EP4373908A1 - Echafaudage microstructure pour la preparation d'un implant tissulaire - Google Patents

Echafaudage microstructure pour la preparation d'un implant tissulaire

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Publication number
EP4373908A1
EP4373908A1 EP22754072.1A EP22754072A EP4373908A1 EP 4373908 A1 EP4373908 A1 EP 4373908A1 EP 22754072 A EP22754072 A EP 22754072A EP 4373908 A1 EP4373908 A1 EP 4373908A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
membrane
microstructured
cells
micropores
scaffold
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22754072.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christelle Monville
Elise HERARDOT
Karim BEN M'BAREK
Frédéric Hamouda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Centre d'Etude des Cellules Souches CECS
UNIVERSITE EVRY VAL D'ESSONNE
Universite Paris Saclay
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Centre d'Etude des Cellules Souches CECS
UNIVERSITE EVRY VAL D'ESSONNE
Universite Paris Saclay
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Centre d'Etude des Cellules Souches CECS, UNIVERSITE EVRY VAL D'ESSONNE, Universite Paris Saclay filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4373908A1 publication Critical patent/EP4373908A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3813—Epithelial cells, e.g. keratinocytes, urothelial cells

Definitions

  • the present invention relates to the preparation of a microstructured scaffold corresponding to a biocompatible membrane-like support material for cell culture.
  • the present invention also relates to a composition comprising the microstructured scaffold and cells, in particular photoreceptors, with or without cells of the retinal pigment epithelium.
  • the present invention applies in particular to the preparation of an implantable graft for the treatment of diseases of the retinal pigment epithelium and of the neural retina.
  • the retina is the sensory layer which lines the posterior surface of the eye, receives the image formed by the lens, and translates this image into neuronal impulses which are transmitted to the brain by the optic nerve.
  • the retina is a neuronal tissue that interacts critically with the retinal pigment epithelium which is necessary for its survival and proper functioning.
  • the macula which is the central part of the retina, is enriched with photoreceptors capable of perceiving different colors and fine visual details. The macula is crucial in particular for facial recognition and reading.
  • retinal pigment epithelium or the neural retina can affect the retinal pigment epithelium or the neural retina and lead to impaired vision that can lead to blindness.
  • diseases can affect the retinal pigment epithelium or the neural retina and lead to impaired vision that can lead to blindness.
  • diseases mention may be made in particular of hereditary or age-related macular degeneration, macular dystrophy and retinitis pigmentosa.
  • the retinal epithelium or the neural retina can also present lesions of traumatic or infectious origin. Recent research appears to demonstrate that damage to the retina can be delayed, arrested, or even repaired by transplantation of retinal pigment epithelium cells or retinal cells into the subretinal space, which may prevent the reduction in capacity vision caused by these diseases or improve them in the case of neural retina cell transplants.
  • Photoreceptors are a highly polarized and specialized cell type with apical outer segments containing photosensitive photopigments and basal axon terminals.
  • Transplantation of polarized photoreceptors with or without retinal pigment epithelial cells presents significant challenges due to the need to provide a multi-layered graft with an organized structure.
  • Three-dimensional support microfabrication technology offers potential solutions to these problems.
  • document WO2017164992 describes a microstructured scaffold system that includes a support member comprising micropores allowing photoreceptors to grow in a vertical direction.
  • micropores of the microstructured scaffold consist of a spherical or conical part called “curvilinear cell receptor” connected to at least one cylindrical part called “cell guide channel”.
  • the density of the micropores of the support element is a very important parameter, since it conditions the number of possible connections between the photoreceptors and the cells of the retinal epithelium. In the case of document WO2017164992, the distance between 2 adjacent micropores is 0.1-5 ⁇ m (edge to edge) or 16 ⁇ m center to center. This scaffolding is favorable to the realization of many intercellular connections. But the depth of the pores is not favorable to an optimal maturation of the photoreceptors.
  • a depth of the order of 100 ⁇ m (corresponding to the size of a mature human photoreceptor) is desired for this type of cell.
  • the production of microstructured membranes with a thickness close to 100 ⁇ m and a periodicity of the pores close to that presented in the document WO2017164992 would not currently be compatible with the manufacturing methods.
  • There is a risk of tearing off the patterns (of this invention) of the master mold during the demolding of the membrane because the period is less than the height of the patterns (50 ⁇ m versus 100-120 ⁇ m).
  • the production of this type of scaffolding can be problematic due to significant physical manufacturing constraints, in particular the risk of tearing the microstructured membrane during its demoulding.
  • microstructured scaffolds for the culture of cells, in particular of photoreceptors comprising micropores of cylindrical shape.
  • part of the cells fall to the bottom of the micropores, which is problematic.
  • the photoreceptors are polarized and oriented cells with outer segments (elongation of the photoreceptors) which form contacts, at the basal level, with cells of the retinal pigment epithelium and at the apical level, with synapses in an inner tissue. alive. Without suitable culture media and appropriate signaling indices, the correct orientation of the photoreceptors in an in vitro reconstructed tissue could be difficult to obtain.
  • proper maturation is guided through a specially designed microstructured polymeric scaffold with micropores into which immature photoreceptors can be seeded while their orientation is dictated by the microstructure of such a scaffold.
  • the microstructured scaffold guides photoreceptor maturation by imposing lateral physical constraints within micropores above a retinal pigment epithelium that provides cues to guide photoreceptor maturation with the expected orientation.
  • One of the objectives of the invention is therefore to provide a scaffold of the microstructured membrane type for cell culture, in particular of photoreceptors, the density of the micropores of which has been optimized to both limit the problems of manufacturing the scaffolding and to propose a cellular organization as close as possible to retinal tissue in vivo.
  • the invention therefore relates to a scaffolding which comprises or consists of a microstructured membrane provided with a plurality of through micropores of conical shape.
  • Another aspect of the invention relates to the microstructured scaffold for its use as a cell culture support, in particular for a photoreceptor.
  • the invention in a second aspect, relates to a composition comprising the microstructured scaffold and cells, in particular photoreceptors.
  • Another aspect of the invention relates to a process for preparing a composition comprising the microstructured scaffold and cells, in particular photoreceptors.
  • the invention relates to an implantable graft comprising the microstructured scaffold, cells, in particular photoreceptors and cells of the retinal pigment epithelium cultured on a support.
  • Another aspect of the invention relates to a method for preparing an implantable graft comprising the microstructured scaffold, cells in particular photoreceptors and cells of the retinal pigment epithelium cultured on a support.
  • Another aspect of the invention relates to a process for preparing a microstructured scaffold, in particular by photolithography.
  • the term “scaffold” is used here to designate a biocompatible support of the microstructured membrane type useful for the culture of cells, in particular of photoreceptors.
  • the scaffold according to the present invention is a microstructured membrane which comprises conical-shaped through micropores.
  • the conical-shaped micropores are either conical over the entire height of the membrane, or partially conical over a first part of the micropore (height hl) located in the apical part of the membrane; a second part of the micropore (height h2) located in the basal part of the membrane is formed by at least two channels, preferably three or four channels, of conical or substantially conical shape. Said channels are preferably not cylindrical or substantially cylindrical in shape.
  • the scaffold comprises or consists of a microstructured membrane which has through micropores of conical shape.
  • the diameter and the distribution of the micropores are different depending on the orientation of the membrane.
  • the apical surface of the membrane (1) corresponds to the surface facing upwards.
  • the basal surface of the membrane (2) corresponds to the surface of the membrane facing downwards, that is to say the surface of the membrane which in certain embodiments of the invention is in contact with a layer of cells of the retinal pigment epithelium and comprising micropores of a diameter smaller than those found on the apical surface of the membrane.
  • the apical surface of the membrane (1) has micropores with a diameter (dl) greater than at least three times, preferably at least four times the diameter (d2) of the micropores of the basal surface of the membrane (2 ).
  • the scaffold comprises or consists of a microstructured membrane comprising conical-shaped micropores passing through said membrane at the level of a first surface (1) and at the level of a second surface (2 ) characterized in that,
  • the apical surface of the membrane (1) has micropores with a diameter (dl) greater than at least three times, preferably at least four times the diameter (d2) of the micropores of the basal surface of the membrane (2 ).
  • the conical-shaped micropore has a first part (apical) of height (hl) and a second part (basal) of height (h2) which has several channels forming several micropores on the surface base of the membrane (2).
  • the height (hl) of the micropore exhibits a value corresponding to approximately one quarter to one half of the total height of the micropore.
  • the height (hl) of the micropore has a value corresponding to approximately one third of the total height of the micropore.
  • the height (hl) of the micropore has a value comprised from 20 ⁇ m to 60 ⁇ m, preferably comprised from 30 ⁇ m to 50 ⁇ m, preferably from 30 ⁇ m to 40 ⁇ m, i.e. from 30, 31, 32, 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39 or 40 pm.
