EP4504931A1 - Neue urethanasen für den enzymatischen abbau von polyurethanen - Google Patents

Neue urethanasen für den enzymatischen abbau von polyurethanen

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EP4504931A1
EP4504931A1 EP23717889.2A EP23717889A EP4504931A1 EP 4504931 A1 EP4504931 A1 EP 4504931A1 EP 23717889 A EP23717889 A EP 23717889A EP 4504931 A1 EP4504931 A1 EP 4504931A1
Authority
EP
European Patent Office
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polypeptide
seq
activity
molecular weight
urethanase
Prior art date
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Pending
Application number
EP23717889.2A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Lukas REISKY
Gernot Jaeger
Simone Goebbels
Vera ESSMANN
Igor POCHOROVSKI
Uwe Bornscheuer
Christoffel Badenhorst
Ren WEI
Yannick BRANSON
Carolin Buchmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Covestro Deutschland AG
Original Assignee
Covestro Deutschland AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by Covestro Deutschland AG filed Critical Covestro Deutschland AG
Publication of EP4504931A1 publication Critical patent/EP4504931A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J11/00—Recovery or working-up of waste materials
    • C08J11/04—Recovery or working-up of waste materials of polymers
    • C08J11/10—Recovery or working-up of waste materials of polymers by chemically breaking down the molecular chains of polymers or breaking of crosslinks, e.g. devulcanisation
    • C08J11/105—Recovery or working-up of waste materials of polymers by chemically breaking down the molecular chains of polymers or breaking of crosslinks, e.g. devulcanisation by treatment with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01075—Urethanase (3.5.1.75)

Definitions

  • the present invention relates to new urethanases for the enzymatic degradation of polyurethanes and an enzymatic process for the complete degradation of polyurethanes into defined monomers.
  • Polyurethanes are established in many areas of normal life. They can be found, for example, in soft foams (mattresses, sponges, upholstered furniture), rigid foams (insulation materials, building materials), thermoplastics (sports shoes) or coatings (varnishes, paints, adhesives). Due to the constantly increasing demand for the products, increasingly larger quantities are being produced. At the same time, there is a growing need for methods for the most sustainable recycling of polyurethane products that are no longer needed, which allows the building blocks of the polymers to be recycled. To do this, the bonds in the polyurethanes must be specifically broken down in order to obtain defined degradation products and thus make them reusable.
  • enzymes fulfill in living organisms, they can be used in a variety of ways to catalyze chemical reactions outside of this context. In comparison to conventional chemical processes, the reactions can be carried out under milder conditions such as lower temperature, neutral pH and without the use of aggressive chemicals. This saves energy, minimizes the formation of by-products and protects the environment, which helps reduce operating costs.
  • the use of enzymes partially makes it possible for labile starting materials to be converted (Jaeger, K.-E. & Reetz, M. T. (1998) Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Trends in biotechnology, 16, 396-403) .
  • enzymes are often chemo-, regio-, stereo- and enantioselective, which makes the purification of the products much easier and can therefore enable the efficient synthesis of products that are difficult to access (Hasan, F., Shah, A. A. & Hameed, A. (2006) Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology, 39, 235-251).
  • polyester polyurethanes can be broken down to some extent by bacteria and fungi.
  • Polyester polyurethanes are significantly more susceptible to microbial or enzymatic degradation than polyether polyurethanes (Nakajima-Kambe, T., Shigeno-Akutsu, Y., Nomura, N., Onuma, F. & Nakahara, T. (1999) Microbial degradation of polyurethane, polyester polyurethanes and polyether polyurethanes. Applied microbiology and biotechnology, 51, 134-140). The degradation of polyester polyurethanes can be easily achieved via the hydrolysis of the ester bonds.
  • polyesters The relatively easy degradation of polyesters is not surprising, since ester bonds in hydrophobic substrates in nature also have to be broken down when lipids are broken down and even polyesters without urethane bonds can be broken down relatively easily by esterases and lipases (Marten, E., Müller, R .-J. & Deckwer, W.-D. (2003) Studies on the enzymatic hydrolysis of polyesters
  • II Aliphatic-aromatic copolyesters.
  • WO 2013/134801 describes the degradation of aromatic polyurethanes based on polyether polyols using an EC 3 class enzyme. No specific enzyme sequences are given, so that the specificity of the process in the breakdown of certain urethane bonds, as well as the controlled cleavage of ester bonds and separately the cleavage of urethane bonds, as shown in the present invention, is not proven in the patent mentioned.
  • a urethanase and variants of this enzyme obtained through protein engineering are described.
  • the enzyme can cleave urethane oligomers based on TDA or MDA.
  • newly identified urethanases are described in WO 2019/243293.
  • the present invention was therefore based on the object of providing further enzymes which can be used for the enzymatic cleavage of urethane bonds and preferably for use in the complete enzymatic degradation of polyurethanes. Furthermore, an enzymatic process should be provided that enables the breakdown of polyurethanes into defined monomers.
  • the present invention relates to a polypeptide having an amino acid sequence as defined by SEQ ID NO.: 1, 2 or 3, or a variant thereof, wherein the variant is obtained by the addition, deletion or replacement of up to 15% of the amino acids contained in the respective polypeptide defined by SEQ ID NO.: 1, 2 or 3, characterized in that the polypeptide has urethanase activity.
  • a polypeptide having a sequence according to SEQ ID NO.: 1, 2 or 3 consists of the amino acid sequence defined by SEQ ID NO.: 1, 2 or 3.
  • polypeptide is well known to those skilled in the art. It refers to a chain of at least 50, preferably at least 70, amino acids linked together by peptide bonds.
  • a polypeptide can contain both naturally occurring and synthetic amino acids. Preferably, it contains the known proteinogenic amino acids as well as optionally selenocysteine, pyrrolysine and hydroxyproline. More preferably it consists of the known proteinogenic amino acids and optionally additionally of selenocysteine, pyrrolysine and hydroxyproline.
  • a variant is obtained from the amino acid sequences according to the invention defined by SEQ ID NO.: 1, 2 or 3, preferably by adding, deleting or replacing up to 10% and even more preferably up to 5% of the amino acids contained in the respective polypeptide.
  • the basis for calculating the sequence identity is preferably the amino acid sequence defined by SEQ ID NO.: 1, 2 or 3.
  • the term “variant” also includes those amino acid sequences derived from the polypeptide defined by SEQ ID NO.: 1, 2 or 3, which are linked at the N-terminus and/or at the C-terminus with further proteins, e.g. the Green Fluorescent Protein.
  • variants of the polypeptides according to the invention are obtained by adding, deleting or replacing up to 20, preferably up to 10 and even more preferably up to 5 amino acids of the disclosed sequences.
  • the aforementioned modifications can occur continuously or discontinuously at any point on the polypeptide in question. However, they preferably occur only at the N-terminus and/or at the C-terminus of the polypeptide.
  • each variant according to the invention obtained by addition, exchange or deletion of amino acids is characterized by urethanase activity as defined later in this application.
  • Urethanase activity refers to the ability of a polypeptide to enzymatically catalyze the cleavage of a urethane group.
  • One mole of amine, one mole of alcohol and one mole of CO2 are produced per mole of urethane group.
  • the urethane group can be an aromatic, a cycloaliphatic or an aliphatically bound urethane group.
  • an aromatically bonded urethane group the nitrogen atom is bonded directly to an aromatic ring.
  • an aliphatically bonded urethane group the nitrogen atom is bonded to an alkyl radical, which is part of an open-chain alkyl radical. It is preferably an unbranched alkyl radical with at least one, more preferably at least two and most preferably at least three carbon atoms.
  • the nitrogen atom is bonded to a carbon atom that is part of an aliphatic ring.
  • This ring can be unsaturated at one or more sites as long as it does not acquire an aromatic character due to the presence of double bonds.
  • the polypeptide with urethanase activity is capable of enzymatically cleaving an aromatically bound urethane group.
  • Whether a polypeptide has urethanase activity can be checked by cleavage of suitable model substrates. These are preferably the substrates whose cleavage was shown in the exemplary embodiment.
  • ethyl 4-nitrophenylcarbamate or the carbamate, which is obtainable by the reaction of 7-amino-4-methylcoumarin with ethyl chloroformate (EMACC)
  • ENPC 7-amino-4-methylcoumarin with ethyl chloroformate
  • the cleavage of ENPC is demonstrated by determining the increase in concentration of 4-nitroaniline. This is preferably done photometrically at a wavelength of 405 nm.
  • the enzyme activity is preferably determined in a reaction buffer with 100 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 7 with 6.25 vol.% ethanol in the presence of 0.2 mg/L ENPC as substrate.
  • the enzyme is incubated in the reaction buffer with ENPC preferably at room temperature and preferably for 24 hours.
  • the cleavage of EMACC is demonstrated by determining the increase in concentration of 7-amino-4-methylcoumarin (AMC). This is preferably done photometrically at a wavelength of 365 nm.
  • AMC 7-amino-4-methylcoumarin
  • the enzyme activity is preferably measured in a reaction buffer with 50 mM Na2HPO 4 /NaH2PO4, pH 8.0 with 0.2 vol.% DMSO in the presence of 100 pM EMACC as substrate certainly.
  • the enzyme is incubated in the reaction buffer with ENPC preferably at 30 °C and preferably for up to 24 hours.
  • ethylphenethyl carbamate is preferably used as a model substrate. Cleavage is demonstrated by determining the increase in concentration of phenethylamine. This is preferably done by HPLC.
  • the reaction buffer used and the reaction conditions preferably correspond to the parameters described above for ENPC.
  • urethane bonds that can be cleaved by the urethanases according to the invention are formally based on the addition of a polyisocyanate with aliphatically, cycloaliphatically, araliphatically or aromatically bonded isocyanate groups and an alcohol.
  • isocyanate with aliphatically bonded isocyanate groups all isocyanate groups are bonded to a carbon atom that is part of an open carbon chain. This can be unsaturated in one or more places.
  • the aliphatically bound isocyanate group or - in the case of polyisocyanates - the aliphatically bound isocyanate groups are preferably bound to the terminal carbon atoms of the carbon chain.
  • Preferred polyisocyanates with aliphatically bound isocyanate groups are 1,4-diisocyanatobutane (BDI), 1,5-diisocyanatopentane (PDI), 1,6-diisocyanatohexane (HDI), 2-methyl-1,5-diisocyanatopentane, 1,5-diisocyanatopentane. 2,2-dimethylpentane, 2,2,4- or 2,4,4-trimethyl-1,6-diisocyanatohexane and 1,10-diisocyanatodecane.
  • BDI 1,4-diisocyanatobutane
  • PDI 1,5-diisocyanatopentane
  • HDI 1,6-diisocyanatohexane
  • 2-methyl-1,5-diisocyanatopentane 1,5-diisocyanatopentane
  • isocyanate with cycloaliphatically bonded isocyanate groups all isocyanate groups are bonded to carbon atoms that are part of a closed ring of carbon atoms. This ring can be unsaturated at one or more sites as long as it does not acquire an aromatic character due to the presence of double bonds.
  • Preferred polyisocyanates with cycloaliphatically bound isocyanate groups are 1,3- and 1,4-diisocyanatocyclohexane, 1,4-diisocyanato-3,3,5-trimethylcyclohexane, 1,3-diisocyanato-2-methylcyclohexane, 1,3-diisocyanato-4- methylcyclohexane, l-isocyanato-3,3,5-trimethyl-5-isocyanatomethylcyclohexane isophorone diisocyanate; (IPDI), l-isocyanato-l-methyl-4(3)-isocyanatomethylcyclohexane, 2,4'- and 4,4'-diisocyanatodicyclohexylmethane (H12MDI), 1,3- and 1,4-bis(isocyanatomethyl)cyclohexane, Bis-(isocyanatomethyl)-norbornane (NBD
  • Preferred polyisocyanates with araliphatically bound isocyanate groups are 1,3- and 1,4-bis-(isocyanatomethyl)benzene (xylylene diisocyanate); XDI), 1,3- and l,4-bis(l-isocyanato-l-methylethyl)-benzene (TMXDI) and bis(4-(l-isocyanato-l-methylethyl)phenyl)-carbonate.
  • Preferred isocyanates with aromatically bound isocyanate groups are tolylene diisocyanate (TDI), methylene diphenyl isocyanate (MDI) and naphthylene diisocyanate.
