EP4448276A1 - Substratspezifische adhäsive peptide - Google Patents

Substratspezifische adhäsive peptide

Info

Publication number
EP4448276A1
EP4448276A1 EP22835223.3A EP22835223A EP4448276A1 EP 4448276 A1 EP4448276 A1 EP 4448276A1 EP 22835223 A EP22835223 A EP 22835223A EP 4448276 A1 EP4448276 A1 EP 4448276A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
amino acid
sequence
seq
amino acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22835223.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Iva ANIC
Christian Kastner
Irmgard Schmidt
Roland Breves
Andreas Taden
Kenji Ito
Shohana ISLAM
Christian DEGERING
Susanne Wieland
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP4448276A1 publication Critical patent/EP4448276A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09J—ADHESIVES; NON-MECHANICAL ASPECTS OF ADHESIVE PROCESSES IN GENERAL; ADHESIVE PROCESSES NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE; USE OF MATERIALS AS ADHESIVES
    • C09J189/00—Adhesives based on proteins; Adhesives based on derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09J—ADHESIVES; NON-MECHANICAL ASPECTS OF ADHESIVE PROCESSES IN GENERAL; ADHESIVE PROCESSES NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE; USE OF MATERIALS AS ADHESIVES
    • C09J2489/00—Presence of protein

Definitions

  • the invention relates to a peptide as described herein.
  • the invention also relates to peptides or polypeptides which comprise at least two of the peptides described herein in the form of multimers, a nucleic acid sequence which codes for the peptide according to the invention, agents comprising at least one peptide according to the invention and the use of such peptides or agents for binding/adhesion to plastic surfaces.
  • LSEP low surface energy polymers
  • the inventors have found and developed specific peptides which, surprisingly, are suitable for adhesion to plastic surfaces, in particular LSEP (low surface energy polymers) surfaces, and partially or completely solve the abovementioned problems.
  • LSEP low surface energy polymers
  • the invention relates to a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence of 4 to 50 amino acids, wherein
  • amino acid sequence in N- to C-terminal orientation has the following sequence (C)mXlX2X 3 (X4)nX5(C)o, where
  • Xi is a positively charged amino acid
  • X2 and X3 are uncharged amino acids, each X4 is independently any amino acid,
  • the invention relates to a multimer of the above-mentioned peptides, which comprises two or more of the amino acid sequences mentioned, preferably in the form of a peptide or polypeptide.
  • the invention relates to a nucleic acid sequence encoding the peptides and polypeptides described herein.
  • the invention relates to an agent which comprises one or more of the peptides or polypeptides according to the invention.
  • the invention relates to the use of at least one peptide or one containing this peptide for adhesion or binding to plastic surfaces, the peptide having the amino acid sequence according to one of SEQ ID NOs: 1-27, preferably of SEQ ID NOs: 1-15, 16- 17 or 18-22, or is a variant thereof which has at least 80%, preferably at least 90%, sequence identity to any of the sequences indicated.
  • At least one refers to 1 or more, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more.
  • the information refers to the type of ingredient and not to the absolute number of molecules.
  • At least one peptide thus means, for example, at least one type of peptide, i.e. one type of peptide or a mixture of several different peptides can be meant.
  • the information relates to all compounds of the specified type that are contained in, for example, a composition or an agent, i.e. the composition or agent typically does not contain any other compounds of this type beyond the specified amount of the corresponding compounds.
  • the invention relates to a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence of 4 to 50 amino acids in length, preferably of at least 8, 9, 10, 11 or 12 amino acids in length. Preferred lengths are up to 40, up to 35, up to 30, or up to 25 or up to 24 amino acids.
  • the peptide can have a length of 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 amino acids, in particular 12 to 18 amino acids.
  • the peptides of the invention have the following amino acid sequence in the N- to C-terminal orientation
  • Xi is a positively charged amino acid, preferably R or K, more preferably R,
  • a “peptide” in the context of the present invention is to be understood as meaning a polymer composed of amino acids, preferably the 20 proteinogenic L-amino acids, preferably linear in structure and having up to 100 amino acids which are linked to one another via peptide bonds.
  • the peptides of the invention have an amino acid sequence of 4 to 50 amino acids.
  • the amino acids are given in the context of this invention in the one-letter code, where for example C stands for cysteine, R for arginine, A for alanine and L for leucine.
  • C in the above sequence (C) m XiX2X3(X4)nX5(C) 0 represents a cysteine residue.
  • the amino acids in an amino acid sequence disclosed herein are linked via peptide bonds and, unless otherwise indicated, the sequence is presented in the N- to C-terminal orientation.
  • N-terminus or “N-terminal” describes the end of the amino acid chain of the peptide according to the invention which has a free amino group.
  • C-terminus or “C-terminal” describes the end of the amino acid chain of the peptide according to the invention, which has a free carboxyl group.
  • the expression “in the N- to C-terminal orientation” refers to an amino acid sequence in which the order of the amino acids is described starting from the N-terminus towards the C-terminus.
  • Typical acidic or negatively charged amino acids are D and E.
  • Amino acids that are positively charged or basic typically include R, K, and H.
  • Amino acids such as G, A, C, I, L, M, F, V, P, S, T, W, Y, N and Q are typically uncharged i.e. neutral amino acids.
  • any amino acid it is usually meant to be one of the 20 naturally occurring proteinogenic amino acids, i.e. one of glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I ), phenylalanine (F), serine (S), threonine (T), proline (P), methionine (M), cysteine (C), histidine (H), lysine (K), arginine (R), glutamine (Q ), asparagine (N), aspartic acid (D), glutamic acid (E), tyrosine (Y) and tryptophan (W).
  • the amino acids are typically L-amino acids unless otherwise indicated.
  • the peptide can also consist of D-amino acids, although it can be preferred that D- and L-amino acids do not occur simultaneously within the peptides described herein.
  • such any amino acid encompasses all of the foregoing amino acids with the exception of proline, and in some embodiments also with the exception of proline and glycine. These two amino acids are not preferred in certain embodiments because they have helix-breaking properties and can therefore adversely affect the secondary structure of the peptides.
  • the peptide according to the invention has an overall charge of -2 to +12, preferably from 0 to +8, more preferably from 0 to +4, in particular from 0 to +2.
  • the overall charge of the peptide is based on the number of positively and negatively charged amino acids in the peptide, specifically arginine (R), lysine (K), histidine (H), aspartic acid (D), and glutamic acid (E), and is the sum of the negative and positive charges, with one positive and one negative charge canceling each other out.
  • a peptide with 2 arginine residues and 1 glutamic acid residue would have thus a total charge of +1.
  • the overall charge of the peptide is preferably -2 to +12, more preferably 0 to +8, even more preferably 0 to +4, especially 0 to +2.
  • the peptide has a net negative or neutral charge at the “C-terminus comprising the last 3-6 amino acids” means that the number of charged amino acids must be 0 or the number of negatively charged amino acids, i.e. D and E, must be greater than the number of positively charged.
  • An example of such a C-terminal sequence would be EAL or the double sequence of this motif.
  • the sequence X1X2X3 is RAL, RSI or RLA, preferably RAL or RLA, in particular RAL.
  • the N-terminal sequence RAL or RLA not only advantageously has a positive net charge, it also includes amino acids with a particularly high alpha-helix-forming potential, as explained further below.
  • the arginine residue can also be replaced by lysine, but the N-terminal arginine residue is particularly preferred.
  • the sequence (X4)nX5 comprises at least one sequence XeXyXs, where Xe is a charged or uncharged amino acid, preferably R, K, E, L, A or Q, more preferably R, K, E or Q, and Xz and Xs are independently uncharged amino acids excluding P and G, preferably A, L, Q or M, more preferably A or L; and or
  • (ii) (X4)n comprises at least one aromatic amino acid, preferably W or F.
  • sequence XeXzXs includes an Xe which is R or K
  • the sequence XeXzXs is preferably not at the C-terminus and preferably not within the 6 C-terminal amino acids.
  • the sequence (X4)nX5 may comprise one or more further sequences XeXyXs C-terminal to the sequence comprising as Xe a positively charged amino acid, these further sequences then preferably having no positively charged amino acid as Xe.
  • one of the sequences XeXzXe that is close, i.e. within the 6 C-terminal amino acids, or at the C-terminus, has as Xe a negatively charged amino acid, for example E.
  • a positively or negatively charged amino acid is located next to, in particular C-terminally, such an aromatic amino acid, in particular there is no further aromatic amino acid next to the aromatic amino acid.
  • the aromatic amino acids phenylalanine (F) and tryptophan (W) are preferably used in the peptide sequence according to the invention as helix formers and/or for pi-stacking.
  • the aromatic amino acid tyrosine (Y) is not used in the peptide sequence in various embodiments because of its helix-breaking properties. In various embodiments, therefore, the peptide is free of Y residues.
  • Pore stacking in the context of the present invention refers to the non-covalent interaction between aromatic ring systems.
  • (ii) (X4)nXs comprises at least one sequence XeXzXs, wherein XeXzXs is EAL or ELA, preferably EAL, and wherein said sequence is preferably not located in the N-terminal amino acids of positions 1-6; and or
  • (X4)nXs comprises at least one sequence XeXzXs, where XeXzXs is QAL or QLA, preferably QAL.
  • (X4)nX5 comprises at least one sequence XeXyXs, where XeXyXs is QLA or EQA, which sequence is preferably not located in the N-terminal amino acids of positions 1-6 or 1-11.
  • (X4)nX5 comprises at least one sequence XeXyXsXg, where XeXyXsXg is AQLA or SEQA, which sequence is preferably not located in the N-terminal amino acids of positions 1-6 or 1-11.
  • the peptide comprises the sequence X1X2X3, where X1X2X3 is RAL, and (X4)nXs comprises at least one of QAL and EAL, preferably both.
  • the peptide has the sequence
  • the peptide additionally comprises at least one further (second) sequence RAL.
  • this can follow directly C-terminally to the first RAL sequence or be separated from it by 1-3 amino acids, for example by 1 or 3 three amino acids.
  • the peptide contains at least one W or F, preferably exactly one W or F.
  • the peptide according to the invention preferably comprises amino acids with a high alpha-helix-forming potential, these amino acids being selected from E, A, L, M, Q, K, R, F, I, H, W and D, more preferably E, A, L, M, Q, K, R, F, I and H; even more preferably E, A, L, M, Q, K, R and F.
  • the peptide consists of at least 60%, preferably at least 65%, more preferably at least 70%, in particular at least 75% or at least 80% or at least 85% or at least 90% or at least 95%
  • Amino acids with a high alpha-helix-forming potential these amino acids being preferably selected from E, A, L, M, Q, K, R, F, I, H, W and D, more preferably E, A, L, M, Q, K, R, F, I and H; even more preferably E, A, L, M, Q, K, R and F.
  • the peptide according to the invention particularly preferably forms a helical secondary structure, in particular an a-helix structure with an a-helix content of at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, in particular higher than 95%.
  • the use of the motif AL or LA in the amino acid sequence of the peptide according to the invention can contribute to the stability of the helical structure because these amino acids have a high ⁇ -helix potential.
  • the peptide can have a high proportion of hydrophobic amino acids selected from A, L, F, W, V, M, I and P, in particular A, L, F, W, V, M and I.
  • the peptide preferably has an amino acid sequence that is 10 to 24 amino acids in length, for example 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 amino acids, in particular 12 to 18 amino acids.
  • the peptide according to the invention comprises or consists of an amino acid sequence which is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88% more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5%, in particular 100% sequence identity with one of the following amino acid sequences: RSIVTFSLRQNAQLA (SEQ ID NO: 16), RSIVTFSLRQNSEQA (SEQ ID NO: 17), GLHTSATNLYLH (SEQ ID NO: 18), QHSIRLLTIKKP (SEQ ID NO: 19), QQSIR
  • the peptide according to the invention can comprise or consist of an amino acid sequence which is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89% , even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5%, in particular 100% sequence identity with one of the following amino acid sequences: RALQALRALQALEAL (SEQ ID NO: 1), RALRALRALEALEAL (SEQ ID NO: 2), RALRALRALQALQAL (SEQ ID NO: 3), RALRALRALQALEAL (SEQ ID NO: 4), RALRALQALEALEAL
  • Variants of the peptides according to the invention whose amino acid sequence is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5% sequence identity with one of the amino acid sequences which corresponds to the sequences in SEQ ID NOs: 1-27, preferably 1-22, more preferably 1-15, 16-17, or 18-22, more preferably 1-15 or 16-17, in particular 1-15 correspond, preferably differ in a maximum of 3 positions, more preferably in a maximum of 2 positions, in particular in a maximum of 1 Position
  • cysteine could have been attached at the C or N terminus.
  • variant refers to variants of the peptide according to the invention, which still have the functionality of the starting peptide, but differ from the starting sequence by one or more sequence deviations, for example 1, 2 or 3 sequence deviations, for example a substitution, deletion or insertion distinguish.
  • sequence identity of such variants may be in the range of 80% based on the total length of the starting peptide, and may be at least 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 99.5%.
  • sequence comparison is based on the BLAST algorithm established in the prior art and commonly used (see, for example, Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ (1990) "Basic local alignment search tool .” J. Mol. Biol. 215:403-410, and Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J.
  • T-Coffee cf., for example, Notredame et al (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217
  • Sequence comparisons are also possible using the Vector NTIR Suite 10.3 computer program (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) with the specified standard parameters, whose AlignX module for sequence comparisons is based on ClustalW. Unless otherwise indicated, sequence identity given herein is determined using the BLAST algorithm. Such a comparison also allows a statement to be made about the similarity of the compared sequences to one another.
  • the peptide or protein concentration can be determined using known methods, for example the BCA method (bicinchoninic acid; 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the Biuret method (A.G. Gornall, C.S. Bardawill and M.M. David, J Biol.Chem., 177 (1948), pp. 751-766).
  • BCA method bicinchoninic acid; 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid
  • Biuret method A.G. Gornall, C.S. Bardawill and M.M. David, J Biol.Chem., 177 (1948), pp. 751-766.
  • Peptides according to the invention can have amino acid changes, in particular amino acid substitutions, insertions or deletions. Such peptides are further developed, for example, by targeted genetic modification, i.e. by mutagenesis methods, and are optimized for specific purposes or with regard to special properties (for example with regard to their stability, binding, etc.).
  • mutations such as substitutions, insertions or deletions can be introduced into the known molecules in order to change certain properties, for example.
  • the surface charges and/or the isoelectric point of the molecules and thereby their interactions with a surface can be changed.
  • the net charge of the peptides can be altered to affect substrate binding.
  • the stability or adsorption of the peptide can be increased by one or more corresponding mutations.
  • Advantageous properties of individual mutations, eg individual substitutions can complement one another.
  • amino acid exchanges first the naturally occurring amino acid is designated in the form of the internationally customary one-letter code, followed by the associated sequence position and finally the inserted amino acid. Multiple substitutions within the same peptide chain are separated by slashes. In the case of insertions, additional amino acids are named after the sequence position. For deletions, the missing amino acid is replaced by a symbol, such as an asterisk or a dash, or an A is given in front of the corresponding position.
  • P9T describes the substitution of proline at position 9 by threonine
  • P9TH the insertion of histidine after the amino acid threonine at position 9
  • P9* or AP9 the deletion of proline at position 9.
  • the invention also includes peptides which are characterized in that they can be obtained from a peptide as described above as a starting molecule, for example from a molecule having one of the amino acid sequences according to SEQ ID NOs: 1-27, preferably 1-22, more preferably 1 -15, 16-17 or 18-22, even more preferably 1-15 or 16-17, in particular 1-15, on which, for example, one or more amino acid substitutions, including single or multiple conservative amino acid substitutions, have been carried out, with the resulting peptide at least 80% sequence identity with one of the amino acid sequences according to SEQ ID NOs: 1-27, preferably 1-22, more preferably 1 -15, 16-17 or 18-22, even more preferably 1-15 or 16-17, in particular 1-15, on which, for example, one or more amino acid substitutions, including single or multiple conservative amino acid substitutions, have been carried out, with the resulting peptide at least 80% sequence identity with one of the amino acid sequences according to SEQ ID NOs: 1-27, preferably 1-22, more
  • NOs: 1-27 preferably 1-22, more preferably 1-15, 16-17 or 18-22, even more preferably 1-15 or 16-17, especially 1-15.
  • conservative amino acid substitution means the exchange (substitution) of one amino acid residue for another amino acid residue, which exchange does not result in a change in polarity or charge at the position of the exchanged amino acid, e.g. B. the exchange of a non-polar amino acid residue for another non-polar amino acid residue.
  • substitutions do not have glycine or tyrosine as the target amino acid or, for example, no amino acid that has a low alpha-helix-forming potential.
  • the peptide according to the invention can also be modified.
  • Preferred modifications can be, for example, the coupling of the peptide according to the invention with certain other molecules or chemical groups, for example organic (macromolecules, e.g. via a covalent bond or a linker via a suitable amino acid of the chain and/or N- and/or C-terminal.
