EP4466254A1 - Composé de phenazine pour mesurer l'efflux bacterien - Google Patents

Composé de phenazine pour mesurer l'efflux bacterien

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Publication number
EP4466254A1
EP4466254A1 EP23701710.8A EP23701710A EP4466254A1 EP 4466254 A1 EP4466254 A1 EP 4466254A1 EP 23701710 A EP23701710 A EP 23701710A EP 4466254 A1 EP4466254 A1 EP 4466254A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound
bacteria
propyl
efflux
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23701710.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Frédéric Brunel
Oliver SIRI
Serhii KRYKUN
Mrunal PATIL
Michel Camplo
Jean-Michel Bolla
Jean-Manuel Raimundo
Frédéric Garzino
Eric GARNOTEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Service de Sante des Armees
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Service de Sante des Armees
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aix Marseille Universite, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Service de Sante des Armees filed Critical Aix Marseille Universite
Publication of EP4466254A1 publication Critical patent/EP4466254A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D241/00—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings
    • C07D241/36—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D241/38—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atoms
    • C07D241/46—Phenazines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the invention relates to cyclic compounds, and in particular their use in the measurement of bacterial efflux.
  • efflux is a mechanism by which cells reject compounds that are toxic for their metabolism, such as antibiotics, heavy metals, drugs, etc., into the external environment.
  • Efflux is an active, energy-dependent transport mechanism provided by transmembrane proteins called efflux pumps.
  • One of the aims of the invention is to provide compounds and methods for measuring bacterial efflux.
  • Another object of the invention consists in proposing a method making it possible to evaluate the antibiotic resistance of bacteria.
  • X - is a halogen atom, or an acceptable counter ion, in particular Cl,
  • n being an integer varying from 1 to 3
  • i being an integer varying from 1 to 3 and where n+i varies from 1 to 4;
  • R1 is -C 4 H 7 and R2 is C 8 H 17 , and
  • R3 is a -CH 3 , or a C2-C8 alkyl, said C2-C8 alkyl possibly being substituted by one or more heteroatoms;
  • X- is a halogen atom, or an acceptable counter ion, in particular Cl,
  • R1 is a Cn+i alkyl
  • R2 is a Cn alkyl
  • R1 is a Cn alkyl
  • R2 is a Cn+i alkyl
  • n being an integer varying from 1 to 3
  • i being an integer varying from 1 to 3 and where n+i varies from 2 to 4;
  • R1 is C 4 H 9 and R2 is C 8 H 17 , and
  • R3 is -CH3, or C2-C8 alkyl, said C2-C8 alkyl possibly being substituted by one or more heteroatoms;
  • X - is a halogen atom, or an acceptable counter ion, in particular Cl,
  • n being an integer varying from 1 to 3
  • i being an integer varying from 1 to 3 and where n+i varies from 1 to 4;
  • R3 is a -CH 3 , or a C2-C8 alkyl, said C2-C8 alkyl possibly being substituted by one or more heteroatoms;
  • the invention is based on the surprising observation made by the inventors that the aforementioned compounds of formula I are colored and fluorescent compounds which are effectively effluxed by bacteria by means of the various efflux pumps, so that said compounds make it possible to measure bacterial efflux and to measure a potential resistance of said bacteria.
  • the compounds of formula I are phenaziniums, i.e. cationic protonated forms of phenazines. Alkylated forms of the phenaziniums of the invention are also contemplated.
  • X ⁇ is an acceptable and in particular pharmaceutically acceptable counter-anion, that is to say a counter-anion the use of which is compatible with animal or bacterial physiology.
  • Advantageous counter-anions are in particular counter-anions where X is a halogen atom such as F, Cl, Br or even I, the advantageous halogen being Cl. hexafluorophosphate (PF 6 - ) or even tetrafluoroborate (BF 4 - ).
  • R1 and R2 are -CH 3 or -C 4 H 9 groups
  • R1 and R2 are C1-C4 alkyls, i.e. C1, C2, C3 or C4 alkyls, preferably linear, such that R1 and R2 always have a difference carbon atom.
  • This is defined by the phase specifying that if R1 is Cn alkyl, R2 is a Cn+i alkyl, and if R1 is Cn+i alkyl, R2 is a Cn alkyl, where i being an integer ranging from 1 to 3 and where n+i varies from 2 to 4,
  • R1 is -C 4 H 7 and R2 is C 8 H 17 .
  • R1 and R2 are identical to each other words.
  • R1 and R2 are linear C1-C4 alkyls
  • R1 or R3 are C3 alkyls, they can be -C 3 H 7 (i.e. -CH 2 -CH 2 -CH3) or -CH(CH 3 ) 2 , and when they are C4 alkyls they can be -C 4 H 9 (i.e. -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 ), -CH(CH 3 )-CH 2 -CH 3 or -CH 2 -CH(CH 3 ) 2 or -C(CH 3 ) 3 .
  • this is a methyl (-CH 3 ) or a C2-C8 alkyl, i.e. an alkyl:
  • each of the carbon atoms can be substituted by a heteroatom, i.e. by an oxygen (O), nitrogen (N) or sulfur (S) atom, or even phosphorus (P).
  • a C4 alkyl can have one of its carbons substituted by an oxygen, and one will obtain the following R3 residues:
  • the invention relates to the compound as defined above, where R1 and R2 are each a C2-C4 alkyl, such as:
  • R1 is a Cn+i alkyl
  • R2 is a Cn alkyl
  • R2 is a Cn+i alkyl
  • R1 is a Cn alkyl
  • n varying from 1 to 3
  • i being an integer varying from 1 to 3 and where n+i varies from 1 to 4
  • R3 is as defined below.
  • the invention relates to the compound as defined above, where R3 is a C2-C4 alkoxy group, in particular methoxyethyl, a dimethylamineethyl or methylaminexethyl group.
  • the invention relates to the aforementioned compound, said compound being chosen from the group of compounds of formula I, where R1, R2 and R3 are together as indicated in each row of the following table:
  • the invention relates to the aforementioned compound, said compound being chosen from the compounds of formulas 47, 52, 53, 392 and 29 following: (47), (52), and (53), (392), and (29).
  • the invention relates to the compound as defined above, as a medicament, or for its use as a medicament. It is also envisaged a use of the compound as defined above, for the manufacture of a medicament.
  • a pharmaceutical composition comprising, as active substance, a compound as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the compound of formula (I) as defined above, or its pharmaceutically acceptable salt is administered or can be administered in a unit dose, or is packaged in a unit dose, of approximately 50 mg to approximately 1500 mg, in particular of approximately 150 to approximately 200 mg.
  • the compound of formula (I) as defined above, or its pharmaceutically acceptable salt is administered or can be administered with a dosage regimen of 50 mg/d to approximately 1500 mg/d, in particular from approximately 150 mg/d to approximately 200 mg/d.
  • the compound of formula (I) as defined above, or its salt pharmaceutically is administered or can be administered in a form suitable for administration by the oral or injectable route. More preferably, the compound of formula (I) as defined above, or its pharmaceutically acceptable salt, is administered or administrable in the form of a powder, cachets, capsules or sachets.
  • the aforementioned compound or the aforementioned pharmaceutical composition is used within the framework of the treatment, or for the treatment of infections with Gram positive bacteria.
  • the aforementioned compound has antibacterial properties that may prove useful in the treatment of infections.
  • the aforementioned compound is used in the context of antibacterial therapies, to treat pathologies or infections linked to contamination by Gram-positive bacteria which are not able to efflux compounds, or bacteria which do not express or little pumps responsible for resistance to antibiotics.
  • the aforementioned compound which has antibiotic properties, or at least antibacterial properties, can be used in the context of the decontamination of inert surfaces infected, or contaminated by bacteria.
  • the compound is then brought into contact with the contaminated surface in order to kill and/or inhibit the growth of contaminating bacteria.
  • the compound can be used in the form of a powder to be distributed on the surface to be decontaminated, or in the form of a solution which can be poured or sprayed on the surface to be decontaminated.
  • Gram-positive bacteria and more particularly Gram-positive bacteria which are not capable of effluxing compounds, that is to say bacteria which do not express or little pumps responsible for multiple drug resistance (pumps allowing efflux).
  • the invention also relates to the use of a compound as defined above, for evaluating or measuring, that is to say for qualitatively observing or quantifying the efflux of said compound by a bacterium.
  • the compound according to the invention is capable of being expelled from bacteria by the efflux mechanism. Also, insofar as the compound according to the invention is colored and/or fluorescent, it is easy to follow its efflux from the inside of the bacterium to the outside.
  • the compound of the invention it is also possible to use the compound of the invention to identify whether or not a bacterial isolate overproduces its efflux pumps. Also, by measuring or evaluating the efflux of the compound of the invention, it is possible to determine whether a pump is overproduced or overexpressed, or on the contrary underproduced or underexpressed.
  • the compound is colored and/or fluorescent, it will be possible to measure on the one hand the coloration/fluorescence at the start of the experiment when bringing the compound into contact with the bacteria, and after a determined time, either the fluorescence or the color in the bacteria, or in the external medium.
  • the invention relates to the aforementioned use, for evaluating or measuring the efflux by Gram-positive bacteria.
  • the msrA and msrB genes are responsible for an MS-type resistance phenotype, that is to say an inducible resistance to macrolides whose nucleus comprises 14 and 15 carbons (C14 and C15) and to compound B of streptogramins, after induction by erythromycin.
  • the mef gene causes a resistance phenotype called M, characterized by a limited resistance to C14 and C15 macrolides.
  • vga A , vgaB genes encode efflux proteins of the only compound A of the synergistins. All these genes are found in different species of Staphylococcus aureus (SA) and coagulase negative staphylococci (CNS).
  • SA Staphylococcus aureus
  • CNS coagulase negative staphylococci
  • the invention relates to the aforementioned use, for evaluating or measuring the efflux by Gram-negative bacteria.
  • the aforementioned use relates to the measurement or evaluation
  • the invention relates to a kit, or kit, for detecting or measuring bacterial efflux, comprising
  • the kit of the invention therefore contains a compound according to the invention which is capable of being effluxed by bacteria, and in addition a control of the experiment, a control bacterium for which the efflux of said compound is known.
  • This control bacterium can express either a wild-type pump, and whose efflux is known in particular with precision and in a reproducible manner, or a mutant pump which no longer allows efflux due to a lack of expression of the proteins forming the pump or a structural modification affecting the function.
  • Other control bacteria can obviously be used and in an advantageous aspect it can be supplied with the kit, or the kit, both a positive control (a bacterium with a functional efflux pump) and a negative control (a bacterium with a non-functional or absent efflux pump).
  • the compound according to the invention is colored and/or fluorescent
  • color palettes making it possible to define whether or not a bacterium is capable of effluxing a compound, or alternatively means for detecting fluorescence.
  • the invention relates to the use of the kit as defined above, for measuring or quantifying the efflux of said compound by a bacterium, in particular a Gram-positive bacterium, in particular S. aureus , B. subtilis , and S. pneumoniae .
  • a bacterium in particular a Gram-positive bacterium, in particular S. aureus , B. subtilis , and S. pneumoniae .
  • the invention relates to the use of the kit as defined above, for measuring or quantifying the efflux of said compound by a Gram-negative bacterium, in particular Escherichia coli .
  • the invention relates to the aforementioned kit, further comprising a protonophore, in particular chosen from 2,4-dinitrophenol, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), C4R1, Ellipticine, 10-[2-(3-hydroxy-6-oxo-xanthen-9-yl)benzoyl]oxidecyl-tri phenyl-phosphonium bromide and 2-(2-Hydroxyaryl)hexylphosphonium bromide, and in particular CCCP.
  • a protonophore in particular chosen from 2,4-dinitrophenol, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), C4R1, Ellipticine, 10-[2-(3-hydroxy-6-ox
  • a protonophore in particular CCCP, is particularly appropriate.
  • the protonophore found in the aforementioned kit is intended to be used at concentrations varying from 0.25 to 15 ⁇ g.mL -1 .
  • the invention relates to the use of a compound as defined above, to assess the resistance of a bacterium to a bacteriostatic or bactericidal compound.
  • the compound according to the invention can be effluxed by bacterial pumps, the latter can therefore logically be used to evaluate the effectiveness of the efflux of bacteria.
  • the invention relates to a method for evaluating resistance, in particular resistance due to an efflux mechanism, of a bacterium to a bacteriostatic or bactericidal compound, comprising:
  • the pellet of bacteria has the color of a pellet of bacteria from a culture of untreated bacteria, said bacterium is resistant to said bacteriostatic or bactericidal compound, and
  • the pellet of bacteria has a color different from the color of a pellet of bacteria from the culture of untreated bacteria, said bacterium is not resistant to said bacteriostatic or bactericidal compound.
  • the evaluation method may include a filtration step replacing the centrifugation step.
  • the bacteria culture is passed over a filter and the bacteria settle on the latter.
  • the coloring of the solid deposit of bacteria present on the filter is then evaluated to determine whether said bacteria exhibit resistance, in particular due to an efflux mechanism, to a bacteriostatic or bactericidal compound.
  • the invention thus relates to a method for evaluating the resistance, in particular a resistance due to an efflux mechanism, of a bacterium to a bacteriostatic or bactericidal compound, comprising:
  • the solid deposit on the filter has the same color as a solid deposit from a culture of untreated bacteria, said bacterium is resistant to said bacteriostatic or bactericidal compound, and
  • the solid deposit has a color different from the color of a solid deposit resulting from the culture of untreated bacteria, said bacterium is not resistant to said bacteriostatic or bactericidal compound.
