EP4201485B1 - Composition comprenant des exopolysaccharides extraits de porphyridium sp pour le traitement et/ou la prévention d'infections par les parasites du phylum apicomplexa - Google Patents

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EP4201485B1
EP4201485B1 EP22215320.7A EP22215320A EP4201485B1 EP 4201485 B1 EP4201485 B1 EP 4201485B1 EP 22215320 A EP22215320 A EP 22215320A EP 4201485 B1 EP4201485 B1 EP 4201485B1
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EP
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porphyridium
exopolysaccharides
eps
microalgae
parasite
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EP22215320.7A
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EP4201485A1 (fr
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Olivier LÉPINE
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Algosource SAS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A61K36/04—Rhodophycota or rhodophyta (red algae), e.g. Porphyra
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials

Definitions

  • the field of the invention is that of the treatment and/or prevention of parasitic infections, in particular infections by parasites of the phylum (or phylum) Apicomplexa.
  • the invention relates to the use of a composition comprising exopolysaccharides obtained from extracts of Porphyridium sp for the treatment and/or prevention of infections by parasites of the phylum Apicomplexa.
  • Parasites are living organisms pathogenic to humans which, during their development cycle, have the need to parasitize (or infect) another organism, inducing degradation of its physiological state, unlike a symbiosis which is profitable. for both living organisms.
  • Plasmodium falciparum parasite responsible for malaria
  • Toxoplasma gondii parasite responsible for toxoplasmosis
  • Eimeria sp. parasite responsible for coccidiosis
  • Plasmodium falciparum is the best known parasite of the phylum Apicomplexa. This parasite is responsible for 220 million cases of malaria worldwide in 2010. The manifestations are particularly severe in children who represent more than % of the 650,000 deaths recorded during that same year. This parasite contaminates humans via the bite of an Anopheles mosquito, which transports it inside their salivary glands. The parasite induces malaria fever characterized by the breakdown of red blood cells.
  • the disease prevention techniques are: the use of antimalarials when traveling to risk areas, limiting the risk of mosquito bites through public awareness, as well as use of insecticides.
  • Standard antimalarial treatments are effective and inexpensive.
  • the appearance of resistance pushes us to continue searching for new molecules for the treatment and/or prevention of infection by this parasite.
  • Obtaining new molecules of natural origin has proven to be disappointing for the moment, in particular for reasons of pharmacodynamics which do not allow a significant effect to be reproduced in vivo in humans ( “Natural products as starting points for future anti-malaria therapies: going bock to our roots? » Wells et al., Malaria Journal, 2011 ).
  • Eimeria sp. is responsible for chicken coccidiosis, the health and financial consequences of which are significant.
  • Coccidial control in chickens is based on a combination of rotating antibiotics, hygiene measures and vaccines ( “Control of avion coccidiosis: future and present natural alternatives”, Ouiroz-Casta ⁇ eda et al., BioMed Research International, 2015 ).
  • the effectiveness of drug treatments, particularly the antibiotics used, must be weighed against the emergence of resistance and the strong pressure from consumers for more natural alternative methods. Aromatherapy, homeopathy, phytotherapy, and the use of pre- or probiotics have thus been proposed.
  • Toxoplasma gondii is the parasite responsible for toxoplasmosis.
  • the life cycle of Toxoplasma gondii includes a classic form involving a definitive host (such as domestic or wild felids) and an intermediate host.
  • the sporozoites of the parasite developed within the oocysts of feline feces, are dispersed in the environment, then ingested by the intermediate host. Within the intestinal tube, the sporozoite form changes into the so-called tachyzoite invasion form.
  • HIV virus Human Immunodeficiency Virus
  • toxoplasmosis The treatment of toxoplasmosis is based on a combination of pyrimethamine and sulfadiazine, the tolerance of which is often poor. Other molecules are available such as dapsone, lindosamie, clindamycin, atovaquone, etc. They also present a risk of undesirable side effects and are not specific to toxoplasmosis or the parasitic cycle ( “Human Toxoplasmosis-searching for novel chemotherapeutics”, Antezazk et al., Biomedicine & Pharmacotherapy, 2016 ). Prophylactic treatments during pregnancy are initiated in the event of seroconversion. They include spiramycin before 18 weeks of amenorrhea, or a combination of drugs beyond.
  • New antitoxoplasmic pharmacological avenues are most often synthetic molecules targeting the intracellular machinery (for example the endoplasmic reticulum, the mitochondria, the apicoplast), the cell membrane, the microneme or the apical end.
  • intracellular machinery for example the endoplasmic reticulum, the mitochondria, the apicoplast
  • cell membrane for example the cell membrane, the microneme or the apical end.
  • Toxoplasma gondii alone, nearly 40 different sites of action are tested ( “A systematic review of in vitro and in vivo activities of anti-toxoplasma drugs and compounds”, Montazeri et al., Frontiers in Microbiology, 2017 ).
  • GAGs glycosaminoglycans
  • GAGs are complex linear polysaccharides expressed in intracellular compartments, on the cell surface, and in the extracellular environment where they interact with various molecules to regulate many cellular processes involved in health and disease. Parasites use GAGs at virtually every major point of entry to promote their attachment and invasion of host cells, their movement from one cell to another and to protect against immune attacks.
  • the gliding phenomenon allows the parasite to cross biological barriers and reach target tissues. It is followed by an attachment phase also involving the recognition of GAGs ( “Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment”, Carruthers et al. Infection and Immunity, 2000 ).
  • the parasite proteins involved in interactions with host cell GAGs are respectively micronemes (e.g.
  • the invention aims in particular to overcome the drawbacks of the prior art and to propose a therapeutic alternative to the use of current medicinal compounds in the treatment of an infection by parasites of the phylum Apicomplexa.
  • the invention aims, in at least one embodiment, to provide a composition making it possible to prevent and/or eliminate, or at least further reduce, infections by parasites of the phylum Apicomplexa, and notably Toxoplasma gondii infections.
  • Another objective of the invention in at least one embodiment, is to provide a composition making it possible to prevent and/or eliminate, or at least reduce, infections by Toxoplasma gondii, while improving tolerance. treatment, that is to say by limiting the undesirable side effects linked to taking anti-infective treatment.
  • compositions for use in the treatment and/or prevention of a parasitic infection caused by a parasite belonging to the phylum Apicomplexa comprises an extract obtained from a red microalgae belonging to the species Porphyridium sp, said extract comprising exopolysaccharides obtained from this red microalgae.
  • the invention thus proposes a completely new and inventive approach for treating and/or preventing a parasitic infection which consists of using molecules from marine biodiversity to mimic the GAGs of host cells recognized by the parasite and thus prevent or to at least limit their infection by the latter.
  • red microalgae present a double advantage allowing their pharmaceutical use to be considered for fragile subjects: a more regular molecular structure than macroalgae, thus ensuring a product of stable composition ( “Marine medicinal glycomics”, Pomin et al., Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2014 ) ; and culture in a sterile photobioreactor.
  • different species of microalgae produce different types of polysaccharides.
  • red microalgae do not produce fibrillar polysaccharides, but exopolysaccharides which form a protective mucilage and encapsulate the cells.
