EP4519288A1 - Système d'expression bactérien de protéines hétérologues - Google Patents

Système d'expression bactérien de protéines hétérologues

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EP4519288A1
EP4519288A1 EP23722546.1A EP23722546A EP4519288A1 EP 4519288 A1 EP4519288 A1 EP 4519288A1 EP 23722546 A EP23722546 A EP 23722546A EP 4519288 A1 EP4519288 A1 EP 4519288A1
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EP
European Patent Office
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sequence
plasmid
gene
seq
orf2
Prior art date
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Pending
Application number
EP23722546.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Lereclus
Michel Gohar
Auriane MONESTIER
Leyla SLAMTI
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Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Universite Paris Saclay
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Universite Paris Saclay
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis

Definitions

  • DESCRIPTION TITLE Bacterial expression system for heterologous proteins
  • the present invention relates to a new system for expression by bacteria of heterologous proteins in pseudo-crystalline form in a stable state, and protected from degradation; this system presents a significant advantage in terms of purification of said proteins.
  • the present invention relates more particularly to an expression cassette allowing the expression of heterologous proteins by bacteria, preferably Gram-positive bacteria; this cassette is characterized in that it contains the sequence coding for the ORF2 protein of Bacillus thuringiensis.
  • the present invention also relates to recombinant expression vectors comprising such an expression cassette and to bacteria, preferably Gram positive, transformed with this recombinant expression vector.
  • Bacillus thuringiensis is a spore-forming Gram-positive bacterium that produces large quantities of insecticidal proteins (Cry and Cyt proteins). These accumulate in the mother cell and form crystalline inclusions representing up to 25% of the dry weight of the bacteria. These inclusions are released, by cell lysis, at the end of the sporulation process (Agaisse and Lereclus, 1995).
  • This massive protein production depends on several factors: i) the number of copies of the cry or cyt genes, ii) the strength of the promoter, iii) the stability of the transcripts, and iv) the formation of a stable crystal.
  • the ability to produce certain of these toxins (Cry or Cyt) in crystalline form is due either to a C-terminal domain of certain Cry proteins allowing the formation of crystalline inclusions, or to an additional “Helper” protein which could have a role of chaperone involved in the crystallization of Cyt proteins or certain Cry proteins, of which the C-ter domain is absent (Adalat et al. 2017).
  • the inventors By developing an original expression cassette allowing the co-expression of the Bt ORF2 protein and a heterologous protein of interest under the control of a strong promoter, the inventors managed to produce large quantities heterologous proteins (other than Cry or Cyt proteins) in an asporogenic Bt strain, preferably in stationary phase. In the absence of cell lysis, the heterologous protein thus produced accumulates in the bacterial cell in the form of a pseudo-crystalline inclusion; this provides a considerable advantage for the production of unstable or cytotoxic proteins that are difficult to express by current expression methods in microorganisms.
  • the present invention relates to an expression cassette comprising: (i) a strong promoter active during the stationary phase; (ii) a sequence having at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% and most preferably 100% identity, with the sequence SEQ ID No. 2 of the gene encoding ORF2 of Bt of SEQ ID No. 1; and (iii) the sequence of a gene encoding a heterologous protein; said gene sequences encoding ORF2 and the heterologous protein being in operon under the control of said strong promoter.
  • Strong promoter A strong promoter is a promoter allowing a high level of transcription of the gene located downstream.
  • AS ⁇ -galactosidase
  • the strong promoter may come from the host cell used for expression of the heterologous protein; it can also be an exogenous promoter. Strong promoters are preferentially promoters activated at the start of stationary phase and/or which are functional during a large part of this physiological state.
  • the strong promoter can be chosen from the promoters which directly or indirectly require the Spo0A regulator such as those of the calY, inhA1, sipW, ces genes.
  • the strong promoter is the promoter of the calY gene (access number EU604076 in GenBank) and is designated PcalY of sequence SEQ ID No. 5, PinhA1 of SEQ ID No. 6 or Pces of SEQ ID No. 7.
  • the strong promoter can be chosen from the promoters which are repressed by the CodY regulator during the exponential growth phase, the strong promoter is then chosen from PoppA of SEQ ID No. 8 and PnppC of SEQ ID No. 9. Repression by CodY is lifted at the end of the exponential phase and these promoters are therefore specifically active during the stationary phase.
  • the strong promoter is expressed during the stationary phase of Bacillus and more preferably the strong promoter is positively regulated by a regulator chosen from PlcR and NprR.
  • the strong promoters are preferentially chosen from PpapR (SEQ. ID. No. 10), PplcB (SEQ. ID. No. 11), PnprA (SEQ.
  • the strong promoter active in stationary phase is chosen from PcalY, PinhA1, Pces, PoppA, PnppC, PpapR, PplcB, PnprA and PnprR.
  • ORF2 coding gene The Bt ORF2 protein of sequence SEQ ID No. 1 is co-transcribed with the gene coding for the Cry2A protein and has been described as a crystallization factor for this protein (Deng et al., Regulation of cry gene expression in Bacillus thuringiensis, Toxins, 2014; 6(7): 2194-2209); it is encoded by the nucleic sequence SEQ ID No. 2.
  • heterologous protein By heterologous protein is meant a protein which is not naturally expressed by the host cell modified by an expression vector comprising the expression cassette according to the invention.
  • the heterologous protein is a protein of industrial or medical interest such as enzymes, such as proteases, lipases, amylases; hormones; antigens, for example, usable as immunogens, peptides or proteins for therapeutic use (bacteriocins, inhibitors or stimulators of the cellular response, etc.).
  • enzymes such as proteases, lipases, amylases
  • hormones such as progens, for example, usable as immunogens, peptides or proteins for therapeutic use (bacteriocins, inhibitors or stimulators of the cellular response, etc.).
  • antigens for example, usable as immunogens, peptides or proteins for therapeutic use (bacteriocins, inhibitors or stimulators of the cellular response, etc.).
  • cytolytic insecticidal toxins naturally expressed by Bt and used as a biopesticide; it may in particular be proteins of the Cry family (crystal proteins) or proteins of the Cyt family (cytolytic insecticidal toxins)
  • the expression cassette according to the invention leading to the expression and condensation of heterologous proteins in the form of inclusion within the bacteria, its use is particularly suitable for the production of heterologous proteins that are cytotoxic for the producing strain or unstable.
  • the ORF2 coding sequence is cloned in cis of the gene encoding the heterologous protein of interest. It is preferentially cloned in an operon with the gene encoding the heterologous protein of interest.
  • the expression cassette according to the invention may also comprise: - an mRNA stabilizing sequence positioned downstream of the promoter and upstream of the gene sequence encoding ORF2; preferably, it is STAB-SD of sequence SEQ ID No.
