EP4634372A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von hypotaurin - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von hypotaurin

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EP4634372A1
EP4634372A1 EP22840570.0A EP22840570A EP4634372A1 EP 4634372 A1 EP4634372 A1 EP 4634372A1 EP 22840570 A EP22840570 A EP 22840570A EP 4634372 A1 EP4634372 A1 EP 4634372A1
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EP
European Patent Office
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hypotaurine
cds
cysteine
csad
expression
Prior art date
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Pending
Application number
EP22840570.0A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
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Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01095—Phosphoglycerate dehydrogenase (1.1.1.95)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/1102—Cysteine dioxygenase (1.13.11.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0103—Serine O-acetyltransferase (2.3.1.30)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01029—Sulfinoalanine decarboxylase (4.1.1.29)

Definitions

  • the invention relates to a process for the fermentative production of hypotaurine, characterized in that i) a microbial production strain is cultivated which is characterized in that it
  • cds a coding sequence
  • cdsB a coding sequence encoding a cysteine dioxygenase (CDO) belonging to the enzyme class EC 1.13.11.20
  • b a cds encoding a cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD) belonging to the enzyme class EC 4.1.1.29
  • c is a cds encoding a 3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA) with a feedback inhibition by serine that is reduced by at least a factor of two compared to the corresponding wild-type enzyme
  • d is a cds encoding a serine-O-acetyl-transferase (CysE) with a feedback inhibition by
  • the expression of the cds a and b in the expression vector is coordinated with the expression of at least one cds selected from the group consisting of c, d and e in a polycistronic expression unit,
  • hypotaurine is secreted by the production strain into the fermentation supernatant and (ii) the fermentation supernatant is isolated, whereby the hypotaurine content in the fermentation supernatant is at least 10 g/L and the molar ratio of hypotaurine:taurine in the fermentation supernatant is at least 3:1.
  • Hypotaurine (2-aminoethanesulphonic acid, CAS number 300-84-5) is an aminosulphonic acid that occurs naturally as a degradation product of the amino acid cysteine. As a sulphonic acid, hypotaurine acts as an antioxidant and is used in the food, feed, cosmetics and pharmaceutical sectors.
  • hypotaurine is a biosynthetic precursor of taurine (2-aminoethanesulphonic acid, CAS number 107-35-7).
  • hypotaurine is produced chemically, e.g. starting from 2-aminoethanethiol hydrochloride. With the trend away from chemically produced ingredients, driven by consumer demands, a biotechnological process for producing hypotaurine is of interest.
  • Known biosynthetic pathways to hypotaurine and further to taurine, starting from L-cysteine, can be found, for example, in the KEGG Pathway database: "Taurine and hypotaurine metabolism”. The most important synthesis steps that lead from L-cysteine to hypotaurine and further to taurine are shown in equations (1) to (5).
  • L-cysteine is oxidized by the enzyme cysteine dioxygenase (CDO, EC 1.13.11.20) to L-cysteine sulfinic acid (3-sulfinoalanine, CAS number 207121-48-0).
  • Cysteamine is formally formed by decarboxylation of L-cysteine, but in mammals it is a reaction product of pantothenate biosynthesis, whereby the enzyme pantetheine hydrolase (EC 3.5.1.92) splits cysteamine from the precursor (R)-pantetheine.
  • pantetheine hydrolase EC 3.5.1.92
  • a cysteine decarboxylase has been described for bacteria, but only acts on the C-terminal cysteine of a precursor peptide as a partial reaction of the biosynthesis of a natural product and is not suitable for the production of cysteamine.
  • the pathway (2) to hypotaurine, starting from cysteine via cysteamine, is therefore technically irrelevant.
  • Cysteine sulfinate decarboxylase (CSAD, EC 4.1.1.29) decarboxylates L-cysteine sulfinic acid to hypotaurine (2-aminoethane sulfinic acid, CAS number 300-84-5).
  • Cysteamine dioxygenase (EC 1.13.11.19) oxidizes cysteamine with atmospheric oxygen to hypotaurine.
  • Known biotechnological processes are primarily aimed at the production of taurine, whereby hypotaurine is in many cases the main product due to the biosynthetic route followed.
  • the known biotechnological processes for the production of hypotaurine are characterized by the fact that the hypotaurine yields, as far as disclosed, are very low.
  • Honjoh et al. (2010) Amino Acids 38: 173-1183 describe a genetically modified yeast strain that heterologously expresses the CDO and CSAD genes from carp (Cyprinus carpio).
  • L-cysteine was added to the culture of the genetically modified strain, the production of hypotaurine was observed as the main product and a smaller proportion of taurine.
  • S. cerevisiae is capable of producing cysteine from its own metabolism, the external addition of L-cysteine to the culture medium was necessary to produce hypotaurine.
  • the approach of Honjoh et al. (2010) thus corresponds to a biotransformation of L-cysteine to hypotaurine. Intracellularly formed taurine was determined analytically, with and without H 2 O2 treatment (Table 1 in Honjoh et al. ). From the significantly higher taurine
  • hypotaurine was not quantified analytically.
  • the non-direct quantification of hypotaurine is surprising, since in the method section of Honjoh et al. a hypo- taurine analysis was carried out.
  • hypotaurine formation in baker's yeast has not been clearly proven and was only indirectly inferred from the increased taurine values after H2O2 oxidation.
  • WO 17/213142 A1 (Ajinomoto) describes taurine-producing strains by heterologous expression of genes encoding cysteine dioxygenase (CDO) and L-cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD) in an originally cysteine-producing strain. Constructs were made from various CDO and CSAD genes, each under the control of the known strong tac promoter. However, their suitability for hypotaurine or taurine production was not tested in strains optimized for cysteine production, but in strains of E. coli (max. cysteine production 2 pM, see Table 5 of WO 17/213142 Al, strain EcoT/pMW2ql 9 ) and Pantoea ananatis (max.
  • cysteine production 0 pM, see Table 5 of WO 17/213142 Al, strain PanT/pMW219), each with an inactivated tauABCD operon (named EcoT for E. coli and PanT for P. ananatis).
  • the tauABCD operon is known to encode genes for the degradation of taurine.
  • the main product was hypotaurine with a maximum yield of 450 pM (49.1 mg/L hypotaurine at 109.2 g/mol mol. weight of hypotaurine).
  • the low hypotaurine yields are not suitable for economic production.
  • the applications relate on the one hand to gene constructs that express a CDO gene and a CSAD gene, each functionally linked to its own promoter, as individual expression cassettes (each monocistronic).
  • gene constructs are also described which are said to express a CDO and a CSAD gene in the form of a fusion protein, combined as a single expression cassette under the control of just one promoter (monocistronic expression cassette).
  • the applications are mainly aimed at the production of taurine in plants, although no statements are made about yields. No measures to improve cysteine production with the aim of higher hypotaurine yields were described. Overall, the applications do not disclose an applicable process for the fermentative production of hypotaurine.
  • the object of the present invention was to provide a process for the fermentative production of hypotaurine with high yields in the fermentation supernatant. Since hypotaurine can oxidize to taurine according to the state of the art, it was also the object to ensure that the yield of hypotaurine significantly exceeds that of taurine.
  • the object is achieved by a process for the fermentative production of hypotaurine, characterized in that i) a microbial production strain is cultivated which is characterized in that it
  • cds a coding sequence
  • cdsB a coding sequence encoding a cysteine dioxygenase (CDO) belonging to the enzyme class EC 1.13.11.20
  • b a cds encoding a cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD) belonging to the enzyme class EC 4.1.1.29
  • c is a cds encoding a 3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA) with a feedback inhibition by serine that is reduced by a factor of at least two compared to the corresponding wild-type enzyme
  • d is a cds encoding a serine-O-acetyl-transferase (CysE) with a feedback inhibition by
  • hypotaurine is secreted by the production strain into the fermentation supernatant and ii) the fermentation supernatant is isolated, whereby the hypotaurine content in the fermentation supernatant is at least 10 g/L and the molar ratio of hypotaurine to taurine in the fermentation supernatant is at least 3:1.
  • a great advantage of the present invention is that a fermentative process for producing hypotaurine is disclosed in which, in the microbial production strain, the expression vectors designed according to the principle of metabolism engineering combine the expression units for increased cysteine production with expression units for hypotaurine production.
  • the polycistronic arrangement of at least one eds of cysteine metabolism with the eds for cysteine dioxygenase (CDO) and the eds for cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD) in an artificial operon under the control of only one promoter allows the coordinated expression of cysteine and hypotaurine metabolism genes in a production strain. This helps to avoid the accumulation of intermediates of metabolism, such as L-cysteine, and maximizes the hypotaurine yield.
  • the use of the claimed production strain in the process according to the invention is characterized in that no product accumulates in the biomass (fermenter cells). lated (see also Example 5).
  • This extracellular production or accumulation i.e. the biosynthesis of hypotaurine in the production strain followed by secretion (export, discharge) from the production strain into the culture medium, offers the great advantage that the volume in which hypotaurine can accumulate is not limited to the small volume of the cell contents (cystosol). This avoids high intracellular product concentrations leading to toxic effects. Far higher hypotaurine yields can therefore be achieved than with intracellular production.
  • the biomass based on the biomass contained in the fermenter broth, as described in Example 5, contains less than 1 g/l hypotaurine. It is particularly preferred that no hypotaurine is detectable in the biomass.
  • hypotaurine also has the advantage of simplified product isolation, since hypotaurine can be isolated directly from the fermentation supernatant without the need for complex mechanical or chemical disruption of the cells. How hypotaurine is secreted from the production strain is unknown. It may be a passive mechanism whereby hypotaurine diffuses through the cell membranes, or one or more transport proteins may be involved in the secretion.
  • a further advantage of the present invention is the low proportion of the by-product taurine, which is formed from hypotaurine through oxidation and reduces the hypotaurine yield.
  • the process according to the invention is therefore very well suited for industrial use, as it enables the economical production of hypotaurine thanks to the high hypotaurine yields in fermentation.
  • Metabolism engineering also called "pathway design” is, in contrast to biotransformation, a method of biotechnology in which the metabolic pathways of an organism are changed by optimizing or changing genetic and regulatory processes.
  • new or modified enzymes can be introduced into an organism, or genes of endogenous enzymes can be expressed in a stronger or weaker manner, thereby establishing new metabolic pathways in an organism or strengthening or weakening existing metabolic pathways.
  • the aim of metabolism engineering is for the organism to produce either a new metabolic product or a cell-specific metabolic product with an increased yield.
  • no starting materials specific to the metabolic product are used, such as an enzyme substrate, such as L-cysteine as a starting compound for the production of hypotaurine, but only a nutrient medium, also referred to as a culture medium, which is required for the growth of the organism in question and is composed of a C source (e.g. glucose), an N source (e.g.
  • the process for the fermentative production of hypotaurine disclosed in the present invention is a metabolism engineering process.
  • biotransformation is defined as the conversion of one or more reactants into a product under enzymatic catalysis, whereby the enzyme substrate is added to a reaction mixture with the enzyme and converted enzymatically.
  • L-cysteine is enzymatically oxidized to L-cysteine sulfinic acid. This reaction is catalyzed by a CDO enzyme (EC 1.13.11.20).
  • CDO enzyme EC 1.13.11.20
  • Gene and protein sequences of CDO enzymes are available, for example, in the NCBI database under the search term "cysteine dioxygenase".
  • the invention comprises Genes which code for proteins with CDO activity, including preferably CDO enzymes selected from Rattus norvegicus (rat), Homo sapiens (human), Cyprinus carpio (carp), Bos taurus (cattle), Capra hircus (goat), Gallus gallus (rooster) or Synechococcus (algae) or CDO enzymes homologous thereto.
  • the method is characterized in that the CDO is the CDO from Rattus norvegicus (CDOrn) with the sequence given in SEQ ID NO: 2 or an enzyme with CDO activity which is at least 80%, particularly preferably at least 90% and especially preferably at least 95% identical thereto.
  • the CDO is a protein having SEQ ID NO: 2.
  • the CDOrn-cds has the sequence given in SEQ ID NO: 1.
  • the CDO enzyme activity test can be carried out as follows: i) Preparation of the enzyme to be tested:
  • An enzyme produced by cultivation in a shake flask or in a fermentation can be used in the reaction as follows: as an aliquot from the culture broth that has not been further processed or as an aliquot of the cell suspension after re-isolation of the cells from the culture broth, e.g. by centrifugation or in the form of an aliquot of the cell homogenate a) after mechanical disruption of the cell suspension or b) in the form of chemically permeabilized cells (e.g. by chloroform) or as a cell extract after separation of particulate components from the cell homogenate or as an enzyme purified e.g. by chromatography.
  • the total protein concentration obtained can be determined using a commercially available Qubit 3.0 fluorometer from Thermo Fisher Scientific using the “Qubit® Protein Assay Kits” according to the manufacturer's instructions. ii) Determination of CDO enzyme activity:
  • L-cysteine (10 mM final concentration) is placed in a solution buffered to pH 7 with potassium phosphate and the reaction is started by adding the enzyme from i).
  • the test volume is 10 ml.
  • the temperature at which the test is carried out is 30°C.
  • the amount of enzyme used depends on the degree of purification. If culture broth, cell suspension of the reisolated cells, cell homogenate or cell extract are used, at least 0.1 mg of the enzyme fractions prepared in i) are used. In the case of purified enzyme, at least 10 pg of the purified enzyme fraction are used.
  • the detection limit of the HPLC method is 1 mg/L L-cysteine sulfinic acid. If less than 1 mg/L L-cysteine sulfinic acid is formed under the test conditions mentioned, then the mixture does not contain any active CDO.
  • L-cysteine sulfinic acid is enzymatically decarboxylated to hypotaurine.
  • This reaction is catalyzed by a CSAD enzyme (EC 4.1.1.29) or alternatively, with much lower enzyme activity, GAD enzyme (EC 4.1.1.15).
  • GAD enzyme EC 4.1.1.15
  • Gene and protein sequences of CSAD enzymes are available, for example, in the NCBI database under the search term "cysteine sulfinic acid decarboxylase”.
  • Gene and protein sequences of GAD enzymes are available, for example, in the NCBI database under the search term "glutamic acid decarboxylase".
  • the invention comprises genes encoding proteins with CSAD activity, including preferably CSAD enzymes selected from Cyprlnus carpio (carp), Rattus norvegicus (rat), Homo sapiens (human), Bos taurus (cattle), Capra hircus (goat), Gallus gallus (rooster), Eschericia coli or Synechococcus (algae) or CSAD enzymes homologous thereto.
  • CSAD enzymes selected from Cyprlnus carpio (carp), Rattus norvegicus (rat), Homo sapiens (human), Bos taurus (cattle), Capra hircus (goat), Gallus gallus (rooster), Eschericia coli or Synechococcus (algae) or CSAD enzymes homologous thereto.
  • the method is characterized in that the CSAD is the CSAD from Cyprinus carpio (CSADcc) with the sequence given in SEQ ID NO: 6 or an enzyme with CSAD activity that is at least 80%, particularly preferably at least 90% and especially preferably at least 95% identical thereto.
  • the CSAD is particularly preferably a protein with SEQ ID NO: 6.
  • the CSADcc-cds preferably has the sequence given in SEQ ID NO: 5 (nt 1-1503).
  • CSAD is the CSAD from Homo sapiens (CSADhs) with the sequence given in SEQ ID NO: 4 or an enzyme with CSAD activity that is at least 80%, particularly preferably at least 90% and especially preferably at least 95% identical thereto.
  • CSADhs Homo sapiens
  • the CSAD is a protein with SEQ ID NO: 4.
  • the CSADhs-cds has the sequence given in SEQ ID NO: 3 (nt 1-1509).
  • the CSAD enzyme activity test can be performed as follows: i) Preparation of the enzyme to be tested:
  • An enzyme produced by cultivation in a shake flask or in a fermentation can be used in the reaction as follows: as an aliquot from the culture broth which has not been further processed or as an aliquot of the cell suspension after re-isolation of the cells from the culture broth, e.g. by centrifugation or in the form of an aliquot of the cell homogenate c) after mechanical disruption of the cell suspension or d) in the form of chemically permeabilised cells (e.g. by chloroform) or as a cell extract after separation of particulate components from the cell homogenate or as a chromatographically purified enzyme, for example.
  • the total protein concentration obtained in each case can be determined, for example, with a commercially available Qubit 3.0 fluorometer from Thermo Fisher Scientific using the "Qubit® Protein Assay Kit” according to the manufacturer's instructions. ii) Determination of CSAD enzyme activity:
  • L-cysteine sulfinic acid (10 mM final concentration) is placed in a solution buffered to pH 7 with potassium phosphate and the reaction is started by adding the enzyme from i).
  • the test batch volume is 10 ml.
  • the temperature at which the test is carried out is 30°C.
  • the amount of enzyme used depends on the degree of purification. If culture broth, cell suspension of the reisolated cells, cell homogenate or cell extract are used, at least 0.1 mg of the enzyme fractions prepared in i) are used. In the case of purified enzyme, at least 10 pg of the purified enzyme fraction are used.
  • the detection limit of the HPLC method is 1 mg/L L-hypotaurine. If less than 1 mg/L hypotaurine is formed under the test conditions mentioned, then the mixture does not contain any active CSAD.
  • the open reading frame (ORF, synonymous with cds, coding sequence) is the region of DNA or RNA that begins with a start codon and ends with a stop codon and codes for the amino acid sequence of a protein.
  • the ORF is also known as the coding region or structural gene.
  • a gene, cistron or expression unit is the DNA section that contains all the basic information for producing a biologically active RNA.
  • a gene contains the DNA section from which a single-stranded RNA copy is produced by transcription and the expression signals that are involved in regulating this copying process.
  • the expression signals include at least one promoter, one transcription start, one translation start and one ribosome binding site (RBS). Other possible expression signals are a terminator and one or more operators.
  • bacterial proteins such as SerA or CysE begin with a capital letter, while the sequences encoding these proteins (cds) are designated with a lower case letter (e.g. serA or cysE).
  • the promoters controlling the expression of these cds are also designated with a lower case letter (e.g. serA promoter or cysE promoter).
  • proteins/enzymes and cds/genes of higher organisms such as Homo sapiens, Rattus norvegicus or Cyprinus carpio are designated with capital letters and, where appropriate, are each identified as protein/enzyme (e.g. CDO protein/enzyme or CSAD protein/enzyme) or cds/gene (e.g. CDO cds/gene or CSAD cds/gene).
  • a gene construct is a DNA molecule produced by cloning that includes at least one expression unit and can also include other genetic elements such as selection markers and replication origins.
  • the gene construct can be a linear DNA molecule integrated into the genome or a circular DNA molecule in the form of a plasmid, which is also known as a vector. This vector is then referred to as an expression vector.
  • the genetic elements of the vector When introduced into a suitable host strain (transformed), the genetic elements of the vector cause its extrachromosomal Inheritance during cell growth and production of the protein encoded by cds.
  • operons are often found in the genomes of microorganisms.
  • An operon is characterized by a DNA section from which several genes can be expressed in a coordinated manner.
  • An operon is a DNA section that contains all the basic information for producing a biologically active RNA.
  • the operon contains the DNA section from which a single-stranded RNA copy is produced by transcription and the expression signals that are involved in regulating this copying process.
  • the RNA copy does not just comprise the cds of a single gene, however, but the cds of two or more genes.
  • the expression signals of the operon comprise a promoter and a transcription start. Each cds of the operon comprises a translation start and a ribosome binding site. Other possible expression signals are a terminator and one or more operators.
  • a monocistronic expression unit If only one gene is expressed by a promoter, this is called a monocistronic expression unit. If two, three or more genes are expressed by a promoter, such an expression unit is called bicistronic, tricistronic, etc., or polycistronic.
  • Operons not only occur naturally in the genome of microorganisms, but can also be specifically produced by cloning ( artificial operons ).
  • the expression unit of an artificial operon also consists of a promoter functionally linked to two or more cds, each with an RBS connected in front of it (bi-, tri- or polycistronic expression unit).
  • an expression unit can also contain other genetic elements such as a terminator or operators.
  • the term "functionally linked" means that the expression unit comprising promoter and cds, or promoter and two or more cds in the case of an operon, leads to the transcription and translation of the cds in the microorganism.
  • a promoter is a nucleotide sequence upstream of the 5' end of the cds that enables the expression of a cds.
  • the promoter is located in the direction of synthesis before the coding region.
  • the promoter contains regions that determine the start of transcription of the gene by the RNA polymerase and can also mediate the specific interaction with DNA-binding proteins (transcription factors) that influence the strength of transcription.
  • all promoters active in the host strain are suitable as promoters of the above-mentioned cds. These include all native promoters of the approximately 5000 genes in E. coli, but also non-native (e.g. promoters from other species of the Enterobacteriaceae family) or "artificial" promoters such as the tac promoter.
  • Preferred promoters in the polycistronic expression unit are the cysE, serA and GAPDH promoters contained on pCys, particularly preferably the serA promoter, as described for example in Rex et al. (1991) , J. Bacteriol. 173: 5944-5953, Fig. 2, nt 1 - nt 457.
