EP4330909A1 - Méthode de caractérisation de l'organisation tridimensionnelle interne d'un échantillon biologique - Google Patents

Méthode de caractérisation de l'organisation tridimensionnelle interne d'un échantillon biologique

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EP4330909A1
EP4330909A1 EP22725731.8A EP22725731A EP4330909A1 EP 4330909 A1 EP4330909 A1 EP 4330909A1 EP 22725731 A EP22725731 A EP 22725731A EP 4330909 A1 EP4330909 A1 EP 4330909A1
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EP
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biological
images
type
elements
interest
Prior art date
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Pending
Application number
EP22725731.8A
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Christophe GROSSET
Baudouin Denis De Senneville
Etienne GONTIER
Fatma-Zohra KHOUBAI
Alexandre LABEDADE
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Bordeaux
Institut Polytechnique de Bordeaux
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Bordeaux
Institut Polytechnique de Bordeaux
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Filing date
Publication date
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    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Definitions

  • TITLE Method for characterizing the internal three-dimensional organization of a biological sample
  • the technical field of the invention is that of biological samples and more particularly that of the study of the internal three-dimensional organization of biological samples.
  • the present invention relates to a method for characterizing a biological sample and in particular a method for characterizing the internal three-dimensional organization of a biological sample.
  • the present invention also relates to a method for comparing the internal three-dimensional organization of a plurality of biological tissue samples, and to a device, a computer program product and a recording medium for implementing the methods .
  • a biological tissue whether healthy or pathological, of human origin or not, comprises numerous types of biological elements of microscopic or nanometric size.
  • biological elements we find in particular organizational and structural elements such as blood capillaries and bile canaliculi, cells of tissue origin (muscle cells, hepatocytes, cells of the immune system, endothelial cells, nerve cells, red blood cells, circulating or infiltrating white cells, including lymphocytes and macrophages, etc., of a very varied nature (normal cells, tumours, stromal cells, accessories, etc.), but also subcellular elements (or organelles) such as nuclei, nucleoli, mitochondria, cytoplasmic membranes, nuclear membranes, lipid vesicles, endoplasmic reticulum, exosomes etc.
  • subcellular elements or organelles
  • SBF-SEM technique consists in imaging the surface of a block of biological tissue sample by collecting the backscattered electrons. The principle is to carry out cycles of cuts and acquisition of images of the surface of a sample.
  • a first image of the sample surface is made by collecting the backscattered electrons, then the cutting system generates a first ultrathin section of the sample in order to expose a lower layer of the sample to the electron beam .
  • the "Acquisition-Slice" cycles will then be linked automatically, knowing that it is possible to acquire several hundred or even a few thousand successive images (comprising the X and Y axes) along the Z axis with a resolution of a few nm.
  • This technique also makes it possible to acquire images of the surface of the large sample (at the microscopic scale, a few tens to several hundreds of pm 2 ) with nanometric resolution (pixel size in XY from 1 to several tens of nm).
  • a first aspect of the invention relates to a method for characterizing the internal three-dimensional organization of a sample of biological tissue comprising a plurality of types of biological elements, comprising the following steps:
  • each image of a stack of images of at least one region containing at least one element biological having as type the type of biological elements of interest, the stack of images having been acquired by serial imaging in Z by ultramicrotomy automated in scanning electron microscopy and comprising a plurality of images each acquired according to a plane perpendicular to a depth axis and each associated with a position on the depth axis, the plurality of images being ordered by increasing position in the stack of images;
  • Characterization of at least one biological element whose type is the type of biological elements of interest by calculating at least one indicator relating to the structure, morphology, size, polarity, texture, to the constitution or orientation of the biological element from each corresponding segmented region.
  • the complete or almost complete internal three-dimensional organization of a sample can be characterized since a characterization of each biological element of the sample can be obtained.
  • the method according to the invention makes it possible to facilitate the study of all types of cancers or tumors solids from biopsies or tissue samples from patients, animals or various experimental models, for example spheroids, tumoroids, tumor organoids or tumor cell xenografts in mice, chicken embryos, Xenopus embryo, zebrafish or any other host animal model.
  • the method according to the first aspect of the invention may have one or more additional characteristics from among the following, considered individually or in all technically possible combinations.
  • the method according to the invention further comprises a step of three-dimensional reconstruction of at least one biological element having as type the type of biological elements of interest, from each corresponding segmented region .
  • the method according to the invention can then ultimately allow the creation of a three-dimensional imaging database accessible to researchers and clinicians, containing high-resolution three-dimensional images of biological tissues of various types and origins. , as well as the set of associated indicators, mathematical data and morphological, constitutional or organizational parameters.
  • the method according to the invention further comprises a step of modifying, aligning and optimizing the stack of images before the segmentation step. .
  • the modification step may consist of aligning the images along the depth axis to facilitate three-dimensional reconstruction and/or converting the images into a lighter format to consume fewer resources and facilitate segmentation, and /or adjusting the brightness and contrast of the images and/or removing noise in the images to facilitate subsequent segmentation.
  • the type of biological elements of interest is chosen from the following types: blood capillary, hemolysis zone, bile canaliculus, cell, cytoplasmic membrane, nucleus, nucleolus, nuclear membrane, mitochondria, endoplasmic reticulum, lipid vesicle, exosome, vessel lumen, vacuole, peroxisome, cell wall, leucoplast, chloroplast or any other biological element composing biological tissue or cells.
  • the segmentation step is carried out using an artificial neural network trained to be able to detect in an image, each region comprising at least one biological element having as type the type of biological elements of interest, the artificial neural network having been trained in a supervised manner on a training database comprising a plurality of images in which each region contains at least one biological element having as type the type of biological elements of interest has been identified.
  • the segmentation step is automatic, reliable and does not require any human intervention.
  • the precision/reliability rate obtained is for example greater than 90% for the segmentation of mitochondria and nuclei.
  • the segmentation step using the trained artificial neural network is followed by a visual check and a manual correction.
  • the segmentation step is semi-automatic and the corrected images can then be used to re-train the artificial neural network and thus improve its accuracy and reliability.
  • the training database is completed with the images of the stack of images in which each region containing at least one biological element having as type the type of biological elements of interest has been segmented by the artificial neural network and the artificial neural network is retrained on the completed training database.
  • the more the artificial neural network is re-trained the more its precision and reliability increase, which makes it possible to reduce the number of steps of visual checks and manual corrections, and to further reduce the time necessary for the automatic segmentation step, while maintaining a high rate of reliability.
  • the segmentation step is carried out manually or semi-manually on a set of images of the stack of images and automatically at using a propagation algorithm on each image of the stack of images located between two images of the set of images in the stack of images.
  • the segmentation step is semi-automatic and makes it possible to segment biological elements, for example cells, the contours of which are not always clear on all the images of the stack of images.
  • the indicator is chosen from the following indicators: volume, distance to another given biological element, surface in a given plane, main axis, alignment with an axis or a given plane, polarization towards a given point, length of the minor axes/major axes, texture indicator, perimeter of the outer envelope, fractal dimension of the surface, number of biological elements in contact, surface of contact with biological elements neighbours, density of biological elements in a nearby region.
  • the method according to the invention further comprises a step of comparison between the indicators calculated for a set of biological elements of the biological tissue sample.
  • a second aspect of the invention relates to a method for comparing the internal three-dimensional organization of a plurality of biological tissue samples comprising the steps of the method according to the first aspect of the invention for each tissue sample of a set of samples of biological tissue comprising a plurality of samples of biological tissue, and a step of comparing the indicators calculated for a set of biological elements of each sample of biological tissue of the set of samples of biological tissue.