  • the height (h2) of the micropore has a value comprised from 40 ⁇ m to 80 ⁇ m, preferably comprised from 50 ⁇ m to 70 ⁇ m, preferably from 55 ⁇ m to 65 ⁇ m, i.e. from 55, 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62, 63, 64 or 65 ⁇ m.
  • the micropore when the conical-shaped micropore has two channels, the micropore is said to be bipod; when the conical-shaped micropore has three channels, the micropore is said to be tripod and when the conical-shaped micropore has four channels, the micropore is said to be quadripod.
  • the conical-shaped micropores are of the bipod, tripod or quadripod type.
  • the conical-shaped micropore has a diameter (dl) at the apical surface of the membrane (1) comprised from 15 ⁇ m to 25 ⁇ m, preferably comprised from 18 ⁇ m to 22 ⁇ m.
  • the diameter (dl) of the micropore at the apical surface of the membrane (1) has a value of 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 ⁇ m.
  • the conical-shaped micropore has a diameter (d2) at the basal surface of the membrane (2), comprised from 4 ⁇ m to 8 ⁇ m, preferably comprised from 5 ⁇ m to 6 ⁇ m.
  • the diameter (d2) of the micropore at the basal surface of the membrane (2) has a value of 4, 5, 6, 7 or 8 ⁇ m.
  • the microstructured membrane has a plurality of conical-shaped micropores of the bipod, tripod, or quadripod type, the micropores being characterized by -a diameter (dl) at the apical surface of the membrane (1), comprised from 15 ⁇ m to 25 ⁇ m, preferably comprised from 18 ⁇ m to 22 ⁇ m,
  • d2 -a diameter (d2) at the basal surface of the membrane (2), comprised from 4 ⁇ m to 8 ⁇ m, preferably comprised from 5 ⁇ m to 6 ⁇ m,
  • h2 comprised from 40 ⁇ m to 80 ⁇ m, it being understood that the total height (h1+h2) of the microstructured membrane is comprised from 80 ⁇ m to 120 ⁇ m.
  • the diameter (dl′) of the micropore of conical shape of the bipod, tripod or quadripod type corresponds to the diameter of the micropore in the zone where the conical part of the micropore has several channels, preferably conical.
  • the diameter (dl′) of the micropore of conical shape of the bipod, tripod or quadripod type is comprised from 9 ⁇ m to 23 ⁇ m, preferably from 16 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the scaffold comprises or consists of a microstructured membrane comprising conical-shaped micropores passing through said membrane at a first surface (1) and at a second surface (2) characterized in that,
  • the apical surface of the membrane (1) has micropores with a diameter (dl) comprised from 15 ⁇ m to 25 ⁇ m, preferably comprised from 18 ⁇ m to 22 ⁇ m,
  • the basal surface of the membrane (2) has micropores with a diameter (d2) comprised from 4 ⁇ m to 8 ⁇ m, preferably comprised from 5 ⁇ m to 6 ⁇ m.
  • the thickness of the microstructured membrane is from 80 ⁇ m to 120 ⁇ m, preferably from 90 ⁇ m to 110 ⁇ m, even more preferably from 95 ⁇ m to 105 ⁇ m or even more preferably from around 100 p.m.
  • the micropores are spaced apart by a distance of 20 ⁇ m to 40 ⁇ m, preferably 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 3738, 39 or 40 ⁇ m from edge on board.
  • the number of micropores on the basal side of the microstructured membrane is increased by a factor of 2, 3 or 4 or more. This technical strategy improves the number of cellular interactions without it being necessary to increase the density of the micropores as is the case in the document WO2017164992.
  • the density of the micropores of the microstructured membrane of the present invention is such that the distance between two adjacent micropores on the apical face of the membrane is at least 20 ⁇ m, preferably 25 ⁇ m minimum, even more preferably 30 ⁇ m minimum and even more preferably 35 ⁇ m minimum.
  • the scaffold consists of a microstructured membrane comprising conical-shaped micropores passing through said membrane at the level of a first surface (1) and at the level of a second surface (2) characterized in that,
  • the apical surface of the membrane (1) has micropores with a diameter (dl) of between 18 ⁇ m and 22 ⁇ m, preferably 20 ⁇ m,
  • the basal surface of the membrane (2) has micropores with a diameter (d2) of 4 ⁇ m to 8 ⁇ m, preferably 5 ⁇ m,
  • the micropores are spaced apart by a distance of 20 ⁇ m to 40 ⁇ m, preferably 35 ⁇ m, from edge to edge,
  • the thickness of the microstructured membrane is between 80 ⁇ m and 120 ⁇ m, preferably 100 ⁇ m.
  • the scaffold according to the present invention comprises or consists of a microstructured membrane made of a biocompatible, flexible and/or extensible polymer, and in certain particularly suitable embodiments the polymer is biodegradable.
  • Suitable polymers include, but are not limited to, synthetic rubbers such as silicone rubbers (e.g., polydimethylsiloxane (PDMS)), polyurethane rubber, styrene butadiene rubber and acrylonitrile butadiene rubber, elastomeric natural rubbers (for example, thermoplastic polyurethane, thermoplastic copolyester, thermoplastic polyamide), epoxy (for eg, SU-8), polyimides, polyurethanes, polyamides, polyesters (eg, poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polycaprolactone (PCL) , poly(glycerol sebacate) (PGS)), polysaccharides (eg, chitosan), parylene, and combinations thereof.
  • synthetic rubbers such as silicone rubbers (e.g., polydimethylsiloxane (PDMS)), polyurethane rubber, styren
  • these polymers are “of plastic type” which facilitates handling of the scaffolding.
  • the polymer is PDMS or PLGA.
  • Another aspect of the invention relates to a composition
  • a composition comprising the microstructured scaffold and cells, in particular photoreceptors.
  • the seeded cells are in particular photoreceptors, photoreceptor precursors or retinal progenitors.
  • the scaffold is characterized in that the microstructured membrane is seeded with cells, in particular photoreceptors, photoreceptor precursors or retinal progenitors.
  • the present composition useful for cell therapy to treat damaged tissue comprises:
  • micropores of the microstructured membrane are configured to allow the adhesion of at least one photoreceptor (or photoreceptor precursor or retinal progenitor) to the interior wall of a micropore.
  • micropores of the microstructured membrane are configured to allow photoreceptor precursors or retinal progenitors to differentiate into photoreceptors and/or mature.
  • the microstructured scaffold may help promote maturation, survival, differentiation, cell attachment and/or cell integration in the retina of the host by adding different biological products or small molecules.
  • These biologics can be neurotrophins (eg CNTF, BDNF, NT-3, NT-4, NGF, GDNF, IGF1) or cytokines (eg IL-13, IL-11, IL-10, IL-6, IL-4, IL-1ra, TGF-beta) or small coat molecules or proteins (eg collagen, laminin, vitronectin, fibronectin).
  • These biological products can also be extracellular vesicles comprising exosomes, microvesicles, apoptotic bodies which can be derived from various cell types such as pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, differentiated or progenitor cells derived from embryos or fetus, differentiated adult cells (primary cells) or cell lines.
  • extracellular vesicles comprising exosomes, microvesicles, apoptotic bodies which can be derived from various cell types such as pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, differentiated or progenitor cells derived from embryos or fetus, differentiated adult cells (primary cells) or cell lines.
  • These cells can be seeded at a concentration ranging from 10,000 cells per cm 2 to 1,000,000 per cm 2 .
  • These cells can be differentiated from human pluripotent stem cells (human induced pluripotent stem cells or human embryonic stem cells).
  • the cell population seeded into the microstructured scaffold may be pure or may contain a mixed population of immature and/or mature retinal cells (eg, bipolar cells, ganglion cells, amacrine cells).
  • the number of cells, in particular of photoreceptors per micropore is comprised from 1 to 20, or more, preferably from 5 to 15, even more preferably from 7 to 12, or approximately 10 i.e. 7, 8, 9, 10, 11 or 12 cells per micropore of the microstructured membrane.
  • the micropores of the microstructured membrane are filled with a soft polymer (for example, acid hyaluronic) or a culture medium containing nutrients and growth factors.
  • a soft polymer for example, acid hyaluronic
  • a culture medium containing nutrients and growth factors.
  • an implantable graft which comprises or consists of an upper layer of photoreceptors or photoreceptor precursors or retinal progenitors seeded therein, a microstructured scaffold, a lower layer of cells of the retinal pigment epithelium cultured on a support of biological or polymeric nature.