  • serA promoter having the sequence given in SEQ ID NO: 7.
  • mRNA also called messenger RNA
  • messenger RNA is a single-stranded ribonucleic acid (RNA) that carries the genetic information for building a protein.
  • RNA ribonucleic acid
  • An mRNA provides the construction instructions for a specific protein in a cell.
  • the mRNA molecule carries the message from the genetic information (DNA) required for protein building to the protein-building ribosomes. In a cell, it is formed as a transcript of a section of DNA belonging to a gene. The genetic information stored in the DNA is not changed in the process.
  • Genes of eukaryotic organisms are predominantly so-called mosaic genes and, in contrast to prokaryotic genes, also contain non-coding sections, so-called introns ('intragenic regions'). Coding sequences, so-called exons ('expressed regions') are DNA sections of a eukaryotic gene that, after transcription into RNA, are translated by the ribosomes into the amino acid sequence of a protein. The introns are spliced from the primary transcript after transcription of the DNA into RNA. The protein-coding RNA freed of introns is called messenger RNA (mRNA), also known as "mature" mRNA. This is subjected to further modifications such as capping and polyadenylation.
  • mRNA messenger RNA
  • the coding region of the mature mRNA is then translated into the protein sequence. If a eukaryotic gene with an exon/intron structure is to be expressed in prokaryotic organisms, it is necessary to translate the protein sequence or the coding region of the mature mRNA back into intron-free DNA, since the processing of the exon/intron structure does not take place in prokaryotes. When, in the context of this invention, reference is made to gene sequences derived from the protein sequence or from the mRNA, this is precisely the process of back translation that is meant. It is preferred that sequence optimization, i.e. adaptation to the codon usage of the corresponding prokaryote (codon optimization), takes place at the same time as the protein sequence or the mRNA sequence is translated back into DNA sequence.
  • sequence optimization i.e. adaptation to the codon usage of the corresponding prokaryote (codon optimization) takes place at the same time as the protein sequence or the mRNA sequence is translated back into DNA sequence.
  • homologous genes or homologous DNA sequences mean that the DNA sequences of these genes or DNA segments are at least 80%, preferably at least 90% and particularly preferably at least 95% identical.
  • the degree of DNA identity is determined by the program "nucleotide blast", found at http://blast. ncbi . nlm. nih . gov/ , which is based on the blastn algorithm.
  • the preset parameters were used as algorithm parameters for an alignment of two or more nucleotide sequences.
  • Homologous protein sequences mean that the protein sequences of these proteins or protein segments are at least 80%, preferably at least 90% and particularly preferably at least 95% identical.
  • the program "protein blast” on the website http://blast. ncbi . nlm. nih . gov/ is used to compare protein sequences. This program uses the blastp algorithm.
  • the preset parameters were used as algorithm parameters for an alignment of two or more protein sequences.
  • WT means wild type.
  • a wild type gene is the form of the gene that has arisen naturally through evolution and is present in the wild type genome.
  • the DNA sequence of Wt genes is publicly available in databases such as NCBI.
  • Alleles are defined as the states of a gene that can be converted into one another by mutation, ie by changes in the nucleotide sequence of the DNA.
  • the gene that occurs naturally in a microorganism is called the wild-type allele and the variants derived from it are called mutated alleles of the gene.
  • Fermentation is a process step for the production (cultivation) of cell cultures on an industrial scale, in which a preferably microbial production strain is made to grow under defined conditions of culture medium, temperature, pH, oxygen supply and medium mixing. If all components of the fermentation are determined at the beginning of the cultivation and then no longer changed, this is called batch fermentation.
  • feed process media components such as glucose (C source) or a complex amino acid mixture such as yeast extract (N source) are continuously added as a so-called feed, this is referred to as fed-batch fermentation (so-called feed process).
  • Fed-batch fermentation can optimize the formation of biomass and target product.
  • the aim of fermentation is, depending on the configuration (genetic makeup) of the production strain, the production of a protein/enzyme or a metabolic product, in each case with the highest possible yield for further use.
  • the product hypotaurine can be produced by fermentation.
  • the end product of the fermentation is a fermenter broth consisting of the biomass of the cells of the production strain (fermenter cells) and the fermentation medium freed of the biomass (fermentation supernatant) which was formed during the fermentation from the culture medium and the metabolic products secreted by the fermenter cells.
  • the culture medium which is defined by its chemical composition
  • the composition of the fermentation medium is not clearly defined due to the unpredictable formation of metabolic products.
  • the product hypotaurine is produced by fermentation.
  • the products of the fermentation can be found in the fermenter cells and/or in the fermentation medium. As disclosed in Example 5 of the present invention, hypotaurine is found within the detection limit exclusively in the fermentation medium. Therefore, only the hypotaurine produced by secretion into the fermentation medium is taken into account.
  • the method is preferably characterized in that the hypotaurine content in the fermentation supernatant, based on the hypotaurine content in the fermentation mixture, is over 70%, preferably over 80% and particularly preferably over 90%.
  • the hypotaurine content in the fermentation supernatant corresponds to the extracellular (secreted) hypotaurine.
  • the hypotaurine content in the fermentation mixture is the sum of the extracellular and intracellular hypotaurine content, also referred to as the total hypotaurine content.
  • the extracellular proportion of hypotaurine is determined as described in Example 3 (sample preparation).
  • the intracellular proportion of hypotaurine is determined as described in Example 5, with a detection limit of 1 mg/L hypotaurine in each case.
  • Shake flask culture is used to cultivate microorganisms on a laboratory scale, in contrast to production scale through fermentation. Although a certain medium and pH are specified for shake flask culture and the culture is carried out in the presence of oxygen and with constant movement (shaking), more defined conditions regarding the medium, temperature, pH, oxygen supply and medium mixing can be set and regulated in the fermenter. Culture on a smaller scale, e.g. in a shake flask, can also be used as a pre-culture for inoculating a culture on a larger scale, e.g. in a fermenter.
  • the production scale in fermentation typically starts at 0.5 L batch volume and can be up to 100,000 L or more.
  • the production scale in shake flask cultivation typically ranges from 10 ml to 1000 ml batch volume.
  • Yield in the sense of the invention is defined as the amount of product obtained by culturing a production strain.
  • the yield can be given in absolute amount of product (mmol or g) or as volume yield (concentration). tration) in volumetric amount of product (mM or g/L ).
  • the method according to the invention comprises a fermentative process for producing hypotaurine using a microbial production strain.
  • a production strain comprises, by definition, a microorganism, referred to as a host strain, and at least one gene construct.
  • the production strain is characterized in that the gene construct is an expression vector.
  • microorganism that is amenable to recombinant DNA techniques and that is suitable for the fermentative production of recombinant proteins is suitable as a host strain.
  • Suitable microorganism strains include bacterial strains selected from the Corynebacteriaceae family or the Enterobacteriaceae family, yeasts (e.g. Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica) or fungi (e.g. Aspergillus niger).
  • the host strain used to prepare the production strain is preferably a prokaryotic microorganism, particularly preferably a bacterial strain selected from the group consisting of Corymbebacterium ssp. (such as particularly preferably C. glutami cum), Pantoea ssp. (such as particularly preferably P. ananatis) and Escherichia ssp. and especially preferably a microorganism of the species Escherichia coli.
  • the microorganism is the strain E. coli K12 W3110, commercially available under the strain number DSM 5911 from the DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
  • a production strain for the fermentative production of at least 10 g/l hypotaurine is characterized by the fact that it contains a gene construct which ( I ) a pathway leading to hypotaurine defined by the expression of cds a ( encoding CDO) and b ( encoding CSAD) and
  • ( I I ) a deregulated cysteine biosynthesis pathway defined by the expression of at least one of the cds selected from the group consisting of c ( encoding SerA with reduced feedback inhibition by serine ), d ( encoding CysE with reduced feedback inhibition by cysteine ) and e ( encoding a cysteine exporter ).
  • the genes CDO and CSAD which constitute the hypotaurine metabolic pathway in the production strain can originate from the microorganism strain which is also the host strain (homologous expression) or they can be foreign genes (heterologous expression), either synthetically produced (including the adaptation of the cds to the expression in the host strain thereby made possible by so-called codon optimization) or isolated from strains other than the host strain, or they can be a combination of homologous and heterologous expression.
  • Heterologous expression of the genes of the hypotaurine metabolic pathway in the production strain is preferred, heterologous expression of synthetically produced genes is particularly preferred and especially preferred is heterologous expression of codon-optimized, synthetically produced genes of the hypotaurine metabolic pathway in the production strain.
  • a production strain containing a gene construct comprising expression units for a deregulated cysteine biosynthesis pathway and thus suitable for cysteine production is characterized in that it contains at least one of the cds selected from the group consisting of c, d and e: c)
  • the production strain comprises at least one modified serA gene, ie it contains at least one cds c coding for a 3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA) with a feedback inhibition by L-serine that is reduced by at least a factor of two compared to the corresponding wild-type enzyme, whereby the SerA enzyme activity can be determined, for example, photometrically by the oxidation of NADH dependent on the SerA substrate 3-phosphohydroxypyruvate, as described, for example, by McKitrick and Pizer, J.
  • the production strain can additionally contain the unmodified WT serA gene.
  • Particularly preferred variants of 3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA) have a feedback inhibition by L-serine that is reduced by at least a factor of 5, particularly preferably by at least a factor of 10 and, in a further preferred embodiment, by at least a factor of 50 compared to the corresponding wild-type enzyme.
  • - serA317 feedback-resistant SerA mutant as used in the present invention in the vector pCys (Fig. 1). It is a C-terminal deletion mutant of SerA comprising the N-terminal 317 amino acids of the SerA WT protein with a total length of 410 amino acids (Bell et al., Eur. J. Biochem., 2002, 269: 4176-4184, referred to therein as "NSD:317"; see also Example 1).
  • - serA G349E Mutation of glycine at position 349 of the WT SerA enzyme to glutamic acid.
  • - serA G349D Mutation of glycine at position 349 of the WT SerA enzyme to aspartic acid.
  • serA mutated serA gene in which 25% of the C-terminal amino acids are altered compared to WT, where i) the change is within the 50 C-terminal amino acids of the WT protein, ii) the change comprises a C-terminal deletion, and iii) the change comprises an insertion into the WT sequence.
  • the production strain comprises at least one modified cysE gene, ie it contains at least one cds d coding for a serine O-acetyl transferase (CysE) which, compared to the corresponding wild-type enzyme, has a feedback inhibition by cysteine reduced by at least a factor of two (as described, for example, in Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol.
  • CysE serine O-acetyl transferase
  • the CysE enzyme activity can be determined, for example, photometrically by the consumption of the CysE substrate acetyl-CoA as a result of the reaction with L-serine to form O-acetyl-L-serine, as described, for example, by Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611.
  • the production strain can additionally contain the unmodified WT cysE gene.
  • CysE serine-O-acetyl transferase
  • cysteine has a feedback inhibition by cysteine that is reduced by at least a factor of 5, particularly preferably by at least a factor of 10 and, in a further preferred embodiment, by at least a factor of 50, compared to the corresponding wild-type enzyme.
  • - cysEIV A237V, mutation of alanine at position 237 to valine and G238S, mutation of glycine at position 238 to serine (double mutant).
  • - cysEV A237V, mutation of alanine at position 237 to valine and G238S, mutation of glycine at position 238 to serine and M256I, mutation of methionine at position 256 to isoleucine (triple mutant).
  • T167A mutation of threonine at position 167 to alanine (used in the vector pCys, example 1).
  • V164A mutation of valine at position 164 to alanine and F267L, mutation of phenylalanine at position 267 to leucine (double mutant).
  • - cysEXIV T167A, mutation of threonine at position 167 to alanine and M256Stop, mutation of methionine at position 256 to stop (double mutant).
  • - cysEXVI D250G, mutation of aspartic acid at position 250 to glycine .
  • T167A mutation of threonine at position 167 to alanine and A237V
  • mutation of alanine at position 237 to valine and G238S mutation of glycine at position 238 to serine (triple mutant) .
  • Arabidopsis thaliana ( plant ): A. thaliana contains three cysE genes, two of which are feedback resistant to cysteine.
  • the production strain comprises at least one increased expression of cds e (overexpression) or an additional cds e encoding a cysteine exporter (-Ef fluxprotein), which leads to an increased expression of cysteine exporters, so that the cell of the production strain has a cysteine export from the cell that is increased by at least a factor of two compared to the corresponding starting strain (host strain), where the cysteine export can be determined by photometric measurement of the extracellular cysteine content according to Gaitonde, Biochem. J.
  • the increased expression of cysteine exporters preferably leads to an increase in cysteine export from the cell by at least a factor of 5, particularly preferably by at least a factor of 10, especially preferably by at least a factor of 20, compared to the parent strain (host strain).
  • the cds encoding the cysteine exporter is preferably one or more sequences selected from the group consisting of ydeD, yfiK, cydDC, bcr and emrAB from E. coli or a sequence that is at least 80%, particularly preferably at least 90% and especially preferably at least 95% identical thereto.
  • the cds which determine hypotaurine biosynthesis, and the cds , which determine the deregulated cysteine biosynthesis pathway, are present extrachromosomally on vectors in the microorganism strain, either combined on one vector or distributed across several vectors.
  • the process for producing hypotaurine is characterized in that the cds encoding CDO (a) and the cds encoding CSAD (b) are present in the expression vector of the microbial production strain with the cds encoding SerA with reduced feedback inhibition by serine (c) in a tricistronic expression unit, which is particularly preferably functionally linked to the serA promoter, which particularly preferably has the sequence given in SEQ ID NO: 7.
  • a tricistronic expression unit which is particularly preferably functionally linked to the serA promoter, which particularly preferably has the sequence given in SEQ ID NO: 7.
  • the 3 cds are present separately one after the other, each cds with its own RBS. Their expression occurs coordinately under the regulation of the same one promoter, which is preferably the serA promoter, but results in 3 separate proteins, not fusion proteins.
  • sequence in the operon such that in the tricistronic operon the promoter, preferably the serA promoter, is followed by the serA-cds, then the CDO-cds and finally the CSAD-cds.
  • SerA is preferably serA317. SerA317 is disclosed in Bell et al., Eur. J.
  • NSD serine feedback-resistant variant of 3-phosphoglycerate dehydrogenase .
  • the tricistronic Expression unit of serA, CDO and CSAD in the present invention allows the coupling of L-cysteine and hypotaurine metabolism by their coordinated expression under the control of the serA promoter.
  • the expression units serA317, CDOrn and CSADhs, or serA317, CDOrn and CSADcc form an artificial tricistronic operon, with expression taking place under the control of the serA promoter.
  • the serA promoter thus controls the expression of three cds in the gene constructs pCys-CDOrn-CSADhs and pCys-CDOrn-CSADcc, namely the expression of the cds encoding serA317 and the expression of the cds encoding the CDOrn enzyme, which was derived from the mRNA of the gene sequence from Rattus norvegicus (rn), as well as in the gene construct pCys-CDOrn-CSADhs the expression of the cds encoding the CSADhs enzyme, which was derived from the mRNA of the gene sequence from Homo sapiens (hs), or in the gene construct pCys-CDOrn-CSADcc the expression of the cds encoding the CSADcc enzyme, which was derived from the mRNA of the gene sequence from Cyprinus carpio (cc).
  • a particularly preferred gene construct which comprises a cds encoding SerA with reduced feedback inhibition by serine and functionally linked to the serA promoter (c), cysE with reduced feedback inhibition by cysteine and functionally linked to the cysE promoter (d) and a cysteine exporter, functionally linked to the promoter of the E. coli GAPDH gene (e) (GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) is the vector pCys disclosed in WO 2021/259491 (Wacker) and described in Example 1 (Fig. 1).
  • the process for producing hypotaurine is characterized in that the CDs encoding CDO (a), CSAD (b), SerA with reduced feedback inhibition by serine (c), CysE with reduced feedback inhibition by cysteine (d) and encoding the cysteine exporter (e) are all present on a single expression vector.
  • the process for producing hypotaurine is characterized in that the expression vector of the microbial production strain is selected from the gene constructs pCys-CDOrn-CSADhs or pCys-CDOrn-CSADcc. These gene constructs are disclosed in Example 1, Fig. 2 and Fig. 3, respectively.
  • the expression vector of the microbial production strain is the gene construct pCys-CDOrn-CSADcc.
  • the gene construct according to the invention thus comprises feedback-resistant alleles of the cysE and/or serA gene and/or a gene for a cysteine exporter such as preferably the ydeD efflux gene as well as genes coding for a CDO and a CSAD enzyme, wherein the CDO and the CSAD gene, each with its own RBS, are linked in polycistronic expression units with the cysE, serA and/or the cysteine efflux gene, such as preferably the ydeD gene.
  • a tricistronic operon is preferred, wherein the following configurations are conceivable, among others: a) serA-CDO-CSAD b) serA-CSAD-CDO c) cysE-CDO-CSAD d) cysE-CSAD-CDO e) ydeD-CDO-CSAD f) ydeD-CSAD-CDO.
  • a) and b) are preferably functionally linked to the serA promoter
  • c) and d) in the tricistronic operon are preferably functionally linked to the cysE promoter
  • e) and f) in the tricistronic operon are preferably functionally linked to the promoter of the E. coli GAPDH gene, whereby a) to f) can be functionally linked to any other promoter active in E. coli.
  • Preferred is a gene construct comprising a tricistronic operon comprising a) serA-CDO-CSAD or b) serA-CSAD-CDO.
  • a gene construct comprising a tricistronic operon comprising a) serA-CDO-CSAD.
  • the vector pCys (Fig. 1) described in WO 2021/259491 (Wacker) was expanded to include the genes for cysteine dioxygenase from Rattus norvegicus (CDOrn), SEQ ID NO: 1, encoding a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, for L-cysteine sulfinic acid decarboxylase from Homo sapiens (CSADhs), SEQ ID NO: 3, nt 1 to nt 1509, encoding a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, or for L-cysteine sulfinic acid decarboxylase from Cyprinus carpio (CSADcc), SEQ ID NO: 5, nt 1 to nt 1503, encoding a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • CDOrn the genes for cysteine dioxygenase from Rattus norvegicus
  • SEQ ID NO: 1 encoding a protein with the amino acid sequence
  • the vectors pCys-CDOrn-CSADhs (Fig. 2) and pCys-CDOrn-CSADcc (Fig. 3) were created for the production of hypotaurine.
  • the gene constructs were produced in accordance with the state of the art, preferably using standard recombinant DNA techniques, as described in Example 1 and as are familiar to the person skilled in the art.
  • the CDOrn and CSADhs genes are cloned in the form of an artificial tricistronic operon, each with its own ribosome binding site (RBS) but without its own promoter, behind the serA317 gene contained in pCys, so that their expression occurs under the control of the serA promoter.
  • RBS ribosome binding site
  • the CDOrn and CSADcc genes are cloned in the form of an artificial tricistronic operon, each with its own ribosome binding site (RBS) but without its own promoter, behind the serA317 gene contained in pCys, so that their expression occurs under the control of the serA promoter.
  • RBS ribosome binding site
  • the production of a production strain is carried out in a known manner by transformation of the gene construct according to the invention into the microorganism (host strain), preferably of the gene construct pCys-CDOrn-CSADhs or the gene construct pCys-CDOrn-CSADcc, particularly preferably of the gene construct pCys-CDOrn-CSADcc into the host strain E. coli K12 W3110.
  • the fermentation of production strains according to the invention which are characterized by the previously unknown coordinated expression of the CDO and CSAD genes from a polycistronic, preferably tricistronic operon under the control of the serA promoter derived from cysteine metabolism, enables a surprisingly much higher production of hypotaurine than the prior art.
  • WO 17/213142 Al (Ajinomoto) discloses hypotaurine yields in E. coli of max. 450 pM, corresponding to 49.1 mg/L hypotaurine at 109.2 g/mol mol. weight of hypotaurine. Honjoh et al.
  • hypotaurine in yeast with yields of 85.3 pmol/g dry biomass, corresponding to 9.3 mg/g hypotaurine at 109.2 g/mol mol. weight of hypotaurine.
  • L-cysteine had to be added to the culture medium as a substrate for hypotaurine biosynthesis (see "Materials and Methods" in Hon oh et al . ).
  • the process for the fermentative production of hypotaurine characterized in that the fermentation volume is at least 1 L, with the production scale of at least 10 L being particularly preferred, of at least 1000 L being particularly preferred and a fermentation volume of at least 10,000 L being especially preferred.
  • the hypotaurine content can be quantified from the culture broth.
  • an aliquot of 1 ml is taken from the culture broth with a cell density ODgoo/ml of at least 1.0/ml, for example, incubated for 5 minutes at 80 °C, then all solid components are separated, for example by centrifuging for five minutes at maximum speed in a table centrifuge and the supernatant is quantified by HPLC calibrated for hypotaurine and taurine, as described for hypotaurine and taurine in example 3, among others.