  • the method according to the second aspect of the invention makes it possible to study the potential links between the internal three-dimensional organization of a tumor tissue, its cellular and subcellular content, and the response of patients to a treatment by comparing the parameters of the tissue before and after taking the treatment, regardless of the treatment considered (chemotherapy, immunotherapy, surgery, radiotherapy, cryotherapy, electroporation, electrofocusing, thermotherapy, light therapy, etc.).
  • a third aspect of the invention relates to a device comprising a processor configured to implement the steps of the method according to the first or the second aspect of the invention.
  • a fourth aspect of the invention relates to a computer program product comprising instructions which, when the program is executed on a computer, lead the latter to implement the steps of the method according to the first or the second aspect of the invention.
  • a fifth aspect of the invention relates to a computer-readable recording medium comprising instructions which, when executed by a computer, lead the latter to implement the steps of the method according to the first or the second aspect of the invention.
  • Figure 1 is a block diagram illustrating the sequence of steps of a method according to a first aspect of the invention.
  • FIG. 2 illustrates the result of the segmentation, characterization and comparison steps of the method according to the first aspect of the invention by choosing cells and blood capillaries as types of biological elements of interest, and the axis main as an indicator.
  • Figure 3a shows a stack of images acquired by serial Z imaging by automated scanning electron microscopy ultramicrotomy, ordered from left to right by increasing position along a Z depth axis, including a bile canaliculus.
  • Figure 3b shows the result of a reconstruction step of the method according to the first aspect of the invention for the bile canaliculus from the stack of images shown in Figure 3a.
  • Figure 4 illustrates an embodiment of a segmentation step of the method according to the first aspect of the invention using a propagation algorithm.
  • Figure 5 shows the result of the reconstruction step of the method according to the first aspect of the invention by choosing nuclei and blood capillaries as types of biological elements of interest.
  • Figure 6 is a block diagram illustrating the sequence of steps of a method according to a second aspect of the invention.
  • a first aspect of the invention relates to a method for characterizing the internal three-dimensional organization of a sample of biological tissue.
  • three-dimensional organization of a sample means the internal structure of the sample that can be detected using an electron microscope, that is to say in a range of values from approximately one to several hundred nanometers.
  • the biological tissue can be human, animal, plant or fungal.
  • the sample has for example been taken by biopsy or by surgical resection from a patient, from an animal or from any other relevant experimental model or from any biological, animal, plant or fungal source.
  • the sample has for example a volume of the order of 1 mm 3 .
  • a biological tissue comprises a plurality of biological elements of different types.
  • a type of biological elements is for example a cell, a red blood cell, a cytoplasmic membrane, a nucleus, a nucleolus, a nuclear membrane, a mitochondria, a blood capillary, a lipid vesicle, a bile canaliculus, an endoplasmic reticulum , a zone of hemolysis, the lumen of the vessels or else an exosome, a vacuole, a peroxisome, a cell wall, a leucoplast, a chloroplast.
  • the type of cell analyzed can be of various origin, such as plant, fungal, animal or human cardiac, muscular, endothelial, neuronal, immune, renal, pancreatic, pulmonary, hepatocyte, biliary, astrocyte, macrocyte, glial, intestinal, stomach.
  • Figure 1 is a block diagram illustrating the sequence of steps of the method 100 according to the first aspect of the invention.
  • the method 100 according to the invention is carried out on a stack of images of the sample of biological tissue obtained by SBF-SEM. Considering that the sample is placed in an orthogonal frame (X, Y, Z) where Z corresponds to the depth of the sample, each image of the stack of images is acquired according to a plane comprising the axes X and Y and perpendicular to the Z depth axis.
  • the planes of the acquired images are parallel to each other and not coincident, that is to say that the planes are spaced from each other along the depth axis Z. Each plane can therefore be associated with a position on the Z depth axis.
  • the first image is for example associated with the position 0 nm on the axis depth Z
  • the second image at the 25 nm position on the Z depth axis
  • the third image at the 50 nm position on the Z depth axis.
  • the images of the stack of images are ordered by increasing position along the depth axis Z.
  • Figure 2 shows an I3D image stack acquired by SBF-SEM and an example lz image constituting the I3D image stack.
  • the method 100 according to the invention may comprise a first step 101 of modification, alignment, and optimization of the stacking of I3D images.
  • the first step 101 may consist of aligning the lz images of the I3D image stack along the Z depth axis and/or converting the lz images of the l3D image stack into a lighter format, for example from 32 bits to 8 bits, and/or to adjust the brightness and the contrast of the lz images of the I3D image stack, and/or to remove the noise in the lz images of the I3D image stack , for example by applying a Gaussian filter.
  • a second step 102 of the method 100 according to the invention consists, for at least one type of biological elements of interest, in automatically or semi-automatically segmenting in each image lz of the stack of I3D images possibly modified in the first step 101 , at least one region of the image lz comprising at least one biological element presenting the type of biological elements of interest.
  • the type of biological elements of interest is chosen from the types of biological elements conventionally present in the biological tissue constituting the sample.
  • the second step 102 consists on the one hand of segmenting each region comprising a cell 202 in each image lz of the stack of I3D images and on the other hand to segment each region comprising a blood capillary 201 in each image lz of the stack of I3D images.
  • the region of the segmented lz image can comprise only the biological element, that is to say that the contours of the region coincide with the contours of the biological element.
  • the region of the segmented lz image can also comprise, within it, other biological elements in addition to the biological element of interest.
  • the second step 102 is carried out using an artificial neural network previously trained in a supervised manner on a training database to segment in each image lz of the stack I3D images, each region comprising at least one biological element of a given type.
  • An artificial neural network comprises at least one layer of artificial neurons each comprising at least one artificial neuron.
  • the artificial neurons of the artificial neural network are interconnected by synapses and each synapse is assigned a synaptic coefficient.
  • the training or learning makes it possible to train the artificial neural network for a predefined task, by updating the synaptic coefficients so as to minimize the error between the output data provided by the artificial neural network and the real output data, i.e. what the artificial neural network should output to fulfill the predefined task on a certain input data.
  • a training database therefore comprises input data, each associated with a real output data.
  • the training database therefore comprises lz images of biological tissue samples acquired by SBF-SEM, as well as data on the contours of each region comprising at least one biological element of the given type present in each image. lz.
  • the artificial neural network is for example a convolutional artificial neural network, such as the U-Net network.
  • the second step 102 according to the first embodiment is then carried out automatically.
  • the segmentation carried out using the artificial neural network can possibly be followed by a visual check and a manual correction to check the quality of the output data provided by the artificial neural network.
  • the second step 102 according to the first embodiment is carried out semi-automatically.
  • the training database can be completed with the images of the stack of images in which each region containing at least one biological element of interest has been segmented and the network of artificial neurons can be re-trained on the thus completed training database.
  • the second step 102 is carried out by manual or semi-manual segmentation of each region comprising at least one biological element of a given type in a set of images of the stack of images I3D and by automatic segmentation of each region comprising at least one biological element of a given type in each image lz of the stack of I3D images located between two images of the set of images in the stack of I3D images using a propagation algorithm.
  • the term "semi-manual segmentation of an element” means a segmentation carried out manually on a portion of the element, the portion of the manually segmented element being used as input data for an algorithm then capable of fully segment the element automatically.