  • Another aspect of the invention relates to a use of an implantable graft as a pharmaceutical composition, said graft comprising or consisting of an upper layer of photoreceptors or photoreceptor precursors or retinal progenitors seeded therein, a microstructured scaffold, of a lower layer of cells of the retinal pigment epithelium cultured on a support of biological or polymeric nature.
  • composition useful for cell therapy to treat damaged tissue comprising:
  • micropores are configured to allow the adhesion of at least one photoreceptor (or photoreceptor precursor or retinal progenitor) to the inner wall of a micropore
  • the at least one photoreceptor is capable of interacting physically or by remote communication via a secretion of biological factor with one or more type(s) of cells located in contact with the first surface (1) of the membrane and at the level of the second surface (2) of the membrane resting on the monolayer of cells of the retinal pigment epithelium.
  • Retinal pigment epithelium cells can be cultured first to form a functional epithelium on top of a thin scaffold that can be made of flexible, stretchable, and biodegradable polymers (PDMS, PLLA/PLGA, parylene, polyester, polyimide, polyether urethanes, membranes PET, PHA: PHB-HV, ePTFE, PCL, polybutylene, PEGDMA, PTMC) or can be a biological substrate (a collagen gel, gelatin gel, fibrin gel, human amniotic membrane, Bruch's membrane, silk fibroin, bacterial cellulose or a membrane made of a biocompatible synthetic material, biodegradable or not).
  • the microstructured scaffold is placed on its surface.
  • the cells arranged on the membrane are derived from pluripotent stem cells, from multipotent adult stem cells or else are derived from primary cultures or cell lines, or else correspond to a cell type of the implantation zone, or are simple epithelial cells or of different subtypes, such as photoreceptors, ganglion cells, bipolar cells, amacrine cells, cells of the retinal pigment epithelium, endothelial cells.
  • the human pluripotent stem cells used for the implementation of the invention do not require the destruction of a human embryo and do not have the capacity to induce the development process of a human being.
  • the cells of the culture are retinal pigment epithelial cells obtained from human pluripotent stem cells placed on a denuded amniotic membrane, then cultured for four weeks.
  • the invention can be applied to implants other than implants of retinal pigment epithelium cells.
  • the invention can be applied to the transplantation of retinal cells of various subtypes and used alone or in combination (for example for the retina: photoreceptors, ganglion cells, bipolar cells, amacrine cells , retinal pigment epithelial cells, endothelial cells).
  • These cells can be associated in monolayers or in pluristratified layers so as to reconstruct an artificial retina. They may also be in particular corneal cells or any other type of epithelial cells.
  • the invention can be applied to any type of epithelium or cell culture in monolayer on a biological or synthetic membrane.
  • the microstructured membrane or the implant according to the invention has a height of between 80 and 120 ⁇ m, a length and a width comprised from 2 mm to 10 mm, preferably a height of 120 ⁇ m, a length and a width of 5 mm.
  • the microstructured membrane has a number of pores/mm 2 comprised from 250 to 1000.
  • a microstructured membrane according to the invention has 400 pores/mm 2 ie 10 4 pores for 25 mm 2 with a periodicity of 50 ⁇ m or 625 pores/mm 2 for 25 mm 2 with a periodicity of 40 ⁇ m.
  • the microstructured membrane comprising tripods present on the basal face 3600 pores/mm 2 ie 9*10 4 for 25 mm 2 with a periodicity of 50 ⁇ m or 5625 pores/mm 2 ie 140625 for 25 mm 2 with a periodicity of 40 pm.
  • FIG. 1 represents a modified retinal tissue composed of 4 elements comprising
  • FIG. 2 describes the main steps (a-c) of the preparation of a microstructured membrane of the invention by 2-photon lithography.
  • the faces (1) and (2) of the scaffold correspond respectively to the apical and basal faces.
  • Figure 3 (Image obtained by scanning electron microscopy (SEM)) describes conical-shaped structures of a master mold obtained by 2-photon lithography and used to produce the conical scaffolds.
  • FIG. 4 describes a microstructured membrane (face 2) (4A) obtained after molding/unmolding of a polymer on a master mold of conical tripod shape (4B) obtained by 2-photon lithography.
  • Figure 5 shows a diagram of a conical micropore, a conical/tripod micropore and a hexagonal conical micropore.
  • FIG. 6 represents an image obtained by confocal fluorescence microscopy of several micropores of a microstructured membrane showing the vertical growth of photoreceptors expressing recoverin and resting on cells of the retinal pigment epithelium.
  • PR photoreceptors
  • RPE retinal pigment epithelium
  • the scaffold according to the present invention can be prepared by forming a master mold.
  • the microstructured membrane of the invention is made using moldable polymers (eg, PDMS), molded from the silicon master mold on which the micropillars are structured with resin, in which the PDMS or any other polymer (for the scaffolding) is poured afterwards.
  • an ultrathin polymeric film is prepared using any method known in the art.
  • the scaffolds of the present invention can be used for cell culture, transplantation, cell development modeling, and for drug screening.
  • stereolithography by two-photon absorption or 2-photons (English: two-photon stereolithography, TPS) is used.
  • a focused laser beam scans point by point a photopolymer in its volume to form the desired 3D object.
  • ultra-short pulses generally a few hundred femtoseconds
  • strong confinement of the light wave make it possible to trigger the biphoton absorption phenomenon which leads the photoinitiator into an excited state. From this excited state, reactive species can be created to initiate a conventional polymerization reaction.
  • a common method to create microstructured scaffolds is soft lithography using the negative tone photoresist, e.g. SU8, to distribute features onto silicon wafers to create masters (SU8-Si) for casting hard polymer replicas .
  • the negative tone photoresist e.g. SU8
  • masters SU8-Si
  • Figure 2 describes the main steps in the formation of the microstructured membrane of the invention.
  • Step a) concerns the preparation of a silicon substrate, the deposition of a resin by spin coating on said substrate, and the heat treatment of the resin-coated substrate.
  • Step b) relates to bi-photon (or 2-photon) laser lithography. The resin polymerizes in the areas exposed to radiation from the 2 focused lasers.
  • Step c) relates to the formation of patterns of conical shapes on the silicon substrate obtained after development of the resin. Unexposed areas are soluble in developer.
  • a drying of the master mold is carried out from a super critical drying based on CO2.
  • the master mold is obtained with patterns of conical shapes (and/or multipods) whose height is approximately 100 ⁇ m. A specific treatment to ensure the demoulding steps is then applied to the master mould.
  • the polymer is then deposited by centrifugal coating on the master mould.
  • a degassing step makes it possible to evacuate the air microbubbles.
  • a flexible film coated with a water-soluble sacrificial layer is then deposited on the polymer.
  • a force is applied to the film to reduce the residual thickness of the polymer.
  • Annealing is performed to harden the polymer.
  • the release is obtained by peeling off the flexible film with the PDMS membrane which has been molded by the patterns of the master mold.
  • the release of the membrane relative to the flexible film is obtained by dissolution of the sacrificial layer.
  • FIG. 3 describes an example of a silicon master mold with a resin microstructured into conical micropillars, obtained by 2-photon lithography. The 100pm high micropillars are spaced edge to edge by 35pm. The image was taken with a scanning electron microscope.
  • FIG. 4 corresponds to an example (A) of the basal face (2) of a conical/tripod scaffold produced in PDMS from a master mold (B) in silicon covered with a microstructured resin in micropillars with a height of lOOpm and spaced edge to edge of 35pm.
  • the master mold was obtained by the 2-photon lithography technique.
  • the method according to the invention is used for the production of a microstructured molded object particularly suitable for the culture of biological cells.
  • the method involves, first, a step in which a plastically deformable porous membrane is prepared having a plurality of micropores.
  • the micropores are preferably configured as micropores and are evenly distributed over the film.
  • the micropores are shaped to be continuous from one side of the film to the other, so that they are permeable.
  • Figure 5 describes the various examples of patterns of micropores used to produce the microstructured scaffolds.
  • the patterns can be simple conical, conical/tripod, or conical with hexagonal bases on each face.
  • the manufacturing process of a scaffold according to the present invention was initiated by the creation of a master mold from a 2-inch silicon wafer of orientation [100] and a thickness of 280 microns.
  • the wafer was previously cleaned with solvents before depositing a photosensitive resin of the SU8 type by centrifugal coating at 3000 rotations per minute (rpm).
  • a heat treatment at 180°C was carried out after this coating to allow the evaporation of the solvent contained in the resin.
  • the 2-photon 3D lithography was performed based on an STL file previously uploaded to the equipment. This file features all the tripod patterns on a 5mm x 5mm area with a periodicity of 50 ⁇ m. After writing the 25 mm 2 on the resin-coated substrate, the resin was developed in a base then rinsed in isopropanol. A CO-based “critical support” drying for 45 minutes made it possible to definitively fix the conical/tripod patterns in SU8 with a height of 120 microns on the silicon substrate, the assembly forming the master mold.