  • tolylene diisocyanate refers to toluene 2,4-diisocyanate (2,4-TDI), toluene 2,6-diisocyanate (2,6-TDI) and any mixtures of the two isomers.
  • methylene diphenyl isocyanate refers to all isomers of MDI, in particular 2,2'-diphenylmethane diisocyanate, 2,4'-diphenylmethane diisocyanate, 4,4'-diphenylmethane diisocyanate, all mixtures which contain at least two of the aforementioned isomers, as well as polynuclear derivatives of MDI.
  • naphthylene diisocyanate refers to 1,4-naphthylene diisocyanate, 1,5-naphthylene diisocyanate and 1,6-naphthylene diisocyanate as well as any mixtures of the aforementioned isomers.
  • oligomeric polyisocyanate refers to polyisocyanates which are composed of at least two of the above-mentioned diisocyanates.
  • the oligomeric polyisocyanates can in particular have a uretdione, isocyanurate, allophanate, biuret, iminooxadiazinedione and/or oxadiazinetrione structure.
  • the oligomeric ones preferably have Polyisocyanates have at least one of the following oligomeric structure types or mixtures thereof:
  • Preferred substrates of the urethanase of the present invention are urethanes, which can be obtained from the aromatic polyisocyanates defined above.
  • enzyme cleavage of a urethane group indicates that the above-described cleavage of a urethane group occurs faster in the presence of a polypeptide with urethanase activity than when incubated with the reaction buffer without enzyme under the same reaction conditions or when incubated with the reaction buffer under the same conditions in the presence of an inactive polypeptide .
  • Bovine serum albumin is preferred as a model for an inactive polypeptide. If in the presence of a polypeptide to be tested the cleavage of the urethane group occurs more quickly than in an otherwise identical control with BSA, said polypeptide has urethanase activity as understood in this application.
  • the present invention relates to a nucleic acid containing a polypeptide as in SEQ. ID NO.: 1, 2 or 3 or encodes one of the above-defined variants of these polypeptides, the encoded polypeptide having urethanase activity.
  • the coding nucleic acid sequence is preferably under the control of a promoter which enables the expression of the polypeptide in a fungus, a yeast or a bacterium.
  • the present invention relates to the use of a polypeptide having an amino acid sequence as defined by SEQ ID NO.: 1, 2 and 3, or one of the variants of these polypeptides defined above in this application, characterized in that the polypeptide has urethanase activity for the enzymatic cleavage of urethane bonds.
  • the use preferably consists of bringing the enzyme according to the invention into contact with a compound which contains at least one urethane bond. This preferably occurs under conditions under which the enzyme displays its urethanase activity. Such conditions can be found in the exemplary embodiments of this application.
  • the person skilled in the art is easily able to use simple series experiments to adjust the reaction conditions in a system, such as temperature, ionic strength, solvent and pH value, so that the enzyme is active.
  • the temperature during use is preferably in the range between 10 ° C and 70 ° C.
  • a higher temperature range between 30 °C and 70 °C is preferred if the reaction rate is more important than the stability of the enzyme.
  • a temperature range between 10 °C and 40 °C is preferred if the reaction rate is of less importance.
  • the pH is when using the SEQ ID NO. 1 and 2 and their variants are preferably between 7 and 12, more preferably between 7 and 11 and most preferably between 8 and 11.
  • the pH is preferably between 7 and 12, more preferably between 7 and 11 and most preferably between 9 and 11.
  • the present invention relates to a method comprising the step of treating a low molecular weight urethane with a polypeptide which has urethanase activity and is selected from the group consisting of a polypeptide defined by SEQ ID Nos. 1, 2 and 3 and those above Variants of these polypeptides defined in this application, whereby the low molecular weight urethane is cleaved.
  • low molecular weight in this context means that the urethane contains at most four, preferably at most three, more preferably at most one or two urethane groups.
  • the structures of the low molecular weight urethanes are preferably formally based on the formation of one or more urethane bonds between a polyisocyanate and one or more low molecular weight alcohols.
  • Aromatic polyisocyanates especially toluene 2,4-diisocyanate (2,4-TDI), toluene 2,6-diisocyanate (2,6-TDI), 2,2'-diphenylmethane diisocyanate (2,2'-MDI), 2 ,4'-diphenylmethane diisocyanate (2,4'-MDI), 4,4'-diphenylmethane diisocyanate (4,4'-MDI), the polynuclear derivatives of the aforementioned diphenylmethane diisocyanates, 1,4-naphthylene diisocyanate, 1,5-naphthylene diisocyanate and 1, 6-Naphthylene diisocyanate is particularly preferred.
  • any compound with at least one hydroxyl group per molecule is suitable as a low molecular weight alcohol.
  • it has a molecular weight of at most 700 g/mol, more preferably at most 500 g/mol and most preferably at most 200 g/mol.
  • low molecular weight alcohols with a higher polarity are preferred.
  • the low molecular weight alcohol particularly preferably contains one or two hydroxyl groups per molecule.
  • the low molecular weight alcohol moreover preferably has a melting point of at most 45°C, more preferably at most 20°C.
  • Alcohols with two hydroxyl groups a molecular weight of at most 500 g/mol and a melting point of at most 45 ° C are therefore more preferred.
  • the low molecular weight alcohol is selected from the group consisting of ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, methyl glycol, triethylene glycol, glycerol, 2-methyl-1,3-propanediol, 1,4-butanediol, 1, 5-pentanediol, 1,6-hexanediol and polyethylene glycol 400. More preferably it is selected from the group consisting of ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, methyl glycol and triethylene glycol.
  • the low molecular weight alcohol diethylene glycol is particularly preferred.
  • a low molecular weight urethane that is particularly preferred for the process according to the invention can be obtained by forming a urethane bond between one of the low molecular weight alcohols mentioned in the previous section, in particular diethylene glycol.
  • the low molecular weight urethanes can be obtained in different ways.
  • the ester bonds of a polyester-polyurethane are cleaved so that carboxylic acids and low molecular weight urethanes are released.
  • the cleavage of the ester groups is preferably carried out enzymatically. Lipases (EC 3.1.1.3) or cutinases (EC 3.1.1.74) are preferably used here.
  • these are preferably low-molecular urethanes which are obtained by the chemical cleavage of a polyether or polyester polyurethane.
  • This chemical cleavage is preferably a so-called “alcoholysis” or “glycolysis” in which the polyether or polyester polyurethane is reacted with one of the low molecular weight alcohols mentioned above, so that the ether component of the polyether polyurethane or the polyester polyol a polyester polyurethane can be replaced by the low molecular weight alcohol.
  • a particularly preferred embodiment for providing low molecular weight urethanes from polyether-polyurethanes is described in WO 2021/032513.
  • polyether polyurethanes are reacted with a low molecular weight alcohol in such a way that the polyether component of the polyether polyurethane is released and a urethane bond is formed between the low molecular weight alcohol used and the isocyanates used to construct the polyether polyurethane.
  • the low molecular weight urethanes to be cleaved according to the invention are therefore compounds which are formally obtained by forming a urethane bond between a polyisocyanate, preferably one of the aliphatic, aromatic, araliphatic or cycloaliphatic polyisocyanates listed above in this application, and a low molecular weight alcohol.
  • polyester-polyurethane refers to a polyurethane whose polyol component contains polyester polyols. Preferably at least 40% by weight of the hydroxyl groups contained in the polyol component are components of polyester polyols. More preferably, this is at least 60% by weight, even more preferably at least 80 % by weight and most preferably at least 95% by weight.
  • the polyester polyurethane may be foamed or non-foamed.
  • the polyester-polyurethane contains at least one aromatic, aliphatic or cycloaliphatic isocyanate as the isocyanate component.
  • the polyurethane preferably contains aromatic isocyanates.
  • the at least one aromatic polyisocyanate is particularly preferably selected from the list given above.
  • polyester polyol is known to those skilled in the art; it refers to polyesters which contain, on average, at least 1.5, preferably at least 1.8 and more preferably at least 2.0 hydroxyl groups per molecule. Particularly preferred are those in the polyurethane to be degraded
  • the polyester polyols contained have a functionality of between 1.5 and 6.0. They contain aromatic and/or aliphatic polyols and aromatic and/or aliphatic polycarboxylic acids in any combination as structural components. Polyester polyols which are obtained by ring-opening polymerization of a lactone are also preferred.
  • polyether-polyurethane refers to a polyurethane whose polyol component contains polyether polyols. Preferably at least 40% by weight of the hydroxyl groups contained in the polyol component are components of polyether polyols. More preferably, this is at least 60% by weight, even more preferably at least 80 % by weight and most preferably at least 95% by weight. It is possible according to the invention for a polyether polyurethane to also contain further polyols as structural components while maintaining the aforementioned proportions of polyether polyols. These are preferably polyester polyols.
  • polyether polyol is well known to those skilled in the art. These are polyethers with an average hydroxyl functionality between 1.5 and 6.0.
  • the polyether polyol contained in the polyether polyurethane is a polyaddition product using one or more alkylene oxides with 2 to 4 carbon atoms at least one starter molecule which contains 2 to 8, preferably 2 to 6, bonded reactive hydrogen atoms.
  • alkylene oxides are styrene oxide, ethylene oxide, propylene oxide, tetrahydrofuran, butylene oxide, epichlorohydrin. More preferred are 1,3-propylene oxide, 1,2- or 2,3-butylene oxide and styrene oxide. Ethylene oxide and 1,2-propylene oxide are particularly preferred.
  • the alkylene oxides can be used individually, alternating one after the other or as mixtures.
  • the “treatment” of the low-molecular urethane takes place under conditions under which the enzyme used shows urethanase activity.
  • the reaction products of the enzymatic cleavage of the low-molecular urethane are a low-molecular-weight alcohol or a mixture of low-molecular-weight alcohols and an amine or a mixture of amines.
  • the chemical structure of the resulting amines depends on the type of polyisocyanate used to synthesize the urethane. Amines are released, which can be derived from the polyisocyanates used by adding water and subsequently eliminating CO2.
  • the present invention relates to the use of at least one of the polypeptides according to the invention to cleave a urethane bond in low molecular weight urethanes. Degradation of polyester urethanes into low molecular weight degradation products
  • the present invention relates to a process for the degradation of polyester-polyurethanes into low-molecular-weight degradation products, comprising the steps a) cleavage of the ester groups contained in the polyester-polyurethane; and b) treating the polyurethane with a polypeptide which has urethanase activity and is selected from the group consisting of polypeptides as in SEQ. ID NO.: 1, 2 and 3 and the variants of these polypeptides defined above in this application; with the proviso that process steps a) and b) can be carried out in any order or simultaneously.
  • process step a) is carried out before process step b).
  • process step a) is carried out with a lipase or cutinase. More preferably, a lipase capable of cleaving tributyrin is used.
  • Process step a) is preferably carried out under reaction conditions in which the lipase or cutinase used shows activity. Such conditions can be determined through routine experiments using common biochemical methods.
  • process step a) takes place chemically.
  • the polyurethane contains at least one aromatic, aliphatic or cycloaliphatic isocyanate as the isocyanate component.
  • the polyurethane preferably contains aromatic isocyanates.
  • the low molecular weight degradation products of the polyester-based polyurethanes preferably have a molecular weight of at most 1,000 g/mol. It is preferably about
  • a “polyol” that is formed as a low-molecular-weight degradation product in the process defined in this section is understood to mean any compound with at least two hydroxyl groups. Said polyol preferably has a molecular weight of at most 300 g/mol.
  • polyester-based polyurethanes are selected from the group consisting of ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, propylene glycol, 1,3-pentanediol, 1,4-butanediol, 1,6-hexanediol, 1,2-di-propylene glycol, neopentyl glycol, glycerin , 1,1,1-trimethylolpropane, sucrose, sorbitol and pentaerythritol.
  • a “polycarboxylic acid”, which is formed as a low molecular weight degradation product in the process defined in this section, is understood to mean any compound that contains at least two carboxyl groups. Said polycarboxylic acid preferably has a molecular weight of at most 300 g/mol.
  • Preferred polycarboxylic acids which Low molecular weight degradation products of the polyester-based polyurethane foams are selected from the group consisting of succinic acid, glutaric acid, adipic acid, itaconic acid, phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid and benzenetricarboxylic acid.
  • a “polyamine”, which is formed as a low molecular weight degradation product in the process defined in this section, is understood to mean any compound that contains at least two amino groups. Said polyamine preferably has a molecular weight of at most 300 g/mol.
