EP4188942A1 - Katalytisch aktive proteinschäume und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Katalytisch aktive proteinschäume und verfahren zu deren herstellung

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EP4188942A1
EP4188942A1 EP21736972.7A EP21736972A EP4188942A1 EP 4188942 A1 EP4188942 A1 EP 4188942A1 EP 21736972 A EP21736972 A EP 21736972A EP 4188942 A1 EP4188942 A1 EP 4188942A1
Authority
EP
European Patent Office
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catalytically active
connector
fused
foam
active protein
Prior art date
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Pending
Application number
EP21736972.7A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christof Niemeyer
Kersten Rabe
Maximilian Grösche
Patrick Bitterwolf
Laurenz Walkowsky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Original Assignee
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
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Filing date
Publication date
Application filed by Karlsruher Institut fuer Technologie KIT filed Critical Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
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    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
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    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
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    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01047—Glucose 1-dehydrogenase (1.1.1.47)
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    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
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    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01029—Diamine transaminase (2.6.1.29)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to catalytically active protein foams and processes for their production.
  • Biocatalysis refers to the conversion and acceleration or control of chemical reactions in which enzymes serve as biological catalysts. Enzymes consist entirely or mainly of one or more proteins and sometimes also of a cofactor.
  • Biocatalysis offers several advantages over classical chemical catalysis: First, the reactions are typically carried out in a milder temperature range (4 - 60 °C), resulting in lower energy requirements needed for the reactions. Enzyme reactions can be performed in an aqueous environment; in parallel, the use of enzymes in combination with organic solvents has increased in recent decades. Biocatalytic reactions in two-phase systems and in pure organic solvents allow for higher substrate loading, prevent hydrolysis of water-sensitive compounds, and shift the thermodynamic equilibrium of many reactions.
  • biocatalytic reactions do not have to be carried out under protective gas, while many homogeneous and heterogeneous catalysts are already oxidized and deactivated by air at room temperature (EMM Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878- 1894).
  • enzyme catalysis benefits from a high chemo-, regio- and stereoselectivity, which allows the production of complex and chiral molecules.
  • biocatalysis is used for a number of industrial processes, such as the production of valuable fine chemicals, optically active pharmaceuticals, crop protection products and fragrances or for the degradation of plastics. Since enzymes are less harmful to health and the environment than chemical catalysts, their use in the food and beverage industry is favored (EMM Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878-1894).
  • Biocatalysis offers the possibility to redesign entire synthetic routes for the production of important molecules, obtain them in higher yields and simplify their downstream processes.
  • the advantages of synthetic strategies based on one-pot organic transformations without the need to isolate intermediates are well known from numerous studies. Such processes are also referred to as "cascade" reactions (EM Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878-1894).
  • Protein technology allows enzymes to be optimized and adapted to industrial requirements by changing their amino acid sequence in terms of expression level, stability, catalytic activity and selectivity.
  • new variants of the P450 enzymes have been generated with desired activity, enabling a remarkable variety of chemical reactions, such as regiospecific oxyfunctionalization, C ⁇ C bond formation, cyclopropanation, and so on.
  • Lipases have also been subjected to protein engineering studies, leading to new catalysts for the kinetic resolution of chiral alcohols (EMM Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878-1894).
  • the enzyme immobilization is a comparatively old approach to making enzymes technically usable (N. Grubhofer et al., Naturwissenschaften 1953, 40, 508).
  • immobilized enzymes are widely used in production processes in the chemical and food industries, in diagnostics and biosensor technology, or in detergents, agricultural products and cosmetics.
  • Enzyme immobilization is generally defined as "physical delimitation or localization of enzymes in a limited space while maintaining the catalytic activity" (E. Katchalski-Katzir, Trends Biotechnol. 1993, 11, 471-478). associated with this, a higher productivity (space-time yield) is achieved and the amount of catalyst used can be reduced.
  • the stability to high temperatures, extreme pH values, mechanical shearing forces and organic solvents can be changed.At the same time, the separation of the enzymes from the reaction medium, thereby enabling the use of the enzymes in multiple reaction cycles.
  • the immobilization can be accompanied by an intrinsic stabilization of the enzymes, so that the storage stability and process lifetime are significantly improved compared to the free enzyme (RA Sheldon et al., Chem R possibly 2018, 118, 2, 801-838).
  • Conventional methods for fixing enzymes are based on the anchoring or crosslinking of the proteins by polyfunctional coupling reagents (“crosslinkers”), either directly in the channel structure or on porous carrier materials (polymers, particles).
  • crosslinkers polyfunctional coupling reagents
  • Carrier-free, insoluble agglomerates (immobilizates) of enzymes are formed by direct or via spacer-mediated covalent cross-linking of the individual protein molecules (U. Rössl et al., Biotechnol. Lett. 2010, 32, 341-350), using bifunctional reagents that react with the reactive functions of the amino acid side chains on the enzyme surface in the case of covalent carrier binding, the e-amino functions of the lysine residues primarily serve as reactants.
  • Dialdehydes e.g. glutardialdehyde, dextrandialdehyde
  • diisocyanates e.g. hexamethyldiisocyanate
  • diisothiocyanates e.g.
  • p-phenylenediisothiocyanate are suitable as crosslinking agents.
  • Cross-linked enzyme crystals (CLEC) and cross-linked enzyme agglomerates (CLEA) have gained particular importance in application technology.
  • CLECs exhibit a solid microporous structure with uniform channels running through the crystal. The particle diameter can be flexibly adjusted between 1 - 100 gm via the ratio of enzyme and cross-linking reagent or via the incubation time.
  • CLEAs takes advantage of the spontaneous agglomeration and precipitation of proteins in the presence of various organic solvents, electrolytes, nonionic polymers, and acids, and occurs with preservation of the three-dimensional structure, ie, without denaturation.
  • the resulting aggregates are crosslinked to form particles of gel-like consistency with a diameter of 5-50 ⁇ m.
  • Hydrogels are porous polymers made from natural or synthetic structural proteins and are being explored within biomedicine for cell encapsulation and tissue engineering (J. H. Lee, J. Tissue Eng. 2018, 9, 1-4).
  • a recently introduced strategy for protein gelation uses a pair of genetically encoded reactive partners, SpyTag and SpyCatcher, which spontaneously form a covalent isopeptide bond under physiological conditions (SC Reddington et al., Current Opinion in Chemical Biology 2015, 29, 94- 99; EP2534484B1).
  • Peschke et al. describe a method for producing self-assembling enzyme hydrogels in which enzymes are genetically fused to a SpyTag or SpyCatcher domain. These enzymes fused with connectors in this way self-crosslink in situ and form monolithic (polymerized in one piece) "all-enzyme hydrogels".
  • the crosslinked polymers so produced typically have pore sizes of ⁇ 200 nm and show a higher catalytic activity than those previously mentioned CLEA's.
  • WO9820100A1 describes uncrosslinked enzyme formulations in detergents which are then foamed. In these, however, extremely low enzyme concentrations in the range of 0.0001 - 0.005% are used.
  • US4195127A the production of enzyme-containing polyurethane-based biohybrid foams and in Brun et al. the production of mesoporous silica-based Described biohybrid foams on which enzymes are subsequently immobilized (N. Brun et al., Chem. Mater. 2010, 22, 16, 4555-4562).
  • Foams can be produced, for example, by passing gas through a membrane (J. Dittmann et al., Journal of Colloid and Interface Science 2016, 467, 148-157) or by shaking a container containing a surfactant-added liquid ( A. Maestro et al., Soft Matter 2014, 10, 36, 6975-6983).
  • the microfluidic generation of foams is based on the generation of individual compartments in two-phase systems due to shearing from one phase to the other.
  • the two phases are immiscible.
  • This technology is known as droplet microfluidics (S. Mashagi et al., Trends in Analytical Chemistry 2016, 82, 118-125).
  • the literature distinguishes between drops (liquid-liquid systems) and bubbles (liquid-air systems), whereby the generation of bubbles can be analogous to the generation of drops in different geometries (SL Anna, Annu. Rev. Fluid. Mech. 2016 , 48, 285-309).
  • the most established methods are the T-junction and the flow-focused junction (T. Fu et al., Chemical Engineering Science 2015, 135, 343-372).
  • the bubble systems are further differentiated according to whether the gas phase is used as a continuous phase (P. Tirandazi et al., Journal of Micromechanics and Microengineering 2017, 27, 075020) or as a disperse phase (S. Andrieux et al., Langmuir 2018, 34 , 1581-1590). These bubble systems differ in terms of the flow regime and the Bubble stabilization systems.
  • the bubbles generated in this way have bubble sizes in the range of 10 gm to 1000 gm and fuse in a self-assembly process into higher-order lattice structures, which can then be changed in a controlled manner via the flow parameters. Depending on the external geometry parameters of the structure, these lattices are formed into dynamically assembled foams (P. Garstecki, Applied Physics Letters 2004, 85, 13, 2649-2651).
  • Protein foams are an essential part of the food industry and are widely used for uniformly inserting fine air cells for texturing food.
  • catalytically inactive mixtures of structural proteins such as egg white, gelatin, soybean or whey proteins are used to generate foam.
  • Phase 1 The proteins diffuse to the air/water interface, are locally concentrated and thus reduce the surface tension.
  • Phase 2 The proteins adsorbed at the interface partially unfold with alignment of their hydrophilic, polar parts to the aqueous phase and their hydrophobic parts to the non-aqueous phase.
  • Phase 3 In addition, the proteins interact with each other at the interface and form a film that can lead to further partial unfolding and coagulation. Proteins quickly adsorb to the interface via the three phases mentioned and form a stabilizing film around individual bubbles. This promotes foam formation.
  • foams Due to the denaturation of proteins at the interfaces, however, foams generally have a destabilizing effect in connection with catalytically active proteins and deactivate them to a considerable extent (JR Clarkson et al., Journal of Colloid and Interface Science 1999, 215, 2, 333-338; Z. Liu et al., Bioseparation 1998, 7, 3, 167-174).
  • Continuous-flow biocatalysis is an emerging area of industrial biotechnology that uses enzymes immobilized in flow channels for the production of value-added chemicals.
  • Biocatalytic flow processes are difficult to realize because the heterogeneous catalytic system requires effective surface immobilization techniques, which are more challenging for enzymes than for conventional organo(metallic) catalysts.
  • Catalytically active protein foams made from coupling together catalytically active proteins have not been described.
  • catalytically active protein foams as a carrier-free material for flow biocatalysis is also not known to date.
  • the present invention is therefore based on the object of providing catalytically active protein foams and a process for their production, in which the protein denaturation during foam formation should be as low as possible, while the volume-specific enzyme loading and the stability of the protein foams should be as high as possible.
  • the invention aims to produce catalytically active protein foams consisting essentially solely of catalytically active proteins coupled together or of composite materials including the catalytically active proteins coupled together.
  • the proteins are an essential part of the material itself, so they are not subsequently applied to foamed materials such as polymers.
  • protein foam and “protein foams” are used as synonyms and are defined as gaseous bubbles enclosed by liquid or solid protein thin films.
  • the method according to the invention comprises the following steps:
  • step B production of bubbles containing catalytically active proteins in a bubble generator using a gas phase and a solution of the catalytically active proteins fused to the connector (7) and the catalytically active proteins fused to the connector (8) from step A);
  • step D) Coupling of the catalytically active proteins contained in the bubbles from step B) in the reaction chamber (5) to form a catalytically active protein foam (10).
  • a feature of the catalytically active protein foam (10) is that the individual molecules of the catalytically active proteins (6) are coupled to one another via connectors (7) and (8) which are complementary to one another.
  • "Coupled to one another” means for the method according to the invention that the connectors (7) and (8) enter into a covalent or non-covalent bond.
  • Non-covalent bonds in the method according to the invention are, for example, hydrogen bonds or ionic bonds, but also hydrophobic interactions and Van -der-Waals forces.
  • the connectors (7) and (8) means that they are specific react with each other so that a specific bond is formed between the catalytically active proteins.
  • the bond is a covalent bond, in another embodiment it is a non-covalent bond.
  • complementarity is that the Ne of a lysine residue of the SpyCatcher domain is specifically linked to the C a of a (complementary)
  • the catalytically active proteins fused to a connector (7) and the catalytically active proteins fused to the connector (7) complementary to connector (8) are heterologously expressed in step A) and the connectors are a genetically fused part the proteins.
  • the heterologous expression of the catalytically active proteins fused to the connectors (7) or (8) bacterial cells are transformed with the appropriate expression vector.
  • the connectors are genetically-fused peptide tags that are covalent
  • the catalytically active protein (6) is genetically fused to a SpyTag or SpyCatcher domain.
  • the reaction of the SpyTag with the SpyCatcher leads to a defined covalent bond between the catalytic active proteins.
  • genetically fused, non-covalent, peptide or protein-based binding systems are used to link the catalytically active proteins (6), such as the RIDD/RIAD system (W. Rang et al., Nat. Commun. 2019, 10, 4248), self-assembling amphipathic peptides (VS. Zhao et al., Microb Cell Fact. 2019, 18, 91), leucine zipper systems (JR Moll et al ., Protein Sci. 2001, 10, 3, 649-655, ) or elastin-like peptides (elastln-lke peptides (ELPs)) and collagen-like peptides (collagen-like peptides (CLPs)) ( ⁇ . W. Urry et al Biopolymers 1985 24 12 2345-2356 Luo T et al J Am Chem Soc 2015 137 49 15362-15365j.
  • the catalytically active proteins (6) such as the RIDD/RIAD system (W. Rang et al
  • a specific embodiment is represented by the protein/protein interaction domains PDZ (PSD95 discs large_Z01), GBD (GTPase binding domain), SH3 (Src homology 3) and their corresponding ligands (J. Dueber et al., Nat. Biotechnol. 2009, 27, 753-759).
  • so-called single-domain antibodies and their corresponding antigens are used (R.H.J. van der Linden et al., Biochimica et Biophysica Acta 1999, 1431, 37-46).
  • so-called macrocyclic host-guest interactions are used to link the catalytically active proteins (6).