  • the invention relates to a method for evaluating resistance due to an efflux mechanism of a bacterium to a bacteriostatic or bactericidal compound, comprising:
  • the pellet of bacteria has the color of a pellet of bacteria from the culture of untreated bacteria, said bacterium is resistant to said bacteriostatic or bactericidal compound, by efflux of said bacteriostatic or bactericidal compound, and
  • said bacterium is not resistant to said bacteriostatic or bactericidal compound by efflux of said bacteriostatic or bactericidal compound.
  • the invention relates to the aforementioned method, said method further comprising a step of incubating the culture of bacteria with a protonophore.
  • the invention relates to a method for evaluating resistance due to an efflux mechanism of a bacterium to a bacteriostatic or bactericidal compound, comprising:
  • the pellet of bacteria has the color of a pellet of bacteria from a culture of untreated bacteria, said bacterium is resistant to said bacteriostatic or bactericidal compound, by efflux of said bacteriostatic or bactericidal compound, and
  • said bacterium is not resistant to said bacteriostatic or bactericidal compound by efflux of said bacteriostatic or bactericidal compound.
  • This method with a pretreatment is particularly advantageous in the context of measuring the efflux of Gram-negative bacteria.
  • the aforementioned compound is very simple and is based on the color properties of the compounds according to the invention.
  • the compound will be effluxed and released into the environment.
  • the bacteria will have no more compounds and the bacterial pellet from the culture will have the color of a pellet that has not been treated with the colored compound.
  • the compound Conversely, if the efflux pumps are not functional, the compound will accumulate in the bacteria, and the pellet will then take on a color which will be that (with one variation in intensity) of the colored compound.
  • the colorimetric tests can be carried out using techniques known to those skilled in the art, and in particular according to the CIE 1976 L*a*b* chromatic space. It is a color space particularly used for the characterization of surface colors.
  • Pellet A represents a pellet of strain CIP 76.26, a reference strain with normal efflux activity – the pellet is pale pink.
  • Pellet B represents a pellet of the SA 1199 strain, a clinical strain with light to moderate efflux activity – the pellet is orange.
  • Pellet C represents a pellet of strain SA 1199 B which corresponds to a mutant strain with high efflux activity – the pellet is white/off-white.
  • Base D represents a base of strain SA K1758, a mutant strain with no efflux pump – the base is shiny dark pink.
  • Pellet A represents a wild BmrA strain pellet – the pellet is pale pink.
  • Pellet B represents a pellet of a strain overexpressing BmrA – the pellet is white.
  • Pellet C represents a pellet of bacteria with a deletion of BmrA (BmrA ⁇ ) – the pellet is dark pink.
  • D NorA deleted strain corresponding to SA K1758 fixed with PFA
  • E wild type strain corresponding to CIP 76.25 fixed with ethanol
  • F reference strain corresponding to the SA strain fixed with ethanol
  • G NorA-overproducing strain corresponding to SA1199B fixed with ethanol
  • H NorA-deleted strain corresponding to SA K1758 fixed with ethanol.
  • the "9A” pellet represents a wild PatA-PatB strain pellet.
  • Pellet “9B” represents a PatA/PatB overexpressing strain pellet.
  • the “9C” pellet represents a PatA/PatB deletion strain pellet.
  • Antibiotic efflux due to its polyspecificity, has long been identified as a complement to more traditional resistance mechanisms (target mutation, enzymes such as Beta-lactamase, etc.), but more recently, as intervening upstream of other mechanisms, favoring their selection.
  • Example 2-1 Staphylococcus aureus
  • Bacterial strains the inventors used the following strains of Staphylococcus aureus :
  • Compound 053 (see synthesis in example 1) is prepared in pure DMSO (Sigma) at a concentration of 20 mg/mL. It will then be diluted in milliQ water to obtain a stock solution of 1000 ⁇ g/mL.
  • Staining of the bacteria the bacteria in the exponential phase of growth are incubated for 15 min in the presence of compound 053. Then the bacteria are washed twice in phosphate buffer and centrifuged, the pellets are observed with the naked eye.
  • Fluorescence measurement The bacteria in the exponential phase of growth are incubated for 15 min in the presence of compound 053. The optical density at 600 nm is then adjusted to 0.5 and 50 ⁇ l are transferred into a black microtiter plate. The fluorescence is read in a Tecan M200 microplate reader.
  • the cell pellets are orange in color indicating moderate efflux activity, this is mainly due to the inherent yellow color of the cells.
  • Figures 1-3 show the color difference (1A) and spectrofluorometric difference (1B) observed in different reference strains (strain A, CIP 76.25), a clinical strain (strain B, SA1199), and laboratory-constructed norA efflux pump mutants of strain B: overexpressing NorA (strain C, SA 1199B) and deleted NorA (strain D, SA K1758).
  • strain C has an overexpressed efflux pump, the efflux of 053 is stronger, and the cell pellet appears white (053 is completely eliminated by efflux).
  • strain D lacks an efflux pump, the cell pellet appears dark pink.
  • Intermediate colors can be observed for reference strains (strain A) and clinical strains (strain B), suggesting mild to moderate activity.
  • the spectrofluorimetric results ( ) show that compound 053 is fluorescent when accumulated in bacteria and that, like staining, fluorescence depends on the level of production of the NorA pump.
  • the NorA pumpless mutant (SAK 1758) has high fluorescence at 670 nm ( Figures 2 and 3 , black curve and histogram).
  • fluorescence requires a suitable spectrofluorimeter.
  • the fluorescence measurement is quantitative and makes it possible to determine with precision the level of efflux activity of the isolates.
  • the inventors also carried out a reading of the fluorescence by flow cytometry in order to validate the results previously obtained by spectrofluorimetry.
  • flow cytometry only considers the fluorescence within the cell and not that surrounding it, thus making it possible to directly assess the concentration of compound 053 within the cell without the need for rinsing.
  • Example 2-2 Bacillus subtilis
  • Bacterial strains the inventors used
  • Figures 4-6 show the color difference ( ) and the spectrofluorometric difference ( Figures 5 and 6) observed on the different strains of Bacillus subtilis .
  • Strain A is wild-type B. subtilis 168 (DSM 402)
  • strain B, BmrA+++ is a BmrA overexpressing mutant
  • strain C is a BmrA deletion mutant (BmrA ⁇ ). Since strain B overexpresses the BmrA efflux pump, compound 053 is completely effluxed out of the cell, and the cell pellet appears white. On the other hand, for strain C which does not have an efflux pump, the cell pellet appears dark pink.
  • Strain A is a normal wild type strain expressing normal efflux activity; compound 053 is therefore partially effluent and the cell pellet appears pale pink, suggesting mild to moderate activity. Similar activity is confirmed and quantified using fluorescence spectroscopy ( Figures 5 and 6).
  • the wild-type strain (DSM 402) producing low levels of pumps exhibits intermediate levels of fluorescence ( Figures 5 and 6, curve and histogram).
  • fluorescence requires a suitable spectrofluorimeter.
  • the fluorescence measurement is quantitative and makes it possible to determine with precision the level of efflux activity of the isolates.
  • the inventors compared the staining induced by compound 053 on different strains of Streptococcus pneumoniae bacteria: a wild strain ("WT”), a strain overexpressing PatA-PatB, an ABC transporter of Streptococcus pneumoniae allowing the transport of molecules outside the cell involved in the resistance of this pathogen to fluoroquinolone type antibiotics (“OVP”), and a strain deleted of PatA-PatB (“DEL").
  • WT wild strain
  • PatA-PatB an ABC transporter of Streptococcus pneumoniae allowing the transport of molecules outside the cell involved in the resistance of this pathogen to fluoroquinolone type antibiotics
  • DEL strain deleted of PatA-PatB
  • Bacterial strains the inventors used
  • Figures 9 and 10 show the color difference ( ) and the spectrofluorometric difference ( ) observed on the different strains of Streptococcus pneumoniae.
  • Compound 053 therefore makes it possible to qualitatively and quantitatively distinguish a strain overexpressing an ABC PatA-PatB transporter from a strain not overexpressing or not expressing this transporter at all.
  • Example 2-4 Escherichia coli
  • PBP potassium phosphate buffer
  • Figures 11 to 16 show the color difference ( Figures 11 and 14) and the spectrofluorimetric difference ( Figures 12, 13, 15 and 16) observed on the different strains of Escherichia coli.
  • Strain EC (ref) is the reference strain (ATCC 11775) showing normal efflux
  • strain AG100 is the wild-type E. coli strain (Wild) also showing normal efflux
  • strain AG102 is an AcrAB overexpressing mutant (acrAB+++) showing high efflux
  • strain AG100A ( ⁇ acrAB) is an acrAB deletion mutant showing low efflux.
  • CCCP Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone
  • the experimental protocol is the same as that described in the examples except that the cells are treated for 1 hour with CCCP (5 ⁇ g/mL) in a phosphate buffer (PPB). After PCC treatment, the entire experiment is carried out in PPB instead of MH-II broth from step 4.

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Abstract

L'invention concerne un composé de formule (I) suivante où X est un anion, où R1 et R2 sont - soit conjointement -CH3, - soit un alkyle en C1-C4, tel que si R1 est un alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, et inversement, n étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4; et où R3 est un -CH3, ou un alkyle en C2-C8, ledit alkyle en C2-C 8étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes.

Description

    COMPOSE DE PHENAZINE POUR MESURER L'EFFUX BACTERIEN
  • L’invention concerne des composés cycliques, et notamment leur utilisation dans le cadre de la mesure de l’efflux bactérien.
  • En biologie, l'efflux est un mécanisme par lequel les cellules rejettent dans le milieu extérieur des composés qui sont toxiques pour leur métabolisme, tels que les antibiotiques, les métaux lourds, des drogues, etc... L'efflux est un mécanisme de transport actif, énergie-dépendant, assuré par des protéines transmembranaires appelées pompes d'efflux.
  • Chez les procaryotes, et notamment les bactéries, de nombreux systèmes d'efflux ont été décrits, mais ces mécanismes peuvent également être observés chez les eucaryotes.
  • Du fait de l’expulsion de composés dans le milieu extérieur, les mécanismes responsables de l'efflux contribuent entre autres à l'émergence de résistances à différents traitements pharmacologiques comme la résistance aux antibiotiques ou la résistance aux chimiothérapies anticancéreuses. Le spectre large de certaines pompes d'efflux observé chez certaines bactéries peut conduire à l'apparition de phénotypes de multirésistance, rendant ainsi très difficile le traitement des infections.
  • Aussi, existe-t-il un besoin de mesurer l’efflux afin d’anticiper les résistances bactériennes.
  • L’un des buts de l’invention est de proposer des composés et des méthodes permettant de mesurer l’efflux bactérien.
  • Un autre but de l’invention consiste à proposer une méthode permettant d’évaluer la résistance aux antibiotiques des bactéries.
  • L’’invention concerne-t-elle un composé de formule I suivante :
    (I)
  • où X- est un atome halogène, ou un contre ion acceptable, notamment Cl,
  • où R1 et R2 sont
  • - soit conjointement -CH3, ou-C4H9
  • - soit un alkyle en C1-C4, tel que si R1 est un alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, et inversement, n’étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4;
  • - soit R1 est -C4H7 et R2 est C8H17, et
  • où R3 est un -CH3, ou un alkyle en C2-C8, ledit alkyle en C2-C8 étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes ;
  • ou un sel ou un solvate de ce composé de formule I, ou une forme protonée de celui-ci.
  • En d’autres termes, l’invention concerne-t-elle un composé de formule I susmentionné
  • X- est un atome halogène, ou un contre ion acceptable, notamment Cl,
  • où R1 et R2 sont
  • - soit conjointement -CH3, ou -C4H9,
  • - soit un alkyle en C1-C4, tel que
  • - si R1 est un alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn,
  • - si R1 est un alkyle en Cn, R2 est un alkyle en Cn+i,
  • n étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et où n+i varie de 2 à 4;
  • - soit R1 est C4H9 et R2 est C8H17, et
  • où R3 est un -CH3, ou un alkyle en C2-C8, ledit alkyle en C2-C8 étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes ;
  • ou un sel ou un solvate de ce composé de formule I, ou une forme protonée de celui-ci.
  • Avantageusement, l’invention concerne-t-elle un composé de formule I suivante :
    (I)
  • où X- est un atome halogène, ou un contre ion acceptable, notamment Cl,
  • où R1 et R2 sont
  • - soit conjointement -CH3,
  • - soit un alkyle en C1-C4, tel que si R1 est un alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, et inversement, n’étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4; et
  • où R3 est un -CH3, ou un alkyle en C2-C8, ledit alkyle en C2-C8 étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes ;
  • ou un sel ou un solvate de ce composé de formule I, ou une forme protonée de celui-ci.
  • L’invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que les composés de formule I susmentionnés sont des composés colorés et fluorescents qui sont efficacement efflués par des bactéries au moyen des différentes pompes d’efflux, de sorte que lesdits composés permettent de mesurer l’efflux bactérien et de mesurer une potentielle résistance desdites bactéries.
  • Les composés de formule I sont des phénaziniums, c’est à dire des formes protonées cationiques de phénazines. Les formes alkylées des phénaziniums de l’invention sont également envisagées.