  • Preferred polyamines, which are low molecular weight degradation products of the polyester-based polyurethane foams, are selected from the group consisting of 4,4'-diaminodiphenylmethane, 2,4'-diaminodiphenylmethane, 2,2'-diaminodiphenylmethane, the polynuclear derivatives of the aforementioned diaminodiphenylmethane compounds, 2,4-
  • Toluenediamine 2,6-toluenediamine, 1,4-naphthylenediamine, 1,5-naphthylenediamine, 1,6-
  • the polyamines are particularly preferably selected from the group consisting of 4,4'-methylenediamine, 2,4'-methylenediamine, 2,2'-methylenediamine, 1,5-naphthylenediamine, 2,4-toluenediamine and 2,6-toluenediamine.
  • the present invention relates to a method comprising the steps a) transurethanization of a polyether polyurethane with at least one low molecular weight alcohol, producing polyether polyols and low molecular weight urethanes; and b) the enzymatic cleavage of the low molecular weight urethanes formed in process step a) with a polypeptide which has urethanase activity and is selected from the group consisting of polypeptides as in SEQ. ID NO.: 1, 2 and 3 and the variants of these polypeptides defined above in this application.
  • Process step a) has two goals: (i) The polyether polyol used to synthesize the polyurethane should be released from the polyurethane as an isolable compound, (ii) The isocyanate used to synthesize the polyurethane should be present as a component of a low molecular weight urethane.
  • the low molecular weight urethane in question is - in contrast to polyurethane with its high molecular weight - well suited as a substrate for the enzymatic cleavage that takes place in process step b) due to its lower molecular weight and the resulting better solubility.
  • process step b an amine and the low-molecular-weight alcohol used for transurethanization in process step a) are released by enzymatic cleavage of the low-molecular-weight urethanes.
  • CO2 is released in this process step.
  • These compounds can be isolated using suitable separation processes and then used further. It is preferred to use the released low molecular weight alcohol again for the reurethanization that takes place in process step a).
  • the released amine is available as a pure and well-defined starting material for new syntheses.
  • Process step a) is carried out at temperatures between 140 °C and 300 °C, preferably between 160 °C and 270 °C.
  • the weight ratio of the low molecular weight alcohol to the polyether urethane is between 2: 1 and 1: 17.
  • catalysts are alkali metal hydroxides, alkaline earth metal hydroxides, alkali metal salts of carboxylic acids (especially acetates), alkaline earth metal salts of carboxylic acid (especially acetates), Lewis acids (such as in particular Dibutyltin dilaurate), organic amines (such as, in particular, diethanolamine), organometallic compounds (such as, in particular, titanium tetrabutoxide) and tin compounds (such as, in particular, tin octoate).
  • Transurethanization is preferred at temperatures in the range from 160 °C to 270 °C carried out in the presence of 0.1% by mass to 5% by mass of catalyst, based on the mass of the polyurethane product added.
  • Figure 1 shows: Enzyme substrates used.
  • pNPB 4-nitrophenylbutyrate
  • ENPC Ethyl-4-nitrophenylcarbamate
  • MDA-BA Carbamate of 4,4'-MDI reacts with benzyl alcohol
  • TDA-Ethoxyethanol Carbamate of toluene diisocyanate (TDI) reacts with ethoxyethanol
  • TDA-DEG Carbamate of TDI reacts with diethylene glycol
  • NDA-MEG Carbamate of NDI reacts with ethylene glycol
  • EMACC Carbamate from the reaction of 7-amino-4-methylcoumarin with ethyl chloroformate.
  • Example 1 Activity determination with EMACC
  • Urethanase genes were cloned into the pET-26 expression vector directly behind the NdeI interface.
  • E. coli BL21(DE3) were transformed with the corresponding plasmids for expression.
  • a single colony was used to inoculate the overnight culture in LB medium containing 1% (w/v) glucose and 50 pg/mL kanamycin.
  • 200 ml of ZYP-5052 with 50 pg/mL kanamycin were inoculated with 1 mL of the overnight culture and incubated for 4 h at 37 °C at 100 rpm in baffled flasks. The temperature was then reduced to 20 °C before the cultures were harvested by centrifugation for 20 min at 4500 g and 4 °C. Cell pellets were stored at ⁇ 20 °C until proteins were purified.
  • lysis buffer 50 mM sodium phosphate (NaPi), pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole
  • the digestion was carried out by ultrasound on ice over two cycles (3 min, 50% pulse, 50% power). To clarify the lysate, it was centrifuged at 10,000 g and 4 °C for 40 - 60 min. The supernatants were stored on ice until loading the IMAC column.
  • IMAC resin (1 ml, ROTI®Garose His Beads, nickel form) was equilibrated with lysis buffer. The lysate was then applied to the columns followed by a washing step with at least ten column volumes of washing buffer (50 mM NaPi, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole). The proteins were then eluted with 15 mL of elution buffer (50 mM NaPi, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole). The volume of the elution fraction was reduced to 2.5 mL using Vivaspin 20 ultrafiltration units (10 kDa MWCO). The proteins were then rebuffered in storage buffer (10 mM NaPi, pH 8.0, 100 mM NaCl) using PDIO columns.
  • washing buffer 50 mM NaPi, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole.
  • the proteins were then eluted
  • urethanase activity a fluorogenic substrate was synthesized from 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) and ethyl chloroformate.
  • AMC 7-amino-4-methylcoumarin
  • EMACC ethyl carbamate of AMC
  • the specific activity was determined under standard conditions (50 mM NaPi, pH 8.0, 30 °C, 100 pM EMACC).
  • EMACC was freshly added from a 50 mM stock in DMSO. Purified urethanases were diluted in storage buffer prior to addition to the assay, resulting in a linear increase in absorbance at 365 nm over 10–30 min.
  • Cultivation took place for 4 h at 37°C and 200 rpm followed by 24 h at 20°C and 200 rpm in an incubation shaker.
  • the cells were separated by centrifugation at 20,425 g and 4 °C for 20 min in a large-capacity centrifuge.
  • the cell pellets were suspended in 6 mL of digestion buffer (20 mM ammonium acetate, 0.4% n-dodedecyl- ⁇ -maltoside, 1% lysozyme, 1 pL/mL benzonase (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen)) and stored for 30 min Incubated at room temperature on the orbital shaker.
  • the whole cell extract solution was then frozen at ⁇ 80 °C and freeze-dried.
  • the lyophilisate was stored at 4 °C.
  • the substrates ENPC, MDA-BA, NDA-MEG, TDA-ethoxyethanol and TDA-DEG were synthesized from the corresponding isocyanates and alcohols by reacting the isocyanates with an excess of alcohol.
  • EMACC and 4-nitropenylbutyrate (pNPB) were used.
  • the enzyme substrates are in error! Reference source could not be found, shown.
  • a spatula tip ( ⁇ 3 mg) of each of the lyophilized whole cell extracts was suspended in 800 pL of 100 mM KPi with 100 mM NaCl pH 7.5.
  • the enzyme solution was diluted 1:10 into the reaction mixture containing the same buffer.
  • Substrate stocks of the carbamates were prepared with a concentration of 5 - 340 mg/mL in DMSO. These were diluted 1:10 into the reaction mixture so that the final DMSO concentration was 10% (v/v).
  • the batches were prepared with a total volume of 500 pL. The incubation took place for one day at 30°C and 800 - 1000 rpm followed by one day at 40°C and 800-1000 rpm in a thermoshaker.
  • EMACC and pNPB the total volume of the reaction was 200 pL and the fluorescence (EMACC, excitation 365 nm, emission 440 nm) or absorption (pNPB, 410 nm) was measured at different times in the Varioskan Lux plate photometer (Thermo Fisher Scientific Inc ., Waltham, Massachusetts, USA).
  • the high-pressure liquid chromatography was carried out on a 1260 Infinity II series device from Agilent Technologies (Santa Clara, USA) with a multisampler and DAD (diode array detector) for UV and the visible range of light.
  • the “Zorbax Eclipse Plus-CIS” column with a particle size of 5 pm and dimensions 4.6 x 150 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) with an appropriate guard column was used for all measurements. 5 pL of sample was injected for all methods and the column was heated to 40 ° C. The flow was generally 1.0 mL/min.
  • the “ER_Juni2021-2” method was used to detect aromatic amines. Because of the high intrinsic absorption, aromatic amines could be quantified at 210 nm and 232 nm without derivatization using this method.
  • the mobile phase A was ddHjO with 5% (v/v) acetonitrile and acetonitrile with 5% (v/v) ddHjO was used as mobile phase B.
  • the data was analyzed using the software “OpenLAB CDS 2.4” in version 2.204.0.661 (Agilent Technologies, Santa Clara, USA).
  • the hydrolytic activity of the urethanases towards the tested carbamates was classified into the categories no activity (-), low activity (+), medium activity (++) and high activity (+++) based on the peak area of the products formed in the chromatogram. It was shown that the urethanase UMG-8, UMG11.2 and UMG 16 accept a wide range of substrates. The tested substrates are in error! Reference source could not be found, shown.
  • Table 3 Activity of urethanase towards various carbamates. Activity is divided into “no activity” (-), “low activity” (+), “medium activity” (++) and "high activity” (+++) categories based on HPLC peak area.
  • enzyme activity was determined analogously to Example 1, with the adjustment that the reaction was carried out in different buffers (100 mM). Buffers with pH 4.0, 5.0, and 6.0 (citrate), 7.0, 8.0, and 9.0 (bis-tris-propane), and 10.0 (CHES) were used. For pH values 10, 11, 12 and 13, a buffer consisting of 100 mM sodium phosphate and 100 mM sodium carbonate and, unlike Example 1, with 200 mM EMACC and 10% (v/v) DMSO was used.
  • Temperature optima were determined by measuring the release of AMC from 100 pM EMACC in 50 mM NaPi (pH 8.0) at 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, and 70 °C. Solvent stability was determined by quantifying the hydrolysis of EMAC under the conditions given in Example 1 at 0, 10, 20, 30, 40 and 50% (v/v) DMSO. The activity optima determined here for pH, temperature and DMSO concentration are in
  • solutions of the purified urethanases with a protein concentration of 0.5 mg/mL were prepared in 100 mM KPi pH 7.5. 100 pL each were stored in the Biometra TAdvanced Basis thermocycler (Analytik Jena GmbH, Jena) at 20°C, 25.7°C, 29.4°C, 36.9°C, 40.6°C, 44.3°C and 50 °C for 12 h and then incubated at 4 °C until activity measurement. The lid heating was heated to 99°C. A reference sample was incubated at 4°C. The residual activity of the enzymes was determined using pNPB assay.
  • 21 pL pNPB was mixed with 4.979 mL DMSO. This solution was diluted 1:10 in 100 mM KPi pH 7.5. 20 pL enzyme solution (UMG-8 diluted 1:5 in 100 mM KPi pH 7.5, UMG-11.2 diluted 1:20 in 100 mM KPi pH 7.5, UMG-16 1:20 in 100 mM KPi pH 7.5 diluted) were placed in a microtiter plate and the reaction was started by adding 180 pL pNPB in 100 mM KPi pH 7.5 with 10% DMSO.
  • Table 6 Specific activity of urethanase towards pNPB in U/mg after incubation for 12 h at 20°C, 25.7°C, 29.4°C, 36.9°C, 40.6°C, 44.3 °C and 50 °C and at 4 °C as a reference.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Urethanasen für den enzymatischen Abbau von Polyurethanen sowie ein enzymatisches Verfahren für den vollständigen Abbau von Polyurethanen in definierte Monomere.

Description

Neue Urethanasen für den enzymatischen Abbau von Polyurethanen
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Urethanasen für den enzymatischen Abbau von Polyurethanen sowie ein enzymatisches Verfahren für den vollständigen Abbau von Polyurethanen in definierte Monomere.
Polyurethane sind in vielen Bereichen des normalen Lebens etabliert. Sie finden sich zum Beispiel in Weichschäumen (Matratzen, Schwämme, Polstermöbel), Hartschäumen (Isolationsmaterialien, Baustoffe), Thermoplasten (Sportschuhe) oder Beschichtungen (Lacke, Farben, Klebstoffe). Aufgrund der stetig steigenden Nachfrage nach den Produkten werden zunehmend größere Mengen produziert. Parallel dazu wächst das Bedürfnis nach Methoden für möglichst nachhaltiges Recycling von nicht mehr benötigten Polyurethanprodukten, die eine Wiederverwertung von Bausteinen der Polymere erlaubt. Dafür müssen die Bindungen in den Polyurethanen gezielt gespalten werden, um definierte Abbauprodukte erhalten zu können und diese damit wiederverwertbar zu machen.
