EP4045634A1 - Cellule souche humaine genetiquement modifiee exprimant une proteine cytochrome p450 2b6 humaine mutante et son utilisation dans le traitement du cancer - Google Patents

Cellule souche humaine genetiquement modifiee exprimant une proteine cytochrome p450 2b6 humaine mutante et son utilisation dans le traitement du cancer

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Publication number
EP4045634A1
EP4045634A1 EP20792611.4A EP20792611A EP4045634A1 EP 4045634 A1 EP4045634 A1 EP 4045634A1 EP 20792611 A EP20792611 A EP 20792611A EP 4045634 A1 EP4045634 A1 EP 4045634A1
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EP
European Patent Office
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chromosome
site
cancer
human stem
genetically modified
Prior art date
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Pending
Application number
EP20792611.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Isabelle De Waziers
Philippe Beaune
Marc Sapoval
Olivier Pellerin
Benjamin NAYAGOM
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Assistance Publique - Hôpitaux de Paris
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Sorbonne Université
Université Paris Cité
Original Assignee
Assistance Publique - Hôpitaux de Paris
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Sorbonne Université
Université Paris Cité
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Assistance Publique - Hôpitaux de Paris, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Sorbonne Université, Université Paris Cité filed Critical Assistance Publique - Hôpitaux de Paris
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Pending legal-status Critical Current

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    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y106/02—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
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    • C12Y114/14—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced flavin or flavoprotein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.14)
    • C12Y114/14001—Unspecific monooxygenase (1.14.14.1)
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified human stem cell, wherein said human stem cell comprises an exogenous nucleic acid comprising a region encoding a fusion protein comprising a mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No.1 or a variant or a fragment thereof and a NADPH-cytochrome P450 reductase protein of SEQ ID No. 2 or a variant or a fragment thereof, operably linked to a promoter, said exogenous nucleic acid having been integrated into one of the safe harbor genes of said human stem cell.
  • the invention also relates to the use of said cell for the treatment of cancer, in particular solid tumors, and in particular hepatocellular carcinomas.
  • liver cancer accounts for more than 841,080 new cases per year, 90% of which are hepatocellular carcinomas.
  • Hepatocellular carcinoma is the third leading cause of cancer death worldwide.
  • Chronic infection with hepatitis C (HCV) and hepatitis B (HBV) viruses or alcoholic cirrhosis are the main causes of hepatocellular carcinoma.
  • HCV hepatitis C
  • HBV hepatitis B
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • Treatment of hepatocellular carcinoma is essential, otherwise it will lead to death.
  • Stages 0 and A (15% of patients) define patients with a disease diagnosed early, in good general condition and carrying a hepatocellular carcinoma of less than 3cm. These patients are eligible only for curative treatments, namely tumor resection surgery and liver transplantation. The 5-year survival is 60%.
  • Stage B (intermediate) concerns patients whose general condition is preserved but presenting one or more hepatocellular carcinoma (s) whose size exceeds 3 cm, without invasion of the portal trunk or metastases. These patients may benefit from hepatic doxorubicin chemoembolization. The median survival of these patients is 20 months.
  • Stage C defines a patient with hepatocarcinoma with portal invasion, lymph node and pulmonary metastases associated with a moderate deterioration in his general condition.
  • Sorafenib an antiangiogenic multikinase inhibitor administered orally, marketed under the name Nexavar® by Onyx / Bayer. In these patients the median survival is 11 months.
  • Other second-line treatments have recently been approved. These are Regorafenib (kinase inhibitor) marketed under the name Stivarga® by Bayer and Nivolumab (anti-PD1 antibody) marketed under the name Opdivo®, by BMS. All of these treatments have limited efficacy and are responsible for major side effects (diarrhea, weight loss, hand-foot syndrome and hypophosphatemia, high blood pressure) often causing poor compliance with treatment leading to suboptimal results.
  • Stage D concerns patients who have reached the palliative stage for which only supportive care can be offered.
  • the inventors have developed a new genetically modified human stem cell capable of metabolize cyclophosphamide and induce immunological death of tumor cells by eliciting a strong anti-tumor immune response.
  • the present invention relates to a genetically modified human stem cell, wherein said human stem cell comprises an exogenous nucleic acid comprising a region encoding a fusion protein comprising a mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No .1 or a variant or a fragment thereof, a NADPH-cytochrome P450 reductase protein of SEQ ID No. 2 or a variant or a fragment thereof, operably linked to a promoter, said exogenous nucleic acid which has been integrated into a safe harbor gene of said human stem cell and characterized in that said genetically modified human stem cell is not an embryonic human stem cell.
  • CYP2B6 * mutant human cytochrome P450 2B6 protein
  • the human stem cell is chosen from mesenchymal stem cells (hMSC), induced pluripotent stem cells (iPSC) and induced mesenchymal stem cells (iMSC).
  • hMSC mesenchymal stem cells
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • iMSC induced mesenchymal stem cells
  • the promoter used is a constitutive promoter, preferably the EF1- ⁇ promoter.
  • the exogenous nucleic acid further comprises a selection marker gene.
  • the present invention also relates to a method of obtaining the genetically modified human stem cell, said human stem cell was obtained by retroviral transduction with a viral vector comprising exogenous nucleic acid.
  • the present invention also relates to the human stem cell genetically modified for its use as a medicament and its formulation in a form suitable for its administration by the transarterial route.
  • the present invention also relates to a method for selecting genetically modified stem cells comprising the steps of a) transducing human stem cells with a viral vector comprising exogenous nucleic acid, b) culturing human stem cells in a culture medium predefined, c) selection of genetically modified human stem cells expressing the selection marker gene at their membrane surface.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the genetically modified human stem cell as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient and optionally at least one second active principle, in particular an anti-cancer agent, said pharmaceutical composition being in a form. suitable for its administration by the transarterial route.
  • the invention also relates to a genetically modified human stem cell or pharmaceutical composition for its use in the prevention and / or treatment of cancer and / or cancer recurrences and / or associated metastases, preferably solid tumors, preferably them. hepatocellular carcinomas and / or associated metastases.
  • the subject of the present invention is therefore a genetically modified human stem cell, in which said human stem cell comprises an exogenous nucleic acid comprising a region encoding a fusion protein comprising a mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No .1 or a variant or a fragment thereof, a NADPH-cytochrome P450 reductase protein of SEQ ID No. 2 or a variant or a fragment thereof, operably linked to a promoter, said exogenous nucleic acid having been integrated into a safe harbor gene of said human stem cell and characterized in that said genetically modified human stem cell is not an embryonic human stem cell.
  • CYP2B6 * mutant human cytochrome P450 2B6 protein
  • the inventors have surprisingly shown that the integration of the exogenous nucleic acid into a safe harbor gene is essential for the genetically modified human stem cell to be able to metabolize cyclophosphamide (CPA) and thus induce immunological death. tumor cells.
  • CPA cyclophosphamide
  • this integration of exogenous nucleic acid into a safe harbor gene allows the genetically modified human stem cell to maintain its morphology and doubling time.
  • the inventors have shown that a single copy of the exogenous nucleic acid is integrated into a safe harbor gene.
  • the inventors have also shown that the use of genetically modified human stem cells according to the invention allows the complete eradication of solid tumors as well as protection by a vaccine effect against recurrences and metastases.
  • the human stem cell is chosen from mesenchymal stem cells (hMSC), induced pluripotent stem cells (iPSC) and induced mesenchymal stem cells (iMSC).
  • hMSC mesenchymal stem cells
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • iMSC induced mesenchymal stem cells
  • mesenchymal stem cells or “hMSC” or “human mesenchymal stem cells” denotes multipotent stem cells capable of differentiating in particular into osteoblasts, chondrocytes, myocytes and adipocytes.
  • Mesenchymal stem cells are found in the mesenchyme, the part of the embryonic mesoderm made up of spindle-shaped or stellate cells, not loosely packed.
  • mesenchymal stem cells include, without limitation, CD34-negative stem cells.
  • human mesenchymal stem cells are isolated from adipose tissue and / or bone marrow.
  • induced pluripotent stem cells or “iPSC” or “human induced pluripotent stem cells” denotes a type of cell. pluripotent strain similar to an embryonic stem cell but which is created when somatic cells (e.g. adult) are reprogrammed to enter a state similar to that of an embryonic stem cell by maintaining the expression of factors important for the maintenance of "pluripotency" of embryonic stem cells (also called CSE or PSC), ie their capacity to be able to engage in different differentiation pathways. Such factors can include certain embryonic genes (such as the OCT4, SOX2 and LF4 transgenes).
  • pluripotent refers to a cell or cell line capable of differentiating into any differentiated cell type, for example, an ability to grow in all three germ layers of the organism's development. , especially endoderm, mesoderm and ectoderm.
  • induced mesenchymal stem cells or “iMSC” or “human induced mesenchymal stem cells” denotes mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells (iPSC).
  • the human stem cell is a mesenchymal stem cell (hMSC). In another particular embodiment of the invention, the human stem cell is an induced pluripotent stem cell (iPSC). In another particular embodiment of the invention, the human stem cell is an induced mesenchymal stem cell (iMSC).)
  • hMSC mesenchymal stem cell
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • iMSC induced mesenchymal stem cell
  • exogenous nucleic acid denotes a nucleic acid not naturally present in the human stem cell according to the invention.
  • the exogenous nucleic acid can be genomic DNA, cDNA, DNAs which are natural or obtained totally or partially by chemical synthesis. According to one embodiment of the invention, the exogenous nucleic acid is of therapeutic interest.
  • the exogenous nucleic acid comprises a region encoding a fusion protein comprising a mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No.1 or a variant or a fragment thereof, a NADPH-cytochrome P450 reductase protein of SEQ ID No.2 or a variant or a fragment thereof.
  • CYP2B6 * mutant human cytochrome P450 2B6 protein
  • the human cytochrome P450 2B6 protein is a mutant human cytochrome P450 2B6 protein, also called CYP2B6 * , of SEQ ID No. 1 or a variant or a fragment thereof, in which said variant or said fragment comprises residues 114V, 199M and 477W as represented in the amino acid sequence SEQ ID No.1.
  • said variant or fragment retains a biological activity of a protein having the amino acid sequence SEQ ID No.1.
  • the amino acid sequence of the human wild-type cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 WT) is represented by the sequence SEQ ID No.3.
  • the mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) has an affinity for CPA more than 8 times greater than that of the wild-type protein (CYP2B6 WT), while retaining the same Vmax, in particular due to the fact 1114V, L199M and V477W substitutions as shown in SEQ ID No. 1.
  • the variants and fragments of the amino acid sequence SEQ ID No.1 are included within the scope of the invention.
  • mutant human cytochrome P450 2B6 proteins, variants and fragments of the invention as described here retain Val at the position corresponding to residue 114 of the amino acid sequence SEQ ID No.1, Met at the position corresponding to residue 199 of the amino acid sequence SEQ ID No.1 and Trp at the position corresponding to residue 477 of the amino acid sequence SEQ ID No.1.
  • amino acid sequence of the wild-type NADPH-cytochrome P450 reductase protein (NADPH WT) is represented by the sequence SEQ ID No.2.
  • Variants and Fragments of the NADPH-cytochrome P450 reductase protein of amino acid sequence of SEQ ID No.2, described below, also fall within the scope of the invention.
  • Variants of the proteins can be natural variants, such as splice variants, alleles and isoforms, or they can be produced by recombinant means.
  • Variations in the amino acid sequence can be introduced by substitution, deletion or insertion of one or more codons in the nucleic acid sequence encoding the protein, resulting in a modification of the amino acid sequence of the protein. protein.
  • the variation can be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 amino acids or more with any other amino acid.
  • the variation can be introduced by addition or deletion of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20 or more amino acids within the protein.
  • Amino acid substitutions can be conservative or non-conservative.
  • the substitutions are conservative substitutions, in which one amino acid is substituted for another amino acid having similar structural and / or functional and / or chemical properties. Examples of conservative substitutions are listed below:
  • Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; To the; norleucine.
  • Variants of the proteins can include proteins which have at least about 80% amino acid sequence identity with a polypeptide sequence described herein.
  • a protein variant will have at least about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% amino acid sequence identity with a complete amino acid sequence or a fragment of an amino acid sequence of SEQ ID No.1 and / or SEQ ID No.2.
  • the identity of the amino acid sequence is defined as the percentage of amino acid residues of the variant sequence that are identical to the amino acid residues of the reference sequence, after sequence alignment and introduction, if applicable. , gaps in order to achieve the maximum percentage sequence identity, and not to consider conservative substitutions within the framework of the sequence identity.
  • the identity of the sequence can be determined over the entire length of the variant sequence, over the entire length of the reference sequence, or both.
  • the methods of sequence alignment and sequence identity determination are well known in the art, for example, using publicly available software such as BioPerl, BLAST, BLAST-2, CS-BLAST, FASTA, ALIGN, ALIGN-2, LALIGN, Jaligner, matcher or Megalign software (DNASTAR).
  • fragments of the proteins and the variants of proteins described in the present application are also encompassed by the invention.
  • Such fragments may be truncated at the N-terminus or at the C-terminus, or may lack internal amino acid residues outside the N-terminus and C-terminus, for example, relative to a full length protein.
  • Some fragments lack amino acid residues which are not essential for enzymatic activity.
  • said fragments are at least approximately 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 amino acids or more in length.
  • Preferred fragments of the proteins described herein include all or part of the active site.
  • Preferred fragments of the mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) comprise or consist of amino acids 1 to 490 of the full length sequence SEQ ID No.1.
  • Preferred fragments of NADPH-cytochrome P450 reductase protein comprise or consist of fragments comprising or consisting of amino acids 60 to 680 of the amino acid sequence SEQ ID No.2.
  • the variants and fragments of the invention preferably retain a biological activity of the complete protein.
  • the variants and fragments of the human cytochrome P450 2B6 protein advantageously have an oxidative activity of a substrate such as cyclophosphamide (CPA), or of another substrate, in particular by catalyzing the hydroxylation to 4-OH- CPA.
  • a substrate such as cyclophosphamide (CPA)
  • CPA cyclophosphamide
  • said variants and fragments have an affinity for cyclophosphamide (CPA) greater than that of the human cytochrome P450 2B6 protein of sequence SEQ ID No.3, preferably at least 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9 or 10 times that of the wild type sequence.
  • CPA cyclophosphamide
  • said variants and fragments have an affinity for CPA which is identical, substantially identical or greater than that of the mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No.1.
  • Methods for assaying said activity and this affinity are well known to those skilled in the art and are described in particular in Nguyen et al., Mol Pharmacol, 2008, 73: 1 122-1 133.