  • Dans les composés de formule I, X- est un contre-anion acceptable et notamment pharmaceutiquement acceptable, c’est à dire un contre-anion dont l’utilisation est compatible avec la physiologie animale ou bactérienne. Des contre-anions avantageux sont notamment des contre-anions où X est un atome d’halogène tel que F, Cl, Br ou encore I, l’halogène avantageux étant Cl. D’autres contre-ions sont envisageables tels que les chlorates, les bromates, les hydrogénocarbonates, les acétates, les butyrates, les formiates, les tartrates, les aluminates, les salicylates, les mésylates, les anions de bore, les anions de phosphore tels que notamment l’hexafluorophosphate (PF6 -) ou encore le tétrafluoroborate (BF4 -).
  • Les composés selon la formule I sont donc des phénaziniums où les groupements R1, R2 et R3 sont définis comme suit :
  • - soit R1 et R2 sont des groupes - CH3, ou -C4H9,
  • - soit R1 et R2 sont des alkyles en C1-C4, c’est-à-dire des alkyles en C1, C2, C3 ou C4, de préférence linéaires, de telle sorte que R1 et R2 ont toujours un atome de carbone de différence. C’est ce que définit la phase précisant que si R1 est alkyle en Cn, R2 est un alkyle en Cn+i, et si R1 est alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, où i étant un entier variant de 1 à 3 et où n+i varie de 2 à 4,
  • - soit R1 est -C4H7 et R2 est C8H17.
  • En d’autres termes, R1 et R2 sont
  • - conjointement un -CH3, ou,
  • lorsque R1 et R2 sont des alkyles linéaires en C1-C4,
  • - R1 = -CH3 et R2 = -C2H5 ou R1 = -C2H5 et R2 = -CH3, ou
  • - R1 = -C2H5 et R2 = -C3H7 ou R1 = -C3H7 et R2 = -C2H5, ou
  • - R1 = -C3H7 et R2 = -C4H9 ou R1 = - C4H9 et R2 = -C3H7.
  • Bien évidemment, lors que R1 ou R3 sont des alkyles en C3, ils peuvent être -C3H7 (i.e. -CH2-CH2-CH3) ou -CH(CH3)2, et lorsqu’ils sont des alkyles en C4 ils peuvent être de -C4H9 (i.e. -CH2-CH2-CH2-CH3), -CH(CH3)-CH2-CH3 ou -CH2-CH(CH3)2 ou -C(CH3)3.
  • En ce qui concerne R3, celui-ci est un méthyle (-CH3) ou un alkyle en C2-C8, c’est-à-dire un alkyle :
  • - en C1, i.e. -CH3, ou
  • - en C2, i.e. -C2H5(i.e. -CH2-CH3), ou
  • - en C3, i.e. -C3H7 (i.e. -CH2-CH2-CH3) ou -CH(CH3)2, ou
  • - en C4, i.e. -C4H9(i.e. -CH2-CH2-CH2-CH3), -CH(CH3)-CH2-CH3 ou -CH2-CH(CH3)2 ou -C(CH3)3, ou
  • - en C5, i.e. -C5H11 (i.e. -CH2-CH2-CH2-CH2-CH3), -CH(CH3)-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH(CH3)-CH2-CH3, - CH2-CH2-CH(CH3)2, -C(CH3)2-CH2-CH3, -CH(CH3)-CH(CH3)-CH3,-CH2-C(CH3)3 ou -CH(CH3)-CH(CH3)2, ou
  • - en C6, i.e. -C6H13 (i.e. -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3), ou une forme ramifiée, ou
  • - en C7, i.e. -C7H15 (i.e. -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3), ou une forme ramifiée, ou
  • - en C8, i.e. -C8H17 (i.e. -CH2-CH2--CH2CH2-CH2-CH2-CH2-CH3), ou une forme ramifiée.
  • Lorsque R3 est un alkyle en C2-C8, chacun des atomes de carbone peut être substitué par un hétéroatome, c’est à dire par un atome d’oxygène (O), d’azote (N) ou de soufre (S), voire même du phosphore (P). Par exemple, un alkyle en C4, peut avoir un de ses carbones substitué par un oxygène, et l’on obtiendra les résidus R3 suivants :
  • - -O-CH2-CH2-CH3, ou
  • - -CH2-O-CH2-CH3, ou
  • - -CH2-CH2-O-CH3, ou
  • - -CH2-CH2-NH-CH3, ou encore
  • - -CH2-CH2-CH2-OH.
  • Ces exemples sont illustratifs et ne sauraient limiter la portée de l’invention.
  • Les formes protonées du composé de formule I susmentionné sont également couvertes par la présente invention.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne le composé tel que défini ci-dessus, où R1 et R2 sont chacun un alkyle en C2-C4, tels que :
  • - si R1 est un alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, ou
  • - si R2 est un alkyle en Cn+i, R1 est un alkyle en Cn,
  • n variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4, et R3 est tel que défini ci-dessous.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne le composé tel que défini ci-dessus, où R3 est un groupement alcoxy en C2-C4, notamment méthoxyéthyle, un groupe diméthylamineéthyle ou méthylaminexéthyle.
  • De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne le composé susmentionné, ledit composé étant choisi dans le groupe des composés de formule I, où R1, R2 et R3 sont conjointement tels qu’indiqués dans chaque ligne du tableau qui suit :
  • composé R1 R2 R3
    méthyle méthyle propyle
    méthyle éthyle propyle
    éthyle méthyle propyle
    éthyle propyle propyle
    propyle éthyle propyle
    propyle butyle propyle
    butyle propyle propyle
    méthyle méthyle butyle
    méthyle éthyle butyle
    éthyle méthyle butyle
    éthyle propyle butyle
    propyle éthyle butyle
    propyle butyle butyle
    #47 butyle propyle butyle
    méthyle méthyle méthoxyéthyle
    méthyle éthyle méthoxyéthyle
    éthyle méthyle méthoxyéthyle
    éthyle propyle méthoxyéthyle
    propyle éthyle méthoxyéthyle
    propyle butyle méthoxyéthyle
    #53 butyle propyle méthoxyéthyle
    #52 butyle propyle octyle
    #392 ou #44 butyle octyle méthoxyéthyle
    #29 butyle butyle propyle
  • On notera que le composé #392 est également nommé #44
  • De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne le composé susmentionné, ledit composé étant choisi parmi les composés de formules 47, 52, 53, 392 et 29 suivantes :
    (47),
    (52), et
    (53),
    (392), et
    (29).
  • Ces trois composés sont les composés les plus avantageux de l’invention et leur synthèse est décrite en détail dans l’Exemple 1, ci-après.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne le composé tel que défini précédemment, en tant que médicament, ou pour son utilisation en tant que médicament. Il est également envisagé une utilisation du composé tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d’un médicament.
  • Il est également envisagé une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un composé tel que défini précédemment, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. De préférence, le composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, ou son sel pharmaceutiquement acceptable, est administré ou administrable à une dose unitaire, ou est conditionné en une dose unitaire, d'environ 50 mg à environ 1500 mg, notamment d'environ 150 à environ 200 mg. De préférence également, le composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, ou son sel pharmaceutiquement acceptable est administré ou administrable avec un régime de dosage de 50 mg/j à environ 1500 mg/j, notamment d'environ 150 mg/j à environ 200 mg/j. De préférence, le composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, ou son sel pharmaceutiquement est administré ou administrable sous une forme convenant pour une administration par voie orale ou injectable. Plus préférablement, le composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, ou son sel pharmaceutiquement acceptable, est administré ou administrable sous la forme d'une poudre, de cachets, de gélules ou de sachets.
  • De manière encore plus avantageuse, le composé susmentionné ou la composition pharmaceutique susmentionnée est utilisé dans le cadre du traitement, ou pour le traitement des infections à bactéries Gram positive. Le composé susmentionné a des propriétés antibactériennes qui peuvent s’avérer utiles dans le cadre du traitement d’infections.
  • De manière plus avantageuse, le composé susmentionné est utilisé dans le cadre de thérapies antibactériennes, pour traiter des pathologies ou des infections liées à la contamination par des bactéries à Gram positif qui ne sont pas capables d’effluer des composés, ou des bactéries qui n’expriment pas ou peu de pompes responsables de la résistance aux antibiotiques.
  • Dans un autre aspect, le composé susmentionné, qui possède des propriétés antibiotiques, ou du moins antibactériennes, peut être utilisé dans le cadre de la décontamination de surfaces inertes infectées, ou contaminées par des bactéries. Le composé est alors mis en contact avec la surface contaminée afin de tuer et/ou inhiber la croissance des bactéries contaminantes. Le composé peut être utilisé sous forme d’une poudre à répartir sur la surface à décontaminer, ou sous la forme d’une solution qui peut être versée ou pulvérisée sur la surface à décontaminer.
  • Il est également envisagé d’utiliser le composé susmentionné, en vue de colorer ou de réaliser un marquage coloré ou fluorescent, de bactéries à Gram positif, et plus particulièrement les bactéries à Gram positives qui ne sont pas capable d’effluer des composées, c’est à dire des bactéries qui n’expriment pas ou peu de pompes responsables de la résistance multiple aux drogues (pompes permettant l’efflux).
  • L’invention concerne également l’utilisation d’un composé tel que défini précédemment, pour évaluer ou mesurer, c’est à dire pour observer de manière qualitative ou quantifier l’efflux dudit composé par une bactérie.
  • Comme cela est illustré dans les exemples, le composé selon l’invention est capable d’être expulsé des bactéries par le mécanisme d’efflux. Aussi, dans la mesure où le composé selon l’invention est coloré et/ou fluorescent, il est facile de suivre son efflux depuis l’intérieur de la bactérie vers l’extérieur.
  • Il est également possible d’utiliser le composé de l’invention pour identifier si un isolat bactérien surproduit ou non ses pompes d’efflux. Aussi, en mesurant ou en évaluant l’efflux du composé de l’invention, il est possible de déterminer si une pompe est surproduite ou surexprimée, ou au contraire sous produite ou sous exprimée.
  • Il est ainsi possible de mesurer des caractéristiques telles que la vitesse d’efflux, ce qui peut éventuellement informer sur la quantité de pompes d’efflux présente à la membrane des bactéries, ou de mesurer la variation d’activité (capacité d’efflux) de pompes suite à une mutagenèse (induite ou naturelle).
  • Dans la mesure où le composé est coloré et/ou fluorescent, il sera possible de mesurer d’une part la coloration/fluorescence au début de l’expérience lors de la mise en contact du composé avec les bactéries, et après un temps déterminé, soit la fluorescence ou la couleur dans la bactérie, soit dans le milieu extérieur.
  • De manière plus avantageuse l’invention concerne l’utilisation susmentionnée, pour évaluer ou mesurer l’efflux par des bactéries à Gram positif.
  • Plusieurs gènes codant pour des systèmes d’efflux ont été décrits chez les bactéries à Gram positif. Leur produit forme un transporteur protéique qui diminue l’accumulation de l’antibiotique dans la cellule.
  • A titre d’exemple, les gènes msrA et msrB sont responsables d’un phénotype de résistance de type MS, c’est-à-dire d’une résistance inductible vis-à-vis des macrolides dont le noyau comporte 14 et 15 carbones (C14 et C15) et au composé B des streptogramines, après induction par l’érythromycine. Le gène mef entraîne un phénotype de résistance nommé M, caractérisé par une résistance limitée aux macrolides en C14 et en C15.
  • Les gènes vga A, vgaB codent des protéines d’efflux du seul composé A des synergistines. Tous ces gènes sont retrouvés chez différentes espèces de Staphylococcus aureus (SA) et les staphylocoques à coagulase négative (SCN).
  • Il ne s’agit ici que d’exemples, et cette liste n’est en aucun cas à considérer comme limitative de l’invention.
  • De manière plus avantageuse l’invention concerne l’utilisation susmentionnée, pour évaluer ou mesurer l’efflux par des bactéries à Gram négatif.
  • De manière avantageuse, l’utilisation susmentionnée concerne la mesure ou l’évaluation
  • Dans un autre aspect, l’invention concerne un kit, ou trousse, de détection ou de mesure de l’efflux bactérien, comprenant
  • - un composé tel que défini ci-dessus, et
  • - au moins une bactérie contrôle.
  • Le kit de l’invention contient donc un composé selon l’invention qui est capable d’être efflué par des bactéries, et en outre un contrôle de l’expérience, une bactérie contrôle pour laquelle on connaît l’efflux dudit composé.
  • Cette bactérie contrôle peut exprimer, soit une pompe sauvage, et dont l’efflux est connu notamment avec précision et de manière reproductible, soit une pompe mutante qui ne permet plus l’efflux du fait d’une absence d’expression des protéines formant la pompe ou d’une modification structurelle affectant la fonction. D’autres bactéries contrôle peuvent évidemment être utilisées et dans un aspect avantageux il peut être fourni avec le kit, ou la trousse, à la fois un contrôle positif (une bactérie avec une pompe à efflux fonctionnelle) et un contrôle négatif (une bactérie avec une pompe à efflux non fonctionnelle ou absente).
  • Dans la mesure où le composé selon l’invention est coloré et/ou fluorescent, il est possible également d’inclure dans le kit selon l’invention des palettes de couleur permettant de définir si une bactérie est capable d‘effluer ou non un composé, ou encore des moyens de détection de la fluorescence.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation du kit tel que défini ci-dessus, pour la mesure ou la quantification de l’efflux dudit composé par une bactérie, notamment une bactérie à Gram positif, en particulier des S. aureus, des B. subtilis , et des S. pneumoniae.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation du kit tel que défini ci-dessus, pour la mesure ou la quantification de l’efflux dudit composé par une bactérie à Gram négatif, en particulier Escherichia coli.