  • the peptide according to the invention is coupled to at least one further (macro) molecule, it can also be referred to as a peptide derivative.
  • the peptide according to the invention is then derivatized.
  • the peptide can act as an adhesion tag, allowing binding of a molecule coupled to it to the desired surface.
  • Such molecules can also be referred to as conjugates.
  • the peptides according to the invention mentioned which, for example, can have the amino acid cysteine N- or C-terminal for coupling purposes, are coupled (functionally modified) to biotin, preferably at a suitable amino acid in the chain and/or N- and/or C- terminal.
  • the peptide is part of a protein or polypeptide.
  • proteins and polypeptides can be recombinantly produced, for example, as fusion proteins.
  • the peptide according to the invention is located at either the N- or C-terminal to mediate adhesion of the entire molecule to a surface. In such embodiments, too, the peptide then acts as an adhesion tag.
  • RALQALRALQALEAL-C (SEQ ID NO: 28), RALRALRALEALEAL-C (SEQ ID NO: 29), RALRALRALQALQAL-C (SEQ ID NO: 30), RALRALRALQALEAL-C (SEQ ID NO: 31), RALRALQALEALEAL-C (SEQ ID NO: 32), RALFEALQALFRALEAL-C (SEQ ID NO: 33), RALRALEALQALEA-C (SEQ ID NO: 34), RALFEALFRALEALR-C (SEQ ID NO: 35), RALFEALFRALEAL-C (SEQ ID NO: 36), RALEALFRALEAL-C (SEQ ID NO: 37), RALRALFEALEAL-C (SEQ ID NO: 38), RALEALFRALQALEAL-C (SEQ ID NO: 39), RALEALWRALQALEAL-C (SEQ ID NO: 40), RALEALWRALEAL-C (SEQ ID NO:
  • (ii) comprise or consist of an amino acid sequence which is at least 80%, preferably at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84% or at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, still more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5% or in particular 100% sequence identity with one of
  • SEQ ID NOs: 28-44 (28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 or 44). , preferably with one of SEQ ID NOs: 28-34, 39-40 or 42-44, in particular 28-32, 34 or 42.
  • the peptide according to the invention comprises or consists of any of the following amino acid sequences: GLHTSATNLYLH-C (SEQ ID NO: 45), QHSIRLLTIKKP-C (SEQ ID NO: 46), QQSIRIMTIKHP-C (SEQ ID NO: 47), WRHPRLRCGNLL-C (SEQ ID NO: 48), or QKSRNRMTRTHP-C (SEQ ID NO: 49); or
  • (ii) comprises or consists of an amino acid sequence which is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5% or in particular 100% sequence identity with one of
  • SEQ ID Nos: 45-49 having sequences named in SEQ ID Nos: 45-49 (45, 46, 47, 48 or 49).
  • the peptide can have an amino acid sequence according to SEQ ID NOs: 50-54 (SRARLFVVTYHK-C (SEQ ID NO: 50), HMISTMNAASRR-C (SEQ ID NO: 51), RSIVTFSLRQNR-C (SEQ ID NO: 52), RNTIRIRTIKHP-C (SEQ ID NO: 53), RHSSTLRYRPLP-C (SEQ ID NO: 54)) or a variant thereof having at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, especially at least 95% sequence identity therewith , comprise or consist of.
  • SEQ ID NOs: 50-54 SRARLFVVTYHK-C (SEQ ID NO: 50), HMISTMNAASRR-C (SEQ ID NO: 51), RSIVTFSLRQNR-C (SEQ ID NO: 52), RNTIRIRTIKHP-C (SEQ ID NO: 53), RHSSTLRYRPLP-C (SEQ ID NO: 54)
  • the peptide is a peptide capable of adhesion to plastic surfaces.
  • adheresion is understood to mean an interaction between the peptide and a surface, as a result of which the peptide can adhere to the surface.
  • an "adhesive peptide” refers to a peptide that has the ability to interact with and/or adhere to a particular surface.
  • the adhesive peptides described herein preferably exhibit 10-fold, more preferably 20-fold, 50-fold or 100-fold higher adhesion to a given surface than any alternative peptide of comparable length not used for this purpose was developed and does not meet the sequence specifications described herein.
  • plastic and “plastic” are to be used synonymously and typically refer to solids that include polymers as the basic building blocks, with other (chemical) groups and molecules being added, for example.
  • solid body refers to any condition of solid substances, i.e. it is to be distinguished from liquid or gaseous substances. Solids can be hard and inflexible, as well as malleable, pliable and flexible. It is particularly preferred that the plastic surface is a plastic surface with low surface energy (Low Surface Energy Polymer (LSEP) surface). These surfaces are typically inert surfaces that previously had to be activated for functionalization or for further modifications. Common methods here are, for example, a plasma or corona treatment and a treatment with primers, for example solvents or oxidizing agents, without being limited to them. Such pretreatment processes can be circumvented or avoided by using the peptides described herein, because the peptides described also bind the untreated LSEP surfaces well.
  • LSEP Low Surface Energy Polymer
  • a contact angle measurement can be carried out, for example, without being limited to this.
  • the measured contact angle indicates the extent to which a liquid can wet the surface of a solid. From this it can be read to what extent this liquid, for example a paint or an adhesive, is suitable for the treatment of the examined surface.
  • Contact angle measurement is a common measurement method for a person skilled in this field.
  • the plastic surface preferably includes or consists of a material selected from the following: polyester (PES), polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyurethane (PU), polystyrene (PS), polyvinyl chloride (PVC), polycarbonate (PC), polyamide (PA), polyphenylene ether, polyphenylene sulfide, polyoxymethylene (POM), polymethyl methacrylate (PMA), polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyhydroxyalkanoate (PHA), polyhydroxybutyrate (PHB) polyimide (PI ), polylactide (PLA), polyvinylidene fluoride (PVDF), polyetherketone (PEK and others), copolymers and/or mixtures thereof and/or polymeric foams thereof, preferably polyester (PES), polyethylene (PE), polypropylene (PP), polystyrene (PS ), Copolymers and
  • the plastic surface can represent one or more of the following parts: composite components, foils, packaging, plastic particles and/or textiles, for example functional textiles.
  • the peptide according to the invention preferably has an adsorption on the plastic surface of from 0.25 to 3, for example from 0.25 to 1 or from 0.4 to 1, measured using the semi-quantitative method for measuring adhesion, which is described, for example, in WO 2014/072313 A1 or as described in Example 2 herein.
  • the preferred adhesion values are in the range of 25 to 100, especially 40 to 100. This method is described in Example 3, for example.
  • Good adhesion to plastic surfaces can be achieved, for example, by a peptide with a pronounced helical structure (in particular a-helix structure) and/or a high arginine content, in particular at one of the termini.
  • Particularly preferred peptides according to the invention for adhesion to plastic surfaces preferably to LSEP surfaces, in particular to polyethylene, polypropylene, polystyrene, copolymers and/or mixtures thereof, comprise or consist of an amino acid sequence of 4 to 50 amino acids, preferably 10 to 24 amino acids, for example 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 amino acids, in particular 12 to 19 amino acids, for example 12 to 18 amino acids, where (a) the amino acid sequence in N- to C-terminal orientation has the following sequence (C) m XlX2X 3 (X4)nX 5 (C)o, where
  • Xi is a positively charged amino acid, preferably R or K, more preferably R,
  • X2 and X3 are uncharged amino acids, preferably selected from A, L, M, S, I and Q, more preferably from A, L, M and Q, especially from A and L, each X4 is independently any amino acid, preferably with the exception of P, more preferably with the exception of P and G;
  • the peptide according to the invention which has good adhesion in particular to polyethylene, particularly preferably has an amino acid sequence of 4 to 50 amino acids, preferably 10 to 24 amino acids, the amino acid sequence being at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86% even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, still more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5%, in particular has 100% sequence identity with one of the amino acid sequences which corresponds to one of the sequences in SEQ ID NOs: 1-5, 7 and 16-17 or 28-32, 34, 43 and 44, in particular 1-5, and 7 or 28-32 and 34
  • Particularly preferred peptides according to the invention which have good adhesion in particular to polypropylene, have an amino acid sequence that is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88% more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5%, in particular 100% sequence identity with one of the amino acid sequences which one of the sequences in SEQ ID NOs. 1, 2, 4, 5, 7, 16 and 17 or 28, 29, 31, 32, 34, 43 and 44, in particular 1, 2, 4, 5 and 7 or 28, 29, 31, 32 and 34.
  • Particularly preferred peptides according to the invention which have good adhesion to polystyrene in particular, have an amino acid sequence that is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88% more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5%, in particular 100% sequence identity with one of the amino acid sequences that correspond to the sequences in SEQ ID NOs. 1-5, 7 and 15-17 or 28-32, 34 and 42-44, respectively.
  • the peptide according to the invention can also be at least one subunit (module) of a polypeptide, where the polypeptide can comprise a multimer of the sequences described herein, for example 1 to 30 repeats, more preferably 2 to 15 repeats, in particular 2 to 10 repeats, for example 2, 3, 4, 5 or 6 repeats of the peptides of the invention.
  • the polypeptide may include or consist of such multimers.
  • the individual peptide subunits of the polypeptide (multimer) can be separated from one another by spacers, for example by spacers with a length of 1 to 10 amino acids, preferably 1 to 4 amino acids.
  • a further aspect of the invention is also a peptide or polypeptide (multimer) comprising one or more, preferably two or more peptides according to the invention, as described herein.
  • polypeptide refers in particular to those peptides which comprise 100 or more amino acids.
  • the peptides according to the invention can be prepared chemically by known methods of peptide synthesis, for example by Merrifield solid-phase synthesis.
  • the peptides according to the invention by means of recombinant methods.
  • this includes all genetic engineering or microbiological processes which are based on introducing the genes for the peptides of interest into a host organism suitable for production and transcribing and translating them (summarized within the scope of this invention as biotechnological processes).
  • the relevant genes are introduced via vectors, in particular expression vectors; but also via those that cause the gene of interest to be inserted into an already existing genetic element such as the chromosome or other vectors in the host organism.
  • the functional unit of gene and promoter and possibly other genetic elements is typically referred to as an expression cassette. However, it does not necessarily have to be available as a physical unit.
  • the peptides according to the invention are particularly preferably produced as polypeptides (multimers) and subsequently cleaved into the functional peptides.
  • Very particularly preferred multimers have 2 to 10 peptide units (each according to the invention), which are each separated from one another by spacers with a length of 0 to 4 amino acids (for example 1, 2, 3 or 4 amino acids).
  • These spacers can consist, for example, of the amino acids glycine (G), alanine (A) and serine (S).
  • the spacers can also be or comprise interfaces for specific proteases/peptidases, in particular endopeptidases, or form such an interface together with parts of the peptide according to the invention.
  • the peptide is produced using biotechnological methods as defined above.
  • vectors are understood to mean elements consisting of nucleic acids which contain a gene of interest as a characteristic nucleic acid region. They are able to establish this in a species or a cell line over several generations or cell divisions as a stable genetic element that replicates independently of the rest of the genome.
  • Vectors are special plasmids, i.e. circular genetic elements, especially when used in bacteria.
  • cloning vectors In genetic engineering, a distinction is made on the one hand between those vectors that are used for storage and thus to a certain extent also for genetic engineering work, the so-called cloning vectors, and on the other hand those that have the function of realizing the gene of interest in the host cell, i.e. the expression of the allow the peptide in question.
  • expression vectors are referred to as expression vectors.
  • the nucleic acid coding for a peptide according to the invention or a multimer of such a peptide, which constitutes a further aspect of the invention, can be cloned into a vector, for example.
  • the molecular-biological dimension of the invention thus consists in vectors with the genes for the corresponding peptides. These can include, for example, those which are derived from bacterial plasmids, from viruses or from bacteriophages, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements from a wide variety of origins. With the other genetic elements present in each case, vectors are able to establish themselves as stable units in the relevant host cells over several generations.
  • the vectors form suitable starting points for molecular biological and biochemical investigations of the relevant gene or associated peptide and for further developments according to the invention and ultimately for the amplification and production of peptides according to the invention. They represent further aspects of the present invention.
  • Preferred embodiments of the present invention are cloning vectors. In addition to storage, biological amplification or selection of the gene of interest, these are suitable for characterizing the gene in question, for example by creating a restriction map or sequencing. Cloning vectors are also preferred embodiments of the present invention because they represent a transportable and storable form of the claimed DNA. They are also prime starting points for non-cell-bound molecular biology techniques, such as the polymerase chain reaction.
  • Expression vectors are chemically similar to cloning vectors, but differ in those partial sequences that enable them to replicate in the host organisms optimized for the production of peptides and there to express the contained gene.
  • Preferred embodiments are expression vectors which themselves carry the genetic elements necessary for expression. Expression is influenced, for example, by promoters that regulate the transcription of the gene. Thus, expression can be effected by the natural promoter originally located in front of this gene, but also by one after genetic fusion promoter of the host cell provided on the expression vector as well as by a modified or a completely different promoter of another organism.
  • Preferred embodiments are those expression vectors that can be regulated by changing the culture conditions or adding certain compounds, such as cell density or special factors.
  • Embodiments of the present invention can also be cell-free expression systems in which peptide biosynthesis is reproduced in vitro. Such expression systems are also established in the prior art.
  • a peptide according to the invention requires the transfer of the associated gene into a host cell, known as its transformation.
  • host cells ie prokaryotes, eukaryotes or cyanophyta.
  • host cells are preferred which can be handled well genetically, for example with regard to transformation with the expression vector and its stable establishment, for example unicellular fungi such as yeasts or bacteria.
  • preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling. This applies, for example, to easy culturing, high growth rates, low requirements for fermentation media and good production and secretion rates for foreign peptides.
  • the optimum expression systems for the individual case often have to be determined experimentally from the abundance of different systems available according to the prior art.
  • Each peptide according to the invention can be obtained in this way from a large number of host organisms.
  • host cells Preferred embodiments are those host cells whose activity can be regulated on the basis of genetic regulatory elements which are made available, for example, on the expression vector, but which can also be present in these cells from the outset. For example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the cultivation conditions or when a certain cell density is reached, expression can be stimulated. This enables a very economical production of the peptides of interest.
  • Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells. Compared to eukaryotes, bacteria are generally characterized by shorter generation times and lower demands on the cultivation conditions. In this way, cost-effective methods for obtaining peptides according to the invention can be established. In gram-negative bacteria, such as E. coli, a large number of peptides are secreted into the periplasmic space, i.e. the compartment between the two membranes enclosing the cells. This can be advantageous for special applications.
  • Gram-positive bacteria such as Bacilli or Actinomycetes or other representatives of the Actinomycetales, on the other hand, do not have an outer membrane, so that secreted peptides are immediately released into the nutrient medium surrounding the cells, from which in another preferred embodiment, the expressed peptides according to the invention can be purified directly.
  • a variant of this principle is represented by expression systems in which additional genes, for example those made available on other vectors, influence the production of peptides according to the invention. These can be modifying gene products or those that are to be purified together with the peptide according to the invention.
  • K12 derivatives and the B strains of Escherichia coli. strains which can be derived from these by genetic and/or microbiological methods known per se and can therefore be regarded as derivatives thereof. These are of the greatest importance for genetic and microbiological work and are preferably used for the development of methods according to the invention.
  • Such derivatives can, for example, be modified in terms of their requirements for the culture conditions via deletion or insertion mutagenesis, have other or additional selection markers or express other or additional peptides.
  • microorganisms are also preferred which are characterized in that they have been obtained after transformation with one of the vectors described above.
  • These can be, for example, cloning vectors that have been introduced into any bacterial strain for storage and/or modification. Such steps are commonplace in the storage and advancement of genetic elements in question. Since the genetic elements in question can be transferred directly from these microorganisms into gram-negative bacteria suitable for expression, the preceding transformation products are also realizations of the subject matter of the invention in question.
  • Eukaryotic cells can also be suitable for the production of peptides according to the invention.
  • examples are fungi such as Actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces. This can be particularly advantageous, for example, when the peptides are to undergo specific modifications in connection with their synthesis, which make such systems possible. These include, for example, the binding of low-molecular compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. In the context of this invention, this would be an example of a functionally modified peptide.
  • the host cells of the method according to the invention are cultivated and fermented in a manner known per se, for example in discontinuous or continuous systems.
  • a suitable nutrient medium is inoculated with the recombinant bacterial strains and the product is harvested from the medium after a period of time to be determined experimentally.
  • Continuous fermentations are characterized by the achievement of a steady state in which some cells die but also regrow over a comparatively long period of time and at the same time product can be removed from the medium.
  • Fermentation processes are well known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step; followed by an appropriate purification method.
  • the optimal conditions for the production methods used, for the host cells and/or the peptides to be produced must be determined experimentally based on the previously optimized culture conditions of the relevant strains to the knowledge of the person skilled in the art, for example with regard to fermentation volume, media composition, oxygen supply or stirrer speed.