  • the variants and fragments of the NADPH-cytochrome P450 reductase protein preferably have cytochrome c-reducing activity, preferably in a NADPH-dependent manner.
  • said variants and fragments have an activity identical to, substantially greater than or equal to that of the full-length NADPH-cytochrome P450 reductase protein (SEQ ID No. 2).
  • Methods of assaying this activity are well known to those skilled in the art and are described in particular in Yasukochi et al; Arch Biochem Biophys, 1980, 202: 491-498.
  • Those skilled in the art will be able to determine which amino acid residues can be inserted, substituted or deleted without harming the activity of the protein using the knowledge of the structure of the protein available in the art and techniques. molecular modeling available to the public (see for example Nguyen et al. Mol Pharmacol 2008, 73: 1122-1133).
  • the variation allowed can be determined by systematically making insertions, deletions or substitutions of amino acids in the sequence and testing the resulting variants for the activity displayed against the wild-type protein.
  • fusion protein denotes a chimeric protein created by joining two or more genes encoding distinct proteins or fragments of proteins, such as different protein domains, in a single reading frame encoding. a single translated protein.
  • the fusion protein of the present invention preferably comprises:
  • CYP2B6 * a mutant human cytochrome P450 2B6 protein of SEQ ID No.1 or a variant or a fragment thereof
  • NADPH-cytochrome P450 reductase protein of SEQ ID No. 2 or a variant or a fragment thereof as described above.
  • said fusion protein of sequence SEQ ID No.4 comprises:
  • SEQ ID No.4 (fusion protein):
  • the mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No.1 or a variant or a fragment thereof may be upstream or downstream of the NADPH-cytochrome P450 reductase protein of SEQ ID No.2 or a variant or a fragment thereof.
  • the mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No.1 or a variant or a fragment thereof is upstream of the NADPH-cytochrome P450 reductase protein of SEQ ID No.2 or a variant or a fragment thereof.
  • proteins of the invention should be understood as encompassing said fusion proteins.
  • the proteins or fragments of proteins constituting the fusion protein can be separated by a peptide linker sequence or a spacer.
  • the peptide binding sequence also called a "linker” or the spacer, also called a “spacer”
  • the peptide linker sequence or the spacer may include an enzymatic cleavage site to allow the polypeptide components to be separated by enzymatic digestion.
  • the peptide linker sequence or the spacer can be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or more amino acids.
  • the linking peptide sequence or spacer is less than 10, less than 9, less than 8, less than 7, less than 6 or less than 5 amino acids in length.
  • a peptide linker or spacer sequence for use in the fusion proteins of the present invention include (Ser) n Thr, where "n" is an integer, preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 or 9. In a preferred embodiment, "n” is 5. In another preferred embodiment, "n” is 3.
  • the term “safe harbor gene” or “safe harbor” denotes a region of the genome where it is possible to integrate genetic material without disturbing the function, transcription and regulation of the native coding sequences, as well as the gene structure. A “safe harbor” allows sufficient expression of the exogenous nucleic acid without predisposing the human stem cell according to the invention to malignant transformation or altering its function.
  • the exogenous nucleic acid is integrated into a safe harbor gene.
  • the exogenous nucleic acid is integrated into the safe harbor gene chosen from: the AAVS1 site of chromosome 19, the CCR5 site of chromosome 3, the hROSA26 site of chromosome 3, the 323 site of chromosome 1, site 325 of chromosome 8, site 289 of chromosome 1, site 227 of chromosome 1, site 229 of chromosome 2, site 253 of chromosome 2, site 255 of chromosome 5, site 257 of chromosome 7, site 259 of chromosome 14, site 261 of chromosome 17, site 263 of X chromosome, site 317 of chromosome 2, site 303 of chromosome 2, site 331 of chromosome 3, site 283 of chromosome 4, site 231 of chromosome 4, site 315 of chromosome 5, site 327 of chromosome 5, site 305 of chromos
  • the promoter to which is operably linked the region encoding a fusion protein comprising a mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No.1 or a variant or a fragment thereof, a NADPH-cytochrome P450 reductase protein of SEQ ID No.2 or a variant or fragment thereof is a constitutive promoter.
  • the constitutive promoter can be chosen from the CMV promoter, the CBA promoter and the EF1-a promoter.
  • the constitutive promoter is the EF1-a promoter.
  • the exogenous nucleic acid further comprises a selection marker gene.
  • selection marker gene means a coding sequence for a selectable marker protein, which allows the selective retention of human stem cells which have integrated the exogenous nucleic acid during the culture and propagation of the cells.
  • the selection marker gene is the CD34 gene, advantageously the CD34 gene which has undergone splicing, also called the spliced CD34 gene.
  • the selection marker gene is the spliced CD34 gene of sequence SEQ ID No. 5:
  • SEQ ID No. 5 (Spliced CD34 selection marker gene):
  • the use of the spliced CD34 gene allows selection of human stem cells that have integrated exogenous nucleic acid without having signal transduction activity.
  • the spliced CD34 selection marker gene is operably linked to a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 6 encoding peptide 2A.
  • the spliced CD34 selectable marker gene is operably linked to a nucleic acid encoding peptide 2A and is represented by the nucleic acid sequence SEQ ID No.7.
  • SEQ ID No. 7 (Spliced CD34 selection marker gene - peptide 2A):
  • Another object of the invention relates to an expression vector, for example a viral vector, comprising the exogenous nucleic acid as defined above.
  • the term “vector” denotes a polynucleotide sequence containing exogenous nucleic acid as defined above and control sequences in functional bond, so that the human stem cells transformed with these sequences are capable of producing the encoded proteins, in particular the fusion protein comprising a mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No.1 or a variant or a fragment thereof and a NADPH-cytochrome P450 reductase protein of SEQ ID No .2 or a variant or a fragment thereof.
  • CYP2B6 * mutant human cytochrome P450 2B6 protein
  • the human stem cell has been obtained by retroviral transduction with a viral vector comprising exogenous nucleic acid.
  • the vector generally comprises a promoter, signals for initiation and termination of translation, as well as appropriate regions for the regulation of transcription.
  • the vector comprises a nucleic acid of SEQ ID No. 8 comprising: - exogenous nucleic acid comprising a region encoding a fusion protein comprising a mutant human cytochrome P450 2B6 protein (CYP2B6 * ) of SEQ ID No.1 or a variant or a fragment thereof and a NADPH-cytochrome P450 protein reductase of SEQ ID No.2 or a variant or a fragment thereof as defined above, and
  • the selection marker gene operably linked to a nucleic acid encoding the 2A peptide as defined above.
  • SEQ ID No 8 vectorized nucleic acid
  • the vector used is a lentiviral vector, advantageously the lentiviral vector pLenti-l I l-EF 1 a, sold by the company Applied Biological Materials Inc.
  • the vector is stably maintained in the human stem cell and may optionally possess particular signals which specify the secretion of the translated protein. These different elements are chosen and optimized by those skilled in the art depending on the host cell used. Such vectors are prepared by methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into the appropriate human stem cell by standard methods, such as lipofection, electroporation, the use of agents. polycationic, thermal shock, or chemical methods.
  • the exogenous nucleic acid can be introduced by various methods into one of the safe harbor genes, in particular using effector nucleation techniques of the transcription activator type (TALEN ), grouped into techniques of regularly spaced short palindromic repeats (CRISPR / Cas9) or zinc finger nucleases (ZFN).
  • TALEN transcription activator type
  • CRISPR / Cas9 regularly spaced short palindromic repeats
  • ZFN zinc finger nucleases
  • the integration of the exogenous nucleic acid into a safe harbor gene is obtained by using regularly grouped short palindromic repeats (CRISPR / Cas9).
  • CRISPR is a microbial nuclease system involved in the defense against invading phages and plasmids.
  • CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR associated genes (Cas) as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of CRISPR-induced nucleic acid cleavage (sgRNA).
  • Cas CRISPR associated genes
  • sgRNA CRISPR-induced nucleic acid cleavage
  • Three types (l-lll) of CRISPR systems have been identified on a wide range of bacterial hosts.
  • a key feature of each CRISPR locus is the presence of an array of repetitive sequences (direct repeats) interspersed with short sequences of non-repeating sequences (spacers).
  • the non-coding CRISPR template is transcribed and cleaved within direct short rRNA repeats containing individual spacer sequences, which direct Cas nucleases to the target site (protospacer).
  • Type II CRISPR is one of the best characterized systems and performs targeted double stranded DNA breakage in four sequential steps.
  • Third, the mature tRNA: tracrRNA complex directs Cas9 on the target DNA via Watson-Crick base pairing between the spacer on the rRNA and the protospacer on the target DNA, next to the adjacent protospracer motif. (PAM), an additional requirement for target recognition.
  • PAM protospracer motif
  • Cas9 is involved in the cleavage of the target DNA in order to create a double-stranded break in the protospacer.
  • Cas9 is therefore the characteristic protein of the CRISPR-Cas type II system and a large monomeric DNA nuclease guided to a DNA target sequence adjacent to the PAM sequence motif (protospacer adjacent motif) by a complex of two non-coding RNAs: CRIPSR RNA (RRNA) and transactivating rRNA (tracrRNA).
  • RRNA CRIPSR RNA
  • tracrRNA transactivating rRNA
  • the HNH nuclease domain cuts the complementary DNA strand while the RuvC-like domain cuts the non-complementary strand and therefore a blunt cut is introduced into the target DNA.
  • Heterologous expression of Cas9 with sgRNA can introduce site-specific double-stranded breaks (DSBs) into the genomic DNA of living cells of various organisms. For applications in eukaryotic organisms, codon optimized versions of Cas9, which is native to the bacterium Streptococcus pyogenes, have been used.
  • Single-guide RNA sgRNA is the second component of the CRISPR / Cas system that forms a complex with Cas9 nuclease.
  • SgRNA is a synthetic RNA chimera created by the fusion of cRNA and tracrRNA.
  • the gRNA guide sequence located at the 5 'end confers specificity to the DNA target. Therefore, by modifying the guide sequence, it is possible to create sgRNAs with different target specificities.
  • the canonical length of the guide sequence is 20 bp.
  • Cas9 expression vectors for use in the methods of the invention can be constructed as described in the art.
  • Another subject of the invention relates to the genetically modified human stem cell as defined above for its use as a medicament.
  • the The present invention relates to the genetically modified human stem cell as defined above for its use in the prevention and / or treatment of cancer and / or cancer recurrences and / or associated metastases.
  • the cancer is a cancer chosen from: cancers affecting the central nervous system, such as astrocytomas and gliomas; cancers of the upper aerodigestive tract (ENT), such as cancer of the lips, cancer of the oral cavity, cancer of the oropharynx and cancer of the nasopharynx; cancers of the endocrine glands, such as thyroid cancer, adrenal gland cancer, and extra-digestive and pulmonary neuroendocrine tumors; cancers of the exocrine glands, such as breast cancer and pancreatic cancer; cancers affecting the chest, such as cancer of the pleura and lung cancer; digestive cancers, such as cancer of the esophagus, cancer of the stomach, cancer of the small intestine, cancer of the colon, and cancer of the rectum and / or anal canal; genital cancers, such as prostate cancer, cervical cancer, endometrial cancer, vaginal cancer, and cancer of the vulva; urinary cancers, such as kidney cancer and bladder cancer; sar
  • the invention relates to the genetically modified human stem cell as defined above for its use in the prevention and / or treatment of solid tumors, and in particular hepatocellular carcinomas, and / or cancer recurrences and / or metastases. associated.
  • the genetically modified human stem cell according to the invention is particularly useful for preventing and / or treating cancer and / or cancer recurrences and / or associated metastases.
  • the genetically modified human stem cell according to the invention is particularly useful for preventing and / or treating solid tumors and / or cancer recurrences and / or associated metastases.
  • the genetically modified human stem cell according to the invention is particularly useful for preventing and / or treating cancer and / or cancer recurrences and / or associated metastases chosen from: cancers affecting the central nervous system, such as astrocytomas and gliomas; cancers of the upper aerodigestive tract (ENT), such as cancer of the lips, oral cavity cancer, oropharyngeal cancer and nasopharyngeal cancer; cancers of the endocrine glands, such as thyroid cancer, adrenal gland cancer, and extra-digestive and pulmonary neuroendocrine tumors; cancers of the exocrine glands, such as breast cancer and pancreatic cancer; cancers affecting the chest, such as cancer of the pleura and lung cancer; digestive cancers, such as cancer of the esophagus, cancer of the stomach, cancer of the small intestine, cancer of the colon and cancer of the rectum and / or anal canal; genital cancers, such as prostate cancer
  • the genetically modified human stem cell according to the invention is particularly useful for preventing and / or treating hepatocellular carcinomas and / or associated metastases.
  • Another aspect of the invention relates to a method for selecting genetically modified stem cells as defined above, characterized in that it comprises the steps of: a) transducing human stem cells with a viral vector comprising exogenous nucleic acid , b) culturing the human stem cells obtained from step a) in a predefined culture medium, and c) selecting the genetically modified human stem cells expressing the selection marker gene on their membrane surface.
  • the culture medium used is a medium specific for human stem cells, such as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2, sold by Promocell (Product reference: C28009).
  • the culture medium used comprises 50% of medium having been in contact with the non-transduced human stem cells for 24 h and 50% of the same fresh medium.
  • the selection marker gene is the spliced CD34 gene.
  • the selection of genetically modified human stem cells expressing the selection marker gene at their membrane surface is carried out by flow cytometry, in particular by means of the BD-FACS ARIAIII TM apparatus using anti-CD34 antibodies coupled to the “brilliant violet 421” fluorochrome (Brillant Violet 421 TM) anti-human CD34 (Product reference: 343609 from Biolegend).
  • Another subject of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the genetically modified human stem cell according to the invention as an active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as active ingredient and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above is particularly useful for preventing and / or to treat cancer and / or cancer recurrences and / or associated metastases.
  • the pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above is administered to a patient suffering from or suspected of suffering from cancer and / or them. recurrence of cancer and / or associated metastases.
  • the cancer is a cancer with solid tumors.
  • solid tumor within the meaning of the present invention, is meant a carcinoma or a sarcoma.
  • the cancer is a cancer chosen from: cancers affecting the central nervous system, such as astrocytomas and gliomas; cancers of the upper aerodigestive tract (ENT), such as cancer of the lips, cancer of the oral cavity, cancer of the oropharynx and cancer of the nasopharynx; cancers of the endocrine glands, such as thyroid cancer, adrenal gland cancer, and extra-digestive and pulmonary neuroendocrine tumors; cancers of the exocrine glands, such as breast cancer and pancreatic cancer; cancers affecting the chest, such as cancer of the pleura and lung cancer; digestive cancers, such as cancer of the esophagus, cancer of the stomach, cancer of the small intestine, cancer of the colon and cancer of the rectum and / or anal canal; genital
  • the pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above is particularly useful for preventing and / or to treat solid tumors, and in particular hepatocellular carcinomas, and / or recurrences of cancer and / or associated metastases.