  • De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne le kit susmentionné, comprenant en outre un protonophore, notamment choisi parmi le 2,4-dinitrophenol, le Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), le Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), le C4R1, l’Ellipticine, le 10-[2-(3-hydroxy-6-oxo-xanthen-9-yl)benzoyl]oxydecyl-triphenyl-phosphonium bromide et le 2-(2-Hydroxyaryl)hexylphosphonium bromide, et en particulier le CCCP.
  • Dans le cadre de la mesure de l’efflux des bactéries à Gram négatif, l’usage d’un protonophore, notamment le CCCP, est particulièrement approprié. Le protonophore se retrouvant dans le kit susmentionné est destiné à être utilisé à des concentrations variant de 0,25 à 15µg.mL-1. Cela signifie que le protonophore est utilisable n’importe quelle dose variant dans cet intervalle et en particulier à une dose de 0,25 µg.mL-1, 0,5µg.mL-1, 0,75µg.mL-1, 1µg.mL-1, 1,25µg.mL-1, 1,5µg.mL-1, 1,75µg.mL-1, 2µg.mL-1, 2,25µg.mL-1, 2,5µg.mL-1, 2,75µg.mL-1, 3µg.mL-1, 3,25µg.mL-1, 3,5µg.mL-1, 3,75µg.mL-1, 4µg.mL-1, 4,25µg.mL-1, 4,5µg.mL-1, 4,75µg.mL-1, 5µg.mL-1, 5,25µg.mL-1, 5,5µg.mL-1, 5,75µg.mL-1, 6µg.mL-1, 6,25µg.mL-1, 6,5µg.mL-1, 6,75µg.mL-1, 7µg.mL-1, 7,25µg.mL-1, 7,5µg.mL-1, 7,75µg.mL-1, 8µg.mL-1, 8,25µg.mL-1, 8,5µg.mL-1, 8,75µg.mL-1, 9µg.mL-1, 9,25µg.mL-1, 9,5µg.mL-1, 9,75µg.mL-1, 10µg.mL-1, 10,25µg.mL-1, 10,5µg.mL-1, 10,75µg.mL-1, 11µg.mL-1, 11,25µg.mL-1, 11,5µg.mL-1, 11,75µg.mL-1, 12µg.mL-1, 12,25µg.mL-1, 12,5µg.mL-1, 12,75µg.mL-1, 13µg.mL-1, 13,25µg.mL-1, 13,5µg.mL-1, 13,75µg.mL-1, 14µg.mL-1, 14,25µg.mL-1, 14,5µg.mL-1, 14,75µg.mL-1 ou 15µg.mL-1. L’homme du métier saura déterminer la dose appropriée selon le protonophore utilisé. Par exemple il est avantageux, lors de l’utilisation du CCCP d’utiliser une dose de 5 µg.mL-1.Dans encore un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un composé tel que défini précédemment, pour évaluer la résistance d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide.
  • Dans la mesure où le composé selon l’invention peut être efflué par les pompes bactériennes, ce dernier peut donc logiquement être utilisé pour évaluer l’efficacité de l’efflux de bactéries.
  • S’il est établi que le composé selon l’invention est efflué, cela signifie que l’efflux est fonctionnel et donc que les bactéries seront capables d’éliminer des antibiotiques. On conclura donc, sans avoir besoin de mesurer la résistance en utilisant un antibiotique, que les bactéries concernées sont résistantes aux antibiotiques par un phénomène d’efflux.
  • A l’inverse, si le composé selon l’invention n’est pas efflué, cela signifie que les pompes d’efflux ne sont pas fonctionnelles, et donc que des antibiotiques ne seront pas non plus efflués. Aussi, de la même manière que pour la résistance, il sera possible de déterminer facilement, sans utiliser d’antibiotique, que les bactéries sont sensibles auxdits antibiotiques par défaut d’efflux.
  • Dans encore un autre aspect, l’invention concerne une méthode d’évaluation de la résistance, notamment une résistance due à un mécanisme d’efflux, d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide, comprenant :
  • - la mise en culture de bactéries dans un milieu de culture approprié, pour obtenir une culture de bactéries,
  • - la mise en contact de la culture de bactéries avec un composé susmentionné, pour obtenir une culture de bactéries traitées,
  • - le lavage de la culture de bactérie traitées, et la précipitation des bactéries contenues dans la culture de bactéries traitées pour obtenir un culot de bactéries,
  • - l’observation de la coloration du culot de bactéries, telle que
  • - si le culot de bactéries présente la couleur d’un culot de bactéries issues d’une culture de bactéries non traitées, ladite bactérie est résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide, et
  • - si le culot de bactéries présente une couleur différente de la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie n’est pas résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide.
  • Alternativement, la méthode d’évaluation peut comprendre une étape de filtration en remplacement de l’étape de centrifugation. Dans cette variante, la culture de bactérie est passée sur un filtre et les bactéries se déposent sur ce dernier. La coloration du dépôt solide de bactéries présent sur le filtre est alors évaluée pour déterminer si lesdites bactéries présentent une résistance, notamment due à un mécanisme d’efflux, à un composé bactériostatique ou bactéricide. Selon ce mode de réalisation, l’invention concernant ainsi une méthode d’évaluation de la résistance, notamment une résistance due à un mécanisme d’efflux, d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide, comprenant :
  • - la mise en culture de bactéries dans un milieu de culture approprié, pour obtenir une culture de bactéries,
  • - la mise en contact de la culture de bactéries avec un composé susmentionné, pour obtenir une culture de bactéries traitées,
  • - le lavage de la culture de bactérie traitées, et la filtration des bactéries contenues dans la culture de bactéries traitées pour obtenir un filtrat d’une part et un dépôt de bactérie sur un filtre d’autre part,
  • - l’observation de la coloration du dépôt solide sur le filtre, telle que
  • - si le dépôt solide sur le filtre présente la même couleur qu’un dépôt solide issus d’une culture de bactéries non traitées, ladite bactérie est résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide, et
  • - si le dépôt solide présente une couleur différente de la couleur d’un dépôt solide issus de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie n’est pas résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne une méthode d’évaluation d’une résistance due à un mécanisme d’efflux d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide, comprenant :
  • - la mise en culture de bactéries dans un milieu de culture approprié, pour obtenir une culture de bactéries,
  • - la mise en contact de la culture de bactéries avec un composé tel que défini ci-dessus, pour obtenir une culture de bactéries traitées,
  • - le lavage de la culture de bactérie traitées, et la précipitation des bactéries contenues dans la culture de bactéries traitées pour obtenir un culot de bactéries,
  • - l’observation de la coloration du culot de bactéries, tel que
  • - si le culot de bactéries présente la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie est résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide, par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide, et
  • - si le culot de bactéries présente une couleur différente de la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie n’est pas résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide.
  • De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne la méthode susmentionnée, la dite méthode comprenant en outre une étape d’incubation de la culture de bactéries avec un protonophore.
  • Cela signifie que de manière avantageuse l’invention concerne une méthode d’évaluation d’une résistance due à un mécanisme d’efflux d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide, comprenant :
  • - la mise en culture de bactéries dans un milieu de culture approprié, pour obtenir une culture de bactéries,
  • - la mise en contact de la culture de bactéries avec un protonophore, notamment un protonophore susmentionné, pour obtenir une culture de bactéries prétraitée,
  • - la mise en contact de la culture de bactéries prétraitée avec un composé tel que défini ci-dessus, pour obtenir une culture de bactéries traitées,
  • - le lavage de la culture de bactérie traitées, et la précipitation des bactéries contenues dans la culture de bactéries traitées pour obtenir un culot de bactéries,
  • - l’observation de la coloration du culot de bactéries, tel que
  • - si le culot de bactéries présente la couleur d’un culot de bactéries issues d’une culture de bactéries non traitées, ladite bactérie est résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide, par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide, et
  • - si le culot de bactéries présente une couleur différente de la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie n’est pas résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide.
  • Cette méthode avec un prétraitement est particulièrement avantageuse dans le cadre de la mesure de l’efflux des bactéries à Gram négatif. Le composé susmentionné est très simple et se base sur les propriétés colorées des composés selon l’invention.
  • En incubant des bactéries avec le composé selon l’invention, ce dernier va s’accumuler dans la bactérie.
  • Si les pompes d’efflux sont fonctionnelles, le composé sera efflué, et relargué dans le milieu. Les bactéries n’auront plus de composés et le culot bactérien issu de la culture aura la couleur d’un culot qui n’a pas été traité avec le composé coloré.
  • A l’inverse, si les pompes d’efflux ne sont pas fonctionnelles, le composé va s’accumuler dans les bactéries, et le culot prendra alors une couleur qui sera celle (à une variation d’intensité près) du composé coloré.
  • Aussi, par un simple test colorimétrique il est possible, après des lavages pour éliminer les composés résiduels qui ont été efflués, ou qui n’ont pas été incorporés dans les bactéries, de déterminer si une bactérie est capable de réaliser un efflux de composés, et donc si elle sera résistante ou non à des antibiotiques.
  • Les tests colorimétriques peuvent être réalisés à l’aide des techniques connues de l’homme du métier, et notamment selon espace chromatique L*a*b* CIE 1976. Il s’agit d’un espace de couleur particulièrement utilisé pour la caractérisation des couleurs de surface. Trois grandeurs caractérisent les couleurs : la clarté L* dérive de la luminance de la surface ; les deux paramètres a* et b* expriment l'écart de la couleur par rapport à celle d'une surface grise de même clarté.
    • Brève description des figures
  • L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels :
  • la est une photographie représentative d’un test de l’activité de la pompe d’efflux NorA dans des souches de Staphylococcus aureus en utilisant le composé 053 à une concentration de 0,75 µg.mL-1. Le culot A représente un culot de souche CIP 76.26, souche de référence ayant une activité d’efflux normale – le culot est rose pâle. Le culot B représente un culot de souche SA 1199, souche clinique ayant une activité d’efflux légère à modérée – le culot est orange. Le culot C représente un culot de souche SA 1199 B qui correspond à une souche mutante ayant une forte activité d’efflux – le culot est blanc/blanc cassé. Le culot D représente un culot de souche SA K1758, souche mutante n’ayant pas de pompe d’efflux – le culot est rose foncé brillant.
  • la est un graphique montrant l’intensité de fluorescence en fonction de la longueur d’onde (en nm) pour : A : le tampon, B : la souche SA K1758, C : la souche CIP 76.26, D : la souche SA 1199 B et E : la souche SA K1758.
  • la est un histogramme représentant sous forme de barres les valeurs maximales d’émission de fluorescence à 642 nm (après une excitation à une longueur d’onde 530 nm) pour : A : le tampon, B : la souche SA K1758, C : la souche CIP 76.26, D : la souche SA 1199 B et E : la souche SA K1758.
  • la représente une photo représentative d’un test d’utilisation du composé 053 à une concentration de 0,75 µg.mL -1 sur des mutants de la pompe d’efflux BmrA de Bacillus subtilis. Le culot A représente un culot de souche BmrA sauvage – le culot est rose pâle. Le culot B représente un culot de souche surexprimant BmrA – le culot est blanc. Le culot C représente un culot de bactéries ayant une délétion de BmrA (BmrA∆) – le culot est rose foncé.
  • la est un graphique montrant l’intensité de fluorescence en fonction de la longueur d’onde (en nm) pour : A : le tampon, B : la souche de B. subtilis surexprimant BrmA, C : la souche la souche sauvage de B. Subtilis et D : la souche BrmA ∆.
  • la est un histogramme représentant sous forme de barres les valeurs maximales d’émission de fluorescence à 642 nm (après une excitation à une longueur d’onde 530 nm) pour : A : le tampon, B : la souche de B. subtilis surexprimant BrmA, C : la souche la souche sauvage de B. Subtilis et D : la souche BrmA ∆.
  • la est un histogramme montrant l’intensité de fluorescence mesurée en cytométrie en flux pour différentes souches de Staphylococcus aureus traitées avec le composé 053. A : une souche sauvage correspondant à CIP 76.25 , B : une souche de référence correspondant à la souche SA, C : une souche surproduisant NorA correspondant à SA1199B, et D : une souche délétée de NorA correspondant à SA K1758. ns : non spécifique. * indique une différence significative avec une valeur de p inférieur à 0,05 ; **** = indique une différence significative avec une valeur de p inférieur à 0,001 – Test ANOVA unidirectionnel avec test Tukey).
  • la est un histogramme montrant l’intensité de fluorescence relative (en unités arbitraires) pour chaque souche de Staphylococcus aureus traitée par le composé 053 et fixée avec du PFA ou de l’éthanol. A :  souche sauvage correspondant à CIP 76.25 fixée avec du PFA , B: souche de référence correspondant à la souche SA fixé avec du PFA, C: souche surproduisant NorA correspondant à SA1199B fixée avec du PFA, D : souche délétée de NorA correspondant à SA K1758 fixée avec du PFA, E :  souche sauvage correspondant à CIP 76.25 fixée avec de l’éthanol, F: souche de référence correspondant à la souche SA fixé avec de l’éthanol, G: souche surproduisant NorA correspondant à SA1199B fixée avec de l’éthanol, et H : souche délétée de NorA correspondant à SA K1758 fixée avec de l’éthanol.
