EP4248219A1 - Marqueurs metaboliques specifiques de maladies neurodegeneratives telles que la maladie de parkinson et leur utilisation dans le diagnostic - Google Patents

Marqueurs metaboliques specifiques de maladies neurodegeneratives telles que la maladie de parkinson et leur utilisation dans le diagnostic

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EP4248219A1
EP4248219A1 EP21844031.1A EP21844031A EP4248219A1 EP 4248219 A1 EP4248219 A1 EP 4248219A1 EP 21844031 A EP21844031 A EP 21844031A EP 4248219 A1 EP4248219 A1 EP 4248219A1
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EP
European Patent Office
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disease
parkinson
metabolites
betaine
patient
Prior art date
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Application number
EP21844031.1A
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German (de)
English (en)
Inventor
Sabrina BOULET
Florence Fauvelle
David MALLET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Grenoble Alpes University
Original Assignee
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Grenoble Alpes University
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Grenoble Alpes University filed Critical Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7057—(Intracellular) signaling and trafficking pathways
    • G01N2800/7066—Metabolic pathways

Definitions

  • the invention relates to the identification of novel combinations of metabolites specific for neurodegenerative diseases, in particular Parkinson's disease (PD), for use as biomarkers in the early diagnosis of neurodegenerative diseases, in particular stage Parkinson's disease. prodromal or de novo.
  • PD Parkinson's disease
  • references in square brackets ([ ]) refer to the list of references at the end of the text.
  • Parkinson's disease is one of the most common neurodegenerative diseases in the world, affecting approximately 1% of adults over the age of 60 [1]. From its appearance, the pathology evolves gradually and continuously according to three stages, i.e. preclinical, prodromal, and clinical, corresponding respectively to the appearance of neurodegeneration without symptoms (preclinical phase), then the progression of the neurodegenerative process leads to the appearance of non-motor symptoms (prodromal phase), and finally to the appearance of motor symptoms (clinical phase) [2]. It is these symptoms, present only in the last stage, which are sufficiently characteristic of PD to allow its diagnosis [ 3].
  • the “prodromal” phase is characterized by a set of non-motor symptoms including neuropsychiatric disorders (e.g. apathy, depression, anxiety). Although they are expressed in 40 to 50% [13] of Parkinson's patients, they are not exclusive to the disease and can be encountered in other pathologies. Patients newly and recently diagnosed with Parkinson's disease correspond to an early clinical phase called "de novo" where neuroprotective intervention can still be considered to slow the progression of the disease.
  • neuropsychiatric disorders e.g. apathy, depression, anxiety
  • the inventors have developed an original strategy making it possible to propose new biomarkers capable of specifically and early diagnosing a neurodegenerative disease, for example Parkinson's disease (PD), in particular Parkinson's disease at the prodromal or de novo stage.
  • PD Parkinson's disease
  • This strategy based on the use of different animal models and different patient cohorts, overcame the intrinsic limitations and increased the incomplete predictive value of each model taken individually, revealing a characteristic set of deregulated metabolites that can be used as a potential biomarker.
  • the study was extended to human serum samples from two biobanks in order to validate the clinical relevance of this new PD biomarker.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model was first used because it stably mimics each stage of PD, with no evolution between stages, and it has already been validated for the study of prodromal phases [ 24]. Moreover, it represents a phenotypically correct model of PD, with good isomorphism and good predictive value [28], although it is etiologically limited.
  • the a-synuclein rat model [29] was then used because it has the advantage of being progressive in the establishment of the phenotype, which makes longitudinal studies possible. In addition, it is closer to human pathology, especially with regard to the anatomo-pathological characteristics and the physiopathological mechanisms of the disease [30].
  • non-human MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) primates were used because they share greater genome sequence identity with humans and important neuroanatomical similarities. .
  • Metabolic changes were analyzed at the blood (serum) level in order to find metabolites that are easy to transpose into the clinic, and in specific regions of the brain differently affected by the neurodegenerative process (the dorsal striatum (DS) and the nucleus accumbens (NAcc). )) to potentially link changes in these metabolites to pathophysiological processes involved in PD.
  • DS dorsal striatum
  • NAcc nucleus accumbens
  • this inter-species study has made it possible to reinforce the relevance of circulating metabolites for the diagnosis of PD.
  • a composite biomarker constructed with a combination of 6 metabolites to distinguish animals mimicking PD from control animals (sham), regardless of the stage of the disease, and in particular from the prodromal or de novo phase. It is important to note that the combination of the same metabolites made it possible to distinguish patients with PD from healthy subjects. It is interesting to note that in animals, certain metabolic dysregulations appeared before the motor symptoms and could thus represent early biomarkers of the disease.
  • the subject of the present invention is therefore an in vitro method for the early diagnosis of a neurodegenerative disease using a biological sample from a patient, comprising: a) the in vitro measurement in said biological sample of the expression levels (E ) of at least 6 of the following metabolites: acetoacetate, betaine, B-hydroxybutyrate (BHB), creatine, pyruvate, and valine; b) comparison of the expression levels of the metabolites measured in step a) with those of a reference biological sample or with reference values; where a difference (e.g. joint dysregulation) of the expression levels of the metabolites measured in step a) compared to those of the reference biological sample or to reference values is the indication that said patient is suffering from the neurodegenerative disease.
  • E expression levels
  • BHB B-hydroxybutyrate
  • step a) further comprises the in vitro measurement of the level of expression of at least one metabolite chosen from the group consisting of alanine, lactate, DMSO2, glycine, serine, threonine, myo-inositol, and leucine.
  • step a) comprises or consists of measuring the levels of expression of acetoacetate, betaine, B-hydroxybutyrate (BHB), creatine, pyruvate, and the valine.
  • telomere shortening is understood to mean a diagnosis made at a stage of the neurodegenerative disease where the discriminating symptoms have not yet appeared or in newly and recently diagnosed patients. For example, a diagnosis would be considered early if made at the prodromal or de novo stage of PD.
  • neurodegenerative disease within the meaning of the present invention means a progressive pathology which affects the brain or more generally the central nervous system, resulting in the death of nerve cells.
  • the most famous and most frequent are Alzheimer's disease and Parkinson's disease, but there are others (multiple sclerosis, Huntington's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, amyotrophic lateral sclerosis (also called Charcot's disease) , etc. In particular, this is Parkinson's disease.
  • biological sample is understood to mean, within the meaning of the present invention, a biological sample (e.g. of bodily fluid (serum, blood, urine, saliva, etc.), or of tissue (brain, marrow, liver, skin,. ..)) taken after fasting for 12 hours in a patient.
  • a biological sample e.g. of bodily fluid (serum, blood, urine, saliva, etc.), or of tissue (brain, marrow, liver, skin,. ..) taken after fasting for 12 hours in a patient.
  • biological reference sample within the meaning of the present invention means a biological sample (e.g. of bodily fluid (serum, blood, urine, saliva, etc.), or of tissue (brain, marrow, liver, skin , ...)) taken after a 12-hour fast from a healthy individual (control/control/sham), i.e. presenting no neurological disease, in particular no symptoms of PD or possibly before -PD runner, no family history of movement disorder and/or PD, and no specific medical conditions.
  • bodily fluid serum, blood, urine, saliva, etc.
  • tissue i.e. presenting no neurological disease, in particular no symptoms of PD or possibly before -PD runner, no family history of movement disorder and/or PD, and no specific medical conditions.
  • the term "reference value" within the meaning of the present invention the value of the level of expression of a metabolite in a healthy individual, that is to say not presenting any neurological disease, in particular no symptoms of PD or possibly a precursor to PD, no family history of movement disorder and/or PD, and no specific medical conditions.
  • difference in expression levels is meant within the meaning of the present invention, the variation in the expression levels of the metabolites measured in a patient compared to the expression levels of the same metabolites in an individual healthy (reference values), i.e. having no neurological disease, in particular no symptoms of PD or which may be a precursor to PD, no family history of movement disorder and/or PD, and no specific medical conditions. For example, in the case of Parkinson's disease.
  • the subject of the present invention is an in vitro method for the early diagnosis of Parkinson's disease using a biological sample from a patient, comprising: a) the in vitro measurement in said biological sample of the expression levels of the following metabolites : acetoacetate, betaine, B-hydroxybutyrate (BHB), creatine, pyruvate, and valine; b) calculation of Logit(Pi) or Logit(P2) logistic regressions, respectively, according to the following formulas:
  • EBetaine where EBHB, Epyruvate, Evaine, EAcetoacetate, Ecreatine and EBetaine correspond respectively to measured expression of B-hydroxybutyrate (BHB), pyruvate, valine, acetoacetate, creatine and betaine, in the biological sample; and where a calculated value of Log it(Pi) or Logit(P2) greater than 0.316 au is an indication that said patient has Parkinson's disease; where a calculated value of Logit(Pi) or Logit(P2) of less than 0.279 au is the indication that said patient does not suffer from Parkinson's disease; where a calculated value of Logit(Pi) less than 0.316 au is the indication that said patient does not suffer from Parkinson's disease; where a calculated value of Logit(P2) greater than 0.279 au is an indication that said patient has Parkinson's
  • logit(P) within the meaning of the present invention means a standard value obtained from the application of a logistic regression using the measurement of the levels of expression of the metabolites mentioned above.
  • a logistic regression using the measurement of the levels of expression of the metabolites mentioned above.
  • any individual obtaining a value greater than 0.316 (arbitrary unit, AU) will be considered to have PD and any individual scoring less than 0.279 (arbitrary unit, AU) will be considered not to have PD.
  • the biological sample of the patient comes from a patient at the prodromal or de novo stage of PD.
  • prodromal stage of PD is meant, within the meaning of the present invention, a stage where the diagnosis of PD could not be established definitively and/or with certainty, on the basis of the symptoms presented. For example, this concerns any patient presenting with non-motor symptoms frequently observed in patients who eventually develop the disease and which could justly represent prodromal symptoms (neuropsychiatric symptoms (apathy, depression, anxiety), loss of sense of smell, constipation , sleep disorders, digestive disorders, cognitive deficits) and/or any patient who presents in his genealogical line people already suffering from the disease.
  • de novo stage of PD or “de novo patients” within the meaning of the present invention means newly and recently diagnosed patients who are at an early clinical stage where a neuroprotective intervention can still be envisaged to slow the progression of disease.
  • the biological sample is for example a serum sample.
  • the step of measuring the expression levels is carried out for example by NMR spectroscopy measurements.
  • the present invention also relates to a biomarker intended for the early diagnosis of a neurodegenerative disease comprising the combination of the following at least six metabolites: acetoacetate, betaine, B-hydroxybutyrate (BHB), creatine, pyruvate, and valine.
  • a biomarker intended for the early diagnosis of a neurodegenerative disease comprising the combination of the following at least six metabolites: acetoacetate, betaine, B-hydroxybutyrate (BHB), creatine, pyruvate, and valine.
  • the biomarker also comprises the combination of at least one metabolite chosen from the group consisting of alanine, lactate, DMSO2, glycine, serine, threonine, myo- inositol, and leucine.
  • the biomarker comprises or consists of the combination of the following six metabolites: acetoacetate, betaine, B-hydroxybutyrate (BHB), creatine, pyruvate, and valine.
  • a subject of the present invention is also the in vitro use of a combination of metabolites according to the present invention, as a biomarker of a neurodegenerative disease, in particular of Parkinson's disease.
  • Figure 1 represents a schematic of the experimental procedures applied to different animal models of PD. All serum samples were collected after fasting and according to the same protocol. They were analyzed by 1 H NMR at 950 MHz. Brain samples from 6-OHDA rats were used for histological analyzes and metabolomic analysis performed by 1 H HRMAS NMR at 500 MHz.
  • Figure 2 depicts striatal dopaminergic denervation induced by bilateral 6-OHDA substantia nigra compact (SNc) lesion resulting in apathetic-like behavior and fine motor dysfunctions.
  • PMP MP Progression Score
  • the PMP score is based on the sum of the histological and behavioral components (self-administration and step readjustment), taking values from 0 to 4 for each. In this way, a score can be assigned to each animal from 0 (control/sham animal) to 3-7 (prodromal type animal), or 8-12 (clinical type animal).
  • FIG. 1 Examples of coronal sections of control (sham) and 6-OHDA rat brains, stained for tyrosine hydroxylase (TH) at three representative striatal levels and localized to bregma, and corresponding patterns selected from the Paxinos atlas and Watson [78]. The areas used for the quantification of dopaminergic denervation in the different sub-regions analyzed are illustrated. Scale bars represent 2 mm.
  • Figure 3 represents ambulatory motor activity measured in an open area. Dopaminergic lesions did not affect horizontal ambulatory activity measured over a 15-minute period. Data are presented as mean value for each minute ⁇ SEM.
  • FIG. 4 represents the evolution of the serum metabolic profile of 6-OHDA rats modified according to the different phases of PD.
  • A Example of 1 H NMR spectrum at 950 MHz (spectral areas: 5 0.5-4.7ppm and 5 6-8.5ppm) acquired with the CPMG pulse sequence (Carr-Purcell-Meiboom-Gill).
  • Allocation 1-isoleucine; 2-leucine; 3-valine; 4-BHB; 5-lactate; 6-alanine; 7-arginine; 8-lysine; 9-acetate; 10-glutamine; 1 1 -methionine; 12-acetone; 13-acetoacetate; 14-glutamate; 15-pyruvate; 16-citrate; 17-asparagine; 18-creatine; 19-phosphocreatine; 20-DMSO2; 21-choline; 22- phosphocholine; 23-glucose; 24-betaine; 25-myo-inositol; 26-glycine; 27-glycerol; 28-threonine; 29-glycerophosphocholine; 30-serine; 31-ascorbate; 32-glycerate; 33-proline; 34-deoxycytidine triphosphate; 35-tyrosine; 36-histidine; 37-phenylalanine; 38-formate.
  • Macromolecules are not specified (see Table 2).
  • B Plot of OPLS scores against the first predictive component and the first orthogonal component. A clear gradation of color is observed from left to right, showing that metabolic profiles change with the progression of PD.
  • C Graph of OPLS weights, plotted in one dimension to mimic an NMR spectrum, with NMR variables on the abscissa.
  • the weights are colored according to their correlation with the PMP score, from light gray (low correlation) to dark gray (high correlation). Metabolites with a correlation > 0.5 are considered to be the most important in discrimination. Positive peaks indicate metabolites that are up-regulated with increasing score, while negative peaks are those that are down-regulated with changing score.