  • the STAB-SD sequence is downstream of the transcription +1 and at a position between approximately 100 and 500, preferably between 100 and 300 and even more preferably between 100 and 150 base pairs upstream of the ribosomal binding site (called RBS for Ribosomal Binding Site); and/or - a terminator sequence of the cry1Ac gene, designated Tcry1Ac, for example of a sequence presenting at least 90%, preferably at least 95% or at least 98%, of identity with SEQ ID No. 4, preferably , this is SEQ ID No. 4; this sequence is cloned downstream of the gene encoding the heterologous protein.
  • the expression cassette according to the invention may comprise: (i) a strong promoter active during the stationary phase; and the mRNA stabilizing sequence STAB-SD; (ii) the sequence of the gene encoding ORF2; (iii) the sequence of a gene encoding a heterologous protein; or (i) a strong promoter active during the stationary phase; (ii) the sequence of the gene encoding ORF2; (iii) the sequence of a gene encoding a heterologous protein; and the terminator sequence of the cry1Ac gene, Tcry1Ac; or (i) a strong promoter active during the stationary phase; and the mRNA stabilizing sequence STAB-SD; (ii) the sequence of the gene encoding ORF2; (iii) the sequence of a gene encoding a heterologous protein; and the cry1A
  • the strong promoter active during the stationary phase can be chosen from PcalY, PinhA1, Pces, PoppA, PnppC, PpapR, PplcB, PnprA and PnprR.
  • recombinant plasmids The present invention also relates to a recombinant plasmid comprising the expression cassette according to the invention.
  • the plasmids which can be used according to the invention conventionally comprise an origin of replication and at least one selection system consisting of one or more genes allowing the selection of transformed bacteria, for example antibiotic resistance genes. Any plasmid, preferably with a high copy number, adapted to the bacterial host used can be used.
  • the appropriate plasmids according to the invention are plasmids allowing expression in bacteria of the Bacillus genus.
  • the plasmids used are those exhibiting strong segregational stability (for example, the plasmid must remain present in the strain for at least 25 generations) and/or structural stability (that is to say, it does not undergo any changes). molecular rearrangements during bacterial growth).
  • the stability of plasmids derived from the pHT1030 replicon for example, the plasmids (pHT304, pHT315 or pHT370) or from the pBC16 replicon has been demonstrated (Lereclus, D., Arantes, O., 1992.
  • spbA locus ensures the segregational stability of pHT1030, a novel type of Gram-positive replicon.
  • Structural stability is defined as non-intramolecular recombination of the plasmid.
  • pHT1030 plasmid and its derivatives The structural stability of the pHT1030 plasmid and its derivatives is demonstrated by the fact that they can carry large exogenous DNA fragments (> 10 kb) without undergoing molecular rearrangements (Lereclus et al., 1989. Transformation and expression of a cloned delta-endotoxin gene in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol . Lett. 60: 211-217).
  • plasmids derived from pHT1030, pBC16, pE194, pC194 and any plasmid naturally present in this bacterium can be used, for example pHT8-1 present in the Bt kurstaki strains HD73 and Bt 407, pHT73 present in the Bt kurstaki HD73 strain, or pBMB299 present in the Bt kurstaki HD1 strain.
  • these are high copy number plasmids in particular derived from the pHT1030 plasmid, such as pHT3101, pHT304, pHT315 and pHT370; preferably pHT315.
  • the construction of the expression cassette according to the invention and its incorporation into a plasmid are carried out by molecular biology techniques well known to those skilled in the art as illustrated in the experimental part.
  • Transformed bacteria The present invention also relates to bacteria transformed with a plasmid according to the invention. Any bacteria in stationary phase growth can be used.
  • these are Gram+ bacteria such as bacteria of the Bacillus genus, in particular Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis. Even more preferably, strains of the Bacillus genus, in particular Bacillus subtilis and Bt, asporogenic (natural or mutant) will be used.
  • the deletion is obtained by double crossing-over between the adjacent regions located upstream and downstream of the gene, using plasmids whose replication is temperature sensitive, for example the plasmids pRN5101 (Lereclus et al., 1992) or pMAD (Arnaud et al ., 2004), and using the protocols described in these articles.
  • the strong promoter used is chosen from PpapR, PoppA, PnppC, PnprA, PnprR and PplcB, and when the inactivated sporulation gene is sigE, the strong promoter is PcalY, PinhA1 or Pces .
  • the plasmid according to the invention can be introduced into the host bacteria according to techniques known to those skilled in the art; in particular, the transformation of the host bacteria can be carried out by electroporation (Lereclus et al., 1989) or by heterogramic conjugation (Tieu-Cuot et al., 1987).
  • the expression cassette containing the gene of interest can also be introduced onto the bacterial chromosome or onto a resident plasmid by homologous recombination (Lereclus et al., 1992).
  • the present invention also relates to a process for producing a heterologous protein comprising the steps of: - preparation of a bacterium transformed according to the invention; - culture of said bacteria transformed into stationary phase; and - optionally, purification of said heterologous protein.
  • the culture of the transformed bacteria is carried out on a culture medium containing at least one source of nitrogen and glucose in appropriate concentrations at a temperature preferably between 25 and 35°C, preferably the temperature is order of 30°C; for example, the culture medium is LB medium.
  • the present invention also relates to the use of a sequence having at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% and most preferably 100% identity, with the ORF2 coding sequence of Bt in a cassette expression also comprising a strong promoter active in stationary phase and the sequence encoding a heterologous protein, for the production of said heterologous protein.
  • FIGURES [Fig 1] schematic representation of the pHT-Cal'orf2-gfp-Tcry1Ac plasmid.
  • FIG 2 Effect of the ORF2 protein on the production and condensation of proteins during the stationary phase of Bt. Observation under a fluorescence microscope of Bt407- ⁇ sigE cells transformed with the plasmid pHTCal'gfp-Tcry1Ac (a) and with the plasmid pHT-Cal'orf2-gfp-Tcry1Ac (b), then with an addition of PEG6000 to the culture medium (c).
  • FIG 3 Purification of GFP produced in operon with ORF2.
  • FIG 4 Effect of the Helper ORF2 protein on GFP production.
  • Western blot the gene coding for GFP is cloned in the presence (ORF2-GFP) or absence (GFP) of orf2 in the construction shown in Figure 1, with the difference that the promoter used is PoppA instead of the PcalY promoter.
  • the cytoplasmic extracts are made from the same cell density and placed on the gel.
  • GFP 1.5 ⁇ g is a purified GFP standard and Seeblue ladder is a size marker.
  • the GFP protein is detected using an anti His-tag antibody from the company GeneScript.
  • the DNA fragment obtained was digested with the enzymes Xba1 and Asc1, then purified as an XbaI/AscI fragment.
  • the Tcry1aC terminator region was amplified with oligos Tcry1 and Tcry2 from plasmid DNA of strain HD73.