  • the pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above is administered to a patient suffering from or suspected of suffering from solid tumors, and in particular from hepatocellular carcinomas, and / or cancer recurrences and / or associated metastases.
  • the patient can be a human, male or female, regardless of age.
  • the patient can be a non-human animal, preferably a non-human mammal, for example a dog, a cat, a mouse, a rat, a hamster, a rabbit, a chinchilla, a horse, a cow. , a pig, a sheep, a goat or a primate.
  • the terms “therapeutically effective” or “effective amount to be treated” or “pharmaceutically effective” denote the amount of genetically modified human stem cells necessary to inhibit or reverse a disease, advantageously cancer, and in particular for treat solid tumors and in particular hepatocellular carcinomas, and / or associated metastases.
  • the determination of a therapeutically effective amount depends specifically on factors such as the toxicity and effectiveness of the drug. These factors will differ depending on other factors such as activity, relative bioavailability, patient body weight, severity of unwanted side effects, and preferred mode of administration. Toxicity can be determined using methods well known in the art. The same is true for efficiency.
  • a pharmaceutically effective amount is, therefore, an amount which is considered by the clinician to be toxicologically tolerable, but effective.
  • the dosage can be appropriately adjusted to achieve desired levels of drug (eg, genetically modified human stem cells), local or systemic, particularly transarterial, depending on the mode of administration. In the event that the response in a patient is insufficient at such doses, even larger doses high (or more effective doses by a different, more localized route of administration) may be used as long as the patient's tolerance allows.
  • Several injections about a week apart can also be used to reach appropriate levels of toxic metabolites formed to cause tumor cell death and trigger an anti-tumor immune response. "Dose” and “dosage” are used interchangeably herein.
  • the frequency of injection is related to the half-life of genetically modified human stem cells.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is administered to the patient at the rate of one administration per week for at least four weeks.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is administered to the patient at the rate of two administrations, advantageously three administrations, advantageously four administrations, advantageously five administrations, advantageously six administrations, advantageously seven administrations per week.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is administered to the patient for at least four weeks, advantageously at least five weeks, advantageously at least six weeks, advantageously at least seven weeks, advantageously at least eight weeks, advantageously at least nine weeks, advantageously at least ten weeks.
  • the pharmaceutical composition according to the invention further comprises at least one second active principle.
  • at least one second active principle can interact synergistically with the genetically modified human stem cells according to the invention.
  • the second active principle is an anti-cancer agent.
  • cytostatic agents cytotoxic agents, cytoprotective agents, growth inhibiting agents, toxins and combinations thereof.
  • anti-cancer agents that can be used in tumor therapy with the genetically modified human stem cells of the invention include cyclophosphamide (CAS number 50-18-0, also known as cyclophosphane, and the trademarks Endoxan ® , Neosar ® , Procytox ® and Revimmune ® ), AQ4N (1, 4).
  • the second active principle can comprise a combination of anticancer agents, such as those listed above.
  • the second active principle is a combination of an anticancer agent and a cytoprotective agent.
  • the second active principle is a combination of cyclophosphamide and mesna.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises genetically modified human stem cells as defined above as active principle and cyclophosphamide as second active principle.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises genetically modified human stem cells as defined above as active principle and mesna as second active principle.
  • the second active principle can be in the form of granules, powders, tablets, coated tablets, (micro) capsules, syrups, emulsions, suspensions or prolonged-release preparations.
  • the second active principle can be in a form which can be administered parenterally.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises genetically modified human stem cells as defined above as active principle and cyclophosphamide as second active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises genetically modified human stem cells as defined above as active principle and cyclophosphamide and mesna as second active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition when the pharmaceutical composition comprises a second active principle, the pharmaceutical composition is suitable for simultaneous administration or sequential administration of genetically modified human stem cells and of the second active principle.
  • the term “simultaneous administration” is understood to mean administration of genetically modified human stem cells and of the second. active ingredient at the same time, at the same time, to a patient in therapeutically effective amounts to allow the synergistic effect of the pharmaceutical composition.
  • This does not mean, however, that the genetically modified human stem cells and the second active principle are necessarily administered in the form of a mixture; they can in fact be administered simultaneously but separately, in the form of separate compositions.
  • compositions By “present in two distinct compositions” is meant that the genetically modified human stem cells and the second active principle are physically separated. They are then used, administered separately in therapeutically effective amounts to allow the synergistic effect of the pharmaceutical composition, without prior mixing, in several (at least two) dosage forms (for example two separate compositions).
  • the genetically modified human stem cells and the second active ingredient can be present in the same composition in therapeutically effective amounts to allow the synergistic effect of the pharmaceutical composition.
  • the term “present in the same composition” is understood to mean the physical combination of genetically modified human stem cells and the second active principle.
  • the genetically modified human stem cells and the second active principle are then necessarily administered simultaneously since they are administered together, in the form of a mixture, in the same dosage form (for example in a single composition containing the genetically modified human stem cells and the anti-cancer agent) and in therapeutically effective amounts to provide the synergistic effect of the pharmaceutical composition.
  • the expression “sequential administration” means that the genetically modified human stem cells and the second active principle are administered in therapeutically effective amounts to allow the synergistic effect of the pharmaceutical composition, not simultaneously but separately in time, one after the other.
  • the terms “precede” or “preceding” and “follow” or “following” then apply.
  • the term “precede” or “preceding” is used when a compound of the pharmaceutical composition according to the invention is administered a few minutes or several hours, or even several days before the administration of the other compound (s) of the composition. pharmaceutical.
  • the term “follow” or “next” is used when a compound of the pharmaceutical composition is administered a few minutes or several hours, or even several days after the administration of the other compound (s) of the. pharmaceutical composition.
  • the genetically modified human stem cells are administered a few days before the second active principle.
  • the pharmaceutical composition when the pharmaceutical composition comprises a second active principle, the pharmaceutical composition is suitable for sequential administration of genetically modified human stem cells and of the second active principle.
  • the second active principle is cyclophosphamide used alone or in combination with mesna.
  • the genetically modified human stem cells are administered to the patient, then two to three days after the administration of the genetically modified human stem cells, cyclophosphamide, alone or in combination with mesna, is administered to the same patient, and this at the rate of two administrations of genetically modified human stem cells and cyclophosphamide, alone or in combination with mesna, per week for at least four weeks, advantageously at least five weeks, advantageously at least six weeks , advantageously at least seven weeks, advantageously at least eight weeks, advantageously at least nine weeks, advantageously at least ten weeks.
  • the pharmaceutical composition used may be in solid, semi-solid or liquid dosage form such as, for example, tablets, pills, powders, capsules, gels, ointments, etc. liquids, suspensions or the like.
  • the pharmaceutical compositions are administered in unit dosage forms suitable for single administration of precise dosage amounts.
  • the pharmaceutical compositions can also comprise, depending on the desired formulation, at least one pharmaceutically acceptable carrier or diluent, which are defined as aqueous-based vehicles commonly used for formulations intended for human administration. The diluent is chosen so as not to affect the biological activity of the active compounds present in the pharmaceutical composition of the invention.
  • diluents examples include distilled water, physiological saline, Ringer's solution, dextrose solution and Hank's solution. Effective amounts of such diluent or carrier are amounts effective to obtain a pharmaceutically acceptable formulation in terms of solubility of the components, biological activity, etc.
  • the pharmaceutical compositions provided herein are sterile.
  • Suitable liquid pharmaceutical preparation forms may in particular comprise aqueous or saline solutions, said aqueous or saline solutions. can be microencapsulated, notched, applied to microscopic gold particles, contained in liposomes.
  • the administration of the pharmaceutical composition or the genetically modified human stem cell according to the present invention can be by any route of administration, including oral, topical, parenteral (also called systemic or general route), intramuscular route. , intranasal, sublingual, intratracheal, inhalation, ocular, vaginal and rectal. Intracapsular, intravenous, transarterial, intraarterial and intraperitoneal routes of administration can also be used. Those skilled in the art will know how to choose the appropriate route of administration depending on the disorder to be treated.
  • the pharmaceutical composition or the genetically modified human stem cell according to the present invention can be administered to a subject by the parenteral route, advantageously by the transarterial route.
  • compositions when it is desirable to be administered systemically, can be formulated for parenteral administration by injection, for example, by bolus injection or continuous infusion.
  • Formulations for injection may be presented in unit dosage form, for example in ampoules or in multiple dose containers, with an added preservative.
  • the compositions can take forms such as suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous vehicles, and can contain formulating agents such as suspending agents, stabilizers and / or dispersants.
  • compositions for parenteral administration include aqueous solutions of the active compositions in water soluble form.
  • suspensions of the active compositions can be prepared as suitable oily injection suspensions.
  • suitable lipophilic solvents or vehicles include fatty oils such as sesame oil, or synthetic fatty acid esters, such as ethyl oleate or triglycerides, or liposomes.
  • Aqueous injection suspensions may contain substances which increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethylcellulose, sorbitol or dextran.
  • the suspension may also contain suitable stabilizers or agents which increase the solubility of the compositions to allow the preparation of highly concentrated solutions.
  • the active compositions may be in the form of powders to constitute a suitable vehicle, for example sterile pyrogen-free water, before use.
  • a suitable vehicle for example sterile pyrogen-free water
  • the pharmaceutical composition or the genetically modified human stem cell according to the present invention can be administered to a patient by the transarterial route.
  • the pharmaceutical composition or the genetically modified human stem cell according to the present invention are in a form suitable for its administration by the trans arterial route.
  • the genetically modified human stem cells according to the present invention represent in an amount of 0.5 to 98% by weight, or even more, of the total weight of the pharmaceutical composition considered.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises only the genetically modified human stem cells as defined above, as a single active principle.
  • Another object of the invention relates to a method of preventive treatment of cancer and / or associated metastases, comprising the administration to the patient of genetically modified human stem cells or of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically human stem cells. modified as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above.
  • prevention or “prophylaxis” or “preventive treatment” or “prophylactic treatment” comprises a treatment leading to the prevention of a disease as well as a treatment reducing and / or delaying the incidence. disease or the risk of disease occurrence.
  • the genetically modified human stem cell is particularly effective in preventing recurrence and the appearance of new metastases, by eliciting a strong anti-tumor immune response, thereby inducing a protective effect against recurrence and metastasis.
  • the present invention is a method of preventive treatment of cancer and / or cancer recurrences and / or associated metastases, comprising the administration to the patient of genetically modified human stem cells or of a pharmaceutical composition. comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above and a second active principle as defined above.
  • the cancer is a cancer with solid tumors.
  • solid tumor within the meaning of the present invention, is meant a carcinoma or a sarcoma.
  • the cancer is a cancer chosen from: cancers affecting the central nervous system, such as astrocytomas and gliomas; cancers of the upper aerodigestive tract (ENT), such as cancer of the lips, cancer of the oral cavity, cancer of the oropharynx and cancer of the nasopharynx; cancers of the endocrine glands, such as thyroid cancer, adrenal gland cancer, and extra-digestive and pulmonary neuroendocrine tumors; cancers of the exocrine glands, such as breast cancer and pancreatic cancer; cancers affecting the chest, such as cancer of the pleura and lung cancer; digestive cancers, such as cancer of the esophagus, cancer of the stomach, cancer of the small intestine, cancer of the colon and cancer of the rectum and / or anal canal; genital cancers, such as prostate cancer, cervical cancer, endometrial cancer, cancer of the vagina, and cancer of the vulva; urinary cancers, such as kidney cancer and
  • the present invention relates to a method of preventive treatment of hepatocellular carcinoma, comprising the administration to the patient of genetically modified human stem cells or of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells. as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above.
  • the present invention relates to a method of preventive treatment of hepatocellular carcinoma, comprising the administration to the patient of genetically modified human stem cells or of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells. as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above and a second active principle as defined above.
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically amount efficient use of genetically modified human stem cells as an active ingredient in the manufacture of a medicament for the prevention of cancer and / or cancer recurrence and / or associated metastases.
  • the cancer is a cancer with solid tumors.
  • solid tumor within the meaning of the present invention, is meant a carcinoma or a sarcoma.
  • the cancer is a cancer chosen from: cancers affecting the central nervous system, such as astrocytomas and gliomas; cancers of the upper aerodigestive tract (ENT), such as cancer of the lips, cancer of the oral cavity, cancer of the oropharynx and cancer of the nasopharynx; cancers of the endocrine glands, such as thyroid cancer, adrenal gland cancer, and extra-digestive and pulmonary neuroendocrine tumors; cancers of the exocrine glands, such as breast cancer and pancreatic cancer; cancers affecting the chest, such as cancer of the pleura and lung cancer; digestive cancers, such as cancer of the esophagus, cancer of the stomach, cancer of the small intestine, cancer of the colon, and cancer of the rectum and / or anal canal; gen
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as an active ingredient in the manufacture of a medicament for the prevention of solid tumors. , and in particular hepatocellular carcinomas, and / or cancer recurrences and / or associated metastases.
  • Another object of the invention relates to a method of curative treatment of cancer and / or associated metastases in patients requiring administration, comprising the administration to said patients of genetically modified human stem cells or of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically amount effective genetically modified human stem cells as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above.
  • treatment or “curative treatment” is defined as a treatment leading to a cure or a treatment which alleviates, improves and / or eliminates, reduces and / or stabilizes the symptoms of a disease or the suffering it causes.
  • Another object of the invention relates to a method of curative treatment of cancer and / or cancer recurrences and / or associated metastases in patients requiring administration, comprising the administration to said patients of genetically modified human stem cells or of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above and a second active principle as defined above.
  • the cancer is a cancer with solid tumors.
  • solid tumor within the meaning of the present invention, is meant a carcinoma or a sarcoma.
  • the cancer is a cancer chosen from: cancers affecting the central nervous system, such as astrocytomas and gliomas; cancers of the upper aerodigestive tract (ENT), such as cancer of the lips, cancer of the oral cavity, cancer of the oropharynx and cancer of the nasopharynx; cancers of the endocrine glands, such as thyroid cancer, adrenal gland cancer, and extra-digestive and pulmonary neuroendocrine tumors; cancers of the exocrine glands, such as breast cancer and pancreatic cancer; cancers affecting the chest, such as cancer of the pleura and lung cancer; digestive cancers, such as cancer of the esophagus, cancer of the stomach, cancer of the small intestine, cancer of the colon, and cancer of the rectum and / or anal canal; gen
  • Another object of the invention relates to a method of curative treatment of a solid tumor, advantageously hepatocellular carcinomas and / or associated metastases, in patients requiring administration, comprising the administration to said patients of genetically modified human stem cells or of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of stem cells genetically modified human as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above.