  • FIG. 5 represents the gradation of the brain metabolic profile associated with the PMP score of the animals.
  • A Example of 1 H HRMAS NMR spectrum at 500 MHz. Allocation 1 -lactate; 2-alanine; 3-GABA; 4-acetate; 5-glutamate; 6-glutamine; 7-N-Acetylaspartate; 8-creatine; 9-phosphocreatine (PCR); 10-phosphoethanolamine; 11-glycerophosphocholine; 12-phosphocholine (PC); 13-choline; 14-scyllo-inositol; 15-taurine; 16-myo-inositol; 17-ascorbate; 18-glycine; 19-glutathione.
  • FIG. 6 represents the impact of a chronic treatment with a dopaminergic agonist (Pra) on the behavioral and metabolic dysregulations of 6-OHDA rats.
  • A Self-administration performance. Average number of sucrose doses obtained per session after injury or after chronic administration of saline (Veh) or Pra (last 3 days). Prodromal-type animals treated with Pra show complete reversal of the effect of injury on the number of sucrose doses obtained compared to prodromal-type animals treated with Veh. The clinical type animals treated with Pra show a moderate increase in the number of sucrose doses obtained compared to the clinical type animals treated with Veh, without reaching the performance of the control animals (sham).
  • B Serum metabolic deregulations.
  • C Metabolic dysregulation of the brain. Percentage change in brain tissue metabolites normalized to Veh-treated control (sham) animals in DS and Nacc for prodromal type (i) and clinical type (ii) animals. Animals treated with pramipexole (hatched bar) showed an inverse variation in dysregulation of metabolite levels compared to animals treated with Veh (solid bar). Mean ⁇ SEM, one-way ANOVA, followed by Tukey's post-hoc test. “: p ⁇ 0.01; ***: p ⁇ 0.001;#:p ⁇ 0.05.
  • Figure 7 shows the absence of metabolic dysregulation at the serum level in animals having received an infusion of GFP (Green fluorescent protein) control virus. Histogram representing the levels of metabolites corresponding to the different samples taken from GFP animals for acetoacetate, betaine, BHB, creatine, glycine, myo-inositol, pyruvate, and serine which represent the main metabolites involved in discrimination of the 3 groups in the OPLS-DA (discriminant analysis) of a-synuclein animals. White bars correspond to samples at week 0, light gray bars at 3 weeks after virus infusion and dark gray bars at 10 weeks after. Data are presented as mean value ⁇ SEM and are tested by one-way ANOVA, followed by Tuckey's post hoc test.
  • GFP Green fluorescent protein
  • FIG. 8 represents the metabolomic study by NMR on serum samples of the other models of PD in different species (A) ⁇ -synuclein rat animal model.
  • OPLS-DA scores constructed from 1 H NMR spectra of serum, compared to the first 2 orthogonal predictive components. The 3 groups, mimicking the 3 different phases of PD, are clearly discriminated.
  • R2Y 0.929;
  • Q2 0.518; 1 predictive component and 3 orthogonal components;
  • CV ANOVA p-value 0.008.
  • C MPTP non-human primate model. OPLS-DA scores constructed from 1 H NMR spectra of serum, compared to the first 2 predictive and orthogonal components. Control animals (sham) and clinical type animals are clearly differentiated.
  • Figure 9 depicts the effect of pramipexole on BHB and betaine levels in PD patients in the US cohort. Histogram showing the relative quantitative values of metabolites in the control (control) group (white bar), PD patients (dark bar) and PD patients treated with Pra (hatched bar). Data are presented as mean value ⁇ SEM.
  • FIG. 10 represents the logistic regression having made it possible to construct a composite biomarker from 6 serum metabolites: BHB, acetoacetate, valine, creatine, betaine and pyruvate.
  • AUC area under the curve
  • ROC ROC curve with data from PD patients and corresponding controls from the US cohort
  • FIG. 11 represents the logistic regression having made it possible to construct a composite biomarker from 6 serum metabolites: BHB, acetoacetate, valine, creatine, betaine and pyruvate.
  • Figure 12 shows the logistic regression curve for the panel of serum metabolites including: BHB, acetoacetate, valine, creatine, betaine and pyruvate.
  • B Logistic regression algorithm for all MP type animals compared to the control (sham) group.
  • Monkeys received intramuscular injections of MPTP (0.3–0.5 mg/kg) every 4–5 days for 3 weeks [77] .
  • Repeated administration of weak MPTP doses were used to mimic a moderate stage, with slow disease development, and the onset of moderate dopaminergic injury.
  • Serum samples were collected at the start of the experiment and after the monkeys reached a stable parkinsonian state (Fig. 1(iii)).
  • Rats the experiments were carried out on adult male Sprague-Dawley rats (Janvier, Le Genest-Saint-Isle, France), weighing approximately 300 g (7 weeks) at the start of the experiment. They were housed under standard laboratory and ethical conditions with an inverted light-dark cycle (12 h/light-dark cycle, with lights on at 7 p.m.) and with food and water readily available. libitum.
  • the protocols used complied with the European Union Animal Protection Act 2010 and French Directive 2010/63, and were approved by the French National Ethics Committee (2013/113) No. 004 and by the local ethics committee C2EA84 and CELYNE C2EA.
  • the animals received a bilateral injection of 2.3 pl of 6-OHDA (3 mg/ml) or physiological saline (NaCl 0.9%; control/sham), at a flow rate of 0.5 pl/min.
  • 6-OHDA 3- mg/ml
  • physiological saline NaCl 0.9%; control/sham
  • 6-OHDA rats The rats were subjected to 2 behavioral tests, 3 weeks after the operation, while the 6-OHDA lesion was stabilized [79].
  • sucrose motivational component
  • Rats were trained to self-administer a 2.5% sucrose solution in operant chambers (Med Associates, St Albans, VT, USA) containing an active lever , reinforced, for which pressing causes the delivery of 0.2 ml of a sucrose solution associated with a low-intensity light stimulus, and an inactive, unreinforced lever, for which pressing causes neither delivery of sucrose nor light stimulus .
  • This task was performed with a fixed ratio of 1, with a single press of the reinforced lever resulting in the delivery of a reward.
  • Each session ended when 100 rewards were obtained, or at the end of the allotted time (1 hour). The number of rewards obtained was counted for each session by the MED-PC IV software.
  • Gait readjustment test (motor component): The animals, held by the posterior third of their body, were moved over a length of 90 cm by a straight and regular movement from left to right, and vice versa, along a smooth surface table. The number of forelimb adjustments made during movement was counted [80]. The test was carried out three times, by two different experimenters, blind (ignorance of the nature of the experimental groups).
  • MPTP monkeys The severity of the parkinsonian state was assessed using a rating scale taking into account classic motor symptoms (bradykinesia, rigidity, tremors, freezing, arm posture and position), spontaneous activities (arm movements, spontaneous eye movements and activity in the housing cage) and other activities (vocalization, triggered eye movements and feeding) [81].
  • Histology Immunolabelling of TH and quantification of denervation in 6-OHDA rats.
  • Brain harvest The rats were sacrificed by decapitation 1 day after the last session of sucrose self-administration and 1 hour after the last injection of Pra or Veh (i.e. 6 weeks after the injection). 6-OHDA or saline solution). The brains were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. They were then sliced using a cryostat thermostated at -20°C. Sections of the regions of interest were taken to carry out both the immunostaining of TH and to carry out the metabolomic study. For HHRMAS 1 NMR, thick sections of DS and Nacc tissue were pooled in inserts, and kept at -80°C until NMR analysis.
  • TH immunostaining 14 ⁇ m coronal sections of the striatal levels of interest [18] were taken and stored at -20°C. Immunostaining was then performed as previously described [18,23]. Briefly, after fixation with 4% paraformaldehyde, striatal sections were incubated with an anti-TH antibody (mouse monoclonal MAB5280, Millipore, France, 1:2500) overnight at 4°C.
  • an anti-TH antibody mouse monoclonal MAB5280, Millipore, France, 1:2500
  • criterion 1 evaluation of neuropsychiatric symptoms (i.e. behavior of apathetic type)
  • criterion 2 evaluation of motor symptoms (i.e. fine motor deficit)
  • criterion 3 the level of denervation dopaminergic in the DS, available only after postmortem histological analysis in the patient.
  • Each criterion was quantified for each animal, with values ranging from 0 to 4, as shown in Figure 2A. The values assigned to each criterion were added together to produce the PMP score, ranging from 0 to 12.
  • Control (sham) animals were assigned a score of 0.
  • Inclusion criteria for controls were: absence of neurological disease, absence of family history of movement disorders, and absence of specific medical conditions.
  • the US cohort included 21 PD patients without antiparkinsonian therapy, 9 PD patients who received Pra treatment, and 30 age- and gender-matched controls.
  • the Italian cohort included 21 patients with PD and 23 age- and gender-matched controls. All clinical and demographic information collected from the two human cohorts has been summarized in Table 1 below (data are represented by mean value ⁇ SEM, H: Male;
  • Quantification was performed with jMRUI software using quantification based on a quantum estimation procedure (QUEST) [83].
  • QUEST quantum estimation procedure
  • This procedure requires the use of a database of metabolites and a complete assignment of spectra.
  • Nineteen metabolites were assigned and quantified: acetate, alanine, ascorbate, choline, creatine, gamma-aminobutyrate (GABA), glutamate, glutamine, glycine, glycerophosphocholine, glutathione, lactate, myo-inositol, A/-acetyl aspartate, phosphocholine , phosphocreatine, phosphoethanolamine, scyllo-inositol and taurine.
  • GABA gamma-aminobutyrate
  • the amplitude of the metabolite calculated by QUEST was normalized with respect to the total signal of the spectrum.
  • CRLBs were calculated for each metabolite as an estimate
  • Serum collection For the rats, the blood was collected from the tail vein after 2 hours of fasting and under gas anesthesia with isof I urane (2%) and was stored in ice before being quickly centrifuged at 1600 g for 15 min at 4° C. The supernatant serum was collected and stored at ⁇ 80° C. until the day of the NMR. The time before freezing never exceeded 30 min [84],
  • PBS phosphate buffered saline
  • Peak assignment was performed using 2-dimensional homonuclear 1H - 1H (TOCSY) and heteronuclear 1H - 13C (HSQC) experiments, and databases. If necessary, the addition of selected metabolites was used to clarify ambiguous identifications.
  • TOCSY 2-dimensional homonuclear 1H - 1H
  • HSQC heteronuclear 1H - 13C
  • Multivariate analysis Data from liquid NMR or HRMAS were imported into SIMCA v.14 (Malmo, Sweden) for multivariate statistics.
  • Unsupervised principal component analysis (PCA) was first used for the overall visualization of the distribution of all samples, followed by OPLS to find the discriminating metabolites associated with a specific disease stage. For the latter, either a continuous variable (i.e., PMP score) or a discrete variable (i.e., group membership) was used to label each sample, which led to the OPLS-DA in the latter case.
  • the total number of components was determined using the cross-validation procedure, which produces the factors R2Y and Q2 that indicate the goodness of fit and the predictability of the model, respectively.
  • a model is considered robust and predictive when both factors are >0.5.
  • Scores were plotted in 2D against the first two components of the OPLS models, while weights were plotted in 1D to mimic an NMR spectrum but with positive/negative peaks indicating upregulated/downregulated metabolites, respectively. decrease. Indeed, in this "statistical spectrum", the correlation of each NMR variable with the continuous ranking variable (score), ranging between 0 and 1, was color-coded, ranging from dark gray (high correlation) to light gray (weak correlation). Metabolites with a correlation >0.5, considered the most discriminating, were subjected to univariate analysis. Analysis of variance of cross-validated predictive residuals (CV-ANOVA) was used to assess the significance of the model.
  • CV-ANOVA cross-validated predictive residuals
  • AUC area under the curve
  • 6-OHDA models For the self-administration tests and the step readjustment tests, a univariate analysis of the effect of Pra was carried out in applying a one-way repeated measures (MR) ANOVA followed by a Sidak post hoc test.
  • MR one-way repeated measures
  • a-synuclein models For the longitudinal study performed in a-synuclein animals, some values were missing, due to artifacts during NMR measurement. Data were therefore analyzed by fitting a proposed mixed model using a compound symmetry covariance matrix, and were fitted using the restricted maximum likelihood (REML) method. This model was followed by a Tukey post hoc test.
  • RML restricted maximum likelihood
  • the 6-OHDA rat model makes it possible to study the different stages of Parkinson's disease
  • a score In order to characterize 6-OHDA rats in relation to the clinical progression of the disease, a score, called the progression of Parkinson's disease score (PMP), based on the same type of criteria as those used in humans, ie the neuropsychiatric component - assessed by the performance of self-administration (motivation) -, the fine motor skills - assessed by the performance of the step readjustment test -, and the extent of the DS lesion - assessed by the post-mortem histological analysis was assigned to them. Based on this score, the animals with PD were divided into two categories, namely prodromal-type animals and clinical-type animals.
  • PMP progression of Parkinson's disease score
  • Tyrosine hydroxylase immunoreactivity revealed that bilateral injection of 6-OHDA into the SNc led to partial nigrostriatal dopaminergic injury resulting in dopaminergic denervation in the DS and to a lesser extent in the Nacc ( Figures 2B and 2C). Indeed, TH-IR quantification showed a strong loss (62.2%) of dopaminergic projections in the DS of prodromal-type animals compared to controls (sham), an even greater loss in clinical-type animals (71 .96%). A slight loss of TH-IR was also observed in the Nacc of 6-OHDA animals (Figure 2C).
  • Figure 4A illustrates a typical 1 H NMR spectrum of 6-OHDA rat serum, acquired at a very high magnetic field (23 T). This allowed the identification of approximately 50 metabolites in the serum samples.
  • the 1 H and 13 C assignment of their chemical groups, as well as the multiplicity of the peaks, are presented as follows: singlet (s), doublet (d), doublet doublet (dd), multiplet (m).
  • the graph of the OPLS scores, made with the NMR data and the PMP scores for each animal shows a clear gradation of the colors of the dots, from “cold” (white) on the left to “warm” (dark gray) on the right. This indicates that the metabolic profile is changing along with disease progression (Figure 4B).
  • Figure 4B shows that the metabolic profile is changing along with disease progression.