  • the DNA fragment obtained was digested with the enzymes Kpn1 and EcoR1, then purified as a KpnI/EcoRI fragment. These two DNA fragments were inserted between the XbaI/AscI and KpnI/EcoRI sites, respectively, in a plasmid pHT315 already containing the STAB-SD region between the AscI and BamHI sites.
  • the orf2 gene was amplified with oligos ORF2(1) and ORF2(2) from the plasmid DNA of the Bt kurstaki HD1 strain.
  • the gfp gene was amplified with oligos GFP1 and GFP2 from plasmid pHT304-gfpbte (laboratory stock). This gfp gene encodes a GFP protein tagged with a His-tag. These two DNA fragments were assembled by “splicing by overlap extension PCR” and inserted into the plasmid (previously linearized by PCR with the LinP1 and LinP2 oligos). Oligonucleotides: SEQ ID No.
  • Plasmid pHT-Cal'gfp-Tcry1 The promoter region of the calY gene (P calY ) was amplified with the oligos PcalY1 and PcalY2 from the chromosomal DNA of the Bt kurstaki strain HD73. The DNA fragment obtained was digested with the enzymes Xba1 and Asc1, then purified as an XbaI/AscI fragment. The STAB-SD region was amplified with oligos StabSD1 and StabSD2 from a plasmid containing the entire promoter region of the cry3A gene. The DNA fragment obtained was digested with the enzymes AscI and BamHI, then purified as an AscI/BamHI fragment.
  • the Tcry1aC terminator region was amplified with oligos Tcry1 and Tcry2 from plasmid DNA of strain HD73.
  • the DNA fragment obtained was digested with the enzymes Kpn1 and EcoR1, then purified as a KpnI/EcoRI fragment. These three DNA fragments were inserted between the XbaI/AscI, AscI/BamHI and KpnI/EcoRI sites, respectively, in a pHT315 plasmid.
  • the gfp gene was amplified with the GFP1' (GFP1 bis) and GFP2' oligos from the pHT304-gfpbte plasmid (laboratory stock) and inserted into the plasmid (previously linearized by PCR with the LinP1 and LinP2 oligos).
  • GFP1' GFP1 bis
  • GFP2' oligos from the pHT304-gfpbte plasmid (laboratory stock) and inserted into the plasmid (previously linearized by PCR with the LinP1 and LinP2 oligos).
  • the asporogenic strain Bt407- ⁇ sigE is transformed with each of the two plasmids constructed, pHT304-18-Cal'orf2-gfp-Tcry1Ac and pHTCal'-gfp-Tcry1Ac (control plasmid), then cultured in LB medium at 30° vs. The culture was stopped 24 h after the start of the culture and the cells fixed with formaldehyde, then observed under a fluorescence microscope ( Figure 2). 2.

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Abstract

La présente invention se rapporte à une cassette d'expression permettant l'expression de protéines hétérologues par des bactéries, de préférence des bactéries Gram positif; cette cassette se caractérise en ce qu'elle contient la séquence codant pour la protéine ORF2 de Bacillus thuringiensis. La présente invention se rapporte encore à des vecteurs d'expression recombinants comprenant une telle cassette d'expression et à des bactéries, de préférence Gram positif, transformées avec ce vecteur d'expression recombinant.

Description

DESCRIPTION TITRE : Système d’expression bactérien de protéines hétérologues La présente invention se rapporte à un nouveau système d’expression par des bactéries de protéines hétérologues sous forme pseudo cristalline dans un état stable, et protégées de la dégradation ; ce système présente un avantage significatif en termes de purification desdites protéines. La présente invention se rapporte plus particulièrement à une cassette d’expression permettant l’expression de protéines hétérologues par des bactéries, de préférence des bactéries Gram positif ; cette cassette se caractérise en ce qu’elle contient la séquence codant pour la protéine ORF2 de Bacillus thuringiensis. La présente invention se rapporte encore à des vecteurs d’expression recombinants comprenant une telle cassette d’expression et à des bactéries, de préférence Gram positif, transformées avec ce vecteur d’expression recombinant. L’utilisation de bactéries recombinantes pour produire des protéines hétérologues d’intérêt, telles que l’insuline et l’hormone de croissance, est connue de longue date et a été largement mise en œuvre, mais elle a aussi montré ses limites. En effet, les bactéries sont incapables de produire des protéines ayant une structure complexe comme les anticorps ou les facteurs de coagulation sanguine. Pour être stables et actives in vivo et donc efficaces chez l’homme, ces protéines doivent subir de multiples modifications post- traductionnelles. En particulier, lorsque E. coli est utilisé pour produire des protéines en grande quantité, celles-ci peuvent se retrouver mal repliées ou former des agrégats insolubles. Pour pallier ce problème, des protéines chaperons peuvent être co-exprimées avec la protéine d’intérêt, augmentant ainsi les chances d’obtenir une protéine correctement repliée et soluble. Cependant, de façon générale, ces méthodes donnent des résultats limités. En effet, lorsque l’expression de protéines formant des agrégats insolubles a été associée à l’expression de protéines chaperons de E. coli (DnaK, DnaJ, GrpE, GroES, GroEL), le résultat montre soit une augmentation très faible de la production de protéine soluble (Malekian et al., 2019, Protein Expression and Purification 160:66-72), soit la nécessité de traiter les agrégats insolubles in vitro par un système de maturation ATP-dépendant (Alfi et al., J Bioscience and. Bioengineering 128:290-295.). Lorsque cette expression est associée à des protéines chaperons d’autres origines, comme Spy (Spheroplast protein Y), l’augmentation de la production de protéines solubles est trop réduite pour présenter un intérêt industriel (Ruan et al., 2020, J. Biotech.307:130-138). Bacillus thuringiensis (Bt) est une bactérie Gram-positif sporulante qui produit d’importantes quantités de protéines insecticides (protéines Cry et Cyt). Celles-ci s’accumulent dans la cellule mère et forment des inclusions cristallines représentant jusqu’à 25% du poids sec de la bactérie. Ces inclusions sont libérées, par lyse cellulaire, à la fin du processus de sporulation (Agaisse et Lereclus, 1995). Cette production massive de protéines dépend de plusieurs facteurs : i) le nombre de copies