  • the yield of the product hypotaurine at the end of the fermentation after a fermentation time of preferably a maximum of 65 hours is preferably at least 10 g/L, particularly preferably at least 20 g/L and especially preferably at least 50 g/L, far more than known in the prior art (e.g. 49.1 mg/L hypotaurine in WO 17/213142 A1).
  • the process according to the invention thus enables the fermentative production of hypotaurine in previously unknown yields for applications in the food, feed and pharmaceutical sectors.
  • the fermentative process according to the invention is further characterized in that it allows the production of hypotaurine in a high molar excess compared to the by-product taurine.
  • the molar excess is defined as the quotient of the molar hypotaurine concentration in the fermentation supernatant at the end of the fermentation divided by the molar taurine concentration in the fermentation supernatant at the same time.
  • the molar excess hypotaurine:taurine is at least 3:1, preferably at least 5:1, particularly preferably at least 10:1 and especially preferably at least 20:1.
  • Media for growing the production strain in shake flasks and by fermentation are familiar to the expert from the practice of microbial cultivation. They typically consist of a carbon source (C source), a nitrogen source (N- Source) as well as additives such as vitamins, salts and trace elements as well as a sulphur source (S-source) which optimises cell growth and hypotaurine production.
  • C source carbon source
  • N- Source nitrogen source
  • S-source sulphur source
  • C sources are those that can be used by the production strain to form hypotaurine products. These include all forms of monosaccharides, including C6 sugars (hexoses) such as glucose, mannose, fructose or galactose and C5 sugars (pentoses) such as xylose, arabinose or ribose, as well as all conceivable di- and polysaccharides formed from them, such as sucrose, lactose, maltose, maltodextrin, starch, or the monomers or oligomers released from them by hydrolysis (enzymatic or chemical).
  • C6 sugars hexoses
  • pentoses such as xylose, arabinose or ribose
  • di- and polysaccharides formed from them such as sucrose, lactose, maltose, maltodextrin, starch, or the monomers or oligomers released from them by hydrolysis (enzymatic or chemical).
  • C sources other than sugars or carbohydrates are acetic acid (or acetate salts derived from it), ethanol, glycerin, citric acid (and their salts) or pyruvate (and its salts).
  • Gaseous C sources such as carbon dioxide or carbon monoxide are also conceivable.
  • Preferred C sources for growing the production strain are glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose and arabinose, among which glucose and sucrose are particularly preferred and glucose is especially preferred.
  • N sources are those that can be used by the production strain to form biomass. Examples of sources that can be used include:
  • Ammonia gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH or its salts such as ammonium sulphate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate or ammonium nitrate and/or
  • nitrate salts such as KNO 3 , NaNO 3 , ammonium nitrate, Ca(NO 3 ) 2 , Mg(NO 3 ) 2 and other N sources such as urea and/or
  • - complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor (liquid or dried as so-called CSD) and/or - NZ-amines and/or
  • the addition of a sulfur source is necessary for the efficient production of hypotaurine.
  • the continuous addition can be carried out as a pure feed solution or in a mixture with another feed component such as glucose.
  • the process is preferably characterized in that it is carried out in the presence of at least one compound selected from the group consisting of a salt of sulfates, sulfites, dithionites, thiosulfates and sulfides, whereby the use of the respective acids is also conceivable given a given stability.
  • Preferred sulfur sources are salts of sulfates, sulfites, thiosulfates and sulfides, particularly preferably salts of sulfates and thiosulfates.
  • the process is particularly preferably characterized in that it is carried out in the presence of salts of thiosulfate.
  • a compound selected from the group consisting of sodium thiosulfate, ammonium thiosulfate and mixtures thereof is particularly preferred as the salt of thiosulfate.
  • the cultivation can be carried out in the so-called batch mode, i.e. in order to obtain biomass, the culture medium is inoculated with a starter culture of the production strain (microorganism cells carrying one or more gene constructs) and then the cell growth takes place without further feeding of nutrient sources.
  • the cultivation can also be carried out in the so-called fed-batch mode (also called cultivation in the feed mode), i.e. a method for obtaining biomass in which, after an initial phase of growth in the batch mode, additional nutrient sources are fed (feed).
  • the feed can consist of the C source, the N source, the sulphur source, one or more vitamins or trace elements that are important for production, or a combination of the above.
  • the feed components can be together as a mixture or separately in individual feed lines.
  • other media components and additives that specifically increase hypotaurine production can also be added to the feed.
  • the feed can be fed continuously or in portions (discontinuously), or also in a combination of continuous and discontinuous feed.
  • the process according to the invention for the fermentative production of hypotaurine with a microbial production strain is preferably characterized in that the fermentative process is a process in fed-batch mode.
  • Preferred C sources in the feed are glucose, sucrose and plant hydrolysates containing glucose or sucrose as well as mixtures of the preferred C sources in any mixing ratio.
  • the particularly preferred C source in the feed is glucose.
  • the C source is added to the culture in such a way that the content of the carbon source in the fermenter during the production phase does not exceed 10 g/L.
  • a maximum concentration of 2 g/L is preferred, particularly preferably 0.5 g/L, especially preferably 0.1 g/L.
  • N sources in the feed are ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH and its salts ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium acetate and ammonium chloride, as well as urea, KNO 3 , NaNO 3 and ammonium nitrate, yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor as well as NZ amines and yeast nitrogen base, among which particularly preferred are ammonia or ammonium salts, yeast extract, soy peptone or corn steep liquor (liquid or in dried form).
  • Preferred sulphur sources in the feed are salts of sulphates, sulphites, thiosulphates and sulphides, particularly preferred are salts of sulphates and thiosulphates and particularly preferred are Salts of thiosulfate, such as sodium thiosulfate and ammonium thiosulfate.
  • Further media additives that can be added include salts of the elements phosphorus, chlorine, sodium, magnesium, nitrogen, potassium, calcium, iron and, in trace amounts (i.e. in pM concentrations), salts of the elements molybdenum, boron, cobalt, manganese, zinc, copper and nickel.
  • organic acids e.g. acetate, citrate
  • amino acids e.g. isoleucine
  • vitamins e.g. vitamin B1, vitamin B6
  • the pH range is preferably from pH 5 to pH 9.
  • a pH range of pH 5.5 to pH 8 is particularly preferred.
  • a pH range of pH 6.0 to pH 7.5 is particularly preferred.
  • the preferred temperature range for the growth of the production strain is 20°C to 40°C. Particularly preferred is the temperature range from 25°C to 37°C and especially preferred is from 28°C to 34°C.
  • the growth of the production strain can occur optionally without oxygen supply (anaerobic cultivation) or with oxygen supply (aerobic cultivation). Aerobic cultivation with oxygen is preferred.
  • a saturation of the oxygen content of preferably at least 10% (v/v), particularly preferably at least 20% (v/v) and especially preferably at least 30% (v/v) is set.
  • the regulation of the oxygen saturation in the culture takes place automatically according to the state of the art via a combination of gas supply and stirring speed.
  • the oxygen supply can be ensured by introducing compressed air or pure oxygen.
  • the preferred method is aerobic cultivation by introducing compressed air.
  • the range of compressed air supply in aerobic cultivation is preferably 0.05 vvm to 10 vvm (vvm: introduction of compressed air into the fermentation mixture, expressed in liters of compressed air per liter of fermentation volume per minute).
  • a compressed air introduction of 0.2 vvm to 8 vvm is particularly preferred, particularly preferably from 0.4 to 6 vvm and especially preferably from 0.8 to 5 vvm.
  • the maximum stirring speed is preferably 2500 rpm, more preferably a maximum of 2000 rpm and especially preferably a maximum of 1800 rpm.
  • the cultivation period is preferably between 10 h and 200 h.
  • a cultivation period of 20 h to 120 h is particularly preferred.
  • a cultivation period of 30 h to 100 h is particularly preferred.
  • the claimed microbial production strain is cultivated in step i and the fermentation supernatant is isolated in step ii.
  • Hypotaurine can be used directly or isolated from the fermentation medium.
  • Various analytical methods for identifying, quantifying and determining the degree of purity of the hypotaurine are available, including spectrophotometry, NMR, gas chromatography, HPLC, mass spectroscopy, gravimetry or a combination of these analytical methods.
  • Fig . 1 pCys .
  • Fig. 2 pCys-CDOrn-CSADhs .
  • Fig. 3 pCys-CDOrn-CSADcc .
  • TetR gene that confers resistance to tetracycline.
  • serA317 serA (3-phosphoglycerate dehydrogenase gene, encodes amino acids 1 to 317)
  • cds cysE X cysE (serine-O-acetyltransferase gene, feedback resistant) cds
  • ORF306 ydeD (cysteine efflux gene) cds
  • PpuMI cleavage site for the restriction enzyme
  • CDOrn CDO (cysteine dioxygenase) R. norvegicus cds
  • CSADhs CSAD (cysteine sulfinic acid decarboxylase) H. sapiens cds
  • CSADcc CSAD (cysteine sulfinic acid decarboxylase) C. carpio cds
  • RBS Ribosome binding site
  • the vectors pCys-CDOrn-CSADhs and pCys-CDOrn-CSADcc are derived from the vector pCys (Fig. 1).
  • pCys: pCys is disclosed in WO 2021/259491 (Wacker) and is a derivative of the plasmid pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306.
  • the plasmid pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 contains the replication origin and a tetracycline resistance gene (starting vector pACYC184) as well as the cysEX allele (synonym cysE-
  • pCys also contains, cloned behind the ydeD (ORF306) efflux gene, the serA317 gene fragment, coding for the N-terminal 317 amino acids of the SerA protein (total length 410 amino acids).
  • the E. coli serA gene is disclosed in the "GenBank" gene database with the gene ID 945258.
  • serA317 is disclosed in Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176- 4184, referred to therein as "NSD:317" and encodes a serine feedback-resistant variant of 3-phosphoglycerate dehydrogenase.
  • the expression of serA317 is controlled by the serA promoter.
  • the serA promoter according to SEQ ID NO: 7 is disclosed in Rex et al. (1991) , J. Bacteriol. 173: 5944-5953, Fig. 2, nt 1 - nt 457.
  • plasmid DNA of the vector pCys was cut with Seal and PpuMI and the 6.1 kb vector fragment was isolated after preparative agarose gel electrophoresis (QIAquick® Gel Extraction Kit, Qiagen), hereinafter referred to as pCys-Scal/PpuMI.
  • CDOrn The amino acid sequence of the cysteine dioxygenase from Rattus norvegicus , derived from the mRNA of the gene, is disclosed in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database under the sequence ID: AAH70509.1. From the amino acid sequence, a DNA sequence codon-optimized for expression in E. coli (publicly available Eurofins Genomics GENEius software) was derived and synthetically produced (Eurofins Genomics) . The CDOrn DNA sequence is disclosed in SEQ ID NO: 1, coding for a protein with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The CDOrn DNA was synthetically produced (Eurofins Genomics) .
  • CSADhs-rrnB The amino acid sequence of the cysteine dioxygenase from Rattus norvegicus , derived from the mRNA of the gene, is disclosed in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database under the sequence ID: AAH70509.1. From the amino acid sequence
  • CSADhs The amino acid sequence of cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSADhs) from Homo sapiens is disclosed in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database under the sequence ID: XP_016861786.1. CSADhs is deposited there as "acidic amino acid decarboxylase GADL1 isoform XI".
  • a DNA sequence publicly available Eurofins Genomics GENEius software codon-optimized for expression in E. coli was derived from the amino acid sequence.
  • This DNA sequence, designated CSADhs-cds is disclosed in SEQ ID NO: 3, nt 1 to 1509, coding for a protein with the amino acid sequence from SEQ ID NO: 4.
  • the DNA sequence of the E. coli rrnB terminator (SEQ ID NO: 3, nt 1510 to 1842) was linked to nt 1509.
  • the DNA sequence of the rrnB terminator is disclosed in Orosz et al., Eur . J. Biochem. (1991) 201: 653 -659.
  • the DNA disclosed in SEQ ID NO: 3, consisting of the CSADhs-cds and the rrnB terminator was produced synthetically (Eurofins Genomics) and named CSADhs- rrnB .
  • CSADcc-rrnB The cDNA gene (cDNA: complementary DNA, isolated from mRNA by reverse transcription) of cysteine sulfinic acid decarboxylase (CSAD) from Cyprinus carpio (common carp) was isolated by Honjoh et al. (2010), Amino Acids 38: 1173-183 and the DNA sequence was disclosed in the NCBI database under the Genbank Sequence ID: AB220585.1 (cds: nt 82 - 1584). A DNA sequence codon-optimized for expression in E. coli (publicly available Eurofins Genomics GENEius software) was derived from the amino acid sequence.
  • CSAD cysteine sulfinic acid decarboxylase
  • This DNA sequence designated CSADcc-cds, is disclosed in SEQ ID NO: 5, nt 1 to 1503, encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 5 nt 1 to 1503
  • CSADcc-cds a DNA sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 5 nt 1504 to 1834
  • the DNA sequence of the rrnB terminator is disclosed in Orosz et al. (1991), see below.
  • the CSADcc-rrnB DNA consisting of the CSADcc-cds and the rrnB terminator, was produced synthetically (Eurofins Genomics).
  • Table 1 summarizes the name of the PCR products used for cloning, their size, and the synthetic DNA (so-called template DNA) and primers used.
  • the PCR products PCRI to PCR4 were produced from the respective template DNA by PCR ("PhusionTM High-Fidelity" DNA Polymerase, Thermo ScientificTM) with the appropriate primers and isolated by agarose gel electrophoresis (QIAquick® Gel Extraction Kit, Qiagen).
  • Table 1 PCR products for the production of gene constructs Preparation of the vector pCys-CDOrn-CSADhs :
  • the NEBuilder® cloning kit (NEB New England Biolabs) was used to produce the vector pCys-CDOrn-CSADhs.
  • the 6.1 kb pCys-Scal/PpuMI vector fragment was ligated together with PCRI and PCR2, following the manufacturer's instructions regarding the amounts of the individual DNA fragments used in the ligation mixture.
  • the ligation mixture was then transformed into E. coli NEB® 10-beta (NEB New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions. Clones from the transformation were selected on LBtet plates.
  • LBtet plates contained 10 g/L tryptone (GIBCOTM), 5 g/L yeast extract (BD Biosciences), 5 g/L NaCl, 15 g/L agar and 15 mg/L tetracycline (Sigma-Aldrich). Plasmid DNA was isolated from the transformation clones (Qiagen kit) and a correct clone was selected. The plasmid DNA of the clone was designated vector pCys-CDOrn-CSADhs (Fig. 2).
  • the NEBuilder® cloning kit (NEB New England Biolabs) was used to produce the vector pCys-CDOrn-CSADcc.
  • the 6.1 kb pCys-Scal/PpuMI vector fragment was ligated together with PCR3 and PCR4, following the manufacturer's instructions regarding the amounts of the individual DNA fragments used in the ligation mixture.
  • the ligation mixture was then transformed into E. coli NEB® 10-beta (NEB New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions. Clones from the transformation were selected on LBtet plates.
  • the plasmid DNA was isolated from the clones of the transformation (Qiagen kit) and a correct clone was selected.
  • the plasmid DNA of the clone was designated vector pCys-CDOrn-CSADcc (Fig. 3).
  • the starting strain (host strain) for the production of production strains was the microorganism strain Escherichia coli K12 W3110 (available under the strain number DSM 5911 from the DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).
  • E. coli W3110 was treated in a known manner with the Vector pCys-CDOrn-CSADhs or vector pCys-CDOrn-CSADcc and transformants were selected on LBtet plates. One transformant was selected as a production strain.
  • the production strains were named E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs and E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc and were used to produce hypotaurine.
  • Pre-culture A pre-culture was prepared from each of the production strains E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs and E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc in LBtet medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 15 mg/L tetracycline) (cultivation at 37 °C and 120 rpm overnight).
  • LBtet medium 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 15 mg/L tetracycline
  • Main culture 0.5 ml of the respective pre-culture was transferred into a 300 ml Erlenmeyer flask (with baffle) with 30 ml SMl medium, further containing 15 g/L glucose, 2 g/L Na 2 S 2 O3 x 5 H 2 O, 0.1 g/L L-isoleucine, 0.1 g/LD, L-methionine, 0.1 g/L L-threonine, 5 mg/L vitamin B1 and 15 mg/L tetracycline.
  • Composition of the SM1 medium 12 g/LK 2 HPO 4 , 3 g/L KH 2 PO 4 , 5 g/L NH 4 sulfate, 0.3 g/L MgSO 4 x 7 H 2 O, 0.015 g/L CaCl 2 x 2 H 2 O, 0.002 g/L FeSO 4 x 7 H 2 O, 1 g/L Na 3 citrate x 2 H 2 O, 0.1 g/L NaCl;
  • composition of the trace element solution 0.15 g/L Na 2 Mo0 4 x 2 H 2 0, 2.5 g/L H3BO3, 0.7 g/L CoCl 2 x 6 H 2 0, 0.25 g/L CuSO 4 x 5 H 2 O, 1.6 g/L MnCl 2 x 4 H 2 0, 0.3 g/L ZnSO 4 x 7 H 2 0.
  • the main cultures were incubated for 24 hours at 30°C and 140 rpm in a chest shaker (Infors). After 24 hours, 1 ml samples were taken and the cell density OD 6 oo/ml (optical density of the main culture, measured photometrically at 600 nm) was measured using a GenesysTM 10S UV-Vis spectrophotometer from Thermo-ScientificTM, and the hypotaurine and taurine content was determined using HPLC.
  • the hypotaurine content was 54.9 mg/L.
  • the content of taurine was 44.6 mg/L.
  • the strain E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc the content of hypotaurine was 158.8 mg/L.
  • the content of taurine was 8.7 mg/L.
  • HPLC analysis of L-cysteine sulfinic acid, hypotaurine and taurine For the quantitative determination of the compounds quantitatively analyzed in the examples and for L-cysteine sulfinic acid to detect CDO enzyme activity, an HPLC method calibrated for L-cysteine sulfinic acid, hypotaurine and taurine was used, whereby the reference substances used for calibration were commercially available (Sigma-Aldrich).
  • OPA derivatization o-phthaldialdehyde
  • the HPLC device was equipped with a fluorescence detector to detect the OPA-derivatized products of hypotaurine and taurine.
  • the detector was set to an excitation wavelength of 330 nm and an emission wavelength of 450 nm.
  • An AccucoreTM aQ column from Thermo ScientificTM, length 100 mM, inner diameter 4.6 mm, particle size 2.6 pm, heated to 40°C in the column oven was also used.
  • Mobile phase A 25 mM Na-phosphate, pH 6.0.
  • Mobile phase B methanol. The separation was carried out in gradient mode: 0 - 25 min, 10% Eluent B to 60% eluent B, followed by 2 min 60% eluent B to 100% eluent B, followed by another 2 min 100% eluent B, at a flow rate of 0.5 ml/min. Retention time of L-cysteine sulfinic acid: 4.1 min. Retention time of taurine: 14.8 min. Retention time of hypotaurine: 15.7 min.
  • the precultures 1 were each completely transferred to 100 ml of SMl medium supplemented with 5 g/L glucose, 5 mg/L vitamin B1 and 15 mg/L tetracycline (for the composition of SMl medium, see Example 3).
  • the cultures were each shaken in an Erlenmeyer flask (1 L volume) at 30°C for 17 h at 150 rpm (Infors chest shaker). After this incubation, the cell densities OD 6 oo/ml were between 3 and 5.
  • the fermentations were carried out in a Biostat B fermenter (2 1 working volume) from Sartorius BBI Systems GmbH.
  • the culture medium (900 ml) contained 15 g/L glucose, 10 g/L tryptone (Difco), 5 g/L yeast extract (Difco), 2.4 g/L (NH 4 ) 2 SO4, 5 g/L KH 2 PO 4 , 0.25 g/L NaCl, 0.6 g/L MgSO 4 x 7 H 2 O, 0.03 g/L CaCl 2 x 2 H 2 O, 0.15 g/L FeSO 4 x 7 H 2 O, 1 g/L Na 3 citrate x 2 H 2 O and 1 ml trace element solution (see example 3), 0.9 g/L L- isoleucine (Sigma-Aldrich), 0.6 g/LD, L-methionine (Sigma-Aldrich), 0.018 g/L vitamin B12.
  • the pH value in the fermenter was initially set to 7.0 by pumping in a 25% NH 4 OH solution. During fermentation, the pH value was maintained at 7.0 by automatic correction with 25% NH 4 OH or 4 MH 3 PO 4 . Foam control was achieved by automatically adding 4% v/v Struktol J673 in H 2 O (Schill & Seilacher).
  • vvm introduction of compressed air into the fermentation mixture, expressed in liters of compressed air per liter of fermentation volume per minute.
  • the oxygen probe was calibrated to 100% saturation before inoculation.