  • Among the 14 most relevant metabolites ie correlation with the PMP score >0.5), ten of them were significantly modified in at least one MP type group compared to the control animals (sham) (FIG.
  • taurine Compared to control (sham) animals, one metabolite, taurine, was significantly altered in the prodromal type group (increase), while four metabolites were significantly altered in the clinical type group: alanine, lactate and phosphocreatine increased and glutamate decreased.
  • an a-synuclein rat model was selected, in which overexpression of human A53T alpha-synuclein was induced in SNc using adeno-associated viral (AAV) vectors.
  • AAV adeno-associated viral
  • OPLS-DA serum MPTP model The OPLS-DA model shown in Figure 8C (i.e., "OPLS-DA serum MPTP model") showed clear discrimination between control (sham) and MPTP groups.
  • non-human MPTP primates exhibited a significant increase in lactate and decrease in valine, similar to 6-OHDA rats.
  • they exhibited a significant increase in acetoacetate and creatine as in the a-synuclein rodent model.
  • a significant increase in BHB and pyruvate was observed, as well as a significant decrease in betaine, as in the two rodent models (Figure 8D).
  • the ROC curve had an area under the curve (AUC) of 0.936.
  • AUC area under the curve
  • the United States (NIH) cohort was used to build a model because i) it is the largest cohort and ii) it includes only recently diagnosed patients, unlike the Italian cohort, which includes patients with longer PD duration. The latter was used as an external validation cohort.
  • the best model retained the six metabolites combined with the following regression algorithm (p: 1.95x10' 4 ):
  • the following ROC curve had an AUC of 0.88.
  • the optimal threshold was 0.316, and the corresponding sensitivity and specificity were 0.957 and 0.714, respectively ( Figure 10B).
  • the classification prediction of the Italian cohort detected 82.6% of patients with PD, with 17.4% false negatives.
  • the following ROC curve had an AUC of 0.87.
  • the optimal threshold was 0.279, and the corresponding sensitivity and specificity were 0.952 and 0.714, respectively (Figure 11, black line).
  • the classification prediction of the Italian cohort detected 82.6% of patients with PD, with 17.4% false negatives.
  • the ROC curve constructed with the Logit(P2) regression algorithm and the Italian cohort had an AUC of 0.83. ( Figure 11, gray line).

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Abstract

L'invention concerne l'identification de nouvelles combinaisons de métabolites spécifiques de maladies neurodégénératives, en particulier de la maladie de Parkinson (MP), pour une utilisation comme biomarqueurs dans le diagnostic précoce de maladies neurodégénératives, en particulier de la maladie de Parkinson au stade prodromal. La combinaison comprend les au moins 6 métabolites suivants: l'acétoacétate, la bétaïne, le beta- hydroxybutyrate (BHB), la créatine, le pyruvate, et la valine.

Description

MARQUEURS METABOLIQUES SPECIFIQUES DE MALADIES NEURODEGENERATIVES TELLES QUE LA MALADIE DE PARKINSON ET LEUR UTILISATION DANS LE DIAGNOSTIC
Description
L’invention concerne l’identification de nouvelles combinaisons de métabolites spécifiques de maladies neurodégénératives, en particulier de la maladie de Parkinson (MP), pour une utilisation comme biomarqueurs dans le diagnostic précoce de maladies neurodégénératives, en particulier de la maladie de Parkinson au stade prodromal ou de novo.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références à la fin du texte.
Etat de l’art
La maladie de Parkinson (MP) est l’une des maladies neurodégénératives les plus répandues dans le monde, touchant environ 1 % des adultes de plus de 60 ans [1]. Dès son apparition, la pathologie évolue progressivement et continuellement selon trois stades, i.e. préclinique, prodromal, et clinique, correspondant respectivement à l’apparition d’une neurodégénérescence sans symptôme (phase préclinique), puis la progression du processus neurodégénératif entraine l’apparition de symptômes non- moteurs (phase prodromale), et enfin à l’apparition de symptômes moteurs (phase clinique) [2], Ce sont ces symptômes, présents uniquement dans la dernière étape, qui sont suffisamment caractéristiques de la MP pour permettre son diagnostic [3]. Cependant, ils apparaissent lorsque 70-80% des neurones dopaminergiques de la voie nigro-striatale ou nigrostriée ont déjà dégénéré [1], donc généralement trop tard pour envisager une intervention neuroprotectrice [4], En outre, les analyses histopathologiques post mortem de cerveaux montrent qu’actuellement la précision du diagnostic de la MP chez des patients présentant des symptômes moteurs depuis moins de cinq ans [5] est seulement de 53 %. Ainsi, le diagnostic trop tardif et son imprécision [3, 6, 7] participent fortement à une prise en charge des patients et à des thérapies limitées et uniquement symptomatiques qui, de plus, deviennent inefficaces après plusieurs années.
Par ailleurs, bien que de nombreuses molécules aient déjà été testées et aient montré des preuves théoriques ou précliniques d’efficacité prometteuses, il n'existe toujours pas d'agent ou de thérapie neuroprotectrice permettant de ralentir, d’arrêter ou d’inverser efficacement la neurodégénérescence chez les patients atteints de MP, en partie parce que ces stratégies thérapeutiques sont appliquées trop tard [8-10].
Ainsi, pouvoir détecter la MP avec un degré élevé de spécificité, au cours des phases précoces, notamment chez des patients en phase prodromale ou nouvellement et récemment diagnostiqués (phase clinique précoce de novo), représente un défi crucial pour permettre le succès de stratégies curatives ou préventives de la MP, et le développement de nouvelles thérapies capables de retarder ou de ralentir sa progression [1 1 , 12].
La phase « prodromale », est caractérisée par un ensemble de symptômes non moteurs incluant des troubles d’ordres neuropsychiatriques (e.g. apathie, dépression, anxiété). Bien qu’ils soient exprimés chez 40 à 50% [13] des patients parkinsoniens, ils ne sont pas exclusifs de la maladie et peuvent être rencontrés dans d’autres pathologies. Les patients nouvellement et récemment diagnostiqués comme atteints de la maladie de Parkinson correspondent à une phase clinique précoce appelée « de novo » où une intervention neuroprotectrice peut encore être envisagée pour ralentir la progression de la maladie.
Ainsi, trouver des biomarqueurs fiables et spécifiques de la phase prodromale ou de novo, adaptés et hautement prédictifs pour une utilisation clinique, est un défi important, qui a motivé l’étude des inventeurs. Leur hypothèse de départ est que le métabolome - i.e. le pool global de métabolites - qui résulte de l’expression du génome mais reflète aussi l’impact de nombreux facteurs environnementaux [15], pourrait contenir des biomarqueurs potentiels de la maladie [16-19], maintenant considérée comme une maladie multifactorielle résultant d’interactions complexes entre des facteurs génétiques et environnementaux [14], D’ailleurs, des altérations métaboliques ont déjà été décrites chez des patients exprimant des symptômes neuropsychiatriques similaires à ceux observés dans la phase prodromale de la MP [20]. De plus, il a été démontré que l’analyse de dérégulations métaboliques observées dans le sérum de patients nouvellement diagnostiqués pour la MP a permis de précisément les distinguer de sujets sains [21 ], Enfin, des altérations du métabolome plasmatique ont été corrélées avec la progression de la maladie, chez des patients parkinsoniens [22], Cependant, l'étude du métabolome comme outil de prédiction de la phase prodromale de la MP n’a encore jamais été réalisée. Pour accéder à cette phase prodromale, l'utilisation de modèles animaux est incontournable. Néanmoins, bien que de nombreux modèles animaux de la MP aient été développés, aucun ne récapitule toutes les caractéristiques phénotypiques et étiologiques de la maladie [23].
Ainsi, bien que la détection précoce de la MP représente une étape clé pour le développement de thérapies curatives ou capables de retarder ou ralentir sa progression, il n’existe actuellement pas d’outil spécifique pour permettre le diagnostic de patients atteints de la MP avant l’apparition des symptômes moteurs, en particulier durant la phase prodromale. La découverte de biomarqueurs facilement mesurables et hautement prédictifs de la phase prodromale de la maladie apparaît comme un jalon pour l'accélération du développement des thérapies curatives et l'amélioration des soins aux patients.
Description de l’invention
Aussi, les Inventeurs ont développé une stratégie inédite permettant de proposer de nouveaux biomarqueurs capables de diagnostiquer spécifiquement et précocement une maladie neurodégénérative, par exemple la maladie de Parkinson (MP), en particulier la maladie de Parkinson au stade prodromal ou de novo. Cette stratégie, basée sur l’utilisation de différents modèles animaux et de différentes cohortes de patients, a surmonté les limites intrinsèques et a augmenté la valeur prédictive incomplète de chaque modèle pris individuellement, révélant un ensemble caractéristique de métabolites dérégulés utilisables comme biomarqueur potentiel. Enfin, l'étude a été étendue à des échantillons de sérum humain provenant de deux bio-banques afin de valider la pertinence clinique de ce nouveau biomarqueur de la MP.
Ainsi, via une évaluation comportementale et histologique et en utilisant des approches métabolomiques basées sur la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) suivies de statistiques multivariées avancées, les Inventeurs ont étudié les changements métaboliques (i) dans le sérum et le tissu cérébral de trois différents modèles animaux de la MP, deux modèles de rongeurs et un modèle de primate non-humain, mimant les différentes phases de la maladie [24-26], y compris la phase prodromale, et (ii) dans le sérum de deux cohortes de patients atteints de MP de novo (n=95) (Etats-Unis, Italie). Des dérégulations communes aux échantillons de sérum et de tissu ont été observées chez les animaux, ce qui montre que le sang pourrait refléter un dysfonctionnement central (cerveau) [27], au moins partiellement. Le modèle de rat 6-hydroxydopamine (6-OHDA) a d’abord été utilisé car il mime de façon stable chaque stade de la MP, sans évolution entre les stades, et il a déjà été validé pour l'étude des phases prodromales [24]. De plus, il représente un modèle de MP phénotypiquement correct, avec un bon isomorphisme et une bonne valeur prédictive [28], bien qu’il soit étiologiquement limité. Le modèle de rat a-synucléine [29] a ensuite été utilisé car il présente l’avantage d'être progressif dans l’établissement du phénotype, ce qui rend possible des études longitudinales. De plus, il est plus proche de la pathologie humaine, notamment en ce qui concerne les caractéristiques anatomo-pathologiques et les mécanismes physiopathologiques de la maladie [30].
Enfin, des primates MPTP (1 -méthyl-4-phényl-1 ,2,3,6-tétrahydropyridine) non humains ont été utilisés car ils partagent une plus grande identité de séquence du génome avec les humains et des similarités neuro-anatomiques importantes.
Les changements métaboliques ont été analysés au niveau du sang (sérum) afin de trouver des métabolites faciles à transposer en clinique, et dans des régions spécifiques du cerveau différemment touchées par le processus neurodégénératif (le striatum dorsal (DS) et le noyau accumbens (NAcc)) afin de potentiellement associer des changements concernant ces métabolites aux processus physiopathologiques impliqués dans la MP.
Dans une perspective translationnelle, l’étude métabolomique a été étendue à des sérums de patients parkinsoniens nouvellement diagnostiqués (phase de novd) provenant de deux bio-banques différentes (Etats-Unis (NIH) +/- 2 patients, Italie). La stratégie translationnelle a révélé des dérégulations métaboliques communes dans le sérum des différents modèles animaux et des patients atteints de la MP. Certaines d'entre elles ont été retrouvées dans les échantillons de tissus (modèles animaux), reflétant peut-être des mécanismes physiopathologiques associés au développement de la MP.
Ainsi, cette étude inter-espèces a permis de renforcer la pertinence des métabolites circulant pour le diagnostic de la MP. De plus, elle propose un biomarqueur composite construit avec une combinaison de 6 métabolites permettant de distinguer les animaux mimant la MP des animaux témoins (sham), quel que soit le stade de la maladie, et en particulier dès la phase prodromale ou de novo. Il est important de noter que la combinaison des mêmes métabolites a permis de distinguer les patients atteints de la MP des sujets sains. Il est intéressant de noter que chez les animaux, certaines dérégulations métaboliques sont apparues avant les symptômes moteurs et pourraient ainsi représenter des biomarqueurs précoces de la maladie.
Ainsi les Inventeurs ont démontré que les concentrations relatives de 6 métabolites : acétoacétate, bétaïne, B-hydroxybutyrate (BHB), créatine, pyruvate, et valine, combinées ensemble selon une méthode de régression logistique, pouvaient constituer un biomarqueur composite de la MP précis, chez l’animal et chez l’homme.
L'utilisation de ce biomarqueur a permis de distinguer les patients parkinsoniens américains de témoins sains (contrôle) avec une grande sensibilité (0,95), et des patients parkinsoniens italiens avec une sensibilité légèrement moindre (0,83). La procédure pré-analytique divergente appliquée pour le prélèvement de sérum dans les deux cohortes (c'est-à-dire les tubes utilisés, le traitement des échantillons...) pourrait constituer une source majeure de variabilité expérimentale qui pourrait expliquer cette différence [31 , 32], En outre, il convient de noter que les échantillons humains ont été collectés selon un protocole expérimental très strict et standardisé, mais qui n'a pas été conçu pour la métabolomique. Cela reflète la puissance de la métabolomique et la robustesse des résultats, et conforte l'opinion selon laquelle les biomarqueurs sériques, plus faciles à utiliser et moins invasifs que des méthodes d'imagerie, pourraient présenter une efficacité similaire [33].
Il est intéressant de noter que parmi les six métabolites utilisés pour construire le biomarqueur composite de la MP dans les modèles animaux ou chez l'homme, la dérégulation de la bétaïne, du BHB et du pyruvate a été corrigée par un traitement chronique avec un agoniste dopaminergique (i.e. le Pramipexole ou Pra), qui corrige également les déficits motivationnels chez les rats 6-OHDA mimant la phase prodromale. Cette validation pharmacologique souligne leur potentielle implication dans les dérégulations cellulaires impliquées dans les symptômes neuropsychiatriques associés au stade prodromal ou de novo. Les dérégulations métaboliques rapportées dans la présente étude pourraient donc également fournir quelques indices sur les mécanismes impliqués dans la progression de la MP.