des gènes cry ou cyt, ii) la force du promoteur, iii) la stabilité des transcrits, et iv) la formation d’un cristal stable. La capacité de produire certaines de ces toxines (Cry ou Cyt) sous forme cristalline est due, soit à un domaine C-terminal de certaines protéines Cry permettant la formation d’inclusions cristallines, soit à une protéine additionnelle « Helper » qui pourrait avoir un rôle de chaperon intervenant dans la cristallisation des protéines Cyt ou de certaines protéines Cry, dont le domaine C-ter est absent (Adalat et al.2017). Par la mise au point d’une cassette d’expression originale permettant la co-expression de la protéine ORF2 de Bt et une protéine hétérologue d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur fort, les Inventeurs sont parvenus à produire d’importantes quantités de protéines hétérologues (autres que des protéines Cry ou Cyt) dans une souche asporogène de Bt, préférentiellement en phase stationnaire. En absence de lyse cellulaire, la protéine hétérologue ainsi produite s’accumule dans la cellule bactérienne sous forme d’inclusion pseudo cristalline ; ceci apporte un avantage considérable pour la production de protéines instables ou cytotoxiques difficilement exprimées par les méthodes actuelles d’expression chez les microorganismes. Ainsi, la présente invention se rapporte à une cassette d’expression comprenant : (i) un promoteur fort actif pendant la phase stationnaire ; (ii) une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 90%, encore préférentiellement au moins 95% et tout préférentiellement 100% d’identité, avec la séquence SEQ ID N°2 du gène codant ORF2 de Bt de SEQ ID N°1 ; et (iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ; lesdites séquences des gènes codant ORF2 et la protéine hétérologue étant en opéron sous le contrôle dudit promoteur fort. Promoteur fort Un promoteur fort est un promoteur permettant un niveau de transcription élevé du gène qui se situe en aval. De façon courante, l’expression des promoteurs est évaluée avec l’activité de la ß- galactosidase (AS, en unités/mg de protéine) selon le calcul décrit dans Perchat et al. (“A cell-cell communication system regulates protease production during sporulation in bacteria of the Bacillus cereus group”, Molecular Biology, Vol.82, 3, p.619-633, 2011) : AS = (A420 x 1500000) / (T x V x C). A420 : absorbance à 420 nm T : temps de réaction en min V : volume de l'extrait brut en µL C : concentration en protéines en µg/mL En utilisant cette formule, un promoteur est considéré comme fortement exprimé lorsque l'AS est supérieure à 500 U/mg prot. Le promoteur fort peut provenir de la cellule hôte utilisée pour l’expression de la protéine hétérologue ; il peut aussi s’agir d’un promoteur exogène. Les promoteurs forts sont préférentiellement des promoteurs activés en début de phase stationnaire et/ou qui sont fonctionnels pendant une grande partie de cet état physiologique. En particulier, le promoteur fort peut être choisi parmi les promoteurs qui requièrent directement ou indirectement le régulateur Spo0A tels que ceux des gènes calY, inhA1, sipW, ces. Selon ce mode de réalisation, le promoteur fort est le promoteur du gène calY (numéro d’accès EU604076 dans GenBank) et est désigné PcalY de séquence SEQ ID N°5, PinhA1 de SEQ ID N°6 ou Pces de SEQ ID N°7. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le promoteur fort peut être choisi parmi les promoteurs qui sont réprimés par le régulateur CodY pendant la phase de croissance exponentielle, le promoteur fort est alors choisi parmi PoppA de SEQ ID N°8 et PnppC de SEQ ID N°9. La répression par CodY est levée en fin de phase exponentielle et ces promoteurs sont donc spécifiquement actifs pendant la phase stationnaire. Selon encore un autre mode de réalisation de l’invention, le promoteur fort est exprimé pendant la phase stationnaire de Bacillus et plus préférentiellement le promoteur fort est régulé positivement par un régulateur choisi parmi PlcR et NprR. Les promoteurs forts sont préférentiellement choisis parmi PpapR (SEQ. ID. N°10), PplcB (SEQ. ID. N°11), PnprA (SEQ. ID. N°12), PnprR (SEQ ID N°13). Ainsi, préférentiellement, le promoteur fort actif en phase stationnaire est choisi parmi PcalY, PinhA1, Pces, PoppA, PnppC, PpapR, PplcB, PnprA et PnprR. Gène codant ORF2 La protéine ORF2 de Bt de séquence SEQ ID N°1 est co-transcrite avec le gène codant pour la protéine Cry2A et a été décrite comme facteur de cristallisation de cette protéine (Deng et al., Regulation of cry gene expression in Bacillus thuringiensis, Toxins, 2014 ; 6(7) : 2194- 2209) ; elle est codée par la séquence nucléique SEQ ID N°2. De façon surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence que la co-expression du gène de la protéine hétérologue avec le gène codant pour la protéine ORF2 permet de condenser sous forme d’inclusion les protéines hétérologues produites (voir la partie expérimentale ci-après) dans les cellules hôtes et ainsi d’augmenter substantiellement la quantité de protéines hétérologues produites. Gène codant la protéine hétérologue On entend par protéine hétérologue, une protéine qui n’est pas naturellement exprimée par la cellule hôte modifiée par un vecteur d’expression comprenant la cassette d’expression selon l’invention. De préférence, la protéine hétérologue est une protéine d’intérêt industriel ou médical comme des enzymes, telles que protéases, lipases, amylases ; des hormones ; des antigènes, par exemple, utilisables comme immunogènes, des peptides ou des protéines à usage thérapeutique (bactériocines, inhibiteurs ou stimulateurs de la réponse cellulaire, …). Il peut encore s’agir de toxines insecticides cytolytiques naturellement exprimées par Bt et utilisées comme biopesticide ; il pourra en particulier s’agir des protéines de la famille Cry (protéines du cristal) ou des protéines de la famille Cyt (toxines insecticides cytolytiques) ou des protéines Vip3 (toxines actives contre les insectes lépidoptères). La cassette d’expression selon l’invention conduisant à l’expression et à la condensation des protéines hétérologues sous forme d’inclusion au sein des bactéries, son utilisation est particulièrement appropriée à la production