Neben den physiologischen Funktionen, welche Enzyme in lebenden Organismen erfüllen, können sie auf vielfältige Weise zur Katalyse chemischer Reaktionen außerhalb dieses Kontextes genutzt werden. Hierbei können im Vergleich zu konventionell chemischen Prozessen die Reaktionen bei milderen Bedingungen wie niedrigerer Temperatur, neutralem pH-Wert und ohne die Verwendung aggressiver Chemikalien durchgeführt werden. Dadurch kann Energie gespart, die Bildung von Nebenprodukten minimiert und die Umwelt geschont werden, was zur Reduktion der Betriebskosten beiträgt. Durch den Einsatz von Enzymen wird es teilweise erst ermöglicht, dass labile Edukte umgesetzt werden können (Jaeger, K.-E. & Reetz, M. T. (1998) Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Trends in biotechnology, 16, 396-403). Weiterhin sind Enzyme häufig chemo-, regio-, stereo- und enantioselektiv, was die Aufreinigung der Produkte deutlich erleichtert und damit die effiziente Synthese schwer zugänglicher Produkte ermöglichen kann (Hasan, F., Shah, A. A. & Hameed, A. (2006) Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology, 39, 235-251).
Heutzutage werden Polyurethane in den wenigsten Fällen recycelt. Die Entsorgung geschieht durch Deponierung oder alternativ durch eine vollständige Verbrennung, wobei zwar Energie gewonnen wird, aber eine effiziente Wiederverwendung der Polymerbausteine entfällt.
Es ist bekannt, dass Polyurethane in gewissem Maße von Bakterien und Pilzen abgebaut werden können. Dabei sind Polyesterpolyurethane deutlich anfälliger gegenüber mikrobiellem bzw. enzymatischem Abbau als Polyetherpolyurethane (Nakajima-Kambe, T., Shigeno-Akutsu, Y., Nomura, N., Onuma, F. & Nakahara, T. (1999) Microbial degradation of polyurethane, polyester polyurethanes and polyether polyurethanes. Applied microbiology and biotechnology, 51, 134-140). Der Abbau von Polyesterpolyurethanen lässt sich leicht über die Hydrolyse der Esterbindungen realisieren. Der relativ einfache Abbau von Polyestern ist nicht weiter verwunderlich, da Esterbindungen in hydrophoben Substraten in der Natur auch beim Abbau von Lipiden gespalten werden müssen und auch Polyester ohne Urethanbindungen relativ leicht durch Esterasen und Lipasen abgebaut werden können (Marten, E., Müller, R.-J. & Deckwer, W.-D. (2003) Studies on the enzymatic hydrolysis of polyesters I. Low molecular mass model esters and aliphatic polyesters. Polymer degradation and stability, 80, 485-501; Marten, E., Müller, R.-J. & Deckwer, W.-D. (2005) Studies on the enzymatic hydrolysis of polyesters. II. Aliphatic-aromatic copolyesters. Polymer degradation and stability, 88, 371-381.). In verschiedenen Literaturstellen wurden zum Abbau von Polyurethan verwendete Enzyme als Esterasen charakterisiert (Allen, A. B., Hilliard, N. P. & Howard, G. T. (1999) Purification and characterization of a soluble polyurethane degrading enzyme from Comamonas acidovorans. International biodeterioration & biodegradation, 43, 37-41; Blake, R., Norton, W. & Howard, G. (1998) Adherence and growth of a Bacillus species on an insoluble polyester polyurethane. International biodeterioration & biodegradation, 42, 63-73; Crabbe, J. R., Campbell, J. R., Thompson, L., Walz, S. L. & Schultz, W. W. (1994) Biodegradation of a colloidal ester-based polyurethane by soil fungi. International biodeterioration & biodegradation, 33, 103-113; Darby, R. T. & Kaplan, A. M. (1968) Fungal susceptibility of polyurethanes. Applied microbiology, 16, 900-905; Howard, G. T., Norton, W. N. & Burks, T. (2012) Growth of Acinetobacter gerneri P7 on polyurethane and the purification and characterization of a polyurethanase enzyme. Biodegradation, 23, 561-573; Kaplan, A. M., Darby, R. T., Greenberger, M. & Rodgers, M. (1968) Microbial deterioration of polyurethane systems. Dev Ind Microbiol, 82, 362-371; Kay, M., Morton, L. & Prince, E. (1991) Bacterial degradation of polyester polyurethane. International biodeterioration, 27 , 205-222; Vega, R. E., Main, T. & Howard, G. T. (1999) Cloning and expression in Escherichia coli of a polyurethane-degrading enzyme from Pseudomonas fluorescens. International biodeterioration & biodegradation, 43, 49-55). Dort gibt es keinen eindeutigen Nachweis auf die Spaltung der Urethanbindung, da die Enzymcharakterisierung in keinem Fall auf Grundlage der Spaltung eines Moleküls mit Urethangruppe durchgeführt wurde.
In vielen Publikationen und Patenten ist der Abbau von Poly(ester)urethanen mit Pilzen oder Bakterien beschrieben. Jedoch zielt der Abbau meist nur auf die relativ leicht zu spaltenden Esterbindungen und wird meist nur durch eine makroskopische Beobachtung des Polymerabbaus belegt. Es gibt hier keinen gesteuerten Abbau von Ester- und Urethanbindungen, wie in der vorliegenden Erfindung und es ergeben sich häufig lange Abbauzeiten. Diese Veröffentlichungen zeigen, dass Urethanasen weit verbreitete Enzyme sind, jedoch belegen sie nicht deren spezifischen Fähigkeiten, Einsatzmöglichkeiten und Gruppenzugehörigkeit, wie in der vorliegenden Erfindung genutzt. (JP09192633, Tang, Y. W., Labow, R. S., Santerre, J. P. (2003) Enzyme induced biodegradation of polycarbonate-polyurethanes: dose dependence effect of cholesterol esterase. Biomaterials 24 (12), 2003-2011, Vega, R. E., Main, T. & Howard, G. T. (1999) Cloning and expression in Escherichia coli of a polyurethane-degrading enzyme from Pseudomonas fluorescens. International biodeterioration & biodegradation, 43, 49-55) Zum enzymatischen Abbau von Poly(ester)urethanen ist ein Abbauverfahren bekannt, bei dem im ersten Schritt aus einer Kultivierung von Comamonas acidovorans eine Esterase gewonnen wird, indem als Kohlenstoffquelle nur Poly(ester)urethan zur Verfügung steht. In einem aufwendigen Aufarbeitungsschritt wird die Esterase abgetrennt und für den Abbau von Poly(ester)urethanen im Batch eingesetzt. Hierbei ergeben sich lange Abbauzeiten in einem mehrstufigen Verfahren und keine Belege für eine spezifische Spaltung der Urethanbindungen. (JP 09201192, JP 10271994)
In verschiedenen Patenten und Publikationen wird der Abbau von Poly(ester)urethanen mit Cutinasen, Esterasen und/oder Lipasen beschrieben. Jedoch zielt der Abbau auch hier nur auf die relativ einfache Spaltung der Esterbindungen, nicht aber spezifisch auf die Urethanbindungen. Außerdem wird keine gezielte Kombination von Ester- und Urethanbindungen spaltenden Enzymen zur gezielten Steuerung des Abbaus beschrieben. Es ist davon auszugehen, dass die beschriebenen Verfahren nur zu einer geringen oder keiner Spaltung der Urethanbindung führen. Damit können in der Synthese von Polyurethanen eingesetzte Diamine nicht effizient wiedergewonnen werden. (EP 0968300, US 6,180,381)
In WO 2013/134801 wird der Abbau von aromatischen Polyurethanen, basierend auf Polyetherpolyolen, unter Anwendung eines Enzymes der Klasse EC 3 beschrieben. Dabei sind keine spezifischen Enzymsequenzen angegeben, so dass die Spezifität des Verfahrens in dem Abbau bestimmter Urethanbindungen, sowie der kontrollierten Spaltung von Ester- und gesondert der Spaltung von Urethanbindungen, wie in der vorliegenden Erfindung gezeigt, in dem genannten Patent nicht belegt ist.
In WO 2006/019095 wird eine Urethanase und durch Protein Engineering gewonnene Varianten dieses Enzyms beschrieben. Das Enzym kann auf TDA oder MDA beruhende Urethanoligomere spalten. Weiterhin werden in WO 2019/243293 neu identifizierte Urethanasen beschrieben.
Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, weitere Enzyme bereitzustellen, die für die enzymatische Spaltung von Urethanbindungen und vorzugsweise für die Verwendung beim vollständigen enzymatischen Abbau von Polyurethanen einsetzbar sind. Weiterhin sollte ein enzymatisches Verfahren bereitgestellt werden, das den Abbau von Polyurethanen in definierte Monomere ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen und in der untenstehenden Beschreibung offenbarten Ausführungsformen gelöst.
In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat wie durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definiert, oder eine Variante davon, wobei die Variante durch die Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 15 % der im jeweiligen durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Polypeptid enthaltenen Aminosäuren erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid Urethanaseaktivität aufweist.
Vorzugsweise besteht ein Polypeptid, das eine Sequenz gemäß SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 hat, aus der durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Aminosäuresequenz.
Polypeptid
Der Begriff „Polypeptid" ist dem Fachmann gut bekannt. Er bezeichnet eine Kette von wenigstens 50, vorzugsweise wenigstens 70 Aminosäuren, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Ein Polypeptid kann sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Aminosäuren enthalten. Vorzugsweise enthält es die bekannten proteinogenen Aminosäuren sowie optional Selenocystein, Pyrrolysin und Hydroxyprolin. Stärker bevorzugt besteht es aus den bekannten proteinogenen Aminosäuren sowie optional zusätzlich aus Selenocystein, Pyrrolysin und Hydroxyprolin.
Eine Variante wird aus den erfindungsgemäßen durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Aminosäuresequenzen vorzugsweise durch Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 10 % und noch stärker bevorzugt bis zu 5 %, der im jeweiligen Polypeptid enthaltenen Aminosäuren erhalten. Basis für die Berechnung der Sequenzidentität ist bevorzugt jeweils die durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierte Aminosäuresequenz. Dem Fachmann ist bewusst, dass Fusionsproteine von Enzymen mit anderen Proteinen gebildet werden, ohne dass dies die Aktivität des Enzyms beeinträchtigt. Deswegen umfasst der Begriff „Variante" in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung auch solche von dem durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Polypeptid abgeleiteten Aminosäuresequenzen, die am N- Terminus und/oder am C-Terminus mit weiteren Proteinen, z.B. dem Green Fluorescent Protein, fusioniert sind.
Besonders bevorzugte Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide werden durch Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 20, bevorzugt bis zu 10 und noch stärker bevorzugt bis zu 5 Aminosäuren der offenbarten Sequenzen erhalten. Grundsätzlich können die vorgenannten Modifikationen an jeder beliebigen Stelle des betreffenden Polypeptids kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Bevorzugt erfolgen sie aber nur am N-Terminus und/oder am C-Terminus des Polypeptids. Jede erfindungsgemäße durch Hinzufügung, Austausch oder Deletion von Aminosäuren erhaltene Variante ist aber durch Urethanaseaktivität wie weiter unten in dieser Anmeldung definiert gekennzeichnet.
Urethanaseaktivität Der Begriff „Urethanaseaktivität" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Polypeptids, die Spaltung einer Urethangruppe enzymatisch zu katalysieren. Pro Mol Urethangruppe entsteht hierbei ein Mol Amin, ein Mol Alkohol und ein Mol CO2.
Bei der Urethangruppe kann es sich um eine aromatisch, eine cycloaliphatisch oder eine aliphatisch gebundene Urethangruppe handeln. Bei einer aromatisch gebundenen Urethangruppe ist das Stickstoffatom direkt an einen aromatischen Ring gebunden. Bei einer aliphatisch gebundenen Urethangruppe ist das Stickstoffatom an einen Alkylrest, der Bestandteil eines offenkettigen Alkylrests ist, gebunden. Vorzugsweise handelt es sich um einen unverzweigten Alkylrest mit wenigstens einem, stärker bevorzugt wenigstens zwei und am stärksten bevorzugt wenigstens drei Kohlenstoffatomen. Bei einer cycloaliphatisch gebundenen Urethangruppe ist das Stickstoffatom an ein Kohlenstoffatom gebunden, das Bestandteil eines aliphatischen Rings ist. Dieser Ring kann an einer oder mehreren Stellen ungesättigt sein, solange er durch das Vorliegen von Doppelbindungen keinen aromatischen Charakter erhält. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polypeptid mit Urethanaseaktivität in der Lage, eine aromatisch gebundene Urethangruppe enzymatisch zu spalten.