  • One embodiment is the use of an FGG (phenylalanine-glycine-glycine) peptide motif fused to the catalytically active proteins and the use of cucurbit[8]uril (DH Nguyen et al., Angew Chem Int Edit. 2010, 49, 5, 895- 898).
  • FGG phenylalanine-glycine-glycine
  • catalytically active proteins (6) are heterologously expressed in step A), wherein for the heterologous expression bacterial cells with the corresponding expression vector are transformed.
  • the connectors (7) or (8) are subsequently chemically bonded to the catalytically active proteins (6).
  • the connectors are heterobifunctional or homobifunctional crosslinkers for covalently linking the catalytically active proteins (6), such as sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate, dimethyl adipimidate or dialdehydes such as 1,5-pentanedial.
  • Crosslinkers with two identical reactive groups are referred to as homobifunctional crosslinkers, and those with two different groups as heterobifunctional crosslinkers.
  • the catalytically active protein (6) is an enzyme, such as a stereoselective enzyme, and/or an enzyme selected from the group of oxidoreductases (EC 1.-.-.-), transferases (EC 2. -.-.-), hydrolases (EC 3.-.-.-), lyases (EC 4.-.-.-), isomerases (EC 5.-.-.-), ligases (EC 6.-.-. -.-) and translocases (EC 7.-.-.-).
  • the Enzyme Commission number (EC number) is a numerical classification scheme for enzymes based on the chemical reactions they catalyze, (https://www.enzyme-database.org/).
  • Examples of enzymes used in the process according to the invention are Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydrogenase (BsGDH), Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp. (S)-imine reductase (GF3546), Halomonas elongata amine transaminase (HEWT).
  • LbADH Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase
  • BsGDH Bacillus subtilis glucose 1-dehydrogenase
  • EsPAD Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase
  • the catalytically active protein foams (10) comprise a catalytically active protein (6) or several catalytically active proteins (6) with different reaction specificities.
  • the catalytically active protein (6) fused to the connector (7) is identical to the catalytically active protein (6) fused to the connector (8).
  • mono-enzyme foam means that the catalytically active protein foam (10) contains only one catalytically active protein (6).
  • step D) different catalytically active proteins (6) are linked to one another via the connectors (7) and (8) by linking a catalytically active protein (6) to the connector ( 7) is fused and a different catalytically active protein (6) is fused to the connector (8) which is complementary to the connector (7) (method a).
  • bi-enzyme foam means that the catalytically active protein foam (10) contains two different catalytically active proteins (6).
  • multi-enzyme foam means that the catalytically active protein foam (10) contains at least three different catalytically active proteins (6).
  • orthogonal connector pairs means that a first connector pair, comprising the associated connectors (7) and (8), couples specifically to one another and that at least a second connector pair, comprising the respectively associated connectors (7) and ( 8), also specifically coupled with each other, without a Cross-coupling of the first and at least the second connector pair takes place.
  • Brune et al. describe, for example, two orthogonal connector pairs SpyTag/SpyCatcher and SnoopTag/SnoopCatcher that are used to create synthetic nanoparticles with different antigens.
  • the SpyCatcher domain forms an isopeptide bond with the SpyTag domain through spontaneous amidation
  • the SnoopCatcher domain forms an isopeptide bond with the SnoopTag domain through transamidation
  • a catalytically active protein (6) is coupled to one another via a first connector pair, comprising the associated connectors (7) and (8), and a second catalytically active protein (6 ) via a second to the first connector pair orthogonal connector pair, comprising the respective associated connectors (7) and (8), coupled together (method b).
  • a first catalytically active protein (6) is coupled to one another via a first connector pair, comprising the associated connectors (7) and (8), a second catalytically active protein (6) via a second connector pair orthogonal to the first connector pair, comprising the respectively associated connectors (7) and (8), coupled to one another and a third catalytically active protein (6) via a third pair of connectors orthogonal to the first and second pair of connectors, comprising the respectively associated connectors (7) and (8) coupled to one another.
  • correspondingly further orthogonal connector pairs are used according to
  • the method according to the invention comprises the production of bubbles containing catalytically active proteins.
  • these bubbles are produced in a fluidic device.
  • the fluidic device includes a bubble generator.
  • Various materials such as metals, glass or polymers, are used to manufacture the bubble generator in the method according to the invention.
  • Polydimethylsiloxane and polymethyl methacrylate are preferably used for the production of the bubble generator.
  • the structures In order to use the structures as fluidic units, the structures must be sealed.
  • the structure is either bonded to a glass slide or to polydimethylsiloxane by thermal plasma oxidation. Alternatively, an adhesive film (eg made of polyolefin) is used for sealing.
  • the first element of the bubble generator (Figure 1) is a continuous phase inlet (1) which splits into two mirror-symmetrical paths. These meet an inlet channel for a disperse phase (2) from both sides at a 45° angle.
  • the latter corresponds to the gas that makes up the bubbles.
  • the channel cross section can have any desired profile.
  • the channel of the disperse phase intersects the channel cross-section of the continuous phase in its mirror axis and thus generates the functional element of the flux-focusing intersection (3). Both phases meet at the junction (3), where the gas phase is separated into individual bubbles by the continuous phase.
  • the bubbles generated at the intersection flow out of the structure via the outlet channel (4) into a reaction chamber (5) ( Figure 2).
  • the reaction chamber consists of an elongated rectangular channel that tapers towards the ends to provide contact for flow actuation.
  • phase that envelops the bubble is the continuous phase
  • the phase that makes up the bubble is the disperse phase. All combinations of gas and liquid that are difficult to mix with one another can be used as phases for the generation of bubbles.
  • gas phase preferably an inert gas
  • nitrogen is used as the gas phase.
  • a solution of catalytically active proteins fused with connectors is used as the continuous phase in the method according to the invention.
  • the solution of the catalytically active proteins fused to connectors is one aqueous solution of the catalytically active proteins fused with connectors.
  • the aqueous solution optionally includes buffer systems such as citrate, acetate or phosphate buffer systems.
  • an aqueous solution is a solution in which H2O is used as the solvent to make up >99.9 percent by volume of the solvent.
  • the solution of the catalytically active proteins fused with connectors also includes solvent mixtures of H2O and organic solvents, such as acetonitrile, ethanol, methanol, dimethyl sulfoxide, isopropanol.
  • the volume fraction of the organic solvent in the solvent mixture can be 0.1-99.9 percent by volume.
  • the solution of catalytically active proteins fused with connectors, which contains such solvent mixtures of H2O and organic solvents optionally includes buffer systems such as, for example, citrate, acetate or phosphate buffer systems.
  • organic solvents for example acetonitrile, ethanol, methanol, dimethyl sulfoxide, isopropanol, which have a water content of less than 0.1 percent by volume are used for dissolving the catalytically active proteins fused with connectors.
  • non-classical solvents such as, for example, ionic liquids, low-melting eutectic solvents or supercritical CO2 can be used for dissolving the catalytically active proteins fused to connectors.
  • the concentration of the solution of catalytically active proteins fused to connectors is between 1 mM and 100 mM, depending on the desired polymerization time.
  • a solution is preferably catalytically active, proteins fused to connectors at a concentration of 1 mM.
  • the protein solutions of the complementary binding partners are mixed with one another in a stoichiometric ratio, incubated and connected to the bubble generator.
  • the bubble generator is first flooded with N2 gas and constantly flushed with N2 gas.
  • the solution of catalytically active proteins fused with connectors is then admitted into the microfluidic unit at a constant flow rate and foamed at the crossing nozzle using the N2 gas.
  • the foamed material is collected at the outlet and transferred directly into a reaction chamber (5) (FIG. 2).
  • the bubbles are stabilized by the proteins used in the method according to the invention, which prevents the bubbles from coalescing for a short time.
  • additives in small amounts of 10-100 pmol/l are added to the solution of catalytically active proteins fused with connectors.
  • additives are additives which have a positive effect on the production of the bubbles in step B) and the formation of the catalytically active foam (10) in step D).
  • the bubbles in step B) are stabilized over the longer term by adding additives.
  • additives in the process according to the invention are surfactants, preferably biocompatible surfactants, such as saponins, lauryl sulfobetaines, rhamnolipids, Tween 20 and Triton X100.
  • the velocities of the continuous and disperse phases are controlled via a pressure gradient Dr.
  • the diameter, the pore sizes and the generation frequency of the bubbles can be precisely adjusted via the geometry of the channels, the pressure gradient used and the type of continuous phase.
  • the bubbles are produced with the process according to the invention with a diameter of 5-1500 gm and a pore size of 10-2000 gm. In a specific embodiment, bubbles with a diameter of 200-300 ⁇ m are generated.
  • the pore sizes of the bubbles generated in this way are 50-1200 ⁇ m, preferably 250-310 ⁇ m.
  • bubbles are generated with a diameter of 15-200 ⁇ m, preferably 30-80 ⁇ m.
  • the pore size of the bubbles is then 15 to 250 ⁇ m, preferably 30 to 100 ⁇ m.
  • reaction chamber (5) consists of polydimethylsiloxane or polymethyl methacrylate.
  • the catalytically active proteins are coupled to form one via the complementary connectors (7) and (8) used in the method according to the invention catalytically active protein foam (10) instead.
  • the thin protein film crosslinked in this way on the bubbles of the catalytically active protein foam (10) has a layer thickness of 0.1-200 gm in the process according to the invention. In a specific embodiment, the layer thickness of the crosslinked thin protein film on the bubbles is 1-60 gm.
  • the protein foam is dried in a further step E) after the crosslinking reaction has ended in the reaction chamber (5) in step D).
  • the layer thickness of the cross-linked thin protein films on the bubbles can be precisely adjusted to 1-50 gm through the drying process. Further advantages of drying the catalytically active protein foam (10) are increased mechanical stability, better shelf life, higher long-term stability against degeneration processes of the catalytically active proteins contained in the protein foam and a monodisperse distribution of the pores and thus a more reproducible end product.
  • this drying step E) takes place with the reaction chamber (5) open at room temperature.
  • the drying takes place with the reaction chamber (5) open at room temperature with continuous air convection in order to support the drying process.
  • the drying time with the reaction chamber (5) open is 30 minutes to 28 days in the process according to the invention. A drying time of at least 2 hours is preferred. A drying time of 2-28 days is particularly preferred in order to increase the stability and activity of the catalytically active protein foam (10) (FIG. 12).
  • Another drying embodiment is to dry the protein foam at 30°C in a continuous air convection incubator.
  • the drying time is here 30 minutes - 28 days.
  • the drying time in the incubator is 30 min - 60 min.
  • the reaction chamber (5) serves as a flow bioreactor in that at least one substrate (11) is converted into at least one product (12) with the catalytically active protein foam (10) dried in step E) ( Figure 3). .
  • the at least one substrate (11) is passed through the reaction chamber (5) as a stream of liquid at a specific flow rate.
  • the at least one product (12) formed in the reaction chamber (5) is in the outlet stream of the reaction chamber (5) and is collected at the outlet of the reaction chamber (5).
  • the catalytically active protein foams (10) are made from catalytically active proteins and composite materials, with the proteins making up more than 5% (w/w) of the dry material.
  • composite materials are materials that consist of two or more components with significantly different physical or chemical properties. Combined, these constituents result in a material with properties distinct from the individual components, while each component remains separate and distinguishable within the final structure (https://www.twi-global.com/technical-knowledge/faqs/what -is-a-composite-material ). Examples of such composite materials are DNA-silica nanocomposite materials (Y. Hu et al., Angew. Chem. Int. Ed.
  • DNA-SiNP composite materials are used as composite materials, the mechanical properties of which can be adjusted by incorporating carbon nanotubes (CNT) and thus consist of different proportions of DNA, SiNP and CNT (Y. Hu et al., Nat. Commun. 2019 , 10, 5522).
  • hybrid materials are produced from the catalytically active proteins and DNA-SiNP composite materials or DNA-SiNP-CNT composite materials with varying proportions of silica nanoparticles from 0-100% and carbon nanotubes from 0-100%.
  • chlorohexyl-modified nucleic acids are incorporated into the DNA polymer by a polymerase reaction and bonded via a self-ligating protein, e.g. the so-called HOB protein (halo-based oligonucleotide binder protein) (KJ Koßmann et al., Chembiochem. 2016, 17, 12, 1102-1106) associated with the protein material.
  • HOB protein halo-based oligonucleotide binder protein
  • the catalytically active proteins (6) are genetically fused both with the connectors (7) and (8) and with the HOB protein in step A) of the method according to the invention.
  • the catalytically active proteins (6) can be coupled to one another both via the complementary connectors (7) and (8) and simultaneously via the HOB protein, for example to a DNA-SiNP composite material.
  • the foaming of the catalytically active proteins has the surprising effect that the catalytically active proteins which are coupled to one another do not denature during the foaming, as is usually the case for enzymes when subjected to mechanical stresses caused by shear forces is observed.
  • the connectors (7) and (8) used also lead to a stable connection of the proteins in the form of a foam in which the bubbles no longer coalesce.
  • sensitive proteins such as the enzyme Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P) can also be used in the protein foam (10) according to the invention, although this enzyme quickly unfolds and its activity increases even in a homogeneous solution when stirred vigorously loses.
  • catalytically active proteins (6) such as Enterobacter sp.
  • EsPAD phenacrylate decarboxylase
  • LbADH Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase
  • BsGDH Bacillus subtilis glucose 1-dehydrogenase
  • S Streptomnyces sp.
  • S Streptomnyces sp.
  • S Streptomnyces sp.
  • S Streptomnyces sp.
  • S Streptomnyces sp.
  • HWT Halomonas elongata amine transaminase
  • the catalytically active protein foams (10) obtained using the process according to the invention show an unexpected aging effect, which increases the catalytic activity of these foams.
  • the bubbles initially line up next to each other and form several layers of bubbles (9), but over time the protein foams “harden”, in which the proteins cross-link in a defined manner via connectors at the molecular level.
  • their mechanical strength is also increased.
  • the protein foams (10) produced by the process according to the invention have a much larger surface, which is advantageous for use as immobilized catalysts, for example.
  • FIG. 1 shows the schematic representation of a bubble generator for the production of bubbles containing catalytically active proteins (6).