  • Another object of the invention relates to a method of curative treatment of a solid tumor, advantageously hepatocellular carcinomas and / or associated metastases, in patients requiring administration, comprising the administration to said patients of genetically modified human stem cells or of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as active principle and at least one pharmaceutically acceptable excipient as defined above and a second active principle as defined above.
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as an active principle in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer and / or associated metastases.
  • the cancer is a cancer with solid tumors.
  • solid tumor within the meaning of the present invention, is meant a carcinoma or a sarcoma.
  • the cancer is a cancer chosen from: cancers affecting the central nervous system, such as astrocytomas and gliomas; cancers of the upper aerodigestive tract (ENT), such as cancer of the lips, cancer of the oral cavity, cancer of the oropharynx and cancer of the nasopharynx; cancers of the endocrine glands, such as thyroid cancer, adrenal gland cancer, and extra-digestive and pulmonary neuroendocrine tumors; cancers of the exocrine glands, such as breast cancer and pancreatic cancer; cancers affecting the chest, such as cancer of the pleura and lung cancer; digestive cancers, such as cancer of the esophagus, cancer of the stomach, cancer of the small intestine, cancer of the colon, and cancer of the rectum and / or anal canal; gen
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of genetically modified human stem cells as an active principle. in the manufacture of a medicament for the treatment of solid tumors, and in particular hepatocellular carcinomas, and / or associated metastases.

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Abstract

La présente invention concerne une cellule souche humaine génétiquement modifiée, dans laquelle ladite cellule souche humaine comprend un acide nucléique exogène comprenant une région codant pour une protéine de fusion comprenant une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci et une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci, liée de manière fonctionnelle à un promoteur, ledit acide nucléique exogène ayant été intégré dans un des gènes sphère de sécurité « safe harbor » de ladite cellule souche humaine. L'invention concerne également l'utilisation de ladite cellule pour le traitement du cancer et/ou les récidives de cancer et/ou des métastases associées, notamment les tumeurs solides, et en particulier les carcinomes hépatocellulaires et/ou des métastases associées.

Description

Titre : Cellule souche humaine génétiquement modifiée exprimant une protéine cytochrome P4502B6 humaine mutante et son utilisation dans le traitement du cancer
Domaine technique
La présente invention concerne une cellule souche humaine génétiquement modifiée, dans laquelle ladite cellule souche humaine comprend un acide nucléique exogène comprenant une région codant pour une protéine de fusion comprenant une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci et une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci, liée de manière fonctionnelle à un promoteur, ledit acide nucléique exogène ayant été intégré dans un des gènes sphère de sécurité « safe harbor » de ladite cellule souche humaine. L’invention concerne également l’utilisation de ladite cellule pour le traitement du cancer, notamment les tumeurs solides, et en particulier les carcinomes hépatocellulaires.
Art antérieur
Les cancers du foie représentent mondialement plus de 841 080 nouveaux cas par année, dont 90% sont des carcinomes hépatocellulaires. Le carcinome hépatocellulaire est la troisième cause de mortalité par cancer dans le monde. L'infection chronique par les virus de l'hépatite C (VHC) et de l'hépatite B (VHB) ou encore la cirrhose alcoolique sont les principales causes du carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, depuis ces 10 dernières années, l'émergence de la stéatohépatite non alcoolique (NASH) liée à l'augmentation de l'obésité, des états pré-diabétique et du diabète de type 2, est une cause émergeante d'hépatocarcinome. Le traitement du carcinome hépatocellulaire est indispensable sous peine d'une évolution fatale. Au regard de l'augmentation des patients atteints de stéatohépatites non-alcooliques, il est fort probable que le nombre de patients atteints de carcinome hépatocellulaire augmentera dans les années à venir. La survie spontanée des patients atteint de carcinome hépatocellulaire n'excède pas 15 mois. La classification BCLC (Barcelona Cancer Liver Center) permet de distinguer 5 types de situation clinique.
Les stades 0 et A (précoce) (15% des patients) définissent des patients avec une maladie précocement diagnostiquée, en bon état général et porteur d'un carcinome hépatocellulaire inférieur à 3cm. Ces patients sont éligibles aux seuls traitements curatifs que sont la chirurgie de résection tumorale et transplantation hépatique. La survie à 5 ans est de 60%.
Le stade B (intermédiaire) concerne des patients dont l'état général est conservé mais présentant un ou des carcinome(s) hépatocellulaire(s) dont la taille dépasse les 3 cm, sans envahissement du tronc porte ou de métastases. Ces patients peuvent bénéficier de chimioembolisation hépatique à la doxorubicine. La médiane de survie de ces patients est de 20 mois.
Le stade C (avancé) défini un patient atteint d'un hépatocarcinome avec envahissement portai, des métastases ganglionnaires et pulmonaires associées à une altération modérée de son état général.
Le traitement de référence à ce stade avancé est le Sorafénib, inhibiteur multikinases antiangiogénique administré par voie orale, commercialisé sous le nom de Nexavar® par Onyx/Bayer. Chez ces patients la médiane de survie est de 11 mois. D'autres traitements de seconde ligne ont été récemment approuvés. Il s'agit du Regorafenib (inhibiteur de kinase) commercialisé sous le nom de Stivarga® par Bayer et le Nivolumab (anticorps anti-PD1) commercialisé sous le nom d’Opdivo®, par BMS. Tous ces traitements ont une efficacité limitée et sont responsables d'effets indésirables majeurs (diarrhées, perte de poids, syndrome main-pied et hypophosphatémie, hypertension artérielle) souvent à l'origine d'une mauvaise observance du traitement aboutissant à des résultats suboptimaux.
Le stade D concerne les patients arrivés au stade palliatifs pour lequel seuls des soins de support peuvent être proposés.
Ainsi, il existe donc un besoin de nouvelles formes efficaces de traitement du cancer, notamment les tumeurs solides et en particulier des carcinomes hépatocellulaires, en particulier des traitements pouvant fournir une thérapie contrôlée et soutenue, seule ou en combinaison avec d’autres thérapies, tout en améliorant la qualité de vie du patient et en diminuant les effets secondaires liés au traitement.
Afin de prévenir et/ou traiter le cancer et/ou les métastases associées, et en particulier les tumeurs solides, et notamment le carcinome hépatocellulaire et/ou les métastases associées, les inventeurs ont mis au point une nouvelle cellule souche humaine génétiquement modifiée capable de métaboliser le cyclophosphamide et d’induire la mort immunologique des cellules tumorales en provoquant une forte réponse immunitaire anti tumorale.
Résumé de l’invention
Ainsi, la présente invention porte sur une cellule souche humaine génétiquement modifiée, dans laquelle ladite cellule souche humaine comprend un acide nucléique exogène comprenant une région codant pour une protéine de fusion comprenant une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci, une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci, liée de manière fonctionnelle à un promoteur, ledit acide nucléique exogène ayant été intégré dans un gène sphère de sécurité « safe harbor » de ladite cellule souche humaine et caractérisée en ce que ladite cellule souche humaine génétiquement modifiée n’étant pas une cellule souche humaine embryonnaire.
Avantageusement, la cellule souche humaine est choisie parmi les cellules souches mésenchymateuses (hMSC), les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules souches mésenchymateuses induites (iMSC).
Avantageusement, le promoteur utilisé est un promoteur constitutif, de préférence le promoteur EF1-a. Avantageusement, l’acide nucléique exogène comprend en outre un gène marqueur de sélection.
La présente invention concerne également une méthode d’obtention de la cellule souche humaine génétiquement modifiée, ladite cellule souche humaine a été obtenue par transduction rétrovirale avec un vecteur viral comprenant l’acide nucléique exogène.
La présente invention concerne également la cellule souche humaine génétiquement modifiée pour son utilisation en tant que médicament et sa formulation sous une forme adaptée pour son administration par voie trans-artérielle.
La présente invention concerne également un procédé de sélection de cellules souches génétiquement modifiées comprenant les étapes de a) transduction des cellules souches humaines avec un vecteur viral comprenant l’acide nucléique exogène, b) mise en culture des cellules souches humaines dans un milieu de culture prédéfini, c) sélection les cellules souches humaines génétiquement modifiées exprimant le gène marqueur de sélection à leur surface membranaire.
La présente invention concerne par ailleurs une composition pharmaceutique comprenant la cellule souche humaine génétiquement modifiée comme principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable et éventuellement au moins un second principe actif, en particulier un agent anti-cancéreux, ladite composition pharmaceutique étant sous une forme adaptée pour son administration par voie trans-artérielle.
L’invention concerne également une cellule souche humaine génétiquement modifiée ou composition pharmaceutique pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer et/ou les récidives de cancer et/ou des métastases associées, de préférence des tumeurs solides, de préférence les carcinomes hépatocellulaires et/ou des métastases associées.
Description détaillée de l’invention La présente invention a donc pour objet une cellule souche humaine génétiquement modifiée, dans laquelle ladite cellule souche humaine comprend un acide nucléique exogène comprenant une région codant pour une protéine de fusion comprenant une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci, une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci, liée de manière fonctionnelle à un promoteur, ledit acide nucléique exogène ayant été intégré dans un gène sphère de sécurité « safe harbor » de ladite cellule souche humaine et caractérisée en ce que ladite cellule souche humaine génétiquement modifiée n’étant pas une cellule souche humaine embryonnaire.
Les inventeurs ont montré de manière surprenante que l’intégration de l’acide nucléique exogène dans un gène sphère de sécurité « safe harbor » est primordiale pour que la cellule souche humaine modifiée génétiquement puisse métaboliser le cyclophosphamide (CPA) et ainsi induire la mort immunologique des cellules tumorales. De plus, cette intégration de l’acide nucléique exogène dans un gène sphère de sécurité « safe harbor » permet à la cellule souche humaine modifiée génétiquement de maintenir sa morphologie et son temps de doublement. Par ailleurs, les inventeurs ont montré qu’une seule copie de l’acide nucléique exogène est intégrée dans un gène sphère de sécurité « safe harbor ». Les inventeurs ont également montré que l’utilisation de cellules souches humaines génétiquement modifiées selon l’invention permet l’éradication complète des tumeurs solides ainsi qu’une protection par effet vaccinant contre les récurrences et les métastases.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la cellule souche humaine est choisie parmi les cellules souches mésenchymateuses (hMSC), les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules souches mésenchymateuses induites (iMSC).
Au sens de la présente invention, le terme « cellules souches mésenchymateuses » ou « hMSC » ou « cellules souches mésenchymateuses humaines » désigne des cellules souches multipotentes capables de se différencier notamment en ostéoblastes, chondrocytes, myocytes et adipocytes. Les cellules souches mésenchymateuses se trouvent dans le mésenchyme, la partie du mésoderme embryonnaire constituée de cellules fusiformes ou stellaires, non tassées de manière lâche. Telles qu'utilisées ici, les cellules souches mésenchymateuses comprennent, sans limitation, les cellules souches CD34- négatives. Dans un mode de réalisation de l’invention, les cellules souches mésenchymateuses humaines sont isolées à partir du tissu adipeux et/ou de moelle osseuse.
Au sens de la présente invention, le terme « cellules souches pluripotentes induites » ou « iPSC » ou « cellules souches pluripotentes induites humaines » désigne un type de cellule souche pluripotente similaire à une cellule souche embryonnaire mais qui est créée lorsque des cellules somatiques (par exemple adultes) sont reprogrammées pour entrer dans un état semblable à celui d’une cellule souche embryonnaire en maintenant l’expression des facteurs importants pour le maintien de la "pluripotence" des cellules souches embryonnaires (appelées également CSE ou PSC), c'est-à-dire leur capacité à pouvoir s'engager dans différentes voies de différenciation. De tels facteurs peuvent inclure certains gènes embryonnaires (tels que les transgènes OCT4, SOX2 et LF4). Tel qu'utilisé ici, le terme « pluripotent » désigne une cellule ou une lignée cellulaire capable de se différencier en n'importe quel type cellulaire différencié, par exemple, une capacité à se développer dans les trois couches germinales du développement de l'organisme, notamment l'endoderme, le mésoderme et l'ectoderme.
Au sens de la présente invention, le terme « cellules souches mésenchymateuses induites » ou « iMSC » ou « cellules souches mésenchymateuses induites humaines », désigne des cellules souches mésenchymateuses dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC).
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la cellule souche humaine est une cellule souche mésenchymateuse (hMSC). Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la cellule souche humaine est une cellule souche pluripotente induite (iPSC). Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la cellule souche humaine est une cellule souche mésenchymateuse induite (iMSC).)
Au sens de la présente invention, le terme « acide nucléique exogène » désigne un acide nucléique non naturellement présent dans la cellule souche humaine selon l’invention. L’acide nucléique exogène peut être un ADN génomique, un ADNc, des ADN naturels ou obtenus totalement ou partiellement par synthèse chimique. Selon un mode de réalisation de l’invention, l’acide nucléique exogène présente un intérêt thérapeutique.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, l’acide nucléique exogène comprend une région codant pour une protéine de fusion comprenant une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci, une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la protéine cytochrome P450 2B6 humaine est une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante, appelée également CYP2B6*, de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci, dans laquelle ledit variant ou ledit fragment comprend les résidus 114V, 199M et 477W tels que représentés dans la séquence d'acides aminés SEQ ID No.1. Avantageusement, ledit variant ou fragment conserve une activité biologique d'une protéine ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID No.1.
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La séquence d'acides aminés de la protéine cytochrome P450 2B6 humaine de type sauvage (CYP2B6 WT) est représentée par la séquence SEQ ID No.3.
SEQ ID No.3 (CYP2B6 WT):
MELSVLLFLALLTGLLLLLVQRHPNTHDRLPPGPRPLPLLGNLLQMDRRGLLKSFLRFREKY
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De manière avantageuse, la protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) a une affinité pour le CPA de plus de 8 fois supérieure à celle de la protéine de type sauvage (CYP2B6 WT), tout en conservant le même Vmax, notamment du fait des substitutions 1114V, L199M et V477W telles que présentées dans la SEQ ID No.1. Comme décrit ci- dessous, les variants et fragments de la séquence d'acides aminés SEQ ID No.1 sont englobés dans le cadre de l'invention. Cependant, toutes les protéines cytochrome P450 2B6 humaines mutantes, variants et fragments de l'invention tels que décrits ici retiennent Val à la position correspondant au résidu 114 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No.1 , Met à la position correspondant au résidu 199 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No.1 et Trp à la position correspondant au résidu 477 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No.1.