En résumé, la présente étude a fait état, pour la première fois, d'altérations métaboliques sériques communes dans trois modèles animaux mimant la MP, bien que provenant de cohortes et d'espèces différentes. En conséquence, cette signature commune est susceptible de refléter des altérations spécifiques liées à la physiopathologie de la MP. En particulier, des dérégulations spécifiques caractéristiques du stade prodromal ou de novo ont été mises en évidence. En plus de fournir des indices pour une étude plus approfondie des altérations métaboliques dans les modèles animaux, des dérégulations métaboliques ont également été trouvées dans les sérums de patients parkinsoniens nouvellement diagnostiqués (c'est-à-dire en phase clinique de novo) provenant de deux bio-banques, non spécifiquement conçues pour la métabolomique. La régression logistique, utilisant les niveaux des mêmes métabolites que ceux utilisés pour les animaux, a permis une discrimination très adéquate entre les sujets sains et les patients atteints de MP dans deux cohortes d'origines différentes (au moins 0,83).
Dans l'ensemble, la présente étude inter espèces, a démontré l'utilité et la reproductibilité de la métabolomique non ciblée comme approche non invasive pour la recherche de biomarqueurs de la MP. Cette approche semble particulièrement prometteuse pour les patients atteints de la MP, car le sérum est facilement accessible et le biomarqueur peut être pertinent même aux premiers stades de la maladie lorsque les autres méthodes échouent.
La présente invention a donc pour objet un procédé in vitro pour le diagnostic précoce d’une maladie neurodégénérative à partir d’un échantillon biologique d’un patient comprenant : a) la mesure in vitro dans ledit échantillon biologique des niveaux d’expression (E) des au moins 6 métabolites suivants : l’acétoacétate, la bétaïne, le B- hydroxybutyrate (BHB), la créatine, le pyruvate, et la valine ; b) la comparaison des niveaux d’expression des métabolites mesurés à l’étape a) par rapport à ceux d’un échantillon biologique de référence ou à des valeurs de référence ; où une différence (e.g. dérégulation conjointe) des niveaux d’expression des métabolites mesurés à l’étape a) par rapport à ceux de l’échantillon biologique de référence ou à des valeurs de référence est l’indication que ledit patient est atteint de la maladie neurodégénérative.
Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, l’étape a) comprend en outre la mesure in vitro du niveau d’expression d’au moins un métabolite choisi dans le groupe constitué de l’alanine, le lactate, le DMSO2, la glycine, la sérine, la thréonine, le myo-inositol, et la leucine. Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, l’étape a) comprend ou consiste en la mesure des niveaux d’expression de l’acétoacétate, la bétaïne, le B-hydroxybutyrate (BHB), la créatine, le pyruvate, et la valine.
On entend par « diagnostic précoce », au sens de la présente invention, un diagnostic réalisé à un stade de la maladie neurodégénérative où les symptômes discriminants ne sont pas encore apparus ou chez des patients nouvellement et récemment diagnostiqués. Par exemple, un diagnostic serait considéré comme précoce si réalisé au stade prodromal ou de novo de la MP.
On entend par « maladie neurodégénérative » au sens de la présente invention, une pathologie progressive qui affecte le cerveau ou plus globalement le système nerveux central, entraînant la mort des cellules nerveuses. Les plus célèbres et les plus fréquentes sont la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson mais il en existe d'autres (sclérose en plaques, maladie de Huntington, maladie de Creutzfeldt- Jakob, sclérose latérale amyotrophique (encore appelée maladie de Charcot),...). En particulier, il s’agit de la maladie de Parkinson.
On entend par « échantillon biologique » au sens de la présente invention, un échantillon biologique (e.g. de fluide corporel (sérum, sang, urine, salive, ...), ou encore de tissu (cerveau, moelle, foie, peau,...)) prélevé après une mise à jeun de 12h chez un patient.
On entend par « échantillon biologique de référence » au sens de la présente invention, un échantillon biologique (e.g. de fluide corporel (sérum, sang, urine, salive, ...), ou encore de tissu (cerveau, moelle, foie, peau, ...)) prélevé après une mise à jeun de 12h chez un individu sain (témoin/contrôle/sham), c’est-à-dire ne présentant aucune maladie neurologique, en particulier aucun symptôme de la MP ou pouvant être avant-coureur de la MP, aucun antécédent familial de trouble du mouvement et/ou de MP, et aucune affection médicale spécifique.
On entend par « valeur de référence » au sens de la présente invention, la valeur du niveau d’expression d’un métabolite chez un individu sain, c’est-à-dire ne présentant aucune maladie neurologique, en particulier aucun symptôme de la MP ou pouvant être avant-coureur de la MP, aucun antécédent familial de trouble du mouvement et/ou de MP, et aucune affection médicale spécifique.
On entend par « différence des niveaux d’expression » au sens de la présente invention, la variation des niveaux d’expression des métabolites mesurés chez un patient par rapport aux niveaux d’expression des mêmes métabolites chez un individu sain (valeurs de référence), c’est-à-dire ne présentant aucune maladie neurologique, en particulier aucun symptôme de la MP ou pouvant être avant-coureur de la MP, aucun antécédent familial de trouble du mouvement et/ou de MP, et aucune affection médicale spécifique. Ainsi, dans le cas par exemple de la maladie de Parkinson.
La présente invention a pour objet un procédé in vitro pour le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson à partir d’un échantillon biologique d’un patient comprenant : a) la mesure in vitro dans ledit échantillon biologique des niveaux d’expression des métabolites suivants : l’acétoacétate, la bétaïne, le B-hydroxybutyrate (BHB), la créatine, le pyruvate, et la valine ; b) le calcul des régressions logistiques Logit(Pi) ou Logit(P2), respectivement, selon les formules suivantes :
-45,60 + 0,28EBHB - 4,54Epyruvate — 1 1 ,23Evaline + 7,05EAcétoacétate + 2,85Ecréatine — 7,79EBétaïne ! OU
-42,78 + 0, 16EBHB — 3,31 Epyruvate — 1 2,01 Evaline + 7,06EAcétoacétate + 3, 14Ecréatine — 8, 27 E Bétaïne, où EBHB, Epyruvate, Evaiine, EAcétoacétate, Ecréatine et EBétaïne correspondent respectivement aux niveaux d’expression mesurés du B-hydroxybutyrate (BHB), du pyruvate, de la valine, de l’acétoacétate, de la créatine et de la bétaïne, dans l’échantillon biologique ; et où une valeur calculée de Log it( Pi ) ou Logit(P2) supérieure à 0,316 u.a. est l’indication que ledit patient est atteint de la maladie de Parkinson ; où une valeur calculée de Logit(Pi) ou Logit(P2) inférieure à 0,279 u.a. est l’indication que ledit patient n’est pas atteint de la maladie de Parkinson ; où une valeur calculée de Logit(Pi) inférieure à 0,316 u.a. est l’indication que ledit patient n’est pas atteint de la maladie de Parkinson ; où une valeur calculée de Logit(P2) supérieure à 0,279 u.a. est l’indication que ledit patient est atteint de la maladie de Parkinson.
On entend par « valeur calculée de Logit(P) » au sens de la présente invention, une valeur de standard obtenue à partir de l’application d’une régression logistique utilisant la mesure des niveaux d’expression des métabolites précédemment cités. Dans le cas de la maladie de Parkinson, selon les deux régressions logistiques ci- dessus utilisant les 6 métabolites suivants : acétoacétate, bétaïne, B-hydroxybutyrate (BHB), créatine, pyruvate, et valine, tout individu obtenant une valeur supérieure à 0,316 (unité arbitraire, u.a.) sera considéré comme atteint de la MP et tout individu obtenant une valeur inférieure à 0,279 (unité arbitraire, u.a.) sera considéré comme n'étant pas atteint de la MP.
Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, l’échantillon biologique du patient provient d’un patient au stade prodromal ou de novo de la MP.
On entend par « stade prodromal de la MP » au sens de la présente invention, un stade où le diagnostic de la MP n’a pas pu être établi de manière définitive et/ou sûre, sur la base des symptômes présentés. Par exemple, cela concerne tout patient présentant des symptômes non moteurs fréquemment observés chez des patients qui développent finalement la maladie et qui pourraient justement représenter des symptômes avant-coureur (symptômes neuropsychiatriques (apathie, dépression, anxiété), perte de l’odorat, constipation, troubles du sommeil, troubles digestifs, déficits cognitifs) et/ou tout patient qui présente dans sa lignée généalogique des personnes déjà atteintes de la maladie.
On entend par « stade de novo de la MP » ou « patients de novo » au sens de la présente invention, des patients nouvellement et récemment diagnostiqués qui sont à un stade clinique précoce où une intervention neuroprotectrice peut encore être envisagée pour ralentir la progression de la maladie.
Selon un mode particulier du procédé de la présente invention, l’échantillon biologique est par exemple un échantillon de sérum.
Selon un mode particulier de la présente invention, l’étape de mesure des niveaux d’expression est réalisée par exemple par des mesures de spectroscopie par RMN.
La présente invention a également pour objet un biomarqueur destiné au diagnostic précoce d’une maladie neurodégénérative comprenant la combinaison des au moins six métabolites suivants : acétoacétate, bétaïne, B-hydroxybutyrate (BHB), créatine, pyruvate, et valine.
Selon un mode particulier de la présente invention, le biomarqueur comprend en outre la combinaison d’au moins un métabolite choisi dans le groupe constitué de l’alanine, le lactate, le DMSO2, la glycine, la sérine, la thréonine, le myo-inositol, et la leucine.
Selon un mode particulier de la présente invention, le biomarqueur comprend ou consiste en la combinaison des six métabolites suivants : acétoacétate, bétaïne, B- hydroxybutyrate (BHB), créatine, pyruvate, et valine. La présente invention a également pour objet, l’utilisation in vitro d’une combinaison de métabolites selon la présente invention, comme biomarqueur d’une maladie neurodégénérative, en particulier de la maladie de Parkinson.
Brève description des figures
La figure 1 représente un schéma des procédures expérimentales appliquées à différents modèles animaux de la MP. Tous les échantillons de sérum ont été prélevés après un jeûne et selon le même protocole. Ils ont été analysés par RMN 1H à 950 MHz. Des échantillons de cerveau de rats 6-OHDA ont été utilisés pour des analyses histologiques et une analyse métabolomique effectuée par RMN HRMAS 1H à 500 MHz.
La figure 2 représente la dénervation dopaminergique striatale induite par une lésion bilatérale de la substance noire compacte (SNc) à la 6-OHDA entraînant un comportement de type apathique et des dysfonctionnements de la motricité fine. (A) Score de progression de la MP (PMP) utilisé pour classer les animaux 6-OHDA en fonction de la progression de la maladie. Le score PMP est basé sur la somme des composantes histologiques et comportementales (auto-administration et réajustement du pas), en prenant des valeurs de 0 à 4 pour chacune. De cette façon, un score peut être attribué à chaque animal de 0 (animal témoin/sham) à 3-7 (animal de type prodromal), ou 8-12 (animal de type clinique). (B) Exemples de coupes coronales de cerveaux de rats témoins (sham) et 6-OHDA, marquées pour la tyrosine hydroxylase (TH) sur trois niveaux striataux représentatifs et localisés par rapport au bregma, et schémas correspondants sélectionnés dans l'atlas de Paxinos et Watson [78]. Les zones utilisées pour la quantification de la dénervation dopaminergique dans les différentes sous-régions analysées sont illustrées. Les barres d'échelle représentent 2 mm. (C) Quantification de la perte de marquage TH aux niveaux striataux indiqués en (B), exprimée en pourcentage de la valeur moyenne obtenue pour les animaux témoins (sham) (n=22). Une forte diminution des neurones TH-positifs dans le DS et une diminution plus légère dans le Nacc a été observée chez les rats de type prodromal (n=14) et les rats de type clinique (n=15). (D) La lésion 6-OHDA de la SNc a induit un déficit instrumental sévère dans une procédure opérante d'autoadministration de saccharose. Nombre moyen de doses de saccharose obtenues par session. (E) La lésion 6-OHDA de la SNc a réduit le nombre de réajustements dans un test de réajustement du pas, uniquement chez les animaux de type clinique. Nombre moyen de réajustements du membre antérieur pour deux essais avant (barre gauche), et après (barre droite) l'injection de 6-OHDA (animaux de type prodromal et de type clinique) ou de sérum physiologique (témoin/sham). Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM (erreur standard de la moyenne) et testées par ANOVA ou ANOVA à mesure répétée (RM-ANOVA) à un facteur, suivies d'un test post-hoc de Tukey ou de Sidak. *** : p < 0,001 comparé au témoin (sham); ## : p < 0,01 de type clinique comparé au type prodromal ; $$$ : p < 0,0001 avant chirurgie comparé à après chirurgie.
La figure 3 représente l’activité motrice ambulatoire mesurée dans une aire ouverte. Les lésions dopaminergiques n'ont pas affecté l'activité ambulatoire horizontale mesurée sur une période de 15 minutes. Les données sont présentées par valeur moyenne pour chaque minute ± SEM.
La figure 4 représente l’évolution du profil métabolique sérique des rats 6-OHDA modifié en fonction des différentes phases de la MP. (A) Exemple de spectre RMN 1H à 950 MHz (zones spectrales : 5 0.5-4.7ppm et 5 6-8.5ppm) acquis avec la séquence d'impulsions CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill). Attribution : 1 -isoleucine ; 2-leucine ; 3-valine ; 4-BHB ; 5-lactate ; 6-alanine ; 7-arginine ; 8-lysine ; 9-acétate ; 10-glutamine ; 1 1 -méthionine ; 12-acétone ; 13-acétoacétate ; 14-glutamate ; 15-pyruvate ; 16-citrate ; 17-asparagine ; 18-créatine ; 19-phosphocréatine ; 20-DMSO2 ; 21 -choline ; 22- phosphocholine ; 23-glucose ; 24-bétaïne ; 25-myo-inositol ; 26-glycine ; 27-glycérol ; 28-thréonine ; 29-glycérophosphocholine ; 30-sérine ; 31 -ascorbate ; 32-glycérate ; 33-proline ; 34-désoxycytidine triphosphate ; 35-tyrosine ; 36-histidine ; 37- phénylalanine ; 38-formiate. Les macromolécules ne sont pas spécifiées (voir tableau 2). (B-C) Modèle statistique OPLS (orthogonal partial least square) construit avec les données RMN et les scores PMP des animaux. R2Y =0,926 ; Q2 = 0,604 ; 1 composante prédictive et 3 composantes orthogonales ; CV-ANOVA (analysis of variance of cross-validated residuals) p-value= 3,47 x10-7. (B) Graphique des scores de l’OPLS par rapport à la première composante prédictive et la première composante orthogonale. Une gradation claire de la couleur est observée de gauche à droite, montrant que les profils métaboliques évoluent avec la progression de la MP. (C) Graphique des poids de l’OPLS, tracés en une dimension pour imiter un spectre RMN, avec les variables RMN en abscisses. Les poids sont colorés selon leur corrélation avec le score PMP, du gris clair (faible corrélation) au gris foncé (forte corrélation). Les métabolites ayant une corrélation > 0.5 sont considérés comme étant les plus importants dans la discrimination. Les pics positifs indiquent les métabolites qui sont régulés à la hausse avec l'augmentation du score, tandis que les pics négatifs sont ceux qui sont régulés à la baisse avec l'évolution du score. (D) Amplitude relative des métabolites les plus impliqués dans la gradation métabolique observée avec l’OPLS, i.e. l'alanine, la bétaïne, le BHB, le diméthyl sulfone (DMSO2), la glycine, le lactate, le pyruvate, la sérine, la thréonine, la valine, chez les animaux témoins (sham) (n=22), 6-OHDA de type prodromal (n=14) et de type clinique (n=15).