  • the solution of catalytically active proteins fused with connectors (continuous phase) is introduced into the system via the inlet (1), and a gas as the disperse phase is introduced via the inlet (2). Both phases meet at the junction (3), where the gas phase is separated into individual bubbles by the continuous phase.
  • a reaction chamber (5) (FIG. 2).
  • FIG. 2 shows the schematic representation of the reaction chamber (5) for flow-catalytic processing of the protein foam.
  • FIG. 2a) shows an isometric view of the reaction chamber.
  • FIG. 2b) shows the side view and
  • FIG. 2c) the top view of the structure.
  • the protein foam is in the 1 mm high, 3 mm wide and 54 mm long Reaction chamber in the dried state in a tightly packed packing of spheres.
  • FIG. 3 schematically shows the entire process of producing a catalytically active protein foam (10): First, catalytically active proteins (6) connected to a connector (7) or a connector (8) are introduced as a solution into the bubble generator (FIG. 1). The bubbles generated in the bubble generator are transferred to the reaction chamber (5) via the outlet channel (4). The individual bubbles are shown schematically in the reaction chamber (5), which are separated by a liquid phase which contains the catalytically active proteins fused to the connectors (7) or (8). Individual molecules of the catalytically active proteins are coupled to one another via the mutually complementary connectors (7) and (8). The bubbles initially arrange themselves side by side and form several layers of bubbles (9). In the resulting protein foam (10), proteins combine through the connectors (7) and (8) in a "maturation", ie properties such as mechanical strength change over time. With the resulting material, for example, a substrate (11) can be converted into a product (12).
  • a substrate (11) can be converted into a product (12).
  • FIG. 4 shows high-speed recordings of the reproducible generation of monodisperse bubbles, which were produced using the bubble generator from FIG. 1, and their spatial arrangement in the outlet channel (4) as a function of the pressures applied.
  • the pressure of the disperse phase corresponds to a) 80 mbar, b) 90 mbar, c) 100 mbar, d) 110 mbar, e) 130 mbar, f) 140 mbar, g) 150 mbar.
  • FIG. 5 documents the time-dependent crosslinking of the protein foam using transmitted light microscopy.
  • monodisperse foam cells can be seen, which partially coalesce over a period of 2 hours at room temperature with constant evaporation of the aqueous portion and form a stable matrix.
  • FIG. 5a) shows the protein foam in the reactor chamber after 12 minutes. The bubbles arrange themselves as hexagonal close-packed Kepler FCC (face centered cubic) spheres.
  • FIG. 5b) shows an intermediate drying step after 60 minutes. After drying and thus reduction of the liquid fraction, the packing of spheres changes after about 2 hours into an arrangement that resembles a Kelvin BCC (body-centered cubic) packing (FIG. 5c)).
  • FIG. 6 shows a fluorescence micrograph of the interfaces of the dried protein display matrix.
  • the proteins were mixed with a fluorescent dye (fluorescein-5-isothiocyanate) in order to visualize the interfaces consisting of crosslinked catalytically active proteins.
  • a fluorescent dye fluorescein-5-isothiocyanate
  • FIG. 7 shows a photograph of the catalytically active protein foam (10) with a confocal laser scanning microscope.
  • intact thin films have formed on the top layer of the protein foams. Dark areas show the lamellae between the bubbles, light areas the outside of the bubbles covered with a cross-linked protein thin film (Figure 7a)).
  • Figure 7b) shows a detail of a bubble where this thin film is perforated due to external forces.
  • FIG. 7c) shows a closed, intact thin film.
  • Figure 8 illustrates the reactor performance of various catalytically active protein foam systems. This was the tested the catalytic productivity of the catalytically active protein foams (10) using the example of enzyme foams (13) under flow conditions in a microreactor and with already published monolithic enzyme materials (14) ("all-enzyme hydrogels", see T. Peschke et al., Angew. Chem . Int. Ed.
  • the tested catalytically active proteins are selected from Enterobacter sp.phenacrylate decarboxylase (EsPAD) , Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydrogenase (BsGDH), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent al coli dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp . (S)-imine reductase (GF3546), Halomonas elongata amine transaminase (HEWT).
  • EsPAD Enterobacter sp.phenacrylate decarboxylase
  • LbADH Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase
  • BsGDH Bacillus subtilis glucose 1-dehydrogenase
  • Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent al coli dehydrogenase Gre2P
  • FIG. 9 shows the stability of the catalytically active protein foam (10) based on the relative foam height in a cuvette with and without the addition of additives over a period of >84 h. 35.4 mM saponin was used as an additive.
  • FIG. 10 shows the catalytic conversion of the catalytically active protein foam (10) after 48 hours.
  • the protein foams (10) stabilized by surfactants show a 20% higher catalytic conversion than the non-stabilized protein foams (10).
  • FIG. 11 shows examples of the production of the catalytically active protein foams (10), which consist of the enzymes LbADH/BsGDH, which react with the non-covalent protein/protein Interaction domains SH3, PDZ and GBD and their corresponding ligands are genetically fused.
  • the time-dependent crosslinking of the protein foam is documented using transmitted light microscopy. At the beginning, monodisperse wet, i.e. not dried, foam cells can be seen (top row of images), which are dried over a period of 30 minutes at 30 °C in an incubator with constant air convection and form a stable, uniformly cross-linked matrix (bottom row of images).
  • the catalytically active protein foams of the method according to the invention can be used in the field of biotechnology, biocatalysis and microfluidics.
  • the protein foams are particularly suitable as carrier-free, immobilized material for flow biocatalysis, for example in flow bioreactors for continuous production processes.
  • the bubble generator used in the process according to the invention has an inlet for the first element continuous phase (1), which splits into two mirror-symmetrical paths. These hit the disperse phase inlet channel (2) from both sides at a 45° angle.
  • the channel cross section is 400 ⁇ m ⁇ 100 ⁇ m over a length of 31.77 mm and tapers short before the two channels come together over a length of 3.59 mm to a cross section of 100 ⁇ m ⁇ 100 ⁇ m.
  • the channel of the disperse phase intersects the channel cross-section of the continuous phase in its mirror axis and thus generates the functional element of the flux-focusing intersection (3).
  • the intersection has a cross section of 100 pm x 100 pm and a length of 31.828 mm.
  • the fourth channel represents the outlet channel (4) for the bubbles generated at the intersection. In the example shown here, it has the dimensions 350 pm x 200 pm x 20.23 mm (WxHxL).
  • the vertical inlet and outlet channels have a diameter of 800 pm.
  • the inlets and outlets of the bubble generator are connected via special pCTW (pchip-to-world) connectors. The seals between chip and interface are ensured by O-rings made of NBR 70.
  • the pCTW connector has connections for standardized fittings and hoses, which in turn are connected to the precision pressure regulators.
  • the phases used for bubble generation were nitrogen as the gas phase and an aqueous solution of catalytically active proteins fused to the connectors (7) and (8) as the continuous phase.
  • the concentration of the protein solution was between 1 pM and 100 mM depending on the desired polymerization time. A protein solution concentration of 1 mM proved to be well suited.
  • the catalytically active protein foam was produced using the bubble generator described in Example 1 and FIG.
  • an aqueous solution of catalytically active proteins fused to connectors (7) and an aqueous solution of catalytically active proteins fused to complementary connectors (8) were mixed together in a stoichiometric ratio and incubated for 30 minutes at room temperature.
  • the solution was then connected to the bubble generator.
  • the bubble generator was first flooded with N2 gas and constantly flowed through.
  • the protein solution was then introduced into the microfluidic unit at a constant flow rate and foamed at the intersection nozzle (intersection (3)) using the N2 gas.
  • the foamed material was collected at the outlet and 100 pL transferred directly to a prepared polydimethylsiloxane reaction chamber (5).
  • SpyCatcher or SpyTag selected from Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro-genase (BsGDH), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomyces sp. (S)-imine reductase (GF3546) and Halomonas elongata amine transaminase (HEWT), E.
  • EsPAD Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase
  • LbADH Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase
  • BsGDH Bacillus subtilis glucose 1-dehydro-genase
  • Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase Gre2P
  • E. coli BL21 (DE3) was transformed with the corresponding expression vector using heat shock transformation.
  • the freshly transformed E. coli cells carrying the protein-encoding plasmids were selected overnight on LB agar plates with 100 pg/ml ampicillin at 37°C.
  • Liquid cultures of 160 ml of ampicillin-supplemented LB medium were prepared from clones of the LB agar plates and cultured overnight for 14-18 hours at 37°C and 180 rpm in a 500 ml shake flask. 2 L of LB medium containing ampicillin was inoculated 1:20 with an overnight culture. Cultures were grown at 37°C, 180 rpm to an OD600 of 0.6.
  • the cell lysate was obtained after centrifugation (45000xg, 1 h), filtered through a 0.45 ⁇ m Durapore PVDF membrane (Steriflip, Millipore) and transferred to two HisTrap FF (5 ml) Ni-NTA- Columns (GE Healthcare, Germany) mounted on an ⁇ kta Pure liquid chromatography system (GE Healthcare, Germany).
  • the column was washed with 100 ml Buffer A and the 6xHis-tagged proteins were overlaid with a gradient from 100% Buffer A to 100% Buffer B (50mM NaH2PC>4, 300mM NaCl, 500mM Imidazole, pH 8.0). a volume of 200 ml eluted.
  • the buffer was then exchanged with Vivaspin 10000 MWCO (GE Healthcare) for a suitable storage buffer.
  • Genetic constructions were performed with isothermal recombination (DG Gibson et al., Nat Methods. 2009, 6, 5, 343-345) using oligonucleotide primers with 30 bp (base pairs) of homologous overlap.
  • the Reaction mixtures were treated with the restriction enzyme DpnI to remove any remaining vectors from previous PCR reactions and then transformed into E. coli DH5 cells. All plasmids were purified with ZR Plasmid Miniprep-Classic (Zymo Research, Germany) according to the manufacturer's instructions and the sequence verified by commercial sequencing (LGC genomics, Germany).
  • Table 1 DNA sequences for the heterologous expression of catalytically active proteins fused with SpyCatcher or SpyTag or with the non-covalent protein/protein interaction domains SH3, PDZ and GBD and their corresponding ligands
  • SC SpyCatcher domain
  • ST or ST2 SpyTag -Domains
  • SH3, PDZ or GBD-BD SH3, PDZ or GBD binding domain
  • SH3, PDZ or GBD-L SH3, PDZ or GBD ligand.
  • WO 2022/022850 PCT/EP2021/025233
  • Example 4 monodisperse bubbles were produced using the bubble generator from Figure 1 while varying the pressure of the disperse phase (( Figure 4).
  • the pressure of the disperse phase corresponded to a) 80 mbar, b) 90 mbar, c) 100 mbar, d) 110 mbar, e) 130 mbar, f) 140 mbar, g) 150 mbar. From a pressure of about 110 mbar began
  • Example 5 the time-dependent crosslinking of the protein foam was demonstrated using transmitted light microscopy.
  • monodisperse foam cells could be seen in the reaction chamber (5), which partially coalesced over a period of 2 hours at room temperature with constant evaporation of the aqueous component and formed a stable matrix.
  • the bubbles arranged themselves as hexagonal close-packed Kepler FCC (face centered cubic) spheres (FIG. 5a).
  • FIG. 5b After an intermediate drying step after 60 minutes (FIG. 5b), after 120 min the packing of spheres changed into an arrangement which resembled a Kelvin BCC (body-centered cubic) packing (FIG. 5c).
  • Enzyme systems GF3546/BsGDH was converted to 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline with regeneration of the cofactor NADPH 3,4-dihydroisoquinoline at a concentration of 5 mM (P. Bitterwolf P. et al., Micromachines 2019, 10, 11, 783 ).
  • HEWT 4-nitrobenzaldehyde was converted to 4-nitrobenzylamine at a concentration of 1 mM.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft katalytisch aktive Proteinschäume und Verfahren zu deren Herstellung mittels der Kupplung von mit Konnektoren fusionierten katalytisch aktiven Proteinen sowie die Verwendung katalytisch aktiver Proteinschäume in der Biokatalyse und Mikrofluidik.

Description

Beschreibung
„Katalytisch aktive Proteinschäume und Verfahren zu deren Herstellung"
Die vorliegende Erfindung betrifft katalytisch aktive Proteinschäume und Verfahren zu deren Herstellung.
Als Biokatalyse wird eine Umsetzung und Beschleunigung oder Steuerung chemischer Reaktionen bezeichnet, in der Enzyme als biologische Katalysatoren dienen. Enzyme bestehen vollständig oder überwiegend aus einem oder mehreren Proteinen und teilweise auch aus einem Co-Faktor.
Die Biokatalyse bietet gegenüber der klassischen chemischen Katalyse mehrere Vorteile: Erstens werden die Reaktionen typischerweise in einem milderen Temperaturbereich (4 - 60 °C) durchgeführt, was zu einem geringeren für die Reaktionen benötigten Energiebedarf führt. Enzymreaktionen können in einer wässrigen Umgebung durchgeführt werden; parallel dazu hat die Verwendung von Enzymen in Kombination mit organischen Lösungsmitteln in den letzten Jahrzehnten zugenommen. Biokatalytische Reaktionen in zweiphasigen Systemen und in reinen organischen Lösungsmitteln ermöglichen eine höhere Substratbeladung, verhindern die Hydrolyse von wasserempfindlichen Verbindungen und verschieben das thermodynamische Gleichgewicht vieler Reaktionen. Ein weiterer Vorteil biokatalytischer Reaktionen ist, dass sie nicht unter Schutzgas durchgeführt werden müssen, während viele homogene und heterogene Katalysatoren bereits bei Raumtemperatur durch Luft oxidiert und deaktiviert werden (E. M. M. Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878-1894).
Aufgrund der komplexen, aber definierten 3-dimensionalen Struktur von Enzymen profitiert die Enzymkatalyse von einer hohen Chemo-, Regio- und Stereoselektivität, die die Herstellung von komplexen und chiralen Molekülen erlaubt. Heutzutage wird die Biokatalyse für eine Reihe von industriellen Prozessen genutzt, wie beispielsweise für die Herstellung von wertvollen Feinchemikalien, optisch aktiven Pharmazeutika, Pflanzenschutzmitteln und Duftstoffen oder für den Abbau von Kunststoffen. Da Enzyme weniger gesundheits- und umweitschädlich sind als chemische Katalysatoren, wird ihr Einsatz in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie favorisiert (E. M. M. Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878- 1894).