de protéines hétérologues cytotoxiques pour la souche productrice ou instables. De préférence, la séquence codant ORF2 est clonée en cis du gène codant la protéine hétérologue d’intérêt. Elle est préférentiellement clonée en opéron avec le gène codant la protéine hétérologue d’intérêt. Autres composants de la cassette d’expression Selon des modes de réalisations particuliers, la cassette d’expression selon l’invention peut en outre comprendre : - une séquence stabilisatrice de l’ARNm positionnée en aval du promoteur et en amont de la séquence du gène codant ORF2 ; de préférence, il s’agit de STAB-SD de séquence SEQ ID N°3 ; de préférence, la séquence STAB-SD est en aval du +1 de transcription et à une position comprise entre environ 100 et 500, préférentiellement entre 100 et 300 et encore préférentiellement entre 100 et 150 paires de bases en amont du site de liaison ribosomique (dit RBS pour Ribosomal Binding Site) ; et/ou - une séquence terminatrice du gène cry1Ac, désignée, Tcry1Ac, par exemple de séquence présentant au moins 90%, de préférence au moins 95% ou au moins 98%, d’identité avec la SEQ ID N°4, de préférence, il s’agit de la SEQ ID N°4 ; cette séquence est clonée en aval du gène codant la protéine hétérologue. Le choix de ces séquences ne doit toutefois pas être considéré comme limitant du fait qu’il est à la portée de l’homme du métier de substituer ces séquences par des séquences aux fonctions équivalentes. Ainsi, la cassette d’expression selon l’invention peut comprendre : (i) un promoteur fort actif pendant la phase stationnaire ; et la séquence stabilisatrice de l’ARNm STAB-SD ; (ii) la séquence du gène codant ORF2 ; (iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ; ou (i) un promoteur fort actif pendant la phase stationnaire ; (ii) la séquence du gène codant ORF2 ; (iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ; et la séquence terminatrice du gène cry1Ac, Tcry1Ac ; ou encore (i) un promoteur fort actif pendant la phase stationnaire ; et la séquence stabilisatrice de l’ARNm STAB-SD ; (ii) la séquence du gène codant ORF2 ; (iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ; et la séquence terminatrice du gène cry1Ac, Tcry1Ac. Selon ces modes de réalisation, le promoteur fort actif pendant la phase stationnaire peut être choisi parmi PcalY, PinhA1, Pces, PoppA, PnppC, PpapR, PplcB, PnprA et PnprR. plasmides recombinants La présente invention se rapporte également à un plasmide recombinant comprenant la cassette d’expression selon l’invention. Les plasmides utilisables selon l’invention comprennent classiquement une origine de réplication et au moins un système de sélection consistant en un ou plusieurs gènes permettant la sélection des bactéries transformées, par exemple des gènes de résistance aux antibiotiques. Tout plasmide, de préférence à haut nombre de copies, adapté à l’hôte bactérien utilisé peut être mis en œuvre. Les plasmides appropriés selon l’invention sont des plasmides permettant une expression dans les bactéries du genre Bacillus. De préférence, les plasmides utilisés sont ceux présentant une forte stabilité ségrégationnelle (par exemple, le plasmide doit rester présent dans la souche pendant au moins 25 générations) et/ou structurale (c’est-à-dire qu’il ne subit pas de remaniements moléculaires au cours de la croissance des bactéries). La stabilité des plasmides dérivés du réplicon pHT1030 (par exemple, les plasmides (pHT304, pHT315 ou pHT370) ou du réplicon pBC16 a été démontré (Lereclus, D., Arantes, O., 1992. spbA locus ensures the segregational stability of pHT1030, a novel type of Gram-positive replicon. Mol. Microbiol. 7: 35-46 doi: 10.1111/j.1365-2958.1992.tb00835.x ; Arantes, O., Lereclus, D., 1991. Construction of cloning vectors for Bacillus thuringiensis. Gene 108: 115-119 doi: 10.1016/0378-1119(91)90495-w). La stabilité structurale se définit comme une non recombinaison intramoléculaire du plasmide. La stabilité structurale du plasmide pHT1030 et de ses dérivés est démontrée par le fait qu’ils peuvent porter des fragments d’ADN exogène de grande taille (> 10 kb) sans subir de remaniements moléculaires (Lereclus et al., 1989. Transformation and expression of a cloned delta-endotoxin gene in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol. Lett. 60: 211- 217). Dans le cas de Bt, on peut utiliser des plasmides dérivés du pHT1030, du pBC16, du pE194, du pC194 et de tout plasmide naturellement présent dans cette bactérie, par exemple le pHT8-1 présent dans les souches Bt kurstaki HD73 et Bt 407, le pHT73 présent dans la souche Bt kurstaki HD73, ou encore le pBMB299 présent dans la souche Bt kurstaki HD1. De préférence, il s’agit de plasmides à haut nombre de copies notamment dérivés du plasmide pHT1030, tels que pHT3101, pHT304, pHT315 et pHT370 ; préférentiellement le pHT315. La construction de la cassette d’expression selon l’invention et son incorporation dans un plasmide sont réalisées par les techniques de biologie moléculaire bien connues de l’homme du métier tel qu’illustré dans la partie expérimentale. Bactéries transformées La présente invention se rapporte encore à des bactéries transformées avec un plasmide selon l’invention. Toute bactérie en phase stationnaire de croissance peut être utilisée. De préférence, il s’agit de bactéries Gram+ telles que des bactéries du genre Bacillus, en particulier Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis et Bacillus thuringiensis. De façon encore préférée, on utilisera des souches du genre Bacillus, en particulier de Bacillus subtilis et Bt, asporogènes (naturelles ou mutant). Les souches asporogènes sont avantageuses en ce qu’elles ne présentent pas de lyse cellulaire, ainsi, les protéines hétérologues produites sont conservées dans la bactérie productrice (cellule mère) et protégées de la dégradation par les protéases extracellulaires. Afin de supprimer l’activité de sporulation d’une souche de Bt, il est possible d’inactiver tout gène essentiel à la sporulation comme les gènes impliqués dans l’expression des facteurs sigma de sporulation Spo0A, SigE, SigH et SigK ; de préférence, une souche Bt ΔsigE ou ∆spo0A, préférentiellement Bt 407-ΔsigE (Bravo et al., 1996) ou Bt