  • la représente une photo représentative d’un test d’utilisation du composé 053 à une concentration de 1µg.ml-1 sur des mutants du transporteur PatA-PatB de Streptococcus pneumoniae. Le culot « 9A » représente un culot de souche PatA-PatB sauvage. Le culot « 9B » représente un culot de souche surexprimant PatA/PatB. Le culot « 9C » représente un culot de souche ayant une délétion de PatA/PatB.
  • la est un histogramme représentant sous forme de barres les valeurs maximales d’émission de fluorescence à 642 nm (après une excitation à une longueur d’onde 530 nm) pour différentes souches de Streptococcus pneumoniae . A : souche PatA-PatB sauvage, B : souche surexprimant PatA/PatB, C : souche ayant une délétion de PatA/PatB.
  • la est une photographie représentative d’un test de l’activité de la pompe d’efflux AcrAB dans des souches de Escherichia c oli en utilisant le composé 392 à une concentration de 1 µg.mL-1. Le culot « A » représente un culot de souche ATCC 11775, souche de référence ayant une activité d’efflux normale. Le culot « B » représente un culot de souche sauvage (AG100) ayant une activité d’efflux normale. Le culot « C » représente un culot de souche AG100A correspondant à une souche mutante délétée de la pompe à efflux AcrAB. Le culot « C » représente un culot de souche AG102, souche mutante ayant une surexpression de AcrAB.
  • la représente un graphique représentatif d’un test de l’activité de la pompe d’efflux AcrAB dans des souches de Escherichia c oli en utilisant le composé 392 à une concentration de 1 µg.mL-1. Ce graphique montre l’intensité de fluorescence en fonction de la longueur d’onde (en nm). « A » représente la souche ATCC 11775, souche de référence ayant une activité d’efflux normale. « B » représente la souche sauvage (AG100) ayant une activité d’efflux normale. « C » représente la souche AG100A correspondant à une souche mutante délétée de la pompe à efflux AcrAB. « D » représente un culot de souche AG102, souche mutante ayant une surexpression de AcrAB.
  • la est un histogramme représentatif d’un test de l’activité de la pompe d’efflux AcrAB dans des souches de Escherichia c oli en utilisant le composé 392 à une concentration de 1 µg.mL-1. Il représente sous forme de barres les valeurs maximales d’émission de fluorescence à 642 nm (après une excitation à une longueur d’onde 530 nm) pour différentes souches d’ Escherichia c oli. ). « A » représente la souche ATCC 11775, souche de référence ayant une activité d’efflux normale. « B » représente la souche sauvage (AG100) ayant une activité d’efflux normale. « C » représente la souche AG100A correspondant à une souche mutante délétée de la pompe à efflux AcrAB. « D » représente un culot de souche AG102, souche mutante ayant une surexpression de AcrAB.
  • la est une photographie représentative d’un test de l’activité de la pompe d’efflux AcrAB dans des souches de Escherichia c oli en utilisant le composé 029 à une concentration de 1 µg.mL-1. Le culot « A » représente un culot de souche ATCC 11775, souche de référence ayant une activité d’efflux normale. Le culot « B » représente un culot de souche sauvage (AG100) ayant une activité d’efflux normale. Le culot « C » représente un culot de souche AG100A correspondant à une souche mutante délétée de la pompe à efflux AcrAB. Le culot « D » représente un culot de souche AG102, souche mutante ayant une surexpression de AcrAB.
  • la représente un graphique représentatif d’un test de l’activité de la pompe d’efflux AcrAB dans des souches de Escherichia c oli en utilisant le composé 029 à une concentration de 1 µg.mL-1. Ce graphique montre l’intensité de fluorescence en fonction de la longueur d’onde (en nm). « A » représente la souche ATCC 11775, souche de référence ayant une activité d’efflux normale. « B » représente la souche sauvage (AG100) ayant une activité d’efflux normale. « C » représente la souche AG100A correspondant à une souche mutante délétée de la pompe à efflux AcrAB. « D » représente un culot de souche AG102, souche mutante ayant une surexpression de AcrAB.
  • la est un histogramme représentatif d’un test de l’activité de la pompe d’efflux AcrAB dans des souches de Escherichia c oli en utilisant le composé 029 à une concentration de 1 µg.mL-1. Il représente sous forme de barres les valeurs maximales d’émission de fluorescence à 642 nm (après une excitation à une longueur d’onde 530 nm) pour différentes souches d’Escherichia c oli. ). « A » représente la souche ATCC 11775, souche de référence ayant une activité d’efflux normale. « B » représente la souche sauvage (AG100) ayant une activité d’efflux normale. « C » représente la souche AG100A correspondant à une souche mutante délétée de la pompe à efflux AcrAB. « D » représente un culot de souche AG102, souche mutante ayant une surexpression de AcrAB.
  • la est une photographie représentative d’un test de l’activité de la pompe d’efflux AcrAB dans des souches de Escherichia c oli pré-traitées au Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone (CCCP) en utilisant le composé 053 à une concentration de 1 µg.mL-1. Le culot « A » représente un culot de souche ATCC 11775, souche de référence ayant une activité d’efflux normale. Le culot « B » représente un culot de souche sauvage (AG100) ayant une activité d’efflux normale. Le culot « C » représente un culot de souche AG100A correspondant à une souche mutante délétée de la pompe à efflux AcrAB. Le culot « D » représente un culot de souche AG102, souche mutante ayant une surexpression de AcrAB.
  • la représente un graphique représentatif d’un test de l’activité de la pompe d’efflux AcrAB dans des souches de Escherichia c oli pré-traitées au Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone en utilisant le composé 053 à une concentration de 1 µg.mL-1 . Ce graphique montre l’intensité de fluorescence en fonction de la longueur d’onde (en nm). « A » représente la souche ATCC 11775, souche de référence ayant une activité d’efflux normale. « B » représente la souche sauvage (AG100) ayant une activité d’efflux normale. « C » représente la souche AG100A correspondant à une souche mutante délétée de la pompe à efflux AcrAB. « D » représente un culot de souche AG102, souche mutante ayant une surexpression de AcrAB.
  • la est un histogramme représentatif d’un test de l’activité de la pompe d’efflux AcrAB dans des souches de Escherichia c oli pré-traitées au Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone en utilisant le composé 053 à une concentration de 1 µg.mL-1. Il représente sous forme de barres les valeurs maximales d’émission de fluorescence à 642 nm (après une excitation à une longueur d’onde 530 nm) pour différentes souches d’Escherichia c oli. ). « A » représente la souche ATCC 11775, souche de référence ayant une activité d’efflux normale. « B » représente la souche sauvage (AG100) ayant une activité d’efflux normale. « C » représente la souche AG100A correspondant à une souche mutante délétée de la pompe à efflux AcrAB. « D » représente un culot de souche AG102, souche mutante ayant une surexpression de AcrAB.
    • Exemples Exemple 1 – Synthèses
  • 1- Schéma générique de synthèse de composés selon l’invention
  • Le schéma de synthèse des différents composés de l’invention est donné ci-après. Concernant trois composés spécifiques, le détail de la synthèse y compris des étapes intermédiaires et également détaillé ci-après.
    • 2- Synthèse du composé 053 2a -étape 1
  • A une solution agitée de 1,4-dinitrofluorobenzène (DFNB - 2 mL, 2,9 g, 18,23 mmol, 1 éq.) dans du dichlorométhane (DCM- 50 mL) à 0 °C, a été ajoutée la propylamine (1,5 mL, 1,08 g, 18,23 mmol, 1 éq.), suivie par l'addition de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA - 3,49 mL, 2,6 g, 20 mmol, 1,1 éq.). Le mélange réactionnel est laissé se réchauffer jusqu'à température ambiante (plus de 30 min), après quoi la réaction était complète (suivie par chromatographie en couche mince (CCM)). Le solvant a été évaporé sous vide pour donner un résidu jaune qui a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de SiO2 pour donner le produit souhaité FBP-002 sous forme d'huile jaune (2,74 g, 13,8 mmol, 76%).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C-RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6.
    • 2b -étape 2
  • A une solution de FBP-002 (3 g, 15 mmol, 1,0 éq.) dans du tétrahydrofurane (THF - 40 mL) a été ajoutée la butylamine (3,32 g, 4,48 mL, 45 mmol, 3 éq.) et le DIPEA (3,3 g, 4,3 mL, 25,5 mmol, 1,7 éq.). Le mélange réactionnel a été agité à 60 °C pendant une nuit. Puis le solvant a été évaporé et le résidu a été repris dans de l’acétate d’éthyle (EtOAc - 150 mL), lavé avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium saturé (2 x 150 mL) et de la saumure (100 mL). Les couches organiques combinées ont ensuite été séchées sur du MgSO4, filtrées et évaporées sous vide. Le brut obtenu a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de SiO2 pour obtenir le produit souhaité FBP-043 sous forme d'huile orange. (1,2 g, 4,8 mmol, rendement de 32 %).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C-RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6.
    • 2c -étape 3
  • Une solution de FBP-043 (1,174 g, 4,67 mmol, 1 éq.) dans du THF (70 mL) a été hydrogénée (P = 20 bars) en présence de Pd/C (5%, 100 mg, 1,0 %mol) pendant une nuit. Après avoir réduit la pression, la solution a été dégazée en faisant barboter de l’Argon dans le mélange. Le 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène (905 mg, 4,4 mmol, 0,95 éq.) a été ajouté à 0 °C sous agitation. En maintenant cette condition pendant 20 min, la fin de la réaction a été détectée par CCM (DCM/CH, 70/30). Le Pd/C a ensuite été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite®. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (DCM/EP, 50/50) pour donner le produit souhaité FB-005 sous forme d'un solide rougeâtre profond (1,466 g, 3,62 mmol, rendement de 77%).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 9,30 (br, 1H), 9,14 (d, J = 8 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,75 (br, 1H), 3,69 (br, 1H), 3,13 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,46 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 159,9 (d, J C-F = 271 Hz), 150,5 (d, J C-F = 13 Hz), 150,3, 145,2, 128,7, 127,8, 126,9, 110,8, 103,9 (d, J C-F = 27 Hz), 101,7, 95,2, 45,3, 43,6, 43,2, 31,7, 22,6, 20,4, 14,0, 11,7.
    • 1d -étape 4
  • À une solution agitée de FB-045 (343 mg, 0,85 mmol, 1 éq.) dans de l'acétonitrile (15 mL), on a ajouté de la méthoxyéthylamine (221 µL, 191 mg, 2,54 mmol, 3 éq.). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2 heures, lorsque l'achèvement a été suivi par CCM. Après évaporation du solvant, de l'éthanol chaud (10 mL) a été ajouté au résidu brut. Un matériau résultant ressemblant à de l'asphalte a été recueilli par filtration et lavé avec de l'eau chaude (30 mL), puis récupéré par dissolution dans du dichlorométhane, séché sur du MgSO4 anhydre et filtré. Après élimination du solvant sous pression réduite et séchage du solide sous vide, le produit souhaité FBP-051 a été isolé sous la forme d'un solide foncé de type asphalte (383 mg ; 0,83 mmol ; 98 %).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 9,26 (s, 1H), 9,13 (br, 1H), 8,36 (t, J = 4,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,71 (s, 1H), 3,79 (br, 1H), 3,67 (br, 1H), 3,54 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 3,35 (s, 3H), 3,19-3,10 (m, 4H), 3,06 (t, J = 7 Hz, 2H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,45 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 149,7, 149,3, 148,6, 145,4, 129,5, 128,8, 125,2, 124,5, 112,1, 101,6, 95,4, 93,2, 69,6, 59,1, 45,4, 43,8, 42,9, 31,8, 22,7, 20,4, 14,0, 11,7.
    • 2e -étape 5
  • Une solution du composé FBP-051 (433 mg, 0,94 mmol, 1 équiv.) dans du méthanol (20 mL) a été hydrogénée (20 bars) en présence de Pd/C (5 % en poids, 36 mg) et de HCl (12M, 0,30 mL) pendant 6 h. Puis le mélange a été agité sous air pendant 16 h. Le Pd/C a été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite® qui a été rincé plusieurs fois avec du méthanol et du dichlorométhane. Après élimination du solvant sous pression réduite, le solide résultant a été repris avec du dichlorométhane (50 mL), et extrait avec de la saumure (2 x 50 mL), la couche organique a ensuite été séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide noir brut qui a ensuite été purifié sur colonne de chromatographie sur gel d'oxyde d'alumine (DCM / MeOH) et a conduit à un solide violet profond de composé FBP-053 ou composé 053 (177 mg, 0,44 mmol, rendement de 49%).