Die Biokatalyse bietet die Möglichkeit, ganze Synthesewege für die Herstellung wichtiger Moleküle neu zu gestalten, sie in höheren Ausbeuten zu gewinnen und ihre nachgeschalteten Prozesse zu vereinfachen. Die Vorteile von Synthesestrategien, die auf organischen Ein-Topf-Transformationen basieren, ohne dass Zwischenverbindungen isoliert werden müssen, sind aus zahlreichen Studien bekannt. Derartige Prozesse werden auch als "Kaskaden"-Reaktionen bezeichnet (E. M. M. Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878-1894).
Die Proteintechnologie erlaubt es, Enzyme über die Änderung ihrer Aminosäuresequenz hinsichtlich des Expressionsniveaus, der Stabilität, der katalytische Aktivität und der Selektivität zu optimieren und industriellen Anforderungen anzupassen. So wurden beispielsweise neue Varianten der P450- Enzyme mit gewünschter Aktivität generiert, die eine bemerkenswerte Vielfalt chemischer Reaktionen, wie die regiospezifische Oxyfunktionalisierung, C-C-Bindungsbildung, Zyklopropanierung usw., ermöglichen. Auch Lipasen wurden Protein-Engineering-Studien unterzogen, die zu neuen Katalysatoren für die kinetische Racematspaltung chiraler Alkohole geführt haben (E. M. M. Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878-1894). Die Enzymimmobilisierung ist ein vergleichsweise alter Ansatz, Enzyme technisch nutzbar zu machen (N. Grubhofer et al., Naturwissenschaften 1953, 40, 508) . Heute werden immobilisierte Enzyme breitflächig u.a. in Produktions verfahren der Chemie und Lebensmittelindustrie, in der Diagnostik und Biosensorik oder in Waschmitteln, Agrarprodukten und Kosmetik genutzt.
Enzymimmobilisierung ist generell definiert als „physikalische Abgrenzung oder Lokalisierung von Enzymen in einem begrenzten Raum unter Erhalt der katalytischen Aktivität" (E. Katchalski- Katzir, Trends Biotechnol. 1993, 11, 471-478). So kann durch Immobilisierung eine Konzentrierung der Enzyme und damit verbunden eine höhere Produktivität (Raum-Zeit-Ausbeute) erreicht und die dabei eingesetzte Katalysatormenge reduziert werden. Je nach Wahl der Immobilisierungsstrategie kann die Stabilität gegenüber hohen Temperaturen, extremen pH-Werten, mechanischen Scherkräften und organischen Solventien verändert werden. Gleichzeitig wird die Abtrennung der Enzyme vom Reaktionsmedium erleichtert, wodurch die Verwendung der Enzyme in mehreren Reaktionszyklen ermöglicht wird. Zusätzlich kann mit der Immobilisierung eine intrinsische Stabilisierung der Enzyme einhergehen, sodass Lagerfähigkeit und Prozessstandzeit im Vergleich zum freien Enzym signifikant verbessert sind (R. A. Sheldon et al., Chem Rev. 2018, 118, 2, 801-838).
Grundlegend lassen sich als Immobilisierungsmethoden die kovalente und nicht kovalente Trägerbindung, das Einschlussverfahren in polymere Matrizes und in Membranen und die trägerfreie Immobilisierung unterscheiden. Herkömmliche Methoden zur Fixierung von Enzymen beruhen auf der Verankerung oder Vernetzung der Proteine durch polyfunktionale Kupplungsreagenzien („crosslinker"), entweder direkt in der Kanalstruktur oder auf porösen Trägermaterialien (Polymere, Partikel) . Die Verwendung von Trägermaterialien stellt hierbei einen Kompromiss dar, der zwar eine effektive Immobilisierung unter Erhalt der katalytischen Aktivität ermöglichen kann, jedoch auch zwangsläufig zur „Verdünnung" der katalytischen Spezies und damit zur Verringerung von Raum/Zeit-Ausbeuten führt. Trägerfreie unlösliche Agglomerate (Immobilisate) von Enzymen entstehen durch direkte oder über Spacer vermittelte kovalente Quervernetzung der einzelnen Proteinmoleküle (U. Rössl et al., Biotechnol. Lett. 2010, 32, 341-350). Dabei kommen bifunktionelle Reagenzien zum Einsatz, die mit den reaktiven Funktionen der Aminosäureseitenketten auf der Enzymoberfläche reagieren. Wie bei der kovalenten Trägerbindung dienen vorrangig die e-Aminofunktionen der Lysinreste als Reaktionspartner. Als Vernetzungsreagenzien sind Dialdehyde (z. B. Glutardialdehyd, Dextrandialdehyd), Diisocyanate (z.B. Hexamethyldiisocyanat) und Diisothiocyanate (z.B. p-Phenylendiisothiocyanat) geeignet. Die Quervernetzung ist sowohl auf Basis gelöster Enzyme als auch ausgehend von gefrier- bzw. sprühgetrockneten Präparaten, Enzymkristallen und voraggregierten Enzymen möglich. Anwendungstechnische Bedeutung haben vor allem vernetzte Enzymkristalle, sog. cross-linked enzyme crystals (CLEC), und vernetzte Enzymagglomerate, sog. cross-linked enzyme aggregates (CLEA), erlangt. CLECs weisen eine solide mikroporöse Struktur mit uniformen, den Kristall durchziehenden Kanälen auf. Der Partikeldurchmesser kann über das Verhältnis von Enzym und Vernetzungsreagenz bzw. über die Inkubationszeit zwischen 1 - 100 gm flexibel eingestellt werden.
Die Erzeugung von CLEAs macht sich die spontane Agglomeration und Präzipitation von Proteinen in Gegenwart verschiedener organischer Lösungsmittel, Elektrolyte, nicht ionischer Polymere und Säuren zunutze und erfolgt unter Erhalt der dreidimensionalen Struktur, d. h. ohne Denaturierung. Die resultierenden Aggregate werden zu Partikeln gelartiger Konsistenz mit einem Durchmesser von 5 - 50 gm vernetzt. (Einführung in die Enzymtechnologie, K.-E. Jaeger et al., 2018 Springer Spektrum, Springer-Verlag GmbH Deutschland, 187-206; R. A. Sheldon, Org. Process Res. Dev. 2011, 15, 1, 213-223).
Eine Lösung für die Beladung mit relativ großen Mengen aktiver Biokatalysatoren bietet die in-situ-Generierung reiner Enzym- Hydrogele. Hydrogele sind poröse Polymere, die aus natürlichen oder synthetischen Strukturproteinen hergestellt sind und innerhalb der Biomedizin für die Verkapselung von Zellen und das Tissue Engineering erforscht werden (J. H. Lee, J. Tissue Eng. 2018, 9, 1-4).
Eine kürzlich eingeführte Strategie zur Protein-Gelbildung verwendet ein Paar von genetisch kodierten reaktiven Partnern, SpyTag und SpyCatcher, die unter physiologischen Bedingungen spontan eine kovalente Isopeptid-Bindung eingehen (S. C. Reddington et al., Current Opinion in Chemical Biology 2015, 29, 94-99; EP2534484B1). Peschke et al. beschreiben ein Verfahren zur Herstellung selbst-assemblierender Enzym- Hydrogele, in dem Enzyme genetisch mit einer SpyTag- bzw. SpyCatcher-Domäne fusioniert werden. Diese derart mit Konnektoren fusionierten Enzyme vernetzen sich in situ mit sich selbst und bilden monolithische (im Stück polymerisierte) „all-enzyme hydrogels". Die so hergestellten quervernetzten Polymere haben typischerweise Porengrößen von < 200 nm und zeigen eine höhere katalytische Aktivität als die zuvor erwähnten CLEAs.
Die Enzymimmobilisierung ist auch in Form von Schäumen beschrieben worden: Die W09820100A1 beschreibt unvernetzte Enzymformulierungen in Detergenzien, die anschließend aufgeschäumt werden. In diesen werden allerdings extrem niedrige Enzymkonzentrationen im Bereich von 0,0001 - 0,005 % eingesetzt. In der US4195127A werden die Herstellung von enzymhaltigen Polyurethan-basierten Biohybridschäumen und in Brun et al. die Herstellung von mesoporigen Silica-basierten Biohybridschäumen beschrieben, auf denen nachträglich Enzyme immobilisiert werden (N. Brun et al., Chem. Mater. 2010, 22, 16, 4555-4562).
Die Herstellung von Schäumen ist eine etablierte Technologie, die darauf basiert, Blasen in eine flüssige Phase einzubringen (W. Drenckhan et al., Advances in Colloid and Interface Science 2015, 222, 228-259; W. Drenckhan et al., Advances in Colloid and Interface Science 2015, 224, 1-16).
Schäume können zum Beispiel durch die Gasdurchführung durch eine Membran (J. Dittmann et al., Journal of Colloid and Interface Science 2016, 467, 148-157) oder durch Schütteln eines Behälters, der eine mit einem Tensid versetzte Flüssigkeit enthält, hergestellt werden (A. Maestro et al., Soft Matter 2014, 10, 36, 6975-6983).
Die mikrofluidische Erzeugung von Schäumen basiert auf der Generierung von Einzelkompartimenten in Zweiphasensystemen aufgrund von Abscherungen von einer Phase in die andere. Die beiden Phasen sind dabei nicht mischbar. Diese Technologie ist als Tropfenmikrofluidik bekannt (S. Mashagi et al., Trends in Analytical Chemistry 2016, 82, 118-125) . Die Literatur unterscheidet zwischen Tropfen (flüssig-flüssig-Systeme) und Blasen (flüssig-Luft-Systeme), wobei die Erzeugung von Blasen analog zu Generierung von Tropfen in verschiedenen Geometrien erfolgen kann (S. L. Anna, Annu. Rev. Fluid. Mech. 2016, 48, 285-309) . Die etabliertesten Verfahren sind die T-Kreuzung und die Fluss-fokussierende Kreuzung (T. Fu et al., Chemical Engineering Science 2015, 135, 343-372).
Die Blasensysteme werden weiterhin darin unterschieden, ob die Gasphase als kontinuierliche Phase (P. Tirandazi et al., Journal of Micromechanics and Microengineering 2017, 27, 075020) oder als disperse Phase verwendet wird (S. Andrieux et al., Langmuir 2018, 34, 1581-1590). Diese Blasensysteme unterscheiden sich hinsichtlich der Flussregime und der Systeme zur Blasenstabilisierung. Die so generierten Blasen weisen Blasengrößen im Bereich von 10 gm bis 1000 gm auf und fusionieren in einem Selbstassemblierungsprozess in höher geordnete Gitterstrukturen, die dann über die Flussparameter kontrolliert geändert werden können. In Abhängigkeit der äußeren Geometrieparameter der Struktur bilden sich diese Gitter zu dynamisch assemblierten Schäumen aus (P. Garstecki, Applied Physics Letters 2004, 85, 13, 2649-2651).
Proteinschäume sind ein wesentlicher Bestandteil der Lebensmittelindustrie und werden weitläufig für das gleichmäßige Inserieren feiner Luftzellen zur Texturierung von Lebensmitteln verwendet. Dabei werden katalytisch nicht aktive Mischungen aus Strukturproteinen wie beispielsweise Eiklar, Gelatine, Soja- oder Molkeproteinen zur Schaumerzeugung eingesetzt .
Bei der Bildung eines Proteinschaums wird zwischen drei Phasen unterschieden (J. R. Clarkson et al., Journal of Colloid and Interface Science 1999, 215, 2, 323-332):
Phase 1: Die Proteine diffundieren zur Luft/Wasser- Grenzfläche, werden dadurch lokal konzentriert und reduzieren so die Oberflächenspannung. Phase 2: Die an der Grenzfläche adsorbierten Proteine entfalten sich partiell mit Ausrichtung ihrer hydrophilen, polaren Anteile zur wässrigen Phase und ihrer hydrophoben Anteile zur nicht-wässrigen Phase.
Phase 3: Zusätzlich interagieren die Proteine an der Grenzfläche miteinander und bilden einen Film, der zu einer weiteren partiellen Entfaltung und Koagulation führen kann. Über die drei genannten Phasen adsorbieren Proteine schnell an der Grenzfläche und bilden einen stabilisierenden Film um einzelne Blasen. Dies fördert die Schaumbildung.
Bei der sog. Zerschäumung von Proteinen wird das Konzentrieren der oberflächenaktiven Proteine an der Grenzfläche zur fraktionierten Auftrennung genutzt. Dabei wird eine proteinhaltige Lösung mit einem inerten Gas durchströmt und der entstehende Schaum sukzessive abgetrennt. Dieses Verfahren ermöglicht eine kostengünstige und einfache Methode, um Proteine aus einer Lösung abzutrennen, und eignet sich zur industriellen Aufreinigung von Enzymen (F. Uraizee et al., Enzyme Microb. Technol. 1990, 12, 315-316).
Aufgrund der Denaturierung von Proteinen an den Grenzflächen wirken Schäume allerdings im Zusammenhang mit katalytisch aktiven Proteinen in der Regel destabilisierend und inaktivieren diese in erheblichen Maße (J. R. Clarkson et al., Journal of Colloid and Interface Science 1999, 215, 2, 333- 338; Z. Liu et al., Bioseparation 1998, 7, 3, 167-174).
Die kontinuierliche Durchfluss-Biokatalyse ist ein aufstrebender Bereich der industriellen Biotechnologie, der in Fließkanälen immobilisierte Enzyme für die Produktion von höherwertigen Chemikalien verwendet. Biokatalytische Fließprozesse sind schwierig zu realisieren, weil das heterogene Katalysesystem effektive Oberflächen immobilisierungstechniken erfordert, die für Enzyme anspruchsvoller sind als für konventionelle organo- (metallische) Katalysatoren.