  • Such an algorithm is for example an artificial neural network or an image processing algorithm, for example region-growing or region-growing in English.
  • FIG. 4 illustrates the implementation of the second embodiment of the second step 102 on a plurality of lz images ordered by increasing position along the Z depth axis from left to right and from top to bottom, by choosing 202 cells as a type of biological elements of interest.
  • the contours of the cell 202 present in image G have been identified semi-manually and on each other image lz, it that is to say on each image lz not belonging to the set of images G, the contours of the cell 202 present in the image lz have been identified automatically by the propagation algorithm from the contours of the cell 202 obtained for the image G of the set of images D immediately preceding the image lz to be segmented.
  • the semi-manual segmentation is carried out on an lz image out of 10, i.e. the set of images G comprises an lz image out of 10 of the set of images I3D.
  • the manual or semi-manual segmentation is for example carried out using image annotation software.
  • the propagation algorithm is for example an algorithm based on the optical flow or "optical flow" in English.
  • the second step 102 according to the second embodiment is then carried out semi-automatically.
  • the second step 102 can be carried out according to the first embodiment for certain types of biological elements of interest and according to the second embodiment for other types of biological elements of interest.
  • the second step 102 can be carried out according to the first embodiment for the mitochondria and according to the second embodiment of realization for cells 202.
  • the method 100 according to the invention may comprise a third step 103 consisting in reconstructing the three-dimensional structure of each biological element included in a region segmented in the second step 102 from the segmentation of the region comprising the biological element in each lz image of the I3D image stack.
  • Figure 3a shows a stack of images comprising eight lz images acquired by SBF-SEM and ordered from left to right by increasing position along the Z depth axis.
  • the first lz image corresponds to a position of 2.5 pm along the depth axis Z
  • the second image lz corresponds to a position of 5 pm along the depth axis Z
  • the third image lz corresponds to a position of 7.5 pm along the depth axis Z
  • the fourth image lz corresponds to a position of 10 pm along the Z depth axis
  • the fifth lz image corresponds to a 12.5 pm position along the Z depth axis
  • the sixth lz image corresponds to a 15 pm position along the Z axis depth Z
  • the seventh lz image corresponds to a position of 17.5 pm along the Z depth axis
  • the eighth lz image corresponds to a 20 pm position along the Z depth axis.
  • each 1z image shows a section of bile canaliculus 203.
  • Figure 3b shows the three-dimensional reconstruction of the bile canaliculus 203 present in the Iz images of Figure 3a obtained from the segmentation of the bile canaliculus 203 in each Iz image of Figure 3a.
  • FIG. 2 is shown the three-dimensional reconstruction of cells 202 and blood capillaries 201 of a sample obtained from a stack of D images acquired by SBF-SEM.
  • FIG. 5 shows the three-dimensional reconstruction of the nuclei 204 and the blood capillaries 201 of a sample, obtained from a stack of D images acquired by SBF-SEM.
  • a fourth step 104 of the method 100 consists in characterizing at least one biological element of a type of biological elements of interest by calculating at least one indicator from each segmented region for the biological element in the I3D image stacking.
  • An indicator can be relative to the structure, to the morphology, to the size, to the polarity, to the texture, to the constitution, to the orientation, to a surface, to the alignment, to the convergence, density, convexity or concavity of the biological element.
  • the indicator is for example the volume of the biological element, the distance between the biological element and another given biological element of the sample, the surface of the biological element in a given plane, the axis principal of the biological element, the alignment of the biological element with a given axis or a plane, the polarization of the biological element towards a given point, the length of the minor axes/major axes of the biological element, a biological element texture indicator, e.g. co-occurrence matrix, biological element outer shell perimeter, biological element surface fractal dimension, biological element count sample in contact with the biological element, the area of contact between the biological element and neighboring biological elements in the sample, the density of biological elements in the region in which the biological element is located or in a neighboring region .
  • a biological element texture indicator e.g. co-occurrence matrix, biological element outer shell perimeter, biological element surface fractal dimension
  • the indicator can for example be the orientation of the nucleus-mitochondria axis, the number of cells in contact with a cell of interest, or even the contact surface of a cell of interest with cells neighbours.
  • Figure 2 is represented by a rod the main axis 302 of each cell 202 and by a cylindrical shape the main axis 301 of the single blood capillary 201 obtained from the three-dimensional reconstruction of each cell 202 and of the blood capillary 201 .
  • the main axis 301, 302 of a biological element is for example obtained by principal component analysis on the coordinates of the voxels constituting the three-dimensional reconstruction of the biological element.
  • the method 100 according to the invention may comprise a fifth step 105 consisting in comparing the indicators calculated in the fourth step 104 with each other for a given set of biological elements, that is to say comparing with each other the indicators calculated in the fourth step 104 for each biological element of the set of biological elements.
  • the set of biological elements comprises a plurality of biological elements each being of a type of biological elements of interest.
  • the set of biological elements can therefore comprise different types of biological elements.
  • FIG. 2 comprises a histogram representing, for different angle values between the main axis 301 of the blood capillary 201 and the main axis 302 of the cell 202, the number of cells 202 having a main axis 302 separated from the main axis 301 of the blood capillary 201 of the angle value.
  • the histogram also includes the cumulative number of cells for each angle value.
  • a second aspect of the invention relates to a method for comparing the internal three-dimensional organization of a plurality of samples of biological tissue.
  • FIG. 6 is a block diagram illustrating the sequence of steps of the method 400 according to the second aspect of the invention.
  • the method 400 according to the invention comprises the steps of the method 100 according to the first aspect of the invention for each sample of biological tissue from a set of samples of biological tissue.
  • the set of biological tissue samples comprises a plurality of samples of the same biological tissue or of different biological tissues.
  • the set of biological tissue samples comprises two samples and the steps of the method 100 according to the first aspect of the invention are therefore carried out twice.
  • the method 400 according to the invention further comprises a step 401 of comparison between the indicators calculated for a set of biological elements of each sample of biological tissue of the set of samples of biological tissue.

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Abstract

Un aspect de l'invention concerne une méthode de caractérisation de l'organisation tridimensionnelle interne d'un échantillon de tissu biologique comprenant une pluralité de types d'éléments biologiques (201, 202), comportant les étapes suivantes : - Pour au moins un type d'éléments biologiques (201, 202) d'intérêt, segmentation automatique ou semi-automatique dans chaque image (IZ) d'un empilement d'images (I3D), d'au moins une région contenant au moins un élément biologique (201, 202) ayant pour type le type d'éléments biologiques (201, 202) d'intérêt, l'empilement d'images (I3D) ayant été acquis par imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage; - Caractérisation d'au moins un élément biologique (201, 202) par calcul d'au moins un indicateur (301, 302) relatif à la structure, à la morphologie, à la taille, à la polarité, à la texture, à la constitution ou à l'orientation de l'élément biologique (201, 202) à partir de chaque région segmentée correspondante.

Description

DESCRIPTION
TITRE : Méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon biologique
DOMAINE TECHNIQUE DE L’INVENTION
[0001] Le domaine technique de l’invention est celui des échantillons biologiques et plus particulièrement celui de l’étude de l’organisation tridimensionnelle interne des échantillons biologiques.