  • the target value for the O2 saturation during fermentation was set at 30%. Once the O2 saturation fell below the target value, a regulation cascade was started to bring the O2 saturation back to the target value. First, the gas supply was continuously increased (to max. 5 vvm) and then the stirring speed was continuously increased (to max. 1,500 rpm).
  • Fermentation was carried out at a temperature of 30 ° C. After 2 h of fermentation, a sulfur source in the form of a sterile 60% (w/v) stock solution of sodium thiosulfate x 5 H 2 0 was added at a rate of 1.5 ml per hour.
  • a 56% (w/w) glucose solution was continuously added.
  • the feeding rate was adjusted so that the glucose concentration in the fermenter no longer exceeded 2 g/L.
  • the glucose determination was carried out using a glucose analyzer from YSI (Yellow Springs, Ohio, USA).
  • the fermentation time was 65 hours. 22 hours, 40 hours and 65 hours after the start of the fermentation, samples were taken from the fermentation mixture and the cell density OD 6 oo/ml and the content of hypotaurine and taurine in the culture supernatant were determined by HPLC. The results are summarized in Table 2 and Table 3.
  • hypotaurine yield was 20.8 g/L (190.5 mM at a hypotaurine molecular weight of 109.2 g/mol) and the taurine yield was 7.4 g/L (59.1 mM at a taurine molecular weight of 125.2 g/mol).
  • the molar ratio of hypotaurine:taurine was 3.2:1.
  • hypotaurine yield was 62.5 g/L (572.2 mM at a hypotaurine molecular weight of 109.2 g/mol) and the taurine yield was 1.2 g/L (9.6 mM at a taurine molecular weight of 125.2 g/mol).
  • the molar ratio of hypotaurine:taurine was 59.6:1.
  • Table 2 Time course of cell density, hypotaurine and taurine content of the fermentation of the production strain W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs
  • Table 3 Time course of cell density, hypotaurine and taurine content of the fermentation of the production strain W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc
  • the fermentation mixture used was that of the production strain E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc from Example 4 with a hypotaurine content of 62.5 g/L and taurine content of 1.2 g/L (Table 3).
  • 2 x 1 ml of the fermenter broth (2 ml total volume) were centrifuged for 5 min at 13,000 rpm (HeraeusTM FrescoTM 21 centrifuge) and the supernatant discarded.
  • the cell pellets were resuspended in 1 ml H 2 O each, centrifuged for 5 min at 13,000 rpm and the supernatant discarded.
  • the cell pellets were suspended in 1 ml H 2 O each, corresponding to 2 ml total volume and corresponding to the volume of fermenter broth used above.
  • a cell extract was prepared from the cell suspension.
  • the FastPrep-24TM 5G cell homogenizer from . MP Biomedicals.
  • the cell pellets, each suspended in 1 ml H 2 O were lysed in 1.5 ml tubes with glass beads (“Lysing Matrix B”) prepared by the manufacturer (3 x 20 seconds at a shaking frequency of 6000 rpm with a break of 30 seconds between each interval).
  • the resulting cell homogenates were combined and centrifuged for 5 minutes at 13000 rpm to produce a cell extract.
  • the cell extract was analyzed by HPLC for the content of hypotaurine and taurine. Neither hypotaurine nor taurine could be detected, with a detection limit of the HPLC analysis of 1 mg/L for hypotaurine and taurine respectively.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin dadurch gekennzeichnet, dass in einem Schritt i ein mikrobieller Produktionsstamm kultiviert wird, der sich dadurch auszeichnet, dass er 1. mindestens einen Expressionsvektor enthält umfassend eine codierende Sequenz (cds) a und eine cds b und mindestens eine der cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c, d und e, wobei a eine cds codierend eine zur Enzymklasse EC 1.13.11.20 zählende Cysteindioxygenase (CDO) ist und b eine cds codierend eine zur Enzymklasse EC 4.1.1.29 zählende Cysteinsulf insäure-Decarboxyläse (CSAD) ist und c eine cds codierend eine 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (SerA) mit verminderter Feedback-Hemmung durch Serin ist und d eine cds codierend eine Serin-O-Acetyl- Transferase (CysE) mit verminderter Feedback-Hemmung durch Cystein ist und e eine cds codierend einen Cystein-Exporter ist, 2. die Expression von der cds a und b im Expressionsvektor mit der Expression mindestens einer cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus cc,, d und e in einer polycistronischen Expressionseinheit koordiniert ist, 3. Hypotaurin vom Produktionsstamm in den Fermentationsüberstand sekretiert wird und in einem Schritt ii der Fermentationsüberstand isoliert wird, wobei der Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsüberstand mindestens 10 g/L beträgt und der molare Anteil Hypotaurin : Taurin im Fermentationsüberstand mindestens 3:1 beträgt.

Description

Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin dadurch gekennzeichnet, dass i) ein mikrobieller Produktionsstamm kultiviert wird, der sich dadurch auszeichnet, dass er
1. mindestens einen Expressionsvektor enthält umfassend eine codierende Sequenz (cds) a und eine cds b und mindestens eine der cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c, d und e, wobei a) a eine cds codierend eine zur Enzymklasse EC 1.13.11.20 zählende Cysteindioxygenase (CDO) ist und b) b eine cds codierend eine zur Enzymklasse EC 4.1.1.29 zählende Cysteinsulf insäure-Decarboxylase (CSAD) ist und c) c eine cds codierend eine 3-Phosphoglycerat- Dehydrogenase (SerA) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch Serin ist und d) d eine cds codierend eine Serin-O-Acetyl-Transf erase (CysE) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch Cystein ist und e) e eine cds codierend einen Cystein-Exporter ist,
2. die Expression von der cds a und b im Expressionsvektor mit der Expression mindestens einer cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c, d und e in einer polycistro- nischen Expressionseinheit koordiniert ist,
3. Hypotaurin vom Produktionsstamm in den Fermentationsüberstand sekretiert wird und ii) der Fermentationsüberstand isoliert wird, wobei der Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsüberstand mindestens 10 g/L beträgt und der molare Anteil Hypotaurin: Taurin im Fermentationsüberstand mindestens 3:1 beträgt. Hypotaurin (2-Aminoethansulf insäure, CAS Nummer 300-84-5) ist eine Aminosulf insäure, die in der Natur als Abbauprodukt der Aminosäure Cystein vorkommt. Als Sulf insäure wirkt Hypotaurin als Antioxidans und findet Anwendungen im Food-, Feed-, Kosmetik- und Pharmabereich. Darüber hinaus ist Hypotaurin eine biosynthetische Vorstufe von Taurin (2-Aminoethansulfon- säure, CAS-Nummer 107-35-7) .
Für den kommerziellen Gebrauch wird Hypotaurin chemisch hergestellt, z.B. ausgehend von 2-Aminoethanthiolhydrochlorid . Mit dem von Konsumentenwünschen beförderten Trend weg von chemisch hergestellten Inhaltsstoffen ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Hypotaurin von Interesse. Bekannte biosynthetische Wege zum Hypotaurin und weiter zu Taurin, ausgehend von L-Cystein, findet man z.B. in der KEGG Pathway Datenbank: „Taurine and hypotaurine metabolism". Die wichtigsten Syntheseschritte, die von L-Cystein zu Hypotaurin und weiter zu Taurin führen, sind in den Gleichungen (1) bis (5) dargestellt .
(1) L-Cystein + O2 -> L-Cysteinsulf insäure
(2) L-Cystein -> Cysteamin + CO2
(3) L-Cysteinsulf insäure -> Hypotaurin + CO2
(4) Cysteamin + O2 -> Hypotaurin
(5) Hypotaurin + ^ 02 -0 Taurin
(1) : L-Cystein wird durch das Enzym Cysteindioxygenase (CDO, EC 1.13.11.20) zu L-Cysteinsulf insäure ( 3-Sulf inoalanin, CAS Nummer 207121-48-0) oxidiert.
(2) : Cysteamin entsteht formal durch Decarboxylierung von L- Cystein, ist aber in Säugern ein Reaktionsprodukt der Pantothenat-Biosynthese, wobei das Enzym Pantethein-Hydrolase (EC 3.5.1.92) Cysteamin aus der Vorstufe (R) -Pantethein abspaltet. Eine Cystein-Decarboxylase wurde für Bakterien beschrieben, wirkt aber nur auf das C-terminale Cystein eines Vorläuferpeptids als Teilreaktion der Biosynthese eines Naturstoffs und ist nicht geeignet zur Herstellung von Cysteamin. Der Weg (2) zu Hypotaurin, ausgehend von Cystein über Cysteamin, ist damit technisch ohne Bedeutung.
(3) : Cysteinsulf inatdecarboxylase (CSAD, EC 4.1.1.29) decarboxyliert L-Cysteinsulf insäure zu Hypotaurin (2-Amino- ethansulf insäure, CAS Nummer 300-84-5) .
(4) : Cysteamin-Dioxygenase (EC 1.13.11.19) oxidiert Cysteamin mit Luftsauerstoff zu Hypotaurin.
(5) : Bisher nicht eindeutig geklärt ist die Oxidation von Hypotaurin zu Taurin.
Bekannte biotechnologische Verfahren zielen vor allem auf die Produktion von Taurin ab, wobei aufgrund des beschrittenen biosynthetischen Weges Hypotaurin in vielen Fällen das Hauptprodukt ist. Dabei sind die bekannten biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von Hypotaurin dadurch gekennzeichnet, dass die Hypotaurin-Ausbeuten, soweit offenbart, sehr gering sind .
Honjoh et al. (2010) , Amino Acids 38: 173-1183 beschreiben einen gentechnisch veränderten Hefestamm, der die CDO- und CSAD-Gene aus Karpfen (Cyprinus carpio) heterolog exprimiert. Wurde der Anzucht des gentechnisch veränderten Stammes L- Cystein zugesetzt, dann konnte die Produktion von Hypotaurin als Hauptprodukt und daneben ein geringerer Anteil an Taurin beobachtet werden. Obwohl S. cerevisiae an sich in der Lage ist, Cystein aus seinem eigenen Stoffwechsel zu produzieren, war die externe Zugabe von L-Cystein in das Anzuchtmedium erforderlich, um Hypotaurin zu produzieren. Der Ansatz von Honjoh et al. (2010) entspricht somit einer Biotransformation von L-Cystein zu Hypotaurin. Analytisch bestimmt wurden intrazellulär gebildetes Taurin, mit und ohne H2O2-Behandlung (Tabelle 1 in Honjoh et al. ) . Aus den deutlich höheren Taurin-
Werten nach H2O2-Behandlung wurde geschlossen, dass ein Großteil des intrazellulär gebildeten Produkts als Hypotaurin vorlag, wenngleich Hypotaurin nicht analytisch quantifiziert wurde. Die nicht direkte Quantifizierung von Hypotaurin ist überraschend, da im Methodenteil von Honjoh et al. eine Hypo- taurin Analytik auf geführt wurde. Somit ist die Hypotaurin- Bildung in der Bäckerhefe nicht eindeutig nachgewiesen und wurde nur indirekt aus den erhöhten Taurin-Werten nach H2O2- Oxidation erschlossen.
WO 17/213142 Al (Ajinomoto) beschreibt Taurin-produzierende Stämme durch heterologe Expression von Genen codierend für Cystein-Dioxygenase (CDO) und L-Cysteinsulf insäure Decarboxylase (CSAD) in einem ursprünglich Cystein-produzierenden Stamm. Es wurden Konstrukte aus verschiedenen CDO- und CSAD- Genen hergestellt, jeweils unter Kontrolle des bekannt starken tac-Promotors . Deren Eignung zur Hypotaurin-, bzw. Taurinproduktion wurde jedoch nicht in zur Cystein-Produktion optimierten Stämmen durchgeführt, sondern in Stämmen von E. coli (max. Cystein-Produktion 2 pM, siehe Tab. 5 von WO 17/213142 Al, Stamm EcoT/pMW2ql 9 ) und Pantoea ananatis (max. Cystein- Produktion 0 pM, siehe Tab. 5 von WO 17/213142 Al, Stamm PanT/pMW219) , jeweils mit inaktiviertem tauABCD-Operon (benannt EcoT für E. coli und PanT für P. ananatis) . Das tauABCD-Operon ist bekannt dafür, dass es Gene für den Abbau von Taurin codiert. Hauptprodukt war Hypotaurin mit max. 450 pM Ausbeute (49,1 mg/L Hypotaurin bei 109,2 g/mol Mol. -Gewicht von Hypotaurin) . Somit wurde die Optimierung des Cystein- Stof fwechsels als Möglichkeit einer verbesserten Hypotaurin- Produktion beschrieben, jedoch nicht experimentell nachgewiesen. Die geringen Hypotaurin Ausbeuten sind für eine wirtschaftliche Produktion nicht geeignet.
US 2019/0062757 Al (KnipBio) beschreibt heterologe Produktionsstämme zur Herstellung von Taurin oder seiner Vorläufersubstanzen, wobei max. Ausbeuten von nur 419 ng/ml Hypotaurin erzielt wurden. Als Wirtsstämme verwendet wurden WT-Stämme von E. coli und Methyl obacteri um extorquens . Es wurden keine Maßnahmen zur Verbesserung der Cystein-Produktion mit dem Ziel höherer Hypotaurin-Ausbeuten beschrieben. US 9 , 267 , 148 B2 und weitere Publikationen von Plant Sensory Systems beschreiben Genkonstrukte , die zur heterologen Expression einer Cystein-Dioxygenase und einer L-Cysteinsul f insäure- Decarboxylase geeignet sein sollen mit dem Ziel der Produktion von Taurin . Insbesondere betref fen die Anmeldungen einerseits Genkonstrukte , die ein CDO-Gen und ein CSAD-Gen, j eweils funktionell verknüpft mit einem eigenen Promotor, als einzelne Expressionskassetten ( j eweils monocistronisch) exprimieren . Andererseits sind auch Genkonstrukte beschrieben, welche ein CDO- und ein CSAD-Gen in Form eines Fusionsproteins exprimieren sollen, kombiniert als einzelne Expressionskassette unter Kontrolle nur eines Promotors (monocistronische Expressionskassette ) . Die Anmeldungen zielen hauptsächlich auf die Produktion von Taurin in Pflanzen ab, wobei keine Aussagen über Ausbeuten gemacht werden . Es wurden keine Maßnahmen zur Verbesserung der Cystein-Produktion mit dem Ziel höherer Hypotaurin-Ausbeuten beschrieben . Insgesamt of fenbaren die Anmeldungen kein anwendbares Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypyotaurin .
Joo et al . ( 2018 ) , J . Agric . Food Chem . 66 : 13454 - 13463 , beschreiben einen gentechnisch veränderten Stamm des Bakteriums Corynebakterl um gl utami cum mit einer Produktionsleistung von 0 , 5 g/L Taurin in der Anzucht im Schüttelkolben . Dabei wurde Taurin of fensichtlich intrazellulär angehäuft und nicht in das Anzuchtmedium sekretiert . Zur Synthese von Taurin wurden in dem Stamm die Gene einer L-Cysteinsäuresynthase , einer Cystein-Dioxygenase und einer L-Cysteinsul f insäure- Decarboxylase heterolog exprimiert . Weiterhin wurde ein Repressorgen der Methionin- und Cystein-Biosynthese inaktiviert , was gleichzeitig eine verbesserte Schwefelaufnahme bewirkte . Die Produktion von Hypotaurin wurde nicht analysiert .
Der Stand der Technik of fenbart somit verschiedene Metabolie Engineering- und Biotrans formationsansätze , um Hypotaurin in heterologen Produktionssystemen herzustellen . Dabei wurden keine Produktionsstämme mit optimierter Cystein-Biosynthese verwendet. Von keinem der im Stand der Technik beschriebenen Stämme wurde die Herstellung von Hypotaurin oder auch Taurin in technischem Maßstab durch ein Verfahren der Fermentation offenbart .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin mit hohen Ausbeuten im Fermentationsüberstand bereitzustellen. Da Hypotaurin nach dem Stand der Technik zu Taurin oxidieren kann, war es ebenso Aufgabe, dass die Ausbeute an Hypotaurin die an Taurin wesentlich übertrifft.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin dadurch gekennzeichnet, dass i) ein mikrobieller Produktionsstamm kultiviert wird, der sich dadurch auszeichnet, dass er
1. mindestens einen Expressionsvektor enthält umfassend eine codierende Sequenz (cds) a und eine cds b und mindestens eine der cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c, d und e, wobei a) a eine cds codierend eine zur Enzymklasse EC 1.13.11.20 zählende Cysteindioxygenase (CDO) ist und b) b eine cds codierend eine zur Enzymklasse EC 4.1.1.29 zählende Cysteinsulf insäure-Decarboxylase (CSAD) ist und c) c eine cds codierend eine 3-Phosphoglycerat-Dehydro- genase (SerA) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch Serin ist und d) d eine cds codierend eine Serin-O-Acetyl-Transf erase (CysE) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch Cystein ist und e) e eine cds codierend einen Cystein-Exporter ist,
2. die Expression von der cds a und b im Expressionsvektor mit der Expression mindestens einer cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c, d und e in einer polycistro- nischen Expressionseinheit koordiniert ist ,
3 . Hypotaurin vom Produktionsstamm in den Fermentationsüberstand sekretiert wird und ii ) der Fermentationsüberstand isoliert wird, wobei der Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsüberstand mindestens 10 g/L beträgt und der molare Anteil Hypotaurin : Taurin im Fermentationsüberstand mindestens 3 : 1 beträgt .
Ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist , dass ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von Hypotaurin of fenbart wird, bei dem im mikrobiellen Produktionsstamm die nach dem Prinzip des Metaboli e Engineering konzipierten Expressionsvektoren die Expressionseinheiten für eine verstärkte Cysteinproduktion mit Expressionseinheiten für die Hypotaurinproduktion vereinigen . Insbesondere die polycistronische Anordnung mindestens einer eds des Cysteinstof fwechsels mit der eds für die Cystein Dioxygenase ( CDO) sowie der eds für die Cysteinsul f insäure Decarboxylase ( CSAD) in einem künstlichen Operon unter Kontrolle nur eines Promotors erlaubt die koordinierte Expression von Cystein- und Hypotaurin-Stof fwechselgenen in einem Produktionsstamm . Dies trägt dazu bei , die Anhäufung von Zwischenprodukten des Stof fwechsels , wie z . B . L- Cystein, zu vermeiden und maximiert die Hypotaurin-Ausbeute .
Es ist überraschend, dass das Produkt Hypotaurin vom Produktionsstamm in einer Konzentration von >10 g/ 1 in den Fermentationsüberstand sekretiert wird ( extrazelluläre Produktion) und sich extrazellulär anreichert (Beispiel 5 ) . Dagegen kommt es im Stand der Technik zu einer intrazellulären Anreicherung wie beispielsweise von Joo et al . ( 2018 , s . o . ) für Taurin beschrieben oder, abhängig vom Produktionssystem, nur zur teilweisen Sekretion .
Die Verwendung des anspruchsgemäßen Produktionsstamms im erfindungsgemäßen Verfahren zeichnet sich also dadurch aus , dass kein Produkt in der Biomasse ( Fermenterzellen) akkumu- liert ( s . auch Beispiel 5 ) . Diese extrazelluläre Produktion bzw . Anreicherung, d . h . die Biosynthese von Hypotaurin im Produktionsstamm gefolgt von der Sekretion (Export , Ausschleusung) aus dem Produktionsstamm heraus in das Anzuchtmedium, bietet den großen Vorteil , dass das Volumen, in dem sich Hypotaurin akkumulieren kann, nicht auf das geringe Volumen des Zellinhalts ( Cystosol ) beschränkt ist . Damit wird vermieden, dass hohe intrazelluläre Produktkonzentrationen zu toxischen Ef fekten führen . Es lassen sich daher weit höhere Hypotaurin- Ausbeuten erzielen als bei intrazellulärer Produktion . Bevorzugt ist in der Biomasse , bezogen auf die in der Fermenterbrühe enthaltene Biomasse , wie in Beispiel 5 beschrieben, unter 1 g/ 1 Hypotaurin enthalten . Besonders bevorzugt ist in der Biomasse kein Hypotaurin nachweisbar .
Die extrazelluläre Produktion von Hypotaurin hat außerdem den Vorteil einer vereinfachten Produktisolierung, da Hypotaurin direkt aus dem Fermentationsüberstand isoliert werden kann, ohne dass vorher die Zellen aufwendig entweder mechanisch oder chemisch aufgeschlossen werden müssen . Wie Hypotaurin aus dem Produktionsstamm sekretiert wird, ist unbekannt . Es kann sich um einen passiven Mechanismus handeln, wobei Hypotaurin durch die Zellmembranen di f fundiert oder es können ein oder mehrere Transportproteine an der Sekretion beteiligt sein .