Gängige Methoden zur Enzymimmobilisierung innerhalb mikrostrukturierter Strömungskanäle, wie z.B. Physisorption, chemische Quervernetzung oder genetisch kodierte Immobilisierungs-Tags haben ihre Anwendbarkeit bewiesen, aber es bleibt das Problem, dass die Menge des immobilisierten Biokatalysators durch die effektive Oberfläche begrenzt ist. Um diese Beschränkung zu überwinden, können Pseudo-3D- Grenzflächenschichten aus synthetischen Polymeren oder Mikro- /Nanopartikeln verwendet werden, um die Beladungskapazität für Enzyme zu erhöhen. Diese Ansätze verschwenden allerdings den begrenzten Reaktorraum und erfordern zudem oft zusätzliche Kopplungsschritte mit möglichen Nachteilen für die biokatalytische Aktivität. Eine Alternative stellen die zuvor erwähnten selbst-assemblierenden „all-enzyme hydrogels" dar, die in biokatalytischen Strömungsprozessen als immobilisierte Biokatalysatoren relativ hohe Raum-Zeit-Ausbeuten aufweisen (T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028- 17032).
Katalytisch aktive Proteinschäume, die aus miteinander kuppelnden katalytisch aktiven Proteinen hergestellt werden, sind noch nicht beschrieben worden.
Auch die Verwendung von katalytisch aktiven Proteinschäumen als trägerfreies Material für die Strömungsbiokatalyse ist bisher nicht bekannt.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, katalytisch aktive Proteinschäume und ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, wobei die Proteindenaturierung während der Schaumbildung möglichst gering sein soll, die volumenspezifische Enzymbeladung und die Stabilität der Proteinschäume hingegen möglichst hoch sein sollen.
Die vorstehende technische Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Die Erfindung zielt darauf ab, katalytisch aktive Proteinschäume herzustellen, die im Wesentlichen allein aus miteinander gekuppelten katalytisch aktiven Proteinen oder aus Verbundmaterialien einschließlich der miteinander gekuppelten katalytisch aktiven Proteine bestehen. Die Proteine sind wesentlicher Bestandteil des Materials selbst, sie sind also nicht nachträglich auf geschäumte Materialien, wie z.B. Polymere, aufgebracht. Im Folgenden werden die Begriffe „Proteinschaum" und „Proteinschäume" als Synonyme verwendet und sind definiert als gasförmige Blasen, die von flüssigen oder festen Proteindünnfilmen eingeschlossen sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
A) Herstellung katalytisch aktiver, mit einem Konnektor (7) fusionierter Proteine sowie katalytisch aktiver, mit einem zum Konnektor (7) komplementären Konnektor (8) fusionierter Proteine;
B) Herstellung von katalytisch aktive Proteine enthaltenden Blasen in einem Blasengenerator unter Einsatz einer Gasphase und einer Lösung der katalytisch aktiven, mit dem Konnektor (7) fusionierten Proteine und der katalytisch aktiven, mit dem Konnektor (8) fusionierten Proteine aus Schritt A);
C) Überführen der in Schritt B) hergestellten Blasen in eine Reaktionskammer (5);
D) Kupplung der in den Blasen enthaltenen katalytisch aktiven Proteine aus Schritt B) in der Reaktionskammer (5) unter Ausbildung eines katalytisch aktiven Proteinschaums (10).
Ein Merkmal des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) besteht darin, dass die individuellen Moleküle der katalytisch aktiven Proteine (6) über zueinander komplementäre Konnektoren (7) und (8) miteinander gekuppelt sind. „Miteinander gekuppelt" bedeutet für das erfindungsgemäße Verfahren, dass die Konnektoren (7) und (8) eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung eingehen. Nicht kovalente-Bindungen sind im erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise Wasserstoff brückenbindungen oder ionische Bindungen, aber auch hydrophobe Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte.
Zueinander komplementär bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren für die Konnektoren (7) und (8), dass sie spezifisch miteinander reagieren, sodass eine spezifische Bindung zwischen den katalytisch aktiven Proteinen ausgebildet wird. Die Bindung ist hierbei in einer Ausführungsform eine kovalente Bindung, in einer anderen Ausführungsform eine nicht-kovalente Bindung .
Für das SpyTag/SpyCatcher-System besteht die Kompelmentarität darin, dass das Ne eines Lysinrests der SpyCatcher-Domäne spezifisch mit dem Ca eines (komplementären)
Asparaginsäurerests der SpyTag-Domäne unter Ausbildung einer Isopeptidbindung und Abspaltung von H2O reagiert (S. C. Reddington et al., Current Opinion in Chemical Biology 2015, 29, 94-99).
In einer Ausführungsform werden die katalytisch aktiven, mit einem Konnektor (7) fusionierten Proteine sowie die katalytisch aktiven, mit dem zum Konnektor (7) komplementären Konnektor (8) fusionierten Proteine in Schritt A) heterolog exprimiert und die Konnektoren sind ein genetisch-fusionierter Teil der Proteine. Für die heterologe Expression der mit den Konnektoren (7) bzw. (8) fusionierten katalytisch aktiven Proteine werden Bakterienzellen mit dem entsprechenden Expressionsvektor transformiert.
In einer bestimmten Ausführungsform sind die Konnektoren genetisch-fusionierte Peptid-Tags, die kovalente
(Iso)peptidbindungen bilden können, wie beispielsweise Split- Inteine (N. H. Shah et al., Chem Sei 2013, 5, 446-461), Sortasen (H. Mao et al., JACS 2004, 126, 2670-2671),
Transglutaminasen (A. Fontana et al., Adv Drug Deliv Rev 2008, 60, 13-28), Peptiligasen (A. Toplak et al., Adv Synth Catal.
2016, 358(13), 2140-2147,) oder das SpyTag/SpyCatcher-System. Beispielsweise wird das katalytisch aktive Protein (6) genetisch mit einer SpyTag- bzw. SpyCatcher-Domäne fusioniert. Die Reaktion des SpyTags mit dem SpyCatcher führt zu einer definierten kovalenten Bindung zwischen den katalytisch aktiven Proteinen.
In einer weiteren Aus führungsform werden genetisch fusionierte, nicht-kovalente, Peptid- bzw. Protein-basierte Bindungssysteme zur Verknüpfung der katalytisch aktiven Proteine (6) verwendet, wie beispielsweise das RIDD/RIAD- System (W. Rang et al., Nat. Commun. 2019, 10, 4248), selbst- assemblierende amphipathische Peptide (self-assembling amphipathic peptides) (VS. Zhao et al., Microb Cell Fact. 2019, 18, 91), Leucin-Zipper-Systeme (J. R. Moll et al., Protein Sei. 2001, 10, 3, 649-655,) oder Elastin-ähnliche Peptide (elastln-llke peptides (ELPs)) und Kollagen-ähnliche Peptide (collagen-like peptides (CLPs)) (Ό. W. Urry et al., Biopolymers. 1985, 24, 12, 2345-2356; T. Luo et al., J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 49, 15362-15365j.
Eine bestimmte Ausführungsform stellen die Protein/Protein Interaktionsdomänen PDZ (PSD95-Discs large_Z01), GBD (GTPase- Bindedomäne), SH3 (Src-homology 3) und deren korrespondierende Liganden dar (J. Dueber et al., Nat. Biotechnol. 2009, 27, 753-759) . In einer weiteren bestimmten Ausführungsform werden sogenannte Einzeldomänenantikörper und deren korrespondierende Antigene verwendet (R. H. J. van der Linden et al., Biochimica et Biophysica Acta 1999, 1431, 37-46). In einer weiteren bestimmten Ausführungsform werden sogenannte makrozyklische Wirt-Gast-Wechselwirkungen zur Verknüpfung der katalytisch aktiven Proteine (6) verwendet. Ein Ausführungsbeispiel ist die Verwendung eines an die katalytisch aktiven Proteine fusionierten FGG (phenyalanine-glycine-glycine) Peptidmotivs und die Verwendung von Cucurbit[8]uril (D. H. Nguyen et al., Angew Chem Int Edit. 2010, 49, 5, 895-898).
In einer anderen Ausführungsform werden in Schritt A) katalytisch aktive Proteine (6) heterolog exprimiert, wobei für die heterologe Expression Bakterienzellen mit dem entsprechenden Expressionsvektor transformiert werden. Die Konnektoren (7) bzw. (8) werden hingegen nachträglich chemisch an die katalytisch aktiven Proteine (6) gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Konnektoren hetero- oder homobifunktionelle Crosslinker zur kovalenten Verknüpfung der katalytisch aktiven Proteine (6), wie beispielsweise Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1- carboxylat, N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat, Dimethyladipimidat oder Dialdehyde, wie beispielsweise 1,5- Pentandial. Als homobifunktionelle Vernetzer werden Vernetzer mit zwei gleichen reaktiven Gruppen, als heterobifunktionelle Vernetzer solche mit zwei unterschiedlichen Gruppen bezeichnet .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das katalytisch aktive Protein (6) ein Enzym, etwa ein stereoselektives Enzym, und/oder ein Enzym, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Oxidoreduktasen (EC 1.-.-.-), Transferasen (EC 2.-.-.-), Hydrolasen (EC 3.-.-.-), Lyasen (EC 4.-.-.-), Isomerasen (EC 5.-.-.-), Ligasen (EC 6.-.-.-) und Translokasen (EC 7.-.-.-). Die Nummer der Enzymkommission (EC-Nummer) ist ein numerisches Klassifikationsschema für Enzyme, das auf den von ihnen katalysierten chemischen Reaktionen basiert, (https://www.enzyme-database.org/).
Beispiele für im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Enzyme sind Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro-genase (BsGDH), Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp. (S)-imine reductase (GF3546), Halomonas elongata amine transaminase (HEWT).
Im erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die katalytisch aktiven Proteinschäume (10) ein katalytisch aktives Protein (6) oder mehrere katalytisch aktive Proteine (6) mit unterschiedlichen Reaktionsspezifitäten.
In einer Ausführungsform zur Herstellung eines Mono- Enzymschaums ist das katalytisch aktive Protein (6), das mit dem Konnektor (7) fusioniert ist, identisch mit dem katalytisch aktiven Protein (6), das mit dem Konnektor (8) fusioniert ist. Mono-Enzymschaum bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren, das der katalytisch aktive Proteinschaum (10) nur ein katalytisch aktives Protein (6) enthält.
In einer Ausführungsform zur Herstellung eines Bi-Enzymschaums werden in Schritt D) unterschiedliche katalytisch aktive Proteine (6) über die Konnektoren (7) und (8) miteinander verknüpft, indem in Schritt A) ein katalytisch aktives Protein (6) mit dem Konnektor (7) fusioniert wird und ein davon verschiedenes katalytisch aktives Protein (6) mit dem zum Konnektor (7) komplementären Konnektor (8) fusioniert wird (Methode a). Bi-Enzymschaum bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren, das der katalytisch aktive Proteinschaum (10) zwei verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) enthält.
In einer weiteren Ausführungsform zur Herstellung eines Bi- Enzymschaums oder eines Multi-Enzymschaums werden mehrere zueinander orthogonale Konnektor-Paare verwendet (Methode b). Multi-Enzymschaum bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren, das der katalytisch aktive Proteinschaum (10) mindestens drei verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) enthält.
Orthogonale Konnektor-Paare bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren, dass ein erstes Konnektor-Paar, umfassend die zugehörigen Konnektoren (7) und (8), spezifisch miteinander kuppelt und dass mindestens ein zweites Konnektor-Paar, umfassend die jeweils zugehörigen Konnektoren (7) und (8), ebenfalls spezifisch miteinander kuppelt, ohne dass eine Kreuzkupplung des ersten und des mindestens zweiten Konnektor- Paars stattfindet. Brune et al. beschreiben beispielsweise zwei orthogonale Konnektorenpaare SpyTag/SpyCatcher und SnoopTag/SnoopCatcher , die zur Herstellung synthetischer Nanopartikel mit verschiedenen Antigenen eingesetzt werden. Hierbei bildet die SpyCatcher-Domäne eine Isopeptid-Bindung mit der SpyTag-Domäne durch spontane Amidierung, die SnoopCatcher-Domäne bildet hingegen eine Isopeptid-Bindung mit der SnoopTag-Domäne durch eine Transamidierung (K. D. Brune et al., Bioconjugate Chem. 2017, 28, 1544-1551; D. Hatlem et al., Int. J. Mol. Sei. 2019, 20, 2129).
Zur Herstellung eines Bi-Enzymschaums unter Einsatz zweier orthogonaler Konnektor-Paare wird ein katalytisch aktives Protein (6) über ein erstes Konnektor-Paar, umfassend die zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt und ein zweites katalytisch aktives Protein (6) über ein zweites zum ersten Konnektor-Paar orthogonales Konnektor-Paar, umfassend die jeweils zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt (Methode b).
Zur Herstellung eines Multi-Enzymschaums unter Einsatz mindestens dreier orthogonaler Konnektor-Paare werden mindestens drei verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) mit dem jeweiligen Konnektor (7) bzw. (8) fusioniert, wobei die jeweiligen Konnektoren (7) und (8) jeweils ein Konnektor- Paar bilden. Beispielsweise wird zur Herstellung eines drei verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) enthaltenden Multi-Enzymschaums ein erstes katalytisch aktives Protein (6) über ein erstes Konnektor-Paar, umfassend die zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt, ein zweites katalytisch aktives Protein (6) über ein zweites zum ersten Konnektor-Paar orthogonales Konnektor-Paar, umfassend die jeweils zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt und ein drittes katalytisch aktives Protein (6) über ein drittes zum ersten und zweiten Konnektor-Paar orthogonales Konnektor-Paar, umfassend die jeweils zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt. Für die Herstellung eines Multi-Enzymschaums, der mindestens 4 verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) enthält, werden entsprechend weitere orthogonale Konnektor-Paare gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.
Denkbar ist auch die Herstellung eines Multi-Enzymschaums durch die Kombination der Methoden a) und b), das heißt, es wird über ein erstes Konnektorpaar ein Heterodimer von katalytisch aktiven Proteinen (6) gebildet und über ein dazu orthogonales mindestens zweites Konnektorpaar wird ein mindestens zweites Heterodimer von katalytisch aktiven Proteinen (6) gebildet.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in einem weiteren Schritt B) die Herstellung von katalytisch aktive Proteine enthaltenden Blasen. Diese Blasen werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer strömungstechnischen Vorrichtung hergestellt .
