la souche de biopréservation. Les résultats montrent qu’au niveau d’inoculum D3, et dans l’ensemble des matrices testées, la souche C. mattaromaticum CNCM I-5804 exerçait un effet inhibiteur sur la souche indicatrice L. monocytogenes EGDelux (Figure 5). Le plus fort niveau d’inhibition mesuré était dans le milieu témoin TSB sans glucose, où la souche C. maitaromaticum CNCM I-5804 inhibait 96,6% ± 2,4% de la luminescence de la souche indicatrice. Les niveaux d’extinction de la luminescence de la souche indicatrice par C. maitaromaticum CNCM I-5804 étaient particulièrement élevés dans les matrices saucisse végétale (91 ,3% ± 3,5%), truite fumée (90,3% ± 3,4%) et boisson soja (87,8% ± 4,9%), et comparables au niveau d’inhibition observé en milieu de laboratoire TSBYE avec glucose (88,3 ± 7,8%). Les niveaux d’inhibition de la souche luminescente étaient élevés, bien que dans une moindre mesure, en boisson à l’avoine 72,6% ± 3,1 %) et en lait d’amande (59,6% ± 3,2%).
Sensibilité des propriétés inhibitrices de la souche C. maitaromaticum CNCM I-5804 au niveau d’inoculum L’utilisation de trois niveaux de dilution de la souche C. maltaromaticum C CM 1-5804, à savoir 102 (D2), 103 (D3) et 104 (D4) a permis de calculer, pour chaque matrice, le coefficient de variation des forces d’inhibition toutes dilutions confondues (Figure 6). Ces coefficients de variation informent de la sensibilité de l’activité inhibitrice au niveau d’inoculation de la souche biopréservatrice. Les résultats montrent que les propriétés d’inhibition de la souche C. maltaromaticum CNCM I-5804 varient de manière importante en fonction du niveau d’inoculum en lait d’amande (99,1 % de variation). Ces propriétés montraient des niveaux de variation intermédiaires selon le niveau d’inoculum dans la boisson à l’avoine (53,9%) ainsi qu’en truite fumée (38,6%). En saucisse végétale, la variabilité de la réponse (31 ,1 %) était comparable à celle observée en milieu témoin TSBYE (26,6%). Enfin, la variabilité de la propriété d’inhibition en fonction du niveau d’inoculum était la plus faible en boisson au soja (20,4%), similaire à celle mesurée en milieu témoin TSBYE sans glucose (19,3%).
En conclusion, les co-cultures de la souche indicatrice avec C. maltaromaticum CNCM I-5804 montrent d’une part que la souche de biopréservation présente une capacité d’inhibition de L monocytogenes EGDelux élevée dans l’ensemble des matrices retenues et plus particulièrement dans les matrices dérivées de saucisse végétale, truite fumée et boisson au soja. D’autre part, l’inoculation de la souche C. maltaromaticum CNCM I-5804 à différents niveaux (1/100, 1/1000 et 1/10000) a montré que ses capacités inhibitrices étaient peu affectées par ces niveaux pour les matrices issues de truite fumée, de saucisse végétale (25% < CV < 50 %), et de boisson au soja (CV < 25%).
Exemple 5 - Challenge tests en modèle fromager de type pâte molle
L’objectif de ces travaux est d’évaluer l’effet anti-Z.. monocytogenes d’une souche de C. maltaromaticum (CNCM I-5804) en modèle fromager de type pâte molle. Ces challenge tests ont été réalisés à l’UMRF (Aurillac).
Matériel et méthodes
Une fabrication comprenait 2 cuves de 5 L de lait (2 fromages de 250g/cuve) dont 1 cuve essai avec L monocytogenes et C. maltaromaticum CNCM I-5804, et 1 cuve témoin avec L. monocytogenes seule sans culture protectrice. Le lait utilisé était du lait pasteurisé et standardisé (MG=taux protéique, MG/TP=1). Les ferments utilisés pour la technologie pâte molle étaient le Flora Danica et le ferment RNA. Les ferments de surface étaient Geotrichum candidum (ferment LIP Jacynthe) et Pénicillium candidum (ferment LIP Edelweiss). Deux fabrications ont été réalisées le même jour, avec le même lait.