  • This mucilage includes a fraction of exopolysaccharides (EPS) soluble in the medium, while 50 to 70% of the polymer produced by the microalgae remains around the cell to form a mucilage which encapsulates the latter.
  • EPS exopolysaccharides
  • These soluble exopolysaccharides (EPS) correspond to the part extracted and purified after culturing the microalgae ( “Separation and fractionation of exopolysaccharides from Porphyridium cruentum”, Patel et al., Bioresource Technology, 2013 ).
  • the invention proposes to use, as a strain producing sulfated exopolysaccharides, a particular red microalgae, Porphyridium sp, whose “GAG mimetic” activity potential has not yet been explored.
  • a strain producing sulfated exopolysaccharides a particular red microalgae, Porphyridium sp, whose “GAG mimetic” activity potential has not yet been explored.
  • An advantage of this red algae and, in particular, of the Porphyridium cruentum strain is that it is considered to comply with the safety standards defined by European authorities.
  • EPS composed mainly of xylose, galactose, glucose, glucuronic acid and rhamnose
  • EPS mainly of xylose, galactose, glucose, glucuronic acid and rhamnose
  • rheological properties « Red microalgal cell-wall polysaccharides: biotechnological aspects”, Arad et al., Current Opinion in Biotechnology, 2010 ; “Superior biolubricant from a species of red microalgal”, Arad et al, Langmuir, 2006 ; “ Bioactivity and Applications of sulphated polysaccharides from marine microalgae”, Jesus de Raposo et al., Marine Drugs, 2013 ).
  • exopolysaccharides obtained from red microalgae such as Porphyridium sp, allow a reduction in parasitic growth.
  • parasites of the phylum Apicomplexa have proven to be particularly sensitive to this type of molecules.
  • biomarine compounds such as the EPS of Porphyridium sp, as proposed by the invention, opens the way to new therapeutic methods in the context of the treatment of parasitic infections and in particular the treatment and/or prevention of infections caused by parasites from the phylum Apicomplexa.
  • an antiparasitic treatment based on EPS offers an alternative to current treatments which sometimes induce undesirable side effects, particularly in the case of anti-toxoplasmic drug treatments.
  • the microalgae of the species Porphyridium sp is chosen from: Porphyridium cruentum and Porphyridium marinum.
  • Porphyridium cruentum and Porphyridium marinum makes it possible to obtain exopolysaccharides which can be used in the treatment and/or prevention of parasitic infections.
  • these strains are good sources of EPS supply.
  • the extract comprises between 50 and 200 ⁇ g/mL of exopolysaccharides extracted from Porphyridium cruentum or Porphyridium marinum.
  • the parasite belongs to the phylum Apicomplexa and Toxoplasma gondii.
  • the microalgae of the species Porphyridium sp is chosen from: Porphyridium cruentum and Porphyridium marinum.
  • the parasitic infection is caused by a parasite belonging to the phylum Apicomplexa, said parasite being Toxoplasma gondii.
  • the extract comprises between 50 and 200 ⁇ g/mL of exopolysaccharides extracted from Porphyridium cruentum or Porphyridium marinum.
  • the parasites having shown sensitivities towards Porphyridium sp molecules are in particular those of the Apicomplexa phylum.
  • FIG. 1 represents a diagram of a cellular structure of parasites of the phylum Apicomplexa.
  • the sporozoite form and the merozoite form are found in humans.
  • Oocysts characterize the contaminating form of parasites found in the environment.
  • Oocysts are “eggs” which are the form of propagation of parasites of the phylum Apicomplexa in the external environment and therefore of parasitic infection.
  • the sporozoite form and the merozoite form include an AP apicoplast, CA cortical alveoli, CO comoid zone, dense DG granules, ER endoplasmic reticulum, GA golgi apparatus, MN micronemes, MP micropore, MT mitochondria, a NU nucleus, PC pre-conoidal rings, a PR polar ring, RH rhoptries and SM subpellicular microtubules.
  • This enzyme makes it possible to quantify parasite growth in the presence of a substrate (for example chlorophenol red- ⁇ -D-galactosidase or CPRG) ( “Use of Toxoplasma gondii expressing ⁇ -galactosidase for colorimetric assessments of drug activity in vitro”, Mc Fadden et al, Antimicrobial and Chemotherapy, 1997 ).
  • a substrate for example chlorophenol red- ⁇ -D-galactosidase or CPRG
  • EPS Exopolysaccharides from Porphyridium marinum (PM) and Porphyridium cruentum (PC) were tested after 1 hour of contact with the parasite.
  • Porphyridium sp produce identical polysaccharides, and in particular EPS, and the activity demonstrated is not species specific.
  • microalgae are cultivated in a suitable medium: typically a modified Hemerick medium.
  • Table 1 below presents the composition of modified Hemerick's medium (MHM5) used for the cultivation of microalgae.
  • MLM5 modified Hemerick's medium
  • Table 1 Macroelements Concentration (g/L) Microelements Concentration (mg/L) NaCl 29 H3BO3 2 MgSO4, 7H2O 6 MnCL2, 4H2O 1.8 NaNO3 1.5 (NH4)6Mo7O24, 4H2O 0.02 CaCL2, 2H2O 0.294 ZnSO4, 7H2O 0.213 KCL 0.75 CuSO4, 5H2O 0.08 NaHCO3 1.7 CoSO4, 7H2O 0.91 KH2PO4 0.8 FeEDTA 0.05
  • All microalgae cultivation systems for cultivating Porphyridium sp are suitable: Raceway type pond, tubular, planar, helical photo-bioreactor, etc.
  • the cultivation that is to say the PROD_BIO production of biomass and therefore EPS, is carried out in a photobioreactor (PBR) of the tubular Air-Lift type of 10L at 25°C, inoculated by a previous culture in PBR One liter Air-Lift plan combined with modified Hemerick medium.
  • PBR photobioreactor
  • EPS production begins at the end of the exponential phase of microalgae development and increases at the stationary phase of microalgae development.
  • the EPS are excreted into the culture medium after a maturation phase of the microalgae, the culture supernatant is then collected by CENT centrifugation following the REC harvesting step of the biomass.
  • the exopolysaccharides in Sol_EPS solution are separated from the C_M microalgal cells and extracted.
  • polysaccharides and in particular EPS
  • EPS can also be extracted from biomass which still contains them (up to 20%).
  • Several technologies are possible: by ball grinding according to a technique described in the patent EP3206477B1 , or cavitation or even hot water extraction...
  • polysaccharides, such as EPS, non-hydrolyzed can be included in the composition which is the subject of the present invention.
  • the measurement of anti-infectious activity is based on a method developed at the LMGE laboratory (“Microorganisms, Genomes and Environment Laboratories”). The method is described below.
  • the strain of Toxoplasma gondii cultivated in the laboratory is a well-known genetically modified parasite strain: the gene for expressing the ⁇ -D-galactosidase enzyme has been inserted into the genome of the parasite. Thus, it is possible by measuring the activity of this enzyme to know the viability and growth of parasites. In the presence of the enzyme substrate, CPRG, a colored complex is formed which is quantified by spectroscopy at 550 nm.
  • the effect of EPS is first evaluated on HFF cells which correspond to Toxoplasma gondii host cells.