In einer Ausführungsform umfasst die strömungstechnische Vorrichtung einen Blasengenerator. Für die Herstellung des Blasengenerators werden im erfindungsgemäßen Verfahren verschiedene Materialien, wie z.B. Metalle, Glas oder Polymere verwendet. Bevorzugt werden für die Herstellung des Blasengenerators Polydimethylsiloxan und Polymethyl- methacrylat eingesetzt. Um die Strukturen als fluidische Einheiten zu verwenden, müssen die Strukturen verschlossen werden. Die Struktur wird dabei entweder durch thermische Plasmaoxidation auf einen Glasobjektträger oder auf Polydimethylsiloxan gebondet. Alternativ wird eine Klebefolie zum Abdichten (z.B. aus Polyolefin) verwendet. Das erste Element des Blasengenerators (Figur 1) ist ein Einlass (1) für eine kontinuierliche Phase, die sich in zwei spiegelsymmetrische Pfade aufteilt. Diese treffen von beiden Seiten in einem 45° Winkel auf einen Einlasskanal für eine disperse Phase (2). Letztere entspricht dem Gas, aus dem die Blasen bestehen. Der Kanalquerschnitt kann dabei ein beliebiges Profil aufweisen. Der Kanal der dispersen Phase schneidet den Kanalquerschnitt der kontinuierlichen Phase in dessen Spiegelachse und generiert damit das funktionelle Element der flussfokussierenden Kreuzung (3). Beide Phasen treffen an der Kreuzung (3) aufeinander, an der die Gasphase durch die kontinuierliche Phase in einzelne Blasen abgetrennt wird. Die an der Kreuzung generierten Blasen fließen über den Auslasskanal (4) aus der Struktur in eine Reaktionskammer (5) (Figur 2). Die Reaktionskammer besteht aus einem gestreckten rechteckigen Kanal, der sich zu den Enden hin verjüngt, um eine Kontaktierung zur Flussaktuierung zu gewährleisten.
Um Blasen in der zuvor beschriebenen Struktur zu generieren, werden zwei nicht ineinander mischbare Phasen verwendet. Die Phase, die die Blase umhüllt, ist die kontinuierliche Phase, die Phase, aus der die Blase besteht, ist die disperse Phase. Als Phasen für die Blasengeneration können alle nur schwer miteinander mischbaren Kombinationen aus Gas - Flüssigkeit verwendet werden.
Als Gasphase wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein beliebiges Gas, bevorzugt ein inertes Gas verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als Gasphase Stickstoff verwendet.
Als kontinuierliche Phase wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine verwendet.
Die Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine ist in einer Ausführungsform eine wässrige Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine. Die wässrige Lösung umfasst gegebenenfalls Puffersysteme, wie zum Beispiel Citrat-, Acetat- oder Phosphat-Puffersysteme. Im erfindungsgemäßen Verfahren ist eine wässrige Lösung eine Lösung, in der H2O als Lösungsmittel zu > 99,9 Volumenprozent des Lösungsmittel anteils eingesetzt wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine auch Lösungsmittelgemische aus H2O und organischen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel Acetonitril, Ethanol, Methanol, Dimethylsulfoxid, Isopropanol. Der Volumenanteil des organischen Lösungsmittels im Lösungsmittelgemisch kann hierbei 0,1 - 99,9 Volumenprozent betragen. Die Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine, die solche Lösungsmittelgemische aus H2O und organischen Lösungsmitteln enthält, umfasst gegebenenfalls Puffersysteme wie zum Beispiel Citrat-, Acetat oder Phosphat-Puffersysteme.
In einer anderen Ausführungsform werden für die Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine organische Lösungsmittel, zum Beispiel Acetonitril, Ethanol, Methanol, Dimethylsulfoxid, Isopropanol, verwendet, die einen Wasseranteil von weniger als 0,1 Volumenprozent haben.
In einer weiteren Ausführungsform können für die Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine nicht-klassische Lösungsmittel eingesetzt werden, wie zum Beispiel ionische Flüssigkeiten, niedrig schmelzende eutektische Lösungsmittel oder super-kritisches CO2.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt die Konzentration der Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine je nach gewünschter Polymerisierungszeit zwischen 1 mM und 100 mM. Bevorzugt ist eine Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine mit einer Konzentration von 1 mM.
In einer bestimmten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Proteinlösungen der komplementären Bindungspartner in einem stöchiometrischen Verhältnis miteinander gemischt, inkubiert und an den Blasengenerator angeschlossen. Der Blasengenerator wird in dieser bestimmten Ausführungsform zuerst mit N2 Gas geflutet und konstant mit N2 Gas durchströmt. Im Anschluss wird die Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine mit einer konstanten Flussgeschwindigkeit in die mikrofluidische Einheit eingelassen und an der Kreuzungsdüse mithilfe des N2 Gases aufgeschäumt . Das aufgeschäumte Material wird am Auslass aufgefangen und direkt in eine Reaktionskammer (5) (Figur 2) überführt .
Die Blasen werden durch die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Proteine stabilisiert, was die kurzfristige Koaleszenz der Blasen verhindert.
In einer Aus führungsform werden der Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine Additive in geringen Mengen von 10 - 100 pmol/l zugesetzt. Additive sind im erfindungsgemäßen Verfahren Zusatzstoffe, die einen positiven Effekt auf die Herstellung der Blasen in Schritt B) und die Bildung des katalytisch aktiven Schaums (10) in Schritt D) haben. So werden die Blasen in Schritt B) beispielsweise durch die Zugabe von Additiven längerfristig stabilisiert. Beispiele für Additive sind im erfindungsgemäßen Verfahren Tenside, bevorzugt biokompatiblen Tenside, wie zum Beispiel Saponine, Lauryl Sulfobetaine, Rhamnolipide, Tween 20 und Triton X100. Die Geschwindigkeiten der kontinuierlichen und dispersen Phase werden über einen Druckgradienten Dr geregelt. Der Druckgradient Dr liegt im erfindungsgemäßen Verfahren für die kontinuierliche Phase zwischen hp_kontinuierlich = 10 mbar und hp_kontinuierlich = 1000 mbar, bevorzugt zwischen 300 und 360 mbar. Der Druckgradient für die disperse Phase liegt im erfindungsgemäßen Verfahren zwischen hp_dispers = 10 mbar und hp_dispers = 1000 mbar, bevorzugt zwischen 110 und 200 mbar. Wichtig ist, dass hp_kontinuierlich größer als hp_dispers ist.
Der Durchmesser, die Porengrößen und die Generierungsfrequenz der Blasen lassen sich präzise über die Geometrie der Kanäle, den verwendeten Druckgradienten und die Art der kontinuier lichen Phase einstellen.
Die Blasen werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Durchmesser von 5 - 1500 gm und einer Porengröße von 10 - 2000 gm hergestellt. In einer bestimmten Ausführungsform werden Blasen mit einem Durchmesser von 200 - 300 pm erzeugt. Die Porengrößen der so generierten Blasen liegen bei 50 - 1200 pm, bevorzugt bei 250 - 310 pm.
In einer anderen bestimmten Ausführungsform werden Blasen mit einem Durchmesser von 15 - 200 pm, bevorzugt von 30 - 80 pm erzeugt. Die Porengröße der Blasen liegt dann bei 15 bis 250 pm, bevorzugt 30 bis 100 pm.
Die so hergestellten, katalytisch aktive Proteine enthaltenden Blasen werden in eine Reaktionskammer (5) überführt. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Reaktionskammer (5) aus Polydimethylsiloxan oder Polymethylmethacrylat.
In der Reaktionskammer (5) findet eine Kupplung der katalytisch aktiven Proteine über die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten komplementären Konnektoren (7) und (8) zu einem katalytisch aktiven Proteinschaum (10) statt. Der so vernetzte Proteindünnfilm auf den Blasen des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) hat im erfindungsgemäßen Verfahren eine Schichtdicke von 0,1 - 200 gm. In einer bestimmten Ausführungsform beträgt die Schichtdicke der vernetzten Proteindünnfilme auf den Blasen 1 - 60 gm.
Der Proteinschaum wird in einer Ausführungsform nach der abgeschlossenen Vernetzungsreaktion in der Reaktionskammer (5) in Schritt D) in einem weiteren Schritt E) getrocknet.
Durch den Trocknungsprozess kann die Schichtdicke der vernetzten Proteindünnfilme auf den Blasen auf 1- 50 gm genau eingestellt werden. Weitere Vorteile der Trocknung des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) sind eine erhöhte mechanische Stabilität, eine bessere Lagerfähigkeit, eine höhere Langzeitstabilität gegen Degenerationsprozesse der im Proteinschaum enthaltenen katalytisch aktiven Proteine sowie eine monodisperse Verteilung der Poren und damit ein reproduzierbareres Endprodukt.
Dieser Trocknungsschritt E) erfolgt in einer Ausführungsform bei offener Reaktionskammer (5) bei Raumtemperatur. In einer besonderen Ausführungsform erfolgt die Trocknung bei offener Reaktionskammer (5) bei Raumtemperatur bei kontinuierlicher Luftkonvektion, um den Trocknungsprozess zu unterstützen.
Die Trocknungszeit bei offener Reaktionskammer (5) beträgt im erfindungsgemäßen Verfahren 30 min - 28 Tage. Bevorzugt ist eine Trocknungszeit von mindestens 2 h. Besonders bevorzugt ist eine Trocknungszeit von 2 - 28 Tagen, um die Stabilität und Aktivität des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) zu erhöhen (Figur 12).
Eine andere Ausführungsform der Trocknung ist, den Proteinschaum bei 30 °C in einem Inkubator bei kontinuierlicher Luftkonvektion zu trocknen. Die Trocknungszeit beträgt hierbei 30 min - 28 Tage. In einer bestimmten Ausführungsform beträgt die Trocknungszeit im Inkubator 30 min - 60 min.
In einer bestimmten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dient die Reaktionskammer (5) als Durchflussbioreaktor, indem mit dem in Schritt E) getrockneten, katalytisch aktiven Proteinschaum (10) mindestens ein Substrat (11) zu mindestens einem Produkt (12) umgesetzt wird (Figur 3). Hierbei wird das mindestens eine Substrat (11) als Flüssigkeitsstrom mit einer bestimmten Flussrate durch die Reaktionskammer (5) geleitet. Das in der Reaktionskammer (5) entstehende mindestens eine Produkt (12) befindet sich nach der Umsetzung im Austrittsstrom der Reaktionskammer (5) und wird am Auslass der Reaktionskammer (5) gesammelt.
In einer anderen Aus führungsform werden die katalytisch aktiven Proteinschäume (10) aus katalytisch aktiven Proteinen und Verbundmaterialien hergestellt, wobei die Proteine mehr als 5 % (w/w) des Trockenmaterials ausmachen. Verbund materialien sind im erfindungsgemäßen Verfahren Materialien, die aus zwei oder mehr Bestandteilen mit deutlich unterschiedlichen physikalischen oder chemischen Eigenschaften bestehen. In Kombination ergeben diese Bestandteile ein Material mit Eigenschaften, die sich von den einzelnen Komponenten unterscheiden, wobei die einzelnen Komponenten innerhalb der fertigen Struktur getrennt und unterscheidbar bleiben (https://www.twi-global.com/technical-knowledge/faqs /what-is-a-composite-material ). Beispiele für solche Verbundmaterialien sind DNA-Silica-Nanokompositmaterialien (Y. Hu et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 17269-17272), welche aus einem DNA Polymer bestehen und durch Silica- Nanopartikel (SiNP) mit Größen von typischerweise < 200 nm Durchmesser durch eine in homogener Lösung ablaufende biochemische Reaktion hergestellt werden. In einem weiteren Ausführungsbeispiel werden als Verbundmaterialien DNA-SiNP- Kompositmaterialien eingesetzt, die durch Einbau von Kohlenstoffnanoröhren (CNT) in ihren mechanischen Eigenschaften einstellbar sind und somit aus unterschiedlichen Anteilen von DNA, SiNP und CNT bestehen (Y. Hu et al., Nat. Commun. 2019, 10, 5522).
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Hybridmaterialien aus den katalytisch aktiven Proteinen und DNA-SiNP- Kompositmaterialien oder DNA-SiNP-CNT-Kompositmaterialien mit variierenden Anteilen von Silica-Nanopartikeln von 0 - 100 % und Kohlenstoffnanoröhren von 0 - 100 % hergestellt. Zur Verknüpfung der Materialien werden beispielsweise chlorohexyl- modifizierte Nukleinsäuren durch eine Polymerasereaktion in das DNA Polymer eingebaut und über ein selbstligierendes Protein, z.B. das sogenannte HOB Protein (Halo-based oligonucleotide binder protein) (K. J. Koßmann et al., Chembiochem. 2016, 17, 12, 1102-1106) mit dem Proteinmaterial verbunden .
Zum Aufbau katalytisch-aktiver DNA-Protein-Hybridmaterialien werden im erfindungsgemäßen Verfahren in Schritt A) die katalytisch aktiven Proteine (6) sowohl mit den Konnektoren (7) bzw. (8) als auch mit dem HOB Protein genetisch fusioniert. Somit können die katalytisch aktiven Proteine (6) sowohl über die komplementären Konnektoren (7) und (8) miteinander gekuppelt werden als auch gleichzeitig über das HOB-Protein beispielsweise an ein DNA-SiNP-Kompositmaterial gekuppelt werden.
Die Aufschäumung der katalytisch aktiven Proteine hat im erfindungsgemäßen Verfahren den überraschenden Effekt, dass die miteinander kuppelnden katalytisch aktiven Proteine bei der Aufschäumung nicht denaturieren, wie dies in der Regel für Enzyme bei mechanischen Belastungen durch Scherkräfte beobachtet wird.