  • Fermentation processes which are characterized in that the fermentation is carried out via a fed-batch strategy are also contemplated.
  • the media components that are consumed by the ongoing cultivation are fed; one also speaks of a supplementary feeding strategy.
  • Considerable increases in cell density, as well as in dry biomass and/or, above all, in the activity of the peptide of interest can be achieved in this way.
  • the fermentation can also be designed in such a way that unwanted metabolites are filtered out or neutralized by adding buffers or suitable counterions.
  • the peptide produced can be subsequently harvested from the fermentation medium. This fermentation process is preferred to product preparation from the dry matter, but requires the provision of suitable secretion markers and transport systems.
  • a further aspect of the present invention are also (isolated) nucleic acid sequences which code for a peptide according to the invention, or which code for a peptide, comprising or consisting of an amino acid sequence according to one of SEQ ID NOs: 1-27, preferably 1-15 and/or or 16-17 and/or 18-22, more preferably 1-15 and/or 16-17, especially 1-15, or variants thereof which are at least 90%, preferably at least 91%, more preferably at least 92% at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, especially at least 99.5 % have sequence identity with the sequences mentioned.
  • the invention relates to vectors, in particular cloning or expression vectors, which comprise at least one (isolated) nucleic acid sequence according to the invention.
  • the invention relates to a host cell which is transformed with at least one (isolated) nucleic acid sequence according to the invention or a vector according to the invention and/or contains these(s).
  • the invention relates to a method for producing the peptides according to the invention.
  • the peptide according to the invention can also be a peptide or polypeptide according to the invention, which comprises one or more, preferably two or more peptides according to the invention, as described herein.
  • the invention relates to agents which comprise or consist of at least one peptide according to the invention according to the invention.
  • the agent according to the invention is preferably (i) a coating agent, a lacquer, a paint, an adhesion promoter or an adhesive, preferably a water-based adhesive; and/or (ii) a detergent or cleaning agent.
  • the agents according to the invention are coating agents, lacquers, paints, adhesion promoters or adhesives, preferably water-based adhesives, preferably for plastic surfaces, in particular for LSEP plastic surfaces, such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polystyrene and / or copolymers or mixtures thereof, in particular polyethylene , polypropylene, polystyrene and/or copolymers and/or mixtures thereof.
  • the peptides according to the invention or the agent according to the invention can be used, for example, as an adhesion promoter between at least two adjacent layers of a multilayer composite or, in the case of coated substrates, between the coating and the substrate.
  • Multi-layer composites are used for a wide variety of purposes, e.g.
  • the multilayer composites can contain at least two, preferably two to five layers, with the individual layers having a thickness of z. B. can have 0.01 to 5 mm.
  • the individual layers are preferably plastic surfaces, in particular LSEP plastic surfaces, for example (LSEP) plastic films or (LSEP) polymer films.
  • the above-mentioned peptides or agents can be used as adhesion promoters between at least two adjacent layers of the multilayer composite.
  • at least one of the adjacent layers is a layer of a natural or synthetic polymer.
  • Particularly suitable polymers are polycondensates such as polyesters, polyadducts such as polyurethanes, polyamides, polycarbonates or polyphenylene ethers or polyphenylene sulfides or polymers which are obtainable by free-radical or ionic polymerization of ethylenically unsaturated compounds (called free-radical polymers for short).
  • Such free-radical polymers preferably consist of at least 60% by weight, particularly preferably at least 80% by weight, of so-called main monomers selected from C1 to C20 alkyl (meth)acrylates, vinyl esters of carboxylic acids containing up to 20 carbon atoms, vinyl aromatics with up to 20 carbon atoms, ethylenically unsaturated nitriles, vinyl halides, vinyl ethers of alcohols containing 1 to 10 carbon atoms, aliphatic hydrocarbons having 2 to 8 carbon atoms and one or two double bonds, in particular ethylene and propylene, and/or cyclic hydrocarbons, in particular styrene .
  • the peptide according to the invention can be applied to one of the adjacent layers, alternatively the peptide can also be applied to both layers.
  • the peptide can be in the form of an aqueous solution.
  • the peptide content of the solution is preferably 0.00001 to 5 parts by weight peptide to 100 parts by weight water, for example 0.00001 to 5% by weight, preferably 0.0001 to 1% by weight, in particular 0.001 to 0.1% by weight in each case based on the total weight of the solution.
  • the solution is preferably further diluted to a concentration of 0.001 to 10000 pg/ml water, preferably 1 to 10,000 pg/ml water, in particular 10 to 1000 pg/ml water. After application, drying can therefore first take place to remove the water. Thereafter, the two adjacent layers by conventional methods such. B. be connected by lamination.
  • Substrates are coated for a wide variety of purposes. Mention may be made in particular decorative coatings or protective coatings (collectively coatings) or adhesive coatings, the adhesive as such can be applied to the substrate or z. B. in the form of a self-adhesive article (label or tape) is stuck.
  • the substrate or the substrate surface can consist of any desired material.
  • the coating or the substrate-side surface of the coating can consist of any desired material.
  • the substrate surface or the coating, or the substrate-side surface of the coating preferably consists of plastic, in particular of polymers or copolymers.
  • Particularly suitable polymers are polycondensates such as polyesters, polyadducts such as polyurethanes, polyamides, polycarbonates or polyphenylene ethers or polyphenylene sulfides or polymers which are obtainable by free-radical or ionic polymerization of ethylenically unsaturated compounds (called free-radical polymers for short).
  • Polymers or copolymers of ethylene, propylene and/or styrene are particularly preferred. The statements made above apply to the structure of the free-radical polymers and their content of main monomers.
  • the amount of peptide required for adhesion promotion corresponds to the amount given above.
  • the peptide can be applied to the substrate surface, to the substrate facing surface of the coating, or to both.
  • the peptide is preferably in the form of an aqueous solution; the content of the solution is as indicated above. After application, drying can therefore first take place to remove the water.
  • the coating can be applied to the substrate using conventional methods; B. be laminated.
  • the coating can be produced by applying a polymer dispersion, polymer solution or a solvent-free polymer to the substrate-side surface provided with the adhesion promoter and subsequent film formation and/or thermal or photochemical curing.
  • the polymer is present for this purpose in the form of an aqueous dispersion or solution, particularly preferably an aqueous dispersion of an emulsion polymer, preferably of a free-radical polymer listed above. After the polymer has been applied, drying is then optionally carried out.
  • the multilayer composites and coated substrates therefore preferably have significantly increased strength.
  • the coating preferably adheres more strongly to the substrate and the individual layers of the multilayer composite adhere better to one another.
  • the substrate is a plastic. In principle, any plastics can be involved here.
  • plastics made of polyester, polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyurethane (PU), polystyrene (PS), polyvinyl chloride (PVC), polycarbonate (PC), polyamide (PA), polyphenylene ether, polyphenylene sulfide, polyoxymethylene (POM), Polymethyl methacrylate (PMA), polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyhydroxyalkanoate (PHA), polyhydroxybutyrate (PHB), polyimide (PI), polylactide (PLA), polyvinylidene fluoride (PVDF), polyether ketone (PEK, etc.), Copolymers thereof and/or polymeric foams thereof, preferably polyester (PES), polyethylene (PE), polypropylene (PP), polystyrene (PS), copolymers thereof and/or polymeric foams thereof, in particular polyethylene (PE), polypropylene (PE
  • the plastics can be in any form, but plastic films, plastic tapes or plastic packaging are preferred. Also textiles made of plastic or a high plastic content (at least 10%, more preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, in particular 60% plastic content, for example 65%) are includes.
  • the plastic can also be a composite material with a plastic surface.
  • the plastic surfaces are coated with the peptides according to the invention or the agents according to the invention as adhesion promoters. This can be done with aqueous solutions of the peptides. Details of the coating have already been mentioned above.
  • the coating can in particular be typical paints or paint systems for coating plastic surfaces. These can be paints that harden thermally, photochemically or according to other mechanisms.
  • Typical paints for coating plastic surfaces include at least one binder and crosslinkable components.
  • the crosslinkable components can be crosslinkers that are used in addition to a binder, or they can be crosslinkable groups that are linked to the binder.
  • the binder can also have crosslinkable groups and a crosslinker can also be used.
  • binders and crosslinkers can be used separately from one another.
  • the binder then comprises reactive functional groups that can react with complementary, reactive functional groups in the crosslinkers.
  • they can also be self-crosslinking binders which comprise reactive functional groups which can enter into crosslinking reactions with groups of their own ("with themselves") or with complementary, reactive functional groups on the same polymer. It is also possible that only the crosslinkers react with one another.
  • binders examples include (meth)acrylate (co)polymers, partially hydrolyzed polyvinyl esters, polyesters, alkyd resins, polylactones, polycarbonates, polyethers, epoxy resin-amine adducts, polyureas, polyamides, polyimides or polyurethanes. Of course you can too Mixtures of different polymers are used, provided the mixture does not cause any undesirable effects.
  • the crosslinking components can have thermally crosslinking groups or photochemically crosslinking groups. Examples of suitable thermal crosslinkers are crosslinkers based on epoxides, melamine or blocked isocyanates.
  • Suitable crosslinkers for photochemical crosslinking are, in particular, compounds having a plurality of ethylenically unsaturated groups, in particular difunctional or polyfunctional acrylates.
  • the adhesion of the paint to the substrate is preferably advantageously improved by the peptides according to the invention or the agents according to the invention. Furthermore, in corrosion protection tests, improved resistance to creeping under the paint layer is preferably also achieved.
  • two plastic surfaces are preferably brought into contact with one another, preferably at least one, but for example also both plastic surfaces having been treated with the peptide according to the invention, or a plastic surface treated with the peptide is brought into contact with another surface.
  • the surface treatment relates in particular to composite components or other (plastic) surfaces which are pretreated with the peptide according to the invention or the agent according to the invention before coating, painting, painting or gluing.
  • the agent according to the invention is a detergent or cleaning agent, in particular for use with textiles made of plastic or with a plastic content (preferably at least 10%, more preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40 %, even more preferably at least 50%, in particular 60% plastic content, for example 65%), for example functional clothing.
  • the textiles preferably consist of plastic or plastic mixtures, for example polyester, polyethylene, polypropylene, polystyrene and/or copolymers and/or mixtures thereof.
  • a further aspect of the invention relates to a method for bonding, coating, painting and/or surface treatment of plastic surfaces, preferably LSEP surfaces, wherein at least one peptide according to the invention or an agent according to the invention is used in at least one method step.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of the peptide according to the invention or the peptide or polypeptide according to the invention (multimer) which comprises one or more, preferably two or more peptides according to the invention, or the means described herein for binding/adhesion to plastic surfaces, in particular LSEP- Surfaces.
  • the use can also include the use of the peptides described herein as components of larger molecules to mediate their binding to a surface.
  • a further aspect of the present invention is the use of a peptide as described herein or corresponding conjugates, multimers or agents for adhesion to plastic surfaces, preferably LSEP surfaces, more preferably polyester, polyethylene, polypropylene, polystyrene or copolymers and/or mixtures thereof, in particular Polyethylene, polypropylene, polystyrene or copolymers and/or mixtures thereof, where the peptide or polypeptide has at least one amino acid sequence according to one of SEQ ID NOs.
  • 1-27 for example 1-15 or 16-17 or 18-22 or 23-27, preferably 1-17 or 18-22, more preferably 1-17, in particular 1-15 has or consists of or is a variant thereof, at least 80%, preferably at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84% or at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96 %, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5% sequence identity to one of the specified sequences.
  • the peptide or agent according to the invention is used for bonding, coating, painting and/or surface treatment of plastic surfaces, preferably LSEP surfaces, and of multilayer composites or coated substrates or for degrading plastic.
  • the peptide according to the invention is preferably used as a component of coating agents, lacquers, paints, adhesion promoters or adhesives for plastic surfaces and in multi-layer composites or coated substrates, or the agent according to the invention is used as a coating agent, lacquer, paint, adhesion promoter or adhesive for plastic surfaces and in multi-layer composites or coated substrates used.
  • the peptide or agent according to the invention can be used to degrade plastics, preferably LSEP microplastics and/or for the cleaning or treatment of textiles made of plastic or with a plastic content (preferably at least 10%, more preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, in particular 60% plastic content, for example 65%) can be used.
  • a plastic content preferably at least 10%, more preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, in particular 60% plastic content, for example 65%
  • the peptide according to the invention can be functionally modified/derivatized/conjugated in these uses as described above and/or it is in a peptide or polypeptide (multimer) comprising one or more, preferably two or more, of the peptide according to the invention , contain.
  • the peptide according to the invention or the agent according to the invention is preferably used at a pH of from 2 to 12, preferably from 5 to 9, for example from 7 to 9. That can be for example to the pH of the finished agent, to the ready-to-use composition or, for example, to the pH of the washing liquor in which the agent or peptide is used.
  • Table 1 Peptide names and associated amino acid sequences.
  • peptides originate from E. coli display database screenings (e.g. P3, P6, P15, P8C), other peptides are either further developments of them or pure designer peptides (e.g. RAL peptides or variants thereof).
  • the peptide can be present as listed or, for example, can be supplemented at the N- and/or C-terminal end with another amino acid such as cysteine.
  • the peptide can, for example, be coupled to another peptide or molecule such as biotin (functionalized peptide).
  • P3 stands for the peptide sequence without cysteine, P3C or 1-C for the peptide sequence with C-terminal cysteine, P3-Bt for the peptide sequence with C-terminal biotin.
  • the peptide can also occur as a subunit (module) in a polypeptide.
  • Table 2 Charge of the peptide domains. Referring to Table 2, underlined amino acids mark parts of the peptide (tripeptides) with a positive charge, bold printed amino acids mark regions of the peptide that are uncharged, and gray highlighted amino acids mark parts of the peptide (tripeptides) with a negative charge.
  • Example 2 Checking the adhesion of the synthesized peptides with regard to their substrate specificity on polyethylene (PE), polypropylene (PP) and polystyrene (PS)
  • PE polyethylene
  • PP polypropylene
  • PS polystyrene
  • non-functionalized peptides Nos. 1-4, 10, 11
  • peptides that have the amino acid cysteine at the C-terminus Nos. 5-C to 9-C, 13-C to 17- C, 19-C, 27-C
  • LSEP surfaces such as polyethylene, polypropylene, and polystyrene
  • AI-S1 VPSSGPQDTRTT
  • MS-S1 ATIHDAFYSAPE
  • SEQ ID NO: 56 aluminum and steel binding peptides, respectively, that served as negative controls.
  • These peptides are from Zuo R., ⁇ rnek, D., Wood, T.K. (2005) Aluminum and mild steel-binding peptides from phage display, Appl. microbiol. Biotechnol., 68:505-509.
  • the peptides were dissolved in 1x PBS buffer pH 7.3 (without NaCl and KCl) to a concentration of 2 mg/mL.
  • 2x 10 pL each were dropped onto an LSEP plate (40 pg).
  • the "peptide spots" were dried at 30°C for 30 min, then washed for 1 h in 1 L 1x PBS buffer with gentle shaking and stained for 30 s in Coomassie staining solution. Destaining was carried out with 1x PBS buffer pH 7.3 (without NaCl and KCl). Depending on the intensity of the bound color on the peptide spots, an optical, semi-quantitative evaluation was carried out.
  • Table 3 Adhesion study of peptides on different LSEP plates.
  • peptides 5-C, 8-C, 9-C, 13-C, 14-C, 15-C, 16-C, 17-C and 19C The peptides 5-C, 7-C, 8-C, 9-C, 13-C, 14-C, 16-C, 17-C and 19-C bind to polypropylene well to very well and the peptides bind to polystyrene 5-C, 7-C, 8-C, 9-C, 13-C, 14-C, 15-C, 16-C, 17-C, 19-C and 27-C good to very good.
  • Example 3 Checking the adhesion of the synthesized peptides with regard to their substrate specificity on polypropylene (PP)
  • Table 4 Adhesion investigation of peptides which have a cysteine C-terminal on polypropylene.
  • Peptides 9-C, 18-C, 24-C and 25-C showed good to excellent adhesion to polypropylene.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Peptid, wie hierin beschrieben. Ferner betrifft die Erfindung ein Peptid oder Polypeptid, welches mindestens zwei der erfindungsgemäßen Peptide umfasst, eine Nukleinsäuresequenz, kodierend für das erfindungsgemäße Peptid, ein Mittel umfassend mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid und die Verwendung solcher Peptide zur Adhäsion an Kunststoffoberflächen.

Description

SUBSTRATSPEZIFISCHE ADHÄSIVE PEPTIDE
Die Erfindung betrifft ein Peptid, wie hierin beschrieben. Ferner betrifft die Erfindung Peptide oder Polypeptide, welches mindestens zwei der hierin beschriebenen Peptide in Form von Multimeren umfassen, eine Nukleinsäuresequenz die für das erfindungsgemäße Peptid kodiert, Mittel umfassend mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid und die Verwendung solcher Peptide oder Mittel zur Bindung/Adhäsion an Kunststoffoberflächen.