La séquence d'acides aminés de la protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de type sauvage (NADPH WT) est représentée par la séquence SEQ ID No.2. Les variants et les fragments de la protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de séquence d'acides aminés de SEQ ID No.2, décrites ci-dessous, entrent également dans le cadre de l'invention.
SEQ ID No. 2 (NADPH WT):
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RYSLDVWS
Les variants des protéines peuvent être des variants naturels, tels que des variants d'épissage, des allèles et des isoformes, ou ils peuvent être produits par des moyens recombinants. Des variations de la séquence d'acides aminés peuvent être introduites par substitution, délétion ou insertion d'un ou plusieurs codons dans la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine, ce qui entraînent une modification de la séquence d'acides aminés de la protéine. De manière facultative, la variation peut être de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 acides aminés ou plus avec tout autre acide aminé. En plus ou alternativement, la variation peut être introduite par addition ou délétion de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 acides aminés ou plus au sein de la protéine. Les substitutions d'acides aminés peuvent être conservatrices ou non conservatrices. De préférence, les substitutions sont des substitutions conservatrices, dans lesquelles un acide aminé est substitué à un autre acide aminé ayant des propriétés structurelles et/ou fonctionnelles et/ou chimiques similaires. Des exemples de substitutions conservatrices sont listés ci-dessous :
Ala (A) Val; Leu; Ile Arg (R) Lys; Gin; Asn Asn (N) Gin; His; Lys Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gin (Q) Asn Glu (E) Asp Gly (G) Pro; Ala; ala His (H) Asn; Gin; Lys; Arg;
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; norleucine Leu
Leu (L) norleucine; Ile; Met; Ala; Phe
Lys (K) Arg; Gin; Asn
Met (M) Leu; Phe; Ile
Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Pro (P) Ala
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr; Phe;
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser;
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleucine.
Les variants des protéines peuvent inclure des protéines qui ont au moins environ 80% d'identité de séquence d'acides aminés avec une séquence polypeptidique décrite ici. Avantageusement, un variant de protéine aura au moins environ 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% d'identité de séquence d'acides aminés avec une séquence d’acides aminés complète ou un fragment d'une séquence d’acides aminés de SEQ ID No.1 et/ou SEQ ID No.2.
L’identité de la séquence d’acides aminés est définie comme le pourcentage de résidus d’acides aminés de la séquence variante qui sont identiques aux résidus d’acides aminés de la séquence de référence, après alignement des séquences et introduction, le cas échéant, de trous afin d’atteindre le pourcentage maximum d’identité de séquence, et ne pas envisager de substitutions conservatrices dans le cadre de l'identité de séquence. L'identité de la séquence peut être déterminée sur toute la longueur de la séquence variante, sur toute la longueur de la séquence de référence ou sur les deux. Les procédés d'alignement de séquence et de détermination d'identité de séquence sont bien connus dans la technique, par exemple, en utilisant un logiciel accessible au public tel que BioPerl, BLAST, BLAST-2, CS-BLAST, FASTA, ALIGN, ALIGN-2, LALIGN, Jaligner, matcher ou le logiciel Megalign (DNASTAR).
Les fragments des protéines et les variants de protéines décrits dans la présente demande sont également englobés par l'invention. De tels fragments peuvent être tronqués à l'extrémité N-terminale ou à l'extrémité C-terminale, ou peuvent être dépourvus de résidus d’acides aminés internes en dehors des extrémités N-terminale et C-terminale, par exemple, par rapport à une protéine de longueur totale. Certains fragments sont dépourvus de résidus d’acides aminés qui ne sont pas essentiels à l’activité enzymatique. Avantageusement, lesdits fragments sont au moins environ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 acides aminés ou plus en longueur.
Les fragments préférés des protéines décrites ici comprennent tout ou partie du site actif. Les fragments préférés de la protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) comprennent ou consistent en les acides aminés 1 à 490 de la séquence de longueur complète SEQ ID No.1. Les fragments préférés de protéine NADPH-cytochrome P450 réductase comprennent ou sont constitués de fragments comprenant ou consistant en les acides aminés 60 à 680 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No.2.
Les variants et les fragments de l'invention conservent de préférence une activité biologique de la protéine complète. Les variants et les fragments de la protéine cytochrome P450 2B6 humaine ont avantageusement une activité d'oxydation d'un substrat tel que le cyclophosphamide (CPA), ou d’un autre substrat, en particulier en catalysant l'hydroxylation en 4-OH-CPA.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, lesdits variants et fragments ont une affinité pour le cyclophosphamide (CPA) supérieure à celle de la protéine cytochrome P450 2B6 humaine de séquence SEQ ID No.3, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 fois celle de la séquence de type sauvage.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, lesdits variants et fragments ont une affinité pour le CPA identique, sensiblement identique ou supérieure à celle de la protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1. Des méthodes permettant de doser ladite activité et cette affinité sont bien connues de l’homme de l’art et sont décrites notamment dans Nguyen et al., Mol Pharmacol, 2008, 73: 1 122-1 133.
Les variants et les fragments de la protéine NADPH-cytochrome P450 réductase ont de préférence une activité de réduction du cytochrome c, de préférence de manière dépendante du NADPH.
Dans un mode de réalisation préféré, lesdits variants et fragments ont une activité identique, sensiblement supérieure ou égale à celle de la protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de longueur complète (SEQ ID No. 2). Des méthodes de dosage de cette activité sont bien connues de l’homme de l’art et sont décrites notamment dans Yasukochi et al; Arch Biochem Biophys, 1980, 202: 491-498. L’homme du métier sera capable de déterminer les résidus d’acides aminés qui peuvent être insérés, substitués ou délétés sans nuire à l’activité de la protéine en utilisant la connaissance de la structure de la protéine disponible dans la technique et les techniques de modélisation moléculaire disponibles au public (voir par exemple Nguyen et al. Mol Pharmacol 2008, 73: 1 122-1133). La variation autorisée peut être déterminée en effectuant systématiquement des insertions, des délétions ou des substitutions d'acides aminés dans la séquence et en testant les variants résultants pour l'activité présentée par rapport à la protéine sauvage.
Au sens de la présente invention, le terme « protéine de fusion » désigne une protéine chimère créée en joignant deux gènes ou plus codant pour des protéines distinctes ou des fragments de protéines, tels que différents domaines protéiques, dans un seul cadre de lecture codant pour une seule protéine traduite.
La protéine de fusion de la présente invention comprend de préférence :
- une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci, et
- une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci telles que décrites précédemment.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite protéine de fusion de séquence SEQ ID No.4 comprend :
- les résidus 1 à 490 de la protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci et
- les résidus 57 à 678 de la protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci.
SEQ ID No.4 (protéine de fusion) :
MELSVLLFLALLTGLLLLLVQRHPNTHDRLPPGPRPLPLLGNLLQMDRRGLLKSFLRFREKY
GDVFTVHLGPRPVVMLCGVEAIREALVDKAEAFSGRGKIAMVDPFFRGYGVVFANGNRWK
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LLMLKYPHVAERVYREIEQVIGPHRPPELHDRAKMPYTEAVIYEIQRFSDLLPMGVPHIVTQH
TSFRGYIIPKDTEVFLILSTALHDPHYFEKPDAFNPDHFLDANGALKKTEAFIPFSLGKRICLGE
GIARAELFLFFTTILQNFSMASPVAPEDIDLTPQECGWGKIPPTYQIRFLPRSSSTIQTLTSSV
RESSFVEKMKKTGRNIIVFYGSQTGTAEEFANRLSKDAHRYGMRGMSADPEEYDLADLSSL
PEIDNALVVFCMATYGEGDPTDNAQDFYDWLQETDVDLSGVKFAVFGLGNKTYEHFNAMG
KYVDKRLEQLGAQRIFELGLGDDDGNLEEDFITWREQFWPAVCEHFGVEATGEESSIRQYE LVVHTDIDAAKVYMGEMGRLKSYENQKPPFDAKNPFLAAVTTNRKLNQGTERHLMHLELDI
SDSKIRYESGDHVAVYPANDSALVNQLGKILGADLDVVMSLNNLDEESNKKHPFPCPTSYRT
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YGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSS
PILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQV
CSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTL
IALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEP*.
La protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci peut être en amont ou en aval de la protéine NADPH- cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci. De préférence, la protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci est en amont de la protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci.
Lorsque le contexte le permet, le terme « protéines de l'invention », « les protéines divulguées ici », doit être compris comme englobant lesdites protéines de fusion.
Les protéines ou fragments de protéines constituant la protéine de fusion peuvent être séparés par une séquence peptidique de liaison ou un espaceur. La séquence peptidique de liaison, appelée également « linker » ou l’espaceur, appelé également « spacer », sert à séparer les protéines ou les fragments de protéines le composant et à aider au repliement et à l'activité efficace des composants individuels. La séquence peptidique de liaison ou l’espaceur peut comprendre un site de clivage enzymatique pour permettre aux composants polypeptidiques d'être séparés par digestion enzymatique. La séquence peptidique de liaison ou l’espaceur peut être, par exemple, de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 acides aminés ou plus. De préférence, la séquence peptidique de liaison ou l’espaceur a une longueur inférieure à 10, inférieure à 9, inférieure à 8, inférieure à 7, inférieure à 6 ou inférieure à 5 acides aminés. Des exemples de séquence peptidique de liaison ou d’espaceur à utiliser dans les protéines de fusion de la présente invention comprennent (Ser)nThr, où «n» est un entier, de préférence 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. Dans un mode de réalisation préféré, «n» vaut 5. Dans un autre mode de réalisation préféré, «n» vaut 3. Au sens de la présente invention, le terme « gène sphère de sécurité » ou « safe harbor » désigne une région du génome où il est possible d’intégrer du matériel génétique sans perturber la fonction, la transcription et la régulation des séquences codantes natives, ainsi que la structure génique. Un « safe harbor » permet l’expression suffisante de l’acide nucléique exogène sans prédisposer la cellule souche humaine selon l’invention à une transformation maligne ou en altérer la fonction.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, l’acide nucléique exogène est intégré dans un gène sphère de sécurité « safe harbor ». Avantageusement, l’acide nucléique exogène est intégré dans le gène sphère de sécurité « safe harbor » choisi parmi : le site AAVS1 du chromosome 19, le site CCR5 du chromosome 3, le site hROSA26 du chromosome 3, le site 323 du chromosome 1 , le site 325 du chromosome 8, le site 289 du chromosome 1 , le site 227 du chromosome 1 , le site 229 du chromosome 2, le site 253 du chromosome 2, le site 255 du chromosome 5, le site 257 du chromosome 7, le site 259 du chromosome 14, le site 261 du chromosome 17, le site 263 du chromosome X, le site 317 du chromosome 2, le site 303 du chromosome 2 , le site 331 du chromosome 3, le site 283 du chromosome 4, le site 231 du chromosome 4, le site 315 du chromosome 5, le site 327 du chromosome 5, le site 305 du chromosome 5, le site 307 du chromosome 16, le site 309 du chromosome 20, le site 285 du chromosome 6, le site 233 du chromosome 6, le site 311 du chromosome 6, le site 299 du chromosome 6, le site 301 du chromosome 7, le site 293 du chromosome 8, le site 319 du chromosome 11 , le site 333 du chromosome 12, le site 295 du chromosome 12, le site 329 du chromosome 12, le site 297 du chromosome 17, le site 291 du chromosome 22, le site 313 du chromosome X et le site 321 du chromosome X.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le promoteur auquel est liée de manière fonctionnelle la région codant pour une protéine de fusion comprenant une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci, une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci, est un promoteur constitutif. Avantageusement, le promoteur constitutif peut être choisi parmi le promoteur CMV, le promoteur CBA et le promoteur EF1-a. Avantageusement, le promoteur constitutif est le promoteur EF1-a.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, l’acide nucléique exogène comprend en outre un gène marqueur de sélection. Par « gène marqueur de sélection », on entend au sens de la présente invention, une séquence codante pour une protéine marqueur sélectionnable, qui permet la rétention sélective des cellules souches humaines ayant intégré l’acide nucléique exogène pendant la culture et la propagation des cellules. Avantageusement, le gène marqueur de sélection est le gène CD34, avantageusement le gène CD34 ayant subi un épissage, appelé également gène CD34 épissé.
Avantageusement, le gène marqueur de sélection est le gène CD34 épissé de séquence SEQ ID No. 5:
SEQ ID No. 5 (Gène marqueur de sélection CD34 épissé) :
ATGCTGGTCCGCAGGGGCGCGCGCGCAGGGCCCAGGATGCCGCGGGGCTGGACCGC GCTTT GCTT GCT G AGTTT GCT GCCTT CT GGGTT CAT G AGT CTT G ACAACAACGGT ACT G CT ACCCCAG AGTT ACCT ACCCAGGG AACATTTT CAAAT GTTT CT ACAAAT GT AT CCT ACC AAG AAACT ACAACACCT AGT ACCCTT GG AAGT ACCAGCCT GCACCCT GT GT CT CAACAT GGCAAT G AGGCCACAACAAACAT CACAG AAACG ACAGT CAAATT CACAT CT ACCT CT GT G AT AACCT CAGTTT AT GG AAACACAAACT CTT CT GT CCAGT CACAG ACCT CT GT AAT CAG CACAGT GTT CACCACCCCAGCCAACGTTT CAACT CCAG AG ACAACCTT G AAGCCT AGCC T GT CACCT GG AAAT GTTT CAG ACCTTT CAACCACT AGCACT AGCCTT GCAACAT CT CCCA CT AAACCCT AT ACAT CAT CTT CT CCT AT CCT AAGT G ACAT CAAGGCAG AAAT CAAAT GTT CAGGCAT CAG AG AAGT G AAATT G ACT CAGGGCAT CT GCCT GG AGCAAAAT AAG ACCT CC AGCT GT GCGG AGTTT AAG AAGG ACAGGGG AG AGGGCCT GGCCCG AGT GCT GT GT GGG G AGG AGCAGGCT G AT GCT G AT GCT GGGGCCCAGGT AT GCT CCCT GCT CCTT GCCCAGT CT G AGGT G AGGCCT CAGT GT CT ACT GCTGGT CTT GGCCAACAG AACAG AAATTT CCAGC AAACT CCAACTT AT G AAAAAGCACCAAT CT G ACCT G AAAAAGCT GGGG AT CCT AG ATTT C ACT G AGCAAG AT GTT GCAAGCCACCAG AGCT ATT CCCAAAAG ACCCT GATT GCACT GGT CACCT CGGG AGCCCT GCTGGCTGT CTT GGGCAT CACT GGCT ATTT CCT G AT G AAT CGC CGCAGCT GG AGCCCCACAGG AG AAAGGCT GG AGCT GG AACCCT GA
L’utilisation du gène CD34 épissé permet de sélectionner les cellules souches humaines ayant intégré l’acide nucléique exogène sans avoir d’activité de transduction du signal. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le gène marqueur de sélection CD34 épissé est lié de manière fonctionnelle à un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 6 codant pour le peptide 2A.