Moyenne ± SEM, ANOVA un facteur, suivie d'un test post-hoc de Tukey et d'une correction pour les comparaisons multiples. * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 . u. a. : unités arbitraires.
La figure 5 représente la gradation du profil métabolique de cerveau associée au score PMP des animaux. (A) Exemple de spectre RMN HRMAS 1H à 500 MHz. Attribution 1 -lactate ; 2-alanine ; 3-GABA ; 4-acétate ; 5-glutamate ; 6-glutamine ; 7-N- Acétylaspartate ; 8-créatine ; 9-phosphocréatine (PCR); 10-phosphoéthanolamine ; 11 -glycérophosphocholine ; 12-phosphocholine (PC) ; 13-choline ; 14-scyllo-inositol ; 15-taurine ; 16-myo-inositol ; 17-ascorbate ; 18-glycine ; 19-glutathione. (B) Courbe des scores du modèle OPLS, construit avec les spectres RMN 1HRMAS du DS (i, en haut) et du Nacc (ii, en bas). Il y a une gradation claire des couleurs de gauche à droite, montrant que les profils métaboliques évoluent avec la progression de la MP, en particulier pour les échantillons DS (i). DS : R2Y= 0,883 ; Q= 0,703, 1 +3 composantes, CV ANOVA p-value= 0,0003 ; (ii) Nacc : R2Y= 0,690 ; Q2= 0,523, 1 +1 composantes, CV ANOVA p-value= 0,0005. (C) Amplitude relative des métabolites dans le DS (i) et le Nacc (ii) chez des animaux témoins (sham), 6-OHDA de type prodromal et de type clinique pour les 7 métabolites clés impliqués dans la gradation métabolique observée dans l’OPLS, i.e. l'alanine, la choline, le glutamate, le lactate, la PC, la PCR et la taurine. Moyenne ± SEM, ANOVA un facteur, suivie d'un test post-hoc de Tukey et d'une correction pour les comparaisons multiples* : p < 0,05.
La figure 6 représente l’impact d’un traitement chronique avec un agoniste dopaminergique (Pra) sur les dérégulations comportementales et métaboliques des rats 6-OHDA. (A) Performances d'auto-administration. Nombre moyen de doses de saccharose obtenues par séance après la lésion ou après l'administration chronique d’une solution saline (Veh) ou de Pra (3 derniers jours). Les animaux de type prodromal traités avec le Pra montrent une réversion totale de l'effet de la lésion sur le nombre de doses de saccharose obtenues par rapport aux animaux de type prodromal traités avec le Veh. Les animaux de type clinique traités avec le Pra présentent une augmentation modérée du nombre de doses de saccharose obtenues par rapport aux animaux de type clinique traités avec le Veh, sans atteindre les performances des animaux témoins (sham). (B) Dérégulations métaboliques du sérum. Pourcentage de variation des métabolites sériques entre les animaux témoins (sham) et les animaux de type prodromal (barre pleine) et entre les animaux de type prodromal traités par Veh ou Pra (barre hachurée). L’alanine, la bétaïne, le BHB et le pyruvate varient dans le sens opposé à l’effet de la lésion. (C) Dérégulation métabolique du cerveau. Pourcentage de variation des métabolites du tissu cérébral normalisé aux animaux témoins (sham) traités avec la Veh dans le DS et dans le Nacc pour les animaux de type prodromal (i) et de type clinique (ii). Les animaux traités avec le pramipexole (barre hachurée) ont montré une variation inverse de la dérégulation des niveaux de métabolites par rapport aux animaux traités avec le Veh (barre pleine). Moyenne ± SEM, ANOVA un facteur, suivie d’un test post-hoc de Tukey. “ : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 ; # : p < 0,05.
La figure 7 représente l’absence de dérèglement métabolique au niveau sérique chez les animaux ayant reçu une infusion de virus contrôle GFP (Green fluorescent protéine). Histogramme représentant les niveaux des métabolites correspondant aux différents prélèvements réalisés chez les animaux GFP pour l'acétoacétate, la bétaïne, le BHB, la créatine, la glycine, le myo-inositol, le pyruvate, et la sérine qui représentent les principaux métabolites impliqués dans la discrimination des 3 groupes dans l'OPLS-DA (analyse discriminante) d’animaux a-synucléine. Les barres blanches correspondent aux échantillons à la semaine 0, les barres gris clair à 3 semaines après l’infusion du virus et les barres gris foncés à 10 semaines après. Les données sont présentées sous forme de valeur moyenne ± SEM et sont testées par ANOVA un facteur, suivie d'un test post hoc de Tuckey.
La figure 8 représente l’étude métabolomique par RMN sur des échantillons de sérum des autres modèles de la MP dans différentes espèces (A) Modèle animal rat a-synucléine. Scores de l’OPLS-DA construite à partir des spectres RMN 1H de sérum, par rapport aux 2 premières composantes prédictives orthogonales. Les 3 groupes, mimant les 3 différentes phases de la MP, sont clairement discriminés. R2Y= 0,929 ; Q2= 0,518 ; 1 composante prédictive et 3 composantes orthogonales ; CV ANOVA p- value= 0,008. (B) Amplitude relative des métabolites les plus impliqués dans la discrimination entre les animaux a-synucléine de type prodromal (n= 1 1 ), de type clinique (n= 1 1 ) et les animaux témoins (sham) (n= 12) i.e. acétoacétate, bétaïne, BHB, créatine, glycine, myo-inositol (myo), pyruvate, sérine. (C) Modèle primate non humain MPTP. Scores de l’OPLS-DA construite à partir des spectres 1H RMN de sérum, par rapport aux 2 premières composantes prédictives et orthogonales. Les animaux témoins (sham) et les animaux de type clinique sont clairement différenciés. R2Y = 0,998 ; Q2 = 0,963 ; 1 composante prédictive et 1 composante orthogonale ; p-value de l'ANOVA CV = 0,0005. (D) Histogramme montrant les variations quantitatives relatives des métabolites entre les animaux MPTP (n= 8) et témoins (sham) (n= 6) pour l'acétoacétate, l'alanine, la bétaïne, le BHB, la créatine, le lactate, le pyruvate et la valine, représentant les principaux métabolites impliqués dans la discrimination des 2 groupes dans l'OPLS-DA. Moyenne ± SEM, modèle mixte suivi d'un test post-hoc de Tukey ou du test t de Mann-Whitney * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 .
La figure 9 représente l’effet du pramipexole sur les taux de BHB et de bétaïne chez les patients atteints de la MP dans la cohorte des Etats-Unis. Histogramme montrant les valeurs quantitatives relatives des métabolites chez le groupe témoin (contrôle) (barre blanche), les patients atteints de la MP (barre foncée) et les patients atteints de la MP et traités avec du Pra (barre hachurée). Les données sont présentées sous forme de valeur moyenne ± SEM.
La figure 10 représente la régression logistique ayant permis de construire un biomarqueur composite à partir de 6 métabolites sériques : BHB, acétoacétate, valine, créatine, bétaïne et pyruvate. (A) Courbe ROC (receiver operating curve) avec les données d’échantillons sériques des modèles animaux témoins (sham) et de type prodromal (rats 6-OHDA et a-synucléine) (AUC (aire sous la courbe) = 0,936, sensibilité : 0,853, spécificité : 0,88). (B) Courbe ROC avec les données des patients parkinsoniens et des contrôles correspondants issus de la cohorte des Etats-Unis (AUC = 0,88, sensibilité : 0,957, spécificité : 0,714).
La figure 1 1 représente la régression logistique ayant permis de construire un biomarqueur composite à partir de 6 métabolites sériques : BHB, acétoacétate, valine, créatine, bétaïne et pyruvate. Courbe ROC avec les données des patients parkinsoniens et des contrôles correspondants issus de la cohorte des Etats-Unis (moins 2 patients non retenus) (AUC = 0,88, sensibilité : 0,957, spécificité : 0,714) et de la cohorte italienne (AUC = 0,83, sensibilité : 0,65, spécificité : 0,90).
La figure 12 représente la courbe de régression logistique pour le panel de métabolites sériques incluant : BHB, acétoacétate, valine, créatine, bétaïne et pyruvate. (A) Courbe ROC à partir d'échantillons de sérum de tous les modèles animaux de type MP. AUC = 0,954, sensibilité : 0,85, spécificité : 0,915. (B) Algorithme de régression logistique pour tous les animaux de type MP par rapport au groupe témoin (sham).
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : MATERIEL ET METHODES
Schéma
La figure 1 illustre un schéma de l'ensemble du protocole appliqué pour les modèles animaux. Les rats de la première cohorte (figure 1 (i)) ont été entraînés pendant deux semaines à une tache d’auto-administration de saccharose jusqu'à ce qu'ils atteignent des performances stables et ont été soumis à un test de réajustement du pas avant de recevoir une injection intracérébrale bilatérale de 6-OHDA (n=29) ou de sérum physiologique (NaCI, n=22) dans la SNc. Après la stabilisation de la lésion (environ 3 semaines), l'auto-administration a été reprise pendant une semaine, et le test de réajustement du pas a été répété pour suivre l'évolution des performances des animaux, avant de soumettre chaque groupe (6-OHDA et NaCI) à 2 semaines d'injections quotidiennes de Pra 0,2 mg/kg (6-OHDA Pra n=15 ; NaCI Pra n=1 1 ) ou de sérum physiologique (NaCI 0,09% ; 6-OHDA NaCI n=14 ; NaCI NaCI n=1 1 ). L'auto- administration a été poursuivie tout au long du traitement au Pra et un dernier test de réajustement du pas a été effectué à la fin du traitement. Des échantillons de sérum ont été prélevés après l'injection intracérébrale de 6-OHDA ou NaCI, à la suite de la stabilisation des performances de l'auto-administration et à la fin du traitement au Pra. Les cerveaux ont été recueillis à la fin de la procédure comportementale, congelés dans de l'azote liquide et maintenus à -80 °C avantd'être traités pour des expériences d'histologie et de RMN HRMAS 1H.
La deuxième cohorte de rats (figure 1 (ii)), a reçu une injection intracérébrale d'AAV-hA53Ta-syn (n=12) ou d'AAV-GFP (n=12) dans la SNc. Des échantillons de sérum ont été prélevés longitudinalement pendant l'étude, avant, 3 et 10 semaines après l’injection d'AAV.
Des singes (n = 8) ont reçu des injections intramusculaires de MPTP (0,3 à 0,5 mg/kg) tous les 4 à 5 jours pendant 3 semaines [77] . L'administration répétée de faibles doses de MPTP a été utilisée pour mimer un stade modéré, avec un développement lent de la maladie, et le déclenchement d'une lésion dopaminergique modérée. Des échantillons de sérum ont été prélevés au début de l'expérience et après que les singes aient atteints un état parkinsonien stable (figure 1 (iii)).
Tous les échantillons de sérum ont été analysés par RMN 1H à 950 MHz et les échantillons de cerveau ont été soumis à la RMN HRMAS 1H à 500 MHz.
Animaux
Rats : les expériences ont été réalisées sur des rats Sprague-Dawley mâles adultes (Janvier, Le Genest-Saint-Isle, France), pesant environ 300 g (7 semaines) au début de l'expérience. Ils ont été hébergés dans des conditions de laboratoire et d'éthique standard avec un cycle lumière-obscurité inversé (12 h/cycle lumière- obscurité, avec allumage des lumières à 19 heures) et avec de la nourriture et de l'eau disponibles ad libitum.
Singes : les expériences ont été réalisées sur des mâles adultes Macaca fascicularis, pesant entre 5 et 8 kg, âgés de 3 à 5 ans et logés dans des conditions standard (cycle lumière-obscurité de 12:12 heures ; 23°C ; 50% d'humidité).
Les protocoles utilisés étaient conformes à la loi de 2010 sur la protection des animaux de l'Union européenne et à la directive française 2010/63, et ont été approuvés par le comité national d'éthique français (2013/113) n° 004 et par le comité d'éthique local C2EA84 et CELYNE C2EA.
Chirurgie
Injection bilatérale de 6-OHDA : Comme décrit précédemment [18, 23], les rats ont reçu une injection sous-cutanée de désipramine (15 mg/kg) 30 minutes avant l'injection de 6-OHDA afin de protéger les neurones noradrénergiques. Tous les animaux ont ensuite été anesthésiés par injection intrapéritonéale de kétamine- xylazine (100-7 mg/kg), et placés dans un cadre stéréotaxique (Kopf Instruments). Les coordonnées stéréotaxiques des sites d'injection ont été les suivantes, selon l'atlas stéréotaxique de Paxinos et Watson [78] et par rapport au bregma : barre incisive placée à -3,2mm : antéropostérieure (AP)=-5,4mm / latérale (L)=+/-1 ,8mm / dorsoventrale (V)=-8,1 mm. Les animaux ont reçu une injection bilatérale de 2.3pl de 6-OHDA (3mg/ml) ou de sérum physiologique (NaCI 0,9% ; témoin/sham), à un débit de 0.5pl/min. Pour les animaux injectés avec la 6-OHDA et présentant une inanition passagère 2-3 jours après l'opération, une supplémentation avec un régime liquide hautement calorique et des aliments appétissants a été mise en place pendant 1 -2 semaines, et arrêtée 10 jours avant le prélèvement de sérum. Les animaux qui ne se sont pas rétablis ont été exclus.