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist der geringe Anteil des Nebenprodukts Taurin, welches aus Hypotaurin durch Oxidation entsteht und die Hypotaurin-Ausbeute verringert . Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren für den technischen Einsatz sehr gut geeignet , da es dank der hohen Hypotaurin-Ausbeuten in der Fermentation die wirtschaftliche Produktion von Hypotaurin ermöglicht . Im Stand der Technik wie beispielsweise Joo et al . ( 2018 , s . o . ) kommt es dagegen zu einer spontanen Oxidation von Hypotaurin zu Taurin, was den Nachteil hat , dass der Hypotaurin-Gehalt gering ist . Metabolie Engineering (auch „Pathwaydesign" genannt) ist im Gegensatz zur Biotransformation eine Methode der Biotechnologie, bei der Stoffwechselwege eines Organismus durch Optimierung, bzw. Veränderung genetischer und regulatorischer Prozesse verändert werden. Dabei können durch Ergänzung des Genoms mit Genen von Enzymen neue oder veränderte Enzyme in einen Organismus eingeführt werden, bzw. Gene endogener Enzyme verstärkt oder abgeschwächt exprimiert werden und dadurch neue Stoffwechselwege in einem Organismus etabliert oder bestehende Stoffwechselwege verstärkt oder abgeschwächt werden. Ziel des Metabolie Engineering ist, dass der Organismus ein Stoffwechselprodukt entweder neu oder ein zelleigenes Stoffwechselprodukt mit erhöhter Ausbeute produziert. In ein Metabolie Engineering-Verfahren werden keine für das Stoffwechselprodukt spezifischen Ausgangsstoffe wie ein Enzymsubstrat, wie z.B. L- Cystein als Ausgangsverbindung zur Herstellung von Hypotaurin, eingesetzt, sondern lediglich ein Nährstoffmedium, auch bezeichnet als Anzuchtmedium, welches für das Wachstum des betreffenden Organismus erforderlich ist und zusammengesetzt ist aus einer C-Quelle (z.B. Glucose) , einer N-Quelle (z.B. ein Ammoniumsalz oder ein komplexes Aminosäuregemisch wie z.B. Pepton oder Hefeextrakt) und weiteren für das Wachstum erforderlichen Salzen. Solche Nährstoffmedien sind dem Fachmann aus der mikrobiologischen Praxis bekannt. Das in der vorliegenden Erfindung offenbarte Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin ist ein Metabolie Engineering Verfahren.
Dagegen ist Biotransformation definiert als Überführung eines oder mehrerer Edukte in ein Produkt unter enzymatischer Katalyse, wobei das Enzymsubstrat mit dem Enzym in einen Reaktionsansatz gegeben und enzymatisch umgesetzt wird.
Nach Gleichung (1) wird L-Cystein enzymatisch zu L-Cysteinsul- finsäure oxidiert. Diese Reaktion wird durch ein CDO-Enzym (EC 1.13.11.20) katalysiert. Gen- und Proteinsequenzen von CDO- Enzymen sind z.B. zugänglich in der NCBI-Datenbank unter dem Suchbegriff „cysteine dioxygenase". Die Erfindung umfasst Gene, die für Proteine mit CDO-Aktivität codieren, darunter bevorzugt CDO-Enzyme ausgewählt aus Rattus norvegicus (Ratte) , Homo sapiens (Mensch) , Cyprinus carpio (Karpfen) , Bos taurus (Rind) , Capra hircus (Ziege) , Gallus gallus (Hahn) oder Synechococcus (Alge) oder dazu homologe CDO-Enzyme. In einer bevorzugten Aus führungs form ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der CDO um die CDO aus Rattus norvegicus (CDOrn) mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Sequenz oder ein dazu zu mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% und insbesondere bevorzugt mindestens 95% identisches Enzym mit CDO-Aktivität handelt. Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei der CDO um ein Protein mit der SEQ ID NO: 2. Im speziellen bevorzugt hat die CDOrn-cds die in SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz.
Der CDO-Enzym-Aktivitätstest kann wie folgt durchgeführt werden : i) Herstellung des zu testenden Enzyms:
Ein durch Anzucht im Schüttelkolben oder in einer Fermentation produziertes Enzym kann wie folgt in die Reaktion eingesetzt werden: als ein Aliquot aus der nicht weiter auf gearbeiteten Kulturbrühe oder als ein Aliquot der Zellsuspension nach Reisolierung der Zellen aus der Kulturbrühe, z.B. durch Zentrifugation oder in Form eines Aliquots des Zellhomogenats a) nach mechanischem Aufschluss der Zellsuspension oder b) in Form chemisch permeabilisierter Zellen (z.B. durch Chloroform) oder als Zellextrakt nach Abtrennung partikulärer Bestandteile aus dem Zellhomogenat oder als z.B. chromatographisch gereinigtes Enzym.
Die jeweils erhaltene Gesamtproteinkonzentration kann z.B. mit einem kommerziell erhältlichen Qubit 3.0 Fluorometer der Fa . Thermo Fisher Scientific unter Einsatz des „Qubit® Protein Assay Kits" nach Angaben des Herstellers bestimmt werden . ii) Bestimmung der CDO-Enzymaktivität :
In einer mit Kaliumphosphat auf pH 7 gepufferten Lösung wird L-Cystein (10 mM Endkonzentration) vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe des Enzyms aus i) gestartet. Das Ansatzvolumen des Tests beträgt 10 ml. Die Temperatur, bei der der Test durchgeführt wird, beträgt 30°C. Die Menge des eingesetzten Enzyms ist abhängig vom Reinigungsgrad. Werden Kulturbrühe, Zellsuspension der reisolierten Zellen, Zell- homogenat oder Zellextrakt verwendet, werden mindestens 0,1 mg der in i) hergestellten Enzymfraktionen eingesetzt. Im Falle von gereinigtem Enzym werden mindestens 10 pg der gereinigten Enzymfraktion eingesetzt. 1 h, 2 h und 4 h nach Start der Reaktion werden j e 1 ml des Testansatzes entnommen, 10 min zentrifugiert und der Gehalt von L-Cysteinsul- finsäure, durch kalibrierte HPLC bestimmt (siehe Beispiel 3) , wobei die zur Kalibrierung verwendeten Referenzsubstanzen kommerziell erhältlich sind (Sigma-Aldrich) .
Dabei liegt die Nachweisgrenze der HPLC-Methode bei 1 mg/L L- Cysteinsulf insäure . Wird unter den genannten Testbedingungen weniger als 1 mg/L L-Cysteinsulf insäure gebildet, dann ist im Ansatz keine aktive CDO enthalten.
Nach Gleichung (3) wird L-Cysteinsulf insäure enzymatisch zu Hypotaurin decarboxyliert . Diese Reaktion wird durch ein CSAD- Enzym (EC 4.1.1.29) oder alternativ, mit weit geringerer Enzymaktivität, GAD-Enzym (EC 4.1.1.15) katalysiert. Gen- und Proteinsequenzen von CSAD-Enzymen sind z.B. zugänglich in der NCBI-Datenbank unter dem Suchbegriff „cysteine sulfinic acid decarboxylase". Gen- und Proteinsequenzen von GAD-Enzymen sind z.B. zugänglich in der NCBI-Datenbank unter dem Suchbegriff „glutamic acid decarboxylase". Die Erfindung umfasst Gene, die für Proteine mit CSAD-Aktivität codieren, darunter bevorzugt CSAD-Enzyme ausgewählt aus Cyprlnus carpio (Karpfen) , Rattus norvegicus (Ratte) , Homo sapiens (Mensch) , Bos taurus (Rind) , Capra hircus (Ziege) , Gallus gallus (Hahn) , Eschericia coli oder Synechococcus (Alge) oder dazu homologe CSAD-Enzyme. In einer bevorzugten Aus führungs form ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der CSAD um die CSAD aus Cyprinus carpio (CSADcc) mit der in SEQ ID NO: 6 angegebenen Sequenz oder ein dazu zu mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% und insbesondere bevorzugt mindestens 95% identisches Enzym mit CSAD-Aktivität handelt. Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei der CSAD um ein Protein mit SEQ ID NO: 6. Im speziellen bevorzugt hat die CSADcc-cds die in SEQ ID NO: 5 (nt 1-1503) angegebene Sequenz.
In einer alternativ bevorzugten Aus führungs form ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei CSAD um die CSAD aus Homo sapiens (CSADhs) mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Sequenz oder ein dazu zu mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% und insbesondere bevorzugt mindestens 95% identisches Enzym mit CSAD-Aktivität handelt.
Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei der CSAD um ein Protein mit SEQ ID NO: 4. Im speziellen bevorzugt hat die CSADhs-cds die in SEQ ID NO: 3 (nt 1-1509) angegebene Sequenz.
Der CSAD-Enzym-Aktivitätstest kann wie folgt durchgeführt werden : i) Herstellung des zu testenden Enzyms:
Ein durch Anzucht im Schüttelkolben oder in einer Fermentation produziertes Enzym kann wie folgt in die Reaktion eingesetzt werden: als ein Aliquot aus der nicht weiter auf gearbeiteten Kulturbrühe oder als ein Aliquot der Zellsuspension nach Reisolierung der Zellen aus der Kulturbrühe, z.B. durch Zentrifugation oder in Form eines Aliquots des Zellhomogenats c) nach mechanischem Aufschluss der Zellsuspension oder d) in Form chemisch permeabilisierter Zellen (z.B. durch Chloroform) oder als Zellextrakt nach Abtrennung partikulärer Bestandteile aus dem Zellhomogenat oder als z.B. chromatographisch gereinigtes Enzym.
Die jeweils erhaltene Gesamtproteinkonzentration kann z.B. mit einem kommerziell erhältlichen Qubit 3.0 Fluorometer der Fa . Thermo Fisher Scientific unter Einsatz des „Qubit® Protein Assay Kits" nach Angaben des Herstellers bestimmt werden . ii) Bestimmung der CSAD-Enzymaktivität :
In einer mit Kaliumphosphat auf pH 7 gepufferten Lösung wird L-Cysteinsulf insäure (10 mM Endkonzentration) vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe des Enzyms aus i) gestartet. Das Ansatzvolumen des Tests beträgt 10 ml. Die Temperatur, bei der der Test durchgeführt wird, beträgt 30°C. Die Menge des eingesetzten Enzyms ist abhängig vom Reinigungsgrad. Werden Kulturbrühe, Zellsuspension der reisolierten Zellen, Zellhomogenat oder Zellextrakt verwendet, werden mindestens 0,1 mg der in i) hergestellten Enzymfraktionen eingesetzt. Im Falle von gereinigtem Enzym werden mindestens 10 pg der gereinigten Enzymfraktion eingesetzt. 1 h, 2 h und 4 h nach Start der Reaktion werden je 1 ml des Testansatzes entnommen, 10 min zentrifugiert und der Gehalt von Hypotaurin, durch kalibrierte HPLC bestimmt (siehe Beispiel 3) , wobei die zur Kalibrierung verwendeten Referenzsubstanzen kommerziell erhältlich sind (Sigma-Aldrich) .
Dabei liegt die Nachweisgrenze der HPLC-Methode bei 1 mg/L L- Hypotaurin. Wird unter den genannten Testbedingungen weniger als 1 mg/L Hypotaurin gebildet, dann ist im Ansatz keine aktive CSAD enthalten.
Als offener Leserahmen (open reading frame, ORF, gleichbedeutend mit cds, coding sequence) wird derjenige Bereich der DNS bzw. RNS bezeichnet, der mit einem Startcodon beginnt und mit einem Stoppcodon endet und für die Aminosäuresequenz eines Proteins codiert. Der ORF wird auch als codierende Region oder Strukturgen bezeichnet. Als Gen, Cistron oder Expressionseinheit wird der DNS- Abschnitt bezeichnet, der alle Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven RNS enthält. Ein Gen enthält den DNS-Abschnitt, von dem durch Transkription eine einzel- strängige RNS-Kopie hergestellt wird und die Expressionssignale, die an der Regulation dieses Kopiervorgangs beteiligt sind. Die Expressionssignale umfassen mindestens einen Promotor, einen Transkriptionsstart, einen Translationsstart und eine Ribosomenbindestelle (RBS) . Des Weiteren sind als Expressionssignale ein Terminator und ein oder mehrere Operatoren möglich .
Im Rahmen dieser Erfindung beginnen bakterielle Proteine wie z.B. SerA oder CysE mit einem Großbuchstaben, während die diese Proteine kodierenden Sequenzen (cds) mit einem Kleinbuchstaben bezeichnet werden (z.B. serA oder cysE) . Ebenso werden die die Expression dieser cds kontrollierenden Promotoren mit einem Kleinbuchstaben bezeichnet (z.B. serA-Promotor oder cysE-Promotor ) . Dagegen werden Proteine/Enzyme und cds/Gene höherer Organismen wie z.B. Homo sapiens, Rattus norvegicus oder Cyprinus carpio mit Großbuchstaben bezeichnet und gegebenenfalls jeweils als Protein/Enzym (z.B. CDO- Protein/Enzym oder CSAD-Protein/Enzym) oder cds/Gen (z.B. CDO- cds/Gen oder CSAD-cds/Gen) gekennzeichnet.
Als Genkonstrukt wird ein durch Klonierung hergestelltes DNS- Molekül bezeichnet, das mindestens eine Expressionseinheit umfasst, und daneben noch weitere genetische Elemente umfassen kann wie Selektionsmarker und Replikationsursprung. Beim Genkonstrukt kann es sich um ein lineares, ins Genom integriertes DNS-Molekül oder um ein zirkuläres DNS-Molekül in Form eines Plasmids, gleichbedeutend Vektor, handeln. Dieser Vektor wird dann als Expressionsvektor bezeichnet. In einen geeigneten Wirtsstamm eingebracht (transformiert) , bewirken die genetischen Elemente des Vektors seine extrachromosomale Vererbung während des Zellwachstums und die Produktion des von der cds codierten Proteins .
In den Genomen von Mikroorganismen findet man viel fach sog . Operons . Ein Operon ist charakterisiert durch einen DNS- Abschnitt , von dem mehrere Gene koordiniert exprimiert werden können . Als Operon wird ein DNS-Abschnitt bezeichnet , der alle Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven RNS enthält . Das Operon enthält den DNS-Abschnitt , von dem durch Transkription eine einzelsträngige RNS-Kopie hergestellt wird und die Expressionssignale , die an der Regulation dieses Kopiervorgangs beteiligt sind . Die RNS-Kopie umfasst j edoch nicht nur die cds eines einzelnen Gens , sondern die cds von zwei oder mehreren Genen . Die Expressionssignale des Operons umfassen einen Promotor und einen Transkriptionsstart . Jede cds des Operons umfasst einen Translationsstart und eine Ribosomenbindestelle . Des Weiteren sind als Expressionssignale ein Terminator und ein oder mehrere Operatoren möglich .
Wird von einem Promotor nur ein Gen exprimiert , wird das als monocistronische Expressionseinheit bezeichnet . Werden von einem Promotor zwei , drei oder mehrere Gene exprimiert , so wird eine solche Expressionseinheit als bicistronisch, tricistronisch us f . , bzw . polycistronisch bezeichnet .
Operons kommen nicht nur natürlicherweise im Genom von Mikroorganismen vor, sondern können auch gezielt durch Klonierung hergestellt werden ( künstliche Operons ) .
Die Expressionseinheit eines künstlichen Operons besteht ebenfalls aus einem Promotor funktionell verknüpft mit zwei oder mehreren cds mit j eweils davor geschalteten RBS (bi- , tri- oder polycistronische Expressionseinheit ) . Daneben kann eine Expressionseinheit auch weitere genetische Elemente enthalten wie einen Terminator oder Operatoren . Der Begri f f „funktionell verknüpft" bedeutet , dass die Expressionseinheit umfassend Promotor und cds , bzw . Promotor und zwei oder mehrere cds im Falle eines Operons , im Mikroorganismus zur Transkription und Translation der cds führt . Als Promotor wird eine stromaufwärts dem 5 ' -Ende der cds vorgeschaltete Nukleotid-Sequenz bezeichnet, welche die Expression einer cds ermöglicht. Der Promotor liegt in Syntheserichtung vor dem codierenden Bereich. Der Promotor enthält Bereiche, welche den Start der Transkription des Gens durch die RNA-Polymerase bestimmen und darüber hinaus die spezifische Wechselwirkung mit die Transkriptionsstärke beeinflussenden DNS-bindenden Proteinen (Transkriptions-faktoren) vermitteln können.
Als Promotoren der genannten cds geeignet sind grundsätzlich alle im Wirtsstamm aktiven Promotoren. Dazu zählen alle nativen Promotoren der ca. 5000 Gene in E. coli, aber auch nichtnative (z.B. Promotoren aus anderen Spezies der Familie der Enterobacteriaceae) oder „künstliche" Promotoren wie z.B. der tac-Promotor . Als Promotoren in der polycistronischen Expressionseinheit bevorzugt sind die auf pCys enthaltenen cysE-, serA- und GAPDH-Promotoren, besonders bevorzugt der serA-Pro- motor, wie er beispielsweise in Rex et al. (1991) , J. Bacteriol. 173: 5944-5953, Fig. 2, nt 1 - nt 457, beschrieben ist .
Insbesondere bevorzugt handelt es sich um den serA-Promotor mit der in SEQ ID NO: 7 angegebenen Sequenz.
Eine mRNS, auch messenger-RNS oder Boten-RNS genannt, ist eine einzelsträngige Ribonukleinsäure (RNS) , welche die genetische Information für den Aufbau eines Proteins trägt. Mit einer mRNS steht die Bauanleitung für ein bestimmtes Protein in einer Zelle zur Verfügung. Das mRNS-Molekül trägt die zum Proteinaufbau notwendige Botschaft aus der Erbinformation (DNS) an die proteinaufbauenden Ribosomen. In einer Zelle wird es gebildet als Transkript eines zu einem Gen gehörenden Teilabschnitts der DNS. Die in der DNS gespeicherte genetische Information wird dabei nicht verändert.
Gene eukaryotischer Organismen sind überwiegend sog. Mosaikgene und enthalten im Gegensatz zu prokaryotischen Genen auch nichtcodierende Abschnitte, sog. Introns (engl. intragenic regions') . Codierende Sequenzen, sog. Exons (engl. expressed regions') sind DNS-Abschnitte eines eukaryotischen Gens, die nach der Transkription in RNS von den Ribosomen in die Aminosäure-Sequenz eines Proteins übersetzt werden. Die Introns werden nach der Transkription der DNS zur RNS aus dem Primärtranskript gespleißt. Die von Introns befreite proteincodierende RNS wird als messenger-RNS (mRNS) , auch als „reife" mRNS bezeichnet. Diese wird weiteren Modifikationen wie dem Capping und der Polyadenylierung unterzogen. Der codierende Bereich der reifen mRNS wird dann in die Proteinsequenz übersetzt. Soll ein eukaryotisches Gen mit Exon/ Intronstruktur in proka- ryotischen Organismen exprimiert werden, ist es notwendig, die Proteinsequenz oder den codierenden Bereich der reifen mRNS in Intron-freie DNS zurückzuübersetzen, da bei Prokaryoten die Prozessierung der Exon/ Intronstruktur nicht stattfindet. Wenn im Rahmen dieser Erfindung von aus der Proteinsequenz oder von aus der mRNS abgeleiteten Gensequenzen die Rede ist, ist genau dieser Prozess der Rückübersetzung gemeint. Es ist bevorzugt, dass gleichzeitig mit der Rückübersetzung der Proteinsequenz oder der mRNS-Sequenz in DNS-Sequenz eine Sequenzoptimierung, d.h. Anpassung an die Codon-Nut zung des entsprechenden Prokaryoten erfolgt (Codon-Optimierung) .
Unter homologen Genen bzw. homologen DNS-Sequenzen ist zu verstehen, dass die DNS-Sequenzen dieser Gene bzw. DNS-Abschnitte zu mindestens 80%, bevorzugt zu mindestens 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% identisch sind.
Der Grad der DNS-Identität wird durch das Programm „nucleotide blast", zu finden auf der Seite http://blast. ncbi . nlm. nih . gov/ , bestimmt, welches auf dem blastn-Algorithmus basiert. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Nukleotidsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 28; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die entsprechenden voreingestellten Scoring Parameter sind: Match/Mismatch Scores = 1,-2; Gap
Costs = Linear.
Unter homologen Proteinsequenzen ist zu verstehen, dass die Proteinsequenzen dieser Proteine bzw. Protein-Abschnitte zu mindestens 80%, bevorzugt zu mindestens 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% identisch sind.
Für den Vergleich von Proteinsequenzen wird das Programm „protein blast", auf der Seite http://blast. ncbi . nlm. nih . gov/ , genutzt. Dieses Programm greift auf den blastp-Algorithmus zurück. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Proteinsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 3; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die voreingestellten Scoring Parameter sind: Matrix = BLOSUM62; Gap Costs = Existence: 11 Extension: 1; Compositional adjustments = Conditional compositional score matrix adjustment.
Die Abkürzung WT (Wt) bezeichnet den Wildtyp. Als Wildtyp-Gen wird die Form des Gens bezeichnet, die natürlicherweise durch die Evolution entstanden und im Wildtyp-Genom vorhanden ist. Die DNS-Sequenz von Wt-Genen ist in Datenbanken wie NCBI öffentlich zugänglich.