Die eingesetzten Konnektoren (7) und (8) führen darüber hinaus zu einer stabilen Verbindung der Proteine in Form eines Schaums, in dem die Blasen nicht mehr koaleszieren. So können in den erfindungsgemäßen Proteinschaum (10) überraschend auch empfindliche Proteine, wie beispielsweise das Enzym Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P) verwendet werden, obwohl sich dieses Enzym bereits in homogener Lösung bei starkem Rühren rasch entfaltet und seine Aktivität verliert. Auch für weitere kata lytisch aktive Proteine (6), wie Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro- genase (BsGDH), Streptomnyces sp. (S)-imine reductase (GF3546) und Halomonas elongata amine transaminase (HEWT) konnte gezeigt werden, dass die katalytische Aktivität in Form der entsprechenden katalytisch aktiven Proteinschäume (10) erhalten bleibt und die katalytische Produktivität gegenüber den entsprechenden monolithischen Enzymmaterialien (14) („all- enzyme hydrogels", siehe T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028-17032) erhöht ist (Figur 8).
Darüber hinaus zeigen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen katalytisch aktiven Proteinschäume (10) einen unerwarteten Alterungseffekt, der die katalytische Aktivität dieser Schäume erhöht. Während sich im Schaumbildungsprozess die Blasen anfänglich zunächst nebeneinander anordnen und mehrere Blasenschichten (9) ausbilden, ist im weiteren zeitlichen Verlauf ein „Aushärten" der Proteinschäume zu beobachten, in dem sich die Proteine über Konnektoren auf molekularer Ebene miteinander definiert vernetzen. Während dieser Reifung der katalytisch aktiven Proteinschäume wird auch deren mechanische Festigkeit erhöht. Gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten „all-enzyme hydrogels" (T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028-17032) haben die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteinschäume (10) eine wesentlich größere Oberfläche, was beispielsweise vorteilhaft für den Einsatz als immobilisierte Katalysatoren ist.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren, Ausführungsbeispiele und Beschreibungen näher erläutert.
Alle dargestellten Merkmale und deren Kombinationen sind nicht nur auf diese Figuren und Ausführungsbeispiele und deren Ausgestaltungen begrenzt. Vielmehr sollen diese stellvertretend für weitere mögliche, aber nicht explizit als Ausführungsbeispiele dargestellte weitere Ausgestaltungen kombinierbar angesehen werden.
Figur 1 zeigt die schematische Darstellung eines Blasengenerators zur Herstellung von katalytisch aktive Proteine (6) enthaltenden Blasen. Über den Einlass (1) wird die Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine (kontinuierliche Phase) in das System eingeführt, über den Einlass (2) ein Gas als disperse Phase. Beide Phasen treffen an der Kreuzung (3) aufeinander, an der die Gasphase durch die kontinuierliche Phase in einzelne Blasen abgetrennt wird. Diese fließen über den Auslass (4) aus der Struktur in eine Reaktionskammer (5) (Figur 2).
Figur 2 zeigt die schematische Darstellung der Reaktionskammer (5) zur flusskatalytischen Prozessierung des Proteinschaums. Figur 2a) zeigt eine isometrische Ansicht der Reaktionskammer. Figur 2b) zeigt die Seitenansicht und Figur 2c) die Aufsicht auf die Struktur. Um die Struktur fluidisch zu kontaktieren, verjüngt sich diese über eine Länge von 4 mm von der Kanalbreite von 3 mm auf 1 mm zu den Enden. Der Proteinschaum befindet sich in der 1 mm hohen, 3 mm breiten und 54 mm langen Reaktionskammer im getrockneten Zustand in einer dicht gepackten Kugelpackung.
Figur 3 zeigt schematisch den gesamten Prozess der Herstellung eines katalytisch aktiven Proteinschaums (10): Zunächst werden mit einem Konnektor (7) bzw. einem Konnektor (8) verbundene katalytisch aktive Proteine (6) als Lösung in den Blasengenerator (Figur 1) eingelassen. Die im Blasengenerator generierten Blasen werden über den Auslasskanal (4) in die Reaktionskammer (5) überführt. In der Reaktionskammer (5) sind schematisch die einzelnen Blasen dargestellt, die durch eine flüssige Phase getrennt sind, welche die katalytisch aktiven, mit den Konnektoren (7) bzw. (8) fusionierten Proteine enthält. Einzelne Moleküle der katalytisch aktiven Proteine werden über die zueinander komplementären Konnektoren (7) und (8) miteinander gekuppelt. Die Blasen ordnen sich zunächst nebeneinander an und bilden mehrere Blasenschichten (9). Im dann entstehenden Proteinschaum (10) verbinden sich Proteine durch die Konnektoren (7) und (8) in einer "Reifung", das heißt Eigenschaften, wie beispielsweise die mechanische Festigkeit, verändern sich mit der Zeit. Mit dem resultierenden Material kann beispielsweise ein Substrat (11) zu einem Produkt (12) umgesetzt werden.
Figur 4 zeigt Hochgeschwindigkeitsaufnahmen der reproduzier baren Generation von monodispersen Blasen, die mittels des Blasengenerators aus Figur 1 hergestellt wurden, und deren räumlichen Anordnung im Auslasskanal (4) in Abhängigkeit der angelegten Drücke. Der Druck der kontinuierlichen Phase wurde dabei konstant auf p = 330 mbar gehalten. Der Druck der dispersen Phase entspricht a) 80 mbar, b) 90 mbar, c) 100 mbar, d) 110 mbar, e) 130 mbar, f) 140 mbar, g) 150 mbar.
Ab einem Druck von ca. 110 mbar beginnen sich die Blasen nebeneinander anzuordnen. Durch die Druckerhöhung der dispersen Phase ist gleichzeitig eine Zunahme des Blasendurchmessers zu erkennen.
In Figur 5 ist die zeitabhängige Vernetzung des Proteinschaums mithilfe von Durchlichtmikroskopie dokumentiert. Zu Beginn sind monodisperse Schaumzellen zu erkennen, die über einen Zeitraum von 2 Stunden unter Raumtemperatur bei konstanter Evaporation des wässrigen Anteils teilweise koaleszieren und eine stabile Matrix ausbilden. Figur 5a) zeigt den Proteinschaum in der Reaktorkammer nach 12 Minuten. Die Blasen ordnen sich als hexagonal dicht gepackte Kepler-FCC (face centered cubic)-Kugelpackungen an. Figur 5b) zeigt einen Zwischentrocknungsschritt nach 60 Minuten. Nach Trocknung und damit Reduktion der Flüssigfraktion geht die Kugelpackung nach ca. 2 Stunden in eine Anordnung über, die einer Kelvin- BCC (body-centered cubic) Packung ähnelt (Figur 5c)).
Figur 6 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der Grenzflächen der getrockneten Proteinschaumatrix. Die Proteine wurden vor der Vernetzung mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluorescein-5-Isothiocyanat) gemischt, um die aus vernetzten katalytisch aktiven Proteinen bestehenden Grenzflächen sichtbar zu machen.
Figur 7 zeigt eine Aufnahme des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) mit einem konfokalen Laserscan-Mikroskop. An der obersten Schicht der Proteinschäume haben sich u.a. intakte Dünnfilme gebildet. Dunkle Bereiche zeigen die Lamellen zwischen den Blasen, helle Bereiche die Außenseite der Blasen, die mit einem vernetzten Protein-Dünnfilm bedeckt sind (Figur 7a)). Figur 7b) zeigt ein Detail einer Blase, bei der dieser dünne Film aufgrund äußerer Kräfte perforiert ist. Figur 7c) zeigt einen geschlossenen, intakten Dünnfilm.
Figur 8 veranschaulicht die Reaktorleistung verschiedener, katalytisch aktiver Proteinschaumsysteme. Dazu wurde die katalytische Produktivität der katalytisch aktiven Proteinschäume (10) am Beispiel von Enzymschäumen (13) unter Durchflussbedingungen in einem Mikroreaktor getestet und mit bereits publizierten monolithischen Enzymmaterialien (14) („all-enzyme hydrogels", siehe T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028-17032) verglichen (Beispiel 6). Zur Berechnung der spezifischen Raum-Zeit-Ausbeuten (engl. sSTY) wurde die jeweilige Substratumwandlung nach einer Stunde unter kontinuierlichem Betrieb des Reaktors ausgewertet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die spezifischen Raum-Zeit- Ausbeuten der Schaummaterialien (Enzymschäume (13)) die der dicht gepackten monolithischen Enzymmaterialien (14) bis zu 4- fach übertreffen. Die getesteten katalytisch aktiven Proteine sind ausgewählt aus Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro- genase (BsGDH), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp . (S)-imine reductase (GF3546), Halomonas elongata amine transaminase (HEWT).
Figur 9 zeigt die Stabilität des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) anhand der relativen Schaumhöhe in einer Küvette mit und ohne Zusatz von Additiven über einen Zeitraum von > 84 h. Als Additiv wurde 35,4 mM Saponin verwendet.
Figur 10 zeigt den katalytischen Umsatz des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) nach 48 h. Dabei weisen die mittels Tensid stabilisierten Proteinschäume (10) einen 20 % höheren katalytischen Umsatz auf als die nicht stabilisierten Proteinschäume (10).
Figur 11 zeigt Beispiele zur Herstellung der katalytisch aktiven Proteinschäume (10), die aus den Enzymen LbADH/BsGDH bestehen, welche mit den nicht kovalenten Protein/Protein Interaktionsdomänen SH3, PDZ und GBD und deren korrespondierenden Liganden genetisch fusioniert sind. Dabei wird die zeitabhängige Vernetzung des Proteinschaums mithilfe von Durchlichtmikroskopie dokumentiert. Zu Beginn sind monodisperse nasse, das heißt nicht getrocknete, Schaumzellen zu erkennen (obere Bilderreihe), die über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 30 °C in einem Inkubator unter konstanter Luftkonvektion getrocknet werden und eine stabile gleichmäßig vernetzte Matrix ausbilden (untere Bilderreihe).
Figur 12 zeigt den katalytischen Umsatz zum Zeitpunkt t = 30 h von Durchflussbioreaktoren in Abhängigkeit der Trocknungsdauer unter Verwendung des Enzymsystems LbADH/BsGDH, das entweder mithilfe des kovalenten Konnektorpaars SC/ST oder mithilfe des nicht-kovalenten Konnektorpaars der Protein/Protein Interaktionsdomäne SH3 und dem korrespondierenden Liganden verknüpft ist. Während bei einer Trocknungsdauer von zwei Tagen sowohl die kovalente als auch die nicht-kovalente Verknüpfung der Enzyme keine optimalen Umsätze generieren, bewirkt eine verlängerte Trocknung für 28 Tage eine signifikante, ca. 4-fache Verbesserung des katalytischen Umsatzes.
Die katalytisch aktiven Proteinschäume des erfindungsgemäßen Verfahrens können im Bereich der Biotechnologie, Biokatalyse und Mikrofluidik eingesetzt werden. Die Proteinschäume eignen sich insbesondere als trägerfreies, immobilisiertes Material für die Strömungsbiokatalyse, beispielsweise in Durchfluss- Bioreaktoren für kontinuierliche Produktionsprozesse.
Beispiele Beispiel 1:
Struktur und Funktion des Blasengenerators:
Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Blasengene rator (Figur 1) hat als erstes Element einen Einlass für die kontinuierliche Phase (1), die sich in zwei spiegelsymmetrische Pfade aufteilt. Diese treffen von beiden Seiten in einem 45° Winkel auf den Einlasskanal der dispersen Phase (2). Der Kanalquerschnitt ist im hier dargestellten Beispiel über eine Länge von 31,77 mm 400 gm x 100 pm und verjüngt sich kurz vor dem Zusammenführen der beiden Kanäle auf einer Länge 3,59 mm zu einem Querschnitt von 100 pm x 100 pm. Der Kanal der dispersen Phase schneidet den Kanalquerschnitt der kontinuierlichen Phase in dessen Spiegelachse und generiert damit das funktionelle Element der flussfokussierenden Kreuzung (3). Im hier dargestellten Beispiel hat die Kreuzung einen Querschnitt von 100 pm x 100 pm und eine Länge von 31,828 mm. Der vierte Kanal stellt den Auslasskanal (4) für die an der Kreuzung generierten Blasen dar. In dem hier gezeigten Beispiel hat er die Abmessungen 350 pm x 200 pm x 20,23 mm (BxHxL). Die senkrechten Ein- und Auslasskanäle haben einen Durchmesser von 800 pm. Die Ein- und Auslässe des Blasengenerators sind über spezielle pCTW (pchip- to-world)-Konnektoren verbunden. Die Abdichtungen zwischen Chip und Interface werden durch O-Ringe aus NBR 70 sichergestellt. Der pCTW-Konnektor besitzt auf der gegenüberliegenden Seite Anschlüsse für standardisierte Fittings und Schläuche, die wiederum mit den Präzision- Druckreglern verbunden sind.
Als Phasen für die Blasengeneration wurde Stickstoff als Gasphase und als kontinuierliche Phase eine wässrige Lösung katalytisch aktiver, mit den Konnektoren (7) bzw. (8) fusionierter Proteine verwendet. Die Konzentration der Proteinlösung lag in Abhängigkeit von der gewünschten Polymerisierungszeit zwischen 1 pM und 100 mM. Eine Konzentration der Proteinlösung von 1 mM erwies sich als gut geeignet. Die Geschwindigkeiten der kontinuierlichen und dispersen Phase wurden über einen Druckgradienten Dr geregelt. In diesem Beispiel wurde ein Druckgradient von Dr = 330 mbar experimentell für die hier gezeigte Blasengröße bestimmt. Für die Blasengenerierung lag der optimale Druckgradient für die disperse Phase bei Dr = 150 mbar.
Beispiel 2:
Erzeugung eines mikrofluidischen katalytisch aktiven Proteinschaums :
Der katalytisch aktive Proteinschaum wurde mithilfe des in Beispiel 1 und Figur 1 beschriebenen Blasengenerators hergestellt. Dazu wurde eine wässrige Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren (7) fusionierter Proteine und eine wässrige Lösung katalytisch aktiver, mit komplementären Konnektoren (8) fusionierter Proteine in einem stöchiometrischen Verhältnis miteinander gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Lösung an den Blasengenerator angeschlossen. Der Blasengenerator wurde zuerst mit N2 Gas geflutet und konstant durchströmt. Im Anschluss wurde die Proteinlösung mit einer konstanten Flussgeschwindigkeit in die mikrofluidische Einheit eingelassen und an der Kreuzungsdüse (Kreuzung (3)) mithilfe des N2 Gases aufgeschäumt. Das aufgeschäumte Material wurde am Auslass aufgefangen und 100 pL direkt in eine angefertigte Polydimethylsiloxan-Reaktionskammer (5) überführt.