HD73 ∆spo0A, est utilisée. L’inactivation de ces gènes peut être obtenue par interruption ou modification de la séquence codante, ou par délétion de tout ou partie du gène. La délétion est obtenue par double crossing-over entre les régions adjacentes situées en amont et aval du gène, en utilisant des plasmides dont la réplication est thermosensible, par exemple les plasmides pRN5101 (Lereclus et al., 1992) ou pMAD (Arnaud et al., 2004), et en utilisant les protocoles décrits dans ces articles. De préférence, lorsque le gène de sporulation inactivé est Spo0A, le promoteur fort utilisé est choisi parmi PpapR, PoppA, PnppC, PnprA, PnprR et PplcB, et lorsque le gène de sporulation inactivé est sigE, le promoteur fort est PcalY, PinhA1 ou Pces. Le plasmide selon l’invention peut être introduit dans la bactérie hôte selon les techniques connues de l’homme du métier ; en particulier, la transformation de la bactérie hôte peut être réalisée par électroporation (Lereclus et al., 1989) ou par conjugaison hétérogramique (Tieu-Cuot et al., 1987). La cassette d’expression contenant le gène d’intérêt peut aussi être introduite sur le chromosome bactérien ou sur un plasmide résident par recombinaison homologue (Lereclus et al., 1992). Procédé de production d’une protéine hétérologue La présente invention se rapporte aussi à un procédé de production d’une protéine hétérologue comprenant les étapes de : - préparation d’une bactérie transformée selon l’invention ; - culture de ladite bactérie transformée en phase stationnaire ; et - optionnellement, purification de ladite protéine hétérologue. La culture de la bactérie transformée est réalisée sur un milieu de culture contenant au moins une source d’azote et de glucose en des concentrations appropriées à une température comprise de préférence entre 25 et 35°C, de manière préférentielle la température est de l’ordre de 30°C ; par exemple, le milieu de culture est le milieu LB. La purification de la protéine hétérologue peut être réalisée par centrifugation et solubilisation des cristaux ; en complément, les méthodes de chromatographie d’exclusion, de chromatographie en échange d’ions ou encore de chromatographie d’affinité peuvent être mises en œuvre. La présente invention se rapporte encore à l’utilisation d’une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 90%, encore préférentiellement au moins 95% et tout préférentiellement 100% d’identité, avec la séquence codant ORF2 de Bt dans une cassette d’expression comprenant également un promoteur fort actif en phase stationnaire et la séquence codant une protéine hétérologue, pour la production de ladite protéine hétérologue. FIGURES [Fig 1] représentation schématique du plasmide pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac. [Fig 2] Effet de la protéine ORF2 sur la production et la condensation de protéines pendant la phase stationnaire de Bt. Observation au microscope à fluorescence de cellules de Bt407- ΔsigE transformées avec le plasmide pHTCal’gfp-Tcry1Ac (a) et avec le plasmide pHT- Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac (b), puis avec un ajout de PEG6000 dans le milieu de culture (c). [Fig 3] Purification de la GFP produite en opéron avec l’ORF2. Photo de la migration sur un gel SDSPAGE 10% des fractions solubles (FS) et insolubles (FI) résultant des cultures de Bt 407ΔsigE - pHTCal’ORF2-gfp-TCry après 24 h à 30°C en milieu LB. [Fig 4 ] Effet de la protéine Helper ORF2 sur la production de GFP. Western blot : le gène codant pour la GFP est cloné en présence (ORF2-GFP) ou en absence (GFP) de orf2 dans la construction montrée figure 1, à la différence que le promoteur utilisé est le PoppA au lieu du promoteur PcalY. Les extraits cytoplasmiques sont réalisés à partir d’une même densité cellulaire, et déposés sur le gel. GFP 1,5 µg est un étalon de GFP purifiée et Seeblue ladder est un marqueur de taille. La protéine GFP est détectée à l’aide d’un anticorps anti His-tag de la société GeneScript. EXEMPLES 1. Matériel et Méthodes 1.1. Construction du plasmide selon l’invention pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac et du plasmide contrôle pHTCal’-gfp-Tcry1Ac Plasmide pHT- La région promotrice du gène calY (PcalY) a été amplifiée avec les oligos PcalY1 et PcalY2 à partir de l’ADN chromosomique de la souche Bt kurstaki HD73. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes Xba1 et Asc1, puis purifié comme fragment XbaI/AscI. La région terminatrice Tcry1aC a été amplifiée avec les oligos Tcry1 et Tcry2 à partir de l’ADN plasmidique de la souche HD73. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes Kpn1 et EcoR1, puis purifié comme fragment KpnI/EcoRI. Ces deux fragments d’ADN ont été insérés entre les sites XbaI/AscI et KpnI/EcoRI, respectivement, dans un plasmide pHT315 contenant déjà la région STAB-SD entre les sites AscI et BamHI. Le gène orf2 a été amplifié avec les oligos ORF2(1) et ORF2(2) à partir de l’ADN plasmidique de la souche Bt kurstaki HD1. Le gène gfp a été amplifié avec les oligos GFP1 et GFP2 à partir du plasmide pHT304-gfpbte (stock du laboratoire). Ce gène gfp code pour une protéine GFP marqué à l’aide d’un His-tag. Ces deux fragments d’ADN ont été assemblés par “splicing by overlap extension PCR” et insérés dans le plasmide (préalablement linéarisé par PCR avec les oligos LinP1 et LinP2). Oligonucléotides : SEQ ID N°14 - PcalY1 5’-GCTCTAGAAAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAG-3’ site XbaI souligné SEQ DI N°15 - PcalY2 5’-GGCGCGCCCACAATCAATTCCCCCTAGCTTT-3’ site AscI souligné SEQ ID N°16 - Tcry1 5’-GGGGTACCAACTCAGGTTTAAATATCGTTTTC-3’ site KpnI souligné SEQ ID N°17 - Tcry2 5’-GGAATTCCCAAATAAAAAAAGAAAAAGCAGAG-3’ site EcoRI souligné SEQ ID N°18 - ORF2(1) 5’-CATTTTATGGATCCCCCAAAGGATTTAACTATGCACGA-3’ SEQ ID N°19 - ORF2(2) 5’-CATTCATGGTGTCACCTCCTTAAAAATAAAGTTTTATATTAAAACTAAACTCTTTTGATA-3’ SEQ ID N°20 - GFP1 5’-TATCAAAAGAGTTTAGTTTTAATATAAAACTTTATTTTTAAGGAGGTGACACCATGAATG-3’ SEQ ID N°21 - GFP2 5’-ACCTGAGTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGAGA-3’ SEQ ID N°22 - LinP1 5’-GGTACCAACTCAGGTTTAAATATC-3’ SEQ ID N°23 - LinP2 5’-GGATCCATAAAATGATTTTTCAT-3’ Le plasmide pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac est représenté schématiquement à la Figure 1. Plasmide pHT-Cal’gfp-Tcry1 La région promotrice du gène calY (PcalY) a été amplifiée avec les oligos PcalY1 et PcalY2 à partir de l’ADN chromosomique de la souche Bt kurstaki HD73. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes Xba1 et Asc1, puis purifié comme fragment XbaI/AscI. La région STAB-SD a été amplifiée avec les oligos StabSD1 et StabSD2 à partir d’un plasmide contenant toute la région promotrice du gène cry3A. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes AscI et BamHI, puis purifié comme fragment AscI/BamHI. La région terminatrice Tcry1aC a été amplifiée avec les oligos Tcry1 et Tcry2 à partir de l’ADN plasmidique de la souche HD73. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes Kpn1 et EcoR1, puis purifié comme fragment KpnI/EcoRI. Ces trois fragments d’ADN ont été insérés entre les sites XbaI/AscI, AscI/BamHI et KpnI/EcoRI, respectivement, dans un plasmide pHT315. Le gène gfp a été amplifié avec les oligos GFP1’ (GFP1 bis) et GFP2’ à partir du plasmide pHT304-gfpbte (stock du laboratoire) et inséré dans le plasmide (préalablement linéarisé par PCR avec les oligos LinP1 et LinP2). SEQ ID N°14 - PcalY1 5’-GCTCTAGAAAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAG-3’ site XbaI souligné SEQ DI N°15 - PcalY2 5’-GGCGCGCCCACAATCAATTCCCCCTAGCTTT-3’ site AscI souligné SEQ ID N°26 - StabSD1 5’-GGCGCGCCTCTTGAAAGGAGGGATGCCT-3’ site AscI souligné SEQ ID N°27 - StabSD2 5’-CGGGATCCATAAAATGATTTTTCATAAATC-3’ site BamHI souligné SEQ ID N°16 - Tcry1 5’-GGGGTACCAACTCAGGTTTAAATATCGTTTTC-3’ site KpnI souligné SEQ ID N°17 - Tcry2 5’-GGAATTCCCAAATAAAAAAAGAAAAAGCAGAG-3’ site EcoRI souligné SEQ ID N°28 - GFP1 bis 5’- TCATTTTATGGATCCGAAATAAAATGCATCTGTATTTGAA-3’ SEQ ID N°21 - GFP2 5’-ACCTGAGTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGAGA-3’ SEQ ID N°22 - LinP1 5’-GGTACCAACTCAGGTTTAAATATC-3’ SEQ ID N°23 - LinP2 5’-GGATCCATAAAATGATTTTTCAT-3’ 1.2. Préparation et transformation de la souche asporogène Bt407-ΔsigE Le mutant Bt 407-ΔsigE est préparé selon Bravo et al., 1996. Les bactéries sont cultivées en milieu LB à 37°C jusqu’à DO600nm = 1 et transformées par électroporation comme décrit dans Lereclus et al., 1989. 1.3. Production de la GFP La souche asporogène Bt407-ΔsigE est transformée avec chacun des deux plasmides construits, pHT304-18-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac et pHTCal’-gfp-Tcry1Ac (plasmide contrôle), puis cultivée en milieu LB a 30°C. La culture a été arrêtée 24 h après le début de la culture et les cellules fixées avec du formaldéhyde, puis observées au microscope a fluorescence (Figure 2). 2. Résultats L’observation au microscope à fluorescence des cellules contenant le plasmide contrôle révèle une expression diffuse de la GFP dans les cellules au bout de 24h de culture (Figure 2 a). L’observation au microscope à fluorescence de la souche Bt407-ΔsigE pHTCal’orf2-gfp- Tcry1Ac quant à elle révèle l’apparition d’un début de formation de cristaux ou de pseudo- cristaux de GFP (Figure 2 b). La présence de l’ORF2 permet donc de produire la GFP sous une forme cristalline ou pseudo cristalline. La co-transcription en opéron des gènes de la protéine ORF2 et de la GFP suffit à la formation de ces structures. De façon intéressante, lorsque les cellules Bt407-ΔsigE-pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac sont centrifugées afin de stopper leur croissance au bout de 24h et qu’un précipitant connu en cristallographie, le PEG6000, est ajouté à hauteur de 20%, il est observé une augmentation de la taille des cristaux ou des pseudo-cristaux dans les cellules (Figure 2 c). A 24h de culture en milieu LB à 30°C, les cellules Bt407-ΔsigE-pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac ainsi que les cellules témoins sont cassées à la French Press à 2 kbar de pression, puis le milieu de culture contenant les cellules cassées est centrifugé afin de séparer la fraction soluble de la fraction insoluble. 2 μg de ces fractions sont déposées sur un gel SDS-page 10% (figure 3). La GFP se retrouve cette fois dans la fraction soluble, signifiant que les inclusions deviennent solubles au moment du cassage des cellules dans un tampon à 200 mM NaCl, 20 mM tris pH7.5. Les mêmes résultats sont observés lorsque le milieu de cassage est acidifié jusqu’à pH5.5.
SEQUENCES SEQ ID N°1 – ORF2 de Bacillus thuringiensis MLKYHFPNVCEDELINIYSYGDFKGQGKYICLFKIENQSFLFWRNDKGNKIYTNLESISVEIINTNNTYN QSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQ NVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVYTQDLIDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCP QDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLNVYTQDLIDTYNQSQNCDCGCK SEQ ID N°2 ATGCTAAAATATCATTTTCCTAATGTATGTGAAGATGAATTAATTAATATATATTCTTATGGGGATT TTAAAGGACAAGGAAAATATATATGCCTCTTTAAAATTGAAAACCAATCATTCTTATTTTGGAGAA ACGATAAAGGAAATAAAATATATACAAATTTAGAATCTATCAGTGTAGAAATAATAAACACGAAT AATACGTATAATCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAATCAAAGTCA GAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAATCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTT AGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAATCAAA GTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAA GATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATACACACAAGATTTAATTGATACGTATAAC CAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCC ACAAGATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGT ATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTGAATGTATACACACAAGATTTAATTGATACGT ATAATCAAAGTCAGAATTGTGATTGTGGTTGTAAG SEQ ID N°3 - STAB-SD Bacillus thuringiensis gaaaggaggg atgcc SEQ ID N°4 - Tcry1Ac - Bacillus thuringiensis aaactcaggt ttaaatatcg ttttcaaatc aattgtccaa gagcagcatt acaaatagat aagtaatttg ttgtaatgaa aaacggacat cacctccatt gaaacggagt gatgtccgtt ttactatgtt attttctagt aatacatatg tatagagcaa cttaatcaag cagagatatt ttcacctatc gatgaaaata tctctgcttt ttcttttttt at SEQ ID N°5 - PcalY Région promotrice du gène calY de Bacillus thuringiensis. 