Injection bilatérale d’a-synucléine : Comme décrit précédemment [19], des rats ont été anesthésiés avec de l'isof I u rane à 2,5 % et placés dans un cadre stéréotaxique (Kopf Instruments) afin de recevoir deux injections bilatérales d'AAV-hA53Ta-syn (1 pl- 7,0x1012vg/ml) ou d'AAV-GFP (7,0x1012vg/ml, animaux témoins/sham) dans la SNc (AP=-5,1 et -5,6mm / L = +/- 2,2mm / V = 8mm de la bregma). Après avoir été réveillés, les animaux ont été replacés dans l'animalerie.
Evaluation comportementale
Rats 6-OHDA : Les rats ont été soumis à 2 tests comportementaux, 3 semaines après l'opération, alors que la lésion 6-OHDA été stabilisée [79].
Auto-administration opérante de saccharose (composante motivationnelle) : Des rats ont été entraînés à s'auto-administrer une solution de saccharose à 2,5% dans des chambres opérantes (Med Associates, St Albans, VT, USA) contenant un levier actif, renforcé, pour lequel un appui provoque la délivrance de 0,2ml d’une solution de saccharose associée à un stimulus lumineux de faible intensité, et un levier inactif, non renforcé, pour lequel un appui ne provoque ni délivrance de saccharose ni stimulus lumineux. Cette tâche a été réalisée avec un ratio fixe de 1 , un seul appui sur le levier renforcé entraînant la délivrance d'une récompense. Chaque séance se terminait lorsque 100 récompenses étaient obtenues, ou à la fin du temps imparti (1 heure). Le nombre de récompenses obtenues a été compté pour chaque session par le logiciel MED-PC IV.
Test de réajustement du pas (composante motrice) : Les animaux, maintenus par le tiers postérieur de leur corps, ont été déplacés sur une longueur de 90 cm par un mouvement rectiligne et régulier de gauche à droite, et inversement, le long d'une table à surface lisse. Le nombre d'ajustements des membres antérieurs réalisés au cours du déplacement a été compté [80]. Le test a été effectué trois fois, par deux expérimentateurs différents, en aveugle (ignorance de la nature des groupes expérimentaux).
Singes MPTP : La gravité de l'état parkinsonien a été évaluée à l'aide d'une échelle de notation prenant en compte les symptômes moteurs classiques (bradykinésie, rigidité, tremblements, blocage, posture et position des bras), les activités spontanées (mouvements des bras, mouvements oculaires spontanés et activité dans la cage d'hébergement) et d'autres activités (vocalisation, mouvements oculaires déclenchés et alimentation) [81 ].
Histologie : Immunomarquage de la TH et quantification de la dénervation chez les rats 6-OHDA.
Prélèvement des cerveaux : Les rats ont été sacrifiés par décapitation 1 jour après la dernière séance d'auto-administration de saccharose et 1 heure après la dernière injection de Pra ou de Veh (c'est-à-dire 6 semaines après l’injection de 6- OHDA ou de solution saline). Les cerveaux ont été immédiatement congelés dans de l'azote liquide et conservés à -80 °C. Ils ont ensute été tranchés à l’aide d’un cryostat thermostaté à -20 ° C. Des coupes des régions d’intéiêt ont été prélevées pour procéder à la fois à l’immunomarquage de la TH et réaliser l’étude métabolomique. Pour la RMN 1HHRMAS, des coupes épaisses de tissu de DS et de Nacc ont été regroupées dans des inserts, et maintenues à -80 °C jusqu'à l'analyse RMN.
Pour l’immunomarquage de la TH, des coupes coronales de 14 pm des niveaux striataux d'intérêt [18] ont été prélevées et stockées à -20 °C. L’immunomarquage a ensuite été effectué comme décrit précédemment [18,23]. Brièvement, après fixation avec du paraformaldéhyde à 4 %, les coupes striatales ont été incubées avec un anticorps anti-TH (monoclonal de souris MAB5280, Millipore, France, 1 :2500) pendant une nuit à 4°C. Ensuite, les coupes ont été incubées avec un anticorps IgG biotinylé de chèvre anti-souris (BA-9200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA ; 1 : 500) et l’immunoréactivité révélée par le conjugué Avidine-peroxydase (Vectastain ABC Elite, Vector Laboratories Burlingame, CA, USA).
La quantification de l'étendue de la dénervation dopaminergique striatale a été déterminée avec le système d'analyse d'images informatisé ICS Framework (Calopix, version 2.9.2, TRIBVN, Châtillon, France) couplé à un microscope optique (Nikon, Eclipse 80i). Après avoir dessiné les masques des trois niveaux striataux d’intérêt, les densités optiques (DO) ont été mesurées pour chaque sous-région striatale (DS et Nacc). Les DO ont été exprimées en pourcentages par rapport à la densité optique moyenne obtenue à partir des régions homologues des animaux témoins opérés (injection intracérébrale de sérum physiologique). Progression du score de la maladie de Parkinson (MP) dans le modèle 6-OHDA
Afin d'évaluer la progression de la MP (PMP) chez les rats 6-OHDA, une échelle appelée "score PMP", et combinant 3 critères, a été développée: 1 ) critère 1 : évaluation des symptômes neuropsychiatriques (i.e. un comportement de type apathique), 2) critère 2 : évaluation des symptômes moteurs (i.e. déficit de la motricité fine), ces deux critères étant également utilisés en clinique dans les échelles permettant le diagnostic de la MP, et 3) critère 3 : le niveau de dénervation dopaminergique dans le DS, disponible uniquement après analyse histologique postmortem chez le patient. Chaque critère a été quantifié pour chaque animal, avec des valeurs allant de 0 à 4, comme illustré dans la figure 2A. Les valeurs attribuées à chaque critère ont été additionnées pour produire le score PMP, allant de 0 à 12.
Pour l'évaluation des déficits comportementaux dans les tests d'autoadministration et de réajustement du pas (critères 1 et 2, respectivement), les performances de chaque animal ont été comparées avant et après l’injection de 6- OHDA (ou de sérum physiologique (sham). Une valeur de 0 pour chacun de ces deux critères correspondait à une absence de déficit, ou à un déficit inférieur à 30%, i.e. la variabilité quotidienne normale des tests utilisés. Les sous-catégories suivantes ont été fixées comme suit : 1 = déficit faible (30% - 50%) ; 2 = symptômes moyens (50% - 70%) ; 3 = symptômes forts (70% -90%) ;4 = déficit important ou total (>90%).
Compte tenu du fait que les symptômes moteurs apparaissent après 70 % de perte des neurones dopaminergiques striataux chez les patients atteints de la MP, la valeur de la dénervation dopaminergique dans la DS (critère 3) a été utilisée pour définir la limite entre la phase prodromale et la phase clinique.
En ce qui concerne le score PMP obtenu par addition des valeurs des 3 critères, l'animal mimant la MP a été classé comme : 1 ) rat asymptomatique présentant de faibles lésions mais aucun symptôme comportemental (score PMP = 1 à 2), 2) animal de type prodromal, i.e. présentant uniquement des troubles neuropsychiatriques et une petite lésion DS (score PMP = 3 à 7) et 3) animal de type clinique, i.e. présentant des troubles neuropsychiatriques, des symptômes moteurs et une lésion DS étendue (score PMP = 8 à 12). Les animaux témoins (sham) se sont vu attribuer un score de 0.
Compte tenu du faible nombre d'animaux asymptomatiques et du fait qu'ils ne présentent aucune pertinence clinique, ils ont été exclus de l'étude. Cohortes humaines
Des échantillons de sang de patients atteints de la MP et de sujets contrôles correspondants, ont été obtenus via 1 ) le Consortium du Programme des biomarqueurs de la maladie de Parkinson (PDBP), soutenu par l'institut National des Troubles Neurologiques et des Accidents Vasculaires Cérébraux des Instituts Nationaux de la Santé (NIH-Etats-Unis), et 2) la Fondation Santa Lucia (Rome, Italie). Tous les sujets (patients et contrôles) ont donné leur consentement éclairé par écrit. Les critères d'inclusion des patients des Etats-Unis comprenaient un diagnostic récent (<1 an) de MP selon les nouveaux critères de la Movement Disorders Society (MDS). Pour la cohorte italienne, les critères de diagnostic étaient moins restrictifs et des patients diagnostiqués depuis plus longtemps que ceux de la cohorte des Etats-Unis ont été inclus (0 à 3 ans après le diagnostic). Dans les deux cohortes, les patients n'avaient reçu aucun traitement antiparkinsonien au moment de l'inclusion, ne présentaient pas de démence ou de troubles psychiatriques, ni aucune autre affection médicale pouvant compromettre l'étude. Les critères d'inclusion des témoins (contrôles) étaient : l'absence de maladies neurologiques, l'absence d'antécédents familiaux de troubles du mouvement et l'absence d’affections médicales spécifiques. La cohorte des Etats-Unis comprenait 21 patients atteints de la MP sans traitement antiparkinsonien, 9 patients atteints de la MP ayant reçu un traitement au Pra et 30 témoins (contrôles) correspondants en termes d'âge et de sexe. La cohorte Italienne comprenait 21 patients atteints de la MP et 23 témoins (contrôles) correspondants en termes d’âge et de sexe. Toutes les informations cliniques et démographiques collectées à partir des deux cohortes humaines ont été résumées dans le tableau 1 ci- dessous (les données sont représentées par la valeur moyenne ± SEM, H : Homme ;
F : Femme ; * 2 patients de sexe inconnu).
Tableau 1
Expériences de RMN RMN HRMAS 1H d’échantillons de cerveaux de rats 6-OHDA : Juste avant l'analyse HRMAS, 1 Opl de D2O ont été ajoutés aux inserts contenant les biopsies cérébrales, qui ont ensuite été scellés et placés dans un rotor en zirconium de 4 mm.
Acquisition des données : Tous les spectres RMN HRMAS ont été acquis, comme décrit précédemment [82], sur un spectromètre Bruker Advance III (Billerica, USA) (IRMaGe, CEA Grenoble, France) à 500 MHz. Les échantillons tournaient à 4000 Hz à l'angle magique (54,7°) et la températureétait maintenue à 4°C pour toutes les expériences. Les spectres à une dimension ont été acquis à l'aide d'une séquence d'impulsions CPMG (TE=30 ms, 256 répétitions, 17 min). Le signal de l’eau résiduelle a été pré-saturé pendant 1 ,7s de relaxation.
Traitement des données : La quantification a été réalisée avec le logiciel jMRUI en utilisant une quantification basée sur une procédure d'estimation quantique (QUEST) [83]. Cette procédure nécessite l'utilisation d'une base de données de métabolites et une attribution complète des spectres. Dix-neuf métabolites ont été attribués et quantifiés : acétate, alanine, ascorbate, choline, créatine, gamma- aminobutyrate (GABA), glutamate, glutamine, glycine, glycérophosphocholine, glutathion, lactate, myo-inositol, A/-acétyl aspartate, phosphocholine, phosphocréatine, phosphoéthanolamine, scyllo-inositol et taurine. L'amplitude du métabolite calculée par QUEST a été normalisée par rapport au signal total du spectre. Les CRLB ont été calculés pour chaque métabolite en tant qu'estimation de l'écart type de l'ajustement.
RMN 1 H du sérum
Prélèvement de sérum : Pour les rats, le sang a été prélevé dans la veine caudale après 2 heures de jeûne et sous anesthésie gazeuse à l'isof I u rane (2%) et a été stocké dans la glace avant d'être rapidement centrifugé à 1600g pendant 15 min à 4° C. Le sérum surnageant a été prélevé et stocké à -80 °C j squ'au jour de la RMN. Le temps avant la congélation n'a jamais dépassé 30 min [84],
Pour les singes, le sang a été prélevé dans la veine saphène après un jeûne de 12 heures, sous anesthésie (atropine 0,05 mg/kg i.m. suivi de zoletil 15 mg/kg i.m.) et soumis au même protocole que le sang de rat.
Pour les humains, le sang a été prélevé après un jeûne d'une nuit, conservé à température ambiante pendant 15 à 60 min avant d'être centrifugé entre 1200 et 1500g à 4°C pendant 10 à 15min. Le sérum surnageant a ensuite été prélevé et stocké à - 80 °C. Le jour des expériences RMN, les échantillons ont été lentement décongelés sur la glace, puis rapidement centrifugés pour éliminer les éventuels cryo-précipités. Les tubes RMN ont été remplis avec 60pl d'échantillon de sérum et 120pl de tampon phosphate salin (PBS) 0,1 M dans du D2O (50% de D2O, pH = 7,4), et stockés à 4°C jusqu'à l'acquisition par RMN.
Acquisition des données : Tous les échantillons de sérum animal et humain ont été soumis au même protocole RMN. Les expériences de RMN 1H ont été réalisées sur un spectromètre RMN Bruker Advance III à 950 MHz (IBS, Grenoble, France) en utilisant une cryosonde de 3 mm. Les spectres ont été enregistrés en utilisant une séquence d'impulsions CPMG. Le signal de l'eau résiduelle a été pré-saturé pendant 2 secondes de relaxation.
L'attribution des pics a été effectuée en utilisant les expériences à 2-dimensions homonucléaires 1H-1H (TOCSY) et hétéronucléaires 1H-13C (HSQC), et des bases de données. Si nécessaire, l'ajout de métabolites sélectionnés a été utilisé pour clarifier des identifications ambiguës.
Traitement des données : Les signaux temporels ont été transformés par la méthode de Fourier et phasés manuellement avec le logiciel Topspin de Bruker, version 3.6.2. Ensuite, d'autres étapes de prétraitement (correction de la ligne de base, alignement, segmentation) ont été effectuées à l'aide du logiciel NMRProcFlow v1.2 en ligne (http://nmrprocflow.org). Des segments de 0,001 ppm ont été réalisés sur la plage spectrale 0-10 ppm, en excluant le pic d'eau résiduelle, des signaux de macromolécules/lipides et d'autres régions contenant des pollutions (55, 0-4, 7 ; 55,25- 5,38 ; 5 2, 2-2,0 ; 5 1 ,4-1 ,25 ; 5 1 ,15-1 ; 5 0,9-0, 5). Chaque segment a été normalisé par rapport à la somme totale des segments.
