EP4330261A1 - Utilisation de dérivés de dicarbonate de fluoresceine comme marqueur cellulaire - Google Patents

Utilisation de dérivés de dicarbonate de fluoresceine comme marqueur cellulaire

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Publication number
EP4330261A1
EP4330261A1 EP22726115.3A EP22726115A EP4330261A1 EP 4330261 A1 EP4330261 A1 EP 4330261A1 EP 22726115 A EP22726115 A EP 22726115A EP 4330261 A1 EP4330261 A1 EP 4330261A1
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EP
European Patent Office
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compound
cells
formula
chosen
cell
Prior art date
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Pending
Application number
EP22726115.3A
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German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Gain
Gilles Thuret
Emilie COURRIER
Zhiguo He
Gilles Ulrich
Antoinette De Nicola
Corantin MAURIN
Corentin MARET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Universite Jean Monnet
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Universite Jean Monnet
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Strasbourg, Universite Jean Monnet filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4330261A1 publication Critical patent/EP4330261A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0073—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form semi-solid, gel, hydrogel, ointment
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • C12Q2334/40—Triphenylmethane dye chromogens, e.g. fluorescein derivatives
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    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to compounds derived from fluorescein, and their use as fluorescent markers. They can in particular be used in biology and medicine, particularly in the field of ophthalmology. Non-fluorescent fluorescein derivatives are activated in the living cell, allowing the detection of living cells as well as the quantification of cell viability thanks to fluorescence, and in the absence of cell toxicity.
  • Corneal transplantation is the most common transplant in the world among all cell and organ transplants with more than 100,000 transplants performed each year.
  • the cornea the only transparent tissue in the body, plays an essential role in the refraction of light which is directed towards the retina. An alteration of this leads to a decrease in visual acuity, or even to a loss of vision.
  • Corneal transplantation is thus necessary in many pathologies such as Fuchs dystrophy and bullous dystrophies, infectious keratitis and keratoconus, but is also used in cases of perforating trauma such as accidents or burns.
  • the corneas to be transplanted are taken from the donors and stored in eye banks, also called cornea banks. Before carrying out the transplant, it is essential to check the quality of the graft, as several factors may be responsible for any alteration such as the state of health of the donor, the harvesting conditions and/or the storage conditions. For this purpose, it is essential that the viability of the endothelial cells of the corneal grafts be measured.
  • dyes such as Trypan blue (CAS [75-57-1]) and tetrazolium salts (CAS [298-93-1]), or fluorophores such as for example acridine orange (CAS [260-94-6]) and DAPI or Di Amido Phenyl Indol (CAS [28718-90-3]).
  • fluorophores such as for example acridine orange (CAS [260-94-6]) and DAPI or Di Amido Phenyl Indol (CAS [28718-90-3]).
  • Still other compounds allow both staining and visualization of cells by fluorescence. Such is the case of the compound resazurin (CAS [550-82-3]).
  • these dyes or fluorophores do not allow cell viability to be measured without altering the cells and consequently the samples analyzed. Indeed, the dyes diffuse into all the cells. Living cells exclude them while non-viable cells absorb them and become visible. A first limit to their use is therefore the overestimation of the proportion of living cells since only cells at an advanced stage of cell death are detected. A second limit is the intensity of the staining which is often low making the cells barely visible, or even not at all (Graefe's Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology, 1986, 224, 428-434).
  • Fluorophores make it possible to distinguish living cells, but their accumulation within cells ultimately leads to cell death.
  • Another approach to measuring cell viability is the use of fluorescent probes comprising one or more fluorochrome groups which are released following a cleavage reaction. The cells then become visible by fluorescence and can be easily studied under fluorescence microscopy ⁇ Anal. Chem., 2019, 91, 2255-2259; Biochemistry: Rottman and Papermaster, 1966, 55, 134-141). Such compounds are also used in other technical fields (JP 2009-006635, JP 2005-091802).
  • the use of these fluorescent probes has many advantages. It is a selective method, quick and easy to implement.
  • fluorescent probes make it possible to work on living cells in vitro or in vivo. The signal emitted is generally of good quality: it is specific, durable and strong.
  • One of the examples of a widely used fluorescent probe for measuring cell viability is Calcein-AM.
  • fluorescent probe allows an objective, precise and non-toxic measurement of cell viability.
  • the invention relates to a compound of general formula (I), characterized in that:
  • - X 1 is chosen from H, Cl, F, Br and NO2;
  • - X 2 is chosen from H, Cl, Br and N(CH 2 CC>2H)2;
  • R 2 is chosen from H, NCS and CO2R 3 ;
  • R 3 is chosen from H or a C 1 -C 3 alkyl; and its pharmaceutically acceptable salts.
  • the invention also covers the use of the compound of general formula (I) as a cell marker, and preferably as a marker of cell viability.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the compound of general formula (I) and a pharmaceutically acceptable excipient and/or vehicle.
  • the invention finds its application in the field of human, animal and plant biology. It is preferentially used in the field of ophthalmology.
  • the invention relates to a compound of general formula (I), characterized in that:
  • - X 1 is chosen from H, Cl, F, Br and NO2;
  • - X 2 is chosen from H, Cl, Br and N(CH 2 CC>2H)2;
  • R 2 is chosen from H, NCS and CO2R 3 ;
  • R 3 is chosen from H or a C 1 -C 3 alkyl; and its pharmaceutically acceptable salts.
  • the compounds of general formula (I) or pharmaceutically acceptable salts may comprise one or more stereocenters, each of which may exist independently of the others in an R or S configuration.
  • the compounds described are therefore in racemic or optically active forms.
  • salts denotes derivatives of the compounds of general formula (I) for which the acidic and/or basic groups exist in their salt form.
  • Pharmaceutically acceptable salts within the scope of the present invention include conventional non-toxic salts.
  • the pharmaceutically acceptable salts according to the invention will appear obvious to those skilled in the art. Examples of salts which can be used are calcium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, hydrogen phosphate, phosphate, edetate, citrate, lactate, hyaluronate, sodium borate and stearate. .
  • alkyl designates a linear and/or branched carbon chain.
  • C a - C b where a and b are integers, corresponds to the number of carbon atoms.
  • C3-C20 alkyl denotes a linear or branched chain comprising from 3 to 20 carbon atoms.
  • C3-C20 alkyl groups are propyl, iso-propyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, iso-pentyl, hexyl, iso-hexyl, heotyl , octyl, nonyl, decyl, undecyl and dodecyl.
  • polyethylene glycol designates in the context of the present invention, polyethylene glycols or poly(ethylene oxide) with an average molar mass ranging from 200 to 8000 g/mol.
  • polypropylene glycol this denomination groups together, within the framework of the present invention, the polymer compounds of the propylene glycol type having an average molar mass ranging from 200 to 600 mol/g.
  • sucrose refers to the compounds glucose, fructose, galactose, mannose, sucrose, lactose, maltose and sorbitol.
  • natural polysaccharides polysaccharides of plant origin, such as cellulose, starch, agarose, alginate and inulin, and polysaccharides of animal origin. such as hyaluronic acid or hyaluronate, chitin and chitosan.
  • Fluorescein can exist in two tautomeric forms: a closed form and an open form (formulas VI and VII).
  • corresponding derivative of fluorescein is meant in the context of the present invention the fluorochrome group of fluorescein substituted by the groups X 1 , X 2 and R 2 as defined previously and represented by the structure below (formula VIII). As previously described for fluorescein, it is understood that the corresponding derivatives of fluorescein can exist in their tautomeric form.
  • the present invention relates to a compound of general formula (I), characterized in that:
  • - X 1 is chosen from H, Cl, F, Br and NO 2 ;
  • - X 2 is chosen from H, Cl, Br and N(CH 2 CC> 2 H) 2 ;
  • R 2 is chosen from H, NCS and CO 2 R 3 ;
  • R 3 is chosen from H or a C 1 -C 3 alkyl; and its pharmaceutically acceptable salts.
  • the R 1 group is a C5-C10 alkyl.
  • R 1 is chosen from n-pentyl and n-decyl groups.
  • the alkyl groups can be linear or branched, thus in a particular embodiment, the group R 1 is a linear C3-C20 alkyl.
  • R 1 is a derivative of malic acid or a corresponding ester, i.e. R 1 is defined by the formula , wherein R 4 and R 4 ' are selected from hydrogen or C1-C6 alkyl.
  • the R 4 and R 4 'groups can be different or identical. In one embodiment, the R 4 and R 4 'groups are identical.
  • the R 2 group is hydrogen
  • the X 1 group is hydrogen
  • the X 2 group is a hydrogen
  • the R 2 , X 1 and X 2 groups are hydrogens.
  • the compounds of general formula (I) or the pharmaceutically acceptable salts are used for cell marking, as fluorescent markers, and more particularly for marking cell viability.
  • the compounds of the present invention comprise within their structure a fluorochrome: fluorescein or a corresponding derivative.
  • the hydrolysis of the carbonate groups R 1 -0-C( 0)-0 by the esterases after penetration into the cell, releases the fluorochrome as well as by-products in particular carbon dioxide and the alcohol of type R 1 - OH.
  • R 1 groups as defined for the compounds of formula (I) or the pharmaceutically acceptable salts are preferably groups devoid of cellular toxicity.
  • the fluorescence emitted by the fluorochrome thus released is visible by techniques well known to those skilled in the art.
  • the visualization of the fluorescence can be done with the naked eye or using devices such as glasses or microscopes, and generally requires the application on the fluorophore of a light at a wavelength generally included between 480 and 520 nm.
  • the hydrolysis of the compounds of the present invention takes place at the level of the cytoplasm. In the absence of esterase reactivity, no cleavage reaction occurs and therefore no fluorescence or staining of the cells is observed.
  • the compounds of general formula (I) or the pharmaceutically acceptable salts are thus used for the quantification of cell viability. Indeed, the activity of the ubiquitous esterases being proportional to the viability of the cells, the intensity of the signal emitted by the released fluorochrome is also proportional to the cellular activity and only the living cells are detected.
  • the absence of cellular toxicity allows use of the compounds of the present invention both in vitro and in vivo without altering the cells, and while allowing their viability to be preserved.
  • the invention also relates to a method for cell labeling of a set of cells which comprises the steps of bringing the cells into contact with a compound of general formula (I) according to the invention, then of verifying the presence of coloration or fluorescence in the set of cells.
  • the invention also relates to a method for verifying the cell viability of a set of cells which comprises the steps of bringing the cells into contact with a compound of general formula (I) according to the invention, then of verifying the presence of coloration or fluorescence in the cell aggregate.
  • the fluorescence or coloration which is the result of cell lysis of the compound of general formula (I) releasing the chromophore or fluorophore derived from fluorescein makes it possible to conclude as to the presence of living cells.
  • the implementation of the method according to the invention comprises the identification and the counting of the number of living cells in the set of cells .
  • a light source excites the fluorophore at a wavelength comprised between 480 and 520 nm, preferentially between 490 and 510 nm, more preferentially between 490 and 500 nm.