An der Entwicklung adhäsiver Peptide wird intensiv geforscht. Insbesondere Peptide, die spezifisch an oxidische Oberflächen wie Metalloberflächen binden oder damit wechselwirken, wurden bereits beschrieben (WO 2014/072313 A1). Adhäsive Peptide sind aber auch für viele andere Oberflächen interessant, die aufgrund ihres Materials oder ihrer Oberflächenbeschaffenheit beispielsweise ein einfaches Verkleben oder Anbringen von anderen Objekten, Stoffen oder Verbindungen erschweren. Bei solchen Oberflächen sind insbesondere solche mit niedrigen Oberflächenenergien, wie sie oft bei bestimmten Kunststoffen gefunden werden, problematisch. Derartige Kunststoffe werden im Stand der Technik auch als low surface energy polymers (LSEP) bezeichnet und umfassen beispielsweise viele Polyolefine.
Die Erfinder haben spezielle Peptide gefunden und entwickelt, die sich überraschenderweise für eine Adhäsion an Kunststoffoberflächen, insbesondere LSEP (low surface energy polymers) Oberflächen, eignen und die oben genannten Probleme teilweise oder vollständig lösen.
Deshalb betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Peptid, umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren, wobei
(a) die Aminosäuresequenz in N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Sequenz aufweist (C)mXlX2X3(X4)nX5(C)o, wobei
Xi eine positiv geladene Aminosäure ist,
X2 und X3 ungeladene Aminosäuren sind, jedes X4 unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure ist,
X5 eine beliebige positiv geladene oder ungeladene Aminosäure ist, m und 0 0 oder 1 sind, wobei m+o = 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 46 ist; oder b) die Aminosäuresequenz mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der in SEQ ID NOs: 16-17 oder 18-22 genannten Aminosäuresequenzen aufweist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Multimer der oben genannten Peptide, welches zwei oder mehr der genannten Aminosäuresequenzen umfasst, vorzugsweise in Form eines Peptides oder Polypeptids. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz kodierend für die hierin beschriebenen Peptide und Polypeptide.
Ferner betrifft die Erfindung ein Mittel, das eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide oder Polypeptide umfasst.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung mindestens eines Peptids oder eines mittels welches dieses Peptid enthält zur Adhäsion oder Bindung an Kunststoffoberflächen, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz gemäß einervon SEQ ID NOs: 1-27, bevorzugt von SEQ ID NOs: 1-15, 16-17 oder 18-22, aufweist oder daraus besteht, oder eine Variante davon ist, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, Sequenzidentität zu einer der angegebenen Sequenzen hat.
Diese und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden für den Fachmann aus dem Studium der folgenden detaillierten Beschreibung und Ansprüche ersichtlich. Dabei kann jedes Merkmal aus einem Aspekt der Erfindung in jedem anderen Aspekt der Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise sind Merkmale oder Ausführungsformen, die für das erfindungsgemäße Peptid beschrieben werden auch für das erfindungsgemäße Polypeptid, das erfindungsgemäße Mittel, die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder die erfindungsgemäße Verwendung heranzuziehen und umgekehrt. Ferner ist es selbstverständlich, dass die hierin enthaltenen Beispiele die Erfindung beschreiben und veranschaulichen sollen, diese aber nicht einschränken und insbesondere die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
Alle Prozentangaben sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichts-% (Gew.-%), jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der entsprechenden Zusammensetzung oder des entsprechenden Mittels. Numerische Bereiche, die in dem Format „von x bis y“ angegeben sind, schließen die genannten Werte ein. Wenn mehrere bevorzugte numerische Bereiche in diesem Format angegeben sind, ist es selbstverständlich, dass alle Bereiche, die durch die Kombination der verschiedenen Endpunkte entstehen, ebenfalls erfasst werden.
„Mindestens ein“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf 1 oder mehr, beispielsweise 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder mehr. Bezogen auf einen Inhaltsstoff bezieht sich die Angabe auf die Art des Inhaltsstoffs und nicht auf die absolute Zahl der Moleküle. „Mindestens ein Peptid“ bedeutet somit beispielsweise mindestens eine Art von Peptid, d.h. dass eine Art von Peptid oder eine Mischung mehrerer verschiedener Peptide gemeint sein kann. Zusammen mit Gewichtsangaben bezieht sich die Angabe auf alle Verbindungen der angegebenen Art, die in beispielsweise einer Zusammensetzung oder einem Mittel enthalten sind, d.h. dass die Zusammensetzung oder das Mittel über die angegebene Menge der entsprechenden Verbindungen hinaus typischerweise keine weiteren Verbindungen dieser Art enthält.
Zahlenwerte, die hierin ohne Dezimalstellen angegeben sind, beziehen sich jeweils auf den vollen angegebenen Wert mit einer Dezimalstelle. So steht beispielsweise „99 %“ für „99,0 %“. Die Erfindung betrifft ein Peptid umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren Länge, bevorzugt von mindestens 8, 9, 10, 11 oder 12 Aminosäuren Länge. Bevorzugte Längen sind bis 40, bis 35, bis 30, oder bis 25 oder bis 24 Aminosäuren. Beispielsweise kann das Peptid eine Länge von 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 oder 24 Aminosäuren, insbesondere 12 bis 18 Aminosäuren haben.
Die Peptide der Erfindung weisenin N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Aminosäuresequenz auf
(C)mXlX2X3(X4)nX5(C)o, wobei
Xi eine positiv geladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder K, noch bevorzugter R,
X2 und X3 ungeladene Aminosäuren sind, vorzugsweise ausgewählt aus A, L, M, S, I und Q, noch bevorzugter aus A, L, M und Q, insbesondere aus A und L, jedes X4 unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G;
X5 eine beliebige positiv geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder eine ungeladenen Aminosäure, noch bevorzugter Q, A oder L, insbesondere A oder L, m und 0 0 oder 1 sind, wobei m+o = 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 46, bevorzugt von 6 bis 20 ist, beispielsweise 9, 10, 11 , 12 oder 13.
Alternativ oder zusätzlich umfassen oder bestehen die Peptide aus einer Aminosäuresequenz die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 81 %, mindestens 82%, mindestens 83%, mindestens 84% oder mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, mindestens 87 %, mindestens 88 %, mindestens 89 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, oder 100 % Sequenzidentität mit einer der in SEQ ID NOs: 16-17 oder 18-22 genannten Aminosäuresequenzen aufweist.
Unter einem „Peptid“ im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein aus Aminosäuren, bevorzugt den 20 proteinogenen L-Aminosäuren, zusammengesetztes, vorzugsweise linear aufgebautes Polymer zu verstehen, das bis zu 100 Aminosäuren aufweist, welche über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Erfindungsgemäß die Peptide der Erfindung eine Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren auf. Die Aminosäuren werden im Kontext dieser Erfindung im Ein-Buchstaben-Code angegeben, wobei beispielsweise C für Cystein, R für Arginin, A für Alanin und L für Leucin steht. Insbesondere steht „C“ in obiger Sequenz (C)mXiX2X3(X4)nX5(C)0 für einen Cysteinrest. Es ist ferner klar, dass sofern nicht anders angegeben, die Aminosäuren in einer hierin offenbarten Aminosäuresequenz über Peptidbindungen verknüpft sind und die Sequenz, sofern nicht anders angegeben, in N- zu C-terminaler Orientierung aufgeführt ist.
Die erfindungsgemäßen Peptide können in verschiedenen Ausführungsformen chemisch synthetisiert und/oder rekombinant mittels Proteindesign hergestellt worden sein. Kurze Peptide sind heutzutage einfach synthetisch, beispielsweise über Festphasensynthese, darstellbar. Längere Peptide und Polypeptide werden dagegen häufig auch rekombinant in Wirtsorganismus hergestellt.
Der Begriff „N-Terminus“ oder „N-terminal“ beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung das Ende der Aminosäurekette des erfindungsgemäßen Peptids, welches eine freie Aminogruppe aufweist.
Der Begriff „C-Terminus“ oder „C-terminal“ beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung das Ende der Aminosäurekette des erfindungsgemäßen Peptids, welches eine freie Carboxylgruppe aufweist.
Der Ausdruck „in N- zu C-terminaler Orientierung“ bezieht sich im Kontext dieser Erfindung auf eine Aminosäuresequenz, in der die Reihenfolge der Aminosäuren ausgehend vom N-Terminus hin zum C- Terminus beschrieben werden.
Typische saure oder negativ geladene Aminosäuren (abhängig vom pH-Wert) sind D und E.
Zu den positiv geladenen oder basischen Aminosäuren (abhängig vom pH-Wert) zählen typischerweise R, K und H.
Aminosäuren wie G, A, C, I, L, M, F, V, P, S, T, W, Y, N und Q sind typischerweise ungeladene d.h. neutrale Aminosäuren.
Wenn hierin auf eine „beliebige“ Aminosäure Bezug genommen wird, ist hiermit üblicherweise eine der 20 natürlich vorkommenden proteinogenen Aminosäuren gemeint, d.h. eine von Glycin (G), Alanin (A), Valin (V), Leucin (L), Isoleucin (I), Phenylalanin (F), Serin (S), Threonin (T), Prolin (P), Methionin (M), Cystein (C), Histidin (H), Lysin (K), Arginin (R), Glutamin (Q), Asparagin (N), Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Tyrosin (Y) und Tryptophan (W). Die Aminosäuren sind, sofern nicht anders angegeben, typischerweise L-Aminosäuren. In alternativen Ausführungsformen kann das Peptid auch aus D-Aminosäuren bestehen, wobei es allerdings bevorzugt sein kann, dass innerhalb der hierin beschriebenen Peptide nicht gleichzeitig D- und L-Aminosäuren vorkommen. In verschiedenen Ausführungsformen erfasst eine derartige beliebige Aminosäure alle der vorgenannten Aminosäuren mit der Ausnahme von Prolin, bzw. in manchen Ausführungsformen auch mit Ausnahme von Prolin und Glycin. Diese beiden Aminosäuren sind in bestimmten Ausführungsformen nicht bevorzugt, da diese helix-brechende Eigenschaften aufweisen und daher die Sekundärstruktur der Peptide nachteilig beeinflussen können.
In bevorzugten Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße Peptid eine Gesamtladung von -2 bis +12, vorzugsweise von 0 bis +8, noch bevorzugter von 0 bis +4, insbesondere von 0 bis +2 auf. Die Gesamtladung des Peptids basiert auf der Anzahl von positiv und negativ geladenen Aminosäuren im Peptid, insbesondere Arginin (R), Lysin (K), Histidin (H), Asparaginsäure (D) und Glutaminsäure (E), und ergibt sich aus der Summe der negativen und positiven Ladungen, wobei sich jeweils eine positive und eine negative Ladung aufheben. Ein Peptid mit 2 Arginin-Resten und 1 Glutaminsäure-Rest hätte somit eine Gesamtladung von +1 . Die Gesamtladung des Peptids beträgt bevorzugt -2 bis +12, stärker bevorzugt 0 bis +8, noch stärker bevorzugt 0 bis +4, insbesondere 0 bis +2.
In bevorzugten Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße Peptid
(i) eine Gesamtladung von -2 bis +12, vorzugsweise von 0 bis +8, noch bevorzugter von 0 bis +4, insbesondere von 0 bis +2 auf; und/oder
(ii) am N-Terminus, der die ersten 3-4 Aminosäuren umfasst, eine positive Nettoladung auf; und/oder
(iii) am C-Terminus, der die letzten 3-6 Aminosäuren umfasst, eine negative oder neutrale Nettoladung auf, vorzugsweise mindestens eine negative geladene Aminosäure, insbesondere E; und/oder
(iv) kein P und noch bevorzugter auch kein G und insbesondere auch kein Y auf.
Alle vorgenannten Merkmale, insbesondere (i)-(iv), können individuell oder in jeder beliebigen Kombination verwirklicht sein.
Das Merkmal, dass das Peptid am „N-Terminus, der die ersten 3-4 Aminosäuren umfasst, eine positive Nettoladung“ aufweist, bedeutet, dass die N-terminalen 3-4 Aminosäuren mehr positive geladene als negative geladene Aminosäure umfassen. In verschiedenen Ausführungsformen ist dieses Merkmal beispielsweise dann erfüllt, wenn die N-terminalen 3-4 Aminosäuren 1 oder 2 positive geladene Aminosäuren, d.h. H, K oder R, vorzugsweise K oder R, noch bevorzugter R, und keine negativ geladenen Aminosäure wie E oder D aufweisen. Sofern der N-Terminus eine negativ geladene Aminosäure enthält, muss die Zahl an positiv geladenen Aminosäuren mindestens 2 betragen, damit die Nettoladung positiv bleibt.
Für das Merkmal, dass das Peptid am „C-Terminus der die letzten 3-6 Aminosäuren umfasst, eine negative oder neutrale Nettoladung“ aufweist bedeutet, dass die Zahl der geladenen Aminosäuren 0 sein muss oder die Zahl der negativ geladenen Aminosäuren, d.h. D und E, größer als die Zahl der positiv geladenen sein muss. Ein Beispiel für eine solche C-terminale Sequenz wäre beispielsweise EAL oder die doppelte Abfolge dieses Motivs.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist die Sequenz X1X2X3 RAL, RSI oder RLA, vorzugsweise RAL oder RLA, insbesondere RAL. Die N-terminale Sequenz RAL oder RLA weist nicht nur in vorteilhafter Weise eine positive Nettoladung auf, sie umfasst auch Aminosäuren mit einem besonders hohen alpha-Helix bildenden Potential, wie weiter unten erläutert wird. In manchen Ausführungsformen kann der Arginin-Rest auch durch Lysin ersetzt sein, besonders bevorzugt ist allerdings der N-terminale Arginin-Rest.
Ferner ist es bevorzugt, dass
(i) die Sequenz (X4)nX5 mindestens eine Sequenz XeXyXs umfasst, wobei Xe eine geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R, K, E, L, A oder Q, noch bevorzugter R, K, E oder Q, und Xz und Xs unabhängig voneinander ungeladene Aminosäure mit Ausnahme von P und G sind, vorzugsweise A, L, Q oder M, noch bevorzugter A oder L; und/oder
(ii) (X4)n mindestens eine aromatische Aminosäure, vorzugsweise W oder F umfasst.
Wenn die Sequenz XeXzXs ein Xe umfasst, welches R oder K ist, ist die Sequenz XeXzXs vorzugsweise nicht am C-Terminus und vorzugsweise nicht innerhalb der 6 C-terminalen Aminosäuren. In solchen Fällen kann die Sequenz (X4)nX5 eine oder mehrere weitere Sequenzen XeXyXs umfassen, die C- terminal zu der Sequenz liegen, die als Xe eine positiv geladene Aminosäure umfasst, wobei diese weiteren Sequenzen dann vorzugsweise keine positiv geladene Aminosäure als Xe aufweisen.
Es ist bevorzugt, dass eine der Sequenzen XeXzXe, die nahe, d.h. innerhalb der 6 C-terminalen Aminosäuren, oder am C-Terminus liegen, als Xe eine negativ geladene Aminosäure aufweisen, beispielsweise E.
Wenn das Peptid in manchen Ausführungsformen eine aromatische Aminosäure ausgewählt aus W und F enthält, befindet sich neben, insbesondere C-terminal, einer solchen aromatischen Aminosäure eine positiv oder negativ geladene Aminosäure, insbesondere befindet sich neben der aromatischen Aminosäure keine weitere aromatische Aminosäure.
Die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin (F) und Tryptophan (W) werden in der erfindungsgemäßen Peptidsequenz bevorzugt als Helixbildner und/oder für das Pi-Stacking eingesetzt. Die aromatische Aminosäure Tyrosin (Y) wird in verschiedenen Ausführungsformen nicht in der Peptidsequenz verwendet, da diese helix-brechende Eigenschaften hat. In verschiedenen Ausführungsformen ist das Peptid daher frei von Y-Resten.
„Pi-Stacking“ bezieht sich im Kontext der vorliegenden Erfindung auf die nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen aromatischen Ringsystemen.
Bevorzugt umfasst
(i) (X4)n mindestens eine Sequenz XeXzXs, wobei XeXzXs RAL oder RLA, vorzugsweise RAL, ist, und wobei diese Sequenz vorzugsweise in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 4-7 bzw. mindestens 6-7 Aminosäuren vom C-Terminus entfernt lokalisiert ist; und/oder
(ii) (X4)nXs mindestens eine Sequenz XeXzXs umfasst, wobei XeXzXs EAL oder ELA, vorzugsweise EAL, ist, und wobei diese Sequenz vorzugsweise nicht in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 1-6 lokalisiert ist; und/oder
(iii) (X4)nXs mindestens eine Sequenz XeXzXs umfasst, wobei XeXzXs QAL oder QLA, vorzugsweise QAL, ist. In anderen möglichen Ausführungsformen umfasst (X4)nX5 mindestens eine Sequenz XeXyXs, wobei XeXyXs QLA oder EQA ist, wobei diese Sequenz vorzugsweise nicht in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 1-6 oder 1-11 lokalisiert ist.