Analyse statistique
Analyse multivariée : Les données provenant de la RMN liquide ou HRMAS ont été importées dans SIMCA v.14 (Malmô, Suède) pour des statistiques multivariées. Une analyse en composantes principales (ACP) non supervisée a d'abord été utilisée pour la visualisation globale de la distribution de tous les échantillons, suivie d'une OPLS pour trouver les métabolites discriminants associés à un stade spécifique de la maladie. Pour cette dernière, soit une variable continue (c'est-à-dire le score PMP), soit une variable discrète (c'est-à-dire l’appartenance à un groupe) a été utilisée pour étiqueter chaque échantillon, ce qui a conduit à l'OPLS-DA dans ce dernier cas. Le nombre total de composantes a été déterminé à l'aide de la procédure de validation croisée, qui produit les facteurs R2Y et Q2 qui indiquent respectivement la qualité de l'ajustement et la prédictibilité du modèle. Un modèle est considéré comme robuste et prédictif lorsque les deux facteurs sont >0.5. Les scores ont été tracés en 2D par rapport aux deux premières composantes des modèles OPLS, tandis que les poids ont été tracés en 1 D pour mimer un spectre RMN mais avec des pics positifs/négatifs indiquant respectivement des métabolites régulés à la hausse/à la baisse. En effet, dans ce "spectre statistique", la corrélation de chaque variable RMN avec la variable de classement continue (score), comprise entre 0 et 1 , a été codée par une couleur, allant de gris foncé (corrélation élevée) à gris clair (corrélation faible). Les métabolites présentant une corrélation >0.5, considérés comme les plus discriminants, ont été soumis à une analyse univariée. L'analyse de la variance des résidus prédictifs validés de manière croisée (CV-ANOVA) a été utilisée pour évaluer la significativité du modèle.
Les métabolites variant significativement dans au moins trois modèles parmi les quatre étudiés (6-OHDA, a-synucléine, MPTP et humain) ont été soumis à une régression logistique multiple afin d'évaluer leur pertinence en tant que biomarqueur prédictif potentiel de la MP à l'aide du logiciel R (version 3.6.1 - R core team). Les régressions, y compris la validation croisée, ont été réalisées pour des animaux de type prodromaux (rats de type prodromal 6-OHDA et a-synucléine). Les animaux de type clinique ont été utilisés pour la validation externe (rats de type clinique 6-OHDA et a-synucléine, et tous les primates). Les mêmes analyses ont été effectuées pour la cohorte des patients des Etats-Unis. La cohorte de patients italiens a été utilisée pour la validation externe. Toutes les combinaisons des métabolites retenus ont été testées, et des courbes ROC ont ensuite été générées pour chacune d'entre elles afin d'évaluer la qualité de l'ajustement en utilisant l’aire sous la courbe (AUC) et le seuil optimal qui maximise la sensibilité et la spécificité.
Analyse univariée :
Toutes les analyses univariées ont été effectuées à l'aide du logiciel Graphpad Prism 8 (San diego - États-Unis). Tous les résultats ont été exprimés en valeurs moyennes ± SEM avec un seuil de signification fixé à 0,05.
Modèles 6-OHDA : Pour les tests d'auto-administration et les tests de réajustement du pas, une analyse univariée de l'effet du Pra a été réalisée en appliquant une ANOVA à un facteur à mesures répétées (MR) suivie d'un test post hoc de Sidak.
Pour les données histologiques et métabolomiques, une ANOVA à un facteur, suivie d'un test post hoc de Tukey avec correction pour les comparaisons multiples a été effectuée.
Modèles a-synucléine : Pour l'étude longitudinale réalisée chez les animaux a- synucléine, certaines valeurs manquaient, en raison d'artefacts lors de la mesure par RMN. Les données ont donc été analysées en ajustant un modèle mixte proposé à l'aide d'une matrice de covariance de symétrie composée, et ont été ajustées à l'aide de la méthode du maximum de vraisemblance restreint (REML). Ce modèle a été suivi par un test post hoc de Tukey.
Singes MPTP : Compte tenu du faible nombre d'animaux, le test non paramétrique de Mann-Whitney a été utilisé.
Humains : Les données ont subi une transformation logarithmique étant donné la distribution non gaussienne des niveaux de métabolites. Tout d'abord, des tests t ont été effectués individuellement dans les deux cohortes différentes. Ensuite, une ANOVA deux facteurs a été appliquée avec i) l'origine de la cohorte et ii) le groupe (contrôle ou MP) comme facteurs, suivis par le test post hoc de Sidak.
EXEMPLE 2 : RESULTATS
Le modèle de rat 6-OHDA permet d'étudier les différents stades de la maladie de Parkinson
Bien que, chez l’homme, le diagnostic de la MP repose sur une échelle qui intègre des évaluations des symptômes neuropsychiatriques et moteurs [22], sa confirmation définitive est basée sur des évaluations histologiques post-mortem, principalement de la perte neuronale dans la voie nigrostriée entraînant la dénervation du DS. Afin de caractériser les rats 6-OHDA par rapport à la progression clinique de la maladie, un score, appelé score de progression de la maladie de Parkinson (PMP), basé sur le même type de critères que ceux utilisés chez l’homme, i.e. la composante neuropsychiatrique - évaluée par les performances d'auto-administration (motivation) -, les capacités de motricité fine - évaluées par les performances du test du réajustement du pas -, et l'étendue de la lésion du DS - évaluée par l'analyse histologique post-mortem -leur a été attribué. Sur la base de ce score, les animaux atteints de la MP ont été répartis en deux catégories, à savoir les animaux de type prodromal et les animaux de type clinique.
L'immunoréactivité de la tyrosine hydroxylase (TH-IR) a révélé que l'injection bilatérale de 6-OHDA dans la SNc a conduit à une lésion dopaminergique nigrostriatale partielle entraînant une dénervation dopaminergique dans le DS et dans une moindre mesure dans le Nacc (figures 2B et 2C). En effet, la quantification TH-IR a montré une forte perte (62,2 %) des projections dopaminergiques dans le DS des animaux de type prodromal par rapport aux témoins (sham), perte encore plus importante chez les animaux de type clinique (71 ,96 %). Une légère perte de TH-IR a également été observée dans le Nacc des animaux 6-OHDA (figure 2C). Ce patron de dénervation préserve les capacités d’apprentissage et l'activité ambulatoire globale des animaux [18], permettant l'étude des processus motivationnels, sans le biais potentiel lié aux altérations locomotrices souvent présentes dans les modèles animaux (figure 3) [18, 23]. La motivation a été mesurée par la procédure d'auto-administration de saccharose. Avant l’injection de 6-OHDA (sérum physiologique pour les shams), les rats ont été entraînés à la tâche d’auto-administration, ce qui leur a permis d'atteindre leur niveau maximal de performances (environ 80 récompenses par séance d'une heure). Pendant la phase post-lésion (i.e. après l’injection de 6-OHDA/sérum physiologique), les performances des rats témoins (sham, injection de sérum physiologique) sont restées stables, tandis que celles des animaux 6-OHDA ont considérablement diminué [30 à 66 %] (figure 2 D).
En ce qui concerne la motricité fine, tous les animaux ont présenté un nombre similaire de réajustements des pattes avant l’injection de 6-OHDA/sérum physiologique, qui n'a pas été modifié après l’injection de 6-OHDA, sauf dans le groupe de type clinique où il a été considérablement réduit (figure 2 E).
Les signatures métaboliques du sérum co-évoluent avec la progression de la MP chez les rats 6-OHDA
La figure 4A illustre un spectre typique de 1H RMN de sérum de rat 6-OHDA, acquis à très haut champ magnétique (23 T). Cela a permis l'identification d'environ 50 métabolites dans les échantillons de sérum. Pour chaque composé, l’attribution 1H et 13C de leurs groupements chimiques, ainsi que la multiplicité des pics, sont présentés comme suit : singulet (s), doublet (d), doublet doublet (dd), multiplet (m). Tableau 2 Tl
Le graphique des scores OPLS, réalisé avec les données RMN et les scores PMP pour chaque animal (i.e. le "modèle OPLS du sérum 6-OHDA") montre une gradation claire des couleurs des points, de "froid" (blanc) à gauche à "chaud" (gris foncé) à droite. Cela indique que le profil métabolique évolue en même temps que la progression de la maladie (figure 4B). Parmi les 14 métabolites les plus pertinents (i.e. corrélation avec le score PMP >0.5), dix d'entre eux ont été modifiés de manière significative dans au moins un groupe de type MP par rapport aux animaux témoins (sham) (figure 4C) : alanine, bétaïne, B-hydroxybutyrate (BHB), diméthyl sulfone (DMSO2), glycine, lactate, pyruvate, thréonine, sérine et valine. Ces métabolites n'ont pas évolué de manière identique avec la progression de la maladie. Tout d'abord, 6 métabolites ont été modifiés de manière significative dès la phase « prodromal » : l'alanine, le BHB, la glycine, le lactate et la sérine ont augmenté, tandis que la bétaïne a diminué. Leurs taux sont ensuite restés stables dans la phase « clinique ». Ensuite, un métabolite, le pyruvate, a augmenté progressivement en fonction des différentes phases de la MP. Enfin, trois métabolites n'ont été modifiés qu'au stade clinique : Le DMSO2 et la valine ont diminué, tandis que la thréonine a augmenté (figure 4D).
Les profils métaboliques du tissu cérébral dans le modèle de rat 6-OHDA renforcent les résultats sanguins
La spectroscopie 1H RMN « High Resolution Magic Angle Spining » (HRMAS) a été utilisée pour étudier les profils métaboliques des biopsies cérébrales intactes (DS et Nacc) d'animaux 6-OHDA, échantillonnés au même niveau que les coupes utilisées pour l'histologie afin de quantifier la dénervation dopaminergique. Un spectre représentatif d'une biopsie DS d'un rat 6-OHDA est présenté à la figure 5A, avec l'étiquetage des métabolites attribués et quantifiés. En ce qui concerne les échantillons DS, le graphique des scores de l'analyse OPLS (i.e. le "modèle OPLS 6-OHDA DS") a révélé une co-évolution des profils métaboliques cérébraux avec le score PMP des animaux, comme dans le sérum (figure 5B(i)). Les dérégulations significatives des principaux métabolites sont illustrées dans la figure 5C(i). Par rapport aux animaux témoins (sham), un métabolite, la taurine, a été modifié de manière significative dans le groupe de type prodromal (augmentation), tandis que quatre métabolites ont été modifiés de manière significative dans le groupe de type clinique : l'alanine, le lactate et la phosphocréatine ont augmenté et le glutamate a diminué.
L'analyse OPLS construite avec les données Nacc (i.e. le "modèle OPLS 6- OHDA Nacc") a montré la même tendance, bien que moins claire (figure 5B(ii)). Les statistiques univariées ont révélé une augmentation significative de l'alanine et du lactate dans le groupe de type prodromal, alors que le groupe de type clinique a été caractérisé par une augmentation significative de la phosphocholine (PC) et une diminution de la choline par rapport aux animaux témoins (sham) (figure 5C(ii)).
Même si certains métabolites comme le pyruvate et le citrate ne sont pas détectés dans les échantillons de tissus, en raison de leur transformation immédiate lors de la mort (effet post-mortem), ces expériences montrent des dérégulations des niveaux d'alanine et de lactate communes aux échantillons de sérum et de tissus. Le pramipexole modifie les dérégulations métaboliques sérique et tissulaire induites par la 6-OHDA
Il a été vérifié si le profil métabolique sérique était modifié par un agoniste dopaminergique classiquement utilisé en clinique, le Pramipexole (Pra), connu pour améliorer uniquement les symptômes neuropsychiatriques lorsqu’il est utilisé à faible dose dans les modèles animaux [23,24], Comme prévu, après 15 jours d'administration subchronique de Pra, les déficits dans la tâche d'auto-administration mesurés chez les rats 6-OHDA ont été totalement ou partiellement améliorés chez les animaux de type prodromal et de type clinique, respectivement. En revanche, les performances des rats traités avec le Veh n’ont pas été améliorées (figure 6A).
En ce qui concerne les profils métaboliques sériques, pour visualiser simultanément l'effet de la lésion 6-OHDA et du traitement, les niveaux de métabolites des animaux de type prodromal ont été normalisés par rapport au niveau des animaux témoins (sham) (effet lésion, barre pleine) et les niveaux de métabolites des animaux de type prodromal traités au Pra ont été normalisés par rapport aux animaux de type prodromal ayant reçu le Veh (effet Pra, barre hachurée). Chez les animaux de type prodromal, les taux d'alanine, de BHB et de pyruvate ont augmenté après la lésion (figure 4D et 6B, barre pleine) et ont été significativement réduits par le Pra (figure 6B, barre hachurée), tandis que la bétaïne a diminué après la lésion, mais a augmenté chez les animaux Pra. Dans le groupe de type clinique, seul le taux d'alanine, augmenté après la lésion, a été légèrement réduit par le Pra, conformément à l'effet comportemental modeste observé en auto-administration et à l'absence d'effet sur les tâches motrices, compte tenu de la faible dose de Pra [24] (données non présentées). Les autres métabolites ont été dérégulés de la même manière dans les deux groupes, quel que soit le traitement reçu (Veh ou Pra).
Contrairement au sérum, pour lequel plusieurs échantillons longitudinaux ont pu être prélevés chez le même animal, les échantillons de cerveau n'ont pu être recueillis qu'à la fin de l'expérience, lorsque tous les animaux avaient reçu un traitement chronique au Pra ou au Veh. Par conséquent, les animaux témoins (sham) traités avec un Veh ont été utilisés comme référence pour normaliser les niveaux de métabolites pour les animaux de type prodromal traité avec le Veh (Effet lésion, barre pleine). Les niveaux de métabolites des animaux de type prodromal traités au Pra ont été normalisés par rapport aux animaux de type prodromal ayant reçu le Veh (effet Pra, barre hachurée). Comme dans le sérum, l'administration de Pra a provoqué une diminution de certains métabolites auparavant augmentés par la lésion 6-OHDA. Cela a été vrai pour l'alanine dans le DS et le Nacc, et pour le lactate dans le Nacc chez les animaux de type prodromal (Fig 6C i). Dans le groupe de type clinique, le taux d'alanine après Pra a également été reversé tout comme chez les animaux de type prodromal, et le lactate a été modifié de manière significative dans le DS. De plus, une réversion des taux de phosphocréatine et de phosphocholine a été observée dans le DS et les Nacc, respectivement (Fig 6C ii).