  • the light source excites the fluorophore at a wavelength of 495 nm.
  • the fluorophore After excitation, the fluorophore releases energy in the form of fluorescent light, the wavelength of which is between 500 and 540 nm, preferentially between 510 and 530 nm, even more preferentially at 520 nm.
  • the marked cells become visible and can be counted.
  • the set of cells can be a sample taken from a living organism, in particular a biological tissue, or even an organ or part of an organ in the same living organism. Mention will be made, by way of examples, of grafts, and in particular corneal grafts, bone marrow grafts and kidney grafts.
  • the living organisms are advantageously animals, in particular mammals, and more particularly humans.
  • the use or the method according to the invention can be implemented with the compound of general formula (I) as sole marker of cell viability.
  • it can be used with other known or future markers, in particular markers which make it possible to identify dead cells, so as to increase the contrast and facilitate the identification and counting of viable cells.
  • markers which make it possible to identify dead cells, so as to increase the contrast and facilitate the identification and counting of viable cells.
  • these other known markers mention may be made, for example, of Trypan blue.
  • the compounds of the present invention used as a cell marker and preferably as a cell viability marker find applications in many fields such as scientific research, cell and tissue therapy units, or even in the medical field with use for clinical diagnostics.
  • the absence of cellular toxicity of the compounds of the present invention thus allows a quantification of the cellular viability without altering the tissues and/or the cells analyzed. They can therefore be used for in vitro, ex vivo or even in vivo studies.
  • the compounds can in particular be used to measure the viability of a cell and/or tissue graft before its implantation, or else in order to follow the evolution of a pathological process, for example in the field of oncology.
  • the cells targeted by the labeling are in particular endothelial cells, and more particularly corneal endothelial cells.
  • the cells of interest are hematopoietic cells.
  • the compounds of the present invention find particular application in measuring the endothelial cell viability of corneal grafts intended for corneal transplantation, by staining corneal endothelial cells and counting living cells.
  • compositions and pharmaceutical compositions are provided.
  • the active ingredient can also be used in the form of a composition, in particular a pharmaceutical composition.
  • compositions according to the invention comprise a compound of general formula (I) according to the invention and a suitable vehicle for the use which will be made of the compound.
  • a suitable vehicle for the use which will be made of the compound.
  • the appropriate vehicle must not affect the viability of the cells.
  • the compositions according to the invention do not include toxic substances, or at least at toxic doses, which would affect cell viability.
  • Those skilled in the art are familiar with the various vehicles and excipients that can be used to allow the compound of general formula (I) to be applied to cells, and will be able to select them to promote the implementation of methods for verifying cell viability.
  • a preferred vehicle is water.
  • the term “pharmaceutical composition” designates a mixture of at least one active compound with at least one pharmaceutically acceptable excipient and/or vehicle. These pharmaceutical compositions are suitable for in vitro, ex vivo and in vivo use of the compounds of general formula (I) according to the invention.
  • compositions of the invention comprise a compound of general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt as active substance and a pharmaceutically acceptable excipient and/or vehicle.
  • excipient and the vehicle are "pharmaceutically acceptable” in the sense that they are compatible with the other ingredients of the composition and are non-toxic. Their use makes it possible in particular to facilitate the preparation, storage and administration of the active compound.
  • excipients and vehicles are well known to those skilled in the art, described in particular in the French or European pharmacopoeia.
  • compositions and vehicles include all solvents, dispersing media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, absorbents, and others that are physiologically compatible.
  • Examples of pharmaceutically acceptable excipients and vehicles are water, saline solutions, alcohols (glycerol, glycols), polyethers (polyethylene glycols, propylene glycols, poly(oxy)ethylene glycols and their derivatives ), polyethoxylated derivatives of castor oil (Kolliphor® EL, Cremophor® EL, and derivatives), hyaluronic acid, sodium hyaluronate, chondroitin sulphate, and in particular sodium chondroitin sulphate, carbomers, and in particular carbomer 974P, poloxamers, poloxamines, dextrans, vegetable oils (soybean oil, rapeseed oil, sunflower oil, olive oil, sweet almond oil, cottonseed oil, castor oil) and mineral oils (vaseline, paraffin), silicones, gelatins, agaroses (agar-agar), alginates, pectins, tragacanth, karaya gum, xanthan
  • the excipient and/or the pharmaceutically acceptable vehicle is chosen from water, polyethoxylated derivatives of castor oil, hyaluronic acid, sodium hyaluronate, sodium chondroitin sulfate, and carbomers.
  • compositions can be prepared by any method known to those skilled in the art.
  • An appropriate quantity of the compound of general formula (I) is mixed with an excipient and/or a pharmaceutically acceptable vehicle to obtain the desired formulation which must be compatible with the mode of administration.
  • composition according to the invention is advantageously a solution comprising the compound of general formula (I), in particular a solution, a suspension, an emulsion, a gel or an ointment or even a film.
  • the composition according to the invention is an aqueous composition.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a solution, gel or film.
  • the pharmaceutical composition is formulated for topical administration, and preferably for ophthalmic administration.
  • the pharmaceutical composition can thus be formulated in the form of eye drops, eye drops or eye drops, creams, ointments, gels and hydrogels.
  • compositions can also be prepared extemporaneously by mixing the compound of formula (I) according to the invention, alone or in the form of a composition, with the appropriate liquid vehicle for its use.
  • the composition which comprises the compound of general formula (I) can be in solid form (powder or tablets in particular) or else in the form of a concentrated liquid.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably in the form of an aqueous composition. It is particularly suitable for use in ophthalmology.
  • the pharmaceutical or non-pharmaceutical composition thus has a physiologically compatible pH, that is to say a pH of between 5 and 8. It therefore generally comprises a buffer suitable for ophthalmic use, known to those skilled in the art.
  • compositions of the invention may comprise other usual adjuvants used for the preparation of such pharmaceutical compositions such as co-solvents, softeners, antioxidants, opacifiers, stabilizers, ionic or nonionic thickeners, surfactants, viscosity agents, osmoprotectants, penetrating agents, gelling agents, silicones, anti-foaming agents, moisturizing agents, vitamins, perfumes, preservatives, fillers, sequestrants, colorants, bases or acids necessary for pH regulation, or any other ingredient usually used for the preparation of ophthalmic compositions.
  • preservatives generally employed in topical compositions are well known to those skilled in the art, such as quaternary ammoniums, in particular benzalkonium chloride, alkyl-dimethyl-benzylammonium, cetrimide, cetylpyridinium chloride, benzododecinium bromide, benzothonium chloride, cetalkonium chloride, mercurial preservatives, such as phenylmercuric nitrate/acetate/borate, thiomersal, alcoholic preservatives, such as chlorobutanol, benzyl alcohol, phenylethanol, phenylethyl alcohol, carboxylic acids, such as sorbic acid, phenols, in particular methyl/propyl paraben, amidines, for example chlorhexidine digluconate and/or chelating agents such as EDTA alone or in combination with at least
  • compositions without preservatives according to the invention differs from a simple composition comprising the same ingredients and obtained without showing any particular precautions or describing the stages of the process making it possible to obtain this characteristic sterility of the pharmaceutical compositions according to the invention, in particular ophthalmic compositions.
  • the compounds of the present invention can be used in combination with one or more therapeutic agents.
  • the administration of different active substances can be simultaneous, sequential or spaced out over time. Preparation process
  • the first step is the reaction of diphenol (II) with diphosgene (trichloromethyl chloroformate, CAS [503-38-8]), or a derivative such as phosgene (carbonyl dichloride, CAS [75-44-5]) or triphosgene (bis(trichloromethyl carbonate), CAS [32315-10-9]).
  • diphenol reacts with diphosgene.
  • the reaction temperature is between 40 and 80°C.
  • the reaction temperature is preferably between 50 and 70° C., more preferably between 55 and 65°C. In one embodiment, the reaction temperature is between 57 and 63°C, and more preferably the reaction temperature is about 60°C.
  • the reaction is carried out in an anhydrous organic solvent, and preferably in a chlorinated solvent, such as chloromethane, dichloromethane, chloroform, tetrachloromethane, trichloroethylene, 1,1,1-trichloroethane, 1,2-dichloroethane, etc
  • a chlorinated solvent such as chloromethane, dichloromethane, chloroform, tetrachloromethane, trichloroethylene, 1,1,1-trichloroethane, 1,2-dichloroethane, etc
  • the reaction solvent is 1,2-dichloroethane.
  • Other solvents in anhydrous form such as diethyl ether, dibutyl ether, tetrahydrofuran (THF) and dioxane can also be used.
  • a base can optionally be used for this reaction.
  • Bases of the tertiary and or hindered secondary amine type such as triethylamine, isopropylamine, diisopropylamine, N,N-diisopropylethylamine, pyrrolidine, pyridine, etc., will be chosen. In one embodiment, the use of triethylamine or diisopropylethylamine will be preferred.
  • the intermediate compound (III), is thus obtained after evaporation of the reaction medium.
  • the condensation reaction takes place at a temperature between 50 and 90°C, preferably between 60 and 80°C.
  • the reaction temperature is between 65 and 75°C, preferably between 68 and 72°C.
  • a temperature of about 70°C will be chosen.
  • the reaction solvent is an anhydrous organic solvent, preferably a chlorinated solvent, such as chloromethane, dichloromethane, chloroform, tetrachloromethane, trichloroethylene, 1,1,1-trichloroethane, 1,2-dichloroethane, etc. .
  • the reaction solvent is 1,2-dichloroethane.
  • Other solvents in anhydrous form such as diethyl ether, dibutyl ether, THF and dioxane can also be used.
  • a base of the tertiary amine type will preferably be used, such as triethylamine, isopropylamine, diisopropylamine, N,N-diisopropylethylamine, pyrrolidine, pyridine, etc.
  • triethylamine or diisopropylethylamine will be the bases selected for the reaction.
  • Figure 3 Images of HEL-299 cells obtained using the MVX10 macroscope under the FITC filter following staining: A: Calcein-AM (4 mM); B: F4267 (4mM); C: F4267 (40 mM) (x2.5 and x6.3 objectives respectively for the first and second line).
  • Figure 4 Endothelial cell loss of human corneas preserved in organoculture and brought into contact with the product F4267 (40 mM) either repeatedly every day for 7 days or once on D0, before each being exposed daily to the light under FITC filter
  • Figure 5 Viability measured in % by fluorescence analysis on human corneas, one of which is incubated daily with the product F4267 (images A and A') and the other uniquely (images B and B') on D0 , but both exposed daily to light under the FITC filter. Images A and B represent the fluorescence after incubation with the product F4267 on D0 and images A' and B' represent the fluorescence after incubation with Calcein-AM at the end of the experiment on D7 to measure cell viability.
  • Figure 6 Images of B4G12 cells obtained using an epifluorescence microscope under the FITC channel and after labeling with calcein-AM (4 mM) and the product F4267 (40 mM) with and without rinsing with PBS according to example 5.