  • the MTT method ( “Towards an optimized MTT assay”, Niks et al, Journal of Immunological Methods, 1990 ) is used to evaluate the impact of EPS produced by PM and PC microalgae strains on the viability of HFF cells.
  • MTT terazolium salt (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) is a water-soluble compound, giving a yellow solution. It enters cells a priori by endocytosis. The tetrazolium ring contained in MTT is reduced to formazan by mitochondrial succinate dehydrogenase of active living cells, forming an insoluble precipitate in the mitochondria of purple color, also called “formazan crystals”. Also, dead cells cannot form crystals. The quantity of precipitate formed is therefore proportional to the quantity of living cells, but above all to the metabolic activity of each cell.
  • the cells and the crystals are dissolved using a solvent (for example DMSO for dimethyl sulfoxide, or isopropanol).
  • a solvent for example DMSO for dimethyl sulfoxide, or isopropanol.
  • the coloring is measured by spectroscopy to know the relative quantity of living and, above all, metabolically active cells.
  • tachyzoites infectious forms of Toxoplasma gondii
  • extracts comprising exopolysaccharides (EPS) obtained according to the process described in connection with the figure 2 , from PM and PC microalgae strains, as well as HFF host cells not infected with Toxoplasma gondii for 1 hour.
  • EPS exopolysaccharides
  • HFF host cells are then infected with 2.10 4 pre-treated tachyzoites (i.e. 200 ⁇ L) for 1 hour. These are then washed once with supplemented MEM medium (“Minimum Essential Medium ”).
  • MEM medium Minimum Essential Medium
  • the extracts comprising EPS obtained from the PM and PC microalgae strains to be tested are then added at the correct concentration of EPS in a volume of 200 ⁇ L.
  • T.gondii parasite is evaluated by measuring the ⁇ -D-galactosidase activity of the parasites, the dosage being proportional to the number of parasites.
  • the 96-well plates are thus centrifuged at 265 x g for 5 min.
  • the cells are lysed with 50 ⁇ L of lysis buffer for 1 hour at 50°C, after removing the culture medium.
  • the reaction buffer 160 ⁇ L is then added and the plates are incubated for 5 min at 37°C in order to optimize the activity of the ⁇ -D-galactosidase enzyme.
  • the culture plates are incubated for 30 min until a red coloring.
  • the OD (Optical Density) or absorbance at 550nm is measured with a microplate reader to quantify parasitic growth.
  • an MTT test is carried out to determine whether the PC and PM extracts are toxic to the HFF host cells allowing the growth of T.gondii.
  • the MTT test aims to demonstrate the absence of significant effect of PM and PC extracts on the viability of HFF host cells.
  • the histogram of the Figure 3 represents on the ordinate the percentage of Via_Cel cell viability (%) and on the abscissa the different EPS treatment conditions as presented previously.
  • the histogram of the figure 4 represents on the ordinate the percentage of C_para parasite growth (%) and on the abscissa the different EPS treatment conditions as presented previously.
  • the invention which has just been presented constitutes the first description of antiparasitic activity against parasites of the human digestive system for microalgal EPS.
  • the results obtained open up new perspectives for chemo-prevention that could lead to a place for the microalgal industry within an innovative pharmaceutical strategy.
  • the results which have just been described make it possible to demonstrate an antiparasitic activity of the EPS of Porphyridium sp.
  • the products, or extracts comprising EPS obtained from PM and PC have an anticoccidial activity of around 50%, with pretreatment of the parasites for one hour. It would therefore be interesting to test several parasite pretreatment times (for example 30 min, 1 hour, 2 hours). The increase in pretreatment time should thus increase the activity of the products obtained from PM and PC.
  • red microalgae-based product for the food and feed sector an outlook for Europe”, Enzig et al., 2016
  • red microalgae-based product for the food and feed sector an outlook for Europe
  • viruses “Bioactivity and Applications of sulphated polysaccharides from marine microalgae”, Jesus de Raposo et al.). They take into account in vitro interactions between the molecule and the virus, but exclude the phenotype of the host cell and/or the tissue barrier to be crossed. In general, these viruses target specific ligands including GAGs ( “Glycosaminoglycans and infection”, Park et al., Frontiers in bioscience, 2016 ), whose expression varies depending on the tissue and explains the different modes of viral transmission. On the contrary, with the invention it is possible to take into account the mode of invasion of the pathogen from the molecular to tissue level, and the safety of the host.
  • Porphyridium cruentum seems the ideal candidate for its rapid application. Its hybrid anti-infective status with preventive purposes risks shifting its regulatory indication towards the medical field.
  • the invention could advantageously be integrated into a defined anti-toxoplamic therapeutic strategy, such as for example chemo-prevention.
  • This policy does not yet determine which host it will be most active towards.
  • the choice of destination towards the definitive host animal model cat would make it possible to limit transmission to humans, but would not eliminate the main routes of contamination which pass through non-domestic animals.
  • the formulation towards humans will have to resolve questions of tolerance due to the fragility of the subjects exposed.
  • it could also be interesting to monitor the appearance of resistance with a view to implementing this new chemoprevention strategy ( “Multidrug resistance: an emerging crisis”, Tanwar et al., Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, 2014 ).
  • the invention which has just been described provides numerous advantages. It presents promising results for the treatment and/or prevention of parasitic infections, which makes it possible to envisage the entry of new bioactive compounds derived from marine polysaccharides (such as EPS) on the pharmaceutical market.
  • marine polysaccharides such as EPS

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Description

    1. Domaine de l'invention
  • Le domaine de l'invention est celui du traitement et/ou de la prévention d'infections parasitaires, notamment d'infections par les parasites du phylum (ou embranchement) Apicomplexa.
  • Plus précisément, l'invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant des exopolysaccharides obtenus à partir d'extraits de Porphyridium sp pour le traitement et/ou la prévention d'infections par les parasites du phylum Apicomplexa.
    • 2. Art antérieur
  • Les parasites sont des organismes vivants pathogènes pour l'Homme qui ont, au cours de leur cycle de développement, le besoin de parasiter (ou infecter) un autre organisme, lui induisant des dégradations de son état physiologique, contrairement à une symbiose qui est profitable pour les deux organismes vivants.
  • Parmi les parasites d'animaux, dont l'Homme, on retrouve les parasites de l'embranchement des Apicomplexes (ou Apicomplexa), nommés également sporozoaires.
  • On compte dans cet embranchement différentes espèces connues telles que Plasmodium falciparum (parasite responsable du paludisme, ou malaria), Toxoplasma gondii (parasite responsable de la toxoplasmose), Eimeria sp. (parasite responsable de la coccidiose), etc. Ces parasites possèdent tous de fortes similarités structurelles et cycliques, suggérant ainsi l'utilisation d'une stratégie thérapeutique commune à ce phylum.
  • Plasmodium falciparum est le parasite le mieux connu du phylum Apicomplexa. Ce parasite est responsable de 220 millions de cas de paludisme dans le monde en 2010. Les manifestations sont particulièrement sévères chez les enfants qui représentent plus de % des 650 000 décès recensés lors de cette même année. Ce parasite contamine l'Homme via une piqûre de moustique du genre Anophèle, qui le transporte à l'intérieur de ses glandes salivaires. Le parasite induit une fièvre paludique caractérisée par la dégradation des globules rouges.