La souche CNCM I-5804 a été précultivée pendant 24h à 30°C dans un milieu TSB- YE (10mL). La préculture a été lavée deux fois : centrifugation à 5000g pendant 10 minutes puis reprise du culot dans un même volume d’eau physiologique. Après le deuxième lavage, le culot est repris dans 10 mL de lait entier UHT. Ces 10 mL sont utilisés pour ensemencer une culture de 100 mL de lait entier UHT qui est incubée 48 heures à 30°C avant d’être congelée à -20°C jusqu’à utilisation. Pour L. monocytogenes, un mélange de 5 souches a été utilisé, comprenant les souches Scott A, CA2165 Fromage-CA Wisconsin E. Ryser, SN167 (souche isolée de fromage St- Nectaire), Lal65 (souche isolée de fromage Laguiole) et PL1547. Après pré-culture, les 5 souches sont mélangées et dénombrées sur milieu PALCAM à 37°C, puis le mélange est conservé à - 80°C.
Le mélange de L. monocytogenes (50 UFC.mL 1) et de la souche C. maitaromaticum CNCM I-5804 (106-107 UFC.mL-1) a été inoculé dans le lait à J-1 (début maturation froide = T0). Les ferments Flora Danica et RNA ont été inoculés à 1 % à mi-maturation froide (T8h J-1). Après salage, Geotricum candidum et Pénicillium candidum ont été pulvérisés en surface.
Des échantillons ont été prélevés à différentes étapes de la fabrication. Un flacon de 30 mL de lait a été prélevé à T0 (J-1) en début de maturation froide, à T8h (J-1) à mi- maturation froide et à T20h (J-1) en fin de maturation froide. Afin d’énumérer L. monocytogenes, 30 g de fromage ont été prélevés à T5j, T15j et T40j.
Listeria monocytogenes a été dénombrée sur gélose PALCAM à chaque prélèvement (mélange pâte et croûte pour les fromages). Pour les dilutions 10° (laits) et 10 1 (fromages), les conditions d’ensemencement étaient de 1 mL sur 3 boîtes. Les extraits secs de la pâte ont été mesurés sur les échantillons de fromage à T40j.
Résultats
Microbiologie Dans les fromages témoins, L monocytogenes, inoculée à 1 ,7 logio UFC.mL 1 dans le lait, croît au-delà de 20h après emprésurage et sa croissance se poursuit jusqu’à T4Oj avec en moyenne 3,5 logio UFC.g 1 à T5j, 4,4 logio UFC.g 1 à T 15j et 5,8 logio UFC.g 1 à T40j (Figure 7, Tableau 1). Tableau 1. Dénombrements de L monocytogenes (logio UFC.g 1) dans les fabrications fromagères en l’absence et en présence de la souche CNCM I-5804.
Dans les fromages inoculés avec la culture bioprotectrice, la croissance de L monocytogenes est inférieure à celle observée dans les fromages témoins tout au long de l’affinage. Une réduction moyenne de L. monocytogenes de 1 ,1 logio UFC.g- 1 à T5j, T15j et T40j est observée pour les fromages inoculés avec la souche CNCM I-5804 par rapport au témoin.
Physico-chimie
Une très bonne reproductibilité du point de vue du déroulement de la technologie fromagère apparaît au travers des mesures de pH (Tableau 2) et d’extraits secs de la pâte (Tableau 3).
Tableau 2. Mesures de pH dans les fabrications fromagères en absence et en présence de la souche CNCM 1-5804.
Tableau 3. Mesures d'extraits secs de la pâte dans les fabrications fromagères après 40 jours d’affinage.
Les valeurs de pH et d’extraits secs sont correctes par rapport aux valeurs attendues dans la technologie pâte molle. Ainsi la souche bioprotectrice testée n’a pas d’impact significatif sur l’évolution du pH au cours de la production.
Conclusion
Les résultats de dénombrement de L. monocytogenes et les calculs d’inhibition par rapport au témoin montrent une efficacité de la souche CNCM 1-5804 dans les fromages, et les analyses physico-chimiques montrent que la souche est compatible avec la technologie pâte molle.
Exemple 6 - Recherche de potentielles incompatibilités entre CNCM 1-5804 et d’autres souches bioprotectrices
L’objectif de ces travaux est de vérifier l’absence de halo d’inhibition indicateurs d’un phénomène de compétition par interférence entre une sélection de souches bioprotectrices et C. mattaromaticum CNCM 1-5804.