  • Annealing for 30 min at 80° C. made it possible to harden the polymer.
  • the detachment of the film with the membrane is done manually, the microstructured membrane with tripods 100 microns high has thus been separated from the master mold.
  • the separation between the membrane and the flexible film was obtained by dissolving the sacrificial layer.
  • the etching of the residual thickness of the microstructured membrane to obtain through holes on each face was carried out in an RIE type frame with a gaseous mixture of O and CF and a power of 25 W.
  • the etching time depends of the residual thickness, typically it is between 6 and 7 minutes.
  • the tissue composed of photoreceptors and cells of the retinal pigment epithelium was produced according to the following procedure:
  • human embryonic stem cells were differentiated for 3 weeks into retinal progenitor cells (characterized by the expression of the VSX2 and PAX6 genes). Then other human embryonic stem cells were differentiated into cells of the retinal pigment epithelium for 3 months. These were then frozen in vial banks in tanks of liquid nitrogen.
  • the retinal pigment epithelial cells were then thawed and recultured on a porous plastic support to reform an epithelium for 4 weeks.
  • the culture medium was replaced twice a week.
  • a scaffold with conical micropores (made according to example 1) was sterilized by baths of 70% ethanol then baths of saline solution. This was covered with a commercial matrix solution L7 (Lonza) diluted to 1/100 in a saline solution containing calcium and magnesium, then incubated for 1 hour at 37°C and 5% carbon dioxide.
  • L7 Longza
  • the matrix solution was removed after the incubation.
  • the scaffold was then placed over the retinal pigment epithelium.
  • the retinal progenitors derived from embryonic stem cells at 3 weeks of culture were then dissociated with a Tryple solution then counted and seeded in the scaffold at a density of 500,000 cells per cm 2 .
  • the culture medium was renewed 3 times a week for 3 months.
  • the tissue was fixed in a 4% paraformaldehyde solution for 15 minutes.
  • the fabric was then rinsed and permeabilized in a saline solution containing 0.1% tritonXIOO.
  • the tissue was incubated for 30 minutes in this same solution containing 5% animal serum then exposed overnight to a primary antibody directed against the recoverin protein (expressed by mature photoreceptors).
  • the next day the fabric was rinsed in a saline solution then exposed for 1 hour to a secondary antibody directed against the first antibody and coupled to a fluorescent molecule.
  • the tissue was then rinsed, stained with DAPI (to label cell nucleus DNA) and mounted on microscope slides. Tissue imaging was performed using a confocal fluorescence microscope.
  • Figure 6 shows on the image on the left, the reconstruction of a section made in the thickness of the tissue where the nuclei of the cells of the retinal pigment epithelium are visualized on the lower part with just above the extensions of the photoreceptors identified by recoverin staining.
  • the image on the right is a 3-dimensional reconstruction of the tissue where the recoverin signal is visualized in each of the micropores. The indicated scale is in pm.
  • the recoverin signal is a marker of photoreceptors and shows the vertical polarization of cells in the micropores above the cells of the retinal pigment epithelium.

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Abstract

La présente invention concerne la préparation d'un échafaudage microstructuré correspondant à un matériau de support de type membrane biocompatible pour la culture cellulaire. La présente invention concerne également une composition comprenant l'échafaudage microstructuré et des cellules en particulier des photorécepteurs. La présente invention s'applique notamment à la préparation d'un greffon implantable pour le traitement de maladies de l'épithélium pigmentaire rétinien et de la rétine neurale.

Description

ECHAFAUDAGE MICROSTRUCTURE POUR LA PREPARATION D'UN IMPLANT TISSULAIRE
La présente invention concerne la préparation d'un échafaudage microstructuré correspondant à un matériau de support de type membrane biocompatible pour la culture cellulaire. La présente invention concerne également une composition comprenant l'échafaudage microstructuré et des cellules en particulier des photorécepteurs, avec ou sans cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien. La présente invention s'applique notamment à la préparation d'un greffon implantable pour le traitement de maladies de l'épithélium pigmentaire rétinien et de la rétine neurale.
La rétine est la couche sensorielle qui tapisse la face postérieure de l'œil, reçoit l'image formée par la lentille, et traduit cette image en impulsions neuronales qui sont transmises au cerveau par le nerf optique. La rétine est un tissu neuronal qui interagit de façon critique avec l'épithélium pigmentaire rétinien qui lui est nécessaire à sa survie et son bon fonctionnement. La macula constituant la partie centrale de la rétine, est enrichie en photorécepteurs capables de percevoir les différentes couleurs et les détails visuels fins. La macula est cruciale notamment pour la reconnaissance faciale et la lecture.
De nombreuses maladies peuvent affecter l'épithélium pigmentaire rétinien ou la rétine neurale et entraîner une altération de la vision pouvant conduire à la cécité. Parmi ces maladies, on peut citer en particulier les dégénérescences maculaires héréditaires ou liées à l'âge, les dystrophies maculaires, et les rétinites pigmentaires. L'épithélium rétinien ou la rétine neurale peut également présenter des lésions d'origine traumatique ou infectieuse. Des recherches récentes semblent démontrer que les lésions de la rétine peuvent être retardées, arrêtées, voire être réparées par la transplantation de cellules d'épithélium pigmentaire rétinien ou de cellules rétiniennes dans l'espace sous-rétinien, ce qui peut prévenir la réduction des capacités visuelles provoquée par ces maladies ou les améliorer dans le cas de greffes de cellules de la rétine neurale.
On a proposé diverses formes de greffes ou de techniques de transplantation pour tenter de préserver la rétine. Plus récemment, des résultats prometteurs ont été obtenus en transplantant une culture de cellules d'épithélium pigmentaire rétinien obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, les cellules étant cultivées sur une membrane biocompatible. Dans le cas de maladie de la rétine à un stade avancé, la transplantation seule de cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien n'est pas suffisante. Les photorécepteurs doivent également être remplacés. Les photorécepteurs sont un type cellulaire hautement polarisé et spécialisé avec des segments externes apicaux contenant des photopigments photosensibles et des terminaisons axonales basales.
La transplantation de photorécepteurs polarisés avec ou sans cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien présente d'importants défis en raison de la nécessité de fournir un greffon multicouche possédant une structure organisée.
La technologie de microfabrication de support tridimensionnel offre des solutions potentielles à ces problèmes.
C'est ainsi que la fabrication de système d'échafaudage pour la culture cellulaire de photorécepteurs a déjà été proposée.
Par exemple, le document WO2017164992 décrit un système d'échafaudage microstructuré qui comprend un élément de support comprenant des micropores permettant aux photorécepteurs de croître dans une direction verticale.
Les micropores de l'échafaudage microstructuré sont constitués d'une partie sphérique ou conique appelée « récepteur de cellule curviligne » connectée à au moins une partie cylindrique appelée « canal de guidage de cellule ». La densité des micropores de l'élément de support est un paramètre très important, car il conditionne le nombre de connexions possibles entre les photorécepteurs et les cellules de l'épithélium rétinien. Dans le cas du document WO2017164992, la distance entre 2 micropores adjacents est de 0,1-5 pm (bord à bord) ou de 16 pm de centre à centre. Cet échafaudage est favorable à la réalisation de nombreuses connexions intercellulaires. Mais la profondeur des pores n'est pas favorable à une maturation optimale des photorécepteurs. Une profondeur de l'ordre de 100 pm (correspondant à la taille d'un photorécepteur mature humain) est souhaitée pour ce type de cellule. Cependant la réalisation de membranes microstucturées avec une épaisseur voisine de 100 pm et une périodicité des pores voisine de celle présentée dans le document WO2017164992 ne serait pas compatible actuellement avec les procédés de fabrication. Il y a un risque d'arracher les motifs (de la présente invention) du moule maître lors du démoulage de la membrane du fait que la période est inférieure à la hauteur des motifs (50 pm versus 100-120 pm). Cependant la réalisation de ce type d'échafaudage peut être problématique en raison de contraintes physiques importantes de fabrication, notamment des risques de déchirure de la membrane microstructurée lors de son démoulage.
On peut également indiquer que l'état de la technique décrit de nombreux échafaudages microstructurés pour la culture de cellules, en particulier de photorécepteurs comprenant des micropores de forme cylindrique. Lorsqu'un échafaudage de ce type est ensemencé avec des photorécepteurs matures ou immatures, une partie des cellules tombe au fond des micropores, ce qui est problématique.