[0002] La présente invention concerne une méthode de caractérisation d’un échantillon biologique et en particulier une méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon biologique. La présente invention concerne également une méthode de comparaison de l’organisation tridimensionnelle interne d’une pluralité d’échantillons de tissu biologique, et un dispositif, un produit-programme d’ordinateur et un support d’enregistrement pour la mise en oeuvre des méthodes.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L’INVENTION
[0003] Un tissu biologique qu’il soit sain ou pathologique, d’origine humaine ou non, comporte de nombreux types d’éléments biologiques de taille microscopique ou nanométrique. Parmi ces éléments biologiques, on retrouve notamment des éléments organisationnels et structurels comme les capillaires sanguins et les canalicules biliaires, des cellules d’origine tissulaire (cellules du muscle, hépatocytes, cellules du système immunitaire, cellules endothéliales, cellules nerveuses, globules rouges, globules blancs circulants ou infiltrants dont des lymphocytes et des macrophages...) de nature très variée (cellules normales, tumorales, stromales, accessoires...), mais aussi des éléments subcellulaires (ou organelles) tels que les noyaux, les nucléoles, les mitochondries, les membranes cytoplasmiques, les membranes nucléaires, les vésicules lipidiques, les réticulum endoplasmiques, les exosomes etc.
[0004] Il existe aujourd’hui plusieurs techniques de microscopie électronique, dont l’imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage ou SBF-SEM pour « serial block face scanning électron microscopy », permettant d’imager l’organisation, l’architecture et l’ultrastructure interne d’un tissu biologique à l’échelle nanométrique, sur un large volume pouvant atteindre 1000 picolitres. [0005] La technique SBF-SEM consiste à imager la surface d’un bloc d'échantillon de tissu biologique en collectant les électrons rétro-diffusés. Le principe est de réaliser des cycles de coupes et d’acquisitions d’images de la surface d’un échantillon. Une première image de la surface de l’échantillon est réalisée en collectant les électrons rétro-diffusés, puis le système de coupe génère une première coupe ultrafine de l’échantillon afin d’exposer une couche inférieure de l’échantillon au faisceau d’électrons. Les cycles « Acquisition-Coupe » vont alors s’enchaîner de manière automatique, sachant qu’il est possible d’acquérir plusieurs centaines voire quelques milliers d’images successives (comportant les axes X et Y) selon l’axe Z avec une résolution de quelques nm. Cette technique permet également d’acquérir des images de la surface de l’échantillon de grande taille (à l’échelle microscopique, quelques dizaines à plusieurs centaines de pm2) avec une résolution nanométrique (taille de pixel en XY de 1 à plusieurs dizaines de nm).
[0006] Pour pouvoir étudier la structure tridimensionnelle d’un élément biologique donné et ainsi pouvoir le caractériser pour quantifier, étudier et évaluer son rôle dans un phénomène biologique donné, il est alors nécessaire de l’identifier précisément sur chacune des images de la série d’images acquises. Une telle identification est donc souvent réalisée manuellement par un spécialiste, ce qui rend la tâche fastidieuse et incompatible avec l’étude de l’organisation interne complète de l’échantillon qui nécessiterait l’identification d’un grand nombre d’éléments biologiques dans chaque image.
[0007] Il existe donc un besoin à propos d’une méthode permettant d’obtenir de manière précise et fiable et en un temps raisonnable, c’est-à-dire de l’ordre de quelques heures, une caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon biologique.
RESUME DE L’INVENTION
[0008] L’invention offre une solution aux problèmes évoqués précédemment, en permettant de caractériser précisément et de manière fiable, l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon biologique en minimisant le nombre d’étapes nécessitant l’intervention d’un spécialiste et en automatisant la procédure d’analyse des éléments d’un échantillon biologique, d’origine humaine, animale, végétale ou fongique, à l’aide d’approches mathématiques et d’intelligence artificielle. [0009] Un premier aspect de l’invention concerne une méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon de tissu biologique comprenant une pluralité de types d’éléments biologiques, comportant les étapes suivantes :
Pour au moins un type d’éléments biologiques d’intérêt parmi la pluralité de types d’éléments biologiques, segmentation automatique ou semi- automatique dans chaque image d’un empilement d’images, d’au moins une région contenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt, l’empilement d’images ayant été acquis par imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage et comportant une pluralité d’images acquises chacune selon un plan perpendiculaire à un axe de profondeur et chacune associée à une position sur l’axe de profondeur, la pluralité d’images étant ordonnées par position croissante dans l’empilement d’images ;
Caractérisation d’au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt, par calcul d’au moins un indicateur relatif à la structure, à la morphologie, à la taille, à la polarité, à la texture, à la constitution ou à l’orientation de l’élément biologique à partir de chaque région segmentée correspondante.
[0010] Grâce à l’invention, l’organisation tridimensionnelle interne complète ou quasi-complète d’un échantillon peut être caractérisée puisqu’une caractérisation de chaque élément biologique de l’échantillon peut être obtenue.
[0011] Comme la segmentation de chaque élément biologique est obtenue automatiquement ou semi-automatiquement, la caractérisation de l’organisation tridimensionnelle de l’échantillon est obtenue beaucoup plus rapidement que dans l’art antérieur, le nombre d’étapes nécessitant une intervention humaine, et plus particulièrement l’intervention d’un spécialiste, étant diminué d’au moins 90%.
[0012] Des paramètres physiques, géométriques, morphologiques, constitutionnels et organisationnels sont ensuite extraits de l’ensemble des segmentations pour être directement corrélés à des concepts biologiques ou pour être comparés avec des paramètres obtenus à partir d’autres échantillons.
[0013] Ainsi, dans le domaine de l’oncologie par exemple, la méthode selon l’invention permet de faciliter l’étude de tous les types de cancers ou de tumeurs solides issus de biopsies ou d’échantillons tissulaires de patients, d’animaux ou de modèles expérimentaux variés, par exemple les sphéroïdes, les tumoroïdes, les organoïdes tumoraux ou encore les xénogreffes de cellules tumorales chez la souris, l’embryon de poulet, l’embryon de Xénope, le poisson zèbre ou tout autre modèle animal hôte.
[0014] Outre les caractéristiques qui viennent d’être évoquées dans le paragraphe précédent, la méthode selon le premier aspect de l’invention peut présenter une ou plusieurs caractéristiques complémentaires parmi les suivantes, considérées individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles.
[0015] Selon une variante de réalisation, la méthode selon l’invention comprend en outre une étape de reconstruction tridimensionnelle d’au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt, à partir de chaque région segmentée correspondante.
[0016] Il est ainsi possible d’obtenir une reconstruction complète ou quasi- complète de l’organisation tridimensionnelle interne de l’échantillon biologique.
[0017] La méthode selon l’invention peut alors permettre à terme la création d’une base de données d’imagerie tridimensionnelle accessible aux chercheurs et aux cliniciens, contenant des images tridimensionnelles à haute résolution de tissus biologiques de types et d’origines variés, ainsi que l’ensemble d’indicateurs associés, de données mathématiques et de paramètres morphologiques, constitutionnels ou organisationnels.
[0018] Selon une variante de réalisation compatible avec la variante de réalisation précédente, la méthode selon l’invention comprend en outre une étape de modification, d’alignement et d’optimisation de l’empilement d’images avant l’étape de segmentation.