  • À l'heure actuelle, les techniques de prévention de la maladie sont : l'utilisation d'antipaludéens lors d'un déplacement dans des zones à risques, la limitation des risques de piqûres de moustiques via une sensibilisation des populations, ainsi que l'emploi d'insecticides. Les traitements de référence antipaludéens sont efficaces et peu coûteux. La bithérapie à base de substances d'origine naturelle, telle que l'Artémisinine et la 4-amino quinoléine, guérit 98% des cas. Toutefois, l'apparition de résistance pousse à continuer à rechercher de nouvelles molécules pour le traitement et/ou la prévention de l'infection par ce parasite. L'obtention de nouvelles molécules d'origine naturelle s'est avérée pour le moment décevante, notamment pour des raisons de pharmacodynamie qui ne permet pas de reproduire in vivo un effet significatif chez l'Homme (« Natural products as starting points for future anti-malaria thérapies : going bock to our roots ? », Wells et al., Malaria Journal, 2011).
  • Chez l'animal, Eimeria sp., est responsable de la coccidiose du poulet, dont les conséquences sanitaires et financières sont importantes. La lutte anticoccidienne du poulet repose sur une combinaison comprenant une rotation des antibiotiques, des mesures d'hygiène et des vaccins (« Control of avion coccidiosis : future and présent natural alternatives », Ouiroz-Castañeda et al., BioMed Research International, 2015). L'efficacité des traitements médicamenteux, notamment des antibiotiques utilisés est à pondérer avec l'émergence de résistances et la forte pression des consommateurs pour des méthodes alternatives plus naturelles. L'aromathérapie, l'homéopathie, la phytothérapie, l'usage de pré- ou probiotiques ont ainsi été proposés. Ces nouvelles méthodes proposent de nouveaux modes d'action complémentaires de renfort de la barrière ou de l'immunité intestinale (« Coccidiose in poultry : anticoccidial products, vaccines and other prévention strategies », Peek et al., Vetenary Quarterly, 2011). En revanche, la prévention de la transmission d'Eimeria sp. ne fait pas encore partie de l'arsenal thérapeutique.
  • Toxoplasma gondii est le parasite responsable de la toxoplasmose. Le cycle de vie de Toxoplasma gondii comprend une forme classique impliquant un hôte définitif (comme par exemple les félidés domestiques ou sauvages) et un hôte intermédiaire. Les sporozoïtes du parasite, développés au sein des oocystes de matières fécales félines, sont dispersés dans l'environnement, puis ingérés par l'hôte intermédiaire. Au sein du tube intestinal, la forme sporozoïte se modifie en forme d'invasion dite tachyzoïte. Cette phase est rapidement limitée par le système immunitaire, qui contient le parasite sous forme de bradyzoïte (« Lytic Cycle of Toxoplasma gondii : 15 Years Later », Blader et al., Animal Review of Microbiology, 2015). Ainsi, cette infection est en général pauci-symptomatique pour l'immunocompétent. Elle est pourtant la principale infection parasitaire d'origine alimentaire responsable d'hospitalisations (« Foodborne Infections in France », Vaillant et al. Foodborne Pathogens and Disease, 2005). Les manifestations les plus sévères surviennent chez les sujets les plus fragiles, en raison de la réactivation de la forme parasitaire quiescente ou du passage des barrières biologiques de la forme invasive du parasite. Elle est notamment responsable chez l'immunodéprimé infecté par le virus du VIH (Virus de l'immunodéficience Humaine) de la toxoplasmose cérébrale et chez le foetus de complications oculaires et cérébrales majeures (« Toxoplasmosis Snapshots : Global Status of Toxoplasma Gondii Seroprevalence and Implications for Pregnancy and Congénital Toxoplasmosis », Pappas et al., International Journal of Parasitology, 2009). La transmission materno-foetale (ou TMF) survient lors de primo-infection maternelle per partum et peut même précéder la grossesse de deux mois.
  • Le traitement de la toxoplasmose repose sur une association de pyriméthamine et de sulfadiazine, dont la tolérance est souvent mauvaise. D'autres molécules sont disponibles comme par exemple le dapsone, la lindosamie, la clindamycine, l'atovaquone... Elles présentent également un risque d'effets secondaires indésirables et ne sont pas spécifiques de la toxoplasmose, ni du cycle parasitaire (« Human Toxoplasmosis-searching for novel chemotherapeutics », Antezazk et al., Biomedicine & Pharmacotherapy, 2016). Les traitements prophylactiques durant la grossesse sont initiés en cas de séroconversion. Ils comprennent la spiramycine avant 18 semaines d'aménorrhée, ou une combinaison de médicaments au-delà. Malgré tout, le taux de transmission verticale, c'est-à-dire de la mère à l'enfant, reste à 10% (« Systematic review and meta-analysis of the efficiency of anti-Toxoplasma gondii medicines in humons », Wei et al., PLoS ONE, 2015).
  • À l'heure actuelle, les seules mesures préventives résident dans des précautions alimentaires et une limitation de contact avec les animaux hôtes permanents du parasite. Pourtant, la piste préventive semble une voie complémentaire à proposer devant les complications liées au retard de diagnostic. Or, elle est pour le moment peu exploitée, la recherche se focalisant sur de nouvelles molécules utiles à visée thérapeutique. Les vaccins sont en cours d'essai chez l'animal, visant notamment l'expression protéique de molécules d'adhésion (« Immune response and protective effect against chronic Toxoplasma gondii infection induced by vaccination with DNA vaccine encoding Profilin », Gao et al, BMC Infectious Diseases, 2018).
  • Les nouvelles pistes pharmacologiques antitoxoplasmiques sont le plus souvent des molécules de synthèse visant la machinerie intracellulaire (par exemple le réticulum endoplasmique, les mitochondries, l'apicoplaste), la membrane cellulaire, le micronème ou l'extrémité apicale. Pour le seul Toxoplasma gondii, près de 40 sites d'action différents sont testés (« A systematic review of in vitro and in vivo activities of anti-toxoplasma drugs and compounds », Montazeri et al., Frontiers in Microbiology, 2017).
  • La phase d'invasion de Toxoplasma gondii est un phénomène relativement conservé au sein du phylum Apicomplexa. En effet, ces protozoaires intracellulaires obligatoires présentent un mode de locomotion unique qui leur permet de franchir des barrières biologiques non permissives et de pénétrer activement dans leurs cellules hôtes. Cette motilité conditionne leur survie et est assurée par un complexe apical sécrétant des molécules reliées à un système d'actine et myosine qui vont reconnaitre des molécules exprimées par la cellule hôte telles que les glycosaminoglycanes sulfatés (GAGs). Les glycosaminoglycanes (GAG) sont des polysaccharides linéaires complexes exprimés dans les compartiments intracellulaires, à la surface des cellules et dans l'environnement extracellulaire où elles interagissent avec diverses molécules pour réguler de nombreux processus cellulaires impliqués dans la santé et la maladie. Les parasites utilisent les GAG à pratiquement tous les principaux points d'entrée pour favoriser leur attachement et leur invasion des cellules hôtes, leur déplacement d'une cellule à l'autre et pour se protéger des attaques immunitaires.