En effet, les photorécepteurs sont des cellules polarisées et orientées avec des segments externes (allongement des photorécepteurs) qui forment des contacts, au niveau basal, avec des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien et au niveau apical, avec des synapses dans un tissu in vivo. Sans support de culture adapté et d'indices de signalisation appropriés, l'orientation correcte des photorécepteurs dans un tissu reconstruit in vitro pourrait être difficile à obtenir. Pour surmonter cela, la bonne maturation est guidée à travers un échafaudage polymère microstructuré spécialement conçu avec des micropores dans lesquels des photorécepteurs immatures peuvent être ensemencés tandis que leur orientation est imposée par la microstructure d'un tel échafaudage. L'échafaudage microstructuré guide la maturation des photorécepteurs en imposant des contraintes physiques latérales à l'intérieur des micropores au-dessus d'un épithélium pigmentaire rétinien qui fournit des indices pour guider la maturation des photorécepteurs avec l'orientation attendue.
Il existe donc un besoin de préparer de nouveaux échafaudages pour la culture cellulaire, qui soient plus faciles à manipuler en raison des contraintes de fabrication et qui permettent une optimisation de la maturation et de l'organisation des photorécepteurs à l'intérieur des micropores.
Un des objectifs de l'invention est donc proposer un échafaudage de type membrane microstructurée pour la culture cellulaire, en particulier de photorécepteur, dont la densité des micropores a été optimisée pour à la fois limiter les problèmes de fabrication de l'échafaudage et de proposer une organisation cellulaire la plus proche possible d'un tissu rétinien in vivo.
Dans un premier aspect, l'invention concerne donc un échafaudage qui comprend ou est constitué d'une membrane microstructurée pourvue d'une pluralité de micropores traversants de forme conique.
Un autre aspect de l'invention concerne l'échafaudage microstructuré pour son utilisation comme support de culture cellulaire, en particulier de photorécepteur.
Dans un deuxième aspect, l'invention concerne une composition comprenant l'échafaudage microstructuré et des cellules, en particulier des photorécepteurs.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition comprenant l'échafaudage microstructuré et des cellules, en particulier des photorécepteurs.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne un greffon implantable comprenant l'échafaudage microstructuré, des cellules, en particulier des photorécepteurs et des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un greffon implantable comprenant l'échafaudage microstructuré, des cellules en particulier des photorécepteurs et des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un échafaudage microstructuré, en particulier par photolithographie.
Le terme « échafaudage » est utilisé ici pour désigner un support biocompatible de type membrane microstructurée utile pour la culture de cellules, en particulier de photorécepteurs.
L'échafaudage selon la présente invention est une membrane microstructurée qui comprend des micropores traversants de forme conique. Les micropores de forme conique sont soit coniques sur toute la hauteur de la membrane, soit partiellement coniques sur une première partie du micropore (hauteur hl) située dans la partie apicale de la membrane ; une seconde partie du micropore (hauteur h2) située dans la partie basale de la membrane est formée d'au moins deux canaux, de préférence trois ou quatre canaux, de forme conique ou sensiblement conique. Lesdits canaux, de préférences ne sont pas de forme cylindrique ou sensiblement cylindrique.
Structure de l'échafaudage de culture cellulaire
Au sens de la présente invention, l'échafaudage comprend ou consiste en une membrane microstructurée qui présente des micropores traversants de forme conique. Le diamètre et la distribution des micropores sont différents en fonction de l'orientation de la membrane. La surface apicale de la membrane (1) correspond à la surface orientée vers le haut. La surface basale de la membrane (2) correspond à la surface de la membrane orientée vers le bas, c'est-à-dire la surface de la membrane qui dans certains modes de réalisation de l'invention se trouve au contact d'une couche de cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien et comprenant des micropores d'un diamètre inférieur à ceux se trouvant sur la surface apicale de la membrane.
Dans un aspect particulier de l'invention,
-la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d'un diamètre (dl) supérieur à au moins trois fois, de préférence à au moins quatre fois le diamètre (d2) des micropores de la surface basale de la membrane (2).
Dans un aspect particulier de l'invention, l'échafaudage comprend ou est constitué d'une membrane microstructurée comprenant des micropores de forme conique traversants ladite membrane au niveau d'une première surface (1) et au niveau d'une seconde surface (2) caractérisée en ce que,
-la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d'un diamètre (dl) supérieur à au moins trois fois, de préférence à au moins quatre fois le diamètre (d2) des micropores de la surface basale de la membrane (2).
Dans un autre aspect particulier de l'invention, le micropore de forme conique, présente une première partie (apicale) de hauteur (hl) et une seconde partie (basale) de hauteur (h2) qui présente plusieurs canaux formant plusieurs micropores à la surface basale de la membrane (2). La hauteur (hl) du micropore présente une valeur correspondant à environ un quart à la moitié de la hauteur totale du micropore. De préférence, la hauteur (hl) du micropore présente une valeur correspondant à environ un tiers de la hauteur totale du micropore.
La hauteur (hl) du micropore présente une valeur comprise de 20 pm à 60 pm, de préférence comprise de 30 pm à 50 pm, de préférence de 30 pm à 40 pm, soit de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 pm. La hauteur (h2) du micropore présente une valeur comprise de 40 pm à 80 pm, de préférence comprise de 50 pm à 70 pm, de préférence de 55 pm à 65 pm, soit de 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 ou 65 pm.
Selon la présente invention, lorsque le micropore de forme conique présente deux canaux, le micropore est dit bipode ; lorsque le micropore de forme conique présente trois canaux, le micropore est dit tripode et lorsque le micropore de forme conique présente quatre canaux, le micropore est dit quadripode.
Dans un aspect particulier de l'invention, les micropores de forme conique sont de type bipode, tripode ou quadripode.
Selon la présente invention le micropore de forme conique présente un diamètre (dl) à la surface apicale de la membrane (1) compris de 15 pm à 25 pm, de préférence compris de 18 pm à 22 pm. Le diamètre (dl) du micropore à la surface apicale de la membrane (1) présente une valeur de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 pm.
Selon la présente invention le micropore de forme conique présente un diamètre (d2) à la surface basale de la membrane (2), compris de 4 pm à 8 pm, de préférence compris de 5 pm à 6 pm.
Le diamètre (d2) du micropore à la surface basale de la membrane (2) présente une valeur de 4, 5, 6, 7 ou 8 pm.
Selon la présente invention la membrane microstructurée présente une pluralité de micropores de forme conique de type bipode, tripode, ou quadripode, les micropores étant caractérisés par -un diamètre (dl) à la surface apicale de la membrane (1), compris de 15 pm à 25 pm, de préférence compris de 18 pm à 22 pm,
- un diamètre (dl') dont la valeur correspond au diamètre (dl) diminué de 2 à 6 pm, de préférence de 3 à 5 pm
-un diamètre (d2) à la surface basale de la membrane (2), compris de 4 pm à 8 pm, de préférence compris de 5 pm à 6 pm,
- une hauteur hl comprise de 20 pm à 60 pm,
- une hauteur h2 comprise de 40 pm à 80 pm, étant entendu que la hauteur totale (hl+h2) de la membrane microstructurée est comprise de 80 pm à 120 pm.
Selon la présente invention, le diamètre (dl') du micropore de forme conique de type bipode, tripode, ou quadripode, correspond au diamètre du micropore dans la zone où la partie conique du micropore présente plusieurs canaux, de préférence coniques.
Selon la présente invention, le diamètre (dl') du micropore de forme conique de type bipode, tripode, ou quadripode est compris de 9 pm à 23 pm, de préférence de 16 pm à 20 pm.
Dans un aspect particulier de l'invention l'échafaudage comprend ou est constitué d'une membrane microstructurée comprenant des micropores de forme conique traversants ladite membrane au niveau d'une première surface (1) et au niveau d'une seconde surface (2) caractérisée en ce que,
-la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d'un diamètre (dl) compris de 15 pm à 25 pm, de préférence compris de 18 pm à 22 pm,
-la surface basale de la membrane (2) présente des micropores d'un diamètre (d2) compris de 4 pm à 8 pm, de préférence compris de 5 pm à 6 pm.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'épaisseur de la membrane microstructurée est comprise de 80 pm à 120 pm, de préférence de 90 pm à 110 pm, encore plus de préférence de 95 pm à 105 pm ou encore plus de préférence d'environ 100 pm.
Dans un aspect particulier de l'invention, les micropores sont espacés d'une distance comprise de 20 pm à 40 pm, de préférence de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 3738, 39 ou 40 pm de bord à bord. Pour augmenter le nombre de contacts des photorécepteurs avec les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien, le nombre de micropores du côté basal de la membrane microstructurée est augmenté d'un facteur 2, 3 ou 4 ou plus. Cette stratégie technique améliore le nombre d'interactions cellulaires sans qu'il soit nécessaire d'augmenter la densité des micropores comme c'est le cas dans le document WO2017164992.