  • Figure 7 Images of B4G12 cells obtained using an epifluorescence microscope under the FITC channel after labeling for 5 days with calcein-AM (4 mM) and the product F4267 (40 mM), with and without rinsing in PBS, according to Example 5.
  • Figure 8 Images of B4G12 cells obtained using an epifluorescence microscope under the DAPI channel (405 nm) after labeling for 5 days with calcein-AM (4 mM) and the product F4267 (40 mM), with and without rinsing with PBS, according to Example 5.
  • fluorescein dicarbonate The general synthesis of “fluorescein dicarbonate” compounds is carried out from fluorescein or corresponding derivatives.
  • the synthesis takes place in 2 steps: a) the fluorescein or the corresponding derivative reacts with a phosgene-generating reagent (phosgene, diphosgene or triphosgene) in the presence of a base and the solvent is evaporated, b) the synthesis intermediate obtained reacts with an alcohol in the presence of a base to obtain the final compound of general formula (I). a) Synthesis protocol in the presence of primary alcohols
  • the reaction medium is poured into water and extracted with DCM.
  • the organic extracts are combined, washed with water, then with saturated aqueous NaCl solution, dried over MgSC, and the solvent is evaporated by rotary evaporation.
  • the crude product is finally purified by column chromatography on silica gel (AcOEt/EP) to obtain the desired product.
  • b) Synthesis protocol in the presence of secondary alcohols Diphosgene (6 eq) then diisopropylethylamine (7 eq) are successively added dropwise to a suspension of fluorescein (1 eq.) in DCE.
  • the reaction mixture is heated at 60° C. for 2 hours.
  • the solvent is evaporated with a Schlenk line and the product is dried for several hours in the dark.
  • Fluorescein pentyl dicarbonate is purified on silica gel (AcOEt/EP 15:80) and isolated in the form of a transparent oil (36%).
  • Lactate Dehydrogenases are a family of ubiquitous cytosolic enzymes present in almost all cell types. Membrane damage causes a release of LDH into the external environment. There is a direct correlation between cellular cytotoxicity which causes membrane damage and the amount of LDH present in the extracellular environment. In the cytotoxicity test, LDH is measured by the enzymatic reaction shown in Figure 1. LDH transforms pyruvate into lactate at the same time as there is reduction of NAD+ into NADH. The NADH thus produced reacts with fluorescent or luminescent molecules.
  • the cytotoxicity test was carried out with the tetrazolium salt (INT) which is converted into formazan. The coloration was then studied using a spectrophotometer. Since the concentration of formazan is proportional to the quantity of LDH present in the medium, the latter was quantified by an absorbance reading at 555 nm, against a blank measurement at 650 nm to eliminate the parasitic absorbance from the medium. The percentage of dead cells is then calculated from the formula below, with the maximum LDH activity being that of a well in which all the cells have been lysed, and the basal LDH activity, that of a well not treaty.
  • INT tetrazolium salt
  • cytoplasmic labeling by compound 1 on cells was evaluated on the adherent line of normal human fetal lung fibroblasts HEL299 [ATCC CCL-137], because they form a cell monolayer (a single thickness facilitating the evaluation of cell morphology and enumeration).
  • a macroscope macro-zoom microscope, MVX10, Olympus, Tokyo, Japan
  • the cytotoxicities were 26.4 ⁇ 14.1% for calcein-AM, 7.3 ⁇ 3.4% for F4267 at 40 mM and 21.6 ⁇ 2.7% for F4267 at 1000 mM.
  • the cytotoxicities were 18.8 ⁇ 11.1% for calcein-AM, 6.1 ⁇ 0.9% for F4267 at 40 mM and 22.3 ⁇ 3.8% for F4267 at 1000 mM ( Figure 2).
  • the labeling of the FIEL299 cells made it possible to visualize the cellular cytoplasms in a similar way with the solution of Calcein-AM [4 mM] and with the solution F4267 respectively at [4 mM] and [40 mM] (FIG. 3).
  • Example 3 Ex vivo study on endothelium of whole corneas, of the “cornea bank test” type
  • the cytotoxicity of compound 1 was evaluated on the endothelium of whole corneas, using pairs of human corneas, preserved in organoculture and refused for transplantation by a cornea bank.
  • the 2 corneas from the same donor have the same biological characteristics and constitute the best comparator of each other.
  • Endothelial Cell Density ECD was first assessed before experimentation using cell counting by image analysis [Cell Tissue Bank, 2017, 18 (2), 185-191, Jumelle et al.], then the endothelium of the two corneas was brought into contact with a solution of F4267 [40 mM] for 45 minutes at ambient temperature, under sterile conditions [Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011, 52 (8), 6018-6025, Pipparelli et al.].
  • the corneas were then observed under the MVX10 macroscope with the x0.8 objective under the FITC filter, then returned to organ culture.
  • the cornea of the right eye (OD) was brought into contact daily with a solution of F4267 [40 mM in OptiMEM, 45 minutes, room temperature] for 7 days while the cornea from the left eye (LE) was only incubated with optiMEM (solvent alone).
  • the corneas were exposed daily to blue light from the FITC filter (same XCite lamp intensity at 12/100) under the x0.8 objective of the MVX10 macroscope.
  • the quality of the cytoplasmic labeling by compound 1 (solution F4267) on corneal endothelium was compared with that of Calcein-AM by staining paired corneas.
  • the DCE in viable cells on D7 after bringing the cornea of the OD into daily contact with the product F4267 followed by observation at low magnification for 7 days, was 1832 cells/mm 2 .
  • This DCE was 1612 cells/mm 2 for a single contact of the LA cornea but also with daily exposure to light The cell loss is therefore comparable indicating that repeated incubation is well tolerated ( Figure 4) .
  • the images in Figure 5 illustrate the viability measured in % after labeling with Calcein-AM on day 7 by fluorescence image analysis: cornea A (OD) brought into contact every day repeatedly for 7 days with the product F4267, cornea B (OG) brought into contact in a single way on D0 but both exposed daily to light under the FITC filter.
  • the product F4267 [40 mM] allows labeling distinguishing the dead cells from the living cells (FIGS. 5A and 5B, at D0). In addition, it has been shown that the product F4267 [40 mM] allows marking to distinguish dead cells from living cells in a manner similar to Calcein-AM [4 mM] on the whole cornea.
  • Corneal endothelial cells (B4G12), fibroblasts (Hel-299) and corneal epithelial cells (FICE-2) were cultured on an 8-well culture slide (LabTek, 177445) for 5 days in culture media corresponding and described below.
  • Culture medium B4G12 ⁇ Gentamycin, OptiMEM, SVFD, CaICh, Ascorbic acid, EGF, Chondroitin sulfate, SB203580, Y27632.
  • HCE-2 culture medium DMEM GlutaMax, F12-FIAM, SVFD, Antibiotic/mycotic, EGF.
  • Hel-299 culture medium DMEM GlutaMax, SVFD, AT B/M
  • cell labeling is carried out for 45 minutes with solutions comprising calcein-AM or the product F4267 at different concentrations (solutions A, B, C and D), before rinsing with PBS. Then the culture wells are removed, and the slide is mounted with a coverslip and Vectashield.
  • Solution A calcein-AM (4 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500)
  • Solution C F4267 (4 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500)
  • Solution D F4267 (400 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500)
  • the slides are then observed under a macroscope with x0.8 and x6.3 magnification and under an epifluorescence microscope with x10 and x60 magnification.
  • the different wells are observed under the same conditions at each magnification to allow a comparison of the intensities and the quality of the labeling with identical image processing.
  • the experiment is carried out with FICEC-B4G12 corneal endothelial cells (CVCL 2065).
  • the cells are thawed and cultured in their culture medium.
  • the cells are trypsinized once a week before being seeded in wells of a 24-well plate at a concentration of 1.10 5 cells/mL.
  • the cells are then incubated for 5 days at 37° C., 5% CO2 until 90% confluence.
  • the various wells are stained daily with calcein-AM (4 mM) or the product F4267 (40 mM), according to the following conditions: labeling for 45 minutes, then rinsing with PBS or labeling for 45 minutes without rinsing.
  • the marking and possibly rinsing step is repeated every day for 4 successive days, then after 2 days without marking, the marking is again repeated for 2 consecutive days.
  • the labeling steps are carried out in duplicate. After each labeling, one well for each of the conditions is observed in epifluorescence microscopy (Olympus 1X81 microscope, FITC channel, x4 objective, L:25, Texp: 142.7ms), while the second well (control) is kept in the darkness in order to evaluate the impact of the fluorescence observation at the end of the study. On the last day of the study, labeling is carried out with calecin-AM (4 mM) in the presence of Floescht (1/500) or the product F4267 (40 mM) in the presence of Floescht (1/500), and the wells are imaged in MIA x4 (reconstruction of several fields to obtain a complete image of the well).
  • the labeling steps are carried out in a clean room under PSM to ensure sterility, and the culture dishes are parafilmed during observation to limit possible contamination.
  • FIGS. 6 and 7 represent the cell layers observed on D0, therefore the first day of labeling and on D5, ie the last day of labeling. It appears that the cell layers of cells marked with calcein-AM are less dense whether for the experiments in the presence or in the absence of rinsing, unlike the cell layers whose cells have been marked with F4267.
  • Figure 8 corresponding to the images of the cells under the DAPI channel confirms the absence of a cell layer for the cells labeled with calcein-AM.

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Abstract

La présente invention concerne des composés dérivés de fluorescéine, et leur utilisation en tant que marqueurs fluorescents. Ils peuvent notamment être utilisés en biologie et en médecine, particulièrement dans le domaine de l'ophtalmologie. Les dérivés de fluorescéine non-fluorescents sont activés dans la cellule permettant alors la détection des cellules vivantes ainsi que la quantification de la viabilité cellulaire grâce à la fluorescence, et en absence de toxicité cellulaire.

Description

UTILISATION DE DÉRIVÉS DE DICARBONATE DE FLUORESCEINE COMME MARQUEUR CELLULAIRE
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne des composés dérivés de fluorescéine, et leur utilisation en tant que marqueurs fluorescents. Ils peuvent notamment être utilisés en biologie et en médecine, particulièrement dans le domaine de l’ophtalmologie. Les dérivés de fluorescéine non-fluorescents sont activés dans la cellule vivante permettant alors la détection des cellules vivantes ainsi que la quantification de la viabilité cellulaire grâce à la fluorescence, et en absence de toxicité cellulaire.
ARRIERE PLAN DE L’INVENTION
La greffe de cornée est la greffe la plus répandue dans le monde parmi toutes les greffes de cellules et d’organes avec plus de 100 000 greffes réalisées chaque année. La cornée, seul tissu transparent du corps, joue un rôle essentiel dans la réfraction de la lumière qui est dirigée vers la rétine. Une altération de celle-ci conduit à une baisse de l’acuité visuelle, voire à une perte de la vision. La greffe de cornée est ainsi nécessaire dans de nombreuses pathologies telles que la dystrophie de Fuchs et les dystrophies bulleuses, les kératites infectieuses et le kératocône, mais est aussi utilisée dans les cas de traumatisme perforant comme les accidents ou les brûlures.