[0019] Ainsi, l’étape de modification peut consister à aligner les images selon l’axe de profondeur pour faciliter la reconstruction tridimensionnelle et/ou à convertir les images dans un format moins lourd pour consommer moins de ressources et faciliter la segmentation, et/ou à ajuster la luminosité et le contraste des images et/ou à supprimer le bruit dans les images pour faciliter la segmentation ultérieure. [0020] Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisation précédentes, le type d’éléments biologiques d’intérêt est choisi parmi les types suivants : capillaire sanguin, zone d’hémolyse, canalicule biliaire, cellule, membrane cytoplasmique, noyau, nucléole, membrane nucléaire, mitochondrie, réticulum endoplasmique, vésicule lipidique, exosome, lumière des vaisseaux, vacuole, péroxysome, paroi cellulaire, leucoplaste, chloroplaste ou tout autre élément biologique composant le tissu biologique ou les cellules.
[0021] Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisations précédentes, l’étape de segmentation est réalisée à l’aide d’un réseau de neurones artificiels entraîné pour être capable de détecter dans une image, chaque région comprenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt, le réseau de neurones artificiels ayant été entraîné de manière supervisée sur une base de données d’entraînement comprenant une pluralité d’images dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt a été identifiée.
[0022] Ainsi, l’étape de segmentation est automatique, fiable et ne nécessite aucune intervention humaine. Le taux de précision/fiabilité obtenu est par exemple supérieur à 90% pour la segmentation des mitochondries et des noyaux.
[0023] Selon une sous-variante de réalisation de la variante de réalisation précédente, l’étape de segmentation à l’aide du réseau de neurones artificiels entraîné est suivie d’une vérification visuelle et d’une correction manuelle.
[0024] Ainsi, l’étape de segmentation est semi-automatique et les images corrigées peuvent ensuite être utilisées pour ré-entraîner le réseau de neurones artificiels et ainsi améliorer sa précision et sa fiabilité.
[0025] Selon une sous-variante de réalisation de la variante de réalisation précédente compatible avec la sous-variante de réalisation précédente, la base de données d’entraînement est complétée avec les images de l’empilement d’images dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt a été segmentée par le réseau de neurones artificiels et le réseau de neurones artificiels est réentraîné sur la base de données d’entraînement complétée. [0026] Ainsi, plus le réseau de neurones artificiels est ré-entraîné, plus sa précision et sa fiabilité augmentent, ce qui permet de diminuer le nombre d’étapes de vérifications visuelles et corrections manuelles, et de réduire encore d’avantage le temps nécessaire à l’étape de segmentation automatique, tout en maintenant un taux élevé de fiabilité.
[0027] Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisations précédentes exceptée la variante de réalisation précédente, l’étape de segmentation est réalisée manuellement ou semi-manuellement sur un ensemble d’images de l’empilement d’images et automatiquement à l’aide d’un algorithme de propagation sur chaque image de l’empilement d’images située entre deux images de l’ensemble d’images dans l’empilement d’images.
[0028] Ainsi, l’étape de segmentation est semi-automatique et permet de segmenter des éléments biologiques, par exemple des cellules, dont les contours ne sont pas toujours nets sur toutes les images de l’empilement d’images.
[0029] Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisations précédentes, l’indicateur est choisi parmi les indicateurs suivants : volume, distance à un autre élément biologique donné, surface dans un plan donné, axe principal, alignement avec un axe ou un plan donné, polarisation vers un point donné, longueur des petits axes/grands axes, indicateur de texture, périmètre de l’enveloppe extérieure, dimension fractale de la surface, nombre d’éléments biologiques en contact, surface de contact avec des éléments biologiques voisins, densité d’éléments biologiques dans une région proche.
[0030] Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisations précédentes, la méthode selon l’invention comprend en outre une étape de comparaison entre les indicateurs calculés pour un ensemble d’éléments biologiques de l’échantillon de tissu biologique.
[0031] Ainsi, il est possible d’étudier les liens entre les structures tridimensionnelles de différents types d’éléments biologiques au sein de l’échantillon. [0032] Un deuxième aspect de l’invention concerne une méthode de comparaison de l’organisation tridimensionnelle interne d’une pluralité d’échantillons de tissu biologique comprenant les étapes de la méthode selon le premier aspect de l’invention pour chaque échantillon de tissu biologique d’un ensemble d’échantillons de tissu biologique comprenant une pluralité d’échantillons de tissu biologique, et une étape de comparaison entre les indicateurs calculés pour un ensemble d’éléments biologiques de chaque échantillon de tissu biologique de l’ensemble d’échantillons de tissu biologique.
[0033] Ainsi, il est possible d’étudier les liens entre les structures tridimensionnelles de plusieurs échantillons biologiques de même origine tissulaire ou d’origine différente, y compris des comparaisons entre tissus de règnes différents (animal versus végétal versus fongique...), mais également les liens entre les structures tridimensionnelles de plusieurs échantillons biologiques issus d’analyses réalisées à différents temps. Ainsi, dans le domaine de l’oncologie par exemple, la méthode selon le deuxième aspect de l’invention permet d’étudier les liens potentiels entre l’organisation tridimensionnelle interne d’un tissu tumoral, son contenu cellulaire et subcellulaire, et la réponse des patients à un traitement en comparant les paramètres du tissu avant et après la prise du traitement et ce, quel que soit le traitement considéré (chimiothérapie, immunothérapie, chirurgie, radiothérapie, cryothérapie, électroporation, électrofocalisation, thermothérapie, luminothérapie...).
[0034] Un troisième aspect de l’invention concerne un dispositif comprenant un processeur configuré pour mettre en oeuvre les étapes de la méthode selon le premier ou le deuxième aspect de l’invention.
[0035] Un quatrième aspect de l’invention concerne un produit-programme d’ordinateur comprenant des instructions qui, quand le programme est exécuté sur un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en oeuvre les étapes de la méthode selon le premier ou le deuxième aspect de l’invention.
[0036] Un cinquième aspect de l’invention concerne un support d'enregistrement lisible par ordinateur comprenant des instructions qui, lorsqu'elles sont exécutées par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en oeuvre les étapes de la méthode selon le premier ou le deuxième aspect de l’invention. [0037] L’invention et ses différentes applications seront mieux comprises à la lecture de la description qui suit et à l’examen des figures qui l’accompagnent.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
[0038] Les figures sont présentées à titre indicatif et nullement limitatif de l’invention.
La figure 1 est un schéma synoptique illustrant l’enchaînement des étapes d’une méthode selon un premier aspect de l’invention.
La figure 2 illustre le résultat d’étapes de segmentation, de caractérisation et de comparaison de la méthode selon le premier aspect de l’invention en choisissant les cellules et les capillaires sanguins comme types d’éléments biologiques d’intérêt, et l’axe principal comme indicateur.
La figure 3a montre un empilement d’images acquises par imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage, ordonnées de gauche à droite par position croissante selon un axe de profondeur Z, comportant un canalicule biliaire.
La figure 3b montre le résultat d’une étape de reconstruction de la méthode selon le premier aspect de l’invention pour le canalicule biliaire à partir de l’empilement d’images représenté sur la figure 3a.
La figure 4 illustre un mode de réalisation d’une étape de segmentation de la méthode selon le premier aspect de l’invention ayant recours à un algorithme de propagation.
La figure 5 montre le résultat de l’étape de reconstruction de la méthode selon le premier aspect de l’invention en choisissant les noyaux et les capillaires sanguins comme types d’éléments biologiques d’intérêt.
La figure 6 est un schéma synoptique illustrant l’enchaînement des étapes d’une méthode selon un deuxième aspect de l’invention.
DESCRIPTION DETAILLEE
[0039] Sauf précision contraire, un même élément apparaissant sur des figures différentes présente une référence unique. [0040] Un premier aspect de l’invention concerne une méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon de tissu biologique.