En raison des contraintes physiques de fabrication de la membrane microstructurée, la densité des micropores de la membrane microstructurée de la présente invention est telle que la distance entre deux micropores adjacents sur la face apicale de la membrane est de 20 pm au minimum, de préférence de 25 pm au minimum, encore plus de préférence de 30 pm au minimum et encore plus de préférence de 35 pm au minimum.
Dans un aspect particulier de l'invention l'échafaudage est constitué d'une membrane microstructurée comprenant des micropores de forme conique traversants ladite membrane au niveau d'une première surface (1) et au niveau d'une seconde surface (2) caractérisée en ce que,
-la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d'un diamètre (dl) compris de 18 pm à 22 pm, de préférence de 20 pm,
-la surface basale de la membrane (2) présente des micropores d'un diamètre (d2) compris de 4 pm à 8 pm, de préférence de 5 pm,
-les micropores sont espacés d'une distance comprise de 20 pm à 40 pm, de préférence de 35 pm, de bord à bord,
-l'épaisseur de la membrane microstructurée est comprise de 80 pm à 120 pm, de préférence de 100 pm.
L'échafaudage selon la présente invention comprend ou est constitué d'une membrane microstructurée constituée d'un polymère biocompatible, flexible et/ou extensible, et dans certains modes de réalisation particulièrement appropriés, le polymère est biodégradable.
Les polymères appropriés comprennent, sans s'y limiter, les caoutchoucs synthétiques tels que les caoutchoucs de silicone (par exemple, le polydiméthylsiloxane (PDMS)), le caoutchouc polyuréthane, le caoutchouc styrène butadiène et le caoutchouc acrylonitrile butadiène, les caoutchoucs naturels élastomères (par exemple, polyuréthane thermoplastique, copolyester thermoplastique, polyamide thermoplastique), époxy (par exemple, SU-8), polyimides, polyuréthanes, polyamides, polyesters (par exemple, poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA), acide polylactique (PLA), l'acide polyglycolique (PGA), la polycaprolactone (PCL), le poly(sébaçate de glycérol) (PGS)), les polysaccharides (par exemple, le chitosan), le parylène, et leurs combinaisons.
Avantageusement, ces polymères sont « de type plastique » ce qui facilite la manipulation de l'échafaudage.
Dans un aspect particulier, le polymère est le PDMS ou le PLGA.
Un autre aspect de l'invention concerne une composition comprenant l'échafaudage microstructuré et des cellules, en particulier des photorécepteurs.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les cellules ensemencées sont en particulier des photorécepteurs, des précurseurs de photorécepteurs ou des progéniteurs rétiniens.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échafaudage est caractérisé en ce que la membrane microstructurée est ensemencée avec des cellules en particulier des photorécepteurs, des précurseurs de photorécepteurs ou des progéniteurs rétiniens.
La présente composition utile pour une thérapie cellulaire pour traiter un tissu endommagé comprend :
-la membrane microstructurée telle que décrite précédemment, et
- au moins un photorécepteur, ou précurseur de photorécepteur ou progéniteur rétinien par micropore.
Les micropores de la membrane microstructurée sont configurés pour permettre l'adhérence d'au moins un photorécepteur (ou précurseur de photorécepteur ou progéniteur rétinien) à la paroi intérieure d'un micropore.
Les micropores de la membrane microstructurée sont configurés pour permettre aux précurseurs de photorécepteur ou aux progéniteurs rétiniens de se différencier en photorécepteur et/ou de maturer.
L'échafaudage microstructuré peut permettre de favoriser la maturation, la survie, la différenciation, l'attachement cellulaire et/ou l'intégration cellulaire dans la rétine de l'hôte par l'ajout de différents produits biologiques ou de petites molécules. Ces produits biologiques peuvent être des neurotrophines (par exemple CNTF, BDNF, NT-3, NT-4, NGF, GDNF, IGF1) ou des cytokines (par exemple IL-13, IL-11, IL-10, IL-6, IL-4, IL-lra, TGF-beta) ou de petites molécules ou protéines d'enrobage (par exemple le collagène, la laminine, la vitronectine, la fibronectine). Ces produits biologiques peuvent être également des vésicules extracellulaires comprenant des exosomes, des microvésicules, des corps apoptotiques qui peuvent être dérivés de divers types cellulaires tels que des cellules souches pluripotentes, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules différenciées ou progénitrices dérivées d'embryons ou de foetus, des cellules différenciées d'adultes (cellules primaires) ou des lignées cellulaires.
Ces produits biologiques sont progressivement libérés lors de la culture cellulaire et/ou après transplantation dans la rétine de l'hôte. Le contrôle de la libération progressive de produits biologiques peut être induit par la dégradation du polymère (si biodégradable) ou par concentration/densité de polymère ou dimension de la matrice polymère ou concentration initiale de produits biologiques. En effet, dans le cas particulier d'un polymère non dégradable, le réseau crée par ce polymère enferme ces produits biologiques et permet un relargage progressif de ceux-ci. Plus le réseau est dense, plus le relargage est lent. Des photorécepteurs ou des précurseurs de photorécepteurs ou des progéniteurs rétiniens (qui peuvent poursuivre la différenciation en photorécepteurs à l'intérieur de l'échafaudage microstructuré) peuvent être ensemencés dans l'échafaudage microstructuré après dissociation et comptage cellulaire. Ces cellules peuvent être ensemencées à une concentration allant de 10000 cellules par cm2 à 1000000 par cm2. Ces cellules peuvent être différenciées à partir de cellules souches pluripotentes humaines (cellules souches pluripotentes induites humaines ou cellules souches embryonnaires humaines). La population cellulaire ensemencée dans l'échafaudage microstructuré peut être pure ou peut contenir une population mixte de cellules rétiniennes immatures et/ou matures (par exemple des cellules bipolaires, cellules ganglionnaires, cellules amacrines).
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le nombre de cellules, en particulier de photorécepteurs par micropore est compris de 1 à 20, ou plus, de préférence de 5 à 15, encore plus de préférence de 7 à 12, ou environ 10 c'est-à-dire 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 cellules par micropores de la membrane microstructurée.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les micropores de la membrane microstructurée sont remplis d'un polymère mou (par exemple, l'acide hyaluronique) ou d'un milieu de culture contenant des nutriments et des facteurs de croissance.
Un autre aspect de l'invention, concerne un greffon implantable qui comprend ou est constitué d'une couche supérieure de photorécepteurs ou de précurseurs de photorécepteurs ou de progéniteurs rétiniens ensemencés à l'intérieur, d'un échafaudage microstructuré, d'une couche inférieure de cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support de nature biologique ou polymérique.
Un autre aspect de l'invention concerne une utilisation d'un greffon implantable en tant que composition pharmaceutique, ledit greffon comprend ou est constitué d'une couche supérieure de photorécepteurs ou de précurseurs de photorécepteurs ou de progéniteurs rétiniens ensemencés à l'intérieur, d'un échafaudage microstructuré, d'une couche inférieure de cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support de nature biologique ou polymérique.
Un autre aspect de l'invention, concerne une composition utile pour une thérapie cellulaire pour traiter un tissu endommagé comprenant :
-la membrane microstructurée telle que décrite,
-au moins un photorécepteur (ou précurseur de photorécepteur ou progéniteur rétinien), dans laquelle les micropores sont configurés pour permettre l'adhérence d'au moins un photorécepteur (ou précurseur de photorécepteur ou progéniteur rétinien) à la paroi intérieure d'un micropore, et
-une monocouche de cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien, dans laquelle le au moins un photorécepteur est capable d'interagir physiquement ou par communication à distance via une sécrétion de facteur biologique avec un ou plusieurs type(s) de cellules situées au contact de la première surface (1) de la membrane et au niveau de la seconde surface (2) de la membrane reposant sur la monocouche de cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien.
Les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien peuvent être cultivées d'abord afin de former un épithélium fonctionnel au-dessus d'un échafaudage mince qui peut être constitué de polymères flexibles et qui peuvent être extensibles, et biodégradables (PDMS, PLLA/PLGA, parylène, polyester, polyimide, Polyéther uréthanes, membranes PET, PHA : PHB-HV, ePTFE, PCL, polybutylène, PEGDMA, PTMC) ou peut être un substrat biologique (un gel de collagène, un gel de gélatine, un gel de fibrine, une membrane amniotique humaine, une membrane de Bruch, une fibroïne de soie, une cellulose bactérienne ou une membrane en un matériau synthétique biocompatible, biodégradable ou non). Lorsque l'épithélium pigmentaire rétinien est reconstruit in vitro, l'échafaudage microstructuré est placé à la surface de celui-ci.