Als Allele werden die Zustandsformen eines Gens definiert, die durch Mutation, d.h. durch Änderungen der Nucleotidsequenz der DNS ineinander übergeführt werden können. Dabei wird das natürlicherweise in einem Mikroorganismus vorkommende Gen als Wildtyp-Allel bezeichnet und die davon abgeleiteten Varianten als mutierte Allele des Gens. Fermentation ist ein Verfahrensschritt zur Herstellung (Kultivierung) von Zellkulturen im technischen Maßstab, bei dem ein bevorzugt mikrobieller Produktionsstamm unter definierten Bedingungen von Kulturmedium, Temperatur, pH, Sauerstof f zufuhr und Mediumdurchmischung zum Wachstum gebracht wird . Werden alle Komponenten der Fermentation zu Beginn der Kultivierung festgelegt und dann nicht mehr verändert , spricht man von Batch- Fermentation .
Werden nach Start der Fermentation Medienbestandteile wie z . B . Glucose ( C-Quelle ) oder ein komplexes Aminosäuregemisch wie z . B . Hefeextrakt (N-Quelle ) als sog . Feed kontinuierlich zugeführt , spricht man von einer Fed-Batch Fermentation ( sog . Zulaufverfahren) . Durch eine Fed-Batch Fermentation kann die Bildung von Biomasse und Zielprodukt optimiert werden . Ziel der Fermentation ist , abhängig von der Konfiguration ( genetischen Ausstattung) des Produktionsstammes , die Produktion eines Proteins/Enzyms oder eines Stof fwechselprodukts , j eweils mit möglichst hoher Ausbeute für die weitere Verwendung . Das Produkt Hypotaurin kann durch Fermentation hergestellt werden . Endprodukt der Fermentation ist eine Fermenterbrühe , bestehend aus der Biomasse der Zellen des Produktionsstammes ( Fermenterzellen) und dem von der Biomasse befreiten Fermentationsmedium ( Fermentationsüberstand) , das sich im Verlauf der Fermentation aus dem Anzuchtmedium und den von den Fermenterzellen sekretierten Stof fwechselprodukten gebildet hat . Im Gegensatz zum durch seine chemische Zusammensetzung definierten Anzuchtmedium ist die Zusammensetzung des Fermentationsmediums infolge der nicht vorhersehbaren Bildung von Stof fwechselprodukten nicht eindeutig definiert . In der vorliegenden Erfindung wird das Produkt Hypotaurin durch Fermentation hergestellt . Prinzipiell können sich die Produkte der Fermentation in den Fermenterzellen und/oder im Fermentationsmedium befinden . Wie in Beispiel 5 der vorliegenden Erfindung of fenbart , findet sich Hypotaurin innerhalb der Nachweisgrenze ausschließlich im Fermentationsmedium wieder . Daher wird nur das durch Sekretion in das Fermentationsmedium hergestellte Hypotaurin berücksichtigt . Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet , dass der Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsüberstand bezogen auf den Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsansatz über 70% , bevorzugt über 80 und insbesondere bevorzugt über 90% beträgt . Der Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsüberstand entspricht dem extrazellulären ( sekretierten) Hypotaurin . Der Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsansatz ist die Summe aus extrazellulärem und intrazellulärem Hypotaurin-Gehalt , auch mit Gesamt-Hypotaurin- Gehalt bezeichnet . Dabei wird der extrazelluläre Anteil an Hypotaurin bestimmt wie in Beispiel 3 ( Probenvorbereitung) beschrieben . Der intrazelluläre Anteil an Hypotaurin wird bestimmt wie in Beispiel 5 beschrieben, wobei j eweils eine Nachweisgrenze von 1 mg/L Hypotaurin gilt .
Zur Kultivierung von Mikroorganismen im Labormaßstab dient die Schüttelkolbenanzucht , im Gegensatz zum Produktionsmaßstab durch Fermentation . Zwar wird auch bei der Schüttelkolbenkultur ein bestimmtes Medium und ein pH vorgegeben und in Gegenwart von Sauerstof f und unter permanenter Bewegung ( Schütteln) kultiviert , aber definiertere Bedingungen betref fend das Medium, Temperatur, pH, Sauerstof f zufuhr und Mediumsdurchmischung lassen sich im Fermenter einstellen und regulieren . Die Kultur in einem kleineren Maßstab z . B . im Schüttelkolben kann auch als Vorkultur zum Animpfen einer Kultur im größeren Maßstab z . B . eines Fermenters genutzt werden .
Der Produktionsmaßstab in der Fermentation beginnt typischerweise bei 0 , 5 L Ansatzvolumen und kann bis 100000 L oder auch mehr betragen . Der Produktionsmaßstab der Schüttelkolbenanzucht reicht typischerweise von 10 ml bis 1000 ml Ansatzvolumen .
Ausbeute im Sinne der Erfindung ist definiert als die Menge des Produkts , welche durch Anzucht eines Produktionsstammes erhalten wird . Die Ausbeute kann angegeben werden in absoluter Menge Produkt (mmol oder g) oder als Volumenausbeute (Konzen- tration) in auf das Volumen bezogene Menge Produkt (mM oder g/L ) .
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von Hypotaurin unter Verwendung eines mikrobiellen Produktionsstamms . Ein Produktionsstamm umfasst definitionsgemäß einen Mikroorganismus , bezeichnet als Wirtsstamm und mindestens ein Genkonstrukt . In der vorliegenden Erfindung ist der Produktionsstamm gekennzeichnet dadurch, dass es sich beim Genkonstrukt um einen Expressionsvektor handelt .
Als Wirtsstamm geeignet ist j eder Mikroorganismus , der rekom- binanten DNS-Techniken zugänglich ist und der für eine fermentative Herstellung von rekombinanten Proteinen geeignet ist . Geeignete Mikroorganismenstämme umfassen Bakterienstämme , ausgewählt aus der Familie der Corynebacteriaceae oder der Familie der Enterobacteriaceae , Hefen ( z . B . Saccharomyces cerevi siae, Yarrowia lipolyti ca ) oder Pil ze ( z . B . Aspergill us niger) .
Beim zur Herstellung des Produktionsstamms verwendeten Wirtsstamm handelt es sich bevorzugt um einen prokaryotischen Mikroorganismus , besonders bevorzugt um einen Bakterienstamm ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Coryn ebacteri um ssp . (wie besonders bevorzugt C. gl utami cum) , Pantoea ssp . (wie besonders bevorzugt P. anana ti s) und Escheri chia ssp . und insbesondere bevorzugt um einen Mikroorganismus der Art Escheri chia coli . In einer speziell bevorzugten Aus führungsform handelt es sich beim Mikroorganismus um den Stamm E. coli K12 W3110 , käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 5911 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH .
Ein Produktionsstamm zur fermentativen Herstellung von mindestens 10 g/ 1 Hypotaurin ist gekennzeichnet dadurch, dass er ein Genkonstrukt enthält , welches ( I ) einen zu Hypotaurin führenden Stof fwechselweg definiert durch die Expression der cds a ( codierend CDO) und b ( codierend CSAD) und
( I I ) einen deregulierten Cystein-Biosyntheseweg definiert durch die Expression mindestens einer der cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c ( codierend SerA mit verminderter Feedback-Hemmung durch Serin) , d ( codierend CysE mit verminderter Feedback-Hemmung durch Cystein) und e ( codierend einen Cystein-Exporter ) umfasst .
( I ) Der zu Hypotaurin führende Stof fwechselweg ist gekennzeichnet dadurch, dass er nach Gleichung ( 1 ) und ( 3 ) die Reaktion von L-Cystein zu Hypotaurin umfasst .
Die den Hypotaurin-Stof fwechselweg konstituierenden Gene CDO und CSAD im Produktionsstamm können aus dem Mikroorganismenstamm stammen, der auch der Wirtsstamm ist (homologe Expression) oder es kann sich um Fremdgene handeln (heterologe Expression) , entweder synthetisch hergestellt ( incl . der dadurch ermöglichten Anpassung der cds auf die Expression im Wirtsstamm durch sog . Codon-Optimierung) oder aus anderen Stämmen als dem Wirtsstamm isoliert , bzw . es kann sich um eine Kombination aus homologer und heterologer Expression handeln . Bevorzugt ist die heterologe Expression der Gene des den Hypotaurin konstituierenden Stof fwechselwegs im Produktionsstamm, besonders bevorzugt die heterologe Expression synthetisch hergestellter Gene und insbesondere bevorzugt die heterologe Expression von codon-optimierten, synthetisch hergestellten Genen des den Hypotaurin konstituierenden Stof fwechselwegs im Produkt ions stamm .
( I I ) Ein Produktionsstamm, enthaltend ein Genkonstrukt umfassend Expressionseinheiten für einen deregulierten Cystein-Biosyntheseweg und damit zur Cystein-Produktion geeignet ist dadurch gekennzeichnet , dass er mindestens eine der cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c, d und e enthält : c) Der Produktionsstamm umfasst mindestens ein verändertes serA-Gen, d.h. er enthält mindestens eine cds c codierend für eine 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase (SerA) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch L- Serin, wobei die SerA-Enzymaktivität z.B. photometrisch bestimmt werden kann durch die vom SerA-Substrat 3- Phosphohydroxypyruvat abhängige Oxidation von NADH wie z.B. von McKitrick und Pizer, J. Bacteriol. (1980) 141: 235 - 245 beschrieben. Darüber hinaus kann der Produktionsstamm zusätzlich das unveränderte WT-serA-Gen enthalten. Besonders bevorzugte Varianten der 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase (SerA) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hinaus bevorzugten Ausführung um mindestens den Faktor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch L-Serin auf.
Beispiele von serA-Varianten, codierend für SerA-Enzyme mit verminderter Feedback-Hemmung sind aus dem Stand der Technik bekannt und stellen im Rahmen dieser Erfindung bevorzugte Aus führungs formen dar:
- serA317 : Feedback-resistente SerA-Mutante, wie in der vorliegenden Erfindung im Vektor pCys (Fig. 1) verwendet. Es handelt sich um eine C-terminale Deletionsmutante von SerA, umfassend die N-terminalen 317 Aminosäuren des SerA WT-Proteins mit einer Gesamtlänge von 410 Aminosäuren (Bell et al., Eur . J. Biochem., 2002, 269: 4176-4184, darin bezeichnet als „NSD:317"; siehe auch Beispiel 1) .
- serA G349E: Mutation von Glycin an Position 349 des WT- SerA Enzyms zu Glutaminsäure.
- serA G349D: Mutation von Glycin an Position 349 des WT- SerA Enzyms zu Asparaginsäure .
- serA T372X: Mutation von Threonin an Position 372 des WT- SerA Enzyms zu X, wobei X jede beliebige natürliche
Aminosäure außer Threonin sein kann. - serA mutiert: serA-Gen, bei dem 25% der C-terminalen Aminosäuren gegenüber WT verändert sind, wobei die Änderung sich i) in den 50 C-terminalen Aminosäuren des WT-Proteins befindet und ii) die Änderung eine C-terminale Deletion umfasst und iii) die Änderung eine Insertion in die WT-Sequenz umfasst . und/ oder d) Der Produktionsstamm umfasst mindestens ein verändertes cysE-Gen, d.h. er enthält mindestens eine cds d codierend für eine Serin-O-Acetyl-Transf erase (CysE) , die im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor zwei verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein aufweist (wie beispielsweise beschrieben in Nakamori et al., Appl . Env. Microbiol. (1998) 64: 1607- 1611) , wobei die CysE-Enzymaktivität z.B. photometrisch bestimmt werden kann durch den Verbrauch des CysE-Substrats Acetyl-CoA infolge der Reaktion mit L-Serin zu O-Acetyl-L- Serin, wie z.B. von Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611 beschrieben. Darüber hinaus kann der Produktionsstamm zusätzlich das unveränderte WT-cysE-Gen enthalten .
Besonders bevorzugte Varianten der Serin-O-Acetyl-Trans- ferase (CysE) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hinaus bevorzugten Ausführung um mindestens den Faktor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein auf.
Beispiele von cysE-Varianten, codierend für CysE-Enzyme mit verminderter Feedback-Hemmung und im Rahmen dieser Erfindung bevorzugte Aus führungs formen sind:
- cysE -mutiert : Mutation im Sequenzbereich Position 97 bis einschließlich 273.
- cysE-deletiert : Deletion im Sequenzbereich Position 248 bis einschließlich 259. Als spezifische Mutationen sind im Rahmen dieser Erfindung bevorzugte Aus führungs formen :
- cysEII: G238S, Mutation von Glycin an Position 238 zu Serin .
- cysEIII: G165D Mutation von Glycin an Position 165 zu Asparaginsäure .
- cysEIV: A237V, Mutation von Alanin an Position 237 zu Valin und G238S, Mutation von Glycin an Position 238 zu Serin (Doppelmutante) .
- cysEV: A237V, Mutation von Alanin an Position 237 zu Valin und G238S, Mutation von Glycin an Position 238 zu Serin und M256I, Mutation von Methionin an Position 256 zu Isoleucin (Tripelmutante) .
- cysEVI : G238S, Mutation von Glycin an Position 238 zu Serin und M256I, Mutation von Methionin an Position 256 zu Isoleucin (Doppelmutante) .
- cysEVII: A237V, Mutation von Alanin an Position 237 zu Valin .
- cysEVIII: M256I, Mutation von Methionin an Position 256 zu Isoleucin und A237V, Mutation von Alanin an Position 237 zu Valin (Doppelmutante) .
- cysEX: T167A, Mutation von Threonin an Position 167 zu Alanin (im Vektor pCys, Beispiel 1, verwendet) .
- cysEXI : T167A, Mutation von Threonin an Position 167 zu Alanin und G245S, Mutation von Glycin an Position 245 zu Serin (Doppelmutante) .
- cysEXII: K97Q, Mutation von Lysin an Position 97 zu Glutamin und G238S, Mutation von Glycin an Position 238 zu Serin und F267L, Mutation von Phenylalanin an Position 267 zu Leucin (Tripelmutante) .
- cysEXIII: V164A, Mutation von Valin an Position 164 zu Alanin und F267L, Mutation von Mutation von Phenylalanin an Position 267 zu Leucin (Doppelmutante) .
- cysEXIV: T167A, Mutation von Threonin an Position 167 zu Alanin und M256Stop, Mutation von Methionin an Position 256 zu Stop (Doppelmutante) . - cysEXVI : D250G, Mutation von Asparaginsäure an Position 250 zu Glycin .
- cysEXVII : G165D, Mutation von Glycin an Position 165 zu Asparaginsäure und T167A, Mutation von Threonin an Position 167 zu Alanin ( Doppelmutante ) .
- cysEXXIII : T167A, Mutation von Mutation von Threonin an Position 167 zu Alanin und A237V, Mutation von Alanin an Position 237 zu Valin und G238S , Mutation von Glycin an Position 238 zu Serin ( Tripelmutante ) .
- cysE M256X : Mutation von Methionin an Position 256 des WT-CysE Enzyms zu X, wobei X j ede beliebige natürliche Aminosäure außer Methionin sein kann .
- cysE Arabidopsis thaliana ( Pflanze ) : A. thaliana enthält drei cysE-Gene , wovon zwei Feedback-resistent gegen Cystein sind .
- cysE M256I : Mutation von Methionin an Position 256 des WT-CysE Enzyms zu I soleucin . und/ oder
Der Produktionsstamm umfasst gegenüber dem Ausgangsstamm (Wirtsstamm) mindestens eine verstärkt exprimierte cds e (Überexpression) oder eine zusätzliche cds e codierend einen Cystein-Exporter ( -Ef fluxprotein) , was zu einer verstärkten Expression von Cystein-Exportern führt , so dass die Zelle des Produktionsstamms einen um mindestens den Faktor zwei erhöhten Cystein-Export aus der Zelle im Vergleich zum entsprechenden Ausgangsstamm (Wirtsstamm) aufweist , wobei der Cystein-Export bestimmt werden kann durch photometrische Messung des extrazellulären Cystein-Gehalts nach Gaitonde , Biochem . J . ( 1967 ) 104 : 627 - 633 (umfassend Cystein, Cystin und das aus Cystein und Pyruvat gebildete Addukt 2-Methyl-Thiazolidin-2 , 4- (R) -dicarbonsaure ) , wie z . B . in US 5 , 972 , 663 B beschrieben .
Die verstärkte Expression von Cystein-Exportern führt im Vergleich zum Ausgangsstamm (Wirtsstamm) bevorzugt zu einem um mindestens den Faktor 5 , besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10 , insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 20 erhöhten Cystein-Export aus der Zelle . Bei der cds codierend den Cystein-Exporter handelt es sich bevorzugt um eine oder mehrere Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ydeD, yfiK, cydDC, bcr und emrAB von E. coli oder eine dazu zu mindestens 80% , besonders bevorzugt mindestens 90% und insbesondere bevorzugt mindestens 95% identische Sequenz .
Die cds , die die Hypotaurin-Biosynthese bedingen und die cds , die den deregulierten Cystein-Biosyntheseweg bedingen, liegen extrachromosomal auf Vektoren im Mikroorganismenstamm vor, entweder auf einem Vektor vereint oder auf mehrere Vektoren auf geteilt .
In einer bevorzugten Aus führungs form ist das Verfahren zur Herstellung von Hypotaurin dadurch gekennzeichnet , dass die cds codierend CDO ( a ) und die cds codierend CSAD (b ) im Expressionsvektor des mikrobiellen Produktionsstamms mit der cds codierend SerA mit verminderter Feedback-Hemmung durch Serin ( c ) in einer tricistronischen Expressionseinheit vorliegen, die besonders bevorzugt funktionell mit dem serA-Pro- motor, der insbesondere bevorzugt die in SEQ ID NO : 7 angegebene Sequenz hat , verknüpft ist . Das bedeutet , dass die Expression der drei genannten cds von nur einem Promotor reguliert wird ( d . h . es liegt ein tricistronisches Operon vor ) . Die 3 cds liegen separat hintereinander vor, j ede cds mit ihrer eigenen RBS . Ihre Expression erfolgt koordiniert unter der Regulation desselben einen Promotors , bei dem es sich bevorzugt um den serA-Promotor handelt , führt aber zu 3 getrennten Proteinen, nicht zu Fusionsproteinen .
Besonders bevorzugt ist die Reihenfolge im Operon so , dass im tricistronischen Operon auf den Promotor, bevorzugt den serA- Promotor, die serA-cds , dann die CDO-cds und abschließend die CSAD-cds folgen . Bei serA handelt es sich bevorzugt um serA317 . SerA317 ist of fenbart in Bell et al . , Eur . J .
Biochem . ( 2002 ) 269 : 4176-4184 , darin bezeichnet als „NSD : 317" und codiert für eine gegen Serin Feedback-resistente Variante der 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase . Die tricistronische Expressionseinheit aus serA, CDO und CSAD in der vorliegenden Erfindung erlaubt die Kopplung des L-Cystein- und des Hypotaurinstoffwechsels durch deren koordinierte Expression unter Kontrolle des serA-Promotors.
In den in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung offenbarten Expressionsvektoren pCys-CDOrn-CSADhs (Fig. 2) und pCys-CDOrn- CSADcc (Fig. 3) bilden beispielsweise die Expressionseinheiten serA317, CDOrn und CSADhs, bzw. serA317, CDOrn und CSADcc ein künstliches tricistronisches Operon, wobei die Expression unter Kontrolle des serA-Promotors erfolgt. Der serA-Promotor kontrolliert somit in den Genkonstrukten pCys-CDOrn-CSADhs und pCys-CDOrn-CSADcc die Expression von drei cds, nämlich jeweils die Expression der cds codierend serA317 und die Expression der cds codierend das CDOrn-Enzym, die von der mRNS der von Rattus norvegicus (rn) vorliegenden Gensequenz abgeleitet wurde, sowie im Genkonstrukt pCys-CDOrn-CSADhs die Expression der cds codierend das CSADhs-Enzym, die von der mRNS der von Homo sapiens (hs) vorliegenden Gensequenz abgeleitet wurde, bzw. im Genkonstrukt pCys-CDOrn-CSADcc die Expression der cds codierend das CSADcc-Enzym, die von der mRNS der von Cyprinus carpio (cc) vorliegenden Gensequenz abgeleitet wurde.