[0041] On entend par « organisation tridimensionnelle d’un échantillon », la structure interne de l’échantillon décelable à l’aide d’un microscope électronique, c’est- à-dire dans une gamme de valeurs d’environ un à plusieurs centaines de nanomètres.
[0042] Le tissu biologique peut être humain, animal, végétal ou fongique.
[0043] L’échantillon a par exemple été prélevé par biopsie ou par résection chirurgicale sur un patient, sur un animal ou à partir de tout autre modèle expérimental pertinent ou de n’importe quelle source biologique, animale, végétale ou fongique.
[0044] L’échantillon a par exemple un volume de l’ordre de 1 mm3.
[0045] Un tissu biologique comporte une pluralité d’éléments biologiques de types différents.
[0046] Un type d’éléments biologiques est par exemple une cellule, une hématie, une membrane cytoplasmique, un noyau, un nucléole, une membrane nucléaire, une mitochondrie, un capillaire sanguin, une vésicule lipidique, un canalicule biliaire, un réticulum endoplasmique, une zone d’hémolyse, la lumière des vaisseaux ou encore un exosome, une vacuole, un péroxysome, une paroi cellulaire, un leucoplaste, un chloroplaste. Le type de cellule analysé peut être d’origine variée, comme les cellules végétales, fongiques, animales ou humaines cardiaques, musculaires, endothéliales, neuronales, immunitaires, rénales, pancréatiques, pulmonaires, hépatocytaires, biliaires, astrocytaires, macrocytaires, gliales, intestinales, stomacales.
[0047] [Fig. 1] La figure 1 est un schéma synoptique illustrant l’enchaînement des étapes de la méthode 100 selon le premier aspect de l’invention.
[0048] La méthode 100 selon l’invention est réalisée sur un empilement d’images de l’échantillon de tissu biologique obtenu par SBF-SEM. [0049] En considérant que l’échantillon est placé dans un repère orthogonal (X, Y, Z) où Z correspond à la profondeur de l’échantillon, chaque image de l’empilement d’images est acquise selon un plan comprenant les axes X et Y et perpendiculaire à l’axe de profondeur Z.
[0050] Les plans des images acquises sont parallèles entre eux et non confondus, c’est-à-dire que les plans sont espacés entre eux selon l’axe de profondeur Z. Chaque plan peut donc être associé à une position sur l’axe de profondeur Z.
[0051] Par exemple, si l’on réalise l’acquisition de trois images perpendiculairement à l’axe de profondeur Z selon des plans espacés chacun de 25 nm, la première image est par exemple associée à la position 0 nm sur l’axe de profondeur Z, la deuxième image à la position 25 nm sur l’axe de profondeur Z et la troisième image à la position 50 nm sur l’axe de profondeur Z.
[0052] Les images de l’empilement d’images sont ordonnées par position croissante selon l’axe de profondeur Z.
[0053] [Fig. 2] La figure 2 montre un empilement d’images I3D acquis par SBF-SEM et un exemple d’image lz constituant l’empilement d’images I3D.
[0054] La méthode 100 selon l’invention peut comporter une première étape 101 de modification, d’alignement, et d’optimisation de l’empilement d'images I3D.
[0055] La première étape 101 peut consister à aligner les images lz de l’empilement d’images I3D selon l’axe de profondeur Z et/ou à convertir les images lz de l’empilement d’images l3Ddans un format moins lourd, par exemple de 32 bits vers 8 bits, et/ou à ajuster la luminosité et le contraste des images lz de l’empilement d’images I3D, et/ou à supprimer le bruit dans les images lz de l’empilement d’images I3D, par exemple par application d’un filtre gaussien.
[0056] Une deuxième étape 102 de la méthode 100 selon l’invention consiste, pour au moins un type d’éléments biologiques d’intérêt, à segmenter automatiquement ou semi-automatiquement dans chaque image lz de l’empilement d’images I3D éventuellement modifié à la première étape 101 , au moins une région de l’image lz comportant au moins un élément biologique présentant le type d’éléments biologiques d’intérêt. [0057] Le type d’éléments biologiques d’intérêt est choisi parmi les types d’éléments biologiques classiquement présents dans le tissu biologique constituant l’échantillon.
[0058] Ainsi, si l’on choisit deux types d’éléments biologiques d’intérêt, par exemple les cellules 202 et les capillaires sanguins 201 , la deuxième étape 102 consiste d’une part à segmenter chaque région comprenant une cellule 202 dans chaque image lz de l’empilement d’images I3D et d’autre part à segmenter chaque région comprenant un capillaire sanguin 201 dans chaque image lz de l’empilement d’images I3D.
[0059] On entend par « segmenter un élément dans une image », identifier les contours de l’élément visible dans l’image.
[0060] La région de l’image lz segmentée peut comporter uniquement l’élément biologique, c’est-à-dire que les contours de la région coïncident avec les contours de l’élément biologique.
[0061] La région de l’image lz segmentée peut également comporter, en son sein, d’autres éléments biologiques en plus de l’élément biologique d’intérêt.
[0062] Selon un premier mode de réalisation, la deuxième étape 102 est réalisée à l’aide d’un réseau de neurones artificiels préalablement entraîné de manière supervisée sur une base de données d’entraînement pour segmenter dans chaque image lz de l’empilement d’images I3D, chaque région comportant au moins un élément biologique d’un type donné.
[0063] Un réseau de neurones artificiels comporte au moins une couche de neurones artificiels comportant chacune au moins un neurone artificiel. Les neurones artificiels du réseau de neurones artificiels sont reliés entre eux par des synapses et à chaque synapse est affecté un coefficient synaptique.
[0064] L’entraînement ou apprentissage permet d’entraîner le réseau de neurones artificiels à une tâche prédéfinie, en mettant à jour les coefficients synaptiques de manière à minimiser l’erreur entre la donnée de sortie fournie par le réseau de neurones artificiels et la vraie donnée de sortie, c’est-à-dire ce que le réseau de neurones artificiels devrait fournir en sortie pour remplir la tâche prédéfinie sur une certaine donnée d’entrée. [0065] Une base de données d’entraînement comporte donc des données d’entrée, chacune associée à une vraie donnée de sortie.
[0066] La base de données d’entraînement comporte donc des images lz d’échantillons de tissus biologiques acquises par SBF-SEM, ainsi que des données sur les contours de chaque région comportant au moins un élément biologique du type donné présente dans chaque image lz.
[0067] Les données sur les contours de chaque région ont été obtenues manuellement et/ou automatiquement et/ou par la combinaison des deux.
[0068] Le réseau de neurones artificiels est par exemple un réseau de neurones artificiels convolutifs, tel que le réseau U-Net.
[0069] La deuxième étape 102 selon le premier mode de réalisation est alors réalisée automatiquement.
[0070] La segmentation réalisée à l’aide du réseau de neurones artificiels peut être éventuellement suivie d’une vérification visuelle et d’une correction manuelle pour contrôler la qualité de la donnée de sortie fournie par le réseau de neurones artificiels. Dans ce cas, la deuxième étape 102 selon le premier mode de réalisation est réalisée de façon semi-automatique.
[0071] Une fois la deuxième étape 102 terminée, la base de données d’entraînement peut être complétée avec les images de l’empilement d’images dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique d’intérêt a été segmentée et le réseau de neurones artificiels peut être ré-entraîné sur la base de données d’entraînement ainsi complétée.