Selon un mode de réalisation, les cellules disposées sur la membrane sont dérivées de cellules souches pluripotentes, de cellules souches adultes multipotentes ou bien sont issues de cultures primaires ou de lignées cellulaires, ou bien correspondent à un type cellulaire de la zone d'implantation, ou bien sont des cellules épithéliales simples ou de différents sous-types, tels que des photorécepteurs, des cellules ganglionnaires, des cellules bipolaires, des cellules amacrines, des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien, des cellules endothéliales. Les cellules souches pluripotentes humaines utilisées pour la mise en oeuvre de l'invention ne nécessitent pas la destruction d'embryon humain et n'ont pas la capacité à induire le processus de développement d'un être humain.
Selon un exemple de réalisation, les cellules de la culture sont des cellules d'épithélium pigmentaire rétinien obtenues à partir de cellules souches pluripotentes humaines disposées sur une membrane amniotique dénudée, puis cultivées durant quatre semaines.
L'invention peut s'appliquer à d'autres implants que des implants de cellules d'épithélium pigmentaire rétinien. En effet, l'invention peut s'appliquer à la transplantation de cellules de la rétine de sous-types variés et utilisés seuls ou en association (par exemple pour la rétine : des photorécepteurs, des cellules ganglionnaires, des cellules bipolaires, des cellules amacrines, des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien, des cellules endothéliales). Ces cellules peuvent être associées en monocouches ou en couches pluristratifiées de façon à reconstruire une rétine artificielle. Il peut s'agir également notamment de cellules de la cornée ou de tout autre type de cellules épithéliales. Plus généralement, l'invention peut s'appliquer à tout type d'épithélium ou de culture de cellules en monocouche sur une membrane biologique ou synthétique.
Selon un mode particulier de l'invention, la membrane microstructurée ou l'implant selon l'invention présente une hauteur comprise de 80 à 120 pm, une longueur et une largeur comprise de 2 mm à 10 mm, de préférence une hauteur de 120 pm, une longueur et une largeur de 5 mm.
Selon un mode particulier de l'invention, la membrane microstructurée présente un nombre de pores/mm2 compris de 250 à 1000. Par exemple, une membrane microstructurée selon l'invention présente 400 pores/mm2 soit 104 pores pour 25 mm2 avec une périodicité de 50 pm ou 625 pores /mm2 pour 25 mm2 avec une périodicité de 40 pm.
Selon un mode particulier de l'invention, la membrane microstructurée comprenant des tripodes présente sur la face basale 3600 pores/mm2 soit 9*104 pour 25 mm2 avec une périodicité de 50 pm ou 5625 pores/mm2 soit 140625 pour 25 mm2 avec une périodicité de 40 pm.
Des exemples de réalisation de l'invention seront décrits dans ce qui suit, à titre non limitatif en relation avec les figures jointes parmi lesquelles : La figure 1 représente un tissu rétinien modifié composé de 4 éléments comprenant
(a) une couche supérieure de photorécepteurs ensemencés à l'intérieur (b) d'une membrane polymère microstructurée et (c) d'une couche inférieure de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes cultivées sur (d) un support biologique ou composé de polymères. La figure 2 décrit les étapes principales (a-c) de la préparation d'une membrane microstructurée de l'invention par lithographie 2 photons. Les faces (1) et (2) de l'échafaudage correspondent respectivement aux faces apicales et basales.
La figure 3 (Image obtenue par microscopie électronique à balayage (MEB)) décrit des structures de forme conique d'un moule maître obtenu par lithographie à 2 photons et utilisé pour réaliser les échafaudages coniques.
La figure 4 décrit une membrane microstructurée (face 2) (4A) obtenue après moulage/démoulage d'un polymère sur un moule maître de forme conique tripode (4B) obtenu par lithographie à 2 photons.
La figure 5 représente un schéma d'un micropore conique, d'un micropore conique/tripode et d'un micropore conique hexagonal.
La figure 6 représente une image obtenue par microscopie à fluorescence confocale de plusieurs micropores d'une membrane microstructurée montrant la croissance verticale de photorécepteurs exprimant la recoverine et reposant sur des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien. (PR= photorécepteurs ; RPE : épithélium pigmentaire rétinien).
Méthodes de préparation de l'échafaudage primaire L'échafaudage selon la présente invention peut être préparé en formant un moule maître.
Par exemple, pour préparer un échafaudage primaire, un moule maître comprenant le négatif des micropores (= micropiliers) est préparé en utilisant une lithographie à 2 photons, une gravure au plasma ou toute autre technique connue de l'homme du métier. Plus typiquement, la membrane microstructurée est moulée sur le moule maître puis démoulée et enfin les pores sont ouverts à l'aide d'une gravure plasma isotrope. La membrane microstructurée de l'invention est fabriquée à l'aide de polymères moulables (par exemple, PDMS), moulés à partir du moule maître en Silicium sur lequel les micropiliers sont structurés avec de la résine, dans lequel le PDMS ou tout autre polymère (pour l'échafaudage) est coulé par la suite.
Bien qu'il soit décrit ici comme la préparation des échafaudages en utilisant la photolithographie, le moulage et la gravure au plasma, il doit être compris que tout moyen pour préparer des échafaudages polymères comme connu dans l'art peut être utilisé sans s'écarter de la présente invention.
D'autres méthodes appropriées incluent, par exemple, l'impression directe à l'aide d'une imprimante 3D ou le moulage à l'aide d'une machine de moulage par micro-injection. Pour préparer l'élément de support, un film polymère ultramince est préparé en utilisant n'importe quel procédé connu dans l'art.
Des exemples de polymères à utiliser comme élément de support comprennent ceux énumérés ci-dessus. Avantageusement, les échafaudages de la présente invention peuvent être utilisés pour la culture cellulaire, la transplantation, la modélisation du développement des cellules, et pour le criblage de médicaments.
Lithographie 3D
Dans le domaine de la lithographie par écriture laser, la stéréolithographie par absorption biphotonique ou à 2 photons (anglais : two-photon stereolithography, TPS) est utilisée. Un faisceau laser focalisé balaie point par point un photopolymère dans son volume pour former l'objet 3D désiré. Le recours à des impulsions ultracourtes (en général quelques centaines de femtoseconde) et un fort confinement de l'onde lumineuse permettent de déclencher le phénomène d'absorption biphotonique qui conduit le photoamorceur dans un état excité. A partir de cet état excité, des espèces réactives peuvent être créées pour amorcer une réaction de polymérisation classique.
Une méthode courante pour créer des échafaudages microstructurés est la lithographie douce utilisant la résine photosensible à tonalité négative, par exemple SU8, pour répartir les caractéristiques sur des plaquettes de silicium pour créer des maîtres (SU8- Si) pour le moulage de répliques en polymère dur.
La figure 2 décrit les étapes principales de la formation de la membrane microstructurée de l'invention.
L'étape a) concerne la préparation d'un substrat en silicium, le dépôt d'une résine par enduction centrifuge sur ledit substrat, et le traitement thermique du substrat enrésiné. L'étape b) concerne la lithographie laser bi-photon (ou à 2 photons). La résine polymérise dans les zones exposées aux rayonnements des 2 lasers focalisés.
L'étape c) concerne la formation des motifs de formes coniques sur le substrat de silicium obtenus après développement de la résine. Les zones non exposées sont solubles dans un développeur. Un séchage du moule maître est réalisé à partir d'un séchage super critique à base de CO2.
Le moule maître est obtenu avec des motifs de formes coniques (et/ou multipodes) dont la hauteur est d'environ 100 pm. Un traitement spécifique pour assurer les étapes de démoulage est ensuite appliqué sur le moule maître.
Le polymère est ensuite déposé par enduction centrifuge sur le moule maître. Une étape de dégazage permet d'évacuer les microbulles d'air. Un film souple enduit d'une couche sacrificielle soluble dans l'eau est ensuite déposée sur le polymère. Une force est appliquée sur le film pour réduire l'épaisseur résiduelle du polymère.
Un recuit est réalisé pour durcir le polymère. Le démoulage est obtenu en décollant le film souple avec la membrane en PDMS qui a été moulée par les motifs du moule maître.
La libération de la membrane par rapport au film souple est obtenue par dissolution de la couche sacrificielle.
Une gravure plasma est réalisée pour éliminer l'épaisseur résiduelle du polymère et obtenir des ouvertures traversantes dans la membrane. La figure 3 décrit un exemple de moule maître en silicium avec une résine microstructurée en micropiliers coniques, obtenu par lithographie 2 photons. Les micropiliers d'une hauteur de lOOpm sont espacés bord à bord de 35pm. L'image a été réalisée au microscope électronique à balayage.