  • En d'autres termes, le phénomène de glissement permet au parasite de traverser les barrières biologiques et d'atteindre les tissus cibles. Il est suivi d'une phase d'attachement passant également par la reconnaissance de GAGs (« Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment », Carruthers et al. Infection and Immunity, 2000). Les protéines du parasite impliquées dans les interactions avec les GAGs des cellules hôtes sont respectivement les micronèmes (par exemple MIC1 et 2) (« Toxoplasma gondii : microneme protein MIC 2 », Brossier et al., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2005), sécrétés lors de la phase de glissement au niveau de la partie apicale du parasite, et les antigènes de surface présents sur l'ensemble de la surface du parasite (par exemple SAG1, « Surface Antigen 1 ») pour l'étape d'attachement. Ces familles de molécules d'adhésion sont différentes selon le parasite, mais s'avèrent des cibles thérapeutiques stratégiques préventives dans la lutte antiparasitaire du phylum Apicomplexa (« Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment », Carruthers et al. Infection and Immunity, 2000). En effet, les mécanismes impliqués dans la motilité des Apicomplexes, leur attachement et leur invasion de la cellule hôte sont en grande partie conservés à travers les membres du phylum.
  • Øystein et al., Engineered Sulfated Polysaccharides for Biomedical Applications, ETH Library Zurich, 2021, pages 1-14, retrouvé sur https://www.research-collection.ethz.ch/bitstream/ handle/20.500.11850/484261/3/Arlov_sulfatedpsreview_final_resubmit_AFM.pdf, démontré que les sulfates de dextran réduisent l'infectivité de Toxoplasma gondii, vraisemblablement en antagonisant les lectines qui se lient normalement aux polysaccharides sulfatés dans la matrice extracellulaire.
  • Il existe donc un besoin d'une nouvelle solution thérapeutique pour empêcher, ou pour le moins réduire, une infection induite par des parasites appartenant à l'embranchement des Apicomplexes. Notamment, il existe un besoin d'une nouvelle solution thérapeutique dont les effets secondaires indésirables sont réduits par rapport au traitements actuels.
    • 3. Objectifs de l'invention
  • L'invention a notamment pour objectif de pallier aux inconvénients de l'art antérieur et de proposer une alternative thérapeutique à l'utilisation des composés médicamenteux actuels dans le traitement d'une infection par les parasites du phylum Apicomplexa.
  • Plus précisément, l'invention a pour objectif, dans au moins un mode de réalisation, de fournir une composition permettant de prévenir et/ou d'éliminer, ou à tout le moins réduire davantage, les infections par les parasites du phylum Apicomplexa, et notamment les infections par Toxoplasma gondii.
  • Un autre objectif de l'invention, dans au moins un mode de réalisation, est de fournir une composition permettant de prévenir et/ou d'éliminer, ou à tout le moins de réduire, les infections par Toxoplasma gondii, tout en améliorant la tolérance au traitement, c'est-à-dire en limitant les effets secondaire indésirables liés à la prise d'un traitement anti-infectieux.
    • 4. Exposé de l'invention
  • Ces objectifs, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints à l'aide d'une composition pour utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une infection parasitaire causée par un parasite appartenant au phylum Apicomplexa. Cette composition comprend un extrait obtenu à partir d'une microalgue rouge appartenant à l'espèce Porphyridium sp, ledit extrait comprenant des exopolysaccharides obtenus à partir de cette microalgue rouge.
  • L'invention propose ainsi une approche tout-à-fait nouvelle et inventive pour traiter et/ou prévenir une infection parasitaire qui consiste à utiliser des molécules issues de la biodiversité marine pour mimer les GAGs des cellules hôtes reconnues par le parasite et ainsi empêcher ou pour le moins limiter leur infection par ce dernier.
  • Contrairement à l'art antérieur (« Dual and Antagonic therapeutic effects of sulfated glycans », Pomin et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2016), qui ne considère que des molécules, parfois impures, d'origine animale, comme source de molécules mimant les GAGs (comme par exemple le kératane sulfate, l'héparane sulfate ou le chondroïtine sulfate), l'invention propose d'exploiter les ressources marines pour renforcer l'arsenal thérapeutique antiparasitaire, et en particulier les microalgues rouges qui sont intéressantes à plusieurs points de vue.
  • En effet, les microalgues rouges présentent un double avantage permettant d'envisager leur exploitation pharmaceutique à destination de sujet fragiles : une structure moléculaire plus régulière que les macroalgues, assurant ainsi un produit de composition stable (« Marine medicinal glycomics », Pomin et al., Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2014) ; et une culture en photobioréacteur stérile. Il convient de noter que les différentes espèces de microalgues produisent des types différents de polysaccharides. En particulier, les microalgues rouges ne produisent pas de polysaccharides fibrillaires, mais des exopolysaccharides qui forment un mucilage de protection et encapsulent les cellules. Ce mucilage comprend une fraction d'exopolysaccharides (EPS) soluble dans le milieu, alors que 50 à 70% du polymère produit par la microalgue reste autour de la cellule pour former un mucilage qui encapsule cette dernière. Ces exopolysaccharides (EPS) solubles correspondent à la partie extraite et purifiée après mise en culture des microalgues (« Séparation and fractionation of exopolysaccharides from Porphyridium cruentum », Patel et al., Bioresource Technology, 2013).
  • En particulier, l'invention propose d'utiliser, comme souche productrice d'exopolysaccharides sulfatés, une microalgue rouge particulière, Porphyridium sp, dont le potentiel d'activité « GAG mimétique » n'a pas encore été exploré. Un avantage de cette algue rouge et, en particulier, de la souche Porphyridium cruentum est qu'elle est considérée comme conforme aux normes de sécurité définies par les autorités européennes. Ses EPS, composés majoritairement de xylose, galactose, glucose, acide glucuronique et rhamnose, ne sont aujourd'hui exploités que par l'industrie cosmétique pour leurs propriétés rhéologiques (« Red microalgal cell-wall polysaccharides : biotechnological aspects », Arad et al., Current Opinion in Biotechnology, 2010 ; « Superior biolubricant from a species of red microalgal », Arad et al, Langmuir, 2006 ; « Bioactivity and Applications of sulphated polysaccharides from marine microalgae », Jesus de Raposo et al., Marine Drugs, 2013).
  • Avantageusement, les inventeurs ont montré que les exopolysaccharides (ou EPS) obtenus à partir de microalgues rouges telles que Porphyridium sp, permettent une diminution de la croissance parasitaire. En particulier, les parasites du phylum Apicomplexa se sont avérés particulièrement sensibles à ce type de molécules.
  • Ainsi, l'utilisation de composés biomarins comme les EPS de Porphyridium sp, telle que proposée par l'invention, ouvre la voie à de nouvelles méthodes thérapeutiques dans le cadre du traitement d'infections parasitaires et notamment le traitement et/ou la prévention d'infections causées par les parasites issus du phylum Apicomplexa.
  • En outre, les inventeurs ont pu établir que l'utilisation des EPS n'induit pas de cytotoxicité pour les cellules hôtes. Ainsi, un traitement antiparasitaire à base d'EPS offre une alternative aux traitements actuels qui induisent parfois des effets secondaires indésirables, notamment dans le cas des traitements médicamenteux anti-toxoplasmiques.