  • 1H-NMR (400 MHz ; CD3OD): δ 7,68 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,17 (dd, J 1 = 9,2 Hz, J 2 = 1,6 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,52 (br, 1H), 4,52 (t, J = 8 Hz, 2H), 3,73 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,45 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,42 (s, 3H), 3,32 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,29 (sext, J = 1,6 Hz, 2H), 1,96 (sext, J = 7,6 Hz, 2H), 1,71 (quint, J = 7 Hz, 2H), 1,51 (sext, J = 7 Hz, 2H), 1,19 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13C NMR (101 MHz; CD3OD): δ 150,9, 139,2, 138,4, 135,5, 132,9, 131,4, 130,9, 92,4, 69,9, 57,8, 43,3, 42,7, 30,5, 20,1, 19,7, 12,9, 10,1; 5 signaux masqués ou chevauchants. Spectrométrie de masse à haute résolution: calculé pour C22H32N5O+: 382,2601; obtenu: 382,2593
    • 3- synthèse du composé 052 3a -étape 1
  • A une solution agitée de DFNB (2 mL, 2,9 g, 18,23 mmol, 1 eq.) dans du DCM (50 mL) à 0 °C, a été ajoutée la propylamine (1,5 mL, 1,08 g, 18,23 mmol, 1 eq.), suivie par l'addition de DIPEA (3,49 mL, 2,6 g, 20 mmol, 1,1 eq.). On a laissé le mélange réactionnel se réchauffer jusqu'à température ambiante (plus de 30 min), après quoi la réaction était complète (suivie par CCM). Le solvant a été évaporé sous vide pour donner un résidu jaune qui a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de SiO2 pour donner le produit FBP-002 souhaité sous forme d'huile jaune (2,74 g, 13,8 mmol, 76%).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
  • 13 C RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6.
    • 3b -étape 2
  • A une solution de FBP-002 (3 g, 15 mmol, 1,0 eq.) dans THF (40 mL) a été ajoutée la butylamine (3,32 g, 4,48 mL, 45 mmol, 3 eq.) et le DIPEA (3,3 g, 4,3 mL, 25,5 mmol, 1,7 eq.). Le mélange réactionnel a été agité à 60 °C pendant une nuit. Puis le solvant a été évaporé et le résidu a été repris dans EtOAc (150 mL), lavé avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium saturé (2 x 150 mL) et de la saumure (100 mL). Les couches organiques combinées ont ensuite été séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées sous vide. Le brut obtenu a été purifié par chromatographie sur gel sur colonne de SiO2 pour obtenir le produit FBP-043 souhaité sous forme d'huile orange. (1,2 g, 4,8 mmol, rendement de 32 %).
  • 1H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 8,52 (br, 1H), 7,99 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,89 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 5,61 (s, 1H), 4,41 (br, 1H), 3,18 (m, 4H), 1,75 (sext, J = 7,2 Hz, 2H), 1,62 (quint, J = 7,2 Hz, 2H), 1,43 (sext, J = 7,5 Hz, 2H), 1,04 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
  • 13C RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 154,5, 148,7, 129,3, 123,7, 104,8, 90,0, 44,8, 43,0, 31,3, 22,2, 20,3, 13,9, 11,8.
    • 3c -étape 3
  • Une solution de FBP-043 (1,174 g, 4,67 mmol, 1 éq.) dans du THF (70 mL) a été hydrogénée (P = 20 bars) en présence de Pd/C (5%, 100 mg, 1,0 %mol) pendant une nuit. Après avoir réduit la pression, la solution a été dégazée en faisant barboter Ar dans le mélange. Le 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène (905 mg, 4,4 mmol, 0,95 éq.) a été ajouté à 0 °C sous agitation. En maintenant cette condition pendant 20 min, la fin de la réaction a été détectée par TLC (DCM/CH, 70/30). Le Pd/C a ensuite été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite®. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (DCM/EP, 50/50) pour donner le produit souhaité FB-045 sous forme d'un solide rougeâtre profond (1,466 g, 3,62 mmol, rendement de 77%).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 9,30 (br, 1H), 9,14 (d, J = 8 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,75 (br, 1H), 3,69 (br, 1H), 3,13 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,46 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
  • 13 C RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 159,9 (d, J C-F = 271 Hz), 150,5 (d, J C-F = 13 Hz), 150,3, 145,2, 128,7, 127,8, 126,9, 110,8, 103,9 (d, J C-F = 27 Hz), 101,7, 95,2, 45,3, 43,6, 43,2, 31,7, 22,6, 20,4, 14,0, 11,7.
    • 3d -étape 4
  • À une solution agitée de FB-045 (327 mg, 0,81 mmol, 1 éq.) dans de l'acétonitrile (15 mL), on a ajouté de l'octylamine (398 µL, 311 mg, 2,41 mmol, 3 éq.). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2 heures, lorsque l'achèvement a été suivi par CCM. Après évaporation du solvant, de l'éthanol chaud (10 mL) a été ajouté au résidu brut. Un matériau résultant ressemblant à de l'asphalte a été recueilli par filtration et lavé avec de l'eau chaude (30 mL), puis récupéré par dissolution dans du dichlorométhane, séché sur du MgSO4 anhydre et filtré. Après élimination du solvant sous pression réduite et séchage du solide sous vide, le produit souhaité FBP-050 a été isolé sous la forme d'un solide foncé (392 mg, 0,76 mmol, rendement de 94 %).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 9,26 (s, 1H), 9,12 (s, 1H), 8,20 (t, J = 5 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,2 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,69 (s, 1H), 3,79 (t, J = 5 Hz, 1H), 3,65 (br, 1H), 3,13 (t, J = 7 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 2,99 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 1,97-1,50 (m, 8H), 1,45 (sext, J = 8 Hz, 2H), 1,30 (m, 8H), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,87 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
  • 13 C RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 149,7, 149,2, 148,6, 129,6, 128,8, 125,0, 124,5, 112,1, 101,6, 95,3, 93,1, 45,4, 43,9, 43,2, 31,9, 31,8, 29,3, 29,2, 28,4, 27,0, 22,7, 22,6, 20,4, 14,2, 14,0, 13,9, 11,7.
    • 3e -étape 5
  • Une solution du composé FBP-050 (316 mg, 0,61 mmol, 1 équiv.) dans du méthanol (20 mL) a été hydrogénée (20 bars) en présence de Pd/C (5 % en poids, 24 mg) et de HCl (12M, 0,25 mL) pendant 6 h. Puis le mélange a été agité sous air pendant 16 h. Le Pd/C a été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite® qui a été rincé plusieurs fois avec du méthanol et du dichlorométhane. Après élimination du solvant sous pression réduite, le solide résultant a été repris avec du dichlorométhane (50 mL), et extrait avec de la saumure (2 x 50 mL), la couche organique a ensuite été séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide noir brut qui a ensuite été purifié sur colonne de chromatographie sur gel d'oxyde d'alumine (DCM / MeOH) et a conduit à un solide violet profond, le composé FBP-052 ou composé 052 (129 mg, 0,27 mmol, rendement de 45%).
  • 1 H- RMN (400 MHz ; CD3OD): δ 7,72 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 7,18 (dd, J 1 = 9,2 Hz, J 2 = 2 Hz, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,56 (br, 1H), 4,55 (t, J = 8,2 Hz, 2H), 3,32 (m, 2H), 3,28 (quint, J = 1,6 Hz, 2H), 3,25 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,98 (sext, J = 8 Hz, 2H), 1,80-1,66 (m, 4H), 1,49 (quint, J = 8 Hz, 4H), 1,41-1,26 (m, 8H), 1,20 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,88 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
  • 13 C RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 153,3, 150,9, 139,2, 138,6, 135,4, 131,3, 130,9, 102,8, 92,4, 48,9, 43,7, 42,7, 31,7, 30,5, 29,3, 29,1, 28,1, 27,1, 22,4, 20,1, 19,7, 13,1, 12,9, 10,1. 3 signaux sont masqués ou chevauchants.
    • 4- synthèse du composé 047 4a -étape 1
  • A une solution agitée de 1,4-dinitrofluorobenzène (DFNB - 2 mL, 2,9 g, 18,23 mmol, 1 éq.) dans du dichlorométhane (DCM- 50 mL) à 0 °C, a été ajoutée la propylamine (1,5 mL, 1,08 g, 18,23 mmol, 1 éq.), suivie par l'addition de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA - 3,49 mL, 2,6 g, 20 mmol, 1,1 éq.). Le mélange réactionnel est laissé se réchauffer jusqu'à température ambiante (plus de 30 min), après quoi la réaction était complète (suivie par chromatographie en couche mince (CCM)). Le solvant a été évaporé sous vide pour donner un résidu jaune qui a été purifié par chromatographie sur gel sur colonne de SiO2 pour donner le produit souhaité FBP-002 sous forme d'huile jaune (2,74 g, 13,8 mmol, 76%).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C-RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6.
    • 4b -étape 2
  • A une solution de FBP-002 (3 g, 15 mmol, 1,0 éq.) dans du tétrahydrofurane (THF - 40 mL) a été ajoutée la butylamine (3,32 g, 4,48 mL, 45 mmol, 3 éq.) et le DIPEA (3,3 g, 4,3 mL, 25,5 mmol, 1,7 éq.). Le mélange réactionnel a été agité à 60 °C pendant une nuit. Puis le solvant a été évaporé et le résidu a été repris dans de l’acétate d’éthyle (EtOAc - 150 mL), lavé avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium saturé (2 x 150 mL) et de la saumure (100 mL). Les couches organiques combinées ont ensuite été séchées sur du MgSO4, filtrées et évaporées sous vide. Le brut obtenu a été purifié par chromatographie sur gel sur colonne de SiO2 pour obtenir le produit souhaité FBP-043 sous forme d'huile orange. (1,2 g, 4,8 mmol, rendement de 32 %).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C-RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6.
    • 4c -étape 3
  • Une solution de FBP-043 (1,174 g, 4,67 mmol, 1 éq.) dans du THF (70 mL) a été hydrogénée (P = 20 bars) en présence de Pd/C (5%, 100 mg, 1,0 %mol) pendant une nuit. Après avoir réduit la pression, la solution a été dégazée en faisant barboter de l’Argon dans le mélange. Le 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène (905 mg, 4,4 mmol, 0,95 éq.) a été ajouté à 0 °C sous agitation. En maintenant cette condition pendant 20 min, la fin de la réaction a été détectée par CCM (DCM/CH, 70/30). Le Pd/C a ensuite été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite®. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (DCM/EP, 50/50) pour donner le produit souhaité FB-005 sous forme d'un solide rougeâtre profond (1,466 g, 3,62 mmol, rendement de 77%).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 9,30 (br, 1H), 9,14 (d, J = 8 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,75 (br, 1H), 3,69 (br, 1H), 3,13 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,46 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 159,9 (d, J C-F = 271 Hz), 150,5 (d, J C-F = 13 Hz), 150,3, 145,2, 128,7, 127,8, 126,9, 110,8, 103,9 (d, J C-F = 27 Hz), 101,7, 95,2, 45,3, 43,6, 43,2, 31,7, 22,6, 20,4, 14,0, 11,7.
    • 4d -étape 4
  • À une solution agitée de FB-045 (341 mg, 0,7 mmol, 0,84 mmol, 1 éq.) dans de l'acétonitrile (15 mL), on a ajouté de la butylamine (249 µL, 186 mg, 2,52 mmol, 3 éq.). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2 heures, lorsque l'achèvement a été suivi par CCM. Après évaporation du solvant, de l'éthanol chaud (10 mL) a été ajouté au résidu brut. Un matériau résultant ressemblant à de l'asphalte a été recueilli par filtration et lavé avec de l'eau chaude (30 mL), puis récupéré par dissolution dans du dichlorométhane, séché sur du MgSO4 anhydre et filtré. Après élimination du solvant sous pression réduite et séchage du solide sous vide, le produit souhaité a été isolé sous la forme d'un solide foncé (354 mg ; 0,67 mmol ; 96 %).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl3): δ 9,26 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 8,20 (t, J = 5 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,98 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,69 (s, 1H), 3,80 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 3,67 (br, 1H), 3,13 (t, J = 7 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,7 Hz, 2H), 3,01 (q, J = 6,7 Hz, 2H), 3,06 (t, J = 7 Hz, 2H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,45 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 1,33 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,88 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
  • 13 C RMN (101 MHz ; CDCl3): δ 149,7, 149,2, 148,6, 145,4, 129,6, 128,8, 125,0, 124,5, 112,1, 101,6, 95,3, 93,1, 45,4, 43,9, 42,9, 31,8, 30,4, 22,7, 20,4, 20,2, 14,0, 13,8, 11,7.
    • 4e -étape 5
  • Une solution du composé FBP-046 (340 mg, 0,74 mmol, 1 équiv.) dans du méthanol (20 mL) a été hydrogénée (20 bars) en présence de Pd/C (5 % en poids, 29 mg) et de HCl (12M, 0,3 mL) pendant 6 heures. Puis le mélange a été agité sous air pendant 16 heures. Le Pd/C a été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite® qui a été rincé plusieurs fois avec du méthanol et du dichlorométhane. Après élimination du solvant sous pression réduite, le solide résultant a été repris avec du dichlorométhane (50 mL), et extrait avec de la saumure (2 x 50 mL), la couche organique a ensuite été séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide brut noir/violet qui a ensuite été purifié sur colonne de chromatographie sur gel d'oxyde d'alumine (DCM / MeOH) et a conduit à un solide violet profond le composé FBP-047 ou composé 047 (130 mg, 0,31 mmol, rendement 42%).
  • 1 H-RMN (400 MHz ; CD3OD): δ 7,72 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,19 (dd, J 1 = 9,2 Hz, J 2 = 2 Hz, 1H), 6,97 (s, 1H), 6,76 (s, 1H), 6,5 (br, 1H), 4,55 (t, J = 8 Hz, 2H), 3,35-3,24 (m, 8H), 1,98 (sext, J = 7,6 Hz, 2H), 1,80-1,64 (m, 4H), 1,51 (quint, J = 7,2 Hz, 4H), 1,20 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,02 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
  • 13 C RMN (101 MHz ; CD3OD): δ 153,3, 150,8, 139,2, 138,5, 135,3, 132,6, 131,3, 130,8, 119,7, 102,7, 92,4, 89,3, 48,9, 43,4, 42,8, 30,5, 30,2, 20,3, 20,1, 19,7, 13,0, 10,1. 1 signal est masqué ou chevauchant.