La figure 4 correspond à un exemple (A) de face basale (2) d'un échafaudage conique/tripode réalisé en PDMS à partir d'un moule maître (B) en silicium recouvert d'une résine microstructurée en micropiliers d'une hauteur de lOOpm et espacés bord à bord de 35pm. Le moule maître a été obtenu par la technique de lithographie à 2 photons.
Le procédé selon l'invention est utilisé pour la réalisation d'un objet moulé microstructuré particulièrement adapté à la culture de cellules biologiques. Le procédé implique, tout d'abord, une étape dans laquelle une membrane poreuse déformable plastiquement est préparée, ayant une pluralité de micropores. Les micropores sont de préférence configurés comme des micropores et sont répartis régulièrement sur le film. Les micropores sont façonnés pour être continus d'un côté à l'autre du film, de sorte qu'ils soient perméables.
La Figure 5 décrit les différents exemples de motifs de micropores utilisés pour réaliser les échafaudages microstructurés. Dans ces exemples, les motifs peuvent être conique simple, conique/tripode ou conique avec des bases hexagonales sur chaque face.
EXEMPLES Exemple 1
Préparation d'un échafaudage
Le processus de fabrication d'un l'échafaudage selon la présente invention a été initié par la création d'un moule maître à partir d'un wafer silicium 2 pouces d'orientation [100] et d'une épaisseur de 280 microns. Le wafer a été préalablement nettoyé avec des solvants avant de déposer une résine photosensible du type SU8 par enduction centrifuge à 3000 rotations par minutes (rpm). Un traitement thermique à 180 °C a été réalisé après cette enduction pour permettre l'évaporation du solvant contenu dans la résine.
La lithographie 3D à 2 photons a été réalisée sur la base d'un fichier STL préalablement téléchargé dans l'équipement. Ce fichier comporte tous les motifs tripodes sur une surface de 5 mm x 5 mm avec une périodicité de 50 pm. Après l'écriture des 25 mm2 sur le substrat enrésiné, la résine a été développée dans une base puis rincée dans l'isopropanol. Un séchage « support critique » à base de CO pendant 45 minutes a permis de fixer définitivement les motifs conique/tripodes en SU8 d'une hauteur de 120 microns sur le substrat de silicium, l'ensemble formant le moule maître.
Un traitement anti adhésif à base trimethylchlorosilane pendant 5 minutes a été déposé en phase vapeur sur ce moule.
Le polymère, du PDMS à l'état liquide a été mélangé avec son catalyseur au platine dans un rapport de 13:1 puis dégazé et déposé sur le moule maître par enduction centrifuge à 900 rpm pendant 60 secondes. Un film souple de 20 pm en polycarbonate enduit d'une couche sacrificielle de 100 nm de PVA soluble dans l'eau a été déposé sur le PDMS. Une pression de 190 Pa a été exercée pour réduire l'épaisseur résiduelle du polymère. Un recuit de 30 min à 80°C a permis de durcir le polymère. Le décollement du film avec la membrane se fait manuellement, la membrane microstructurée avec des tripodes de 100 microns de haut a ainsi été séparée du moule maître.
La séparation entre la membrane et le film souple a été obtenue par dissolution de la couche sacrificielle. La gravure de l'épaisseur résiduelle de la membrane microstructurée pour obtenir des trous traversant sur chaque face a été réalisée dans un bâti de type RIE avec un mélange gazeux de O et de CF et une puissance de 25 W. Le temps de gravure est fonction de l'épaisseur résiduelle, typiquement il est compris entre 6 et 7 minutes.
Exemple 2
Mode opératoire pour obtenir le tissu composé de photorécepteurs et une couche de RPE selon la figure 6
Dans cet exemple, le tissu composé de photorécepteurs et de cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien a été réalisé selon le mode opératoire suivant :
Dans un premier temps, des cellules souches embryonnaires humaines ont été différenciées pendant 3 semaines en cellules progénitrices rétiniennes (caractérisées par l'expression des gènes VSX2 et PAX6). Puis d'autres cellules souches embryonnaires humaines ont été différenciées en cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien pendant 3 mois. Ces dernières ont ensuite été congelées en banque d'ampoules dans des cuves d'azote liquide.
Les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien ont ensuite été décongelées et remises en culture sur un support plastique poreux pour reformer un épithélium pendant 4 semaines. Le milieu de culture a été remplacé deux fois par semaine.
Un échafaudage avec des micropores coniques (réalisé selon l'exemple 1) a été stérilisé par des bains d'éthanol à 70% puis des bains de solution saline. Celui-ci a été recouvert d'une solution de matrice commerciale L7 (Lonza) diluée au l/100e dans une solution saline contenant du calcium et du magnésium, puis incubé lheure à 37°C et 5% de dioxyde de carbone.
La solution de matrice a été retirée à l'issue de l'incubation. L'échafaudage a ensuite été placé au-dessus de l'épithélium pigmentaire rétinien. Les progéniteurs rétiniens dérivés des cellules souches embryonnaires à 3 semaines de culture ont ensuite été dissociés avec une solution de Tryple puis comptés et ensemencés dans l'échafaudage à la densité de 500000 cellules par cm2. Le milieu de culture a été renouvelé 3 fois par semaine pendant 3 mois.
A l'issue des 3 mois de culture, le tissu a été fixé dans une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 15 minutes. Le tissu a été ensuite rincé et perméabilisé dans une solution saline contenant 0,1% de tritonXIOO. Le tissu a été incubé 30 minutes dans cette même solution contenant 5% de sérum animal puis exposé durant la nuit à un anticorps primaire dirigé contre la protéine recoverine (exprimée par les photorécepteurs matures). Le lendemain, le tissu a été rincé dans une solution saline puis exposé 1 heure à un anticorps secondaire dirigé contre le premier anticorps et couplé à une molécule fluorescente. Le tissu a été ensuite rincé, coloré avec du DAPI (pour marquer l'ADN du noyau des cellules) et monté sur des lames de microscopie. L'imagerie du tissu a été réalisée à l'aide d'un microscope à fluorescence confocal.
La figure 6 montre sur l'image de gauche, la reconstruction d'une section réalisée dans l'épaisseur du tissu où sont visualisés sur la partie inférieure les noyaux des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien avec juste au-dessus des prolongements des photorécepteurs identifiés par le marquage à la recoverine. L'image de droite est une reconstruction en 3 dimensions du tissu où le signal à la recoverine est visualisé dans chacun des micropores. L'échelle indiquée est en pm. Le signal à la recoverine est un marqueur des photorécepteurs et montre la polarisation verticale des cellules dans les micropores au- dessus des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien.

Claims

REVENDICATIONS
1. Echafaudage qui comprend ou est constitué d'une membrane microstructurée comprenant des micropores de forme conique traversants ladite membrane au niveau d'une première surface apicale (1) et au niveau d'une seconde surface basale (2) caractérisée en ce que, -la surface apicale (1) de la membrane présente des micropores d'un diamètre supérieur au moins trois fois, de préférence au moins quatre fois au diamètre des micropores de la surface basale (2) de la membrane, et
-les micropores de forme conique sont de type bipode, tripode ou quadripode.
2. Echafaudage selon la revendication 1, caractérisé en ce que,
-la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d'un diamètre (dl) compris de 15 pm à 25 pm, de préférence compris de 18 pm à 22 pm,
-la surface basale de la membrane (2) présente des micropores d'un diamètre (d2) compris de 4 pm à 8 pm, de préférence compris de 5 pm à 6 pm.
3. Echafaudage selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'épaisseur de la membrane microstructurée est comprise de 80 pm à 120 pm.
4. Echafaudage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les micropores sont espacés d'une distance comprise de 20 pm à 40 pm de bord à bord.
5. Echafaudage selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la membrane microstructurée est constituée d'un polymère biocompatible, et optionnellement biodégradable.
6. Echafaudage selon la revendication 5, caractérisé en ce que le polymère est le PDMS ou le PLGA.
7. Echafaudage selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la membrane microstructurée est ensemencée avec des cellules en particulier des photorécepteurs, des précurseurs de photorécepteurs ou des progéniteurs rétiniens et pourvu que les cellule souches pluripotentes humaines utilisées pour la mise en oeuvre desdites cellules de l'échafaudage ne nécessitent pas la destruction d'embryon humain et n'ont pas la capacité à induire le processus de développement d'un être humain.
8. Utilisation de l'échafaudage selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour réaliser un greffon implantable.
9. Utilisation de l'échafaudage selon la revendication 8, caractérisé en ce que le greffon implantable comprend ou est constitué d'une couche supérieure de photorécepteurs ou de précurseurs de photorécepteurs ou de progéniteurs rétiniens ensemencés à l'intérieur d'un échafaudage microstructuré selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, d'une couche inférieure de cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support de nature biologique ou polymérique.
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