  • Selon une autre caractéristique, la microalgue de l'espèce Porphyridium sp est choisie parmi : Porphyridium cruentum et Porphyridium marinum.
  • De manière avantageuse, l'utilisation de l'une ou l'autre de ces deux souches de Porphyridium sp. (Porphyridium cruentum et Porphyridium marinum), permet d'obtenir des exopolysaccharides pouvant être utilisés dans le traitement et/ou la prévention d'infections parasitaires. En effet, ces souches sont de bonnes sources d'approvisionnement en EPS.
  • Selon une autre caractéristique, l'extrait comprend entre 50 et 200 µg/mL d'exopolysaccharides extrait de Porphyridium cruentum ou Porphyridium marinum.
  • Selon une autre caractéristique, le parasite appartient au phylum Apicomplexa est Toxoplasma gondii.
  • Selon une caractéristique de l'invention, la microalgue de l'espèce Porphyridium sp est choisie parmi : Porphyridium cruentum et Porphyridium marinum.
  • Selon une autre caractéristique, l'infection parasitaire est causée par un parasite appartenant au phylum Apicomplexa, ledit parasite étant Toxoplasma gondii.
  • Selon une autre caractéristique de l'invention, l'extrait comprend entre 50 et 200 µg/mL d'exopolysaccharides extrait de Porphyridium cruentum ou Porphyridium marinum.
    • 5. Brève description des figures
  • D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante, donnée à titre de simple exemple illustratif, et non limitatif, en relation avec les figures, parmi lesquelles :
    • [Fig. 1] : la figure 1 illustre un schéma d'une structure cellulaire d'un sporozoïte ou mérozoïte des parasites provenant de l'embranchement des Apicomplexes ;
    • [Fig. 2] : la figure 2 présente sous forme de diagramme un exemple de procédé de culture de microalgue et de production et récupération d'ExoPolySaccharides de la microalgue Porphyridium cruentum ;
    • [Fig. 3] : la figure 3 représente un histogramme illustrant la viabilité de cellules HFF après traitement par une composition comprenant des exopolysaccharides extrait de Porphyridium cruentum ou Porphyridium marinum ;
    • [Fig.4] : la figure 4 représente un histogramme illustrant le développement parasitaire après infection par Toxoplasma gondii de cellules HFF et traitement par une composition comprenant des exopolysaccharides extrait de Porphyridium cruentum ou Porphyridium marinum.
    6. Description des modes de réalisation de l'invention
  • Les parasites ayant montré des sensibilités envers des molécules de Porphyridium sp, sont en particulier ceux de l'embranchement des Apicomplexes.
  • La figure 1 représente un schéma d'une structure cellulaire des parasites du phylum Apicomplexa. En particulier, la forme sporozoïte et la forme mérozoïte sont retrouvées chez l'Homme. Les oocystes caractérisent la forme contaminante des parasites trouvés dans l'environnement. Les oocystes sont des « oeufs » qui sont la forme de propagation des parasites du phylum Apicomplexa dans l'environnement extérieur et donc de l'infection parasitaire. La forme sporozoïte et la forme merozoïte comprennent un apicoplaste AP, des alvéoles corticales CA, une zone comoïde CO, des denses granules DG, un réticulum endoplasmique ER, un appareil de golgi GA, des micronèmes MN, un micropore MP, des mitochondries MT, un noyau NU, des anneaux pré-conoïdales PC, un anneau polaire PR, des rhoptries RH et des microtubules subpelliculaires SM.
  • Afin de démontrer l'effet antiparasitaire des EPS de Porphyridium sp., des tests in vitro d'activités antitoxoplasmiques ont été réalisés sur des fibroblastes de prépuce humain HFF (« Human Foreskin Fibroblasts ») infestés par une souche de Toxoplasma gondii génétiquement modifiée pour exprimer une β-D-galactosidase. L'expression de cette enzyme permet de quantifier la croissance parasitaire en présence d'un substrat (par exemple du chlorophénole rouge-β-D-galactosidase ou CPRG) (« Use of Toxoplasma gondii expressing β-galactosidase for colorimétrie assessments of drug activity in vitro », Mc Fadden et al, Antimicrobial and Chemotherapy, 1997).
  • Les exopolysaccharides (EPS) de Porphyridium marinum (PM) et Porphyridium cruentum (PC) ont été testés après 1h de contact avec le parasite.
    • 6.1. Cultures des microalgues rouges
  • Les souches microalgales utilisées sont les suivantes :
    • Porphyridium cruentum (PC) : UTEX 161 ;
    • Porphyridium marinum (PM) : Kylin (1937) CCAP 1380/10.
  • Toutes les souches de Porphyridium sp produisent des polysaccharides identiques, et en particulier des EPS, et l'activité démontrés n'est pas spécifique à une espèce.
  • La mise en culture des microalgues est effectuée dans un milieu adapté : typiquement un milieu d'Hemerick modifié.
  • Le tableau 1 ci-dessous présente la composition du milieu d'Hemerick modifié (MHM5) utilisé pour la culture des microalgues. [Table 1]
    Macroéléments Concentration (g/L) Microéléments Concentration (mg/L)
    NaCl 29 H3BO3 2
    MgSO4, 7H2O 6 MnCL2, 4H2O 1,8
    NaNO3 1,5 (NH4)6Mo7O24, 4H2O 0,02
    CaCL2, 2H2O 0,294 ZnSO4, 7H2O 0,213
    KCL 0,75 CuSO4, 5H2O 0,08
    NaHCO3 1,7 CoSO4, 7H2O 0,91
    KH2PO4 0,8
    FeEDTA 0,05
  • On présente désormais en lien avec la figure 2 un exemple de procédé de culture d'une microalgue Porphyridium cruentum et d'extraction des EPS produits par celle-ci.
  • Il est à noter que la même procédure peut être mise en oeuvre avec la microalgue Prophyridium marinum.
  • Tous les systèmes de culture de microalgues permettant de cultiver Porphyridium sp sont adaptés : bassin de type Raceway, photo-bioréacteur tubulaire, plan, hélicoïdale...
  • Dans l'exemple en lien avec la figure 2, la mise en culture, c'est-à-dire la production PROD_BIO de biomasse et donc des EPS, est réalisée en photobioréacteur (PBR) de type Air-Lift tubulaire de 10L à 25°C, inoculé par une culture antérieure en PBR Air-Lift plan d'un litre associé à un milieu d'Hemerick modifié.
  • La production d'EPS débute à la fin de la phase exponentielle de développement des microalgues et se majore à la phase stationnaire de développement des microalgues.
  • Les EPS sont excrétées dans le milieu de culture après une phase de maturation des microalgues, le surnageant de culture est alors recueilli par centrifugation CENT suite à l'étape de récolte REC de la biomasse. Les exopolysaccharides en solution Sol_EPS sont séparés des cellules microalgales C_M et extraits.
  • Plusieurs technologies peuvent être utilisées pour la concentration et la purification CONC_PUR de la solution d'EPS Sol_EPS obtenue après centrifugation, pour obtenir des EPS purifiés, comme la filtration membranaire par diafiltration / ultrafiltration et la précipitation à l'éthanol.