Les cornées à greffer sont prélevées sur les donneurs et conservées dans des banques des yeux, également appelées banques de cornées. Avant d’effectuer la greffe, il est essentiel de vérifier la qualité du greffon, plusieurs facteurs pouvant être responsables d’une éventuelle altération tels que l’état de santé du donneur, les conditions de prélèvement et/ou les conditions de conservation. Dans ce but, il est essentiel que la viabilité des cellules endothéliales des greffons cornéens soit mesurée.
De nombreuses techniques pour la quantification de la viabilité cellulaire existent, mais ces tests sont en général destructifs, toxiques ou imparfaits, c’est-à-dire qu’ils ne permettent pas une estimation précise de qualité de la viabilité de l’échantillon.
Parmi les méthodes de mesure de viabilité de cellules, on peut citer l’utilisation de colorants comme le bleu de Trypan (CAS [75-57-1]) et les sels de tétrazolium (CAS [298-93- 1]), ou de fluorophores comme par exemple l’orange d’acridine (CAS [260-94-6]) et le DAPI ou Di Amido Phenyl Indol (CAS [28718-90-3]). D’autres composés encore permettent à la fois une coloration et une visualisation des cellules par fluorescence. Tel est le cas du composé résazurine (CAS [550-82-3]).
Cependant ces colorants ou fluorophores ne permettent pas une mesure de la viabilité cellulaire sans altérer les cellules et par conséquent les échantillons analysés. En effet, les colorants diffusent dans l’ensemble des cellules. Les cellules vivantes les excluent tandis que les cellules non-viables les absorbent et deviennent visibles. Une première limite à leur utilisation est par conséquent la surestimation de la proportion de cellules vivantes puisque seules les cellules à un stade de mort cellulaire avancé sont détectées. Une seconde limite est l’intensité de la coloration qui est souvent faible rendant les cellules peu, voire pas, visibles (Graefe’s Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology, 1986, 224, 428-434).
Les fluorophores permettent quant à eux de distinguer les cellules vivantes, mais leurs accumulations au sein des cellules conduisent à terme à la mort cellulaire.
Une autre approche de la mesure de la viabilité cellulaire est l’utilisation de sondes fluorescentes comprenant un ou des groupements fluorochromes qui sont libérés suite à une réaction de clivage. Les cellules deviennent alors visibles par fluorescence et peuvent être facilement étudiées sous microscopie en fluorescence {Anal. Chem., 2019, 91, 2255-2259 ; Biochemistry : Rottman and Papermaster, 1966, 55, 134-141). De tels composés sont aussi utilisés dans d’autres domaines techniques (JP 2009-006635, JP 2005-091802). L’utilisation de ces sondes fluorescentes présente de nombreux avantages. C’est une méthode sélective, rapide et facile à mettre en oeuvre. De plus, les sondes fluorescentes permettent de travailler sur des cellules vivantes de manière in vitro ou in vivo. Le signal émis est généralement de bonne qualité : il est spécifique, durable et fort. Un des exemples de sonde fluorescente largement utilisée pour la mesure de la viabilité cellulaire est la Calcéine- AM.
Calcéine-AM
Cette molécule pénètre dans les cellules, est hydrolysée par les estérases et le fluorochrome est libéré. Cependant, parallèlement à la libération du fluorochrome, des molécules de formaldéhyde sont produites, entraînant une toxicité pour la cellule. L’utilisation de la calcéine-AM est donc limitée, voire impossible, pour des applications où la préservation de la viabilité des cellules ou des tissus étudié(e)s est recherchée {IOVS, 2011 , 52, 6018- 6025). Il existe donc un besoin de développer de nouveaux marqueurs fluorescents pour la quantification de la viabilité cellulaire tout en préservant cette viabilité.
Les inventeurs ont ainsi développé un nouveau marqueur, appelé dans la présente invention « dicarbonate de fluorescéine ». Cette sonde fluorescente permet une mesure objective, précise, et non toxique de la viabilité cellulaire.
BREVE DESCRIPTION DE L’INVENTION
L’invention concerne un composé de formule générale (I), caractérisé en ce que :
- R1 est choisi parmi
- un alkyle C3-C20,
- un polyéthylène glycol ou un polypropylène glycol,
- les dérivés de l’acide malique et les esters correspondants,
- les sucres, et
- les polysaccharides naturels ;
- X1 est choisi parmi H, Cl, F, Br et NO2 ;
- X2 est choisi parmi H, Cl, Br et N(CH2CC>2H)2 ;
- R2 est choisi parmi H, NCS et CO2R3 ;
- R3 est choisi parmi H ou un alkyle C1-C3 ; et ses sels pharmaceutiquement acceptables.
L’invention couvre aussi l’utilisation du composé de formule générale (I) comme marqueur cellulaire, et préférentiellement comme marqueur de la viabilité cellulaire.
L’invention concerne par ailleurs, une composition pharmaceutique comprenant le composé de formule générale (I) et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.
L’invention trouve son application dans le domaine de la biologie humaine, animale et végétale. Elle est préférentiellement utilisée dans le domaine de l’ophtalmologie.
Enfin, un procédé de préparation du composé de formule générale (I) est décrit, le procédé comprenant les étapes de : a) réaction entre un diphénol de formule (II) avec du phosgène ou un dérivé de celui-ci en présence de base, et b) réaction de l’intermédiaire obtenu (III), avec un alcool primaire ou secondaire de formule (IV) R1OH, en présence de base, avec les groupements R1, R2, X1, X2 tels que définis précédemment.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
L’invention concerne un composé de formule générale (I), caractérisé en ce que :
- R1 est choisi parmi
- un alkyl C3-C20,
- un polyéthylène glycol, un polypropylène glycol,
- les dérivés de l’acide malique et les esters correspondants,
- les sucres, et
- les polysaccharides naturels ;
- X1 est choisi parmi H, Cl, F, Br et NO2 ;
- X2 est choisi parmi H, Cl, Br et N(CH2CC>2H)2 ;
- R2 est choisi parmi H, NCS et CO2R3 ;
- R3 est choisi parmi H ou un alkyle C1-C3 ; et ses sels pharmaceutiquement acceptables.
Ces composés, aussi appelés « dicarbonate de fluorescéine » dans le cadre de l’invention, sont constitués d’un fluorochrome, la fluorescéine (CAS [2321-07-5]) ou un dérivé correspondant, et de groupements carbonate de type R1-0-C(=0)-0 qui confèrent aux molécules leurs propriétés de solubilité et de stabilité. Définitions
Les composés de formule générale (I) ou sels pharmaceutiquement acceptables peuvent comporter un ou plusieurs stéréocentres, chacun pouvant exister indépendamment des autres sous une configuration R ou S. Les composés décrits sont donc sous des formes racémiques ou optiquement actives.
Le terme « sels pharmaceutiquement acceptables » désigne des dérivés des composés de formule générale (I) pour lesquels les groupements acides et/ou basiques existent sous leur forme de sel. Les sels pharmaceutiquement acceptables dans le cadre de la présente invention comprennent des sels non-toxiques conventionnels. Les sels pharmaceutiquement acceptables selon l’invention apparaîtront de manière évidente pour l’homme du métier. Des exemples de sels pouvant être utilisés sont le chlorure de calcium, le chlorure de potassium, le chlorure de magnésium, l’hydrogénophosphate, le phosphate, l’édetate, le citrate, le lactate, le hyaluronate, le borate de sodium et le stéarate.
Le terme « alkyl » désigne une chaîne carbonée linéaire et/ou ramifiée. Le terme « Ca- Cb », où a et b sont des entiers, correspond au nombre d’atomes de carbone. Ainsi le terme « alkyl C3-C20 » désigne une chaîne linéaire ou ramifiée comprenant de 3 à 20 atomes de carbone. Des exemples de groupements alkyl C3-C20, mais sans s’y limiter, sont propyl, iso- propyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, iso-pentyl, hexyl, iso-hexyl, heotyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl et dodecyl.
Le terme « polyéthylènes glycol » désigne dans le cadre de la présente invention, les polyéthylènes glycols ou poly(oxyde d’éthylène)s de masse molaire moyenne allant de 200 à 8000 g/mol. Quant au terme « polypropylènes glycol », cette dénomination regroupe dans le cadre de la présente invention, les composés polymères de type propylène glycol ayant une masse molaire moyenne allant de 200 à 600 mol/g.
Par « dérivés de l’acide malique et esters correspondants », on entend dans le cadre de la présente invention un groupement défini par la formule générale (V), o , pour laquelle R4 et R4’ sont indépendamment choisis parmi un hydrogène ou un alkyl C1-C6.
Le terme « sucres » désigne les composés glucose, fructose, galactose, mannose, saccharose, lactose, maltose et sorbitol.
Par « polysaccharides naturels », on entend dans le cadre de la présente invention des polysaccharides d’origine végétale, telle que la cellulose, l’amidon, l’agarose, l’alginate et l’inuline, et des polysaccharides d’origine animale tels que l’acide hyaluronique ou hyaluronate, la chitine et le chitosane. La fluorescéine peut exister sous deux formes tautomères : une forme fermée et une forme ouverte (formules VI et VII).
Par « dérivé correspondant de la fluorescéine », on entend dans le cadre de la présente invention le groupement fluorochrome de la fluorescéine substitué par les groupements X1, X2 et R2 tels que définis précédemment et représenté par la structure ci- dessous (formule VIII). Comme précédemment décrit pour la fluorescéine, il est entendu que les dérivés correspondant de la fluorescéine peuvent exister sous leur forme tautomère.
Composés
La présente invention concerne un composé de formule générale (I), caractérisé en ce que :
- R1 est choisi parmi
- un alkyle C3-C20,
- un polyéthylène glycol ou un polypropylène glycol,
- les dérivés de l’acide malique et les esters correspondants,
- les sucres, et
- les polysaccharides naturels ;
- X1 est choisi parmi H, Cl, F, Br et NO2 ;
- X2 est choisi parmi H, Cl, Br et N(CH2CC>2H)2 ;
- R2 est choisi parmi H, NCS et CO2R3 ; et
- R3 est choisi parmi H ou un alkyle C1-C3 ; et ses sels pharmaceutiquement acceptables. Dans un mode de réalisation, le groupement R1 est un alkyl C5-C10. Dans un mode de réalisation préféré, R1 est choisi parmi les groupements n-pentyl et n-décyl. Les groupements alkyles peuvent être linéaires ou ramifiés, ainsi dans un mode de réalisation particulier, le groupement R1 est un alkyl C3-C20 linéaire.
Dans un autre mode de réalisation, R1 est un dérivé de l’acide malique ou un ester correspondant, c’est-à-dire que R1 est définit par la formule , dans laquelle R4 et R4’ sont choisis parmi un hydrogène ou un alkyl C1-C6. Les groupements R4 et R4’ peuvent être différents ou identiques. Dans un mode de réalisation, les groupements R4 et R4’ sont identiques. Dans un mode de réalisation préférée, R4 et R4’ sont des hydrogènes. Dans un autre mode de réalisation préféré, R4 et R4’ sont un alkyl C1-C6, préférentiellement R4 et R4’ sont des éthyles.