Es ist ferner möglich, dass (X4)nX5 mindestens eine Sequenz XeXyXsXg umfasst, wobei XeXyXsXg AQLA oder SEQA ist, wobei diese Sequenz vorzugsweise nicht in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 1-6 oder 1-11 lokalisiert ist.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Peptid die Sequenz X1X2X3, wobei X1X2X3 RAL ist, und (X4)nXs mindestens eine von QAL und EAL umfasst, vorzugsweise beide. In derartigen Ausführungsformen hat das Peptid die Sequenz
(C)mRAL(Xio)qQAL(Xii)rEAL(Xi2)s(C)o, oder
(C)mRAL(Xio)qEAL(Xii)rQAL(Xi2)s(C)o, wobei X10 und Xu unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure sind, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G;
X12 eine beliebige ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise Q, A oder L, insbesondere A oder L; q und r O oder ganze Zahlen von 1-10 sind, vorzugsweise 0, 1 , 2 oder 3; und s 0 oder 1 ist, wobei q+r+s = 0-21 sind, vorzugsweise 0-15 oder 0-9 oder 1-15 oder 1-9 oder 1-6 oder 0-6 oder 0-3 oder 1-3.
Ferner ist es bevorzugt, dass das Peptid zusätzlich mindestens eine weitere (zweite) Sequenz RAL umfasst. Diese kann, in verschiedenen Ausführungsformen, direkt C-terminal auf die erste RAL- Sequenz folgen oder von dieser durch 1-3 Aminosäuren getrennt sein, beispielsweise durch 1 oder 3 drei Aminosäuren.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Peptid zwei Sequenzen RAL und jeweils mindestens eine Sequenz EAL und QAL. Bevorzugte Abfolgen sind:
RALRAL(Xio)qQAL(Xii)rEAL(Xi2)s,
RALRAL(Xio)qEAL(Xii)rQAL(Xi2)s
RAL(Xio)qRALQAL(Xii)rEAL(Xi2)s,
RAL(Xio)qRALEAL(Xii)rQAL(Xi2)s
RAL(Xw)qQALRAL (Xn)rEAL(Xi2)s,
RAL(Xw)qEALRAL (Xn)rQAL(Xi2)s, wobei X10 und Xu unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G, beispielsweise W oder F oder weitere Motive QAL oder EAL umfasst; X12 eine beliebige ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise Q, A oder L, insbesondere A oder L; q und r 0 oder ganze Zahlen von 1-6 sind, vorzugsweise 0, 1 , 2, oder 3; und s 0 oder 1 , vorzugsweise 0 ist, wobei q+r = 0-9, vorzugsweise 0-6 oder 0-3 oder 1-9 oder 1-6 oder 1-3 sind.
Ferner ist es in verschiedenen Ausführungsformen bevorzugt, dass das Peptid mindestens ein W oder F, vorzugsweise genau ein W oder F enthält.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Peptid Aminosäuren mit einem hohem alpha-Helix-bildenden Potential, wobei diese Aminosäuren ausgewählt werden aus E, A, L, M, Q, K, R, F, I, H, W und D, stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R, F, I und H; noch stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R und F.
In bevorzugten Ausführungsformen besteht das Peptid zu mindestens 60 %, bevorzugt zu mindestens 65 %, stärker bevorzugt zu mindestens 70 %, insbesondere zu mindestens 75 % oder zu mindestens 80% oder zu mindestens 85% oder zu mindestens 90% oder zu mindestens 95% aus Aminosäuren mit einem hohem alpha-Helix-bildenden Potential, wobei diese Aminosäuren bevorzugt ausgewählt werden aus E, A, L, M, Q, K, R, F, I, H, W und D, stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R, F, I und H; noch stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R und F.
Besonders bevorzugt bildet das erfindungsgemäße Peptid eine helikale Sekundärstruktur aus, insbesondere eine a-Helix-Struktur mit einem a-Helix-Gehalt von mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, insbesondere höher als 95 %. Die Verwendung des Motivs AL oder LA in der Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Peptids kann zur Stabilität der Helixstruktur beitragen, weil diese Aminosäuren ein hohes a-Helix-Potential aufweisen.
In bevorzugten Ausführungsformen weist das Peptid die Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NOs: 1-15 oder 16-17, insbesondere 1-15 auf, sowie Varianten davon, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 81 %, mindestens 82 %, mindestens 83 %, mindestens 84 % oder mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, mindestens 87 %, mindestens 88 %, mindestens 89 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, mindestens 99,5 % oder 100 % Sequenzidentität zu der angegebenen Sequenz haben, wobei vorzugsweise das Motiv RAL, und stärker bevorzugt auch das Motiv EAL und/oder QAL, sofern vorhanden, invariabel sind. Wenn die Motive RAL, EAL und QAL in dem Peptid vorhanden sind, sind diese vorzugsweise in allen vorgenannten Varianten invariabel.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Peptid einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren aufweisen, ausgewählt aus A, L, F, W, V, M, I und P, insbesondere A, L, F, W, V, M und I. Bevorzugt weist das Peptid eine Aminosäuresequenz auf, die eine Länge von 10 bis 24 Aminosäuren, beispielsweise 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 oder 24 Aminosäuren, insbesondere 12 bis 18 Aminosäuren, hat.
In manchen Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße Peptid am C-Terminus die Aminosäure Cystein (C) auf. In anderen Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße Peptid die Aminosäure Cystein am N-Terminus auf. Diese Aminosäure kann über die freie Sulfhydryl-Gruppe die Kopplung an andere Moleküle, Strukturen oder Substrate ermöglichen. Diese Aminosäure dient daher als Verknüpfungsstelle ist aber typischerweise nicht an der gewünschten adhäsiven Wirkung beteiligt.
Bevorzugt umfasst oder besteht das erfindungsgemäße Peptid (aus) eine(r) Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 %, insbesondere 100 % Sequenzidentität mit einerderfolgenden Aminosäuresequenzen aufweist: RALQALRALQALEAL (SEQ ID NO: 1), RALRALRALEALEAL (SEQ ID NO: 2), RALRALRALQALQAL (SEQ ID NO: 3), RALRALRALQALEAL (SEQ ID NO: 4), RALRALQALEALEAL (SEQ ID NO: 5), RALFEALQALFRALEAL (SEQ ID NO: 6), RALRALEALQALEA (SEQ ID NO: 7), RALFEALFRALEALR (SEQ ID NO: 8), RALFEALFRALEAL (SEQ ID NO: 9), RALEALFRALEAL (SEQ ID NO: 10), RALRALFEALEAL (SEQ ID NO: 11), RALEALFRALQALEAL (SEQ ID NO: 12), RALEALWRALQALEAL (SEQ ID NO: 13), RALEALWRALEAL (SEQ ID NO: 14), RALARALARALAQALA (SEQ ID NO: 15), RSIVTFSLRQNAQLA (SEQ ID NO: 16) oder RSIVTFSLRQNSEQA (SEQ ID NO: 17), bevorzugt 1-15.
In verschiedenen anderen Ausführungsformen umfasst oder besteht das erfindungsgemäße Peptid (aus) eine(r) Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 %, insbesondere 100 % Sequenzidentität mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist: RSIVTFSLRQNAQLA (SEQ ID NO: 16), RSIVTFSLRQNSEQA (SEQ ID NO: 17), GLHTSATNLYLH (SEQ ID NO: 18), QHSIRLLTIKKP (SEQ ID NO: 19), QQSIRIMTIKHP (SEQ ID NO: 20), WRHPRLRCGNLL (SEQ ID NO:21) oder QKSRNRMTRTHP (SEQ ID NO: 22), bevorzugt 16 oder 17. In verschiedenen anderen Ausführungsformen umfasst oder besteht das erfindungsgemäße Peptid (aus) eine(r) Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 %, insbesondere 100 % Sequenzidentität mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist: GLHTSATNLYLH (SEQ ID NO: 18), QHSIRLLTIKKP (SEQ ID NO: 19), QQSIRIMTIKHP (SEQ ID NO: 20), WRHPRLRCGNLL (SEQ ID NO:21) oder QKSRNRMTRTHP (SEQ ID NO: 22).
In verschiedenen Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Peptid eine Aminosäuresequenz umfassen oder daraus bestehen, die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 %, insbesondere 100 % Sequenzidentität mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist: RALQALRALQALEAL (SEQ ID NO: 1), RALRALRALEALEAL (SEQ ID NO: 2), RALRALRALQALQAL (SEQ ID NO: 3), RALRALRALQALEAL (SEQ ID NO: 4), RALRALQALEALEAL (SEQ ID NO: 5), RALFEALQALFRALEAL (SEQ ID NO: 6), RALRALEALQALEA (SEQ ID NO: 7), RALFEALFRALEALR (SEQ ID NO: 8), RALFEALFRALEAL (SEQ ID NO: 9), RALEALFRALEAL (SEQ ID NO: 10), RALRALFEALEAL (SEQ ID NO: 11), RALEALFRALQALEAL (SEQ ID NO: 12), RALEALWRALQALEAL (SEQ ID NO: 13), RALEALWRALEAL (SEQ ID NO: 14), RALARALARALAQALA (SEQ ID NO: 15), RSIVTFSLRQNAQLA (SEQ ID NO: 16), RSIVTFSLRQNSEQA (SEQ ID NO: 17), GLHTSATNLYLH (SEQ ID NO: 18), QHSIRLLTIKKP (SEQ ID NO: 19), QQSIRIMTIKHP (SEQ ID NO: 20), WRHPRLRCGNLL (SEQ ID NO:21), QKSRNRMTRTHP (SEQ ID NO: 22), SRARLFVVTYHK (SEQ ID NO: 23), HMISTMNAASRR (SEQ ID NO: 24), RSIVTFSLRQNR (SEQ ID NO: 25), RNTIRIRTIKHP (SEQ ID NO: 26) oder RHSSTLRYRPLP (SEQ ID NO: 27).
Varianten der erfindungsgemäßen Peptide, deren Aminosäuresequenz mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 % Sequenzidentität mit einer der Aminosäuresequenzen aufweist, die den Sequenzen in SEQ ID NOs: 1-27, bevorzugt 1-22, stärker bevorzugt 1-15, 16-17, oder 18-22, stärker bevorzugt 1-15 oder 16-17, insbesondere 1-15 entsprechen, unterscheiden sich bevorzugt in maximal 3 Positionen, stärker bevorzugt in maximal 2 Positionen, insbesondere in maximal 1 Position von einer der Aminosäuresequenzen, die den Sequenzen in SEQ ID NOs: 1-27, bevorzugt 1 -22, stärker bevorzugt 1-15, 16-17, oder 18-22, stärker bevorzugt 1 -15 oder 16-17, insbesondere 1-15 entsprechen. Beispielsweise kann, wenn 1 Position unterschiedlich ist entweder eine der Aminosäuren der jeweiligen Sequenz ausgetauscht sein oder aber die Sequenzen stimmen überein, aber es wurde eine Aminosäure innerhalb der Aminosäurekette oder N- oder C-terminal ergänzt oder weggelassen. Beispielsweise könnte C- oder N-terminal ein Cystein (C) angehängt worden sein.
Der Begriff „Variante“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Varianten des erfindungsgemäßen Peptids, die weiterhin die Funktionalität des Ausgangspeptids aufweisen, sich aber von der Ausgangssequenz durch eine oder mehrere Sequenzabweichungen, beispielsweise 1 , 2 oder 3 Sequenzabweichungen, beispielsweise eine Substitution, Deletion oder Insertion unterscheiden. Die Sequenzidentität solcher Varianten kann im Bereich von 80 % bezogen auf die gesamte Länge des Ausgangspeptids liegen, und kann mindestens 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5 % betragen.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403- 410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500), T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren. Ferner möglich sind Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer-Programm Vector NTIR Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert. Soweit nicht anders angegeben, wird die hierin angegebene Sequenzidentität mit dem BLAST-Algorithmus bestimmt. Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Peptids/Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch als Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Peptide, Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Peptids/Proteins aber essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz.
Die Peptid- oder Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA- Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2‘-Bichinolyl-4,4‘-dicarbonsäure) oder dem Biuret- Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751-766) bestimmt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet der Peptid- und Proteintechnologie kennt eine Vielzahl geeigneter Verfahren zur Bestimmung der Peptid- oder Proteinkonzentration, die im Rahmen dieser Erfindung angewendet werden können.
Erfindungsgemäße Peptide können Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure- Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen, aufweisen. Solche Peptide sind beispielsweise durch gezielte genetische Veränderung, d.h. durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer Stabilität, Bindung, usw.) optimiert.
Beispielsweise können in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen eingeführt werden, um beispielsweise bestimmte Eigenschaften zu verändern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit einer Oberfläche verändert werden. So kann beispielsweise die Nettoladung der Peptide verändert werden, um darüber die Substratbindung zu beeinflussen. Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen beispielsweise die Stabilität oder Adsorption des Peptids erhöht werden. Vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Substitutionen, können sich ergänzen. Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird hierin folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben- Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Peptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt oder vor der entsprechenden Position ein A angegeben. Beispielsweise beschreibt P9T die Substitution von Prolin an Position 9 durch Threonin, P9TH die Insertion von Histidin nach der Aminosäure Threonin an Position 9 und P9* oder AP9 die Deletion von Prolin an Position 9. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt.
Somit umfasst die Erfindung auch Peptide, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie aus einem Peptid wie vorstehend beschrieben als Ausgangsmolekül erhältlich sind, beispielsweise aus einem Molekül mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOs: 1-27, bevorzugt 1-22, stärker bevorzugt 1-15, 16-17 oder 18-22, noch stärker bevorzugt 1-15 oder 16-17, insbesondere 1-15, an welchem beispielsweise ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, unter anderem auch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution, durchgeführt wurden, wobei das resultierende Peptid mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID
NOs: 1-27, bevorzugt 1-22, stärker bevorzugt 1-15, 16-17 oder 18-22, noch stärker bevorzugt 1-15 oder 16-17, insbesondere 1-15 aufweist.
Der Begriff "konservative Aminosäuresubstitution" bedeutet den Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, l=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T. Es kann aber bevorzugt sein, dass derartige Austausche als Zielaminosäure nicht Glycin oder Tyrosin haben oder beispielsweise auch keine Aminosäure, die ein niedriges alpha-Helix-bildendes Potential hat.
In bevorzugten Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Peptid auch modifiziert sein. Bevorzugte Modifikationen können beispielsweise das Koppeln des erfindungsgemäßen Peptids mit bestimmten anderen Molekülen oder chemischen Gruppen sein, beispielsweise organischen (Makromolekülen, z.B. über eine kovalente Bindung oder einen Linker über eine geeignete Aminosäure der Kette und/oder N- und/oder C-terminal.
Ist das erfindungsgemäße Peptid mit mindestens einem weiteren (Makro-)Molekül gekoppelt, kann es auch als Peptid-Derivat bezeichnet werden. Das erfindungsgemäße Peptid ist dann derivatisiert. In solchen Ausführungsformen kann das Peptid als Adhäsions-Tag wirken, welches die Bindung eines mit ihm gekoppelten Moleküls an die gewünschte Oberfläche bewirkt. Derartige Moleküle können auch als Konjugate bezeichnet werden.
In manchen Ausführungsformen sind die genannten erfindungsgemäßen Peptide, welche beispielsweise für Kopplungszwecke N- oder C-terminal die Aminosäure Cystein aufweisen können, mit Biotin gekoppelt (funktional modifiziert), bevorzugt an einer geeigneten Aminosäure der Kette und/oder N- und/oder C-terminal.