    • 5- synthèse du composé 029
  • Une solution du composé FBP-025 (356 mg, 0,78 mmol, 1 équiv.) dans du méthanol (20 mL) a été hydrogénée (20 bars) en présence de Pd/C (5 % en poids, 30 mg) et de HCl (12M, 0,3 mL) pendant 6 h. Puis le mélange a été agité sous air pendant une nuit. Le Pd/C a été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite® qui a été rincé plusieurs fois avec du méthanol et du dichlorométhane. Après élimination du solvant sous pression réduite, le solide résultant a été repris avec du dichlorométhane (50 mL), et extrait avec de la saumure (2 x 50 mL), la couche organique a ensuite été séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide noir brut qui a ensuite été purifié sur une colonne de chromatographie sur gel d'oxyde d'alumine (Brockman activity I) (DCM / MeOH) et a conduit à un solide violet profond (160 mg, 39 mmol ; 50 %).
  • 1H-RMN (400 MHz ; CD3OD): δ 7.68 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.16 (dd, J 1 = 9.2 Hz, J 2 = 2 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.5 (br, 1H), 4.54 (t, J = 8 Hz, 2H), 3.32-3.19 (m, 8H), 1.89 (m, 2H), 1,79 (quint, J = 7.4 Hz, 2H), 1.73-1.58 (m, 4H), 1.49 (quint, J = 7.5 Hz, 2H), 1.1 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.08 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
  • 13C RMN (101 MHz ; CD3OD): δ 153.3, 150.8, 139.2, 138.5, 135.3, 132.6, 131.3, 130.8, 119.7, 102.7, 92.4, 89.3, 48.9, 43.4, 43.3, 42.6, 30.5, 30.2, 20.3, 20.2, 19.7, 13.0, 10.2.
    • 6- synthèse du composé 392 ou 44
  • Une solution du composé TM390 (3,08g, 5,8 mmol, 1 équiv.) dans du méthanol (60 mL) a été hydrogénée (40 bars) en présence de Pd/C (5 % en poids, 617 mg) et de HCl (12M, 1 mL) pendant 16 h. Puis le mélange a été agité sous air pendant 16 h. Le Pd/C a été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite® qui a été rincé plusieurs fois avec du méthanol et du dichlorométhane. Après élimination du solvant sous pression réduite, le solide résultant a été purifié sur colonne de chromatographie sur gel d'oxyde d'alumine (DCM / MeOH 95:5 -> 90:10) et a conduit au TM 392 sous forme de solide violet profond (rendement de 3%).
  • 1H-RMN (400 MHz ; CD3OD): δ 7.56 (d, 3 J = 8.97 Hz, 1H), 7.11 (dd, 3 J = 9.25 Hz, 4 J = 1.87 Hz, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.34 (br, 1H), 4.44 (t, 3 J = 7.99 Hz, 2H), 3.76 (t, 3 J = 5.29 Hz, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.41 (t, 3 J = 5.41 Hz, 2H), 3.27 (t, 3 J = 7.09 Hz, 2H), 1.85-1.32 (mm, 16H), 1.04 (t, 3 J = 7.2 Hz, 3H), 0.92 (t, 3 J = 7.08 Hz, 3H).
  • Exemple 2 – Identification de l’efflux d’antibiotique et de quantification de son efficacité
  • L’efflux d’antibiotiques est un phénomène reconnu d’une extrême gravité par les instances de santé du monde entier. Il concerne l’ensemble des bactéries mais est évidemment majoritairement préoccupant dans un contexte hospitalier, en réanimation, chirurgie orthopédique ou thoracique et dans les infections associées au diabète.
  • L’efflux d’antibiotique, par sa polyspécificité, est identifié depuis longtemps comme un complément aux mécanismes de résistance plus classiques (mutation de cible, enzymes telles que Beta-lactamase, etc.), mais plus récemment, comme intervenant en amont des autres mécanismes, favorisant leur sélection.
  • Alors qu’il existe des méthodes d’identification des principaux mécanismes de résistance dans les laboratoires de biologie, l’efflux n’est pas identifié et pas identifiable par une méthode standardisée sauf par des déductions pas toujours très fiable.
  • Il est donc nécessaire de mettre au point une méthode d’identification de l’efflux d’antibiotique et de quantification de son efficacité. Le composé 053 par ses caractéristiques de coloration et de fluorescence s’est avéré un excellent outil pour mener à bien ce type de projet.
    • Exemple 2-1 : Staphylococcus aureus
  • Matériels et méthodes :
  • Souches bactériennes : les inventeurs ont utilisé les souches de Staphylococcus aureus suivantes :
  • - CIP 76.25, souche de référence produisant un niveau basal de NorA,
  • - SA1199 souche de référence produisant un niveau basal de NorA,
  • - SA 1199B surproductrice de la pompe NorA, et
  • - SA K1758 délétée du gène NorA, (Kaatz et al., 2003, Antimicrob Agents Chemother. 2003 Feb;47(2):719-26).
  • Composé : Le composé 053 (voir synthèse en exemple 1) est préparé dans du DMSO pur (Sigma) à une concentration de 20 mg/mL. Il sera ensuite dilué dans de l'eau milliQ pour obtenir une solution mère de 1000 μg/mL.
  • Coloration des bactéries : les bactéries en phase exponentielle de croissance sont incubées pendant 15 min en présence du composé 053. Ensuite les bactéries sont lavées deux fois en tampon phosphate et centrifugées, les culots sont observés à l’œil nu.
  • Mesure de fluorescence : Les bactéries en phase exponentielle de croissance sont incubées pendant 15 min en présence du composé 053. La densité optique à 600nm est ensuite ajustée à 0,5 et 50 µL sont transférés dans une plaque de micro-titration noire. La fluorescence est lue dans un lecteur de microplaques Tecan M200.
  • Le protocole suivant a été suivi :
  • 1. Cultiver les bactéries sur une plaque de gélose Muller Hilton-II (MH-II) fraîchement préparée. Incuber la boîte de Petri pendant une nuit à 37°C (Remarque : la température d'incubation et le temps de croissance dépendent des bactéries utilisées pour l'expérience).
  • 2. Le lendemain matin, prélever une ou deux colonies de la plaque cultivée pendant la nuit et les inoculer dans un erlenmeyer contenant 20 ml de bouillon MH-II.
  • 3. Incuber l’erlenmeyer sur un incubateur à agitation orbitale à 37°C et 160 rpm pendant 3-4 h. Note : Cette étape permet d'obtenir des cellules en phase exponentielle, il faut donc considérer le temps de doublement des bactéries utilisées.
  • 4. Après l'incubation, transférer les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger les cellules à 4500 rpm pendant 10 minutes. Jeter le surnageant. Ajouter du bouillon MH-II frais dans le tube de centrifugation et ajuster la densité optique des cellules à 0,5.
  • 5. Transférer une partie aliquote (5 mL) des cellules dont la densité optique a été ajustée dans un nouveau tube à centrifuger (50 mL). Ajouter à ce tube 3,75 µL de la solution mère du composé 053 (1000 µg/mL). Boucher les tubes et les agiter soigneusement pour mélanger le composé. Ensuite, gardez le tube de centrifugation sur la table pendant 15 minutes à température ambiante. Note : Il est préférable d'avoir une plus grande surface pour faciliter l'agitation. La concentration finale de 053 utilisée pour l'expérience est de 0,75 µg/mL. Ne pas incuber plus de 15 minutes.
  • 6. Après 15 minutes de temps de contact, centrifuger les tubes pendant 10-15 minutes à 4 500 rpm pour obtenir des culots cellulaires et éliminer le surnageant. À l'aide de 5 mL de solution saline tampon phosphate (PBS, pH 7) ou de tampon phosphate de potassium, laver soigneusement les culots cellulaires (PBS, pH 7) répéter deux fois cette opération. Note : Pipeter à plusieurs reprises avec une pipette de 5 mL ou 1 mL pendant le lavage. S'assurer qu'il n'y a pas de grumeaux pendant le pipetage. Le but du lavage est d'éliminer l'excès de colorant de la surface des cellules.
  • 7. La variation de couleur dans les cellules est visible à l'œil nu sur le culot cellulaire après les deux lavages.
  • a. Les cellules qui surexpriment la pompe d'efflux (c'est-à-dire qui sont résistantes) seront de couleur blanche ou blanc cassé (couleur par défaut des cellules).
  • b. Les cellules présentant une activité d'efflux normale ou modérée seront de couleur légèrement rose.
  • c. Les cellules dépourvues de pompes d'efflux ou dont les pompes d'efflux sont dysfonctionnelles seront colorées en rose foncé.
  • d. Parfois, les culots cellulaires sont de couleur orange, ce qui indique une activité d'efflux modérée, ceci est principalement dû à la couleur jaune inhérente des cellules.
  • RESULTATS :
  • Les figures 1 à 3 montre la différence de couleur (1A) et la différence spectrofluorométrique (1B) observées dans différentes souches de référence (souche A, CIP 76.25), une souche clinique (souche B, SA1199) et des mutants de la pompe d'efflux norA construits en laboratoire de la souche B : NorA surexprimant (souche C, SA 1199B) et NorA délété (souche D, SA K1758). Comme la souche C présente une pompe d'efflux surexprimée, l'efflux de 053 est plus fort, et le culot cellulaire apparaît blanc (053 est complètement éliminé par efflux). En revanche, comme la souche D n'a pas de pompe d'efflux, le culot cellulaire apparaît rose foncé. Des couleurs intermédiaires peuvent être observées pour les souches de référence (souche A) et les souches cliniques (souche B), suggérant une activité légère à modérée. Ceci est confirmé par la spectroscopie de fluorescence (figure s 2 et 3). La montre le spectre d’émission de fluorescence du composé 053 dans les cellules bactériennes après une excitation à 530nm. La montre les histogrammes obtenus en rapportant les valeurs d’intensité de fluorescence à 642 nm obtenues après une excitation à 530 nm.
  • Les résultats obtenus en colorimétrie (Figure s 1 à 3) montrent clairement que le composé 053 permet de distinguer visuellement 3 niveaux de coloration des souches :
  • 1. Une coloration rose foncé correspondant à des souches dépourvues de la pompe d'efflux NorA (SAK 1758).
  • 2. Une absence de coloration pour les souches surproduisant la pompe NorA (SA 1199B).
  • 3. Une coloration rose pâle intermédiaire pour les souches produisant des niveaux basaux de pompe (SA 1199 et CIP 76.25).
  • Il est donc possible d'identifier, parmi les isolats, ceux qui surproduisent la pompe d'efflux NorA, qui ont donc un potentiel de résistance aux antibiotiques très élevé, et de les différencier des isolats produisant un niveau basal.
  • Les résultats spectrofluorimétriques ( ) montrent que le composé 053 est fluorescent lorsqu'il est accumulé dans les bactéries et que, comme la coloration, la fluorescence dépend du niveau de production de la pompe NorA.
  • 1. La fluorescence de la souche surproductrice (SA 1199B) est presque nulle (Figures 2 et 3, courbe et histogramme verts).
  • 2. Le mutant sans pompe NorA (SAK 1758) a une fluorescence élevée à 670 nm (Figures 2 et 3, courbe et histogramme noirs).
  • 3. Les deux souches produisant de faibles niveaux de pompes (CIP 76.25, SA 1199) présentent des niveaux intermédiaires de fluorescence (Figures 2 et 3, courbes et histogrammes rouges et bleus).
  • Contrairement au test colorimétrique qui ne nécessite pas de matériel de lecture particulier, la fluorescence nécessite un spectrofluorimètre adapté. En revanche, la mesure de fluorescence est quantitative et permet de déterminer avec précision le niveau d'activité d'efflux des isolats.
  • Les inventeurs ont également procédé à une lecture de la fluorescence par cytométrie en flux afin de valider les résultats précédemment obtenus en spectrofluorimétrie. Avantageusement, la cytométrie en flux ne considère que la fluorescence au sein de la cellule et non pas celle l’environnant, permettant ainsi d’évaluer directement la concentration du composé 053 au sein de la cellule sans nécessité de rinçage.
  • Les résultats sont cohérents avec ceux précédemment obtenus. La montre l’intensité de fluorescence mesurée en cytométrie en flux d’une souche sauvage correspondant à CIP 76.25 (WT- A), d’une souche de référence correspondant à la souche SA (Ref strain - B), d’une souche surproduisant NorA correspondant à SA1199B (NorA overproducer - C) et d’une souche délétée de n orA correspondant à SA K1758 (NorA deleted - D). Les résultats en cytométrie montrent que le composé 53 s’accumule modérément dans les souches sauvages et de référence, qu’il s’accumule très peu dans la souche surexprimant NorA et enfin qu’il s’accumule fortement dans la souche délétée de n orA.Les inventeurs ont également testé l’incidence que pourrait avoir un agent de fixation tel que le paraformaldéhyde (PFA) 1% poids/volume ou l’éthanol froid 70% sur les cellules traitées au composé 053. La montre l’intensité de fluorescence relative pour chaque souche traitée par le composé 053 et avec du PFA (A-D) ou de l’éthanol (E-H). Quel que soit l’agent de fixation utilisé, le différentiel d‘efflux entre les différentes souches reste visible prouvant la robustesse de la méthode indépendamment de l’environnement de fixation.