Ob ein Polypeptid eine Urethanaseaktivität besitzt, kann durch die Spaltung geeigneter Modellsubstrate überprüft werden. Dies sind vorzugsweise die Substrate, deren Spaltung in den Ausführungsbeispiel gezeigt wurde.
Für die Fähigkeit zur Spaltung aromatisch gebundener Urethangruppen dienen besonders bevorzugt Ethyl-4-Nitrophenylcarbamat (ENPC) oder das Carbamat, das durch die Reaktion von 7-Amino-4- Methylcumarin mit Ethylchlorformiat erhältlich ist (EMACC) als Modellsubstrate. Die Spaltung von ENPC wird durch die Bestimmung des Konzentrationsanstiegs von 4-Nitroanilin nachgewiesen. Dies erfolgt vorzugsweise photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm. Die Enzymaktivität wird vorzugsweise in einem Rektionspuffer mit 100 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 7 mit 6,25 Vol.-% Ethanol in Anwesenheit von 0,2 mg/L ENPC als Substrat bestimmt. Die Inkubation des Enzyms im Reaktionspuffer mit ENPC erfolgt vorzugsweise bei Raumtemperatur und vorzugsweise für 24 Stunden. CO2 + EtOH
Die Spaltung von EMACC wird durch die Bestimmung des Konzentrationsanstiegs von 7-Amino-4- Methylcumarin (AMC) nachgewiesen. Dies erfolgt vorzugsweise photometrisch bei einer Wellenlänge von 365 nm. Die Enzymaktivität wird vorzugsweise in einem Rektionspuffer mit 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 8,0 mit 0,2 Vol.-% DMSO in Anwesenheit von 100 pM EMACC als Substrat bestimmt. Die Inkubation des Enzyms im Reaktionspuffer mit ENPC erfolgt vorzugsweise bei 30 °C und vorzugsweise für bis zu 24 Stunden.
Für die Fähigkeit zur Spaltung aliphatisch gebundener Urethangruppen dient vorzugsweise Ethylphenethylcarbamat (EPEC) als Modellsubstrat. Die Spaltung wird durch die Bestimmung des Konzentrationsanstiegs von Phenethylamin nachgewiesen. Dies erfolgt vorzugsweise durch HPLC. Der verwendete Reaktionspuffer und die Reaktionsbedingungen entsprechen vorzugsweise den oben für ENPC beschriebenen Parametern.
+ CO2 + EtOH
Die Urethanbindungen, die durch die erfindungsgemäßen Urethanasen gespalten werden können, basieren formal auf der Addition eines Polyisocyanats mit aliphatisch, cycloaliphatisch, araliphatisch oder aromatisch gebundenen Isocyanatgruppen und einem Alkohol.
Bei einem Isocyanat mit aliphatisch gebundenen Isocyanatgruppen sind alle Isocyanatgruppen an ein Kohlenstoffatom gebunden, das Teil einer offenen Kohlenstoffkette ist. Diese kann an einer oder mehreren Stellen ungesättigt sein. Die aliphatisch gebundene Isocyanatgruppe oder - im Fall von Polyisocyanaten - die aliphatisch gebundenen Isocyanatgruppen sind vorzugsweise an den terminalen Kohlenstoffatomen der Kohlenstoffkette gebunden.
Bevorzugte Polyisocyanate mit aliphatisch gebundenen Isocyanatgruppen sind 1,4-Diisocyanatobutan (BDI), 1,5-Diisocyanatopentan (PDI), 1,6-Diisocyanatohexan (HDI), 2-Methyl-l,5-diisocyanatopentan, l,5-Diisocyanato-2,2-dimethylpentan, 2,2,4- bzw. 2,4,4-Trimethyl-l,6-diisocyanatohexan und 1,10- Diisocyanatodecan.
Bei einem Isocyanat mit cycloaliphatisch gebundenen Isocyanatgruppen sind alle Isocyanatgruppen an Kohlenstoffatome gebunden, die Teil eines geschlossenen Rings aus Kohlenstoffatomen sind. Dieser Ring kann an einer oder mehreren Stellen ungesättigt sein, solange er durch das Vorliegen von Doppelbindungen keinen aromatischen Charakter erhält. Bevorzugte Polyisocyanate mit cycloaliphatisch gebundenen Isocyanatgruppen sind 1,3- und 1,4- Diisocyanatocyclohexan, l,4-Diisocyanato-3,3,5-trimethylcyclohexan, l,3-Diisocyanato-2- methylcyclohexan, l,3-Diisocyanato-4-methylcyclohexan, l-lsocyanato-3,3,5-trimethyl-5- isocyanatomethyl-cyclohexan Isophorondiisocyanat; (IPDI), l-lsocyanato-l-methyl-4(3)- isocyanatomethylcyclohexan, 2,4'- und 4,4'-Diisocyanatodicyclohexylmethan (H12MDI), 1,3-und 1,4- Bis(isocyanatomethyl)cyclohexan, Bis-(isocyanatomethyl)-norbornan (NBDI), 4,4'-Diisocyanato-3,3'- dimethyldicyclohexylmethan, 4,4'-Diisocyanato-3,3',5,5'-tetramethyl-dicyclohexylmethan, 4,4'- Diisocyanato-l,l'-bi(cyclohexyl), 4,4'-Diisocyanato-3,3'-dimethyl-l,l'-bi(cyclohexyl), 4,4'- Diisocyanato-2,2',5,5'-tetra-methyl-l,l'-bi(cyclohexyl), 1,8-Diisocyanato-p-menthan, 1,3- Diisocyanato-adamantan und l,3-Dimethyl-5,7-diisocyanatoadamantan.
Bei einem Isocyanat mit araliphatisch gebundenen Isocyanatgruppen sind alle Isocyanatgruppen an Methylenreste gebunden, der ihrerseits an einen aromatischen Ring gebunden sind.
Bevorzugte Polyisocyanate mit araliphatisch gebundenen Isocyanatgruppen sind 1,3- und 1,4-Bis- (iso-cyanatomethyl)benzol (Xylylendiisocyanat); XDI), 1,3- und l,4-Bis(l-isocyanato-l-methyhethyl)- benzol (TMXDI) und Bis(4-(l-isocyanato-l-methylethyl)phenyl)-carbonat.
Bei einem Isocyanat mit aromatisch gebundener Isocyanatgruppe sind alle Isocyanatgruppen direkt an Kohlenstoffatome gebunden, die Teil eines aromatischen Ringes sind.
Bevorzugte Isocyanate mit aromatisch gebundenen Isocyanatgruppen sind Toluylendiisocyanat (TDI), Methylendiphenylisocyanat (MDI) und Naphthylendiisocyanat.
Der Begriff „Toluylendiisocyanat" bezeichnet Toluylen-2,4-diisocyanat (2,4-TDI), Toluylen-2,6- diisocyanat (2,6-TDI) sowie beliebige Gemische der beiden Isomere. Der Begriff „Methylendiphenylisocyanat" bezeichnet alle Isomeren des MDI, insbesondere 2,2'- Diphenylmethandiisocyanat, 2,4'-Diphenylmethandiisocyanat, 4,4'-Diphenylmethandiisocyanat, alle Gemische, die wenigstens zwei der vorgenannten Isomere enthalten, sowie mehrkernige Derivate des MDI.
Der Begriff „Naphthylendiisocyanat" bezeichnet, 1,4-Naphthylendiisocyanat, 1,5- Naphthylendiisocyanat und 1,6-Naphthylendiisocyanat sowie beliebige Gemische der vorgenannten Isomere.
Dem Fachmann ist bewusst, dass alle oben genannten Polyisocyanate auch als Oligomere vorliegen können, so dass die zu spaltende Urethanbindung zwischen einem oligomeren Polyisocyanat, das auf einem der oben genannten monomeren Diisocyanate basiert, und einem Alkohol ausgebildet ist. Der Begriff „Oligomeres Polyisocyanat" bezeichnet Polyisocyanat, die aus wenigstens zwei der oben genannten Diisocyanate aufgebaut sind. Die oligomeren Polyisocyanate können erfindungsgemäß insbesondere Uretdion-, Isocyanurat-, Allophanat-, Biuret-, Iminooxadiazindion- und/oder Oxadiazintrionstruktur aufweisen. Bevorzugt weisen die oligomeren Polyisocyanate mindestens eine der folgenden oligomeren Strukturtypen oder deren Gemische auf:
Uretdion Isocyanurat Allophanat Biuret Iminooxadiazindion Oxadiazintrion
Bevorzugte Substrate der Urethanase der vorliegenden Erfindung sind Urethane, die aus den oben definierten aromatischen Polyisocyanaten erhalten werden können.
Enzymatische Spaltung
Der Begriff „enzymatische Spaltung einer Urethangruppe" kennzeichnet, dass die oben beschriebene Spaltung einer Urethangruppe in Anwesenheit eines Polypeptids mit Urethanaseaktivität schneller abläuft als bei Inkubation mit dem Reaktionspuffer ohne Enzym unter denselben Reaktionsbedingungen oder bei Inkubation mit dem Reaktionspuffer unter denselben Bedingungen in Anwesenheit eines inaktiven Polypeptids. Als Modell für ein inaktives Polypeptid ist bovines Serumalbumin bevorzugt. Wenn in Anwesenheit eines zu testenden Polypeptids die Spaltung der Urethangruppe schneller abläuft als in einer ansonsten identischen Kontrolle mit BSA, besitzt besagtes Polypeptid Urethanaseaktivität wie in dieser Anmeldung verstanden.
Nukleinsäure
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid wie in SEQ. ID NO.: 1, 2 oder 3 definiert oder eine der oben definierten Varianten dieser Polypeptide kodiert, wobei das kodierte Polypeptid Urethanaseaktivität aufweist. Bevorzugt steht die kodierende Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines Promotors, der die Expression des Polypeptids in einem Pilz, einer Hefe oder einem Bakterium ermöglicht.
Verwendung In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz aufweist wie durch SEQ ID NO.: 1, 2 und 3 definiert, oder einer der oben in dieser Anmeldung definierten Varianten dieser Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid Urethanaseaktivität aufweist, zur enzymatischen Spaltung von Urethanbindungen.
Alle oben gegebenen Definitionen gelten - soweit nicht explizit anders definiert - auch für diese Ausführungsform. Die Verwendung besteht vorzugsweise darin, dass das erfindungsgemäße Enzym mit einer Verbindung, die wenigstens eine Urethanbindung enthält, in Kontakt gebracht wird. Dies geschieht vorzugweise unter Bedingungen, unter denen das Enzym seine Urethanaseaktivität zeigt. Solche Bedingungen können den Ausführungsbeispielen dieser Anmeldung entnommen werden. Darüber hinaus ist der Fachmann ohne Probleme in der Lage, durch einfache Reihenversuche die Reaktionsbedingungen in einem System wie z.B. Temperatur, lonenstärke, Lösungsmittel und pH-Wert so anzupassen, dass das Enzym aktiv ist.
Für die erfindungsgemäße Urethanase liegt die Temperatur bei der Verwendung vorzugsweise im Bereich zwischen 10 °C und 70 °C. Hierbei wird ein höherer Temperaturbereich zwischen 30 °C und 70 °C bevorzugt, wenn die Reaktionsgeschwindigkeit wichtiger ist als die Stabilität des Enzyms. Umgekehrt wird ein Temperaturbereich zwischen 10 °C und 40 °C bevorzugt, wenn die Reaktionsgeschwindigkeit von geringerer Bedeutung ist.
Der pH liegt bei der Verwendung der durch SEQ ID NO. 1 und 2 definierten Urethanasen und ihrer Varianten vorzugsweise zwischen 7 und 12, stärker bevorzugt zwischen 7 und 11 und am stärksten bevorzugt zwischen 8 und 11. Bei der Verwendung der durch SEQ ID NO.: 3 definierten Urethanase oder einer ihrer Varianten liegt der pH vorzugsweise zwischen 7 und 12, stärker bevorzugt zwischen 7 und 11 und am stärksten bevorzugt zwischen 9 und 11.