Ebenfalls möglich ist, dass das Peptid Teil eines Proteins oder Polypeptids ist. Derartige Proteine und Polypeptide können beispielsweise als Fusionsproteine rekombinant hergestellt werden. In derartigen Ausführungsformen ist das Peptid gemäß der Erfindung entweder N- oder C-Terminal lokalisiert, um die Adhäsion des Gesamtmoleküls an eine Oberfläche zu vermitteln. Auch in derartigen Ausführungsformen wirkt das Peptid dann somit als Adhäsions-Tag.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Peptid
(i) eine der folgenden Aminosäuresequenzen umfassen oder daraus bestehen: RALQALRALQALEAL-C (SEQ ID NO: 28), RALRALRALEALEAL-C (SEQ ID NO: 29), RALRALRALQALQAL-C (SEQ ID NO: 30), RALRALRALQALEAL-C (SEQ ID NO: 31), RALRALQALEALEAL-C (SEQ ID NO: 32), RALFEALQALFRALEAL-C (SEQ ID NO: 33), RALRALEALQALEA-C (SEQ ID NO: 34), RALFEALFRALEALR-C (SEQ ID NO: 35), RALFEALFRALEAL-C (SEQ ID NO: 36), RALEALFRALEAL-C (SEQ ID NO: 37), RALRALFEALEAL-C (SEQ ID NO: 38), RALEALFRALQALEAL-C (SEQ ID NO: 39), RALEALWRALQALEAL-C (SEQ ID NO: 40), RALEALWRALEAL-C (SEQ ID NO: 41), RALARALARALAQALA-C (SEQ ID NO: 42), RSIVTFSLRQNAQLA-C (SEQ ID NO: 43), RSIVTFSLRQNSEQA-C (SEQ ID NO: 44), insbesondere eine von SEQ ID NOs: 28-34, 39- 40 oder 42-44, insbesondere 28-32, 34 oder 42; oder
(ii) eine Aminosäuresequenz umfassen oder daraus bestehen, die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 81 %, mindestens 82 %, mindestens 83 %, mindestens 84 % oder mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 % oder insbesondere 100 % Sequenzidentität mit einer der
Sequenzen, die in SEQ ID NOs: 28-44 (28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43 oder 44) genannt werden, aufweist, vorzugsweise mit einer von SEQ ID NOs: 28-34, 39-40 oder 42-44, insbesondere 28-32, 34 oder 42.
Ferner ist es möglich, dass das erfindungsgemäße Peptid (i) eine der folgenden Aminosäuresequenzen umfasst oder daraus besteht: GLHTSATNLYLH- C (SEQ ID NO: 45), QHSIRLLTIKKP-C (SEQ ID NO: 46), QQSIRIMTIKHP-C (SEQ ID NO: 47), WRHPRLRCGNLL-C (SEQ ID NO: 48), oder QKSRNRMTRTHP-C (SEQ ID NO: 49); oder
(ii) eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 % oder insbesondere 100 % Sequenzidentität mit einer der
Sequenzen, die in SEQ ID NOs: 45-49 (45, 46, 47, 48 oder 49) genannt werden, aufweist.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs: 50-54 (SRARLFVVTYHK-C (SEQ ID NO: 50), HMISTMNAASRR-C (SEQ ID NO: 51), RSIVTFSLRQNR- C (SEQ ID NO: 52), RNTIRIRTIKHP-C (SEQ ID NO: 53), RHSSTLRYRPLP-C (SEQ ID NO: 54)) oder eine Variante davon, die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 90%, insbesondere mindestens 95% Sequenzidentität damit aufweist, umfassen oder daraus bestehen.
In bestimmten Ausführungsformen ist das Peptid ein Peptid das für die Adhäsion an Kunststoffoberflächen geeignet ist.
Unter „Adhäsion“ wird im Kontext dieser Erfindung eine Wechselwirkung zwischen dem Peptid und einer Oberfläche verstanden, wodurch das Peptid an der Oberfläche haften kann. Somit bezeichnet ein „adhäsives Peptid“ ein Peptid, das die Fähigkeit besitzt mit einer bestimmten Oberfläche zu wechselwirken und/oder an einer bestimmten Oberfläche zu haften. Die adhäsiven Peptide, die hierin beschrieben werden, weisen vorzugsweise eine 10-fach, noch bevorzugter eine 20-fach, 50-fach oder 100-fach höhere Adhäsion an eine gegebene Oberfläche auf als ein beliebiges alternatives Peptid vergleichbarer Länge, welches nicht für diesen Zweck entwickelt wurde und nicht die hierin beschriebenen Sequenzvorgaben erfüllt.
Die Begriffe „Kunststoff und „Plastik“ sind synonym zu verwenden und bezeichnen typischerweise Festkörper, die Polymere als Grundbausteine umfassen, wobei beispielsweise andere (chemische) Gruppen und Moleküle dazukommen können.
Der Begriff „Festkörper“ bezieht sich hierbei auf jede Beschaffenheit fester Stoffe, ist also zu unterscheiden von flüssigen oder gasförmigen Stoffen. Festkörper können sowohl hart und unbiegsam, als auch dehnbar, biegsam und flexibel sein. Es ist besonders bevorzugt, dass die Kunststoffoberfläche eine Kunststoffoberfläche mit geringer Oberflächenenergie (Low Surface Energy Polymeroberfläche (LSEP-Oberfläche)) ist. Diese Oberflächen sind typischerweise inerte Oberflächen, die bisher zur Funktionalisierung oder für weitere Modifizierungen zuerst aktiviert werden mussten. Gängige Verfahren sind hier beispielsweise eine Plasma- oder Corona-Behandlung sowie eine Behandlung mit Primern, beispielsweise Lösungsmitteln oder Oxidationsmitteln, ohne darauf beschränkt zu sein. Derartige Vorbehandlungsverfahren können durch den Einsatz der hierin beschriebenen Peptide umgangen bzw. vermieden werden, weil die beschriebenen Peptide auch die unbehandelten LSEP-Oberflächen gut binden.
Zur Bestimmung der Oberflächenenergie einer Kunststoffoberfläche kann beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Kontaktwinkel-Messung durchgeführt werden. Der gemessene Kontaktwinkel gibt an, inwieweit eine Flüssigkeit die Oberfläche eines Festkörpers benetzen kann. Daraus kann abgelesen werden, inwieweit diese Flüssigkeit, beispielsweise ein Lack oder ein Klebstoff, für die Behandlung der untersuchten Oberfläche geeignet ist. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist die Kontaktwinkel-Messung eine gängige Messmethode.
Bevorzugt umfasst oder besteht die Kunststoffoberfläche (aus) ein(em) Material ausgewählt aus den Folgenden: Polyester (PES), Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polyurethan (PU), Polystyrol (PS), Polyvinylchlorid (PVC), Polycarbonat (PC), Polyamid (PA), Polyphenylenether, Polyphenylensulfid, Polyoxymethylen (POM), Polymethylmethacrylat (PMA), Polyethylenterephthalat (PET), Polybutylenterepthalat (PBT), Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyhydroxyalkanoat (PHA), Polyhydroxybutyrat (PHB) Polyimid (PI), Polylactid (PLA), Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polyetherketon (PEK u.a.), Copolymere und/oder Mischungen davon und/oder polymere Schäume davon, bevorzugt Polyester (PES), Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polystyrol (PS), Copolymere und/oder Mischungen davon und/oder polymere Schäume davon, insbesondere Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polystyrol (PS) oder Copolymere und/oder Mischungen davon.
In bevorzugten Ausführungsformen kann die Kunststoffoberfläche eines oder mehrere der folgenden Teile darstellen: Verbundbauteile, Folien, Verpackungen, Kunststoffpartikel und/oder Textilien, beispielsweise Funktionstextilien.
Bevorzugt weist das erfindungsgemäße Peptid eine Adsorption an die Kunststoffoberfläche von 0,25 bis 3, beispielsweise von 0,25 bis 1 oder von 0,4 bis 1 auf, gemessen mittels der halbquantitativen Methode zur Adhäsionsmessung, welche beispielsweise in der WO 2014/072313 A1 oder hierin in Beispiel 2 beschrieben wird.
Unter Verwendung der direkten BCA-Methode zur Adhäsionsmessung liegen die bevorzugten Adhäsionswerte im Bereich von 25 bis 100, insbesondere 40 bis 100. Dieses Verfahren wird beispielsweise in Beispiel 3 beschrieben. Eine gute Adhäsion an Kunststoffoberflächen kann beispielsweise durch ein Peptid mit einer ausgeprägten Helix-Struktur (insbesondere a-Helixstruktur) und/oder einem hohen Arginin-Gehalt, insbesondere an einem der Termini, erzielt werden.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Peptide, zur Adhäsion an Kunststoffoberflächen, bevorzugt an LSEP-Oberflächen, insbesondere an Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Copolymere und/oder Mischungen davon, umfassen oder bestehen aus einer Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt 10 bis 24 Aminosäuren, beispielsweise 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 oder 24 Aminosäuren, insbesondere 12 bis 19 Aminosäuren, beispielsweise 12 bis 18 Aminosäuren, wobei (a) die Aminosäuresequenz in N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Sequenz aufweist (C)mXlX2X3(X4)nX5(C)o, wobei
Xi eine positiv geladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder K, noch bevorzugter R,
X2 und X3 ungeladene Aminosäuren sind, vorzugsweise ausgewählt aus A, L, M, S, I und Q, noch bevorzugter aus A, L, M und Q, insbesondere aus A und L, jedes X4 unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G;
X5 eine beliebige positiv geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder eine ungeladenen Aminosäure, noch bevorzugter Q, A oder L, insbesondere A oder L, m und 0 0 oder 1 sind, wobei m+o = 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 46, bevorzugt von 6 bis 20 ist, beispielsweise 9, 10, 11 , 12 oder 13; oder b) die Aminosäuresequenz mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 81 %, mindestens 82%, mindestens 83%, mindestens 84% oder mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, mindestens 87 %, mindestens 88 %, mindestens 89 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, mindestens 99,5 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer der in SEQ ID NOs: 16- 22, bevorzugt 16-17 oder 18-22 genannten Aminosäuresequenzen aufweist.
Besonders bevorzugt weist das erfindungsgemäße Peptid, das insbesondere gegenüber Polyethylen eine gute Adhäsion aufweist, eine Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt von 10 bis 24 Aminosäuren auf, wobei die Aminosäuresequenz mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 %, insbesondere 100 % Sequenzidentität mit einer der Aminosäuresequenzen hat, die einer der Sequenzen in SEQ ID NOs: 1-5, 7 und 16-17 oder 28-32, 34, 43 und 44, insbesondere 1-5, und 7 oder 28-32 und 34 entsprechen. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Peptide, die insbesondere gegenüber Polypropylen eine gute Adhäsion aufweisen, weisen eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 %, insbesondere 100 % Sequenzidentität mit einer der Aminosäuresequenzen hat, die einer der Sequenzen in SEQ ID NOs. 1 , 2, 4, 5, 7, 16 und 17 oder 28, 29, 31 , 32, 34, 43 und 44 entsprechen, insbesondere 1 , 2, 4, 5 und 7 oder 28, 29, 31 , 32 und 34.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Peptide, die insbesondere gegenüber Polystyrol eine gute Adhäsion aufweisen, weisen eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 %, insbesondere 100 % Sequenzidentität mit einer der Aminosäuresequenzen hat, die den Sequenzen in SEQ ID NOs. 1-5, 7 und 15-17 oder 28-32, 34 und 42-44, entsprechen.
Verfahren zur Bestimmung der Adhäsion der erfindungsgemäßen Peptide werden in den Beispielen beschrieben, wobei die Bestimmung nicht auf diese Verfahren beschränkt ist und der Fachmann auf diesem Gebiet alle ihm bekannten und geeigneten Verfahren zur Bestimmung der Adhäsion anwenden kann.
Ferner kann das erfindungsgemäße Peptid auch mindestens eine Untereinheit (Modul) eines Polypeptids sein, wobei das Polypeptid ein Multimer der hierin beschriebenen Sequenzen umfassen kann, beispielsweise 1 bis 30 Wiederholungen, stärker bevorzugt 2 bis 15 Wiederholungen, insbesondere 2 bis 10 Wiederholungen, beispielsweise 2, 3, 4, 5 oder 6 Wiederholungen der erfindungsgemäßen Peptide. Das Polypeptid kann solche Multimere umfassen oder daraus bestehen. In verschiedenen Ausführungsformen können die einzelnen Peptid-Untereinheiten des Polypeptids (Multimers) durch Spacer voneinander getrennt sein, beispielsweise durch Spacer mit einer Länge von 1 bis 10 Aminosäuren, bevorzugt 1 bis 4 Aminosäuren.
Somit ist ein weiterer Aspekt der Erfindung auch ein Peptid oder Polypeptid (Multimer) umfassend eins oder mehr, bevorzugt zwei oder mehr erfindungsgemäße Peptide, wie hierin beschrieben. Der Begriff „Polypeptid“ bezeichnet in diesem Zusammenhang insbesondere solche Peptide die 100 oder mehr Aminosäuren umfassen.
Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.
Bevorzugt ist es jedoch, die erfindungsgemäßen Peptide mittels rekombinanter Verfahren herzustellen. Hierunter sind erfindungsgemäß alle gentechnisch oder mikrobiologischen Verfahren zu verstehen, die darauf beruhen, dass die Gene für die interessierenden Peptide in einen für die Produktion geeigneten Wirtsorganismus eingebracht und von diesem transkribiert und translatiert werden (zusammengefasst im Rahmen dieser Erfindung als biotechnologische Verfahren). Beispielsweise erfolgt die Einschleusung der betreffenden Gene über Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren; aber auch übersolche, die bewirken, dass das interessierende Gen im Wirtsorganismus in ein bereits vorhandenes genetisches Element wie das Chromosom oder andere Vektoren eingefügt werden kann. Die funktionelle Einheit aus Gen und Promotor und eventuell weiteren genetischen Elementen wird typischerweise als Expressionskassette bezeichnet. Sie muss dafür jedoch nicht notwendigerweise auch als physische Einheit vorliegen.
Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Peptide als Polypeptide (Multimere) hergestellt und nachfolgend in die funktionellen Peptide gespalten. Ganz besonders bevorzugte Multimere weisen 2 bis 10 Peptideinheiten (jeweils gemäß der Erfindung) auf, die jeweils durch Spacer von 0 bis 4 Aminosäuren Länge (beispielsweise 1 , 2, 3 oder 4 Aminosäuren) voneinander getrennt sind. Diese Spacer können, z.B. aus den Aminosäuren Glycin (G), Alanin (A) und Serin (S) bestehen. Alternativ können die Spacer auch Schnittstellen für spezifische Proteasen/Peptidasen, insbesondere Endopeptidasen, sein oder solche umfassen bzw. zusammen mit Teilen des erfindungsgemäßen Peptids eine solche Schnittstelle bilden.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden, möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen und diese dann zur Synthese von Peptiden und Polypeptiden in geeigneten Wirtszellen einzusetzen.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das Peptid mittels biotechnologischer Verfahren, wie oben definiert, hergestellt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zelllinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als vom übrigen Genom unabhängig replizierendes, stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfühlen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Peptids zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.
Die für ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein Multimer eines solchen Peptides kodierende Nukleinsäure, welche einen weiteren Aspekt der Erfindung ausmacht, kann beispielsweise in einen Vektor kloniert werden. Die molekularbiologische Dimension der Erfindung besteht somit in Vektoren mit den Genen für die entsprechenden Peptide. Dazu können beispielsweise solche gehören, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bakteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren, sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie sich extrachomosomal als eigene Einheiten etablieren oder in ein Chromosom integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.
Die Vektoren bilden geeignete Ausgangspunkte für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugehörigen Peptids und für erfindungsgemäße Weiterentwicklungen und letztlich für die Amplifikation und Produktion erfindungsgemäßer Peptide. Sie stellen weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung dar.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Klonierungsvektoren. Diese eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für die Charakterisierung des betreffenden Gens, etwa über das Erstellen einer Restriktionskarte oder die Sequenzierung. Klonierungsvektoren sind auch deshalb bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, weil sie eine transportierbare und lagerfähige Form der beanspruchten DNA darstellen. Sie sind auch bevorzugte Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion.
Expressionsvektoren sind chemisch den Klonierungsvektoren ähnlich, unterscheiden sich aber in jenen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den für die Produktion von Peptiden optimierten Wirtsorganismen zu replizieren und dort das enthaltene Gen zur Expression zu bringen. Bevorzugte Ausführungsformen sind Expressionsvektoren, die selbst die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen. Die Expression wird beispielsweise von Promotoren beeinflusst, welche die Transkription des Gens regulieren. So kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch nach gentechnischer Fusion sowohl durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle als auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche Expressionsvektoren, die über Änderungen der Kulturbedingungen oder Zugabe von bestimmten Verbindungen, wie beispielsweise die Zelldichte oder spezielle Faktoren, regulierbar sind.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Peptidbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Derartige Expressionssysteme sind im Stand der Technik ebenfalls etabliert.
Die In-vivo-Synthese eines erfindungsgemäßen Peptids, also die durch lebende Zellen, erfordert den Transfer des zugehörigen Gens in eine Wirtszelle, deren sogenannte Transformation. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten, Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze wie z.B. Hefen oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdpeptide. Häufig müssen aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden. Jedes erfindungsgemäße Peptid kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind solche Wirtszellen. Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Peptide.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryotische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich gegenüber Eukaryoten in der Regel durch kürzere Generationszeiten und geringere Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer Peptide etabliert werden. Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Peptiden in den periplasmatischen Raum sekretiert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Gram-positive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales, besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sekretierte Peptide sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abgegeben werden, aus welchem sich nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform die exprimierten erfindungsgemäßen Peptide direkt aufreinigen lassen.
Eine Variante dieses Prinzips stellen Expressionssysteme dar, bei denen zusätzliche Gene, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, die Produktion erfindungsgemäßer Peptide beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Genprodukte handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Peptid gemeinsam aufgereinigt werden sollen.