SEQ ID No. 6 (peptide 2A) :
AG AGCCG AGGGCAGGGG AAGT CTT CT AACAT GCGGGG ACGT GG AGG AAAAT CCCGGG CCC
Le gène marqueur de sélection CD34 épissé est lié de manière fonctionnelle à un acide nucléique codant pour le peptide 2A et est représenté par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID No.7. SEQ ID No. 7 (Gène marqueur de sélection CD34 épissé - peptide 2A) :
AG AGCCG AGGGCAGGGG AAGT CTT CT AACAT GCGGGG ACGT GG AGG AAAAT CCCGGG CCCAT GCT GGT CCGCAGGGGCGCGCGCGCAGGGCCCAGG AT GCCGCGGGGCT GG AC CGCGCTTT GCTT GCT G AGTTT GCT GCCTT CT GGGTT CAT G AGT CTT GACAACAACGGT A CT GCT ACCCCAG AGTT ACCT ACCCAGGG AACATTTT CAAAT GTTT CT ACAAAT GT AT CCT ACCAAG AAACT ACAACACCT AGT ACCCTT GG AAGT ACCAGCCT GCACCCT GT GT CT CAA CAT GGCAAT G AGGCCACAACAAACAT CACAG AAACG ACAGT CAAATT CACAT CT ACCT C T GT G AT AACCT CAGTTT AT GG AAACACAAACT CTT CT GT CCAGT CACAG ACCT CT GT AAT CAGCACAGT GTT CACCACCCCAGCCAACGTTT CAACT CCAG AG ACAACCTT G AAGCCT A GCCT GT CACCT GG AAAT GTTT CAG ACCTTT CAACCACT AGCACT AGCCTT GCAACAT CT C CCACT AAACCCT AT ACAT CAT CTT CT CCT AT CCT AAGT G ACAT CAAGGCAG AAAT CAAAT GTT CAGGCAT CAG AG AAGT G AAATT G ACT CAGGGCAT CT GCCT GG AGCAAAAT AAG ACC T CCAGCT GT GCGG AGTTT AAG AAGG ACAGGGG AG AGGGCCT GGCCCG AGT GCT GT GT GGGG AGG AGCAGGCT G AT GCT G AT GCT GGGGCCCAGGT AT GCT CCCT GCT CCTT GCC CAGT CT G AGGT G AGGCCT CAGT GT CT ACT GCTGGT CTT GGCCAACAG AACAG AAATTT C CAGCAAACT CCAACTT AT G AAAAAGCACCAAT CT G ACCT G AAAAAGCT GGGG AT CCT AG ATTT CACT G AGCAAG AT GTT GCAAGCCACCAG AGCT ATT CCCAAAAG ACCCT GATT GCA CT GGT CACCT CGGG AGCCCT GCT GGCT GT CTT GGGCAT CACT GGCT ATTT CCT G AT G AA T CGCCGCAGCT GG AGCCCCACAGG AG AAAGGCT GG AGCT GG AACCCT GA
Un autre objet de l’invention concerne un vecteur d’expression, par exemple un vecteur viral, comprenant l’acide nucléique exogène tel que défini précédemment.
Au sens de la présente invention, le terme « vecteur » désigne une séquence polynucléotidique contenant l’acide nucléique exogène tel que défini précédemment et des séquences de contrôle en liaison fonctionnelle, de sorte que les cellules souches humaines transformées avec ces séquences sont capables de produire les protéines codées, en particulier la protéine de fusion comprenant une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci et une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle- ci.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule souche humaine a été obtenue par transduction rétrovirale avec un vecteur viral comprenant l’acide nucléique exogène.
Le vecteur comporte généralement un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, le vecteur comprend un acide nucléique de SEQ ID No 8. comprenant : - l’acide nucléique exogène comprenant une région codant pour une protéine de fusion comprenant une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci et une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle-ci tel que défini précédemment, et
- le gène marqueur de sélection lié de manière fonctionnelle à un acide nucléique codant pour le peptide 2A tel que défini précédemment.
SEQ ID No 8 (acide nucléique vectorisé) :
AT GG AACT CAGCGT CCT CCT CTT CCTT GCACT CCT CACAGG ACT CTT GCT ACT CCT GGT T CAGCGCCACCCT AACACCCAT G ACCGCCT CCCACCAGGGCCCCGCCCT CT GCCCCTT TT GGG AAACCTT CT GCAG AT GG AT AG AAG AGGCCT ACT CAAAT CCTTT CT G AGGTT CCG AG AG AAAT AT GGGG ACGT CTT CACGGT ACACCT GGG ACCG AGGCCCGT GGT CAT GCTG T GT GG AGT AG AGGCCAT ACGGG AGGCCCTT GT GG ACAAGGCT G AGGCCTT CT CTGGCC GGGG AAAAAT CGCCAT GGT CG ACCCATT CTT CCGGGG AT AT GGT GT GGT CTTT GCCAAT GG AAACCGCT GG AAGGT GCTT CGGCG ATT CT CT GT G ACCACT AT G AGGG ACTT CGGG A T GGG AAAGCGG AGT GT GG AGG AGCGG ATT CAGG AGG AGGCT CAGT GT CT G AT AG AGG AGCTT CGG AAAT CCAAGGGGGCCCT CAT GG ACCCCACCTT CCT CTT CCAGT CCATT ACC GCCAACAT CAT CT GCT CCAT CGT CTTT GG AAAACG ATT CCACT ACCAAG AT CAAG AGTT C CT G AAG AT G AT G AACTT GTT CT ACCAG ACTTTTT CACT CAT CAGCT CT GT ATT CGGCCAG CT GTTT G AGCT CTT CT CT GGCTT CTT G AAAT ACTTT CCT GGGGCACACAGGCAAGTTT AC AAAAACCT GCAGG AAAT CAAT GCTT ACATT GGCCACAGT GT GG AG AAGCACCGT G AAAC CCT GG ACCCCAGCGCCCCCAAGG ACCT CAT CG ACACCT ACCT GCT CCACAT GG AAAAA G AG AAAT CCAACGCACACAGT G AATT CAGCCACCAG AACCT CAACCT CAACACGCT CT C GCT CTT CTTT GCT GGCACT G AG ACCACCAGCACCACT CT CCGCT ACGGCTT CCT GCT CA TGCT CAAAT ACCCT CAT GTT GCAG AG AG AGT CT ACAGGG AG ATT G AACAGGT GATT GGC CCACAT CGCCCT CCAG AGCTT CAT G ACCG AGCCAAAAT GCCAT ACACAG AGGCAGT CAT CT AT G AG ATT CAG AG ATTTT CCG ACCTT CT CCCCAT GGGT GT GCCCCACATT GT CACCC AACACACCAGCTT CCG AGGGT ACAT CAT CCCCAAGG ACACAG AAGT ATTT CT CAT CCT G AGCACT GCT CT CCAT GACCCACACT ACTTT G AAAAACCAG ACGCCTT CAAT CCT G ACCA CTTT CT GG AT GCCAAT GGGGCACT G AAAAAGACT G AAGCTTTT AT CCCCTT CT CCTT AG GG AAGCGG ATTT GT CTT GGT G AAGGCAT CGCCCGT GCGG AATT GTT CCT CTT CTT CACC ACCAT CCT CCAG AACTT CT CCAT GGCCAGCCCCGT GGCCCCAG AAGACAT CG AT CT GA CACCCCAGG AGT GT GGTT GGGGCAAAAT ACCCCCAACAT ACCAG AT CCGCTT CCT GCC CCGCT CG AGCT CT ACG ATT CAG ACATT G ACCT CCT CT GT CAG AG AG AGCAGCTTT GTGG AAAAG AT G AAG AAAACGGGG AGG AACAT CAT CGT GTT CT ACGGCT CCCAG ACGGGG AC T GCAG AGG AG TTT GCCAACCGCCT GT CCAAGG ACGCCCACCGCT ACGGG AT GCG AGG CAT GT CAGCGG ACCCT G AGG AGT AT G ACCT GGCCG ACCT G AGCAGCCT GCCAG AG AT C G ACAACGCCCT GGT GGTTTT CT GCAT GGCCACCT ACGGT G AGGG AG ACCCCACCG ACA ATGCCCAGG ACTT CT ACG ACT GGCT GCAGG AG ACAG ACGT GG AT CT CT CT GGGGT CAA GTT CGCGGT GTTT GGT CTT GGG AACAAG ACCT ACG AGCACTT CAAT GCCAT GGGCAAGT ACGT GG ACAAGCGGCTGG AGCAGCT CGGCGCCCAGCGCAT CTTT G AGCT GGGGTT GG GCG ACG ACG AT GGG AACTT GG AGG AGG ACTT CAT CACCT GGCG AGAGCAGTT CT GGCC GGCCGT GT GT G AACACTTT GGGGT GG AAGCCACT GGCG AGG AGT CCAGCATT CGCCA GT ACG AGCTT GT GGT CCACACCG ACAT AG AT GCGGCCAAGGT GT ACAT GGGGG AG AT G GGCCGGCT G AAG AGCT ACG AG AACCAG AAGCCCCCCTTT G AT GCCAAG AAT CCGTT CC TGGCT GCAGT CACCACCAACCGG AAGCT G AACCAGGG AACCG AGCGCCACCT CAT GCA CCT GG AATT GG ACAT CT CGG ACT CCAAAAT CAGGT AT G AAT CT GGGG ACCACGT GGCT GT GT ACCCAGCCAACG ACT CT GCT CT CGT CAACCAGCT GGGCAAAAT CCT GGGT GCCG ACCT GG ACGT CGT CAT GT CCCT G AACAACCT GG AT G AGG AGT CCAACAAG AAGCACCC ATT CCCGT GCCCT ACGT CCT ACCGCACGGCCCT CACCT ACT ACCT GG ACAT CACCAACC CGCCGCGT ACCAACGT GCT GT ACG AGCT GGCGCAGT ACGCCT CGGAGCCCT CGG AGC AGG AGCT GCT GCGCAAG AT GGCCT CCT CCT CCGGCG AGGGCAAGGAGCT GT ACCT GA GCT GGGT GGT GG AGGCCCGG AGGCACAT CCT GGCCAT CCT GCAGGACT GCCCGT CCC T GCGGCCCCCCAT CG ACCACCT GT GT G AGCT GCT GCCGCGCCT GCAGGCCCGCT ACT ACT CCAT CGCCT CAT CCT CCAAGGT CCACCCCAACT CT GT GCACAT CT GT GCGGT GGTT GT GG AGT ACG AG ACCAAGGCCGGCCGCAT CAACAAGGGCGT GGCCACCAACT GGCTG CGGGCCAAGG AGCCT GCCGGGG AG AACGGCGGCCGT GCGCT GGT GCCCAT GTT CGT GCGCAAGT CCCAGTT CCGCCT GCCCTT CAAGGCCACCACGCCT GT CAT CAT GGT GGGC CCCGGCACCGGGGT GGCACCCTT CAT AGGCTT CAT CCAGG AGCGGGCCT GGCT GCG A CAGCAGGGCAAGG AGGT GGGGG AG ACGCT GCT GT ACT ACGGCT GCCGCCGCT CGG AT G AGG ACT ACCT GT ACCGGG AGG AGCT GGCGCAGTT CCACAGGG ACGGT GCGCT CACC CAGCT CAACGT GGCCTT CT CCCGGG AGCAGT CCCACAAGGT CT ACGT CCAGCACCT GC T AAAGCAAG ACCG AG AGCACCT GT GG AAG TT G AT CG AAGGCGGT GCCCACAT CT ACGT CT GT GGGG AT GCACGG AACAT GGCCAGGG AT GT GCAG AACACCTT CT ACG ACAT CGT G GCT G AGCT CGGGGCCAT GG AGCACGCGCAGGCGGT GG ACT ACAT CAAG AAACT G AT G ACCAAGGGCCGCT ACT CCCT GG ACGT GT GG AGCAG AGCCG AGGGCAGGGG AAGT CTT CT AACAT GCGGGG ACGT GG AGG AAAAT CCCGGGCCCAT GCTGGT CCGCAGGGGCGCG CGCGCAGGGCCCAGGAT GCCGCGGGGCT GGACCGCGCTTT GCTT GCT G AGTTT GCTG CCTT CT GGGTT CAT G AGT CTT G ACAACAACGGT ACT GCT ACCCCAG AGTT ACCT ACCCA GGGAACATTTT CAAAT GTTT CT ACAAAT GT AT CCT ACCAAG AAACT ACAACACCT AGT AC CCTT GG AAGT ACCAGCCT GCACCCT GT GT CT CAACAT GGCAAT G AGGCCACAACAAACA T CACAGAAACG ACAGT CAAATT CACAT CT ACCT CT GT G AT AACCT CAGTTT AT GG AAACA CAAACT CTT CT GT CCAGT CACAG ACCT CT GT AAT CAGCACAGT GTT CACCACCCCAGCC AACGTTT CAACT CCAGAG ACAACCTT G AAGCCT AGCCT GT CACCT GG AAAT GTTT CAG A CCTTT CAACCACT AGCACT AGCCTT GCAACAT CT CCCACT AAACCCT AT ACAT CAT CTT C T CCT AT CCT AAGT G ACAT CAAGGCAG AAAT CAAAT GTT CAGGCAT CAG AG AAGT G AAATT G ACT CAGGGCAT CT GCCT GG AGCAAAAT AAG ACCT CCAGCT GT GCGG AGTTT AAG AAG G ACAGGGG AG AGGGCCT GGCCCG AGT GCT GT GT GGGG AGG AGCAGGCT G AT GCT G AT GCT GGGGCCCAGGT AT GCT CCCT GCT CCTT GCCCAGT CT G AGGT G AGGCCT CAGT GT C T ACT GCT GGT CTT GGCCAACAG AACAG AAATTT CCAGCAAACT CCAACTT AT G AAAAAGC ACCAAT CT G ACCT G AAAAAGCT GGGG AT CCT AG ATTT CACT G AGCAAG AT GTT GCAAGC CACCAG AGCT ATT CCCAAAAG ACCCT GATT GCACT GGT CACCT CGGGAGCCCT GCT GG CT GT CTT GGGCAT CACT GGCT ATTT CCT G AT GAAT CGCCGCAGCT GGAGCCCCACAGG AG AAAGGCT GG AGCT GG AACCCT G A
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le vecteur utilisé est un vecteur lentiviral, avantageusement le vecteur lentiviral pLenti-l I l-EF 1 a, commercialisé par la société Applied Biological Materials Inc.