Dans l'ensemble, des altérations significatives des métabolites au niveau sériques et tissulaires ont été mesurées dans le modèle de rat 6-OHDA et associées aux différentes phases de la maladie et, de façon intéressante, ont été détectées dès le stade prodromal. De plus, certaines de ces perturbations ont été partiellement inversées par l'administration chronique de Pra, qui a également permis de corriger les déficits neuropsychiatriques.
Afin de tester la spécificité des biomarqueurs trouvés dans le modèle 6-OHDA concernant la progression et les mécanismes physiopathologiques de la maladie, l'étude métabolomique du sérum a été étendue à deux autres modèles animaux de MP.
Les rats 6-OHDA, a-synucléine et les singes MPTP partagent des perturbations métaboliques sériques
Tout d'abord, en utilisant la même souche de rat (Sprague Dawley) que pour l'étude 6-OHDA, un modèle de rat a-synucléine a été sélectionné, dans lequel une surexpression de la synucléine alpha A53T humaine a été induite dans la SNc en utilisant des vecteurs viraux adénoassociés (AAV). Cette expression ciblée conduit à une neurodégénérescence progressive dans la région ciblée, ce qui permet de suivre les différents stades de la MP chez le même animal [19], à savoir la phase de type prodromal autour de 3 semaines et la phase de type clinique autour de 10 semaines après l'injection.
Un modèle OPLS-DA a été utilisé afin d’évaluer si une signature métabolique spécifique était associée à ces différentes phases (i.e. le "modèle OPLS-DA sérique a-synucléine"). Les animaux sham (témoin ayant reçu une injection d’un virus contrôle codant pour la GFP) n’ont présenté aucune différence entre les trois différents points temporels 0, 3 et 10 semaines après l'injection (figure 7), tandis que pour les animaux a-synucléine, les 3 groupes correspondant aux trois différents prélèvements caractéristiques des différentes phases sont clairement séparés dans le modèle OPLSD-DA(figure 8A), ce qui indique que chaque phase a été caractérisée par une signature métabolique différente. En particulier, une augmentation significative de BHB, de glycine, de pyruvate, de sérine et une diminution de la bétaïne ont été observées au fil du temps, comme chez les rats 6-OHDA. De plus, une diminution significative du myo-inositol et une augmentation de l'acétoacétate et de la créatine n'ont été observées que dans le modèle a-synucléine (figure 8B).
Ces résultats ont révélé des perturbations métaboliques similaires entre les deux modèles de rats de la MP, qui sont associées à la progression de la maladie. Pour aller plus loin, une analyse métabolique a été effectuée dans un modèle primate non humain de la MP, e.g. le modèle MPTP, qui mime la phase clinique de la MP et présente une plus grande homologie avec les humains [25].
Le modèle OPLS-DA présenté dans la figure 8C (c'est-à-dire le "modèle OPLS- DA sérum MPTP") a montré une nette discrimination entre les groupes témoins (sham) et les groupes MPTP. D'une part, les primates MPTP non humains ont présenté une augmentation significative du lactate et une diminution de la valine, comme chez les rats 6-OHDA. D'autre part, ils ont présenté une augmentation significative d'acétoacétate et de créatine comme dans le modèle de rongeur a-synucléine. Enfin, une augmentation significative du BHB et du pyruvate a été observée, ainsi qu’une diminution significative de la bétaïne, comme dans les deux modèles de rongeurs (figure 8D).
Pris ensemble, ces résultats révèlent des altérations métaboliques communes associées à la progression de la MP dans trois modèles animaux différents de la MP, réalisés chez deux espèces différentes. Ainsi, pour valider la pertinence clinique de ces marqueurs, ces résultats précliniques ont été comparés à ceux obtenus dans des échantillons de patients atteints de la MP.
Les signatures métaboliques sériques de patients parkinsoniens nouvellement diagnostiqués et de modèles animaux de la MP présentent des similitudes
Chaque cohorte a d'abord été analysée individuellement, i.e. les patients parkinsoniens nouvellement diagnostiqués (n = 21 dans chaque cohorte) par rapport aux contrôles correspondant en termes d’âge et de sexe (n = 30/23 N I H/ltalie).
À l'exception de certains métabolites, e.g. l'alanine (données non présentées), les variations observées ont été cohérentes entre les 2 cohortes, comme le montre le tableau 3. Ce dernier présente les principales modifications individuelles et collectives des métabolites entre les patients atteints de la MP et les témoins dans les cohortes italiennes et des Etats-Unis (NIH), analysées individuellement par test t et collectivement par ANOVA à deux facteurs, suivie d’un test post hoc de Sidak. * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 ; ns : non significatif.
Tableau 3
Par exemple, une augmentation marginale du BHB et de l'acétoacétate a été observée chez les patients italiens atteints de la MP (+28,3 %, p = 0,24 et +17,2 %, p = 0,05 respectivement), et était encore plus élevée chez les patients des Etats-Unis (+103,2 %, p = 0,09 et +28,1 %, p = 0,12).
Afin d'augmenter la puissance statistique, les deux cohortes ont été mises en commun (MP n = 42, contrôle n = 53). Néanmoins, comme la variance des données était principalement affectée par l'origine de l'échantillon, c'est-à-dire l'Italie ou les Etats-Unis, indépendamment du cas (MP ou contrôle), une ANOVA à deux facteurs a été effectuée avec i) l'origine de la cohorte et ii) le cas (contrôle ou MP) comme facteurs pour extraire les informations relatives à la MP uniquement. Le tableau 3 illustre les métabolites significatifs pour le facteur cas, sans interaction entre l'origine de la cohorte et le cas. L'augmentation du BHB et de l'acétoacétate, observée dans chaque cohorte, est apparue significative lorsqu'elle a été mise en commun. Une diminution significative de la bétaïne dans le sérum des patients atteints de la MP a également été détectée, comme dans l’ensemble des modèles animaux. De plus, une diminution significative de la valine a été observée comme dans le modèle de rat 6-OHDA. Enfin, une diminution de la leucine a été constatée. De plus, l'analyse d'un petit nombre d'échantillons de sérum provenant d'autres patients parkinsoniens nouvellement diagnostiqués et traités avec du Pra 0,5-100 mg/jour (n = 9) a révélé une tendance à la normalisation des taux de BHB et de bétaïne par rapport aux patients atteints de la MP non traités, comme observé chez les rats 6-OHDA (figure 9). Métabolites sériques comme marqueurs potentiels pour le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson
Pour évaluer le potentiel des métabolites identifiés à distinguer les animaux de type prodromal des animaux témoins (sham), de multiples modèles de régression logistique ont été développés, basés sur toutes les combinaisons possibles des niveaux d'acétoacétate, de bétaïne, de créatine, de BHB, de pyruvate et de valine, regroupant des rats 6-OHDA et a-synucléine de type prodromal.
Le meilleur modèle de régression, évalué par les courbes de ROC (voir matériel et méthodes), a retenu les six métabolites, en utilisant une régression basée sur l'algorithme prédictif suivant (p : 1 ,107x10’15) :
Logit(P) = log(P/(1 -P)) = -54,72 + 0,49BHB + 0,39Pyruvate - 0,42Valine + 0,06Acétoacétate + 0,52Créatine - 0,10Bétaine
La courbe ROC avait une aire sous la courbe (AUC) de 0,936. En appliquant le seuil optimal de 0,618 (sensibilité 0,85, spécificité 0,88) (figure 10A), une précision de 0,925 a été trouvée, permettant de prédire de façon correcte 37 animaux parmi les 40 inclus dans la cohorte de validation (rats de type clinique et tous les primates).
En ce qui concerne les échantillons humains, la cohorte des Etats-Unis (NIH) a été utilisée pour construire un modèle car i) il s'agit de la plus grande cohorte et ii) elle ne comprend que des patients récemment diagnostiqués, contrairement à la cohorte italienne, qui comprend des patients présentant une durée de MP plus longue. Cette dernière a été utilisée comme cohorte de validation externe. Là encore, le meilleur modèle a retenu les six métabolites combinés avec l’algorithme de régression suivant (p : 1 ,95x10’4) :
Logit(Pi) = log(Pi/(1 -Pi)) = -45,60 + 0,28BHB - 4,54Pyruvate - 1 1 ,23Valine + 7,05Acétoacétate + 2,85Créatine - 8,27Bétaine.
La courbe ROC suivante avait une AUC de 0,88. Le seuil optimal était de 0,316, et la sensibilité et la spécificité correspondantes étaient respectivement de 0,957 et 0,714 (figure 10B). La prédiction de la classification de la cohorte italienne a permis de détecter 82,6 % des patients atteints de la MP, avec 17,4 % de faux négatifs.
La cohorte des Etats-Unis (NIH) moins 2 patients non retenus a également été utilisée pour construire un modèle. Là encore, le meilleur modèle a retenu les six métabolites combinés avec l’algorithme de régression suivant (p : 1 ,95x10’4) : Logit(P2) = log(P2/(1 -P2)) = -42,78 + 0,16BHB - 3,31 Pyruvate - 12,01 Valine + 7,06Acétoacétate + 3,14Créatine - 7,79Bétaine.
La courbe ROC suivante avait une AUC de 0,87. Le seuil optimal était de 0,279, et la sensibilité et la spécificité correspondantes étaient respectivement de 0,952 et 0,714 (figure 1 1 , ligne noire). La prédiction de la classification de la cohorte italienne a permis de détecter 82,6 % des patients atteints de la MP, avec 17,4 % de faux négatifs. La courbe ROC construite avec l’algorithme de régression Logit(P2) et la cohorte italienne avait une AUC de 0,83. (figure 1 1 , ligne grise).
Enfin, une régression logistique multiple a été réalisée en utilisant les données sériques de tous les animaux MP (de type prodromal et clinique) de tous les modèles utilisant les mêmes six métabolites et a été évaluée avec la courbe ROC suivante présentant une AUC de 0,954. (figure 12) et une précision de 88,9%.
Au total, la précision du biomarqueur développé à partir des six mêmes métabolites sériques était d'au moins 82,6 % quelle que soit l'espèce.
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Claims

38 REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro pour le diagnostic précoce d’une maladie neurodégénérative à partir d’un échantillon biologique d’un patient comprenant : a) la mesure in vitro dans ledit échantillon biologique des niveaux d’expression des au moins 6 métabolites suivants : l’acétoacétate, la bétaïne, le B-hydroxybutyrate (BHB), la créatine, le pyruvate, et la valine ; b) la comparaison des niveaux d’expression des métabolites mesurés à l’étape a) par rapport à ceux d’un échantillon biologique de référence ou à des valeurs de référence ; où une différence des niveaux d’expression des métabolites mesurés à l’étape a) par rapport à ceux de l’échantillon biologique de référence ou à des valeurs de référence est l’indication que ledit patient est atteint de la maladie neurodégénérative.
2. Procédé selon la revendication 1 , où l’étape a) comprend en outre la mesure in vitro du niveau d’expression d’au moins un métabolite choisi dans le groupe constitué de l’alanine, le lactate, le DMSO2, la glycine, la sérine, la thréonine, le myoinositol, et la leucine.
3. Procédé selon la revendication 1 , où l’étape a) comprend la mesure des niveaux d’expression des métabolites suivants : acétoacétate, bétaïne, B- hydroxybutyrate (BHB), créatine, pyruvate, et valine.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, où la maladie neurodégénérative est la maladie de Parkinson.
5. Procédé in vitro pour le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson à partir d’un échantillon biologique d’un patient comprenant : a) la mesure in vitro dans ledit échantillon biologique des niveaux d’expression des métabolites suivants : l’acétoacétate, la bétaïne, le B-hydroxybutyrate (BHB), la créatine, le pyruvate, et la valine ; b) le calcul des régressions logistiques Logit(Pi) ou l_ogit(P2), respectivement, selon les formules suivantes :
-45,60 + 0,28EBHB - 4,54Epyruvate — 1 1 ,23Evaline + 7,05EAcétoacétate + 2,85Ecréatine — 7,79EBétaïne ! OU 39
■42,78 + 0, 16EBHB — 3,31 Epyruvate — 1 2,01 Evaline + 7,06EAcétoacétate + 3, 14Ecréatine — 8, 27 E Bétaïne,
OÙ EBHB, Epyruvate, Evaline, EAcétoacétate, Ecréatine et EBétaïne Correspondent respectivement aux niveaux d’expression mesurés du B-hydroxybutyrate (BHB), du pyruvate, de la valine, de l’acétoacétate, de la créatine et de la bétaïne, dans l’échantillon biologique ; et où une valeur calculée de Log it( Pi ) ou Logit(P2) supérieure à 0,316 u.a. est l’indication que ledit patient est atteint de la maladie de Parkinson ; où une valeur calculée de Logit(Pi) ou Logit(P2) inférieur à 0,279 u.a. est l’indication que ledit patient n’est pas atteint de la maladie de Parkinson ; où une valeur calculée de Logit(Pi) inférieure à 0,316 u.a. est l’indication que ledit patient n’est pas atteint de la maladie de Parkinson ; où une valeur calculée de Logit(P2) supérieure à 0,279 u.a. est l’indication que ledit patient est atteint de la maladie de Parkinson.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, où l’échantillon biologique du patient provient d’un patient au stade prodromal ou de novo de la maladie de Parkinson.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, où l’échantillon biologique est un échantillon de sérum.
8. Biomarqueur destiné au diagnostic précoce d’une maladie neurodégénérative comprenant la combinaison des au moins six métabolites suivants : acétoacétate, bétaïne, B-hydroxybutyrate (BHB), créatine, pyruvate, et valine.
9. Biomarqueur selon la revendication 7 comprenant en outre la combinaison d’au moins un métabolite choisi dans le groupe constitué de l’alanine, le lactate, le DMSO2, la glycine, la sérine, la thréonine, le myo-inositol, et la leucine.
10. Biomarqueur selon l’une quelconque des revendications 8 ou 9, comprenant la combinaison des six métabolites suivants : acétoacétate, bétaïne, B- hydroxybutyrate (BHB), créatine, pyruvate, et valine. 40
11. Utilisation in vitro d’un biomarqueur selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, comme biomarqueur d’une maladie neurodégénérative.
12. Utilisation selon la revendication 11 , où la maladie neurodégénérative est la maladie de Parkinson.
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