Aufgrund der weitreichenden Erfahrungen, die man beispielsweise hinsichtlich der molekularbiologischen Methoden und der Kultivierbarke it mit coliformen Bakterien hat, stellen diese bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Besonders bevorzugt sind solche der Gattungen Escherichia coli, insbesondere nichtpathogene, für die biotechnologische Produktion geeignete Stämme.
Repräsentative Vertreter dieser Gattungen sind die K12-Derivate und die B-Stämme von Escherichia coli. Stämmen, die sich nach an sich bekannten genetischen und/oder mikrobiologischen Methoden von diesen ableiten lassen, und somit als deren Derivate angesehen werden können. Diese besitzen für genetische und mikrobiologische Arbeiten die größte Bedeutung und werden vorzugsweise zur Entwicklung erfindungsgemäßer Verfahren eingesetzt. Solche Derivate können beispielsweise über Deletions- oder Insertionsmutagenese hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder andere oder zusätzliche Peptide exprimieren. Es kann sich insbesondere um solche Derivate handeln, die zusätzlich zu dem erfindungsgemäß hergestellten Peptid weitere wirtschaftlich interessante Peptide exprimieren.
Auch solche Mikroorganismen sind bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie nach Transformation mit einem der oben beschriebenen Vektoren erhalten worden sind. Dabei kann es sich beispielsweise um Klonierungsvektoren handeln, die zur Lagerung und/oder Modifikation in einen beliebigen Bakterienstamm eingebracht worden sind. Solche Schritte sind in der Lagerung und in der Weiterentwicklung betreffender genetischer Elemente allgemein verbreitet. Da aus diesen Mikroorganismen die betreffenden genetischen Elemente in zur Expression geeignete gram-negative Bakterien unmittelbar übertragen werden können, handelt es sich auch bei den vorangegangenen Transformationsprodukten um Verwirklichungen des betreffenden Erfindungsgegenstands.
Auch eukaryotische Zellen können sich zur Produktion erfindungsgemäßer Peptide eignen. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Peptide im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Dazu gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Das wäre im Kontext dieser Erfindung ein Beispiel für ein funktional modifiziertes Peptid. Die Wirtszellen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den rekombinanten Bakterienstämmen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.
Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik wohlbekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar; gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode.
Alle Fermentationsverfahren, die auf einem der oben ausgeführten Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Peptide beruhen, stellen entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Hierbei müssen die für die eingesetzten Herstellungsverfahren, für die Wirtszellen und/oder die herzustellenden Peptide jeweils optimalen Bedingungen anhand der zuvor optimierten Kulturbedingungen der betreffenden Stämme nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise hinsichtlich Fermentationsvolumen, Medienzusammensetzung, Sauerstoffversorgung oder Rührergeschwindigkeit experimentell ermittelt werden.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert; man spricht auch von einer Zufütterungsstrategie. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte, als auch in der Biotrockenmasse und/oder vor allem der Aktivität des interessierenden Peptids erreicht werden.
Analog dazu kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passenden Gegenionen neutralisiert werden.
Das hergestellte Peptid kann nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Dieses Fermentationsverfahren ist gegenüber der Produktaufbereitung aus der Trockenmasse bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung geeigneter Sekretionsmarker und Transportsysteme.
Ohne Sekretion ist u.U. die Aufreinigung des Peptids aus der Zellmasse erforderlich, auch dazu sind verschiedene Verfahren bekannt, wie Fällung z.B. durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung, wenn erforderlich bis zur Homogenität. Die Mehrzahl der beschriebenen technischen Verfahren dürfte jedoch mit einer angereicherten, stabilisierten Präparation auskommen.
Alle bereits oben ausgeführten Elemente können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Peptide herzustellen. Diese Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide stellen weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung dar. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Peptid eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar. Optimale Bedingungen, könnten für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind ferner (isolierte) Nukleinsäuresequenzen, die für ein erfindungsgemäßes Peptid kodieren, oder die für ein Peptid kodieren, umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NOs: 1-27, bevorzugt 1-15 und/oder 16-17 und/oder 18-22, stärker bevorzugt 1-15 und/oder 16-17, insbesondere 1-15, oder Varianten davon, die mindestens 90%, bevorzugt mindestens 91 %, stärker bevorzugt mindestens 92%, stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 94%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97%, noch stärker bevorzugt mindestens 98%, noch stärker mindestens 99%, insbesondere mindestens 99,5% Sequenzidentität mit den genannten Sequenzen aufweisen.
Ferner betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Klonierungs- oder Expressionsvektoren, die mindestens eine erfindungsgemäße (isolierte) Nukleinsäuresequenz umfassen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die mit mindestens einer erfindungsgemäßen (isolierten) Nukleinsäuresequenz oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist und/oder diese(n) enthält.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide.
Das erfindungsgemäße Peptid kann bei den genannten Aspekten auch ein erfindungsgemäßes Peptid oder Polypeptid sein, welches eins oder mehr, bevorzugt zwei oder mehr erfindungsgemäße Peptide, wie hierin beschrieben, umfasst.
Ferner betrifft die Erfindung Mittel, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid gemäß der Erfindung umfassen oder daraus bestehen.
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Mittel (i) ein Beschichtungsmittel, ein Lack, ein Anstrichmittel, ein Haftvermittler oder ein Klebstoff, bevorzugt ein wasserbasierter Klebstoff; und/oder (ii) ein Wasch- oder Reinigungsmittel. In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Mittel Beschichtungsmittel, Lacke, Anstrichmittel, Haftvermittler oder Klebstoffe, bevorzugt wasserbasierte Klebstoffe, vorzugsweise für Kunststoffoberflächen, insbesondere für LSEP-Kunststoffoberflächen, wie beispielsweise Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol und/oder Copolymere oder Mischungen davon, insbesondere Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol und/oder Copolymere und/oder Mischungen davon.
Die erfindungsgemäßen Peptide oder das erfindungsgemäße Mittel kann/können beispielsweise als Haftvermittler zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten eines mehrschichtigen Verbunds oder bei beschichteten Substraten zwischen der Beschichtung und dem Substrat angewendet werden.
Mehrschichtige Verbünde werden für unterschiedlichste Zwecke, z.B. als Verpackungsmittel (insbesondere Verbundfolien) oder selbstklebende Artikel (mehrschichtiger Verbund aus mindestens Träger und Klebstoffschicht) eingesetzt. Die mehrschichtigen Verbünde können mindestens zwei, vorzugsweise zwei bis fünf Schichten enthalten, wobei die einzelnen Schichten eine Dicke von z. B. 0,01 bis 5 mm haben können.
Die einzelnen Schichten sind bevorzugt Kunststoffoberflächen, insbesondere LSEP- Kunststoffoberflächen, beispielsweise (LSEP)-Kunststofffolien oder (LSEP)-Polymerfolien.
Zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des mehrschichtigen Verbunds können die oben genannten Peptide oder Mittel als Haftvermittler verwendet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei mindestens einer der benachbarten Schichten um eine Schicht aus einem natürlichen oder synthetischen Polymer. Als Polymere kommen insbesondere Polykondensate, wie Polyester, Polyaddukte wie Polyurethane, Polyamide, Polycarbonate oder Polyphenylenether oder Polyphenylensulfide oder Polymere, welche durch radikalische oder ionische Polymerisation von ethylenisch ungesättigten Verbindungen erhältlich sind (kurz radikalische Polymere genannt) in Frage. Derartige radikalische Polymere bestehen vorzugsweise zu mindestens 60 Gew.-%, besonders bevorzugt zu mindestens 80 Gew.-% aus sogenannten Hauptmonomeren, ausgewählt aus C1 bis C20 Alkyl(meth)acrylaten, Vinylestern von bis zu 20 C-Atome enthaltenden Carbonsäuren, Vinylaromaten mit bis zu 20 C-Atomen, ethylenisch ungesättigten Nitrilen, Vinylhalogeniden, Vinylethern von 1 bis 10 C Atome enthaltenden Alkoholen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen mit 2 bis 8 C Atomen und ein oder zwei Doppelbindungen, insbesondere Ethylen und Propylen, und/oder cyclischen Kohlenwasserstoffen, insbesondere Styrol. Das erfindungsgemäße Peptid kann auf eine der benachbarten Schichten aufgetragen werden, alternativ kann das Peptid auch auf beide Schichten aufgetragen werden.
Das Peptid kann als wässrige Lösung vorliegen. In solchen Ausführungsformen beträgt der Peptidgehalt der Lösung vorzugsweise 0,00001 bis 5 Gew.-Teile Peptid auf 100 Gew.-Teile Wasser, beispielsweise 0,00001 bis 5 Gew.-%, bevorzugt 0,0001 bis 1 Gew.-%, insbesondere 0,001 bis 0,1 Gew.-% jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung. Für die erfindungsgemäßen Verwendungen in Beschichtungsmitteln, Haftvermittlern oder Klebstoffen für Kunststoffoberflächen wird die Lösung vorzugsweise weiter verdünnt auf eine Konzentration von 0,001 bis 10000 pg/ml Wasser, bevorzugt 1 bis 10000 pg/ml Wasser, insbesondere 10 bis 1000 pg/ml Wasser. Nach dem Aufträgen kann daher zunächst eine Trocknung zur Entfernung des Wassers erfolgen. Danach können die beiden benachbarten Schichten durch übliche Methoden, z. B. durch Kaschierung verbunden werden.
Substrate werden zu unterschiedlichsten Zwecken beschichtet. Genannt seien insbesondere dekorative Überzüge oder Schutzüberzüge (zusammenfassend Lackierungen) oder auch Klebstoffbeschichtungen, wobei der Klebstoff als solcher auf das Substrat aufgebracht werden kann oder z. B. in Form eines selbstklebenden Artikels (Etikett oder Klebeband) aufgeklebt wird. Das Substrat, bzw. die Substratoberfläche, kann aus einem beliebigen Material bestehen. Ebenso kann die Beschichtung bzw. die substratseitige Oberfläche der Beschichtung aus einem beliebigen Material bestehen. Vorzugsweise besteht die Substratoberfläche oder die Beschichtung, bzw. die substratseitige Oberfläche der Beschichtung aus Kunststoff, insbesondere aus Polymeren oder Copolymeren.
Als Polymere kommen insbesondere Polykondensate, wie Polyester, Polyaddukte wie Polyurethane, Polyamide, Polycarbonate oder Polyphenylenether oder Polyphenylensulfide oder Polymere, welche durch radikalische oder ionische Polymerisation von ethylenisch ungesättigten Verbindungen erhältlich sind (kurz radikalische Polymere genannt) in Frage. Besonders bevorzugt sind Polymere oder Copolymere aus Ethylen, Propylen und/oder Styrol. Zum Aufbau der radikalischen Polymere und ihrem Gehalt an Hauptmonomeren gilt das oben gesagte.
Die für die Haftvermittlung benötigte Menge des Peptids entspricht der oben angegebenen Menge. Das Peptid kann auf die Substratoberfläche, auf die substratseitige Oberfläche der Beschichtung oder auf beide aufgetragen werden. Das Peptid liegt vorzugsweise als wässrige Lösung vor; der Gehalt der Lösung ist wie oben angegeben. Nach dem Aufträgen kann daher zunächst eine Trocknung zur Entfernung des Wassers erfolgen.
Die Beschichtung kann nach üblichen Methoden auf das Substrat aufgebracht werden, Folien oder mehrschichtige Verbünde können z. B. aufkaschiert werden. Insbesondere kann die Beschichtung durch Aufbringen einer Polymerdispersion, Polymerlösung oder eines lösemittelfreien Polymers auf die mit dem Haftvermittler versehene substratseitige Oberfläche und anschließender Verfilmung und/oder thermischer oder photochemischer Härtung hergestellt werden. Insbesondere liegt das Polymer dazu in Form einer wässrigen Dispersion oder Lösung vor, besonders bevorzugt handelt es sich um eine wässrige Dispersion eines Emulsionspolymerisats, vorzugsweise eines oben aufgeführten radikalischen Polymers. Nach dem Aufträgen des Polymers erfolgt dann gegebenenfalls eine Trocknung.
Die mehrschichtigen Verbünde und beschichteten Substrate haben damit bevorzugt eine deutlich erhöhte Festigkeit. Bevorzugt haftet die Beschichtung durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide als Haftvermittler stärker auf dem Substrat und die einzelnen Schichten des mehrschichtigen Verbunds haften besser aneinander. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Substrat um einen Kunststoff. Es kann sich hierbei prinzipiell um beliebige Kunststoffe handeln. Beispiele umfassen Kunststoffe aus Polyester, Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polyurethan (PU), Polystyrol (PS), Polyvinylchlorid (PVC), Polycarbonat (PC), Polyamid (PA), Polyphenylenether, Polyphenylensulfid, Polyoxymethylen (POM), Polymethylmethacrylat (PMA), Polyethylenterephthalat (PET), Polybutylenterepthalat (PBT), Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyhydroxyalkanoat (PHA), Polyhydroxybutyrat (PHB) Polyimid (PI), Polylactid (PLA), Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polyetherketon (PEK u.a.), Copolymere davon und/oder polymere Schäume davon, bevorzugt Polyester (PES), Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polystyrol (PS), Copolymere davon und/oder polymere Schäume davon, insbesondere Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polystyrol (PS), Copolymere davon und/oder polymere Schäume davon. Die Kunststoffe können in beliebiger Form vorliegen, bevorzugt sind aber Kunststofffolien, Kunststoffbänder oder Kunststoffverpackungen. Auch Textilien aus Kunststoff oder einem hohem Kunststoffanteil (mindestens 10%, stärker bevorzugt mindestens 20 %, noch stärker bevorzugt mindestens 30%, noch stärker bevorzugt mindestens 40 %, noch stärker bevorzugt mindestens 50 %, insbesondere 60% Kunststoffanteil, beispielsweise 65 %) sind umfasst. Bei dem Kunststoff kann es sich auch um ein Verbundmaterial mit einer Kunststoffoberfläche handeln.
Die Kunststoffoberflächen werden mit den erfindungsgemäßen Peptiden, oder den erfindungsgemäßen Mitteln als Haftvermittler beschichtet. Dies kann mit wässrigen Lösungen der Peptide erfolgen. Einzelheiten zur Beschichtung wurden bereits vorstehend genannt.
Bei der Beschichtung kann es sich insbesondere um typische Lacke bzw. Lacksysteme zur Beschichtung von Kunststoffoberflächen handeln. Es kann sich hierbei um thermisch, fotochemisch oder nach anderen Mechanismen härtende Lacke handeln.
Typische Lacke zur Beschichtung von Kunststoffoberflächen umfassen mindestens ein Bindemittel sowie vernetzbare Komponenten. Bei den vernetzbaren Komponenten kann es sich um Vernetzer handeln, welche zusätzlich zu einem Bindemittel eingesetzt werden oder es kann sich hierbei um vernetzbare Gruppen handeln, welche mit dem Bindemittel verbunden sind. Selbstverständlich kann auch das Bindemittel vernetzbare Gruppen aufweisen und zusätzlich ein Vernetzer eingesetzt werden. Hierbei sind verschiedene Kombinationsmöglichkeiten denkbar. Beispielsweise können Bindemittel und Vernetzer getrennt voneinander eingesetzt werden. Das Bindemittel umfasst dann reaktive funktionelle Gruppen, die mit komplementären, reaktiven funktionellen Gruppen in den Vernetzern reagieren können. Alternativ kann es sich auch um selbstvernetzende Bindemittel handeln, die reaktive funktionelle Gruppen umfassen, die mit Gruppen ihrer Art ("mit sich selbst") oder mit komplementären, reaktiven funktionellen Gruppen am selben Polymer Vernetzungsreaktionen eingehen können. Möglich ist auch, dass ausschließlich die Vernetzer miteinander reagieren.
Beispiele geeigneter Bindemittel umfassen (Meth)acrylat(co)polymerisate, partiell verseifte Polyvinylester, Polyester, Alkydharze, Polylactone, Polycarbonate, Polyether, Epoxidharz-Amin- Addukte, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyimide oder Polyurethane. Selbstverständlich können auch Mischungen verschiedener Polymerer eingesetzt werden, vorausgesetzt es treten durch die Mischung keine unerwünschten Effekte auf. Die vernetzenden Komponenten können thermisch vernetzende Gruppen oder fotochemisch vernetzende Gruppen aufweisen. Geeignete thermische Vernetzer sind beispielsweise Vernetzer auf Basis von Epoxiden, von Melamin oder von blockierten Isocyanaten. Geeignete Vernetzer zur photochemischen Vernetzung sind insbesondere Verbindungen mit mehreren ethylenisch ungesättigten Gruppen, insbesondere di- oder polyfunktionelle Acrylate. Durch die erfindungsgemäßen Peptide oder die erfindungsgemäßen Mittel wird die Haftung des Lackes auf dem Substrat bevorzugt vorteilhaft verbessert. Weiterhin wird in Korrosionsschutztests bevorzugt auch eine verbesserte Beständigkeit gegen Unterwanderung der Lackschicht erreicht.