  • Dans une variante, les polysaccharides, et en particulier les EPS, peuvent aussi être extraits à partir de la biomasse qui en contient encore (jusqu'à 20%). Plusieurs technologies sont possibles : par broyage à bille selon une technique décrite dans le brevet EP3206477B1 , ou cavitation ou encore extraction à l'eau chaude... Quelle que soit la technologie d'extraction, les polysaccharides, comme les EPS, non hydrolysés, peuvent rentrer dans la composition objet de la présente invention.
    • 6.2. Mesure de l'activité anti-infectieuse de Toxoplasma gondii
  • La mesure de l'activité anti-infectieuse est basée sur une méthode mise au point au laboratoire LMGE (« Laboratoires Microorganismes, Génomes et Environnement »). La méthode est décrite ci-dessous.
    • 6.2.1 La souche parasitaire
  • La souche de Toxoplasma gondii cultivée au sein du laboratoire est une souche de parasite génétiquement modifiée bien connue : le gène d'expression de l'enzyme de β-D-galactosidase a été inséré dans le génome du parasite. Ainsi, il est possible par le dosage de l'activité de cette enzyme de connaître la viabilité et la croissance des parasites. En présence du substrat de l'enzyme, le CPRG, il y a formation d'un complexe coloré qui est quantifié par spectroscopie à 550 nm.
    • 6.2.2 Analyse de la viabilité cellulaire
  • L'effet des EPS est évalué, dans un premier temps, sur des cellules HFF qui correspondent aux cellules-hôtes de Toxoplasma gondii. La méthode MTT (« Towards an optimized MTT assay », Niks et al, Journal of Immunological Methods, 1990) est utilisée pour évaluer l'impact des EPS produit par les souches de microalgues PM et PC sur la viabilité des cellules HFF.
  • Le sel de térazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) est un composé soluble dans l'eau, donnant une solution jaune. Il pénètre les cellules a priori par endocytose. L'anneau de tétrazolium contenu dans le MTT est réduit en formazan par le succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, formant un précipité insoluble dans la mitochondrie de couleur violette, dit aussi « cristaux de formazan ». Aussi, les cellules mortes ne peuvent pas former de cristaux. La quantité de précipité formée est donc proportionnelle à la quantité de cellules vivantes, mais surtout à l'activité métabolique de chaque cellule. Ainsi, après l'incubation des cellules en présence de MTT pendant environ 2 à 3H à 37°C, les cellules et les cristaux sont dissous à l'aide d'un solvant (par exemple DMSO pour diméthylsulfoxyde, ou isopropanol). La coloration est mesurée par spectroscopie pour connaître la quantité relative de cellules vivantes et surtout, actives métaboliquement.
  • Les conditions sont les suivantes :
    • Contrôle négatif : cellules saines non traitées (C_S) ;
    • Contrôle positif : cellules traitées au DMSO 20% (DMSO 20%) ;
    • Cellules HFF traitées 4 jours en présence d'extraits issus des microalgues PM et PC avec des concentrations en EPS de 50µg/mL, 100µg/mL et 200µg/mL (PM_200 ; PM_100; PM_50 ; PC_200 ; PC_100 ; PC_50).
  • Les résultats sont présentés en lien avec la figure 3 décrite ci-dessous en section 6.3.1.
    • 6.2.3 Analyse de la croissance de Toxoplasma gondii : tests anticoccidiens
  • Les tachyzoïtes (formes infectieuses de Toxoplasma gondii) sont pré-traités avec des extraits comprenant des exopolysaccharides(EPS) obtenus selon le procédé décrit en lien avec la figure 2, à partir des souches de microalgues PM et PC, ainsi que les cellules-hôtes HFF non infectées par Toxoplasma gondii pendant 1h.
  • Un fois arrivées à confluence dans des plaques de culture 96 puits, les cellules-hôtes HFF sont ensuite infectées par 2.104 tachyzoïtes pré-traités (soit 200µL) pendant 1 heure. Celles-ci sont ensuite lavées une fois avec du milieu MEM (« Minimum Essential Medium », ou milieu de culture minimum essentiel en français) supplémenté.
  • Les extraits comprenant des EPS obtenus à partir des souches de microalgues PM et PC à tester sont ensuite ajoutés à la bonne concentration d'EPS dans un volume de 200µL.
  • Trois témoins sont réalisés : cellules HFF saines (non représentées), cellules HFF infectées non traitées (C_IN) et cellules HFF infectées et traitées à la pyriméthamine (molécule anticoccidienne de référence)(Pyr). Au bout de 72 heures, la croissance du parasite T.gondii est évaluée en dosant l'activité β-D-galactosidase des parasites, le dosage étant proportionnel au nombre de parasites. Les plaques 96 puits sont ainsi centrifugées à 265 x g pendant 5 min. Les cellules sont lysées avec 50µL de tampon de lyse pendant 1h à 50°C, après avoir ôté le milieu du culture. Le tampon de réaction (160µL) et ensuite ajouté et les plaques sont incubées 5 min à 37°C afin d'optimiser l'activité de l'enzyme β-D-galactosidase. Ensuite, le substrat de l'enzyme : rouge de chlorophénol β-D galactosidase (mis préalablement 1h à 50°C) à une concentration de 6,25mM en solution dans du tampon phosphate pH=7,3, est ajouté (40µL). Les plaques de culture sont incubées 30 min jusqu'à obtention d'une coloration rouge. La DO (Densité Optique) ou absorbance, à 550nm est mesurée au lecteur de micro-plaques pour quantifier la croissance parasitaire.
  • Des tests de comparaison de moyennes sont effectués et en fonction de la normalité des données de tests paramétriques (par exemple de type Anova) ou non paramétriques (par exemple Kruskall et Wallis) sont effectués pour vérifier la significativité des résultats.
  • Les conditions expérimentales sont les suivantes :
    • Cellules saines (non représentées)
    • Cellules infectées non traitées (C_IN)
    • Cellules infectées + pyriméthamine 0,1µg/mL (molécule anticoccidienne de référence)(Pyr)
    • Cellules infectées + extrait de PM 200µg/mL (PM_200)
    • Cellules infectées + extrait de PM 100µg/mL (PM_100)
    • Cellules infectées + extrait de PM 50µg/mL (PM_50)
    • Cellules infectées + extrait de PC 200µg/mL (PC_200)
    • Cellules infectées + extrait de PC 100µg/mL (PC_100)
    • Cellules infectées + extrait de PC 50µg/mL (PC_50)
  • Les résultats sont présentés en lien avec la figure 4 décrite ci-dessous en section 6.3.2.
    • 6.3. Résultats
  • Une réduction de la croissance parasitaire dose dépendante a été constatée pour les deux souches de Porphyridium sp : réduction de 43% pour Porphyridium cruentum (PC) et 52% pour Porphyridium marinum (PM) à 200µg/mL d'EPS, sans toxicité cellulaire.
    • 6.3.1. Résultats sur l'analyse de la viabilité cellulaire
  • Comme décrit ci-dessus en section 6.2.2, préalablement aux essais sur parasite, un test MTT est réalisé pour savoir si les extraits de PC et PM sont toxiques pour les cellules-hôtes HFF permettant la croissance de T.gondii. Autrement dit, le test MTT vise à démontrer l'absence d'effet important des extraits de PM et PC sur la viabilité des cellules-hôtes HFF.