Spaltung niedermolekularer Urethane
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren enthaltend den Verfahrensschritt der Behandlung eines niedermolekularen Urethans mit einem Polypeptid, welches Urethanaseaktivität aufweist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem durch SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 definierten Polypeptid und den oben in dieser Anmeldung definierten Varianten dieser Polypeptide, wodurch das niedermolekulare Urethan gespalten wird.
Der Begriff „niedermolekular" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das Urethan höchstens vier, bevorzugt höchstens drei, stärker bevorzugt höchstens eine oder zwei Urethangruppen enthält. Bevorzugt basieren die Strukturen der niedermolekularen Urethane formal auf der Ausbildung einer oder mehrerer Urethanbindungen zwischen einem Polyisocyanat und einem oder mehrerer niedermolekularer Alkohole.
Hierbei sind jene Polyisocyanate bevorzugt, die bereits weiter oben als Partner der durch die erfindungsgemäßen Urethanasen zu spaltenden Urethanbindungen genannt wurden. Aromatische Polyisocyanate, insbesondere Toluylen-2,4-diisocyanat (2,4-TDI), Toluylen-2,6-diisocyanat (2,6-TDI), 2,2'-Diphenylmethandiisocyanat (2,2'-MDI), 2,4'-Diphenylmethandiisocyanat (2,4'-MDI), 4,4'- Diphenylmethandiisocyanat (4,4'-MDI), die mehrkernigen Derivate der vorgenannten Diphenylmethandiisocyanate, 1,4-Naphthylendiisocyanat, 1,5-Naphthylendiisocyanat und 1,6- Naphthylendiisocyanat sind hierbei besonders bevorzugt.
Grundsätzlich ist als niedermolekularer Alkohol jede Verbindung mit wenigstens einer Hydroxylgruppe pro Molekül geeignet. Bevorzugt hat er ein Molekulargewicht von höchstens 700 g/Mol, stärker bevorzugt von höchstens 500 g/Mol und am stärksten bevorzugt von höchstens 200 g/Mol.
Weiterhin sind niedermolekulare Alkohole mit einer höheren Polarität bevorzugt. Besonders bevorzugt enthält der niedermolekulare Alkohol eine oder zwei Hydroxylgruppen pro Molekül. Der niedermolekulare Alkohol hat darüber hinaus bevorzugt einen Schmelzpunkt von höchstens 45 °C, stärker bevorzugt von höchstens 20 °C.
Stärker bevorzugt sind folglich Alkohole mit zwei Hydroxylgruppen, einem Molekulargewicht von höchstens 500 g/Mol und einem Schmelzpunkt von höchstens 45 °C.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der niedermolekulare Alkohol ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Diethylenglykol, Propylenglykol, Dipropylenglykol, Methylglykol, Triethylenglykol, Glycerin, 2-Methyl-l,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, 1,5-Pentandiol, 1,6-Hexandiol und Polyethylenglykol 400. Stärker bevorzugt ist er ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Diethylenglykol, Propylenglykol, Dipropylenglykol, Methylglykol und Triethylenglykol. Ganz besonders bevorzugt ist der niedermolekulare Alkohol Diethylenglykol.
Ein für das erfindungsgemäße Verfahren besonders bevorzugtes niedermolekulares Urethan ist durch Ausbildung einer Urethanbindung zwischen einem der im vorangehenden Abschnitt genannten niedermolekularen Alkohole, insbesondere Diethylenglykol, und erhältlich.
Die niedermolekularen Urethane können auf unterschiedliche Weisen erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Esterbindungen eines Polyester-Polyurethans gespalten, so dass Carbonsäuren und niedermolekulare Urethane freigesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Spaltung der Estergruppen erfolgt vorzugsweise enzymatisch. Hierbei werden bevorzugt Lipasen (EC 3.1.1.3) oder Cutinasen (EC 3.1.1.74) eingesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bevorzugt um solche niedermolekularen Urethane, die durch die chemische Spaltung eines Polyether- oder Polyester-Polyurethans erhalten werden. Bei dieser chemischen Spaltung handelt es sich vorzugweise um eine sogenannte „Alkoholyse" oder „Glykolyse" bei der das Polyether- oder Polyester-Polyurethan mit einem der oben genannten niedermolekularen Alkohole zur Reaktion gebracht, so dass die Etherkomponente des Polyether-Polyurethans bzw. das Polyesterpolyol eines Polyester-Polyurethans durch den niedermolekularen Alkohol ersetzt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform zur Bereitstellung von niedermolekularen Urethanen aus Polyether-Polyurethanen ist in WO 2021/032513 beschrieben. In diesem Verfahren werden Polyetherpolyurethane mit einem niedermolekularen Alkohol so umgesetzt, dass die Polyetherkomponente des Polyetherpolyurethans freigesetzt wird und eine Urethanbindung zwischen dem verwendeten niedermolekularen Alkohol und den zum Aufbau des Polyether-Polyurethans verwendeten Isocyanaten ausgebildet wird. Somit handelt es sich bei den erfindungsgemäß zu spaltenden niedermolekularen Urethanen um Verbindungen, die formal durch Bildung einer Urethanbindung zwischen einem Polyisocyanat, bevorzugt einem der weiter oben in dieser Anmeldung aufgeführten aliphatischen, aromatischen, araliphatischen oder cycloaliphatischen Polyisocyanate, und einem niedermolekularen Alkohol erhalten werden.
Polyester-Polyurethan
Der Begriff „Polyester-Polyurethan" bezeichnet ein Polyurethan, dessen Polyolkomponente Polyesterpolyole enthält. Bevorzugt sind wenigstens 40 Gew.-% der in der Polyolkomponente enthaltenen Hydroxylgruppen Bestandteile von Polyesterpolyolen. Stärker bevorzugt sind dies wenigstens 60 Gew.-%, noch stärker bevorzugt wenigstens 80 Gew.-% und am stärksten bevorzugt wenigstens 95 gew.-%. Das Polyester-Polyurethan kann geschäumt oder nicht geschäumt vorliegen.
Das Polyester-Polyurethan enthält als Isocyanatkomponente wenigstens ein aromatisches, aliphatisches oder cycloaliphatisches Isocyanat. Bevorzugt enthält das Polyurethan aromatische Isocyanate. Das wenigstens eine aromatische Polyisocyanat ist besonders bevorzugt aus der weiter oben gegebenen Liste ausgewählt.
Der Begriff „Polyesterpolyol" ist dem Fachmann bekannt, es handelt sich um Polyester, die im Durchschnitt pro Molekül wenigstens 1,5, bevorzugt wenigstens 1,8 und stärker bevorzugt wenigstens 2,0 Hydroxylgruppen enthalten. Besonders bevorzugt weisen die in dem abzubauenden Polyurethan enthaltenen Polyesterpolyole Funktionalität zwischen 1,5 und 6,0 auf. Sie enthalten als Aufbaukomponenten aromatische und/oder aliphatische Polyole sowie aromatische und/oder aliphatischen Polycarbonsäuren in beliebiger Kombination. Ebenfalls bevorzugt sind Polyesterpolyole, die durch Ringöffnungspolymerisation eines Lactons erhalten werden.
Polyether-Polyurethan
Der Begriff „Polyether-Polyurethan" bezeichnet ein Polyurethan, dessen Polyolkomponente Polyetherpolyole enthält. Bevorzugt sind wenigstens 40 Gew.-% der in der Polyolkomponente enthaltenen Hydroxylgruppen Bestandteile von Polyetherpolyolen. Stärker bevorzugt sind dies wenigstens 60 Gew.-%, noch stärker bevorzugt wenigstens 80 Gew.-% und am stärksten bevorzugt wenigstens 95 Gew.-%. Es ist erfindungsgemäß möglich, dass ein Polyetherpolyurethan unter Einhaltung der vorgenannten Mengenanteile der Polyetherpolyole auch noch weitere Polyole als Aufbaukomponenten enthält. Dies sind vorzugsweise Polyesterpolyole.
Der Begriff „Polyetherpolyol" ist dem Fachmann gut bekannt. Hierbei handelt es sich um Polyether mit einer durchschnittlichen Hydroxylfunktionalität zwischen 1,5 und 6,0. Bevorzugt ist das im Polyetherpolyurethan enthaltene Polyetherpolyol ein Polyadditionsprodukt eines oder mehrerer Alkylenoxide mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen unter Verwendung mindestens eines Startermoleküls, das 2 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6, reaktive Wasserstoffatome gebunden enthält.
Bevorzugte Alkylenoxide sind Styroloxid, Ethylenoxid, Propylenoxid, Tetrahydrofuran, Butylenoxid, Epichlorhydrin. Stärker bevorzugt sind 1,3-Propylenoxid, 1,2- bzw. 2,3-Butylenoxid und Styroloxid. Besonders bevorzugt sind Ethylenoxid und 1,2-Propylenoxid. Die Alkylenoxide können einzeln, alternierend nacheinander oder als Mischungen verwendet werden.
Die „Behandlung" des niedermolekularen Urethans erfolgt unter Bedingungen, unter denen das eingesetzte Enzym Urethanaseaktivität zeigt. Unter diesen Bedingungen entstehen als Reaktionsprodukte der enzymatischen Spaltung des niedermolekularen Urethans ein niedermolekularer Alkohol bzw. ein Gemisch niedermolekularer Alkohole und ein Amin oder ein Gemisch von Aminen. Die chemische Struktur der entstehenden Amine ist von der Art des zur Synthese des Urethans eingesetzten Polyisocyanats abhängig. Es werden Amine freigesetzt, die von den eingesetzten Polyisocyanaten durch Anlagerung von Wasser und nachfolgende Abspaltung von CO2 abgeleitet werden können.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung wenigstens eines der erfindungsgemäßen Polypeptide zur Spaltung einer Urethanbindung in niedermolekularen Urethanen. Abbau von Polyester-Urethanen in niedermolekulare Abbauprodukte
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Abbau von Polyester-Polyurethanen in niedermolekulare Abbauprodukte enthaltend die Schritte a) Spaltung der im Polyester-Polyurethan enthaltenen Estergruppen; und b) Behandlung des Polyurethans mit einem Polypeptid, welches Urethanaseaktivität aufweist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden wie in SEQ. ID NO.: 1, 2 und 3 definiert und den oben in dieser Anmeldung definierten Varianten dieser Polypeptide; mit der Maßgabe, dass die Verfahrensschritte a) und b) in beliebiger Reihenfolge oder auch gleichzeitig durchgeführt werden können.
Vorzugsweise wird der Verfahrensschritt a) vor dem Verfahrensschritt b) durchgeführt.
Soweit nicht anders angegeben gelten alle weiter oben in dieser Anmeldung gegebenen Definition auch für diese Ausführungsform. Dies gilt insbesondere für die Behandlung des Polyurethans mit einer Urethanase in Verfahrensschritt b).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Verfahrensschritt a) mit einer Lipase oder Cutinase durchgeführt. Stärker bevorzugt wird eine Lipase verwendet, die in der Lage ist, Tributyrin zu spalten. Verfahrensschritt a) wird vorzugsweise unter Reaktionsbedingungen durchgeführt, bei denen die verwendete Lipase oder Cutinase Aktivität zeigt. Solche Bedingungen können durch Routineexperimente mit gängigen biochemischen Methoden bestimmt werden.
In einer anderen, ebenfalls bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Verfahrensschritt a) chemisch.
Das Polyurethan enthält als Isocyanatkomponente wenigstens ein aromatisches, aliphatisches oder cycloaliphatisches Isocyanat. Bevorzugt enthält das Polyurethan aromatische Isocyanate.
Die niedermolekularen Abbauprodukte der polyesterbasierten Polyurethane weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht von höchstens 1.000 g/mol auf. Es handelt sich vorzugsweise um
(i) Amine, die von den bei der Herstellung des betreffenden Polyurethans eingesetzten Isocyanaten abgeleitet sind, Beispielsweise im Falle von 2,4- Toluylendiisocyanat um das 2,4- Toluylendiamin; und (ii) Alkohole und Carbonsäuren, die zum Aufbau der für die Synthese des betreffenden Polyurethans eingesetzten Polyesterpolyole eingesetzt wurden.