Dans un mode de réalisation, le groupement R2 est un hydrogène.
Dans un mode de réalisation, le groupement X1 est un hydrogène.
Dans un mode de réalisation, le groupement X2 est un hydrogène.
Dans un mode de réalisation, les groupements R2, X1 et X2 sont des hydrogènes.
Utilisations
Les composés de formule générale (I) ou les sels pharmaceutiquement acceptables sont utilisés pour le marquage cellulaire, en tant que marqueurs fluorescents, et plus particulièrement pour le marquage de la viabilité cellulaire.
Les composés de la présente invention comprennent au sein de leur structure un fluorochrome : la fluorescéine ou un dérivé correspondant. L’hydrolyse des groupements carbonate R1-0-C(=0)-0 par les estérases après pénétration dans la cellule, libère le fluorochrome ainsi que des sous-produits notamment du dioxyde de carbone et l’alcool de type R1-OH.
Les groupements R1 tels que définis pour les composés de formule (I) ou les sels pharmaceutiquement acceptables sont préférentiellement des groupements dépourvus de toxicité cellulaire.
La fluorescence émise par le fluorochrome ainsi libérée est visible par des techniques bien connues de l’homme du métier. La visualisation de la fluorescence peut se faire à l’œil nu ou à l’aide d’appareils tels que des lunettes ou des microscopes, et nécessite généralement l’application sur le fluorophore d’une lumière à une longueur d’onde comprise généralement entre 480 et 520 nm.
L’hydrolyse des composés de la présente invention s’effectue au niveau du cytoplasme. En absence de réactivité des estérases, aucune réaction de clivage ne se produit et aucune fluorescence ou coloration des cellules n’est par conséquent observée. Les composés de formule générale (I) ou les sels pharmaceutiquement acceptables sont ainsi utilisés pour la quantification de la viabilité cellulaire. En effet, l’activité des estérases ubiquitaires étant proportionnelle à la viabilité des cellules, l’intensité du signal émis par le fluorochrome libéré est elle aussi proportionnelle à l’activité cellulaire et seules les cellules vivantes sont détectées.
L’absence de toxicité cellulaire permet une utilisation des composés de la présente invention à la fois in vitro et in vivo sans altérer les cellules, et tout en permettant de conserver leur viabilité. Les produits libérés lors de l’hydrolyse des groupements carbonates R1-0-C(=0)- O sont du dioxyde de carbone, des alcools de type R1-OH ainsi que le fluorochrome : la fluorescéine ou un dérivé correspondant.
L’invention concerne aussi une méthode de marquage cellulaire d’un ensemble de cellules qui comprend les étapes de mettre en contact les cellules avec un composé de formule générale (I) selon l’invention, puis de vérifier la présence de coloration ou fluorescence dans l’ensemble de cellules.
L’invention concerne aussi une méthode de vérification de la viabilité cellulaire d’un ensemble de cellules qui comprend les étapes de mettre en contact les cellules avec un composé de formule générale (I) selon l’invention, puis de vérifier la présence de coloration ou fluorescence dans l’ensemble de cellules. La fluorescence ou coloration qui est le résultat de la lyse cellulaire du composé de formule générale (I) libérant le chromophore ou fluorophore dérivé de fluorescéine permet de conclure quant à la présence de cellules vivantes.
Dans un mode particulier de l’utilisation des composés de formule générale (I) selon l’invention, la mise en oeuvre de la méthode selon l’invention comprend l’identification et le comptage du nombre de cellules vivantes dans l’ensemble de cellules.
Les moyens d’identifier les cellules et de les compter sont bien connus de l’homme du métier. Les cellules, préalablement marquées à l’aide des composés de la présente invention, sont visualisées à l’aide d’un microscope ou d’un macroscope en fluorescence ou avec tout autre appareil permettant de détecter la fluorescence. Une source lumineuse excite le fluorophore à une longueur d’onde comprise entre 480 et 520 nm, préférentiellement entre 490 et 510 nm, plus préférentiellement entre 490 et 500 nm. De manière avantageuse, la source lumineuse excite le fluorophore à une longueur d’onde de 495 nm. Après excitation, le fluorophore libère de l’énergie sous forme de lumière fluorescente, dont la longueur d’onde est comprise entre 500 et 540 nm, préférentiellement entre 510 et 530 nm, encore plus préférentiellement à 520 nm. Les cellules marquées deviennent visibles et peuvent être comptabilisées.
L’ensemble des cellules peut être un échantillon prélevé dans un organisme vivant, en particulier un tissu biologique, ou encore un organe ou une partie d’organe dans le même organisme vivant. On citera à titre d’exemples les greffons, et notamment les greffons cornéens, les greffons de moelle osseuse et les greffons de rein. Les organismes vivants sont avantageusement des animaux, en particulier des mammifères, et plus particulièrement l’homme.
L’utilisation ou la méthode selon l’invention peuvent être mises en oeuvre avec le composé de formule générale (I) comme seul marqueur de la viabilité cellulaire. Alternativement, il peut être employé avec d’autres marqueurs connus ou à venir, en particulier des marqueurs qui permettent d’identifier les cellules mortes, de manière à augmenter le contraste et faciliter l’identification et le décompte des cellules viables. Parmi ces autres marqueurs connus, on peut citer par exemple le bleu de Trypan.
Les composés de la présente invention utilisés en tant que marqueur cellulaire et préférentiellement en tant que marqueur de la viabilité cellulaire trouvent des applications dans de nombreux domaines tels que la recherche scientifique, les unités de thérapie cellulaire et tissulaire, ou encore dans le domaine médical avec une utilisation pour les diagnostics cliniques. L’absence de toxicité cellulaire des composés de la présente invention permet ainsi une quantification de la viabilité cellulaire sans altérer les tissus et/ou les cellules analysé(e)s. Ils peuvent donc être utilisés pour des études in vitro, ex vivo ou encore in vivo.
En médecine vétérinaire ou humaine, les composés peuvent notamment être utilisés pour mesurer la viabilité d’un greffon cellulaire et/ou tissulaire avant son implantation, ou encore afin de suivre l’évolution d’un processus pathologique par exemple dans le domaine de l’oncologie.
Dans le cadre de la présente invention, les cellules visées par le marquage sont notamment les cellules endothéliales, et plus particulièrement les cellules endothéliales cornéennes. Dans un mode de réalisation, les cellules d’intérêt sont les cellules hématopoïétiques.
Dans le domaine de l’ophtalmologie, les composés de la présente invention trouvent une application particulière dans la mesure de la viabilité cellulaire endothéliale des greffons cornéens destinés à la greffe de cornée, par la coloration des cellules endothéliales cornéennes et le dénombrement des cellules vivantes.
Compositions et compositions pharmaceutiques
Bien qu’il soit possible que l’ingrédient actif soit employé seul, il peut aussi être utilisé sous la forme d’une composition, en particulier une composition pharmaceutique.
Les compositions selon l’invention comprennent un composé de formule générale (I) selon l’invention et un véhicule approprié pour l’usage qui sera fait du composé. Pour les usages et méthodes privilégiés que sont le marquage cellulaire in vitro ou in vivo, il est entendu que le véhicule approprié ne doit pas affecter la viabilité des cellules. Il est entendu que les compositions selon l’invention ne comprennent pas de substances toxiques, ou pour le moins à des doses toxiques, qui affecteraient la viabilité des cellules. L’homme du métier connaît bien les différents véhicules et excipients pouvant être employés pour permettre d’appliquer le composé de formule générale (I) sur les cellules, et saura les sélectionner pour favoriser la mise en oeuvre des méthodes de vérification de la viabilité cellulaire. Un véhicule préféré est l’eau.
Tel qu’utilisé dans le cadre de la présente invention, le terme « composition pharmaceutique » désigne un mélange d’au moins un composé actif avec au moins un excipient et/ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions pharmaceutiques sont appropriées pour un usage in vitro, ex vivo et in vivo des composés de formule générale (I) selon l’invention.
Ainsi, les compositions pharmaceutiques de l’invention comprennent un composé de formule générale (I) ou un sel pharmaceutiquement acceptable en tant que substance active et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.
L’excipient et le véhicule sont « pharmaceutiquement acceptables » dans le sens où ils sont compatibles avec les autres ingrédients de la composition et sont non-toxiques. Leur utilisation permet notamment de faciliter la préparation, la conservation et l’administration du composé actif. De tels excipients et véhicules sont bien connus de l’homme du métier, décrits notamment dans la pharmacopée française ou européenne.
Les excipients et véhicules pharmaceutiquement acceptables comprennent tous les solvants, les milieux de dispersion, les revêtements, les agents antibactériens et antifongiques, les agents isotoniques, les agents d’absorption, et autres qui sont physiologiquement compatibles.
Des exemples d’excipients et de véhicules pharmaceutiquement acceptables sont l’eau, les solutions salines, les alcools (le glycérol, les glycols), les polyéthers (les polyéthylène glycols, les propylène glycols, les poly(oxy)ethylène glycols et leurs dérivés), les dérivés polyéthoxylés de l’huile de ricin (Kolliphor® EL, Cremophor® EL, et dérivés), l’acide hyaluronique, le hyaluronate de sodium, le chondroïtine sulfate, et notamment le chondroïtine sulfate sodique, les carbomères, et notamment le carbomère 974P, les poloxamères, les poloxamines, les dextranes, les huiles végétales (huile de soja, huile de colza, huile de tournesol, huile d’olive, huile d’amande douce, huile de coton, huile de ricin) et les huiles minérales (vaseline, paraffine), les silicones, les gélatines, les agaroses (agar-agar), les alginates, les pectines, la tragacanthe, la gomme de karaya, la gomme de xanthane, la carraghénane, les carbohydrates (saccharose, lactose, l’amylose), les amidons (amidon de maïs, amidon de riz, amidon de pomme de terre, amidon de blé), les esters d’acides gras, la cellulose et ses dérivés (méthylcellulose, carboxyméthyl cellulose, hydroxyméthylcellulose, hydroxyéthylcellulose, hydroxypropylcellulose), etc. Dans un mode de réalisation préféré, l’excipient et/ou le véhicule pharmaceutiquement acceptables est choisi parmi l’eau, les dérivés polyéthoxylés de l’huile de ricin, l’acide hyaluronique, le hyaluronate de sodium, le chondroïtine sulfate sodique, et les carbomères.
Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées par n’importe quel procédé connu de l’homme du métier. Une quantité appropriée du composé de formule générale (I) est mélangée avec un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour obtenir la formulation souhaitée qui doit être compatible avec le mode d’administration.
La composition selon l’invention est avantageusement une solution comprenant le composé de formule générale (I), en particulier une solution, une suspension, une émulsion, un gel ou une pommade ou encore un film. De préférence, la composition selon l’invention est une composition aqueuse. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est sous la forme d’une solution, d’un gel ou d’un film.
Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est formulée pour une administration topique, et préférentiellement pour une administration ophtalmique. La composition pharmaceutique peut ainsi être formulée sous forme de gouttes oculaires, collyres ou instillations oculaires, crèmes, pommades, gels et hydrogels.
Les compositions liquides, pharmaceutiques ou non, peuvent aussi être préparées de manière extemporanée en mélangeant le composé de formule (I) selon l’invention, seul ou sous forme de composition, avec le véhicule liquide approprié pour son usage. Dans ce cas, la composition qui comprend le composé de formule générale (I) peut être sous forme solide (poudre ou comprimés en particulier) ou bien sous forme d’un liquide concentré.
La composition pharmaceutique de la présente invention se présente préférentiellement sous la forme d’une composition aqueuse. Elle est particulièrement adaptée pour une utilisation en ophtalmologie.
La composition pharmaceutique ou non présente ainsi un pH physiologiquement compatible, c’est-à-dire un pH compris entre 5 et 8. Elle comprend donc généralement un tampon approprié pour un usage ophtalmique, connu de l’homme du métier.
Les compositions de l'invention peuvent comprendre d’autres adjuvants usuels mis en oeuvre pour la préparation de telles compositions pharmaceutiques tels que les co-solvants, les adoucissants, les antioxydants, les opacifiants, les stabilisants, les épaississants ioniques ou non ioniques, les surfactants, les agents de viscosité, les agents osmoprotecteurs, les agents de pénétration, les agents de gélification, les silicones, les agents anti-mousse, les agents hydratants, les vitamines, les parfums, les conservateurs, les charges, les séquestrants, les colorants, les bases ou les acides nécessaires à la régulation du pH, ou tout autre ingrédient habituellement utilisé pour la préparation de compositions ophtalmiques.
Les agents conservateurs généralement employés dans des compositions topiques (cosmétiques, pharmaceutiques, ophtalmiques, etc.) pour éviter leur contamination par des germes, sont bien connus de l’homme du métier, comme les ammoniums quaternaires, notamment le chlorure de benzalkonium, l’alkyl-diméthyl-benzylammonium, le cétrimide, le chlorure de cétylpyridinium, le bromure de benzododécinium, le chlorure de benzothonium, le chlorure de cetalkonium, les conservateurs mercuriels, comme le nitrate/acétate/borate phénylmercurique, le thiomersal, les conservateurs alcooliques, comme le chlorobutanol, l’alcool benzylique, le phényléthanol, l’alcool phényléthylique, les acides carboxyliques, tels que l’acide sorbique, les phénols, en particulier méthyl/propyl parabène, les amidines, par exemple le chlorhexidine digluconate et/ou des agents chélateurs comme l'EDTA seul ou en association avec au moins un autre conservateur.
En l’absence de conservateurs, la composition doit subir un traitement particulier au cours de sa préparation et de son conditionnement de manière à éviter et prévenir la contamination par des pathogènes. Ces traitements et procédures sont bien connus de l’homme du métier. En ce sens, une composition sans conservateurs selon l’invention se distingue d’une simple composition comprenant les mêmes ingrédients et obtenue sans montrer de précautions particulières ni décrivant d’étapes du procédé permettant d’obtenir cette stérilité caractéristique des compositions pharmaceutiques selon l’invention, en particulier des compositions ophtalmiques.
Les composés de la présente invention peuvent être utilisés en association avec un ou plusieurs agents thérapeutiques. L’administration de différentes substances actives peut être simultanée, séquentielle ou espacée dans le temps. Procédé de préparation
La synthèse des composés de formule générale (I) est réalisée en deux étapes
Xf Xj successives a partir du diphenol (II), , sans isoler le compose intermédiaire (III)
La première étape est la réaction du diphénol (II) avec du diphosgène (chloroformiate de trichlorométhyle, CAS [503-38-8]), ou un dérivé tel que le phosgène (dichlorure de carbonyle, CAS [75-44-5]) ou le triphosgène (carbonate de bis(trichlorométhyle), CAS [32315- 10-9]). Dans un mode de réalisation préféré, le diphénol réagit avec du diphosgène.
La température de la réaction est comprise entre 40 et 80 °C. La température de réaction est préférentiellement comprise entre 50 et 70°C, plus préférentiellement entre 55 et 65 °C. Dans un mode de réalisation, la température de réaction est comprise entre 57 et 63 °C, et plus préférentiellement la température de la réaction est d’environ 60 °C.
La réaction est effectuée dans un solvant organique anhydre, et préférentiellement dans un solvant chloré, tel que le chlorométhane, le dichlorométhane, le chloroforme, le tétrachlorométhane, le trichloréthylène, le 1 ,1 ,1 -trichloroéthane, le 1 ,2-dichloroéthane, etc. Dans un mode de réalisation préféré, le solvant de la réaction est le 1 ,2-dichloréthane. D’autres solvants sous forme anhydre tel que le diéthyléther, le dibutyléther, le tétrahydrofurane (THF) et le dioxane peuvent aussi être employés.
Une base peut éventuellement être utilisée pour cette réaction. On choisira des bases de type amine tertiaire et ou secondaire encombré (non nucléophile), telle que la triéthylamine, l’isopropylamine, la diisopropylamine, la N,N-diisopropyléthylamine, la pyrrolidine, la pyridine, etc. Dans un mode de réalisation, l’utilisation de la triéthylamine ou de la diisopropyléthylamine sera préférée.
Le composé intermédiaire (III), , est ainsi obtenu après évaporation du milieu réactionnel.
Dans une deuxième étape, ce dernier réagit avec un alcool de formule générale (IV),
R1OH, pour former le composé de formule générale les sels pharmaceutiquement acceptables.
La réaction de condensation s’effectue à une température comprise entre 50 et 90 °C, préférentiellement entre 60 et 80 °C. Dans un mode de réalisation, la température de la réaction est comprise entre 65 et 75 °C, préférentiellement entre 68 et 72 °C. Dans un mode de réalisation préféré, on choisira une température d’environ 70 °C.
Le solvant de la réaction est un solvant organique anhydre, préférentiellement un solvant chloré, tel que le chlorométhane, le dichlorométhane, le chloroforme, le tétrachlorométhane, le trichloréthylène, le 1 ,1 ,1 -trichloroéthane, le 1 ,2-dichloroéthane, etc. Dans un mode de réalisation préféré, le solvant de la réaction est le 1 ,2-dichloréthane. D’autres solvants sous forme anhydre tel que le diéthyléther, le dibutyléther, le THF et le dioxane peuvent aussi être employés.
La réaction s’effectue en présence de base. Une base de type amine tertiaire sera préférentiellement utilisée, telle que la triéthylamine, l’isopropylamine, la diisopropylamine, la N,N-diisopropyléthylamine, la pyrrolidine, la pyridine, etc. Dans un mode de réalisation, la triéthylamine ou la diisopropyléthylamine seront les bases sélectionnées pour la réaction.
Les produits de formule générale (I) ou sels pharmaceutiquement acceptables sont obtenus après des étapes d’extraction et/ou purification.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Test de dosage de la LDH par réaction enzymatique
Figure 2 : Cytotoxicité de la calcéine-AM (4 mM) et du composé 1 en solution dans le CremophorOEL [CAS 61791 -12-6] (ratio molaire 1 / 1) désigné par la référence F4267 (40 mM et 1000 mM) sur les cellules HCE-2, exprimée en % en fonction du temps après mise en contact unique (0 =45 min, 24 h et 48 h).
Figure 3 : Images des cellules HEL-299 obtenues à l’aide du macroscope MVX10 sous le filtre FITC suite à une coloration : A : Calcéine-AM (4 mM) ; B : F4267 (4 mM) ; C : F4267 (40 mM) (objectifs x2.5 et x6.3 respectivement pour la première et deuxième ligne).
Figure 4 : Perte cellulaire endothéliale de cornées humaines conservées en organoculture et mises en contact avec le produit F4267 (40 mM) soit de manière répétée tous les jours pendant 7 jours soit de façon unique à J0, avant d’être exposée chacune quotidiennement à la lumière sous le filtre FITC
Figure 5 : Viabilité mesurée en % par analyse de la fluorescence sur des cornées humaines dont l’une est incubée quotidiennement avec le produit F4267 (images A et A’) et l’autre de façon unique (images B et B’) à J0, mais toutes deux exposées quotidiennement à la lumière sous le filtre FITC. Les images A et B représentent la fluorescence après incubation avec le produit F4267 à J0 et les images A’ et B’ représentent la fluorescence après incubation avec la Calcéine-AM en fin d’expérience à J7 pour mesurer la viabilité cellulaire.
Figure 6 : Images des cellules B4G12 obtenues à l’aide d’un microscope à épifluorescence sous le canal FITC et après marquage avec de la calcéine-AM (4 mM) et le produit F4267 (40 mM) avec et sans rinçage au PBS selon l’exemple 5.
Figure 7 : Images des cellules B4G12 obtenues à l’aide d’un microscope à épifluorescence sous le canal FITC après marquage pendant 5 jours avec de la calcéine-AM (4 mM) et le produit F4267 (40 mM), avec et sans rinçage au PBS, selon l’exemple 5.
Figure 8 : Images des cellules B4G12 obtenues à l’aide d’un microscope à épifluorescence sous le canal DAPI (405 nm) après marquage pendant 5 jours avec de la calcéine-AM (4 mM) et le produit F4267 (40 mM), avec et sans rinçage au PBS, selon l’exemple 5.
EXEMPLES
Les exemples donnés dans la présente demande sont illustratifs et ne limitent pas la portée de l’invention. Exemple 1 : Synthèse des composés
1. Abréviations
AcOEt Acétate d’éthyle
DCE 1 ,2-dichloroéthane
DCM Dichlorométhane
DMAP 4-Diméthylaminopyridine
DMSO Diméthylsulfoxyde
EP Ether de pétrole
HRMS Spectrométrie de masse de haute résolution
NMR Résonance magnétique nucléaire
2. Modes opératoires
La synthèse générale des composés « dicarbonates de fluorescéine » est réalisée à partir de fluorescéine ou de dérivés correspondants. La synthèse se fait en 2 étapes : a) la fluorescéine ou le dérivé correspondant réagit avec un réactif générant du phosgène (phosgène, diphosgène ou triphosgène) en présence de base et le solvant est évaporé, b) l’intermédiaire de synthèse obtenu réagit avec un alcool en présence de base pour obtenir le composé final de formule générale (I). a) Protocole de synthèse en présence d’alcools primaires
A une suspension de fluorescéine (1 eq.) dans du DCE sont successivement ajoutés du diphosgène (6 eq.) puis de la triéthylamine (1 eq.) goutte à goutte. Le mélange réactionnel est chauffé à 60 °C pendant 2 heures. Le solvant est évaporé avec une ligne de Schlenk et le produit est séché pendant plusieurs heures dans le noir. Dans un autre tube de Schlenk, l’alcool primaire (2 eq.) est dissout dans du DCE et de la triéthylamine (2 eq.) est ajoutée goutte à goutte. Le résidu de fluorescéine, précédemment obtenu, est dissout dans du DCE et la solution alcoolique est ajoutée au goutte à goutte pendant 10 minutes. Le mélange réactionnel est chauffé pendant 3 heures à 70 °C.