Beispiel 3:
Herstellung von katalytisch aktiven Proteinen mit genetisch fusionierter SpyCatcher bzw. SpyTag-Domäne (Tabelle 1) für die Polymerisation :
Für die heterologe Expression von 6 katalytisch aktiven, mit SpyCatcher bzw. SpyTag fusionierten Proteinen, ausgewählt aus Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro-genase (BsGDH), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp. (S)-imine reductase (GF3546) und Halomonas elongata amine transaminase (HEWT), wurde E. coli BL21 (DE3) mit dem entsprechenden Expressionsvektor mittels Hitzeschocktransformation transformiert. Die frisch transformierten E. coli-Zellen, die die proteincodierenden Plasmide tragen, wurden über Nacht auf LB-Agar-Platten mit 100 pg/ml Ampicillin bei 37 °C selektiert. Flüssigkulturen von 160 ml mit Ampicillin versetztem LB-Medium wurden aus Klonen der LB-Agar-Platten hergestellt und über Nacht für 14-18 Stunden bei 37 °C und 180 U/min in einem 500 ml Schüttelkolben kultiviert. 2 1 ampicillinhaltiges LB-Medium wurde 1:20 mit einer Übernachtkultur beimpft. Die Kulturen wurden bei 37 °C, 180 U/min bis zu einer OD600 von 0,6 kultiviert. Die Temperatur wurde anschließend auf 25 °C gesenkt, IPTG wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben und die Kulturen wurden weitere 16 Stunden inkubiert. Die Kulturen wurden gepoolt und die Zellen durch Zentrifugation (10000xg, 10 min) geerntet und in 60 ml Puffer A (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0) resuspendiert. Nach dem Aufschluss durch Ultraschall wurde das Zelllysat nach Zentrifugation (45000xg, 1 h) gewonnen, durch eine 0,45 pm Durapore PVDF-Membran (Steriflip, Millipore) filtriert und auf zwei in Reihe geschaltete HisTrap FF (5 ml) Ni-NTA-Säulen (GE Healthcare, Deutschland) geladen, die auf einem Äkta Pure Flüssigchromatographie-System (GE Healthcare, Deutschland) montiert waren. Die Säule wurde mit 100 ml Puffer A gewaschen und die 6xHis-getaggten Proteine wurden mit einem Gradienten von 100% Puffer A zu 100% Puffer B (50 mM NaH2PC>4, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol, pH 8,0) über ein Volumen von 200 ml eluiert. Anschließend wurde der Puffer mit Vivaspin 10000 MWCO (GE Healthcare) gegen einen geeigneten Lagerpuffer ausgetauscht. Die genetischen Konstruktionen wurden mit der isothermen Rekombination (D. G. Gibson et al., Nat Methods. 2009, 6, 5, 343-345) unter Verwendung von Oligonucleotidprimern mit 30 bp (Basenpaaren) homologen Überlappungen durchgeführt. Nach dem Zusammenbau wurden die Reaktionsgemische mit dem Restriktionsenzym Dpnl behandelt, um alle verbliebenen Vektoren aus früheren PCR-Reaktionen zu entfernen, und dann in E. coli DH5 Zellen transformiert. Alle Plasmide wurden mit ZR Plasmid Miniprep-Classic (Zymo Research, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt und die Sequenz durch kommerzielle Sequenzierung (LGC genomics, Deutschland) verifiziert. Tabelle 1: DNA-Sequenzen für die heterologe Expression katalytisch aktiver, mit SpyCatcher bzw. SpyTag oder mit den nichtkovalenten Protein/Protein Interaktionsdomänen SH3, PDZ und GBD und deren korrespondierenden Liganden fusionierter Proteine (SC = SpyCatcher-Domäne; ST bzw. ST2 = SpyTag-Domänen; SH3-, PDZ- bzw. GBD-BD = SH3-, PDZ- bzw. GBD-Bindedomäne; SH3-, PDZ- bzw. GBD-L = SH3-, PDZ- bzw. GBD-Ligand. WO 2022/022850 PCT/EP2021/025233
GATGTTCGTGTGAATACCGTTCATCCGGGTTATATCAAAACACCGCTG
GTTGATGATCTGCCTGGTGCCGAAGAAGCAATGAGCCAGCGTACCAAA
ACCCCGATGGGTCATATTGGTGAACCGAATGATATTGCCTATATCTGT
GTTTATCTGGCCAGCAACGAAAGTAAATTTGCAACCGGTAGCGAATTT
GTTGTGGATGGTGGTTATACCGCACAGTAA
Beispiel 4:
In Beispiel 4 wurden monodisperse Blasen mittels des Blasengenerators aus Figur 1 unter Variation des Druckes der dispersen Phase hergestellt ((Figur 4). Der Druck der kontinuierlichen Phase wurde dabei konstant auf p = 330 mbar gehalten. Der Druck der dispersen Phase entsprach a) 80 mbar, b) 90 mbar, c) 100 mbar, d) 110 mbar, e) 130 mbar, f) 140 mbar, g) 150 mbar. Ab einem Druck von ca. 110 mbar begannen die
Blasen sich nebeneinander anzuordnen. Durch die Druckerhöhung der dispersen Phase war gleichzeitig eine Zunahme des Blasendurchmessers zu erkennen. Beispiel 5:
In Beispiel 5 wurde die zeitabhängige Vernetzung des Proteinschaums mithilfe von Durchlichtmikroskopie demonstriert. Zu Beginn der Vernetzungsreaktion waren in der Reaktionskammer (5) monodisperse Schaumzellen zu erkennen, die über einen Zeitraum von 2 Stunden unter Raumtemperatur bei konstanter Evaporation des wässrigen Anteils teilweise koaleszierten und eine stabile Matrix ausbildeten. Nach 12 Minuten Vernetzungszeit in der Reaktorkammer ordneten sich die Blasen als hexagonal dicht gepackte Kepler-FCC (face centered cubic)-Kugelpackungen an (Figur 5a). Nach einem Zwischentrocknungsschritt nach 60 Minuten (Figur 5b) ging die Kugelpackung nach 120 min in eine Anordnung über, die einer Kelvin-BCC (body-centered cubic) Packung ähnelte (Figur 5c).
Beispiel 6:
In Beispiel 6 wurde die katalytische Produktivität des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) am Beispiel von Enzymschäumen (13) unter Durchflussbedingungen in einem Mikroreaktor getestet (Figur 8). Die Reaktorleistung wurde mit der Reaktorleistung bereits publizierter monolithischer Enzymmaterialien (14), den „all-enzyme hydrogels" (T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028-17032) verglichen (Figur 8). Zur Berechnung der spezifischen Raum-Zeit-Ausbeuten (sSTY) wurde die jeweilige Substratumwandlung nach einer Stunde unter kontinuierlichem Betrieb des Reaktors ausgewertet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die spezifischen Raum-Zeit-Ausbeuten (engl. sSTY) der Schaummaterialien (Enzymschäume (13)) die der dicht gepackten monolithischen Enzymmaterialien (14) bis zu 4-fach übertreffen (Figur 8). Die getesteten Proteine sind ausgewählt aus Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro-genase (BsGDH), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp . (S)-imine reductase (GF3546), Halomonas elongata amine transaminase (HEWT).
Unter Verwendung des Enzyms EsPAD wurde das Substrat p- Cumarsäure mit einer Substratkonzentration von 5 mM zu 4- Vinylphenol umgesetzt (E. Mittmann et al., Micromachines 2019, 10, 795). Unter Verwendung des Enzymsystems LbADH/BsGDH wurde unter Regenerierung des Kofaktors NADPH 5-Nitrononan-2,8-dion mit einer Konzentration von 5 mM zu den entsprechenden (R)- Hydroxyketonen und (R,R)-Diol umgesetzt (T. Peschke et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2018, 57, 52, 17028-17032). Unter Verwendung des Enzymsystems Gre2p/BsGDH wurde unter Regenerierung des Kofaktors NADPH 5-Nitrononan-2,8-dion mit einer Konzentration von 5 mM zu den entsprechenden (S)- Hydroxyketonen und (S,S)-Diol umgesetzt (P. Bitterwolf P. et al., Chemical Science 2019, 10, 9752). Unter Verwendung des
Enzymsystems GF3546/BsGDH wurde unter Regenerierung des Kofaktors NADPH 3,4-Dihydroisoquinolin mit einer Konzentration von 5 mM zu 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinolin umgesetzt (P. Bitterwolf P. et al., Micromachines 2019, 10, 11, 783). Unter Verwendung des Enzyms HEWT wurde 4-Nitrobenzaldehyd mit einer Konzentration von 1 mM zu 4-Nitrobenzylamin umgesetzt.

Claims

Patentansprüche
1.Verfahren zur Herstellung katalytisch aktiver Proteinschäume, umfassend die Schritte
A) Herstellung katalytisch aktiver, mit einem Konnektor (7) fusionierter Proteine sowie katalytisch aktiver, mit einem zum Konnektor (7) komplementären Konnektor (8) fusionierter Proteine;
B) Herstellung von katalytisch aktive Proteine enthaltenden Blasen in einem Blasengenerator unter Einsatz einer Gasphase und einer Lösung der katalytisch aktiven, mit dem Konnektor (7) fusionierten Proteine und der katalytisch aktiven, mit dem Konnektor (8) fusionierten Proteine aus Schritt A);
C) Überführen der in Schritt B) hergestellten Blasen in eine Reaktionskammer (5);
D) Kupplung der in den Blasen enthaltenen katalytisch aktiven Proteine aus Schritt B) in der Reaktionskammer (5) unter Ausbildung eines katalytisch aktiven Proteinschaums (10).
2.Verfahren nach Anspruch 1, wobei zur Herstellung eines Monoenzymschaums in der Lösung des Schrittes B) das katalytisch aktive Protein (6), das mit dem Konnektor (7) fusioniert ist, identisch ist mit dem katalytisch aktiven Protein (6), das mit dem Konnektor (8) fusioniert ist oder wobei zur Herstellung eines Bi-Enzymschaums das katalytisch aktive Protein (6), das mit dem Konnektor (7) fusioniert ist, verschieden ist von dem zweiten katalytisch aktiven Protein (6), das mit dem Konnektor (8) fusioniert ist.
3.Verfahren nach Anspruch 1, wobei zur Herstellung eines Bi- Enzymschaums unter Einsatz zweier orthogonaler Konnektor- Paare die Lösung des Schrittes B) ein erstes katalytisch aktives Protein (6), das mit einem ersten Konnektor (7) bzw. (8) fusioniert ist, und ein zweites, vom ersten katalytisch aktiven Protein (6) verschiedenes katalytisch aktives Protein (6), das mit einem zweiten Konnektor (7) bzw. (8) fusioniert ist, enthält, wobei die ersten Konnektoren (7) und (8) das erste Konnektor-Paar und die zweiten Konnektoren
(7) und (8) das zweite Konnektor-Paar bilden.
4.Verfahren nach Anspruch 1, wobei zur Herstellung eines Multi-Enzymschaums unter Einsatz mindestens dreier orthogonaler Konnektor-Paare die Lösung des Schrittes B) mindestens drei verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) enthält, die jeweils mit einem Konnektor (7) bzw. (8) fusioniert sind, wobei die jeweiligen Konnektoren (7) und
(8) jeweils ein Konnektor-Paar bilden.
5.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die katalytisch aktiven, mit einem Konnektor (7) fusionierten Proteine sowie die katalytisch aktiven, mit dem Konnektor (8) fusionierten Proteine heterolog exprimiert werden und die Konnektoren ein genetisch-fusionierter Teil der Proteine sind.
6.Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Konnektoren (7) bzw.
(8) Peptid-Tags sind.
7.Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, wobei katalytisch aktive Proteine (6) heterolog exprimiert werden und die Konnektoren (7) und (8) nachträglich chemisch an die katalytisch aktiven Proteine (6) gebunden werden.
8.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der katalytisch aktive Proteinschaum (10) nach Schritt D) in einem Schritt E) getrocknet wird.
9.Verfahren nach Anspruch 8, wobei mit dem in Schritt E) getrockneten, katalytisch aktiven Proteinschaum (10) in der Reaktionskammer (5) in einem Flüssigkeitsstrom mindestens ein Substrat (11) zu mindestens einem Produkt (12) umgesetzt wird .
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die katalytisch aktiven Proteine (6) Enzyme sind.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Enzyme ausgewählt sind aus Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro-genase (BsGDH),
Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD),
Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp. (S)-imine reductase (GF3546), Halomonas elongata amine transaminase (HEWT).
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in Schritt B) hergestellten Blasen einen Durchmesser von 5 - 1500 gm haben und die Porengröße der Blasen zwischen 10 und 2000 gm liegt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die vernetzten Proteindünnfilme auf den Blasen des in Schritt D) hergestellten katalytisch aktiven Proteinschaums (10) eine Schichtdicke von 0,1 - 200 pm, bevorzugt eine
Schichtdicke von 1 - 60 pm aufweisen.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der katalytisch aktive Proteinschaum (10) durch Additive stabilisiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei als Additiv ein Tensid verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dem katalytisch aktiven Proteinschaum (10) Verbundmateria lien zugesetzt werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Verbundmaterialien ausgewählt sind aus DNA-Silica-Nanokompositmaterialien oder DNA-Silica-Nanokompositmaterialien, die zusätzlich Kohlen stoffnanoröhren umfassen.
18. Katalytisch aktiver Proteinschaum (10), hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
19. Verwendung des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) nach Anspruch 18 für die Biokatalyse.
20. Verwendung des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) nach Anspruch 19 als trägerfreies, immobilisiertes Material für die Strömungsbiokatalyse in Durchfluss-Bioreaktoren.
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