Unter einem „Polyol", das in dem in diesem Abschnitt definierten Verfahren als niedermolekulares Abbauprodukt entsteht, wird in dieser Anmeldung jede Verbindung mit wenigstens zwei Hydroxylgruppen verstanden. Besagtes Polyol hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von höchstens 300 g/mol. Bevorzugte Polyole, die niedermolekulare Abbauprodukte der polyesterbasierten Polyurethane sind, sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Diethylenglykol, Triethylenglykol, Propylenglykol, 1,3-Pentandiol, 1,4-Butandiol, 1,6,-Hexandiol, 1,2-Di-Propylenglykol, Neopentylglykol, Glycerin, 1,1,1-Trimethylolpropan, Saccharose, Sorbitol und Pentaerythritol.
Unter einer „Polycarbonsäure", die in dem in diesem Abschnitt definierten Verfahren als niedermolekulares Abbauprodukt entsteht, wird in dieser Anmeldung jede Verbindung verstanden, die wenigstens zwei Carboxylgruppen enthält. Besagte Polycarbonsäure hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von höchstens 300 g/mol. Bevorzugte Polycarbonsäuren, die niedermolekulare Abbauprodukte der polyesterbasierten Polyurethanschäume sind, sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Itakonsäure, Phthalsäure, Isophthalsäure, Terephthalsäure und Benzoltricarbonsäure.
Unter einem „Polyamin", das in dem in diesem Abschnitt definierten Verfahren als niedermolekulares Abbauprodukt entsteht, wird in dieser Anmeldung jede Verbindung verstanden, die wenigstens zwei Aminogruppen enthält. Besagtes Polyamin hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von höchstens 300 g/mol. Bevorzugte Polyamine, die niedermolekulare Abbauprodukte der polyesterbasierten Polyurethanschäume sind, sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 4,4'- Diaminodiphenylmethan, 2,4'-Diaminodiphenylmethan, 2,2'-Diaminodiphenylmethan, den mehrkernigen Derivate der vorgenannten Diaminodiphenylymethanverbindungen, 2,4-
Toluylendiamin, 2,6-Toluylendiamin, 1,4-Naphthylendiamin, 1,5-Naphthylendiamin, 1,6-
Naphthylendiamin, Hexamethylendiamin, Isophorondiamin, Xylylendiamin, Pentamethylendiamin, para-Phenylendiamin, Butyldiamin und H12-Methylendiamin. Besonders bevorzugt sind die Polyamine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 4,4'-Methylendiamin, 2,4'-Methylendiamin, 2,2'- Methylendiamin, 1,5-Naphthylendiamin, 2,4-Toluylendiamin und 2,6- Toluylendiamin.
Abbau von Polyether-Polyurethan
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren enthaltend die Schritte a) Umurethanisierung eines Polyetherpolyurethans mit wenigstens einem niedermolekularen Alkohol, wobei Polyetherpolyole und niedermolekulare Urethane entstehen; und b) die enzymatische Spaltung der in Verfahrensschritt a) entstandenen niedermolekularen Urethane mit einem Polypeptid, welches Urethanaseaktivität aufweist, und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden wie in SEQ. ID NO.: 1, 2 und 3 definiert und den oben in dieser Anmeldung definierten Varianten dieser Polypeptide.
Der Verfahrensschritt a) hat zwei Ziele: (i) Das zur Synthese des Polyurethans verwendete Polyetherpolyol soll als isolierbare Verbindung aus dem Polyurethan freigesetzt werden, (ii) Das zur Synthese des Polyurethans verwendete Isocyanat soll als Bestandteil eines niedermolekularen Urethans vorliegen. Das besagte niedermolekulare Urethan ist - im Gegensatz zum Polyurethan mit seinem hohen Molekulargewicht - durch sein geringeres Molekulargewicht und die dadurch bessere Löslichkeit als Substrat für die in Verfahrensschritt b) erfolgende enzymatische Spaltung gut geeignet.
Soweit nicht anders angegeben gelten alle weiter oben in dieser Anmeldung gegebenen Definition auch für diese Ausführungsform. Dies gilt insbesondere für die enzymatische Spaltung der niedermolekularen Urethane in Verfahrensschritt b).
In Verfahrensschritt b) werden durch enzymatische Spaltung der niedermolekularen Urethane ein Amin und der in Verfahrensschritt a) zur Umurethanisierung eingesetzte niedermolekulare Alkohol freigesetzt. Zusätzlich wird in diesem Verfahrensschritt CO2 freigesetzt. Diese Verbindungen können durch geeignete Trennungsverfahren isoliert und anschließend weiter verwendet werden. Hierbei ist es bevorzugt, den freigesetzten niedermolekularen Alkohol erneut für die in Verfahrensschritt a) erfolgende Umurethanisierung einzusetzen. Das freigesetzte Amin steht als reiner und gut definierter Ausgangsstoff für neue Synthesen zur Verfügung.
Die grundsätzlich geeigneten Reaktionsbedingungen und Katalysatoren für die Umurethanisierung in Verfahrensschritt a) sind in Simon et al. (2018), Waste Management, 76: 147-171 beschrieben. Verfahrensschritt a) wird bei Temperaturen zwischen 140 °C und 300 °C, bevorzugt zwischen 160 °C und 270 °C durchgeführt. Das Gewichtsverhältnis des niedermolekularen Alkohols zum Polyetherurethan liegt zwischen 2 : 1 und 1 : 17. Als Katalysator eignen sich insbesondere Alkalimetall- Hydroxide, Erdalkalimetallhydroxide, Alkalimetallsalze von Carbonsäuren (insbesondere Acetate), Erdalkalimetallsalze von Carbonsäure (insbesondere Acetate), Lewis-Säuren (wie insbesondere Dibutylzinndilaurat), organischen Amine (wie insbesondere Diethanolamin), organometallische Verbindungen (wie insbesondere Titantetrabutanolat) und Zinnverbindungen (wie insbesondere Zinnoctoat). Die Umurethanisierung wird bevorzugt bei Temperaturen im Bereich von 160 °C bis 270 °C in Gegenwart von 0,1 Massen-% bis 5 Massen-% Katalysator, bezogen auf die Masse des zugegebenen Polyurethanprodukts, durchgeführt.
Abbildung 1 zeigt: Genutzte Enzymsubstrate. pNPB: 4-Nitrophenylbutyrate; ENPC: Ethyl-4- nitrophenylcarbamate; MDA-BA: Carbamat von 4,4'-MDI reagiert mit Benzylalkohol; TDA-Ethoxyethanol: Carbamat von Toluoldiisocyanat (TDI) reagiert mit Ethoxyethanol; TDA-DEG: Carbamat von TDI reagiert mit Diethylenglykol; NDA-MEG: Carbamat von NDI reagiert mit Ethylenglykol; EMACC: Carbamat aus der Reaktion von 7-Amino-4-methylcoumarin mit Ethylchlorformiat.
Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen nur dazu, die Erfindung zu erläutern. Sie sollen den Schutzumfang der Patentansprüche in keiner Weise beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Aktivitätsbestimmung mit EMACC
Enzymherstellung
Urethanasegene wurden in den pET-26-Expressionsvektor direkt hinter die Ndel-Schnittstelle kloniert. E. coli BL21(DE3) wurden zur Expression mit den entsprechenden Plasmiden transformiert. Eine Einzelkolonie wurde zur Inokulation der Übernachtkultur in LB-Medium mit 1% (w/v) Glukose und 50 pg/mL Kanamycin verwendet. Für die Hauptkultur wurden 200 ml ZYP-5052 mit 50 pg/mL Kanamycin mit 1 mL der Übernachtkultur angeimpft und für 4 h bei 37 °C bei 100 rpm in Schikanekolben inkubiert. Anschließend wurde die Temperatur auf 20 °C reduziert, bevor die Kulturen durch Zentrifugation für 20 min bei 4500 g und 4 °C geerntet wurden. Zellpellets wurden bis zur Reinigung der Proteine bei -20 °C gelagert.
Zur Reinigung wurden 15 mL Lysepuffer (50 mM Natriumphosphat (NaPi), pH 8,0, 300 mM NaCI, 10 mM Imidazol) zum Zellpellet gegeben. Der Aufschluss erfolgte per Ultraschall auf Eis über zwei Zyklen (3 min, 50% pulse, 50% Power). Zur Klärung des Lysates wurde bei 10.000 g und 4 °C für 40 - 60 min zentrifugiert. Die Überstände wurden bis zum Beladen der IMAC-Säule auf Eis gelagert.
IMAC-Harz (1 ml, ROTI®Garose His Beads, Nickel-Form) wurde mit Lysepuffer equilibriert. Anschließend wurde das Lysat auf die Säulen aufgetragen gefolgt von einem Waschschritt mit mindestens zehn Säulenvolumen Waschpuffer (50 mM NaPi, pH 8,0, 300 mM NaCI, 20 mM Imidazol). Anschließend wurden die Proteine mit 15 mL Elutionspuffer (50 mM NaPi, pH 8,0, 300 mM NaCI, 250 mM Imidazol) eluiert. Das Volumen der Elutionsfraktion wurde über Vivaspin-20- Ultrafiltrationseinheiten (10 kDa MWCO) auf 2,5 mL reduziert. Anschließend wurden die Proteine unter Verwendung von PDIO-Säulen in Lagerpuffer (10 mM NaPi, pH 8,0, 100 mM NaCI) umgepuffert.
EMACC Assay
Zur Bestimmung der Urethanaseaktivität wurde ein fluorogenes Substrat aus 7-Amino-4- methylcoumarin (AMC) und Ethylchlorformiat synthetisiert. Das so gebildete Ethylcarbamat von AMC (EMACC) lag als feines Pulver vor. Die Bestimmung der spezifischen Aktivität erfolgte unter Standardbedingungen (50 mM NaPi, pH 8,0, 30 °C, 100 pM EMACC). EMACC wurde aus einem 50 mM Stock in DMSO frisch zugegeben. Gereinigte Urethanasen wurden vor der Zugabe zum Assay in Lagerpuffer verdünnt, sodass sich ein linearer Anstieg der Absorption bei 365 nm über 10 - 30 min ergab. Die Messung erfolge in 96-well-Platten in einem auf 30 °C vorgeheizten Plattenphotometer und die spezifische Aktivität wurde aus dem linearen Anstieg der Absorption in den ersten Minuten berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Spezifische Aktivität der Urethanase gegenüber EMACC
Beispiel 2: Screening gegenüber weiteren Substraten
Enzymherstellung
Für die Herstellung der Enzympräparate wurden jeweils 4,5 mL LB-Medium mit 1 % (w/v) Glucose mit Einzelkolonien von E. coli BL21(DE3) pET26b_UMG-8 bzw. BL21(DE3) pET26b_UMG-11.2 oder BL21(DE3) pET26b_UMG-16 inokuliert und über Nacht bei 37 °C und 200 rpm im Inkubationsschüttler inkubiert. Sämtliche Kulturen wurden mit 50 pg/mL Kanamycin versetzt. Anschließend wurden jeweils 200 mL ZYP-5052 Medium mit 200 pL der Übernachtkulturen inokuliert. Die Kultivierung erfolgte für 4 h bei 37°C und 200 rpm gefolgt von 24 h bei 20°C und 200 rpm im Inkubationsschüttler. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 20.425 g und 4 °C für 20 min in der Großraumzentrifuge abgetrennt. Die Zellpellets wurden in jeweils 6 mL Aufschlusspuffer (20 mM Ammoniumacetat, 0,4 % n-Dodedecyl- ß-Maltosid, 1 % Lysozym, 1 pL/mL Benzonase (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen)) suspendiert und für 30 min bei Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler inkubiert. Anschließend wurde die Ganzzellextraktlösung bei -80 °C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde bei 4 °C gelagert.
Enzymreaktionen
Die Substrate ENPC, MDA-BA, NDA-MEG, TDA-Ethoxyethanol und TDA-DEG wurden aus den entsprechenden Isocyanaten und Alkoholen synthetisiert indem die Isocyanate mit einem Überschuss an Alkohol zur Reaktion gebracht wurden. Zur Bestätigung der Aktivität der Urethanasen wurden EMACC und 4-Nitropenylbutyrat (pNPB) genutzt. Die Enzymsubstrate sind in Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden, dargestellt.