Le milieu réactionnel est versé dans de l’eau et extrait avec du DCM. Les extraits organiques sont combinés, lavés avec de l’eau, puis avec une solution aqueuse de NaCI saturée, séchés sur MgSC , et le solvant est évaporé par évaporation rotative. Le produit brut est finalement purifié par colonne chromatographie sur gel de silice (AcOEt/EP) pour obtenir le produit désiré. b) Protocole de synthèse en présence d’alcools secondaires A une suspension de fluorescéine (1 eq.) dans du DCE sont successivement ajoutés du diphosgène (6 eq) puis de la diisopropyléthylamine (7 eq) goutte à goutte. Le mélange réactionnel est chauffé à 60 °C pendant 2 heures. Le solvant est évaporé avec une ligne de Schlenk et le produit est séché pendant plusieurs heures dans le noir. Dans un autre tube de Schlenk, l’alcool secondaire (2 eq.) est dissout dans du DCE. Diisopropyléthylamine (2 eq.) et DMAP (1 eq.) sont ajoutés. Le résidu de fluorescéine, précédemment obtenu, est dissout dans du DCE et la solution alcoolique est ajoutée au goutte à goutte pendant 10 minutes. Le mélange réactionnel est chauffé pendant 3 heures à 70 °C. Le milieu réactionnel est versé dans de l’eau et extrait avec du DCM. Les extraits organiques sont combinés, lavés avec de l’eau, puis avec une solution aqueuse de NaCI saturée, séchés sur MgSC , et le solvant est évaporé par évaporation rotative. Le produit brut est finalement purifié par colonne chromatographie sur gel de silice (AcOEt/cyclohexane, puis DCM/AcOEt) pour obtenir le produit désiré. 3. Composés synthétisés
Composé 1 : Dicarbonate de pentyle de fluorescéine
Le dicarbonate de pentyle de fluorescéine est purifié sur gel de silice (AcOEt/EP 15:80) et isolé sous la forme d’une huile transparente (36 %). 1H NMR (500 MHz, CDCI3) d (ppm) : 8.04 (dt, 3J = 7.5 Hz, 4J= 1.0 Hz, 1 H), 7.69 (td, 3J= 7.4 Hz, 4J= 1.1 Hz, 1 H), 7.64 (td, 3J= 7.4
Hz, 4J= 1.1 Hz, 1 H), 7.22 - 7.14 (m, 3H), 6.91 (dd, 3J= 8.7 Hz, 4J= 2.3 Hz, 2H), 6.84 (d, 3J = 8.7 Hz, 2H), 4.26 (t, 3J= 6.7 Hz, 4H), 1.82 - 1 .70 (m, 4H), 1 .46 - 1 .31 (m, 8H), 0.94 (t, 3J= 6.7 Hz 6H). 13C NMR (126 MHz, CDCI3) d (ppm): 169.11 , 153.08, 152.93, 152.44, 151.56, 135.34, 130.12, 129.07, 126.10, 125.31 , 124.05, 117.26, 116.61 , 109.93, 81.54, 69.41 , 28.26, 27.81 , 22.30, 13.95.
Composé 2 : Dicarbonate de décyle de fluorescéine
Le dicarbonate de décyle de fluorescéine est purifié sur gel de silice (AcOEt/EP 20:80) et isolé sous la forme d’une huile transparente (77 %). 1H NMR (500 MHz, DMSO-cfe) d (ppm): 8.07 (dt, 3 J = 7.6 Hz, 4 J = 1.0 Hz, 1 H), 7.83 (td, 3J = 7.4 Hz, 4 J = 1 .1 Hz, 1 H), 7.77 (td, 3J =
7.4 Hz, 4J= 1.1 Hz, 1 H), 7.46 - 7.36 (m, 3H), 7.06 (dd, 3J = 8.7 Hz, 4J = 2.4 Hz, 2H), 6.91 (d, 3 J = 8.7 Hz, 2H), 4.22 (t, 3 J = 6.6 Hz, 4H), 1 .77 - 1 .59 (m, 4H), 1 .38 - 1 .21 (m, 28H), 0.85 (t, 3J = 6.6 Hz, 6H). 13C NMR (126 MHz, DMSO) d (ppm): 168.85, 152.93, 152.60, 151.23, 136.52, 131.09, 129.75, 125.84, 125.55, 124.57, 118.52, 116.90, 110.48, 81.28, 69.39, 31.75, 29.38, 29.15, 29.04, 28.39, 25.59, 22.56, 14.42. HRMS (ESI-TOF) C42H52O9 found: 701.3644 [M+H]+, calculated : 701 .3684
Composé 3: Dicarbonate diéthyl (L-)malate de fluorescéine
Le dicarbonate diéthyl (L-)malate de fluorescéine est purifié sur gel de silice (AcOEt/cyclohexane 35:65, puis DCM/AcOEt 95:5) 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d (ppm): 8.06 (d, 3 J = 7.1 Hz, 1 H), 7.78 - 7.60 (m, 2H), 7.27 - 7.12 (m, 3H), 6.97 (dd, 3 J = 8.7 Hz, 4 J = 2.4 Hz, 2H), 6.87 (d, 3J = 8.8 Hz, 2H), 5.50 (t, 3 J = 6.1 Hz, 2H), 4.40 - 4.13 (m, 8H), 3.10 - 2.92 (m, 4H), 1.43 - 1.16 (m, 12H). 13C NMR (101 MHz, CDCI3) 5 (ppm): 169.02, 168.74, 168.08, 152.87, 152.18, 152.13, 151.48, 151.48, 135.37, 130.14, 129.12, 125.98, 125.32, 123.98, 117.09, 116.89, 109.82, 77.33, 77.02, 76.70, 72.27, 62.30, 61.43, 36.02, 14.13, 14.08.
Composé 4 : Dicarbonate d’acide (L)-malique de fluorescéine
Le dicarbonate d’acide (L-)malique de fluorescéine est purifié sur gel de silice (AcOEt/EP 75:25, puis DCM/AcOEt 97:3) 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d (ppm): 8.08 - 8.01 (d, 3J = 7.1 Hz 1 H), 7.73 - 7.58 (m, 2H), 7.17 (d, 3J= 7.1 Hz, 1 H), 7.13 (d, 4J= 2.2 Hz, 2H), 6.86 (dd, 3J= 8.7 Hz, 4J = 2.2 Hz, 2H), 6.81 (d, 3J = 8.6 Hz, 2H), 4.36 (hept, 3J= 6.7 Hz, 2H), 3.35 (d, 3 J = 7.4 Hz, 4H).
Exemple 2 : Etude in vitro sur cellules adhérentes de type « test de laboratoire de recherche »
1. Matériel et méthodes
Cytotoxicité
La cytotoxicité d’une solution du composé 1 dans le CremophorOEL [CAS 61791-12- 6] (ratio molaire 1 / 1), désigné sous la référence F4267, comparée à celle de la calcéine-AM, a été évaluée sur la lignée cellulaire d’épithélium cornéen humain immortalisée par SV40, HCE-2 (ATCC CRL-11135) en utilisant deux solutions de F4267 de concentrations [40 mM] et [1000 mM] ou de calcéine-AM (FP-FI9820, Interchim) [4 mM] diluées dans de l’optiMEM (11058021 , Gibco, ThermoFisher) et déposées pendant 45 minutes sur les cellules (100 pL par puits ensemencés 24 h avant à 1 .105cellules/mL [3788, Corning, surface : 0.32cm2]. Après les 45 minutes de mise en contact avec le composé 1 ou avec la calcéine-AM, les cellules ont été rincées avec leur milieu de culture, puis remises en culture en étuve avec 5% de CO2, à 37°C. La cytotoxicité a été mesurée en dosant les lactates déshydrogénases (LDH) relarguées dans le surnageant en utilisant le kit CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay (C20301 , ThermoFisher, voir test de cytotoxicité ci-dessous) et exprimée en % de cellules mortes grâce à un étalon interne. La cytotoxicité était évaluée 45 minutes (avant rinçage), 24 h et 48 h après le début de l’incubation (3 puits par conditions, n=1 expérimentations).
Test de cytotoxicité
Les Lactates DésHydrogénases (LDH) sont une famille d’enzymes cytosoliques ubiquitaires présentes dans presque tous les types cellulaires. Les dommages membranaires provoquent un relargage de LDH dans le milieu extérieur. Il y a une corrélation directe entre la cytotoxicité cellulaire qui provoque des dommages membranaires et la quantité de LDH présente dans le milieu extracellulaire. Dans le test de cytotoxicité, la LDH est dosée par la réaction enzymatique représentée dans la figure 1 . La LDH transforme le pyruvate en lactate en même temps qu’il y a réduction du NAD+ en NADH. Le NADH ainsi produit réagit avec des molécules fluorescentes ou luminescentes.
Le test de cytotoxicité a été réalisé avec le sel de tétrazolium (INT) qui est converti en formazan. La coloration a alors été étudiée à l’aide d’un spectrophotomètre. La concentration de formazan étant proportionnelle à la quantité de LDH présente dans le milieu, celle-ci a été quantifiée par une lecture d’absorbance à 555 nm, contre une mesure à blanc à 650 nm pour éliminer l’absorbance parasite du milieu. Le pourcentage de cellules mortes est ensuite calculé à partir de la formule ci-après, avec l’activité LDH maximale étant celle d’un puits dont toutes les cellules ont été lysées, et l’activité LDH basale, celle d’un puits non traité.
Qualité du marquage
La qualité du marquage cytoplasmique par le composé 1 sur cellules a été évaluée sur la lignée adhérente de fibroblastes pulmonaires foetaux normaux humains HEL299 [ATCC CCL-137], car elles forment une monocouche cellulaire (une seule épaisseur facilitant l’évaluation de la morphologie cellulaire et le dénombrement). Des cellules ont été ensemencées à 1.105 cellules/mL 72 h avant marquage, puis marquées avec la solution de composé 1 désignée par la référence F4267 à [4 mM] et [40 mM] ou avec une solution de Calcéine-AM [4 mM], puis observées en boite de Pétri stérile sous le filtre FITC d’un macroscope (macro-zoom microscope, MVX10, Olympus, Tokyo, Japon) (2 puits par condition, n=1 expérimentations).
2. Résultats Cytotoxicité A 45 min, la cytotoxicité (%) provoquée sur HCE-2, était très faible : 0.6±0.5% pour la calcéine-AM, 0.8±0.5% pour F4267 à 40 mM et 2.2±0.6% pour F4267 1000 mM.
A 24 h, les cytotoxicités étaient de 26.4±14.1% pour la calcéine-AM, de 7.3±3.4% pour F4267 à 40 mM et de 21 .6±2.7% pour F4267 à 1000 mM.