Bei der Verklebung werden bevorzugt zwei Kunststoffoberflächen, wobei vorzugsweise mindestens eine, beispielsweise aber auch beide Kunststoffoberflächen mit dem erfindungsgemäßen Peptid behandelt wurden, miteinander in Kontakt gebracht oder eine mit dem Peptid behandelte Kunststoffoberfläche wird mit einer anderen Oberfläche in Kontakt gebracht.
Die Oberflächenbehandlung bezieht sich insbesondere auf Verbundbauteile oder andere (Kunststoff-)Oberflächen, die vor der Beschichtung, der Lackierung, dem Anstrich oder der Verklebung mit dem erfindungsgemäßen Peptid oder dem erfindungsgemäßen Mittel vorbehandelt werden.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das erfindungsgemäße Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere für die Benutzung bei Textilien aus Kunststoff oder mit einem Kunststoffanteil (bevorzugt mindestens 10%, stärker bevorzugt mindestens 20 %, noch stärker bevorzugt mindestens 30%, noch stärker bevorzugt mindestens 40 %, noch stärker bevorzugt mindestens 50 %, insbesondere 60% Kunststoffanteil, beispielsweise 65 %), beispielsweise Funktionskleidung. Dabei bestehen die Textilien bevorzugt aus Kunststoff oder Kunststoff-Mischungen, beispielsweise Polyester, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol und/oder Copolymeren und/oder Mischungen davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verklebung, Beschichtung, Lackierung und/oder Oberflächenbehandlung von Kunststoffoberflächen, bevorzugt LSEP-Oberflächen, wobei in mindestens einem Verfahrensschritt mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein erfindungsgemäßes Mittel eingesetzt wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids oder des erfindungsgemäßen Peptids oder Polypeptids (Multimers), welches ein oder mehr, bevorzugt zwei oder mehr erfindungsgemäße Peptide umfasst, oder der hierin beschriebenen Mittel zur Bindung/Adhäsion an Kunststoffoberflächen, insbesondere LSEP-Oberflächen. Die Verwendung kann auch die Verwendung der hierin beschriebenen Peptide als Bestandteile größerer Moleküle, um deren Bindung an eine Oberfläche zu vermitteln, umfassen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Peptids wie hierin beschrieben bzw. entsprechender Konjugate, Multimere oder Mittel zur Adhäsion an Kunststoffoberflächen, bevorzugt LSEP-Oberflächen, stärker bevorzugt Polyester, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol oder Copolymeren und/oder Mischungen davon, insbesondere Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol oder Copolymeren und/oder Mischungen davon, wobei das Peptid oder Polypeptid mindestens eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NOs. 1-27, beispielsweise 1-15 oder 16-17 oder 18-22 oder 23-27, bevorzugt 1-17 oder 18-22, stärker bevorzugt 1-17, insbesondere 1-15 aufweist oder daraus besteht oder eine Variante davon ist, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 81 %, mindestens 82%, mindestens 83%, mindestens 84% oder mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, noch stärker bevorzugt mindestens 87 %, noch stärker bevorzugt mindestens 88 %, noch stärker bevorzugt mindestens 89 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, noch stärker bevorzugt mindestens 91 %, noch stärker bevorzugt mindestens 92 %, noch stärker bevorzugt mindestens 93 %, noch stärker bevorzugt mindestens 94 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 %, noch stärker bevorzugt mindestens 96 %, noch stärker bevorzugt mindestens 97 %, noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5 % Sequenzidentität zu einer der angegebenen Sequenzen hat.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße Peptid oder Mittel zur Verklebung, Beschichtung, Lackierung und/oder Oberflächenbehandlung von Kunststoffoberflächen, bevorzugt LSEP-Oberflächen, sowie von mehrschichtigen Verbunden oder beschichteten Substraten oder zum Abbau von Kunststoff verwendet. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Peptid als Bestandteil von Beschichtungsmitteln, Lacken, Anstrichmitteln, Haftvermittlern oder Klebstoffen für Kunststoffoberflächen sowie bei mehrschichtigen Verbunden oder beschichteten Substraten verwendet oder das erfindungsgemäße Mittel wird als Beschichtungsmittel, Lack, Anstrichmittel, Haftvermittleroder Klebstoff für Kunststoffoberflächen sowie bei mehrschichtigen Verbunden oder beschichteten Substraten verwendet.
In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Peptid oder Mittel zum Abbau von Kunststoffen, bevorzugt LSEP-Mikroplastik und/oder zur Reinigung oder Behandlung von Textilien aus Kunststoff oder mit einem Kunststoffanteil (bevorzugt mindestens 10%, stärker bevorzugt mindestens 20 %, noch stärker bevorzugt mindestens 30%, noch stärker bevorzugt mindestens 40 %, noch stärker bevorzugt mindestens 50 %, insbesondere 60% Kunststoffanteil, beispielsweise 65 %) verwendet werden.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Peptid bei diesen Verwendungen, wie oben beschrieben, funktional modifiziert/derivatisiert/konjugiert sein und/oder es ist in einem Peptid oder Polypeptid (Multimer), welches eins oder mehr, bevorzugt zwei oder mehr, des erfindungsgemäßen Peptids umfasst, enthalten.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Peptid oder das erfindungsgemäße Mittel bei einem pH-Wert von 2 bis 12, bevorzugt von 5 bis 9, beispielsweise von 7 bis 9, angewendet. Das kann sich beispielsweise auf den pH-Wert des fertigen Mittels, auf die anwendungsbereite Zusammensetzung oder z.B. auf den pH-Wert der Waschflotte beziehen, in welcher das Mittel oder Peptid angewendet wird.
Beispiele
Beispiel 1 : Peptidsequenzen
Tabelle 1 : Peptidnamen und zugehörige Aminosäuresequenzen.
Die Peptide stammen teilweise aus E. coli Display Datenbank Screenings (z.B. P3, P6, P15, P8C), andere Peptide sind entweder Weiterentwicklungen davon oder reine Designer-Peptide (beispielsweise RAL-Peptide oder Varianten davon). Das Peptid kann wie gelistet vorliegen oder beispielsweise N- und/oder C-terminal durch eine weitere Aminosäure wie Cystein ergänzt werden. Ferner kann das Peptid beispielsweise an ein anderes Peptid oder Molekül wie Biotin gekoppelt sein (funktionalisiertes Peptid). Beispielsweise steht P3 für die Peptidsequenz ohne Cystein, P3C oder 1-C für die Peptidsequenz mit C-terminalem Cystein, P3-Bt für die Peptidsequenz mit C-terminalem Biotin. Ferner kann das Peptid auch als Untereinheit (Modul) in einem Polypeptid auftreten.
Tabelle 2: Ladung der Peptidbereiche. Bezogen auf Tabelle 2 markieren unterstrichene Aminosäuren Teile des Peptids (Tripeptide) mit einer positiven Ladung, fett gedruckte Aminosäuren Bereiche des Peptids, die ungeladen sind, und grau hervorgehobene Aminosäuren Teile des Peptids (Tripeptide) mit einer negativen Ladung.
Beispiel 2: Überprüfung der Adhäsion der synthetisierten Peptide hinsichtlich Ihrer Substratspezifität auf Polyethylen (PE), Polypropylen (PP) und Polystyrol (PS)
Hier wurde die Adhäsion von nicht-funktionalisierten Peptiden (Nr. 1-4, 10, 11) und Peptiden, die am C- Terminus die Aminosäure Cystein aufweisen, (Nr. 5-C bis 9-C, 13-C bis 17-C, 19-C, 27-C) an LSEP- Oberflächen wie Polyethylen, Polypropylen und Polystyrol untersucht; AI-S1 (VPSSGPQDTRTT) (SEQ ID NO: 55) und MS-S1 (ATIHDAFYSAPE) (SEQ ID NO: 56) sind Aluminium- bzw. Stahl-bindende Peptide, die als Negativ-Kontrolle dienten. Diese Peptide sind aus Zuo R., Örnek, D., Wood, T.K. (2005) Aluminum- and mild steel-binding peptides from phage display, Appl. Microbiol. Biotechnol., 68: 505- 509 bekannt.
Für die Untersuchung wurden die Peptide in 1x PBS Puffer pH 7,3 (ohne NaCI und KCl) auf eine Konzentration von 2 mg/mL gelöst. Es wurden 2x je 10 pL auf eine LSEP Platte aufgetropft (40 pg). Die „Peptidspots“ wurden bei 30°C für 30 min getrocknet, danach für 1 Std. in 1 L 1x PBS-Puffer unter leichtem Schütteln gewaschen und für 30 s in Coomassie-Färbelösung gefärbt. Das Entfärben erfolgte mit 1x PBS-Puffer pH 7,3 (ohne NaCI und KCl). Je nach Intensität der gebundenen Farbe auf den Peptidspots wurde eine optische halbquantitative Auswertung vorgenommen.
Halbquantitative Bewertung der Adhäsion:
0 - keine Adhäsion
0,5 - geringe Adhäsion
1 - mittlere Adhäsion
2 - gute Adhäsion
3 - sehr gute Adhäsion
Tabelle 3: Adhäsionsuntersuchung von Peptiden auf verschiedenen LSEP-Platten.
Eine gute bis sehr gute Adhäsion wurde an Polyethylen für die Peptide 5-C, 8-C, 9-C, 13-C, 14-C, 15- C, 16-C, 17-C und 19C festgestellt. An Polypropylen binden die Peptide 5-C, 7-C, 8-C, 9-C, 13-C, 14- C, 16-C, 17-C und 19-C gut bis sehr gut und an Polystyrol binden die Peptide 5-C, 7-C, 8-C, 9-C, 13-C, 14-C, 15-C, 16-C, 17-C, 19-C und 27-C gut bis sehr gut.
Beispiel 3: Überprüfung der Adhäsion der synthetisierten Peptide hinsichtlich Ihrer Substratspezifität auf Polypropylen (PP)
Direkte Messmethode der Adhäsionsmessung mit BCA:
Es wurden 50 pL 0,1 mg/mL Peptid-Lösung in eine 96-Well-Platte aus Polypropylen gegeben. Die „Peptidspots“ wurden bei 30°C für 16 h im Inkubator getrocknet. Danach wurden je 0,2 mL Aqua dest. zugegeben und es wurde für 10, 30, 60 und 90 min bei RT, schüttelnd bei 300 rpm, inkubiert. 100 pL des Überstands wurden transferiert und mit 50 pL BCA-Reagenz versetzt und für 30 min bei 60°C inkubiert. Die Absorption wurde bei 562 nm gemessen. Ein Adhäsionspunkt nach unendlicher Adhäsionszeit lässt sich aus den gemessenen Adhäsionswerten herauslesen.
Bewertung der Adhäsion in %:
< 20 keine Adhäsion
21 bis 40 geringe Adhäsion 41 bis 60 mittlere Adhäsion
61 bis 80 gute Adhäsion
> 80 sehr gute Adhäsion
Tabelle 4: Adhäsionsuntersuchung von Peptiden, welche C-terminal ein Cystein aufweisen, auf Polypropylen.
Die Peptide 9-C, 18-C, 24-C und 25-C zeigten eine gute bis sehr gute Adhäsion auf Polypropylen.
Mittlere Adhäsionen wurden für 13-C, 14-C, 17-C, 19-C, 20-C und 21 -C bestimmt.

Claims

Patentansprüche
1. Peptid, umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt 10 bis 24 Aminosäuren, wobei
(a) die Aminosäuresequenz in N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Sequenz aufweist (C)mXlX2X3(X4)nX5(C)o, wobei
Xi eine positiv geladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder K, noch bevorzugter R,
X2 und X3 ungeladene Aminosäuren sind, vorzugsweise ausgewählt aus A, L, M und Q, noch bevorzugter aus A und L, jedes X4 unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G;
X5 eine beliebige positiv geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder eine ungeladene Aminosäure, noch bevorzugter Q, A oder L, insbesondere A oder L, m und 0 0 oder 1 sind, wobei m+o = 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 46, bevorzugt von 6 bis 20 ist; oder b) die Aminosäuresequenz mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 86 %, mindestens 87 %, mindestens 88 %, mindestens 89 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, mindestens 99,5 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer der in SEQ ID NOs: 16-17 oder 18-22 genannten Aminosäuresequenzen aufweist.
2. Das Peptid gemäß Anspruch 1 a), wobei
(i) das Peptid eine Gesamtladung von 0 bis +4 aufweist, vorzugsweise 0 bis +2; und/oder
(ii) der N-Terminus umfassend die ersten 3-4 Aminosäuren eine positive Nettoladung aufweist; und/oder
(iii) der C-Terminus umfassend die letzten 3-6 Aminosäuren eine negative oder neutrale Nettoladung aufweist und vorzugsweise mindestens eine negative geladene Aminosäure, insbesondere E, umfasst; und/oder
(iv) das Peptid kein P und vorzugsweise auch kein G und noch bevorzugter auch kein Y enthält.
3. Das Peptid gemäß Anspruch 1 a) oder 2, wobei die Sequenz X1X2X3 RAL oder RLA, vorzugsweise RAL, ist.
4. Das Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 a) bis 3, wobei
(iii) (X4)nXs mindestens eine Sequenz XeXyXs umfasst, wobei Xe eine geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R, K, E oder Q, und X7 und Xe unabhängig voneinander ungeladene Aminosäure mit Ausnahme von P und G sind, vorzugsweise A, L, oder M, noch bevorzugter A oder L;
36 (iv) (X4)n mindestens eine aromatische Aminosäure, vorzugsweise W oder F umfasst. Das Peptid gemäß Anspruch 4, wobei
(i) (X4)n mindestens eine Sequenz XeXyXs umfasst, wobei XeXyXs RAL oder RLA, vorzugsweise RAL, ist, und wobei diese Sequenz vorzugsweise in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 4-7 lokalisiert ist; und/oder
(ii) (X4)nXs mindestens eine Sequenz XeXyXs umfasst, wobei XeXyXs EAL oder ELA, vorzugsweise EAL, ist, und wobei diese Sequenz vorzugsweise nicht in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 1-6 lokalisiert ist; und/oder
(iii) (X4)nXs mindestens eine Sequenz XeXyXs umfasst, wobei XeXyXs QAL oder QLA, vorzugsweise QAL, ist. Das Peptid gemäß Anspruch 5, wobei das Peptid die Sequenz X1X2X3 RAL umfasst und (X4)nXs mindestens eine von QAL und EAL umfasst, vorzugsweise beide. Das Peptid gemäß Anspruch 6, wobei das Peptid zusätzlich mindestens eine weitere Sequenz RAL umfasst. Das Peptid gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei das Peptid zwei Sequenzen RAL und jeweils mindestens eine Sequenz EAL und QAL enthält. Das Peptid gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Peptid mindestens ein W oder F, vorzugsweise genau ein W oder F enthält. Das Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 a) bis 9, wobei das Peptid zu mindestens 60%, bevorzugt zu mindestens 65%, stärker bevorzugt zu mindestens 70%, insbesondere zu mindestens 75% aus Aminosäuren mit einem hohem alpha-Helix-bildenden Potential besteht, wobei diese Aminosäuren bevorzugt ausgewählt werden aus E, A, L, M, Q, K, R, F, I, H, W und D, stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R, F, I und H; noch stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R und F. Das Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 a) bis 10, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NOs: 1-15 aufweist, sowie Varianten davon, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, Sequenzidentität zu der angegebenen Sequenz haben, wobei bevorzugt das Motiv RAL, und vorzugsweise auch das Motiv EAL und/oder QAL, sofern vorhanden, invariabel sind. Das Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei das Peptid ein Peptid zur Adhäsion an eine Kunststoffoberfläche, bevorzugt an eine LSEP-Oberfläche, insbesondere an eine Oberfläche aus Polyethylen (PE), Polypropylen (PP) oder Polystyrol (PS) oder Copolymeren oder Mischungen davon, ist.
37 Peptid oder Polypeptid (Multimer) umfassend zwei oder mehr der Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12. Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 oder für ein Peptid oder Polypeptid gemäß Anspruch 13, bevorzugt für ein Peptid umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID NOs: 1-15, 16-17 oder 18-22. Mittel, umfassend mindestens ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 oder ein Peptid oder Polypeptid gemäß Anspruch 13. Verwendung eines Peptids zur Adhäsion an Kunststoffoberflächen, bevorzugt LSEP- Oberflächen, wobei das Peptid mindestens eine Aminosäuresequenz gemäß einer Sequenz von SEQ ID NOs: 1-27, bevorzugt von SEQ ID NOs: 1-15, 16-17 oder 18-22, stärker bevorzugt 1-15 oder 16-17, insbesondere 1-15, aufweist, oder eine Variante davon, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, Sequenzidentität zu einer der angegebenen Sequenzen hat, wobei das Peptid in bevorzugten Ausführungsformen ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 oder ein Peptid oder Polypeptid gemäß Anspruch 13 ist.
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