Le vecteur est maintenu de façon stable dans la cellule souche humaine et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de la cellule hôte utilisée. De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultants peuvent être introduits dans la cellule souche humaine appropriée par des méthodes standards, telles que la lipofection, l'électroporation, l'utilisation d'agents polycationiques, le choc thermique, ou des méthodes chimiques.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, l’acide nucléique exogène peut être introduit par différentes méthodes dans un des gènes sphère de sécurité « safe harbor », en utilisant notamment des techniques de nucléation effectrice de type activateur de transcription (TALEN), regroupées en techniques de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR / Cas9) ou de nucléases à doigts de zinc (ZFN). Avantageusement, l’intégration de l’acide nucléique exogène dans un gène sphère de sécurité « safe harbor » est obtenue en utilisant des répétitions palindromiques courtes régulièrement groupées (CRISPR / Cas9). L'utilisation de cette technologie dans l'édition du génome est bien décrite dans la technique. En résumé, CRISPR est un système de nucléase microbienne impliqué dans la défense contre les phages et les plasmides envahisseurs. Les locus CRISPR chez les hôtes microbiens contiennent une combinaison de gènes (Cas) associés à CRISPR ainsi que des éléments d'ARN non codants capables de programmer la spécificité du clivage des acides nucléiques (sgRNA) induit par CRISPR. Trois types (l-lll) de systèmes CRISPR ont été identifiés sur un large éventail d'hôtes bactériens. Une caractéristique clé de chaque locus CRISPR est la présence d'un tableau de séquences répétitives (répétitions directes) entrecoupées de courtes séquences de séquences non répétitives (espaceurs). La matrice CRISPR non codante est transcrite et clivée au sein de répétitions directes en ARNrc courts contenant des séquences d'espaceur individuelles, qui dirigent les nucléases Cas vers le site cible (protospacer). Le type II CRISPR est l’un des systèmes les mieux caractérisés et réalise une cassure ADN double brin ciblée en quatre étapes séquentielles. Premièrement, deux ARN non codants, la matrice de pré-ARNr et le tracrARN, sont transcrits à partir du locus CRISPR. Deuxièmement, le tracrRNA s'hybride aux régions répétées du pré-ARNt et intervient dans le traitement du pré-ARNr en ARNr matures contenant des séquences d'espaceur individuelles. Troisièmement, le complexe ARNt mature: tracrARN dirige Cas9 sur l’ADN cible via l’appariement des bases de Watson- Crick entre l’espaceur situé sur l’ARNr et le protospacer situé sur l’ADN cible, à côté du motif adjacent protospracer (PAM), une exigence supplémentaire pour la reconnaissance de la cible. Enfin, Cas9 intervient dans le clivage de l’ADN cible afin de créer une rupture à double brin dans le protospacer. Cas9 est donc la protéine caractéristique du système CRISPR-Cas de type II et une grande nucléase d’ADN monomère guidée vers une séquence cible ADN adjacente au motif de séquence PAM (protospacer adjacente motif) par un complexe de deux ARN non codants : CRIPSR RNA (ARNr) et ARNr trans-activant (tracrRNA). La protéine Cas9 contient deux domaines de nucléase homologues aux nucléases RuvC et HNH. Le domaine de nucléase HNH coupe le brin d'ADN complémentaire tandis que le domaine de type RuvC coupe le brin non complémentaire et, par conséquent, une coupe franche est introduite dans l'ADN cible. L'expression hétérologue de Cas9 avec un sgRNA peut introduire des cassures double brin (DSB) spécifiques au site dans l'ADN génomique de cellules vivantes de divers organismes. Pour les applications dans les organismes eucaryotes, des versions optimisées en codons de Cas9, qui est originaire de la bactérie Streptococcus pyogenes, ont été utilisées. L'ARN à guide unique (sgRNA) est le deuxième composant du système CRISPR / Cas qui forme un complexe avec la nucléase Cas9. Le sgRNA est une chimère d'ARN synthétique créée par la fusion d'ARNc et de tracrARN. La séquence guide d'ARNg située à l'extrémité 5 'confère la spécificité à la cible ADN. Par conséquent, en modifiant la séquence guide, il est possible de créer des sgRNA avec différentes spécificités de cible. La longueur canonique de la séquence guide est de 20 pb. Les vecteurs d'expression Cas9 destinés à être utilisés dans les procédés de l'invention peuvent être construits comme décrit dans la technique.
Un autre objet de l’invention concerne la cellule souche humaine génétiquement modifiée telle que définie précédemment pour son utilisation comme médicament. En particulier, la présente invention concerne la cellule souche humaine génétiquement modifiée telle que définie précédemment pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer et/ou les récidives de cancer et/ou les métastases associées.
Avantageusement, le cancer est un cancer choisi parmi : les cancers touchant le système nerveux central, tels que les astrocytomes et les gliomes ; les cancers des voies aérodigestives supérieures (ORL), tels que le cancer des lèvres, le cancer de la cavité buccale, le cancer de l’oropharynx et le cancer du nasopharynx ; les cancers des glandes endocrines, tels que le cancer de la thyroïde, le cancer des glandes surrénales et les tumeurs neuroendocrines extra-digestives et pulmonaires ; les cancers des glandes exocrines, tels que le cancer du sein et le cancer du pancréas ; les cancers touchant le thorax, tels que le cancer de la plèvre et le cancer du poumon ; les cancers digestifs, tels que le cancer de l’œsophage, le cancer de l’estomac, le cancer de l’intestin grêle, le cancer du côlon et le cancer du rectum et/ou du canal anal ; les cancers génitaux, tels que le cancer de la prostate, le cancer du col de l’utérus, le cancer de l’endomètre, le cancer du vagin et le cancer de la vulve ; les cancers urinaires, tels que le cancer du rein et le cancer de la vessie ; les sarcomes, tels que le sarcome des tissus mous, les tumeurs stromales gastro intestinales (GIST) et le sarcome de l’os ; les cancers de la peau, tel que le mélanome, les cancers hépatobiliaires, tels que le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome, la liste n’étant pas limitative.
Avantageusement, l’invention concerne la cellule souche humaine génétiquement modifiée telle que définie précédemment pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des tumeurs solides, et en particulier les carcinomes hépatocellulaires, et/ou les récidives de cancer et/ou des métastases associées.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon l’invention est particulièrement utile pour prévenir et/ou traiter le cancer et/ou les récidives de cancer et/ou les métastases associées.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon l’invention est particulièrement utile pour prévenir et/ou traiter les tumeurs solides et/ou les récidives de cancer et/ou les métastases associées.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon l’invention est particulièrement utile pour prévenir et/ou traiter un cancer et/ou les récidives de cancer et/ou les métastases associées choisi parmi : les cancers touchant le système nerveux central, tels que les astrocytomes et les gliomes ; les cancers des voies aérodigestives supérieures (ORL), tels que le cancer des lèvres, le cancer de la cavité buccale, le cancer de l’oropharynx et le cancer du nasopharynx ; les cancers des glandes endocrines, tels que le cancer de la thyroïde, le cancer des glandes surrénales et les tumeurs neuroendocrines extra-digestives et pulmonaires ; les cancers des glandes exocrines, tels que le cancer du sein et le cancer du pancréas ; les cancers touchant le thorax, tels que le cancer de la plèvre et le cancer du poumon ; les cancers digestifs, tels que le cancer de l’œsophage, le cancer de l’estomac, le cancer de l’intestin grêle, le cancer du côlon et le cancer du rectum et/ou du canal anal ; les cancers génitaux, tels que le cancer de la prostate, le cancer du col de l’utérus, le cancer de l’endomètre, le cancer du vagin et le cancer de la vulve ; les cancers urinaires, tels que le cancer du rein et le cancer de la vessie ; les sarcomes, tels que le sarcome des tissus mous, les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) et le sarcome de l’os ; les cancers de la peau, tel que le mélanome, les cancers hépatobiliaires, tels que le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome, la liste n’étant pas limitative.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon l’invention est particulièrement utile pour prévenir et/ou traiter les carcinomes hépatocellulaires et/ou les métastases associées.
Un autre aspect de l’invention concerne un procédé de sélection de cellules souches génétiquement modifiées telle que définies précédemment, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes de : a) transduction des cellules souches humaines avec un vecteur viral comprenant l’acide nucléique exogène, b) mise en culture des cellules souches humaines issues de l’étape a) dans un milieu de culture prédéfini , et c) sélection les cellules souches humaines génétiquement modifiées exprimant le gène marqueur de sélection à leur surface membranaire.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le milieu de culture utilisé est un milieu spécifique des cellules souches humaines, tel que le milieu Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2, commercialisé par Promocell (Référence produit : C28009).
Avantageusement, le milieu de culture utilisé comprend 50% de milieu ayant été en contact avec les cellules souches humaines non transduites pendant 24h et 50% du même milieu frais.
Dans un mode de réalisation particulier, le gène marqueur de sélection est le gène CD34 épissé. Avantageusement, la sélection des cellules souches humaines génétiquement modifiées exprimant le gène marqueur de sélection à leur surface membranaire est réalisée par cytométrie de flux, en particulier au moyen de l’appareil BD-FACS ARIAIII™ en utilisant des anticorps anti-CD34 couplés au fluorochrome « brillant violet 421 » (Brillant Violet 421™) anti-human CD34 (Référence produit : 343609 chez Biolegend).
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon l’invention comme principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition pharmaceutique selon l’invention comprend une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées comme principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées comme principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tels que définis ci-dessus est particulièrement utile pour prévenir et/ou traiter le cancer et/ou les récidives de cancer et/ou les métastases associées.
Avantageusement, la composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées comme principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tels que définis ci- dessus est administrée à un patient souffrant ou suspecté de souffrir d’un cancer et/ou les récidives de cancer et/ou de métastases associées.
Avantageusement, le cancer est un cancer à tumeurs solides. Par « tumeur solide » au sens de la présente invention, on entend un carcinome ou un sarcome. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le cancer est un cancer choisi parmi : les cancers touchant le système nerveux central, tels que les astrocytomes et les gliomes ; les cancers des voies aérodigestives supérieures (ORL), tels que le cancer des lèvres, le cancer de la cavité buccale, le cancer de l’oropharynx et le cancer du nasopharynx ; les cancers des glandes endocrines, tels que le cancer de la thyroïde, le cancer des glandes surrénales et les tumeurs neuroendocrines extra-digestives et pulmonaires ; les cancers des glandes exocrines, tels que le cancer du sein et le cancer du pancréas ; les cancers touchant le thorax, tels que le cancer de la plèvre et le cancer du poumon ; les cancers digestifs, tels que le cancer de l’œsophage, le cancer de l’estomac, le cancer de l’intestin grêle, le cancer du côlon et le cancer du rectum et/ou du canal anal ; les cancers génitaux, tels que le cancer de la prostate, le cancer du col de l’utérus, le cancer de l’endomètre, le cancer du vagin et le cancer de la vulve ; les cancers urinaires, tels que le cancer du rein et le cancer de la vessie ; les sarcomes, tels que le sarcome des tissus mous, les tumeurs stromales gastro intestinales (GIST) et le sarcome de l’os ; les cancers de la peau, tel que le mélanome, les cancers hépatobiliaires, tels que le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome, la liste n’étant pas limitative.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées comme principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tels que définis ci-dessus est particulièrement utile pour prévenir et/ou traiter les tumeurs solides, et en particulier les carcinomes hépatocellulaires, et/ou les récidives de cancer et/ou de métastases associées.
Avantageusement, la composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées comme principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tels que définis ci- dessus est administrée à un patient souffrant ou suspecté de souffrir de tumeurs solides, et en particulier de carcinomes hépatocellulaires, et/ou de récidives de cancer et/ou de métastases associées.
Dans un mode de réalisation, le patient peut être un être humain, homme ou femme, quel que soit l'âge. Dans un autre mode de réalisation, le patient peut être un animal non humain, avantageusement un mammifère non humain, par exemple un chien, un chat, une souris, un rat, un hamster, un lapin, un chinchilla, un cheval, une vache, un porc, un mouton, une chèvre ou un primate.
Au sens de la présente invention, les termes « thérapeutiquement efficace » ou « quantité efficace à traiter » ou « pharmaceutiquement efficace » désignent la quantité de cellules souches humaines génétiquement modifiées nécessaires pour inhiber ou inverser une maladie, avantageusement un cancer, et en particulier pour traiter les tumeurs solides et notamment les carcinomes hépatocellulaires, et/ou des métastases associées. La détermination d'une quantité thérapeutiquement efficace dépend spécifiquement de facteurs tels que la toxicité et l'efficacité du médicament. Ces facteurs différeront en fonction d'autres facteurs tels que l'activité, la biodisponibilité relative, le poids corporel du patient, la sévérité des effets secondaires indésirables et le mode d'administration préféré. La toxicité peut être déterminée en utilisant des méthodes bien connues dans l'art. Il en est de même pour l’efficacité. Une quantité pharmaceutiquement efficace est, par conséquent, une quantité qui est considérée par le clinicien comme tolérable sur le plan toxicologique, mais efficace.
Le dosage peut être ajusté de manière appropriée pour atteindre les niveaux de médicament (par exemple, de cellules souches humaines génétiquement modifiées) souhaités, locaux ou systémiques, en particulier trans-artérielle, en fonction du mode d'administration. Dans le cas où la réponse chez un patient est insuffisante à de telles doses, des doses encore plus élevées (ou des doses plus efficaces par une voie d'administration différente, plus localisée) peuvent être utilisées dans la mesure où la tolérance du patient le permet. Plusieurs injections à environ une semaine d’intervalle peuvent également être utilisées pour atteindre des niveaux appropriés de métabolites toxiques formés pour provoquer la mort des cellules tumorales et le déclenchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale. « Dose » et « dosage » sont utilisés de manière interchangeable ici.
La fréquence d’injection est liée à la demi-vie des cellules souches humaines génétiquement modifiées.