Je eine Spatelspitze (~3 mg) der lyophilisierten Ganzzellextrakte wurde in 800 pL 100 mM KPi mit 100 mM NaCI pH 7,5 suspendiert. Die Enzymlösung wurde 1:10 in das Reaktionsgemisch verdünnt, welches den gleichen Puffer enthielt. Es wurden Substrat-Stocks der Carbamate mit einer Konzentration von 5 - 340 mg/mL in DMSO hergestellt. Diese wurden 1:10 in das Reaktionsgemisch verdünnt, sodass die DMSO-Endkonzentration bei 10 % (v/v) lag. Die Ansätze wurden mit einem Gesamtvolumen von 500 pL hergestellt. Die Inkubation erfolgte für einen Tag bei 30°C und 800 - 1000 rpm gefolgt von einen Tag bei 40°C und 800- 1000 rpm im Thermoschüttler. Nach der Inkubation wurde zur Verbesserung der Löslichkeit von Substraten und Produkten 500 pL Acetonitril zugesetzt. Die Proben wurden durch Zentrifugation durch eine 0,2 pm PVDF-Filterplatte filtriert und für die HPLC- Analytik eingesetzt. Für die Substrate EMACC und pNPB lag das Gesamtvolumen der Reaktion bei 200 pL und die Fluoreszenz (EMACC, Anregung 365 nm, Emission 440 nm) bzw. Absorption (pNPB, 410 nm) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten im Plattenphotometer Varioskan Lux (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA) gemessen.
H PLC -Analytik
Die Hochdruckflüssigchromatographie wurde an einem Gerät der 1260 Infinity II Serie von Agilent Technologies (Santa Clara, USA) mit Multisampler und DAD {diode array detector) für UV und den sichtbaren Bereich des Lichtes durchgeführt. Für alle Messungen wurde die Säule „Zorbax Eclipse Plus- CIS" mit einer Partikelgröße von 5 pm und den Abmessungen 4,6 x 150 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) mit entsprechender Vorsäule verwendet. Bei allen Methoden wurden 5 pL Probe injiziert und die Säule auf 40 °C temperiert. Der Fluss lag generell bei 1,0 mL/min.
Zur Detektion von aromatischen Aminen wurde die Methode „ER_Juni2021-2" verwendet. Aromatische Amine konnten wegen der hohen Eigenabsorption ohne Derivatisierung mit dieser Methode bei 210 nm und 232 nm quantifiziert werden. Als Laufmittel A wurde ddHjO mit 5 % (v/v) Acetonitril und als Laufmittel B wurde Acetonitril mit 5 % (v/v) ddHjO verwendet. Die Analyse der Daten erfolgte mit der Software „OpenLAB CDS 2.4" in der Version 2.204.0.661 (Agilent Technologies, Santa Clara, USA).
Tabelle 2: HPLC-Gradient
Ergebnisse
Die Klassifizierung der hydrolytischen Aktivität der Urethanasen gegenüber den getesteten Carbamaten erfolgte anhand der Peakfläche der gebildeten Produkte im Chromatogramm in die Kategorien keine Aktivität (-), wenig Aktivität (+), mittlere Aktivität (++) und hohe Aktivität (+++). Es zeigte sich, dass die Urethanase UMG-8, UMG11.2 und UMG 16 ein breites Spektrum an Substraten akzeptieren. Die getesteten Substrate sind in Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden, dargestellt. Tabelle 3: Aktivität der Urethanase gegenüber verschiedenen Carbamaten. Aktivität ist in die Kategorien „keine Aktivität" (- ), „ wenig Aktivität" (+), „mittlere Aktivität" (++) und „hohe Aktivität" (+++) anhand der HPLC-Peakfläche eingeteilt.
Beispiel 3: Optimierung der Reaktionsbedingungen
Zur Bestimmung der pH-Optima wurde Enzymaktivität analog zu Beispiel 1 bestimmt, mit der Anpassung, dass die Reaktion in verschiedenen Puffern (100 mM) durchgeführt wurde. Es wurden Puffer mit pH 4,0, 5,0 und 6,0 (Citrat), 7,0, 8,0 und 9,0 (Bis-Tris-Propan) und 10,0 (CHES) verwendet. Für die pH-Werte 10, 11, 12 und 13 wurde ein Puffer aus 100 mM Natriumphosphat und 100 mM Natriumcarbonat und abweichend von Beispiel 1 mit 200 mM EMACC und 10% (v/v) DMSO verwendet. Temperaturoptima wurden bestimmt, indem die Freisetzung von AMC aus 100 pM EMACC in 50 mM NaPi (pH 8,0) bei 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 und 70 °C gemessen wurde. Die Lösemittelstabilität wurde bestimmt, indem die Hydrolyse von EMAC unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen bei 0, 10, 20, 30, 40 und 50 % (v/v) DMSO quantifiziert wurde. Die hier bestimmten Aktivitätsoptima für pH, Temperatur und DMSO-Konzentration sind in
Tabelle 4 zusammengefasst. Die Abhängigkeit der Aktivität ist in
Tabelle 4: Optimale Reaktionsbedingungen für Urethanase.
Tabelle 5: Abhängigkeit der Aktivität der Urethanase vom pH-Wert. In beiden Datensets war die Aktivität bei pH 10 am höchsten, sodass auf diesen Wert normiert wurde. Die Aktivitätsdaten von pH 12 und pH 13 wurden nicht dargestellt, da die Fluoreszenz von AMC nur im Bereich zwischen pH 3 und pH 12 konstant ist.
Temperaturstabilität
Zur Ermittlung der Langzeit-Temperaturstabilität wurden Lösungen der gereinigten Urethanasen mit einer Proteinkonzentration von 0,5 mg/mL in 100 mM KPi pH 7,5 hergestellt. Jeweils 100 pL wurden im Thermocycler Biometra TAdvanced Basis (Analytik Jena GmbH, Jena) bei 20°C, 25,7 °C, 29,4 °C, 36,9 °C, 40,6 °C, 44,3 °C und 50 °C für 12 h und anschließend bis zur Aktivitätsmessung bei 4°C inkubiert. Die Deckelheizung wurde auf 99°C temperiert. Eine Referenzprobe wurde bei 4 °C inkubiert. Die Restaktivität der Enzyme wurde mittels pNPB-Assay bestimmt. Dazu wurden 21 pL pNPB mit 4,979 mL DMSO vermischt. Diese Lösung wurde 1:10 in 100 mM KPi pH 7,5 verdünnt. 20 pL Enzymlösung (UMG-8 1:5 in 100 mM KPi pH 7,5 verdünnt, UMG-11.2 1:20 in 100 mM KPi pH 7,5 verdünnt, UMG-16 1:20 in 100 mM KPi pH 7,5 verdünnt) wurden in einer Mikrotiterplatte vorgelegt und die Reaktion wurde durch Zugabe von 180 pL pNPB in 100 mM KPi pH 7,5 mit 10 % DMSO gestartet. Bei der Hydrolyse des pNPBs durch die Urethanasen wird para-Nitrophenol frei, welches durch die Messung der Absorption bei 410 nm im Plate Reader Varioskan Lux (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA) quantifiziert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6: Spezifische Aktivität der Urethanase gegenüber pNPB in U/mg nach Inkubation für 12 h bei 20° C, 25, 7 °C, 29,4 °C, 36,9 °C, 40,6 °C, 44,3 °C und 50 °C und bei 4 °C als Referenz.

Claims

Patentansprüche
1. Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat wie durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definiert, oder eine Variante davon, wobei die Variante durch die Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 15 % der im jeweiligen durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Polypeptid enthaltenen Aminosäuren erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid Urethanaseaktivität aufweist.
2. Verwendung eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, das eine Aminosäuresequenz hat wie durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definiert, oder einer Variante eines dieser Polypeptide, wobei die Variante durch die Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 15 % der im jeweiligen durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Polypeptid enthaltenen Aminosäuren erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid Urethanaseaktivität aufweist, zur enzymatischen Spaltung von Urethanbindungen.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei die Urethangruppe aromatisch gebunden ist.
4. Nukleinsäure, die ein Polypeptid wie durch SEQ ID NO. 1, 2 oder 3 definiert oder eine Variante eines der vorgenannten Polypeptide kodiert, das Urethanaseaktivität aufweist, wobei die Variante durch die Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 15 % der im jeweiligen durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Polypeptid enthaltenen Aminosäuren erhalten wird.
5. Verfahren enthaltend den Verfahrensschritt der Behandlung eines niedermolekularen Urethans mit einem Polypeptid, welches Urethanaseaktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 definiert hat, oder mit einer Variante davon, wobei die Variante durch die Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 15 % der im jeweiligen durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Polypeptid enthaltenen Aminosäuren erhalten wird, wodurch das niedermolekulare Urethan gespalten wird.
6. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei wenigstens ein Polyamin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 4,4'-Diaminodiphenylmethan, 2,4'-Diaminodiphenylmethan, 2,2'- Diaminodiphenylmethan, den mehrkernigen Derivate der vorgenannten Diaminodiphenylymethanverbindungen, 2,4-Toluylendiamin, 2,6-Toluylendiamin, 1,4- Naphthylendiamin, 1,5-Naphthylendiamin und 2,6- Toluylendiamin entsteht.
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BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91 ) ISA/EP Das Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei ein Alkohol mit wenigstens zwei Hydroxylgruppen und einem Molekulargewicht von höchstens 700 g/Mol freigesetzt wird. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei wenigstens ein Alkohol ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Diethylenglykol, Propylenglykol, Dipropylenglykol, Methylglykol, Triethylenglykol, Glycerin, 2-Methyl-l,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, 1,5-Pentandiol, 1,6- Hexandiol und Polyethylenglykol 400 freigesetzt wird. Verwendung wenigstens eines Polypeptids, welches Urethanaseaktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definiert hat oder eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Sequenzidentität zu der vorgenannten Sequenz hat, zur Spaltung einer Urethanbindung in niedermolekularen Urethanen. Verfahren zum Abbau von Polyester-Polyurethanen in niedermolekulare Abbauprodukte enthaltend die Schritte a) Spaltung der im Polyester-Polyurethan enthaltenen Estergruppen; und b) Behandlung des Polyurethans mit einem Polypeptid, welches Urethanaseaktivität aufweist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden wie durch SEQ. ID NO.: 1, 2 und 3 definiert und Varianten dieser Polypeptide wobei die Varianten durch die Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 15 % der im jeweiligen durch SEQ ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Polypeptid enthaltenen Aminosäuren erhalten werden; mit der Maßgabe, dass die Verfahrensschritte a) und b) in beliebiger Reihenfolge oder auch gleichzeitig durchgeführt werden können. Verfahren enthaltend die Schritte a) Umurethanisierung eines Polyetherpolyurethans mit wenigstens einem niedermolekularen Alkohol, wobei Polyetherpolyole und niedermolekulare Urethane entstehen; und b) die enzymatische Spaltung der in Verfahrensschritt a) entstandenen niedermolekularen Urethane mit einem Polypeptid, welches Urethanaseaktivität aufweist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden wie durch SEQ ID NO.: 1, 2 und 3 definiert und Varianten dieser Polypeptide
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BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91 ) ISA/EP wobei die Varianten durch die Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 15 % der im jeweiligen durch SEQ. ID NO.: 1, 2 oder 3 definierten Polypeptid enthaltenen Aminosäuren erhalten werden.
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BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91 ) ISA/EP
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JPH09192633A (ja) 1995-05-15 1997-07-29 Rengo Co Ltd ウレタン化合物の分解方法および該化合物を分解する菌
JP3735918B2 (ja) 1996-01-24 2006-01-18 スズキ株式会社 エステラーゼ活性を有するポリウレタン分解用酵素液の調製方法
DE19706023A1 (de) 1997-02-17 1998-08-20 Bayer Ag Abbau von biologisch abbaubaren Polymeren mit Enzymen
JPH10271994A (ja) 1997-03-31 1998-10-13 Suzuki Motor Corp ポリウレタンエステラーゼをコードする遺伝子
JP2006055005A (ja) 2004-08-17 2006-03-02 Japan Science & Technology Agency 新規ウレタナーゼ遺伝子
AT512560B1 (de) 2012-03-12 2013-12-15 Eurofoam Gmbh Verfahren zur stofflichen Verwertung von Polyurethanen
PT3587570T (pt) 2018-06-21 2022-11-21 Covestro Deutschland Ag Uretanases inovadoras para a degradação enzimática de poliuretanos
CA3141437A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Covestro Intellectual Property Gmbh & Co. Kg Process for the decomposition of polyether-polyurethane

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