Ein besonders bevorzugtes Genkonstrukt, welches eine cds codierend SerA mit verminderter Feedback-Hemmung durch Serin und funktionell verknüpft mit dem serA-Promotor (c) , cysE mit verminderter Feedback-Hemmung durch Cystein und funktionell verknüpft mit dem cysE-Promotor (d) und einen Cystein-Expor- ter, funktionell verknüpft mit dem Promotor des E. coli GAPDH- Gens (e) umfasst (GAPDH: Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase) , ist der in WO 2021/259491 (Wacker) offenbarte und in Beispiel 1 beschriebene Vektor pCys (Fig. 1) . Transformiert man pCys in einen geeigneten Wirtsstamm, erhält man einen Produktionsstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg, welcher dadurch zur Cystein-Produktion geeignet ist (siehe z.B. WO 2021/259491, Wacker) . Besonders bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von Hypotaurin dadurch gekennzeichnet, dass die cds codierend CDO (a) , CSAD (b) , SerA mit verminderter Feedback-Hemmung durch Serin (c) , CysE mit verminderter Feedback-Hemmung durch Cystein (d) und codierend den Cystein-Exporter (e) alle auf einem einzigen Expressionsvektor vorliegen. Insbesondere bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von Hypotaurin dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor des mikrobiellen Produktionsstamms ausgewählt ist aus den Genkonstrukten pCys-CDOrn-CSADhs oder pCys-CDOrn-CSADcc . Diese Genkonstrukte sind in Beispiel 1, Fig. 2 bzw. Fig. 3 offenbart. In einer speziell bevorzugten Aus führungs form ist der Expressionsvektor des mikrobiellen Produktionsstamms das Genkonstrukt pCys-CDOrn-CSADcc.
Das erfindungsgemäße Genkonstrukt umfasst somit Feedbackresistente Allele des cysE- und/oder des serA-Gens und/oder ein Gen für einen Cystein-Exporter wie bevorzugt das ydeD Efflux-Gen sowie Gene codierend für ein CDO- und ein CSAD- Enzym, wobei das CDO- und das CSAD-Gen, jeweils mit eigener RBS, in polycistronischen Expressionseinheiten mit dem cysE-, serA- und/oder dem Cystein-Ef f luxgen, wie bevorzugt dem ydeD- Gen, verknüpft sind. Bevorzugt ist ein tricistronisches Operon, wobei u.a. folgende Konfigurationen denkbar sind: a) serA-CDO-CSAD b) serA-CSAD-CDO c) cysE-CDO-CSAD d) cysE-CSAD-CDO e) ydeD-CDO-CSAD f) ydeD-CSAD-CDO.
Dabei sind a) und b) im tricistronischen Operon bevorzugt funktionell verknüpft mit dem serA-Promotor , c) und d) im tricistronischen Operon bevorzugt funktionell verknüpft mit dem cysE-Promotor und e) und f) im tricistronischen Operon bevorzugt funktionell verknüpft mit dem Promotor des E. coli GAPDH-Gens, wobei a) bis f) mit jedem anderen in E. coli aktiven Promotor funktionell verknüpft sein können. Bevorzugt ist ein Genkonstrukt umfassend ein tricistronisches Operon umfassend a) serA-CDO-CSAD oder b) serA-CSAD-CDO.
Besonders bevorzugt ist ein Genkonstrukt umfassend ein tricistronisches Operon umfassend a) serA-CDO-CSAD.
Wie in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung beschrieben, wurde der in WO 2021/259491 (Wacker) beschriebene Vektor pCys (Fig. 1) um die Gene für Cystein-Dioxygenase aus Rattus norvegicus (CDOrn) , SEQ ID NO: 1, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2, für L-Cysteinsulf in- säure-Decarboxylase aus Homo sapiens (CSADhs) , SEQ ID NO: 3, nt 1 bis nt 1509, codierend für ein Protein mit der Amino- säuresquenz SEQ ID NO: 4 oder für L-Cysteinsulf insäure-Decar- boxylase aus Cyprinus carpio (CSADcc) , SEQ ID NO: 5, nt 1 bis nt 1503, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresquenz SEQ ID NO: 6, erweitert. Es entstanden die Vektoren pCys- CDOrn-CSADhs (Fig. 2) und pCys-CDOrn-CSADcc (Fig. 3) zur Produktion von Hypotaurin. Die Herstellung der Genkonstrukte erfolgte entsprechend dem Stand der Technik vorzugsweise mit Hilfe von üblichen rekombinanten DNS-Techniken, wie in Beispiel 1 beschrieben und wie sie dem Fachmann geläufig sind. In pCys-CDOrn-CSADhs sind das CDOrn- und CSADhs-Gen in Form eines künstlichen tricistronischen Operons jeweils mit eigener Ribosomenbindestelle (RBS) , aber ohne eigenen Promotor, hinter das in pCys enthaltene serA317-Gen kloniert, so dass ihre Expression unter Kontrolle des serA-Promotors erfolgt. In pCys-CDOrn-CSADcc sind das CDOrn- und CSADcc-Gen in Form eines künstlichen tricistronischen Operons jeweils mit eigener Ribosomenbindestelle (RBS) , aber ohne eigenen Promotor, hinter das in pCys enthaltene serA317-Gen kloniert, so dass ihre Expression unter Kontrolle des serA-Promotors erfolgt.
Die Herstellung eines Produktionsstammes erfolgt in bekannter Weise durch Transformation des erfindungsgemäßen Genkonstrukts in den Mikroorganismus (Wirtsstamm) , bevorzugt des Genkonstrukts pCys-CDOrn-CSADhs oder des Genkonstrukts pCys- CDOrn-CSADcc, besonders bevorzugt des Genkonstrukts pCys- CDOrn-CSADcc in den Wirtsstamm E. coli K12 W3110.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung offenbart, ermöglicht die Fermentation erfindungsgemäßer Produktionsstämme, die durch die bisher unbekannte koordinierte Expression des CDO- und CSAD-Gens von einem polycistronischen, bevorzugt tricistronischen Operon unter Kontrolle des aus dem Cystein-Stof fwechsel stammenden serA-Promotors gekennzeichnet sind, eine überraschend weit höhere Produktion von Hypotaurin als der Stand der Technik. Im Stand der Technik offenbart sind z.B. in WO 17/213142 Al (Ajinomoto) Hypotaurin Ausbeuten in E. coli von max. 450 pM, entsprechend 49,1 mg/L Hypotaurin bei 109,2 g/mol Mol. -Gewicht von Hypotaurin. Honjoh et al. (2010) , Amino Acids 38: 173-1183, beschreiben nur die intrazelluläre Produktion von Hypotaurin in Hefe mit Ausbeuten von 85,3 pmol/g Trockenbiomasse, entsprechend 9,3 mg/g Hypotaurin bei 109,2 g/mol Mol. -Gewicht von Hypotaurin. Allerdings musste dem Anzuchtsmedium L-Cystein als Substrat der Hypotaurin Biosynthese zugesetzt werden (siehe „Materials and Methods" in Hon oh et al . ) .
Weiterhin beschreibt der Stand der Technik nur Produktionsausbeuten für Taurin, das Oxidationsprodukt von Hypotaurin. So offenbart US 2019/0062757 Al (KnipBio) Ausbeuten von 419 ng/ml Taurin (E. coli) , während Joo et al. (2018) , J. Agric. Food Chem. 66: 13454 - 13463, Taurin Ausbeuten in C. glutamicum von max. 0,5 g/L Taurin beschreibt.
Bevorzugt ist das Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsvolumen mindestens 1 L beträgt, wobei der Produktionsmaßstab von mindestens 10 L besonders bevorzugt, von mindestens 1000 L insbesondere bevorzugt und ein Fermentationsvolumen von mindestens 10000 L im speziellen bevorzugt ist. Der Gehalt an Hypotaurin kann aus der Kulturbrühe quantifiziert werden. Dazu wird der Kulturbrühe mit einer Zelldichte ODgoo/ml von mindestens 1,0/ml z.B. ein Aliquot von 1 ml entnommen, 5 min bei 80 °C inkubiert, anschließend alle festen Bestandteile beispielsweise durch fünfminütiges Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge abgetrennt und der Überstand durch für Hypotaurin und Taurin kalibrierte HPLC quantifiziert, wie u.a. in Beispiel 3 für Hypotaurin und Taurin beschrieben.
Im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt die Ausbeute des Produkts Hypotaurin am Ende der Fermentation nach einer Fermentationsdauer von bevorzugt maximal 65 h bevorzugt mindestens 10 g/L, besonders bevorzugt mindestens 20 g/L und insbesondere bevorzugt mindestens 50 g/L, weit mehr als im Stand der Technik bekannt (z.B. 49,1 mg/L Hypotaurin in WO 17/213142 Al) .
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die fermentative Herstellung von Hypotaurin in bisher nicht bekannten Ausbeuten für Anwendungen im Lebensmittel-, Futtermittel- und auch pharmazeutischen Bereich.
Das erfindungsgemäße fermentative Verfahren zeichnet sich darüber hinaus dadurch aus, dass es die Produktion von Hypotaurin in einem hohen molaren Überschuss gegenüber dem Nebenprodukt Taurin erlaubt. Dabei wird der molare Überschuss definiert als Quotient der molaren Hypotaurin-Konzentration im Fermentationsüberstand am Ende der Fermentation dividiert durch die molare Taurin-Konzentration im Fermentationsüberstand zum gleichen Zeitpunkt. Wie in Beispiel 4 offenbart, beträgt der molare Überschuss Hypotaurin : Taurin mindestens 3:1, bevorzugt mindestens 5:1, besonders bevorzugt mindestens 10:1 und insbesondere bevorzugt mindestens 20:1.
Medien zur Anzucht des Produktionsstamms im Schüttelkolben und durch Fermentation sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiellen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoff quelle (C-Quelle) , einer Stickstoff quelle (N- Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen sowie einer Schwefelquelle (S-Quelle) , durch die das Zellwachstum und die Hypotaurin-Produktion optimiert werden.
C-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Hypotaurin-Produktbildung genutzt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker (Hexosen) wie z. B. Glucose, Mannose, Fructose oder Galactose sowie C5- Zucker (Pentosen) wie z.B. Xylose, Arabinose oder Ribose sowie alle denkbaren daraus gebildeten Di- und Polysaccharide, wie z.B. Saccharose, Lactose, Maltose, Maltodextrin, Stärke, bzw. der daraus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch) freigesetzten Monomere oder Oligomere. Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze) , Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat (und dessen Salze) . Es sind aber auch gasförmige C-Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmonoxid denkbar.
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht des Produktionsstamms sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose und Arabinose, darunter besonders bevorzugt Glucose und Saccharose und insbesondere bevorzugt Glucose.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genutzt werden können. Dazu können beispielsweise verwendet werden:
- Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat und/ oder
- die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO3, NaNO3, Ammoniumnitrat, Ca(NO3)2, Mg(NO3)2 sowie andere N-Quellen wie z.B. Harnstoff und/oder
- komplexe Aminosäuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) und/oder - NZ-Amine und/oder
- Yeast Nitrogen Base.
Die Zudosierung einer Schwefel-Quelle, entweder als einmalige Zugabe in Batch-Form oder als kontinuierlicher Feed, ist für die effiziente Produktion von Hypotaurin erforderlich. Die kontinuierliche Zudosierung kann dabei als reine Feedlösung oder aber auch im Gemisch mit einer weiteren Feed-Komponente wie z.B. Glucose erfolgen. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch charakterisiert, dass es in Gegenwart mindestens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Salz der Sulfate, Sulfite, Dithionite, Thiosulfate und Sulfide, wobei auch bei gegebener Stabilität der Einsatz der jeweiligen Säuren denkbar ist, durchgeführt wird. Bevorzugte Schwefelquellen sind Salze der Sulfate, Sulfite, Thiosulfate und Sulfide, darunter besonders bevorzugt Salze der Sulfate und Thiosulfate. Insbesondere bevorzugt ist das Verfahren dadurch charakterisiert, dass es in Gegenwart von Salzen des Thiosulfats durchgeführt wird. Als Salz des Thiosulfats besonders bevorzugt ist eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumthiosulfat, Ammoniumthiosulfat und deren Gemische.
Die Anzucht (Kultivierung der Mikroorganismenzellen) kann erfolgen im sog. Batch Modus, d.h. dass zur Gewinnung von Biomasse das Anzuchtmedium (Kulturmedium) mit einer Starterkultur des Produktionsstamms (ein oder mehrere Genkonstrukt/e tragende Mikroorganismenzellen) inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoff quellen erfolgt. Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus (auch genannt Anzucht im Zulauf-Modus ) , d.h. ein Verfahren zur Gewinnung von Biomasse, in dem nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch-Modus zusätzlich Nährstoff quellen zugefüttert werden (Feed, bzw. Zulauf) . Der Feed kann bestehen aus der C-Quelle, der N-Quelle, der Schwefel-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der Vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die Hypotaurin-Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden, oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin mit einem mikrobiellen Produktionsstamm dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim fermentativen Verfahren um ein Verfahren im Fed-Batch Modus handelt.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Saccharose sowie Glucose oder Saccharose enthaltende pflanzliche Hydrolysate sowie Mischungen der bevorzugten C-Quellen in beliebigem Mischungsverhältnis. Besonders bevorzugte C-Quelle im Feed ist Glucose .
Bevorzugt wird die C-Quelle der Kultur so zudosiert, dass der Gehalt der Kohlenstoff quelle im Fermenter während der Produktionsphase 10 g/L nicht übersteigt. Bevorzugt ist eine maximale Konzentration von 2 g/L, besonders bevorzugt von 0,5 g/L, insbesondere bevorzugt von 0,1 g/L.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KNO3, NaNO3 und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base, darunter besonders bevorzugt Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Hefeextrakt, Sojapepton oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form) .
Bevorzugte Schwefelquellen im Feed sind Salze der Sulfate, Sulfite, Thiosulfate und Sulfide, darunter besonders bevorzugt Salze der Sulfate und Thiosulfate und insbesondere bevorzugt Salze des Thiosulfats, wie z.B. Natriumthiosulfat und Ammoniumthiosulfat .
Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren (d. h. in pM Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink, Kupfer und Nickel zugesetzt werden. Des Weiteren können organische Säuren (z.B. Acetat, Citrat) , Aminosäuren (z.B. Isoleucin) und Vitamine (z.B. Vitamin Bl, Vitamin B6) dem Medium zugesetzt werden.
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die Hypotaurin-Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der pH-Bereich reicht bevorzugt von pH 5 bis pH 9. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 8. Insbesondere bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7,5.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 37°C und insbesondere bevorzugt von 28°C bis 34°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoff zufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoff zufuhr (aerobe Kultivierung) . Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff.
Bei der aeroben Kultivierung des erfindungsgemäßen Stammes zur Hypotaurin-Produktion wird eine Sättigung des Sauerstoff- Gehalts von bevorzugt mindestens 10% (v/v) , besonders bevorzugt von mindestens 20% (v/v) und insbesondere bevorzugt von mindestens 30% (v/v) eingestellt. Die Regulation der Sauerstoff-Sättigung in der Kultur erfolgt dabei entsprechend dem Stand der Technik automatisch über eine Kombination aus Gaszufuhr und Rührgeschwindigkeit.
Die Sauerstoffversorgung kann durch Eintrag von Pressluft oder reinen Sauerstoff gewährleistet werden. Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft . Der Bereich der Pressluft zufuhr bei der aeroben Kultivierung beträgt bevorzugt 0 , 05 vvm bis 10 vvm (vvm : Eintrag von Pressluft in den Fermentationsansatz angegeben in Liter Pressluft j e Liter Fermentationsvolumen pro Minute ) . Besonders bevorzugt ist ein Presslufteintrag von 0 , 2 vvm bis 8 vvm, insbesondere bevorzugt von 0 , 4 bis 6 vvm und im speziellen bevorzugt von 0 , 8 bis 5 vvm .
Die maximale Rührgeschwindigkeit beträgt bevorzugt 2500 rpm, besonders bevorzugt maximal 2000 rpm und insbesondere bevorzugt maximal 1800 rpm .
Die Kultivierungsdauer beträgt bevorzugt zwischen 10 h und 200 h . Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h . Insbesondere bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h .
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin wird in Schritt i der anspruchsgemäße mikrobielle Produktionsstamm kultiviert und in Schritt ii der Fermentationsüberstand isoliert . D . h . Fermentationsansätze , die durch das beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten Hypotaurin extrazellulär akkumuliert im Fermentationsüberstand . Hypotaurin kann direkt weiterverwendet oder aus dem Fermentationsmedium isoliert werden . Verschiedene analytische Methoden zur Identi fi zierung, Quanti fi zierung und Bestimmung des Reinheitsgrades des Hypotaurins sind verfügbar, darunter Spektralphotometrie , NMR, Gaschromatographie , HPLC, Massenspektroskopie , Gravimetrie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden .
Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide .
Fig . 1 : pCys . Fig. 2: pCys-CDOrn-CSADhs .
Fig. 3: pCys-CDOrn-CSADcc .
In den Figuren verwendete Abkürzungen:
TetR: Gen, das Resistenz gegen Tetracyclin verleiht.
P15A ORT: Replikationsursprung. serA317: serA ( 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase-Gen, codiert für Aminosäure 1 bis 317) cds cysE X: cysE (Serin-O-Acetyltransferase-Gen, Feedbackresistent) cds
ORF306: ydeD (Cystein Efflux-Gen) cds
Seal: Schnittstelle für das Restriktionsenzym Seal
PpuMI : Schnittstelle für das Restriktionsenzym PpuMI
CDOrn: CDO (Cystein Dioxygenase) R. norvegicus cds
CSADhs : CSAD (Cysteinsulf insäure Decarboxylase) H. sapiens cds
CSADcc: CSAD (Cysteinsulf insäure Decarboxylase) C. carpio cds
RBS : Ribosomenbindestelle
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der
Erfindung .
Beispiel 1: Herstellung von pCys-CDOrn-CSADhs und pCys-
CDOrn-CSADcc
Die Vektoren pCys-CDOrn-CSADhs und pCys-CDOrn-CSADcc sind abgeleitet vom Vektor pCys (Fig. 1) . pCys : pCys ist offenbart in WO 2021/259491 (Wacker) und ist ein Derivat des Plasmids pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306. Das Plasmid pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 enthält neben dem Replikationsursprung und einem Tetracyclin-Resistenzgen (Ausgangsvektor pACYC184) das cysEX-Allel (synonym cysE-
Allel) , das für eine Serin-O-Acetyl-Transf erase mit einer verminderten Feedback-Hemmung durch Cystein codiert und dessen Expression durch den cysE-Promotor gesteuert wird sowie das Effluxgen ydeD (ORF306) , dessen Expression durch den konstitutiven GAPDH Promotor, stammend vom E. coli GAPDH-Gen, gesteuert wird. pCys enthält darüber hinaus, kloniert hinter das ydeD (ORF306) Efflux Gen, noch das serA317 Genfragment, codierend für die N- terminalen 317 Aminosäuren des SerA Proteins (Gesamtlänge 410 Aminosäuren) . Das E. coli serA-Gen ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank mit der Gene ID 945258. serA317 ist offenbart in Bell et al., Eur . J. Biochem. (2002) 269: 4176- 4184, darin bezeichnet als „NSD:317" und codiert für eine gegen Serin Feedback-resistente Variante der 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase. Die Expression von serA317 wird gesteuert durch den serA-Promotor . Der serA-Promotor gemäß SEQ ID NO: 7 ist in Rex et al. (1991) , J. Bacteriol. 173: 5944-5953, Fig. 2, nt 1 - nt 457, offenbart.
Für Klonierungszwecke wurde Plasmid-DNS des Vektors pCys mit Seal und PpuMI geschnitten und das 6, 1 kb große Vektorf ragment nach präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert (QIAquick® Gel Extraction Kit, Qiagen) , im Folgenden als pCys-Scal/PpuMI bezeichnet .
CDOrn: Die Aminosäuresequenz der Cystein Dioxygenase aus Rattus norvegicus , abgeleitet aus der mRNS des Gens, ist in der NCBI (National Center for Biotechnology Information) Datenbank unter der Sequence ID: AAH70509.1 offenbart. Aus der Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression in E. coli codon-optimierte DNS-Sequenz (öffentlich zugängliche Eurofins Genomics GENEius Software) abgeleitet und synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics) . Die CDOrn DNS-Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 offenbart, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2. Die CDOrn DNS wurde synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics) . CSADhs-rrnB:
CSADhs : Die Aminosäuresequenz der Cysteinsulf insäure- Decarboxylase (CSADhs) aus Homo sapiens ist in der NCBI (National Center for Biotechnology Information) Datenbank unter der Sequence ID: XP_016861786.1 offenbart. Dort ist CSADhs als „acidic amino acid decarboxylase GADL1 isoform XI" hinterlegt. Aus der Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression in E. coli codon-optimierte DNS-Sequenz (öffentlich zugängliche Eurofins Genomics GENEius Software) abgeleitet. Diese mit CSADhs-cds bezeichnete DNS-Sequenz ist in SEQ ID NO: 3, nt 1 bis 1509 offenbart, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 4. Die DNS-Sequenz des E. coli rrnB-Terminators (SEQ ID NO: 3, nt 1510 bis 1842) wurde mit nt 1509 verknüpft. Die DNS-Sequenz des rrnB-Terminators ist offenbart in Orosz et al., Eur . J. Biochem. (1991) 201: 653 -659. Die in SEQ ID NO: 3 offenbarte DNS, bestehend aus der CSADhs-cds und dem rrnB-Terminator wurde synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics) und erhielt die Bezeichnung CSADhs- rrnB .