5’- AAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAGTGTGAGGGAACGTTAGCCCTCACCTCTTTGTTTTTCTTTT TTCTTATAGTATTAAATGATTTGAGTGTGAAAAAAGTTATAAATTATCATTGTTTTTTTCTGAAAAG TCTAAATGATATTGAGAAATAAAAATAACTGAAAATATTAATAAATATGTGTTGTGTTTATATAGG GTTGTTCGTTATAATGAACATAAGGTTTTTAAAAAAGAACACATATTAGCTAAGCTAATATAGTTT TCTTTACATCTCTTATTGAAAAATAAGTGATAAAAATATAAAAAAAAGCTAGGGGGAATTGATT-3’ Soulignée d’un trait : la région 10 (TATAAT) du promoteur. Soulignée de deux traits : la région -35 (TTGTGT) du promoteur. En gras : le +1 de transcription déterminé par RACE PCR. SEQ ID N°6 - Région promotrice du gène inhA1 de Bacillus thuringiensis - PinhA1 AATTGTGATATATTCGTATGCTAACTATGAAATTTTTACAAATATATTAAAAATATTACATGATATG ACTAAATATTGAAAAAATATTGAATTTTTAATAAAATTCAATTTGTAATACATATTATTTATTAGGG GAGGAAATATGGGATG Pces de SEQ ID N°7 AAGTAATCGTTGCCGTACCCGTATGAAATTGAAATAAATAAAATTATTAATATTCTAATAATTCGT ATTGCGTGAATATTAATAATTGTTTATAATGAAAATTGTATAATTTTGGTTAATTAACTTGTGCGAA GAAAAGTTAATAATGTATTAAGGAAAATGAATGTTTTTGTATTTTACTTTTTTTAAAAGAGGG SEQ ID N°8 Région promotrice du gène oppA de Bacillus thuringiensis - PoppA CTAGACCGTCAAAATATTACTAGAATTATTATACTATAAAAGCTATAATAAGTACTAGGATTAATT TTTTGAAAATTATACGCAATTAAAGGTCTGATTTTAAGATGATGGTAGCAATGTTAATGTATCCCT TTACGAAAAATTTAAAATATAAATATTTTATTAAAAATTTTAACAAAAAAACAAAAAACTATATTCA CAATTGTTATATTATATGTATAATGAAAATTGTAGAAACTTGGAGATTATTCTTTCAATTCTACTTT TTAACAAGTGAGGGTACAGGAAGTGCAATTAGGGGAGG SEQ ID N°9 - Région promotrice du gène nppC de Bacillus thuringiensis - PnppC ATTCCACTTTTATATAAAAAGATTTTTGAATATTTTTTCAACTTACCCTTGTCAAACATTGTCAATTT ATATTAAAATAACAACATACAAAATATTTAGTCTTTTCAGAAAAGATGGAGGGATAGCCATG SEQ ID N°10 - Région promotrice du gène papR de Bacillus thuringiensis - PpapR CTAGAACCATGAATTAAAAGAATCACTTATAAAAAAAATGAAGAAATAAAAAAGACATAAAGAA CAAATATGCATAATTGCATAAAGTCTGGATAATTTTTCATGATATATTTAAAGAAAAAATGCGG SEQ ID N°11 - Région promotrice du gène plcB de Bacillus thuringiensis - PplcB AGCATGTGTATGCTTTACTCTTTTTTTACATTAGTTTAGACAAGCCTTAATAATAGTTTATTAAAAT GAAAGTGTATTCATTCATTATATTCACTGTGTATAAAGTTATAATGATATGAACATTTGCATATTTT AATTTAGTGATAGAAATTTCGTGAAAGGTGGGATATTCTAGTCATAGGTTAACCGGACGACATCA TAGGATCCTAACAAAATGTTTACAATAATTCAATTATAAAATGGAGG SEQ ID N°12 - région promotrice du gène nprA de Bacillus thuringiensis PnprA TTTTTTCAATATTTGTTCCTCAAAATTCTACAAAACTTGAGAAATAAATTAATTGAATTTTTAGTATA TTAATAGTGGAAACATAATGCTAATATGAAACTACTCTTTTTCAAAAAAATTTTTATTAGGGGGAA GGTTCATG SEQ ID N°13 - région promotrice du gène inhA1 de Bacillus thuringiensis PnprR GAAGTGAAGTCAAGAGAGAAAAAAATGAAATTATGCATATTTTTTAGAAAATTTATATTTATCAAT TTATATTTCTCCGAATTTTATGTATTATTAGAGTAATGGGGTAATGAGAATGGAGG oligonucléotides SEQ ID N°14 - PcalY1 5’-GCTCTAGAAAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAG-3’ SEQ DI N°15 - PcalY2 5’-GGCGCGCCCACAATCAATTCCCCCTAGCTTT-3’ SEQ ID N°16 - Tcry1 5’-GGGGTACCAACTCAGGTTTAAATATCGTTTTC-3’ SEQ ID N°17 - Tcry2 5’-GGAATTCCCAAATAAAAAAAGAAAAAGCAGAG-3’ SEQ ID N°18 - ORF2(1) 5’-CATTTTATGGATCCCCCAAAGGATTTAACTATGCACGA-3’ SEQ ID N°19 - ORF2(2) 5’-CATTCATGGTGTCACCTCCTTAAAAATAAAGTTTTATATTAAAACTAAACTCTTTTGATA-3’ SEQ ID N°20 - GFP1 5’-TATCAAAAGAGTTTAGTTTTAATATAAAACTTTATTTTTAAGGAGGTGACACCATGAATG-3’ SEQ ID N°21 - GFP2 5’-ACCTGAGTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGAGA-3’ SEQ ID N°22 - LinP1 5’-GGTACCAACTCAGGTTTAAATATC-3’ SEQ ID N°23 - LinP2 5’-GGATCCATAAAATGATTTTTCAT-3’ SEQ ID N°24 - PcalY1 oligo 5’-GCTCTAGAAAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAG-3’ SEQ ID N°25 – PcalY2 oligo 5’-GGCGCGCCCACAATCAATTCCCCCTAGCTTT-3’ SEQ ID N°26 - StabSD1 5’-GGCGCGCCTCTTGAAAGGAGGGATGCCT-3’ SEQ ID N°27 - StabSD2 5’-CGGGATCCATAAAATGATTTTTCATAAATC-3’ SEQ ID N°28 - GFP1 bis 5’- TCATTTTATGGATCCGAAATAAAATGCATCTGTATTTGAA-3’

Claims

REVENDICATIONS 1. Cassette d’expression comprenant : (i) un promoteur fort actif en phase stationnaire ; (ii) une séquence ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 du gène codant ORF2 de Bt ; et (iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ; lesdites séquences des gènes codant ORF2 et la protéine hétérologue étant en opéron sous le contrôle dudit promoteur fort. 2. Cassette d’expression selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit promoteur fort actif en phase stationnaire est choisi parmi PcalY, PinhA1, Pces, PoppA, PnppC, PpapR, PplcB, PnprA et PnprR. 3. Cassette d’expression selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre une séquence stabilisatrice de l’ARNm et/ou une séquence terminatrice du gène cry1Ac. 4. Cassette d’expression selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence stabilisatrice de l’ARNm est la séquence STAB-SD. 5. Plasmide recombinant comprenant la cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Plasmide recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit plasmide est un plasmide à forte stabilité ségrégationnelle et/ou structurale permettant une expression dans les bactéries du genre Bacillus. 7. Plasmide recombinant selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisé en ce que ledit plasmide est choisi parmi pHT3101, pHT304, pHT315, pHT370, pBC16, pE194, pC194, pHT8-1, pHT73 et pBMB299 ou d’un plasmide dérivé. 8. Bactérie transformée comprenant un plasmide selon l’une quelconque des revendications 5 à 7. 9. Bactérie transformée selon la revendication 8, caractérisée en ce qu’elle est une bactérie asporogène du genre Bacillus. 10. Bactérie transformée du genre Bacillus selon la revendication 9, caractérisée en ce que le gène de sporulation inactivé est Spo0A et ledit promoteur fort actif en phase stationnaire est choisi parmi PpapR, PoppA, PnppC, PnprA, PnprR et PplcB, 11. Bactérie transformée du genre Bacillus selon la revendication 9, caractérisée en ce que le gène de sporulation inactivé est sigE et ledit promoteur fort actif en phase stationnaire est choisi parmi PcalY, PinhA1 et Pces. 12. Procédé de production d’une protéine hétérologue comprenant les étapes de : - préparation d’une bactérie transformée selon l’une quelconque des revendications 8 à 11 ; - culture de ladite bactérie transformée en phase stationnaire ; et - optionnellement, purification de ladite protéine hétérologue. 13. Utilisation d’une séquence ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 codant ORF2 de Bt dans une cassette d’expression comprenant également un promoteur fort actif en phase stationnaire et la séquence codant une protéine hétérologue, pour la production de ladite protéine hétérologue.
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