[0072] Selon un deuxième mode de réalisation, la deuxième étape 102 est réalisée par segmentation manuelle ou semi-manuelle de chaque région comportant au moins un élément biologique d’un type donné dans un ensemble d’images de l’empilement d’images I3D et par segmentation automatique de chaque région comportant au moins un élément biologique d’un type donné dans chaque image lz de l’empilement d’images I3D située entre deux images de l’ensemble d’images dans l’empilement d’images I3D à l’aide d’un algorithme de propagation. [0073] On entend par « segmentation semi-manuelle d’un élément », une segmentation réalisée manuellement sur une portion de l’élément, la portion de l’élément segmenté manuellement étant utilisée comme données d’entrée pour un algorithme alors capable de segmenter intégralement l’élément de manière automatique.
[0074] Un tel algorithme est par exemple un réseau de neurones artificiels ou un algorithme de traitement d’images, par exemple de croissance de région ou region- growing en anglais.
[0075] [Fig. 4] La figure 4 illustre la mise en oeuvre du deuxième mode de réalisation de la deuxième étape 102 sur une pluralité d’images lz ordonnées par position croissante selon l’axe de profondeur Z de gauche à droite et de haut en bas, en choisissant les cellules 202 comme type d’éléments biologiques d’intérêt.
[0076] Sur chaque image G de l’ensemble d’images représentées encadrées en pointillés sur la figure 4, les contours de la cellule 202 présente dans l’image G ont été identifiés semi-manuellement et sur chaque autre image lz, c’est-à-dire sur chaque image lz n’appartenant pas à l’ensemble d’images G, les contours de la cellule 202 présente dans l’image lz ont été identifiés automatiquement par l’algorithme de propagation à partir des contours de la cellule 202 obtenus pour l’image G de l’ensemble d’images D précédant immédiatement l’image lz à segmenter.
[0077] Sur la figure 4, la segmentation semi-manuelle est réalisée sur une image lz sur 10, c’est-à-dire que l’ensemble d’images G comprend une image lz sur 10 de l’ensemble d’images I3D.
[0078] La segmentation manuelle ou semi-manuelle est par exemple réalisée à l’aide d’un logiciel d’annotations d’images.
[0079] L’algorithme de propagation est par exemple un algorithme basé sur le flux optique ou « optical flow » en anglais.
[0080] La deuxième étape 102 selon le deuxième mode de réalisation est alors réalisée semi-automatiquement.
[0081] Si l’on choisit une pluralité de types d’éléments biologiques d’intérêt, la deuxième étape 102 peut être réalisée selon le premier mode de réalisation pour certains types d’éléments biologiques d’intérêt et selon le deuxième mode de réalisation pour les autres types d’éléments biologiques d’intérêt. [0082] Ainsi, si l’on choisit deux types d’éléments biologiques d’intérêt, par exemple les cellules 202 et les mitochondries, la deuxième étape 102 peut être réalisée selon le premier mode de réalisation pour les mitochondries et selon le deuxième mode de réalisation pour les cellules 202.
[0083] La méthode 100 selon l’invention peut comporter une troisième étape 103 consistant à reconstruire la structure tridimensionnelle de chaque élément biologique compris dans une région segmentée à la deuxième étape 102 à partir de la segmentation de la région comprenant l’élément biologique dans chaque image lz de l’empilement d’images I3D.
[0084] [Fig. 3a] La figure 3a montre un empilement d’images comportant huit images lz acquises par SBF-SEM et ordonnées de gauche à droite par position croissante selon l’axe de profondeur Z. [0085] La première image lz correspond à une position de 2.5 pm selon l’axe de profondeur Z, la deuxième image lz correspond à une position de 5 pm selon l’axe de profondeur Z, la troisième image lz correspond à une position de 7.5 pm selon l’axe de profondeur Z, la quatrième image lz correspond à une position de 10 pm selon l’axe de profondeur Z, la cinquième image lz correspond à une position de 12.5 pm selon l’axe de profondeur Z, la sixième image lz correspond à une position de 15 pm selon l’axe de profondeur Z, la septième image lz correspond à une position de 17.5 pm selon l’axe de profondeur Z et la huitième image lz correspond à une position de 20 pm selon l’axe de profondeur Z.
[0086] Sur la figure 3a, chaque image lz présente une section de canalicule biliaire 203.
[0087] [Fig. 3b] La figure 3b montre la reconstruction tridimensionnelle du canalicule biliaire 203 présent dans les images Izde la figure 3a obtenue à partir de la segmentation du canalicule biliaire 203 dans chaque image Izde la figure 3a.
[0088] Sur la figure 2 est représentée la reconstruction tridimensionnelle des cellules 202 et des capillaires sanguins 201 d’un échantillon obtenu à partir d’un empilement d’images D acquises par SBF-SEM. [0089] [Fig. 5] La figure 5 montre la reconstruction tridimensionnelle des noyaux 204 et des capillaires sanguins 201 d’un échantillon, obtenue à partir d’un empilement d’images D acquises par SBF-SEM.
[0090] Une quatrième étape 104 de la méthode 100 consiste à caractériser au moins un élément biologique d’un type d’éléments biologiques d’intérêt en calculant au moins un indicateur à partir de chaque région segmentée pour l’élément biologique dans l’empilement d’images I3D.
[0091] Un indicateur peut être relatif à la structure, à la morphologie, à la taille, à la polarité, à la texture, à la constitution, à l’orientation, à une surface, à l’alignement, à la convergence, à la densité, à la convexité ou à la concavité de l’élément biologique.
[0092] L’indicateur est par exemple le volume de l’élément biologique, la distance entre l’élément biologique et un autre élément biologique donné de l’échantillon, la surface de l’élément biologique dans un plan donné, l’axe principal de l’élément biologique, l’alignement de l’élément biologique avec un axe ou un plan donné, la polarisation de l’élément biologique vers un point donné, la longueur des petits axes/grands axes de l’élément biologique, un indicateur de texture de l’élément biologique, par exemple la matrice de cooccurrence, le périmètre de l’enveloppe extérieure de l’élément biologique, la dimension fractale de la surface de l’élément biologique, le nombre d’éléments biologiques de l’échantillon en contact avec l’élément biologique, la surface de contact entre l’élément biologique et des éléments biologiques voisins dans l’échantillon, la densité d’éléments biologiques dans la région dans laquelle se situe l’élément biologique ou dans une région voisine.
[0093] L’indicateur peut par exemple être l’orientation de l’axe noyau-mitochondrie, le nombre de cellules en contact avec une cellule d’intérêt, ou encore la surface de contact d’une cellule d’intérêt avec des cellules voisines.
[0094] Sur la figure 2 est représenté par un bâtonnet l’axe principal 302 de chaque cellule 202 et par une forme cylindrique l’axe principal 301 de l’unique capillaire sanguin 201 obtenus à partir de la reconstruction tridimensionnelle de chaque cellule 202 et du capillaire sanguin 201 . [0095] L’axe principal 301 , 302 d’un élément biologique est par exemple obtenu par analyse en composante principale sur les coordonnées des voxels constituant la reconstruction tridimensionnelle de l’élément biologique.
[0096] La méthode 100 selon l’invention peut comporter une cinquième étape 105 consistant à comparer entre eux les indicateurs calculés à la quatrième étape 104 pour un ensemble d’éléments biologiques donné, c’est-à-dire à comparer entre eux les indicateurs calculés à la quatrième étape 104 pour chaque élément biologique de l’ensemble d’éléments biologiques.