A 48 h, les cytotoxicités étaient de 18.8±11.1% pour la calcéine-AM, de 6.1 ±0.9% pour F4267 à 40 mM et de 22.3±3.8% pour F4267 à 1000 mM (Figure 2).
Qualité du marquage
Le marquage des cellules FIEL299 permettait de visualiser les cytoplasmes cellulaires de façon similaire avec la solution de Calcéine-AM [4 mM] et avec la solution F4267 respectivement à [4 mM] et [40 mM] (Figure 3).
Exemple 3 : Etude ex vivo sur endothélium de cornées entières, de type « test en banque de cornées »
1. Matériel et méthodes
Cytotoxicité
La cytotoxicité du composé 1 (solution F4267) a été évaluée sur l’endothélium de cornées entières, en utilisant des paires de cornées humaines, conservées en organoculture et récusées pour la greffe par une banque de cornées. Les 2 cornées d’un même donneur ont les mêmes caractéristiques biologiques et constituent le meilleur comparateur l’une de l’autre. La Densité Cellulaire Endothéliale (DCE) a d’abord été évaluée avant expérimentation grâce à un comptage cellulaire par analyse d’image [Cell Tissue Bank, 2017, 18 ( 2 ), 185-191 , Jumelle et al.], puis l’endothélium des deux cornées a été mis au contact d’une solution de F4267 [40 mM] pendant 45 minutes à température ambiante, en conditions stériles [Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 , 52 (8), 6018-6025, Pipparelli et al.]. Les cornées ont ensuite été observées au macroscope MVX10 avec l’objectif x0.8 sous le filtre FITC, puis remises en organoculture. Afin d’évaluer la toxicité par incubation répétée, la cornée de l’œil droit (OD) a été mise en contact quotidiennement avec une solution de F4267 [40 mM en OptiMEM, 45 minutes, température ambiante] pendant 7 jours tandis que la cornée de l’œil gauche (OG) a été seulement incubée avec de l’optiMEM (solvant seul). Les cornées ont été exposées quotidiennement à la lumière bleue du filtre FITC (même intensité de lampe XCite à 12/100) sous l’objectif x0.8 du macroscope MVX10. La DCE a été mesurée à nouveau à J7 à l’aide de la coloration Floechst-Ethidium-Calcéine-AM ( Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 , 52 (8), 6018- 6025, Pipparelli et al) (1 paire de cornées, n =1).
Qualité du marquage
La qualité du marquage cytoplasmique par le composé 1 (solution F4267) sur endothélium cornéen a été comparée à celle de la Calcéine-AM en colorant des cornées appariées. La face endothéliale des cornées a été incubée 45 minutes soit avec la solution F4267 (40 mM sur l’œil gauche, OG) soit avec la Calcéine-AM (4 mM sur l’œil droit, OD) en suivant un protocole de coloration validé ( Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 , 52 ( 8 ), 6018-6025, Pipparelli et al.) (n =2 paires de cornées).
2. Résultats
Cytotoxicité
La DCE en cellules viables à J7, après mise en contact quotidienne de la cornée de l’OD avec le produit F4267 suivie d’une observation à faible grossissement pendant 7 jours, était de 1832 cellules/mm2. Cette DCE était de 1612 cellules/mm2 pour une mise en contact unique de la cornée de l’OG mais avec également une exposition quotidienne à la lumière La perte cellulaire est donc comparable indiquant que l’incubation répétée est bien tolérée (Figure 4).
Les images de la figure 5 illustrent la viabilité mesurée en % après marquage à la Calcéine-AM à j7 par analyse d’image de la fluorescence : cornée A (OD) mise en contact tous les jours de manière répétée pendant 7 jours avec le produit F4267, cornée B (OG) mise en contact de façon unique à J0 mais toutes deux exposées de façon quotidienne à la lumière sous le filtre FITC.
Qualité du marquage
Le produit F4267 [40 mM] permet un marquage démarquant les cellules mortes des cellules vivantes (Figures 5A et 5B, à J0). De plus, il a été montré que le produit F4267 [40 mM] permet un marquage démarquant les cellules mortes des cellules vivantes de façon similaire à la Calcéine-AM [4 mM] sur cornée entière.
Exemple 4 : Marquage de différents types cellulaires
Des cellules endothéliales cornéennes (B4G12), des fibroblastes (Hel-299) et des cellules épithéliales cornéennes (FICE-2) ont été mises en culture sur une lame de culture 8 puits (LabTek, 177445) pendant 5 jours dans des milieux de cultures correspondants et décrits ci-dessous.
Milieu de culture B4G12 \ Gentamycine, OptiMEM, SVFD, CaICh, Acide ascorbique, EGF, Chondroïtine sulfate, SB203580, Y27632.
Milieu de culture HCE-2 : DMEM GlutaMax, F12-FIAM, SVFD, Antibiotique/mycotique, EGF. Milieu de culture Hel-299 : DMEM GlutaMax, SVFD, AT B/M
Lors de la confluence, le marquage cellulaire est réalisé pendant 45 minutes avec les solutions comprenant de la calcéine-AM ou le produit F4267 à différentes concentrations (solutions A, B, C et D), avant un rinçage au PBS. Puis les puits de culture sont enlevés, et la lame est montée avec une lamelle et du Vectashield.
Solution A : calcéine-AM (4 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500)
Solution B\ F4267 (40 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500)
Solution C: F4267 (4 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500) Solution D: F4267 (400 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500)
Les lames sont ensuite observées au macroscope avec un grossissement x0,8 et x6,3 et au microscope à épifluorescence avec un grossissement x10 et x60. Les différents puits sont observés dans les mêmes conditions à chaque grossissement pour permettre une comparaison des intensités et de la qualité du marquage avec des traitements d’image identiques.
Les cytoplasmes des cellules vivantes, quel que soit le type de cellule, sont bien visibles avec le composé F4267.
Exemple 5 : Evaluation de l’impact du marquage cellulaire sur la viabilité cellulaire
L’expérience est réalisée avec des cellules endothéliales cornéennes FICEC-B4G12 (CVCL 2065). Les cellules sont décongelées et mises en culture dans leur milieu de culture. Les cellules sont trypsinées une fois par semaine avant d’être ensemencées dans des puits de plaque 24 puits à une concentration de 1.105 cellules/mL. Les cellules sont ensuite incubées pendant 5 jours à 37°C, 5% CO2 jusqu’à 90% de confluence.
Les différents puits sont colorés quotidiennement avec de la calcéine-AM (4 mM) ou du produit F4267 (40 mM), selon les conditions suivantes : marquage pendant 45 minutes, puis rinçage au PBS ou marquage pendant 45 minutes sans rinçage. L’étape de marquage et éventuellement de rinçage est répété tous les jours pendant 4 jours successifs, puis après 2 jours sans marquage, le marquage est de nouveau répété pendant 2 jours consécutifs.
Les étapes de marquage sont réalisées en double. Après, chaque marquage un puit pour chacune des conditions est observé en microscopie à épifluorescence (Microscope Olympus 1X81 , canal FITC, objectif x4, L :25, Texp : 142.7ms), tandis que le second puit (témoin) est conservé dans l’obscurité afin d’évaluer l’impact de l’observation en fluorescence à la fin de l’étude. Le dernier jour de l’étude, le marquage est réalisé avec de la calécine-AM (4 mM) en présence de Floescht (1/500) ou le produit F4267 (40 mM) en présence de Floescht (1/500), et les puits sont imagés en MIA x4 (reconstitution de plusieurs champs pour obtenir une image complète du puit).
Les étapes de marquage sont effectuées dans une salle blanche sous PSM afin d’assurer la stérilité, et les boites de cultures sont parafilmées lors de l’observation pour limiter la contamination possible.
Les figures 6 et 7 représentent les tapis cellulaires observés à J0, donc le premier jour de marquage et à J5, soit le dernier jour du marquage. Il apparaît que les tapis cellulaires des cellules marqués avec la calcéine-AM sont moins denses que ce soit pour les expériences en présence ou en absence de rinçage, au contraire des tapis cellulaires dont les cellules ont été marquées avec F4267. La figure 8 correspondant aux images des cellules sous le canal DAPI confirme l’absence de tapis cellulaire pour les cellules marquées avec la calcéine-AM.
Ces différentes observations concluent que le produit F4267 apparaît comme non- toxique, ou du moins, moins toxique que la calcéine-AM pour les cellules, puisque aucune influence négative du marqueur F4267 sur le tapis cellulaire n’est mis en évidence.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d’un composé de formule générale (I), caractérisé en ce que :
R1 est choisi parmi
- un alkyle C3-C20,
- un polyéthylène glycol ou un polypropylène glycol,
- les dérivés de l’acide malique et les esters correspondants,
- les sucres, et
- les polysaccharides naturels ;
- X1 est choisi parmi H, Cl, F, Br et NO2 ;
- X2 est choisi parmi H, Cl, Br et N(CH2CC>2H)2 ;
- R2 est choisi parmi H, NCS et CO2R3 ; et
- R3 est choisi parmi H ou un alkyle C1-C3 et ses sels pharmaceutiquement acceptables, pour le marquage cellulaire.
2. Utilisation du composé de formule (I) selon la revendication 1 , caractérisé en ce que R1 est un alkyle C5-C10.
3. Utilisation du composé de formule (I) selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que R2 est un hydrogène.
4. Utilisation du composé de formule (I) selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que X1 est un hydrogène.
5. Utilisation du composé de formule (I) selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que X2 est un hydrogène.
6. Utilisation du composé de formule (I) selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le marquage cellulaire est réalisé in vitro.
7. Utilisation du composé de formule (I) selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le marquage cellulaire est réalisé in vivo ou ex vivo.
8. Utilisation du composé de formule (I) selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules endothéliales.
9. Utilisation du composé de formule (I) selon la revendication 8, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules endothéliales cornéennes.
10. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle comprend un composé de formule (I) défini à l’une des revendications 1 à 5 et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
11. Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce que la composition est une composition aqueuse.
12. Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 10 ou 11 , caractérisée en ce que la composition est sous forme de gel ou de film.
13. Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 11 à 12, caractérisée en ce que l’excipient et/ou le véhicule est approprié pour une utilisation ophtalmique.
14. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes de : a) Réaction entre le diphénol (II) , avec du phosgène ou un dérivé de celui-ci en présence de base conduisant à la formation de l’intermédiaire de synthèse de formule (III)
b) Réaction de l’intermédiaire (III), avec un alcool de formule (IV), R1OH, en présence de base pour obtenir le composé de formule
Formules pour lesquelles,
- R1 est choisi parmi
- un alkyl C3-C20,
- un polyéthylène glycol, un polypropylène glycol,
- les dérivés de l’acide malique et les esters correspondants,
- les sucres, et
- les polysaccharides naturels ;
- X1 est choisi parmi H, Cl, F, Br et NO2 ;
- X2 est choisi parmi Fl, Cl, Br et N(CFl2CC>2FI)2 ;
- R2 est choisi parmi Fl, NCS et CO2R3 ; et
- R3 est choisi parmi Fl ou un alkyle C1-C3.
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