Matériel et méthodes
Les souches émettrices sélectionnées pour cet essai sont C. mattaromaticum CNCM 1-5242, Lactobacillus plantarum (HOLDBAC®) et C. maltaromaticum CNCM 1-5243. La souche indicatrice est C. maltaromaticum CNCM 1-5804, permettant d’évaluer la compatibilité avec les autres souches de biopréservation. Listeria monocytogenes EGDe est utilisée comme souche indicatrice témoin permettant de vérifier la production d’une substance inhibitrice diffusible par les souches émettrices sélectionnées. Dix millilitres de bouillon trypticase-soja (TSB, 30 g.L 1) supplémentés par de l’extrait de levure (YE, 6 g.L 1) (TSBYE) sont ensemencés à l’aide d’une ose stérile, par transfert d’un prélèvement provenant de cultures de ces souches conservées à -80°C. En parallèle de ces conditions d’inoculation, un autre bouillon TSBYE est inoculé avec la souche C. maltaromaticum CNCM I-5243 à partir de culture lyophilisée (Lallemand Speciality Cultures). Les bouillons inoculés sont incubés à 30°C pendant 24 h.
Après 24h de culture, une gélose TSAYE (TSBYE supplémenté de 12 g.L 1 d’agar bactériologique) est inoculée avec la culture de C. maltaromaticum CNCM I-5804 ou de L. monocytogenes EGDe diluées au 1/100. Les géloses ainsi préparées sont placées à 4°C pendant 30 min. En parallèle, les cultures émettrices sont centrifugées à 5000 g pendant 10 min. Les surnageants de cultures sont traités thermiquement pendant 30 min à 80°C de manière à détruire d’éventuelles cellules en suspension. Des puits sont percés dans les géloses à l’aide d’une cloche de Durham stérile, puis 25 pL des surnageants traités y sont déposés. Les géloses sont alors incubées 48h à 30°C avant lecture.
Résultats
Les résultats révèlent la présence d’un halo d’inhibition autour de chaque dépôt de surnageant de culture de souche biopréservatrice sur la gélose contenant L monocytogenes EGDe, confirmant la production de substances inhibitrices diffusibles par ces souches (Figure 8A). Sur la gélose contenant C. maltaromaticum CNCM I- 5804, un halo d’inhibition est observé autour du dépôt de surnageant de culture de la souche L piantarum (HOLDBAC®), suggérant une capacité de cette souche à inhiber CNCM I-5804 (Figure 8B, dépôt H). Toutefois, aucun halo d’inhibition n’a été observé autour des dépôts correspondant aux surnageants des souches de C. maltaromaticum testées, suggérant l’absence d’incompatibilité majeure entre les souches C. maltaromaticum CNCM I-5242 et CNCM I-5804, ni entre C. maltaromaticum CNCM I- 5243 et CNCM I-5804.
Conclusion
Les tests d’activité en simple couche suggèrent l’absence d’incompatibilité majeure ente les souches C. maltaromaticum CNCM 1-5242 et C. maltaromaticum CNCM I- 5804, ainsi qu’entre les souches C. maltaromaticum CNCM 1-5243 et C. maltaromaticum CNCM 1-5804, ouvrant la possibilité de combiner ces différentes solutions de biopréservation.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Souche de Camobacterium mattaromaticum déposée sous le numéro CNCM I-5804.
[Revendication 2] Préparation bactérienne comprenant la souche CNCM 1-5804.
[Revendication 3] Préparation bactérienne selon la revendication 2, ladite préparation comprenant en outre un ferment lactique et/ou un ferment d’affinage.
[Revendication 4] Préparation bactérienne selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que ladite préparation est une culture protectrice de C. mattaromaticum.
[Revendication 5] Préparation bactérienne selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que ladite préparation comprend en outre au moins une souche de C. mattaromaticum différente de CNCM I-5804.
[Revendication 6] Utilisation d'une souche selon la revendication 1 ou d'une préparation bactérienne selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 dans la préparation d'un produit alimentaire.
[Revendication 7] Utilisation selon la revendication 6, pour inhiber la croissance des bactéries du genre Listeria dans un produit alimentaire.
[Revendication 8] Produit alimentaire comprenant la souche CNCM I-5804.
[Revendication 9] Procédé de préparation d'un fromage, ledit procédé comprenant : - l'ensemencement par au moins une souche de C. maitaromaticum selon la revendication 1 ou une préparation bactérienne selon les revendications 2 à 5, dans le lait ou pendant la transformation du lait.
[Revendication 10] Procédé pour réduire la contamination microbienne lors du processus de fabrication d'un produit laitier fermenté caractérisé en ce que qu'il comprend l'addition d'une quantité de 102 UFC.mL 1 à 1011 UFC.mL-1, notamment de 106 à 107 UFC.mL 1, par rapport au volume du produit laitier, de C. maltaromaticum selon la revendication 1 ou une préparation bactérienne selon les revendications 2-5.
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