  • Comme illustré en figure 3, les extraits de PM et PC entraînent une légère baisse de la viabilité des cellules-hôtes, mais pas d'effet cytotoxique (observations effectuées au microscope).
  • L'histogramme de la figure 3 représente en ordonnée le pourcentage de viabilité cellulaire Via_Cel (%) et en abscisse les différentes conditions de traitements aux EPS comme présenté précédemment.
    • 6.3.2. Résultats sur la croissance de T.gondii : activité anticoccidienne des exopolysaccharides
  • La figure 4 illustre l'effet antiparasitaire des EPS extraits des souches de microalgues PC ou PM à différentes concentrations. Il est d'abord constaté que la pyriméthamine (Pyr) a bien un effet antiparasitaire, puisque nous n'observons pas de croissance de T.gondii.
  • En ce qui concerne les extraits de PM et PC testés, les activités anticoccidiennes les plus importantes sont observées avec les concentrations les plus fortes en exopolysaccharides, avec des réductions significatives de la croissance parasitaire de 43% pour des extraits de PC à 200µg/mL d'EPS et 52% pour des extraits de PM à 200µg/mL d'EPS.
  • Un effet dose-réponse est à noter puisque l'activité des exopolysaccharides diminue quand leur concentration diminue. Toutefois, les prétraitements des parasites n'ont pas permis de bloquer totalement l'infection des cellules.
  • L'histogramme de la figure 4 représente en ordonnée le pourcentage de croissance parasitaire C_para (%) et en abscisse les différentes conditions de traitements aux EPS comme présenté précédemment.
    • 6.4 Discussion
  • L'invention qui vient d'être présentée constitue la première description d'activité antiparasitaire contre des parasites du système digestif humain pour les EPS microalgaux. Les résultats obtenus ouvrent des perspectives nouvelles de chimio-prévention pouvant faire envisager une place pour l'industrie microalgale au sein d'une stratégie pharmaceutique innovante. On note qu'il pourrait en outre être particulièrement intéressant de confirmer la cible protéique et valider l'efficacité et la tolérance des EPS microalgaux in vivo.
  • Les résultats qui viennent d'être décrits permettent de mettre en évidence une activité antiparasitaire des EPS de Porphyridium sp. Les produits, ou extraits comprenant des EPS obtenus à partir de PM et PC, présentent une activité anticoccidienne de l'ordre de 50%, avec un prétraitement des parasites pendant une heure. Il serait dont intéressant de tester plusieurs temps de prétraitement des parasites (par exemple 30min, 1h, 2h). L'augmentation du temps de prétraitement devrait augmenter ainsi l'activité des produits obtenus à partir de PM et PC.
  • Il s'agit aussi de la première étude d'activité d'un composé d'origine marine visant Toxoplasma gondii. Ces résultats confirment l'intérêt potentiel des polysaccharides sulfatés microalgaux, notamment des exopolysaccharides, à visée anti-infectieuse (« Bioactivity and Applications of sulphated polysaccharides from marine microalgae », Jesus de Raposo et al., Marine Drugs, 2013,).
  • Afin de valider que le mécanisme d'inhibition de l'activité parasitaire est lié à une activité « GAG mimétique » des EPS de Porphyridium cruentum et Porphyridium marinum, il serait intéressant de confirmer l'interaction des EPS avec une ou des molécule(s) d'adhésion du pathogène et d'exclure des faux positifs associés au solvant de purification.
  • Ainsi, un avantage de choisir des microalgues rouges est qu'elles sont d'ores et déjà reconnues comme sûres pour l'hôte (« Microalgae-based product for the food and feed sector : an outlook for Europe », Enzig et al., 2016), ce qui permet d'envisager une potentielle bonne tolérance de l'hôte.
  • Les activités anti-infectieuses des polysaccharides microalgaux testées jusqu'à maintenant se sont portées préférentiellement vers les virus (« Bioactivity and Applications of sulphated polysaccharides from marine microalgae », Jesus de Raposo et al.). Elles tiennent compte d'interactions in vitro entre la molécule et le virus, mais excluent le phénotype de la cellule hôte et/ou de la barrière tissulaire à traverser. En général, ces virus visent des ligands spécifiques dont les GAGs (« Glycosaminoglycans and infection », Park et al., Frontiers in bioscience, 2016), dont l'expression varie selon le tissu et explique les modes de transmission virale différents. Au contraire avec l'invention il est possible de prendre en compte le mode d'invasion du pathogène de l'étage moléculaire à tissulaire, et la sécurité de l'hôte.
  • Au vu des résultats obtenus , et en particulier des données sur la tolérance qui ont été confirmées à l'échelle cellulaire dans cette étude, Porphyridium cruentum paraît le candidat idéal pour son application rapide. Son statut hybride anti-infectieux à visée préventive risque de faire basculer son indication règlementaire vers le champ médical.
  • Par conséquent, ces résultats donnent l'opportunité idéale d'adapter la méthode pharmacologique aux futurs nutricaments ou médicaments microalgaux. L'invention pourrait s'intégrer avantageusement dans une stratégie thérapeutique anti-toxoplamique définie, comme par exemple la chimio-prévention. Cette stratégie ne détermine pas encore vers quel hôte elle sera la plus active. Le choix de destination vers le chat modèle animal hôte définitif permettrait de limiter la transmission à l'Homme, mais n'éliminerait pas les principales voies de contamination qui passent par les animaux non domestiques. La formulation vers l'Homme devra résoudre des questions de tolérance en raison de la fragilité des sujets exposés. Enfin, il pourrait aussi être intéressant de surveiller l'apparition de résistances en vue de la mise en application de cette nouvelle stratégie de chimioprévention (« Multidrug résistance : an emerging crisis », Tanwar et al., Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, 2014).
  • L'invention qui vient d'être décrite procure de nombreux avantages. Elle présente des résultats prometteurs pour le traitement et/ou la prévention d'infections parasitaires, ce qui permet d'envisager l'entrée de nouveaux composés bioactifs issus des polysaccharides marins (comme les EPS) sur le marché pharmaceutique.

Claims (4)

  1. Composition pour utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une infection parasitaire causée par un parasite appartenant au phylum Apicomplexa, ladite composition comprenant un extrait obtenu à partir d'une microalgue rouge appartenant à l'espèce Porphyridium sp, ledit extrait comprenant des exopolysaccharides obtenus à partir de ladite microalgue rouge.
  2. Composition pour utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite microalgue de l'espèce Porphyridium sp est choisie parmi : Porphyridium cruentum et Porphyridium marinum.
  3. Composition pour utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit extrait comprend entre 50 et 200 µg/mL d'exopolysaccharides extrait de Porphyridium cruentum ou Porphyridium marinum.
  4. Composition pour utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit parasite appartenant au phylum Apicomplexa est Toxoplasma gondii.
EP22215320.7A 2021-12-21 2022-12-21 Composition comprenant des exopolysaccharides extraits de porphyridium sp pour le traitement et/ou la prévention d'infections par les parasites du phylum apicomplexa Active EP4201485B1 (fr)

Applications Claiming Priority (1)

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