CSADcc-rrnB: Das cDNS-Gen (cDNS: komplementäre DNS, durch reverse Transkription aus der mRNS isoliert) der Cysteinsul- finsäure Decarboxylase (CSAD) aus Cyprinus carpio (Karpfen) wurde von Honjoh et al. (2010) , Amino Acids 38: 1173-183 isoliert und die DNS-Sequenz in der NCBI Datenbank unter der Genbank Sequence ID: AB220585.1 (cds: nt 82 - 1584) offenbart. Aus der Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression in E. coli codon-optimierte DNS-Sequenz (öffentlich zugängliche Eurofins Genomics GENEius Software) abgeleitet. Diese mit CSADcc-cds bezeichnete DNS-Sequenz ist in SEQ ID NO: 5, nt 1 bis 1503 offenbart, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 6. Mit dem 3 '-Ende der CSADcc-cds verknüpft wurde die DNS-Sequenz des E. coli rrnB-Terminators (SEQ ID NO: 5, nt 1504 bis 1834) . Die DNS-Sequenz des rrnB-Terminators ist offenbart in Orosz et al. (1991) , s.o. Die CSADcc-rrnB DNS, bestehend aus der CSADcc-cds und dem rrnB- Terminator, wurde synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics) . Verwendete Primer : cdorn-lf (SEQ ID NO: 8) csadhs-2r (SEQ ID NO: 9) csadhs-3f (SEQ ID NO: 10) glf-2r (SEQ ID NO: 11) : cdorn-3r (SEQ ID NO: 12) csadcc-lf (SEQ ID NO: 13)
PCR- Produkte :
Tabelle 1 fasst die Bezeichnung der für die Klonierung verwendeten PCR-Produkte, deren Größe sowie die verwendeten synthetischen DNS (sog. Template-DNS) und Primer zusammen. Die PCR- Produkte PCRI bis PCR4 wurden von der jeweiligen Template-DNS durch PCR („Phusion™ High-Fidelity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit den entsprechenden Primern hergestellt und durch Agarose-Gelelektrophorese (QIAquick® Gel Extraction Kit, Qiagen) isoliert.
Tabelle 1: PCR-Produkte zur Herstellung von Genkonstrukten Herstellung des Vektors pCys-CDOrn-CSADhs :
Zur Herstellung des Vektors pCys-CDOrn-CSADhs wurde der NEBuilder® Klonierkit (NEB New England Biolabs) eingesetzt. Das 6, 1 kb pCys-Scal/PpuMI Vektorf ragment wurde zusammen mit PCRI und PCR2 ligiert, wobei den Angaben des Herstellers gefolgt wurde was die in den Ligationsansat z eingesetzten Mengen der einzelnen DNS-Fragmente betraf. Anschließend wurde der Liga- tionsansatz nach den Angaben des Herstellers in E. coli NEB® 10-beta (NEB New England Biolabs) transformiert. Klone aus der Transformation wurden auf LBtet-Platten selektiert. LBtet- Platten enthielten 10 g/L Trypton (GIBCO™) , 5 g/L Hefeextrakt (BD Biosciences) , 5 g/L NaCl, 15 g/L Agar und 15 mg/L Tetracyclin (Sigma-Aldrich) . Aus Klonen der Transformation wurde die Plasmid-DNS isoliert (Qiagen Kit) und ein korrekter Klon ausgewählt. Die Plasmid-DNS des Klons wurde als Vektor pCys- CDOrn-CSADhs (Fig. 2) bezeichnet.
Herstellung des Vektors pCys-CDOrn-CSADcc :
Zur Herstellung des Vektors pCys-CDOrn-CSADcc wurde der NEBuilder® Klonierkit (NEB New England Biolabs) eingesetzt. Das 6, 1 kb pCys-Scal/PpuMI Vektorf ragment wurde zusammen mit PCR3 und PCR4 ligiert, wobei den Angaben des Herstellers gefolgt wurde was die in den Ligationsansat z eingesetzten Mengen der einzelnen DNS-Fragmente betraf. Anschließend wurde der Liga- tionsansatz nach den Angaben des Herstellers in E. coli NEB® 10-beta (NEB New England Biolabs) transformiert. Klone aus der Transformation wurden auf LBtet-Platten selektiert. Aus Klonen der Transformation wurde die Plasmid-DNS isoliert (Qiagen Kit) und ein korrekter Klon ausgewählt. Die Plasmid-DNS des Klons wurde als Vektor pCys-CDOrn-CSADcc (Fig. 3) bezeichnet.
Beispiel 2: Herstellung von Produkt! on s Stämmen
Ausgangsstamm (Wirtsstamm) zur Herstellung von Produktionsstämmen war der Mikroorganismenstamm Escherichia coli K12 W3110 (käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 5911 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) . E. coli W3110 wurde in bekannter Weise mit dem Vektor pCys-CDOrn-CSADhs , bzw. dem Vektor pCys-CDOrn-CSADcc transformiert und Transformanten auf LBtet Platten selektiert. Jeweils eine Transformante wurde als Produktionsstamm ausgewählt. Die Produktionsstämme erhielten die Bezeichnung E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli W3110 x pCys-CDOrn- CSADcc und wurden zur Produktion von Hypotaurin eingesetzt.
Beispiel 3: Produktion von Hypotaurin im Schüttelkolben
Vorkultur: Von den Produktionsstämmen E. coli W3110 x pCys- CDOrn-CSADhs und E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc wurde in LBtet-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 15 mg/L Tetracyclin) jeweils eine Vorkultur hergestellt (Anzucht bei 37 °C und 120 rpm über Nacht) .
Hauptkultur: 0,5 ml der jeweiligen Vorkultur wurde in einen 300 ml Erlenmeyerkolben (mit Schikane) mit 30 ml SMl-Medium, darüber hinaus enthaltend 15 g/L Glucose, 2 g/L Na2S2O3 x 5 H2O, 0,1 g/L L-Isoleucin, 0,1 g/L D, L-Methionin, 0,1 g/L L-Threo- nin, 5 mg/L Vitamin Bl und 15 mg/L Tetracyclin, überführt.
Zusammensetzung des SM1- Mediums: 12 g/L K2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 5 g/L NH4-Sulfat, 0,3 g/L MgSO4 x 7 H2O, 0,015 g/L CaCl2 x 2 H2O, 0,002 g/L FeSO4 x 7 H2O, 1 g/L Na3Citrat x 2 H2O, 0,1 g/L NaCl;
1 ml/L Spurenelementlösung .
Zusammensetzung der Spurenelementlösung : 0,15 g/L Na2Mo04 x 2 H20, 2,5 g/L H3BO3, 0,7 g/L CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/L CuSO4 x 5 H2O, 1, 6 g/L MnCl2 x 4 H20, 0,3 g/L ZnSO4 x 7 H20.
Die Hauptkulturen wurde für 24 h bei 30°C und 140 rpm in einem Truhenschüttler (Infors) inkubiert. Nach 24 h wurden 1 ml Proben entnommen und die Zelldichte OD6oo/ml (optischen Dichte der Hauptkultur, photometrisch gemessen bei 600 nm) , gemessen mit einem Genesys™ 10S UV-Vis Spektralphotometer der Fa . Thermo-Scientif ic™, sowie der Gehalt an Hypotaurin und Taurin durch HPLC bestimmt. Für den Stamm E. coli W3110 x pCys-CDOrn- CSADhs betrug der Gehalt an Hypotaurin 54,9 mg/L. Der Gehalt an Taurin betrug 44, 6 mg/L. Für den Stamm E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc betrug der Gehalt an Hypotaurin 158,8 mg/L. Der Gehalt an Taurin betrug 8,7 mg/L.
Probenvorbereitung zur Quantifizierung von Hypotaurin und Taurin durch HPLC :
1 ml Kulturbrühe aus der Schüttelkolbenanzucht oder der Fermentation wurden 5 min bei 80°C inkubiert und dann 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) . Der Zellkulturüberstand wurde isoliert. Zellkulturüberstände aus der Schüttelkolbenanzucht wurden direkt durch HPLC auf den Gehalt an Hypotaurin und Taurin untersucht. Zellkulturüberstände aus der Fermentation wurden 10-fach in H2O verdünnt und durch HPLC auf den Gehalt an Hypotaurin und Taurin untersucht.
HPLC-Analytik von L-Cysteinsulf insäure, Hypotaurin und Taurin: Zur quantitativen Bestimmung der in den Beispielen quantitativ analysierten Verbindungen sowie für L-Cysteinsulf insäure zum Nachweis von CDO-Enzymaktivität wurde eine jeweils für L- Cysteinsulf insäure, Hypotaurin und Taurin kalibrierte HPLC- Methode eingesetzt, wobei die zur Kalibrierung verwendeten Referenzsubstanzen kommerziell erhältlich waren (Sigma- Aldrich) . Verwendet wurde ein HPLC-Gerät der Fa . Agilent, Modell 1260 Infinity II, ausgerüstet mit einer aus der Analytik von Aminosäuren bekannten Vorsäulenderivatisierung mit o-Phtaldialdehyd (OPA-Derivatisierung) vom gleichen Hersteller. Zum Nachweis der OPA-derivatisierten Produkte von Hypotaurin und Taurin war das HPLC-Gerät mit einem Fluoreszenzdetektor ausgerüstet. Der Detektor war eingestellt auf eine Excitationswellenlänge von 330 nm und eine Emissionswellenlänge von 450 nm. Des Weiteren verwendet wurde eine Accucore™ aQ Säule der Fa . Thermo Scientific™, Länge 100 mM, innerer Durchmesser 4, 6 mm, Partikelgröße 2, 6 pm, im Säulenofen auf 40°C temperiert.
Laufmittel A: 25 mM Na-Phosphat, pH 6,0. Laufmittel B: Methanol. Die Trennung erfolgte im Gradientenmodus: 0 - 25 min, 10% Laufmittel B auf 60% Laufmittel B, gefolgt von 2 min 60% Laufmittel B auf 100% Laufmittel B, gefolgt von weiteren 2 min 100% Laufmittel B, bei einer Flußrate von 0,5 ml/min. Retentionszeit von L-Cysteinsulf insäure : 4,1 min. Retentionszeit von Taurin: 14,8 min. Retentionszeit von Hypotaurin: 15,7 min.
Beispiel 4 : Produktion von Hypotaurin durch Fermentation
Vorkultur 1 :
Je 20 ml LBtet-Medium wurden in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit dem Produktionsstamm E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs , bzw. dem Produktionsstamm E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc beimpft und 7 h auf einem Schüttler (150 rpm, 30°C) inkubiert.
Vorkultur 2 :
Anschließend wurden die Vorkulturen 1 jeweils vollständig in 100 ml SMl-Medium, supplementiert mit 5 g/L Glucose, 5 mg/L Vitamin Bl und 15 mg/L Tetracyclin (Zusammensetzung SMl-Medium siehe Beispiel 3) , überführt. Die Kulturen wurden jeweils in einem Erlenmeyerkolben (1 L Volumen) bei 30°C für 17 h bei 150 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler) . Nach dieser Inkubation lagen die Zelldichten OD6oo/ml jeweils zwischen 3 und 5.
Hauptkultur :
Die Fermentationen wurden in einem Biostat B Fermenter (2 1 Arbeitsvolumen) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt .
Das Anzuchtmedium (900 ml) enthielt 15 g/L Glucose, 10 g/L Trypton (Difco) , 5 g/L Hefeextrakt (Difco) , 2,4 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L KH2PO4, 0,25 g/L NaCl, 0, 6 g/L MgSO4 x 7 H2O, 0,03 g/L CaCl2 x 2 H2O, 0,15 g/L FeSO4 x 7 H2O, 1 g/L Na3Citrat x 2 H2O und 1 ml Spurenelementlösung (siehe Beispiel 3) , 0,9 g/L L- Isoleucin (Sigma-Aldrich) , 0, 6 g/L D, L-Methionin (Sigma- Aldrich) , 0,018 g/L Vitamin Bl (Sigma-Aldrich) , 0,09 g/L Pyridoxin x HCl (Vitamin B6, Sigma-Aldrich) und 15 mg/L Tetracyclin . Der pH-Wert im Fermenter wurde zu Beginn durch Zupumpen einer 25% NH4OH-Lösung auf 7 , 0 eingestellt . Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische Korrektur mit 25% NH4OH, bzw . 4 M H3PO4 auf einem Wert von 7 , 0 gehalten . Schaumbekämpfung erfolgte durch automatische Zudosierung von 4 % v/v Struktol J673 in H2O ( Schill & Seilacher ) .
Zum Animpfen wurden j eweils 100 ml der Vorkultur 2 in das Fermentergefäß gepumpt . Das Anfangsvolumen betrug somit 1 L . Die Kulturen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit einer Belüftungsrate von 2 vvm (vvm : Eintrag von Pressluft in den Fermentationsansatz angegeben in Liter Pressluft j e Liter Fermentationsvolumen pro Minute ) mit einer über einen Sterilfilter entkeimten Druckluft begast . Unter diesen Startbedingungen war die Sauerstof f-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung kalibriert worden .
Der Soll-Wert für die O2-Sättigung während der Fermentation wurde auf 30% eingestellt . Nach Absinken der O2-Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet , um die O2-Sättigung wieder an den Soll-Wert heranzuführen . Dabei wurde zunächst die Gas zufuhr kontinuierlich erhöht ( auf max . 5 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit ( auf max . 1 . 500 rpm) kontinuierlich gesteigert .
Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 30 ° C durchgeführt . Nach 2 h Fermentationsdauer erfolgte die Zufütterung einer Schwefelquelle in Form einer sterilen 60% (w/v) Stammlösung von Natrium-Thiosul f at x 5 H20 mit einer Rate von 1 , 5 ml pro Stunde .
Sobald der Glucose-Gehalt im Fermenter von anfänglich 15 g/L auf ca . 2 g/L abgesunken war, erfolgte eine kontinuierliche Zudosierung einer 56% (w/w) Glucose-Lösung . Die Fütterungsrate wurde so eingestellt , dass die Glucosekonzentration im Fermenter 2 g/L fortan nicht mehr überstieg . Die Glucose-Bestimmung erfolgte mit einem Glucoseanalysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA) .
Die Fermentationsdauer betrug 65 h. 22 h, 40 h und 65 h nach Start der Fermentation wurden Proben vom Fermentationsansatz entnommen, die Zelldichte OD6oo/ml sowie der Gehalt an Hypotaurin und Taurin im Kulturüberstand durch HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tab. 2 und Tab. 3 zusammengefaßt.
Für den Stamm W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs betrug nach einer Fermentationszeit von 65 h die Hypotaurin-Ausbeute 20,8 g/L (190,5 mM bei einem Hypotaurin Mol. -Gewicht von 109,2 g/mol) und die Taurin-Ausbeute 7,4 g/L (59,1 mM bei einem Taurin Mol. -Gewicht von 125,2 g/mol) . Das molare Verhältnis von Hypotaurin : Taurin betrug 3,2:1.
Für den Stamm W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc betrug nach einer Fermentationszeit von 65 h die Hypotaurin-Ausbeute 62,5 g/L (572,2 mM bei einem Hypotaurin Mol. -Gewicht von 109,2 g/mol) und die Taurin-Ausbeute 1,2 g/L (9, 6 mM bei einem Taurin Mol.- Gewicht von 125,2 g/mol) . Das molare Verhältnis von Hypotaurin : Taurin betrug 59, 6:1.
Tabelle 2: Zeitlicher Verlauf von Zelldichte, Hypotaurin- und Taurin-Gehalt der Fermentation des Produktionsstamms W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs Tabelle 3: Zeitlicher Verlauf von Zelldichte, Hypotaurin- und Taurin-Gehalt der Fermentation des Produktionsstamms W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc
Beispiel 5: Extraktion von Hypotaurin und Taurin aus
Fermenterzellen
Verwendet wurde der Fermentationsansatz des Produktionsstammes E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADcc aus Beispiel 4 mit einem Gehalt an Hypotaurin von 62,5 g/L und Taurin von 1,2 g/L (Tabelle 3) . 2 x 1 ml der Fermenterbrühe (2 ml Gesamtvolumen) wurden 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und der Überstand verworfen. Die Zellpellets wurden in je 1 ml H2O resuspendiert , 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellpellets wurden in je 1 ml H2O suspendiert, entsprechend 2 ml Gesamtvolumen und entsprechend dem oben eingesetzten Volumen Fermenterbrühe. Aus der Zellsuspension wurde ein Zellextrakt hergestellt. Dazu wurde der Zellhomogenisator FastPrep-24TM 5G der Fa . MP Biomedicals verwendet. Die in je 1 ml H2O suspendierten Zellpellets wurden in vom Hersteller vorgefertigten 1,5 ml Röhrchen mit Glaskugeln („Lysing Matrix B") aufgeschlossen (3 x 20 see bei einer Schüttelfrequenz von 6000 rpm mit jeweils 30 see Pause zwischen den Intervallen) . Die erhaltenen Zell- homogenate wurden vereinigt und 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert, um einen Zellextrakt herzustellen. Der Zellextrakt wurde durch HPLC auf den Gehalt an Hypotaurin und Taurin untersucht. Es konnten weder Hypotaurin noch Taurin nachgewiesen werden, bei einer Nachweisgrenze der HPLC-Analytik von jeweils 1 mg/L für Hypotaurin, bzw. Taurin.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Hypotaurin dadurch gekennzeichnet, dass i) ein mikrobieller Produktionsstamm kultiviert wird, der sich dadurch auszeichnet, dass er
1. mindestens einen Expressionsvektor enthält umfassend eine codierende Sequenz (cds) a und eine cds b und mindestens eine der cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c, d und e, wobei a) a eine cds codierend eine zur Enzymklasse EC 1.13.11.20 zählende Cysteindioxygenase (CDO) ist und b) b eine cds codierend eine zur Enzymklasse EC 4.1.1.29 zählende Cysteinsulf insäure-Decarboxylase (CSAD) ist und c) c eine cds codierend eine 3-Phosphoglycerat- Dehydrogenase (SerA) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch Serin ist und d) d eine cds codierend eine Serin-O-Acetyl-Trans- ferase (CysE) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch Cystein ist und e) e eine cds codierend einen Cystein-Exporter ist,
2. die Expression von der cds a und b im Expressionsvektor mit der Expression mindestens einer cds ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus c, d und e in einer polycistronischen Expressionseinheit koordiniert ist,
3. Hypotaurin vom Produktionsstamm in den Fermentationsüberstand sekretiert wird und ii) der Fermentationsüberstand isoliert wird, wobei der Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsüberstand mindestens 10 g/L beträgt und der molare Anteil Hypotaurin : Taurin im Fermentationsüberstand mindestens 3:1 beträgt . Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim zur Herstellung des mikrobiellen Produktionsstamms verwendeten Wirtsstamms um einen Mikroorganismus der Art Escherichia coli handelt. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der CDO um die CDO aus Rattus norvegicus (CDOrn) mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Sequenz oder ein dazu zu mindestens 80% identisches Enzym mit CDO-Aktivität handelt. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der CSAD um die CSAD aus Cyprinus carpio (CSADcc) mit der in SEQ ID NO: 6 angegebenen Sequenz oder ein dazu zu mindestens 80% identisches Enzym mit CSAD-Aktivität handelt. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der CSAD um die CSAD aus Homo sapiens (CSADhs) mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Sequenz oder ein dazu zu mindestens 80% identisches Enzym mit CSAD-Aktivität handelt. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die cds codierend CDO (a) und die cds codierend CSAD (b) im Expressionsvektor des mikrobiellen Produktionsstamms mit der cds codierend SerA mit verminderter Feedback-Hemmung durch Serin (c) in einer tricistronischen Expressionseinheit vorliegen, die funktionell mit dem serA-Promotor verknüpft ist. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet , dass die cds codierend CDO ( a ) , CSAD (b ) , SerA mit verminderter Feedback-Hemmung durch Serin ( c ) , CysE mit verminderter Feedback-Hemmung durch Cystein ( d) und codierend den Cystein-Exporter ( e ) alle auf einem einzigen Expressionsvektor vorliegen . Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet , dass der Expressionsvektor des mikrobiellen Produktionsstamms ausgewählt ist aus den Genkonstrukten pCys-CDOrn-CSADhs oder pCys-CDOrn-CSADcc . Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet , dass das Fermentationsvolumen mindestens 1 L beträgt . Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 , dadurch gekennzeichnet , dass es in Gegenwart von Sal zen des Thiosul fats durchgeführt wird . Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10 , dadurch gekennzeichnet , dass es sich beim fermentativen Verfahren um ein Verfahren im Fed-Batch Modus handelt . Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet , dass der Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsüberstand bezogen auf den Hypotaurin-Gehalt im Fermentationsansatz über 70% beträgt
EP22840570.0A 2022-12-15 2022-12-15 Verfahren zur fermentativen herstellung von hypotaurin Pending EP4634372A1 (de)

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