[0097] L’ensemble d’éléments biologiques comporte une pluralité d’éléments biologiques étant chacun d’un type d’éléments biologiques d’intérêt. Quand la deuxième étape 102 a été réalisée pour plusieurs types d’éléments biologiques d’intérêt, l’ensemble d’éléments biologiques peut donc comporter différents types d’éléments biologiques.
[0098] La figure 2 comporte un histogramme représentant pour différentes valeurs d’angle entre l’axe principal 301 du capillaire sanguin 201 et l’axe principal 302 de la cellule 202, le nombre de cellules 202 présentant un axe principal 302 séparé de l’axe principal 301 du capillaire sanguin 201 de la valeur d’angle.
[0099] L’histogramme comporte aussi le nombre de cellules cumulé pour chaque valeur d’angle.
[00100] Il est alors possible d’en déduire que plus des trois quarts des cellules 202 de l’échantillon sont orientées avec un angle d’inclinaison de 0 à 20° par rapport au capillaire sanguin 201 , et donc que le capillaire sanguin 201 , qui a un angle d’inclinaison de 8°, pourrait avoir un rôle dans l’orientation des cellules 202.
[00101] Un deuxième aspect de l’invention concerne une méthode de comparaison de l’organisation tridimensionnelle interne d’une pluralité d’échantillons de tissu biologique.
[00102] [Fig. 6] La figure 6 est un schéma synoptique illustrant l’enchaînement des étapes de la méthode 400 selon le deuxième aspect de l’invention. [00103] La méthode 400 selon l’invention comporte les étapes de la méthode 100 selon le premier aspect de l’invention pour chaque échantillon de tissu biologique d’un ensemble d’échantillons de tissu biologique.
[00104] L’ensemble d’échantillons de tissu biologique comprend une pluralité d’échantillons d’un même tissu biologique ou de tissus biologiques différents.
[00105] Sur la figure 6, l’ensemble d’échantillons de tissu biologique comporte deux échantillons et les étapes de la méthode 100 selon le premier aspect de l’invention sont donc réalisées deux fois. [00106] La méthode 400 selon l’invention comporte en outre une étape 401 de comparaison entre les indicateurs calculés pour un ensemble d’éléments biologiques de chaque échantillon de tissu biologique de l’ensemble d’échantillons de tissu biologique.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Méthode (100) de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon de tissu biologique comprenant une pluralité de types d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204), comportant les étapes suivantes :
- Pour au moins un type d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) d’intérêt parmi la pluralité de types d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204), segmentation automatique ou semi-automatique dans chaque image (lz) d’un empilement d’images (I3D), d’au moins une région contenant au moins un élément biologique (201 , 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) d’intérêt, l’empilement d’images (I3D) ayant été acquis par imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage et comportant une pluralité d’images (lz) acquises chacune selon un plan perpendiculaire à un axe de profondeur (Z) et chacune associées à une position sur l’axe de profondeur (Z), la pluralité d’images (lz) étant ordonnées par position croissante dans l’empilement d’images (I3D, 102) ;
- Caractérisation d’un ensemble d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) d’intérêt, par calcul, pour chaque élément biologique (201 , 202, 203, 204) de l’ensemble d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204), d’au moins un indicateur (301 , 302) relatif à la structure, à la morphologie, à la taille, à la polarité, à la texture, à la constitution, à l’orientation, à une surface, à l’alignement, à la convergence, à la densité, à la convexité ou à la concavité de l’élément biologique (201 , 202, 203, 204), à partir de chaque région segmentée correspondante (104) ;
- Comparaison entre les indicateurs (301 , 302) calculés pour l’ensemble d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204).
[Revendication 2] Méthode selon la revendication 1 , comprenant en outre une étape de reconstruction tridimensionnelle d’au moins un élément biologique (201 , 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) d’intérêt, à partir de chaque région segmentée correspondante (103).
[Revendication s] Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape (101 ) préalable de modification, d’alignement et d’optimisation de l’empilement d’images (I3D).
[Revendication 4] Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le type d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) d’intérêt est choisi parmi les types suivants : cellule (202), membrane cytoplasmique, noyau (204), nucléole, membrane nucléaire, mitochondrie, capillaire sanguin (201 ), vésicule lipidique, canalicule biliaire (203), réticulum endoplasmique, exosome, lumière des vaisseaux, zone d’hémolyse, vacuole, péroxysome, paroi cellulaire, leucoplaste, chloroplaste.
[Revendication s] Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’étape (102) de segmentation est réalisée à l’aide d’un réseau de neurones artificiels entraîné pour être capable de détecter dans une image (Iz), chaque région contenant au moins un élément biologique (201 , 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) d’intérêt, le réseau de neurones artificiels ayant été entraîné de manière supervisée sur une base de données d’entraînement comprenant une pluralité d’images (Iz) dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique (201 , 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) d’intérêt a été identifiée.
[Revendication 6] Méthode (100) selon la revendication 5, dans laquelle l’étape (102) de segmentation à l’aide du réseau de neurones artificiels entraîné est suivie d’une vérification visuelle et d’une correction manuelle.
[Revendication 7] Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications 5 ou 6, selon laquelle la base de données d’entraînement est complétée avec les images de l’empilement d’images dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt a été segmentée par le réseau de neurones artificiels et le réseau de neurones artificiels est ré-entraîné sur la base de données d’entraînement complétée.
[Revendication 8] Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l’étape (102) de segmentation est réalisée manuellement ou semi- manuellement sur un ensemble d’images (G) de l’empilement d’images (I3D) et automatiquement à l’aide d’un algorithme de propagation sur chaque image (lz) de l’empilement d’images (I3D) située entre deux images (lz) de l’ensemble d’images (G) dans l’empilement d’images (I3D).
[Revendication 9] Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’indicateur (301 , 302) est choisi parmi les indicateurs suivants : volume, distance à un autre élément biologique (201 , 202, 203, 204) donné, surface dans un plan donné, axe principal (301 , 302), alignement avec un axe ou un plan donné, polarisation vers un point donné, longueur des petits axes/grands axes, indicateur de texture, périmètre de l’enveloppe extérieure, dimension fractale de la surface, nombre d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) en contact, surface de contact avec des éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) voisins, densité d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) dans une région proche.
[Revendication 10] Méthode (400) de comparaison de l’organisation tridimensionnelle interne d’une pluralité d’échantillons de tissu biologique comprenant les étapes de la méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes pour chaque échantillon de tissu biologique d’un ensemble d’échantillons de tissu biologique comprenant une pluralité d’échantillons de tissu biologique, et une étape (401 ) de comparaison entre les indicateurs (301 , 302) calculés pour un ensemble d’éléments biologiques (201 , 202, 203, 204) de chaque échantillon de tissu biologique de l’ensemble d’échantillons de tissu biologique.
[Revendication 11] Dispositif comprenant un processeur configuré pour mettre en oeuvre les étapes de la méthode (100, 400) selon l’une quelconque des revendications précédentes.
[Revendication 12] Produit-programme d’ordinateur comprenant des instructions qui, quand le programme est exécuté sur un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en oeuvre les étapes de la méthode (100, 400) selon l’une quelconque des revendications 1 à 10.
[Revendication 13] Support d'enregistrement lisible par ordinateur comprenant des instructions qui, lorsqu'elles sont exécutées par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en oeuvre les étapes de la méthode (100, 400) selon l’une quelconque des revendications 1 à 10.
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