    • Exemple 2-2 : Bacillus subtilis MATERIELS ET METHODES :
  • Souches bactériennes : les inventeurs ont utilisé
  • - la souche de référence Bacillus subtilis 168 (DSM 402) produisant un niveau basal de BmrA,
  • - Bacillus subtilis BmrA+++ surproduisant la pompe BmrA et
  • - Bacillus subtilis BmrA Δ délétée du gène BmrA.
  • (voir Steinfels E et al. Biochemistry 43: 7491–7502 et Krügel H et al. FEMS Microbiol Lett . 2010 Dec;313(2):155-63 ).
  • Les protocoles utilisés sont identiques à ceux mis en œuvre pour l’exemple 2-1.
    • RÉSULTATS :
  • Les figures 4 à 6 montrent la différence de couleur ( ) et la différence spectrofluorométrique (Figures 5 et 6) observées sur les différentes souches de Bacillus subtilis. La souche A est la souche sauvage de B. subtilis 168 (DSM 402), la souche B, BmrA+++, est un mutant surexprimant BmrA et la souche C est un mutant délété de BmrA (BmrAΔ). Puisque la souche B présente une surexpression de la pompe d'efflux BmrA, le composé 053 est complètement efflué hors de la cellule, et le culot cellulaire apparaît blanc. En revanche, pour la souche C qui ne possède pas de pompe d'efflux, le culot cellulaire apparaît rose foncé. La souche A est une souche sauvage normale exprimant une activité d'efflux normale ; le composé 053 est donc partiellement efflué et le culot cellulaire apparaît rose pâle, ce qui suggère une activité légère à modérée. Une activité similaire est confirmée et quantifiée en utilisant une spectroscopie de fluorescence (Figures 5 et 6).
  • Comme observé sur la en colorimétrie, il est clair que le composé 053 permet de distinguer visuellement le mutant BmrA à 3 niveaux de coloration :
  • 1. Une coloration rose foncé correspondant aux souches dépourvues de la pompe d'efflux BmrA (BmrAΔ),
  • 2. Absence de coloration pour les souches surproduisant la pompe BmrA (BmrA +++)
  • 3. Une coloration rose pâle intermédiaire pour les souches produisant des niveaux basaux (normaux, type sauvage) de pompe.
  • Il est donc possible d'identifier, parmi les isolats cliniques, ceux qui surproduisent la pompe d'efflux BmrA, un transporteur ABC (ATP-binding cassette) de taille moyenne impliqué dans la multirésistance aux médicaments.
  • Les résultats spectrofluorimétriques (Figures 5 et 6) sont conformes et valident quantitativement les résultats. Le composé 053 est fluorescent lorsqu'il est accumulé dans les bactéries et que, comme la coloration, la fluorescence dépend du niveau de production de la pompe BmrA.
  • 1. La fluorescence de la souche surproductrice (BmrA+++) est presque nulle (Figures 5 et 6, courbe et histogramme)
  • 2. Celle du mutant dépourvu de pompe (BmrAΔ) est très élevée avec un maximum à 642 nm (Figures 5 et 6, courbe et histogramme).
  • 3. La souche sauvage (DSM 402) produisant de faibles niveaux de pompes présente des niveaux intermédiaires de fluorescence (Figures 5 et 6, courbe et histogramme).
  • Contrairement au test colorimétrique qui ne nécessite pas de matériel de lecture particulier, la fluorescence nécessite un spectrofluorimètre adapté. En revanche, la mesure de fluorescence est quantitative et permet de déterminer avec précision le niveau d'activité d'efflux des isolats.
    • Exemple 2-3 : Streptococcus pneumoniae
  • Les inventeurs ont comparé la coloration induite par le composé 053 sur différentes souches de bactéries Streptococcus pneumoniae  : une souche sauvage (« WT »), une souche surexprimant PatA-PatB, un transporteur ABC de Streptococcus pneumoniae permettant le transport de molécules à l’extérieur de la cellule impliqué dans la résistance de ce pathogène à des antibiotiques de types fluoroquinolones (« OVP »), et une souche délétée de PatA-PatB (« DEL »).
    • MATERIELS ET METHODES :
  • Souches bactériennes : les inventeurs ont utilisé
  • -WT : la souche de référence Streptococcus pneumoniae produisant un niveau basal de PatA-PatB
  • - OVP : souche surproduisant PatA-PatB
  • - DEL : souche délétée du gène codant pour PatA-PatB
  • Les protocoles utilisés sont identiques à ceux mis en œuvre pour l’exemple 2-1.
    • RÉSULTATS :
  • Les figures 9 et 10 montrent la différence de couleur ( ) et la différence spectrofluorométrique ( ) observées sur les différentes souches de Streptococcus pneumoniae.
  • Puisque la souche OVP présente une surexpression du transporteur PatA-PatB, le composé 053 est fortement efflué hors de la cellule, et le culot cellulaire apparaît blanc. En revanche, pour la souche WT et la souche DEL qui ne possède pas de transporteur PatA-PatB, le culot cellulaire apparaît rose foncé. Une activité similaire est confirmée et quantifiée en utilisant une spectroscopie de fluorescence ( ).
  • Le composé 053 permet donc de distinguer qualitativement et quantitativement une souche surexprimant un transporteur ABC PatA-PatB d’une souche ne surexprimant pas ou n’exprimant pas du tout ce transporteur.
    • Exemple 2-4: Escherichia coli
  • a) Composés 392 et 29.
  • Les inventeurs ont testé l’utilisation du composé 392 et du composé 29 sur différentes souches d’E. coli présentant des niveaux variables d’expression de la pompe à efflux AcrAB.

    • MATERIELS ET METHODES :
  • Le protocole expérimental est le même que celui décrit dans les exemples précédents à la différence des souches bactériennes utilisées. Brièvement, les composés 29 et 392 (1 μg/mL) ont été ajoutés à 5ml d’une suspension cellulaire de différentes souches d’E. coli (DO=1.5), mélangé par inclinaison et laissé à reposer sur la table à température ambiante pendant 15 min. Puis, les cellules ont été centrifugées à 3,500 rpm pendant 10 minutes et rincées avec du tampon phosphate de potassium (PBP). Une seule étape de lavage du culot cellulaire a été réalisée.
    • Souches bactériennes :
  • Souche Description Abbreviation
    EC (ATCC 11775) Bactérie de référence avec activité d’efflux normal EC (ref)
    AG100 Bactérie sauvage (parent) WT
    AG100A Bactérie avec une délétion acrAB Δ acrAB
    AG102 Bactérie surexprimant acrAB acrAB+++
    • RESULTATS :
  • Les figures 11 à 16 montrent la différence de couleur (Figures 11 et 14) et la différence spectrofluorimétrique (Figures 12, 13, 15 et 16) observées sur les différentes souches de Escherichia coli. La souche EC (ref) est la souche de référence (ATCC 11775) présentant un efflux normal, la souche AG100 est la souche sauvage de E. coli (Wild) présentant également un efflux normal, la souche AG102 est un mutant surexprimant AcrAB (acrAB+++) présentant un fort efflux et la souche AG100A (Δ acrAB) est un mutant délété de acrAB présentant un faible efflux.
  • Comme visible sur les figures 11 et 14, les bactéries présentant un efflux normal (EC et AG100) sont marquées d’un rose très pale tandis que la souche présentant une délétion du gène codant la pompe AcrAB (AG100A) présent un marquage rose foncé. A l’opposée, la souche présentant une surexpression d’AcrAB (AG102) n’est pas marquée. La même différence d’activité d’efflux entre les différentes souches est confirmée et d’autant plus marquée en spectroscopie de fluorescence (Figures 12, 13, 15 et 16).
  • b) Composé 053
  • Les inventeurs ont également testé le composé 053 (1 µg/mL) sur les mêmes souches d’ Escherichia c oli présentant des niveaux variables d’expression de la pompe à efflux AcrAB. Le protocole a été légèrement modifié pour introduire une étape de pré-traitement des souches avec du Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone (CCCP). Le CCCP est un inhibiteur chimique de phosphorylation oxydative. Il interfère avec le gradient électrochimique transmembranaire et la force proton-motrice et par conséquent réduit la production d’ATP. Le CCCP a pour effet de réduire l’efficacité des pompes à efflux, ce qui permet de mieux percevoir les différences de marquages entre les différentes souches.
  • Structure chimique du CCCP
    • MATERIELS ET METHODES :
  • Le protocole expérimental est le même que celui décrit dans les exemples à la différence que les cellules sont traitées pendant 1h avec du CCCP (5µg/mL) dans un tampon phosphate (PPB). Après traitement au CCP, l’ensemble de l’expérience se déroule dans du PPB à la place du bouillon MH-II à partir de l’étape 4.
    • RESULTATS :
  • Comme visible sur la , il est visuellement possible de distinguer les souches présentant un efflux normal (EC, AG100) ou une absence d’efflux (AG100A) de la souche surexprimant AcrAB (AG102). L’analyse en spectroscopie par fluorescence (Figures 18 et 19) permet de confirmer cette observation.
    •

Claims (14)

  1. Composé de formule I suivante :
    (I)
    où X- est un atome halogène, ou un contre ion acceptable, notamment Cl,
    où R1 et R2 sont
    - soit conjointement -CH3, ou-C4H9
    - soit un alkyle en C1-C4, tel que si R1 est un alkyle en Cn+ i, R2 est un alkyle en Cn, et inversement, n étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4;
    - soit R1 est -C4H7 et R2 est C8H17,
    et
    où R3 est un -CH3, ou un alkyle en C2-C8, ledit alkyle en C2-C8étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes ;
    ou un sel ou un solvate de ce composé de forme I, ou une forme protonée de celui-ci.
  2. Composé selon la revendication 1:
    où R1 et R2 sont
    - soit conjointement -CH3,
    - soit un alkyle en C1-C4, tel que si R1 est un alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, et inversement, n étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4;
    et
    où R3 est un -CH3, ou un alkyle en C2-C8, ledit alkyle en C2-C8étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes ;
    ou un sel ou un solvate de ce composé de forme I, ou une forme protonée de celui-ci.
  3. Composé selon la revendication 1 ou la revendication 2, où R1 et R2 sont chacun un alkyle en C2-C4, tels que :
    - si R1 est un alkyle en Cn+ i, R2 est un alkyle en Cn, ou
    - si R2 est un alkyle en Cn+ i, R1 est un alkyle en Cn,
    n variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4.
  4. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, où R3 est un groupement alcoxy en C2-C4, un groupe dimethylamineéthyle ou methylaminexethyle.
  5. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, ledit composé étant choisi dans le groupe des composés de formule I, où R1, R2 et R3 sont conjointement tels qu’indiqués dans chaque ligne du tableau qui suit : composé R1 R2 R3 méthyle méthyle propyle méthyle éthyle propyle éthyle méthyle propyle éthyle propyle propyle propyle éthyle propyle propyle butyle propyle butyle propyle propyle méthyle méthyle butyle méthyle éthyle butyle éthyle méthyle butyle éthyle propyle butyle propyle éthyle butyle propyle butyle butyle #47 butyle propyle butyle méthyle méthyle méthoxyéthyle méthyle éthyle méthoxyéthyle éthyle méthyle méthoxyéthyle éthyle propyle méthoxyéthyle propyle éthyle méthoxyéthyle propyle butyle méthoxyéthyle #53 butyle propyle méthoxyéthyle #52 butyle propyle octyle #392 butyle octyle méthoxyéthyle #29 butyle butyle propyle
  6. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, ledit composé étant choisi parmi les composés de formules 47, 52, 53, 392 et 29 suivantes :
    (47),
    (52),
    (53),
    (392), et
    (29).
  7. Utilisation d’un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, pour évaluer ou mesurer l’efflux dudit composé par une bactérie.
  8. Utilisation selon la revendication 7, pour évaluer ou mesurer l’efflux par une bactérie à Gram positif.
  9. Utilisation selon la revendication 7, pour évaluer ou mesurer l’efflux par une bactérie à Gram négatif.
  10. Kit de détection ou de mesure de l’efflux bactérien, comprenant
    - un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, et
    - au moins une bactérie contrôle.
  11. Kit de détection selon la revendication 10, comprenant en outre un protonophore notamment choisi parmi le 2,4-dinitrophenol, le Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), le Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), le C4R1, l’Ellipticine, le 10-[2-(3-hydroxy-6-oxo-xanthen-9-yl)benzoyl]oxydecyl-triphenyl-phosphonium bromide et le 2-(2-Hydroxyaryl)hexylphosphonium bromide.
  12. Utilisation d’un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, pour évaluer la résistance d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide.
  13. Méthode d’évaluation d’une résistance due à un mécanisme d’efflux d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide, comprenant :
    - la mise en culture de bactéries dans un milieu de culture approprié, pour obtenir une culture de bactéries,
    - la mise en contact de la culture de bactéries avec un composé tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 6, pour obtenir une culture de bactéries traitées,
    - le lavage de la culture de bactérie traitées, et la précipitation des bactéries contenues dans la culture de bactéries traitées pour obtenir un culot de bactéries,
    - l’observation de la coloration du culot de bactéries, tel que
    - si le culot de bactéries présente la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie est résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide, par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide, et
    - si le culot de bactéries présente une couleur différente de la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie n’est pas résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide.
  14. Méthode selon la revendication 13, ladite méthode comprenant en outre une étape d’incubation de la culture de bactéries avec un protonophore.
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