Dans un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l’invention est administrée au patient à raison d’une administration par semaine pendant au moins quatre semaines. Avantageusement, la composition pharmaceutique selon l’invention est administrée au patient à raison de deux administrations, avantageusement trois administrations, avantageusement quatre administrations, avantageusement cinq administrations, avantageusement six administrations, avantageusement sept administrations par semaine. Avantageusement, la composition pharmaceutique selon l’invention est administrée au patient pendant au moins quatre semaines, avantageusement au moins cinq semaines, avantageusement au moins six semaines, avantageusement au moins sept semaines, avantageusement au moins huit semaines, avantageusement au moins neuf semaines, avantageusement au moins dix semaines.
Dans un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l’invention comprend en outre au moins un second principe actif. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, l’au moins un second principe actif peut interagir de manière synergique avec les cellules souches humaines génétiquement modifiées selon l’invention.
Avantageux, le second principe actif est un agent anti-cancéreux. À titre d’exemple de second principe actif, on peut notamment citer les agents cytostatiques, les agents cytotoxiques, les agents cytoprotecteurs, les agents inhibiteurs de croissance, les toxines et les combinaisons de ceux-ci. Des exemples d'agents anti-cancéreux pouvant être utilisés en thérapie tumorale avec les cellules souches humaines génétiquement modifiées de l'invention comprennent le cyclophosphamide (numéro CAS 50-18-0, également connu sous le nom de cyclophosphane, et les marques commerciales Endoxan®, Neosar®, Procytox® et Revimmune®), AQ4N (1 , 4). -bis - {[2- (diméthylamino-N-oxyde) éthyl] amino} 5,8- dihydroxyanthracène-9,10-dione, également connu sous le nom de banoxantrone®), ifosfamide (numéro CAS 3778-73-2), bezyloxyrésorufine, 7 -Ethoxy-4-trifluoro-méthyl- coumarine (EFC), Bupropion, thiotépa (, N'N'-triéthylènethiophosphoramide, numéro CAS 52-24-4), mytomycine C (numéro CAS 50-0-07), tirapazamine (SR-4233, numéro CAS 27314-97-2). ). À titre d’exemples d’agent cytoprotecteur, on peut notamment citer le mesna, également connu sous la marque commerciale Uromitexian®. Avantageusement, le second principe actif peut comprendre une combinaison d’agents anticancéreux, tels que ceux listés ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le second principe actif est une combinaison d’un anticancéreux et d’un agent cytoprotecteur. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le second principe actif est une combinaison de cyclophosphamide et de mesna.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l’invention comprend les cellules souches humaines génétiquement modifiées telles que définies précédemment comme principe actif et le cyclophosphamide en tant que second principe actif.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l’invention comprend les cellules souches humaines génétiquement modifiées telles que définies précédemment comme principe actif et le mesna en tant que second principe actif.
Dans un mode de réalisation particulier selon l’invention, le second principe actif peut être sous la forme de granules, de poudres, de comprimés, de comprimés enrobés, de (micro)capsules, de sirops, d’émulsions, de suspensions ou de préparations à libération prolongée. Dans un autre mode de réalisation particulier selon l’invention, le second principe actif peut être sous une forme administrable par voie parentérale.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l’invention comprend les cellules souches humaines génétiquement modifiées telles que définies précédemment comme principe actif et le cyclophosphamide en tant que second principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l’invention comprend les cellules souches humaines génétiquement modifiées telles que définies précédemment comme principe actif et le cyclophosphamide et le mesna en tant que second principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, lorsque la composition pharmaceutique comprend un second principe actif, la composition pharmaceutique est adaptée pour une administration simultanée ou une administration séquentielle des cellules souches humaines génétiquement modifiées et du second principe actif.
Au sens de la présente invention, on entend par « administration simultanée », une administration des cellules souches humaines génétiquement modifiées et du second principe actif en même temps, au même moment, à un patient en des quantités thérapeutiquement efficaces pour permettre l’effet synergique de la composition pharmaceutique. Cela ne signifie pas pour autant que les cellules souches humaines génétiquement modifiées et le second principe actif sont nécessairement administrés sous la forme d'un mélange ; ils peuvent en effet être administrés simultanément mais séparément, sous la forme de compositions distinctes.
Par « présents dans deux compositions distinctes », on entend que les cellules souches humaines génétiquement modifiées et le second principe actif sont physiquement séparés. Ils sont alors mis en oeuvre, administrés séparément en des quantités thérapeutiquement efficaces pour permettre l’effet synergique de la composition pharmaceutique, sans mélange préalable, dans plusieurs (au moins deux) formes posologiques (par exemple deux compositions distinctes).
Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, les cellules souches humaines génétiquement modifiées et le second principe actif peuvent être présents dans une même composition en des quantités thérapeutiquement efficaces pour permettre l’effet synergique de la composition pharmaceutique. Au sens de la présente invention, on entend par « présents dans une même composition », la combinaison physique des cellules souches humaines génétiquement modifiées et le second principe actif. Les cellules souches humaines génétiquement modifiées et le second principe actif sont alors nécessairement administrés simultanément puisqu'ils sont administrés ensemble, sous la forme d'un mélange, dans une même forme posologique (par exemple dans une seule composition contenant les cellules souches humaines génétiquement modifiées et l’agent anti-cancéreux) et en des quantités thérapeutiquement efficaces pour permettre l’effet synergique de la composition pharmaceutique.
Au sens de la présente invention, l’expression « administration séquentielle », signifie que les cellules souches humaines génétiquement modifiées et le second principe actif sont administrés en des quantités thérapeutiquement efficaces pour permettre l’effet synergique de la composition pharmaceutique, non pas simultanément mais séparément dans le temps, l'un après l'autre. Les termes « précéder » ou « précédant » et « suivre » ou « suivant » s'appliquent alors. Le terme « précéder » ou « précédant » est utilisé lorsqu'un composé de la composition pharmaceutique selon l'invention est administré quelques minutes ou plusieurs heures, voire plusieurs jours avant l'administration des autre(s) composé(s) de la composition pharmaceutique. À l'inverse, le terme « suivre » ou « suivant » est utilisé lorsqu'un composé de la composition pharmaceutique est administré quelques minutes ou plusieurs heures, voire plusieurs jours après l'administration des autre(s) composé(s) de la composition pharmaceutique. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, les cellules souches humaines génétiquement modifiées sont administrées quelques jours avant le second principe actif.
Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, lorsque la composition pharmaceutique comprend un second principe actif, la composition pharmaceutique est adaptée pour une administration séquentielle des cellules souches humaines génétiquement modifiées et du second principe actif. Avantageusement, le second principe actif est le cyclophosphamide utilisé seul ou en combinaison avec le mesna.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les cellules souches humaines génétiquement modifiées sont administrées au patient, puis deux à trois jours après l’administration des cellules souches humaines génétiquement modifiées, le cyclophosphamide, seul ou en combinaison avec le mesna, est administré à ce même patient, et cela à raison de deux administrations de cellules souches humaines génétiquement modifiées et de cyclophosphamide, seul ou en combinaison avec le mesna, par semaine pendant au moins quatre semaines, avantageusement au moins cinq semaines, avantageusement au moins six semaines, avantageusement au moins sept semaines, avantageusement au moins huit semaines, avantageusement au moins neuf semaines, avantageusement au moins dix semaines.
En fonction du mode d'administration prévu in vivo, la composition pharmaceutique utilisée peut être sous la forme de dosage solide, semi-solide ou liquide comme par exemple des comprimés, des pilules, des poudres, des capsules, des gels, des pommades, des liquides, des suspensions ou similaires. De préférence, les compositions pharmaceutiques sont administrées sous des formes posologiques unitaires appropriées pour une administration unique de quantités posologiques précises. Les compositions pharmaceutiques peuvent également comprendre, en fonction de la formulation souhaitée, au moins un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable, qui sont définis comme des véhicules à base aqueuse couramment utilisés pour les formulations destinées à une administration humaine. Le diluant est choisi de manière à ne pas affecter l'activité biologique des composés actifs présents dans la composition pharmaceutique de l'invention. Des exemples de tels diluants sont l'eau distillée, le sérum physiologique, la solution de Ringer, la solution de dextrose et la solution de Hank. Des quantités efficaces d'un tel diluant ou support sont des quantités efficaces pour obtenir une formulation pharmaceutiquement acceptable en termes de solubilité des composants, d'activité biologique, etc. Dans certains modes de réalisation, les compositions pharmaceutiques fournies ici sont stériles.
Des formes de préparation pharmaceutique liquides convenables peuvent notamment comprendre des solutions aqueuses ou salines, lesdites solutions aqueuses ou salines pouvant être micro-encapsulées, encochées, appliquées sur des particules d'or microscopiques, contenues dans des liposomes.
L’administration de la composition pharmaceutique ou la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon la présente invention peuvent se faire par n’importe quelle voie d’administration, y compris par voie orale, topique, parentérale (également appelée voie systémique ou générale), intramusculaire, intranasale, sublinguale, intratrachéale, par inhalation, oculaire, vaginale et rectale. Des voies d'administration intracapsulaire, intraveineuse, trans-artérielle, intra-artérielle et intrapéritonéale peuvent également être utilisées. L'homme du métier saura choisir la voie d'administration appropriée en fonction du trouble à traiter.
Avantageusement, la composition pharmaceutique ou la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon la présente invention peuvent être administrées à un sujet par voie parentérale, avantageusement par voie trans-artérielle.
Les compositions, lorsqu'il est souhaitable de les administrer par voie systémique, peuvent être formulées pour une administration parentérale par injection, par exemple, par injection de bolus ou perfusion continue. Les formulations pour injection peuvent être présentées sous une forme posologique unitaire, par exemple dans des ampoules ou dans des récipients à doses multiples, avec un conservateur ajouté. Les compositions peuvent prendre des formes telles que des suspensions, des solutions ou des émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux, et peuvent contenir des agents de formulation tels que des agents de suspension, des stabilisants et/ou des dispersants.
Les formulations pharmaceutiques pour administration parentérale comprennent des solutions aqueuses des compositions actives sous forme soluble dans l'eau. De plus, des suspensions des compositions actives peuvent être préparées sous forme de suspensions pour injection huileuse appropriées. Les solvants ou véhicules lipophiles appropriés comprennent les huiles grasses telles que l'huile de sésame, ou les esters d'acides gras synthétiques, tels que l'oléate d'éthyle ou les triglycérides, ou les liposomes. Les suspensions d'injection aqueuses peuvent contenir des substances qui augmentent la viscosité de la suspension, telles que la carboxyméthylcellulose de sodium, le sorbitol ou le dextrane. De manière optionnelle, la suspension peut également contenir des stabilisants ou agents appropriés qui augmentent la solubilité des compositions pour permettre la préparation de solutions fortement concentrées. En variante, les compositions actives peuvent être sous forme de poudres pour constituer un véhicule approprié, par exemple de l'eau stérile apyrogène, avant utilisation. De manière encore plus avantageuse, la composition pharmaceutique ou la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon la présente invention peuvent être administrées à un patient par voie trans-artérielle. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition pharmaceutique ou la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon la présente invention sont sous une forme adaptée pour son administration par voie trans artérielle.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les cellules souches humaines génétiquement modifiées selon la présente invention représentent à raison de 0,5 à 98% en poids, voire plus, du poids total de la composition pharmaceutique considérée.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de la présente invention, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend uniquement les cellules souches humaines génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, en tant que principe actif unique.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de traitement préventif du cancer et/ou des métastases associées, comprenant l'administration au patient de cellules souches humaines génétiquement modifiées ou d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tel que défini précédemment.
Au sens de la présente invention, le terme « prévention » ou « prophylaxie » ou « traitement préventif » ou « traitement prophylactique » comprend un traitement conduisant à la prévention d’une maladie ainsi qu’un traitement réduisant et/ou retardant l’incidence d’une maladie ou le risque de survenue de la maladie.
Selon la présente invention, la cellule souche humaine génétiquement modifiée est particulièrement efficace pour empêcher les récidives et l’apparition de nouvelles métastases, en provoquant une réponse immunitaire anti-tumorale forte, induisant ainsi un effet protecteur contre les récidives et les métastases.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la présente invention une méthode de traitement préventif du cancer et/ou les récidives de cancer et/ou des métastases associées, comprenant l'administration au patient de cellules souches humaines génétiquement modifiées ou d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tels que définis précédemment et un second principe actif tel que défini précédemment. Avantageusement, le cancer est un cancer à tumeurs solides. Par « tumeur solide » au sens de la présente invention, on entend un carcinome ou un sarcome. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le cancer est un cancer choisi parmi : les cancers touchant le système nerveux central, tels que les astrocytomes et les gliomes ; les cancers des voies aérodigestives supérieures (ORL), tels que le cancer des lèvres, le cancer de la cavité buccale, le cancer de l’oropharynx et le cancer du nasopharynx ; les cancers des glandes endocrines, tels que le cancer de la thyroïde, le cancer des glandes surrénales et les tumeurs neuroendocrines extra-digestives et pulmonaires ; les cancers des glandes exocrines, tels que le cancer du sein et le cancer du pancréas ; les cancers touchant le thorax, tels que le cancer de la plèvre et le cancer du poumon ; les cancers digestifs, tels que le cancer de l’œsophage, le cancer de l’estomac, le cancer de l’intestin grêle, le cancer du côlon et le cancer du rectum et/ou du canal anal ; les cancers génitaux, tels que le cancer de la prostate, le cancer du col de l’utérus, le cancer de l’endomètre, le cancer du vagin et le cancer de la vulve ; les cancers urinaires, tels que le cancer du rein et le cancer de la vessie ; les sarcomes, tels que le sarcome des tissus mous, les tumeurs stromales gastro intestinales (GIST) et le sarcome de l’os ; les cancers de la peau, tel que le mélanome, les cancers hépatobiliaires, tels que le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome, la liste n’étant pas limitative. Avantageusement, le cancer est une tumeur solide, en particulier un carcinome hépatocellulaire, et/ou les récidives de cancer et/ou des métastases associées.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la présente invention concerne une méthode de traitement préventif du carcinome hépatocellulaire, comprenant l'administration au patient de cellules souches humaines génétiquement modifiées ou d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tel que défini précédemment.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la présente invention concerne une méthode de traitement préventif du carcinome hépatocellulaire, comprenant l'administration au patient de cellules souches humaines génétiquement modifiées ou d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tels que définis précédemment et un second principe actif tel que défini précédemment.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif dans la fabrication d'un médicament destiné à la prévention du cancer et/ou les récidives de cancer et/ou des métastases associées.
Avantageusement, le cancer est un cancer à tumeurs solides. Par « tumeur solide » au sens de la présente invention, on entend un carcinome ou un sarcome. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le cancer est un cancer choisi parmi : les cancers touchant le système nerveux central, tels que les astrocytomes et les gliomes ; les cancers des voies aérodigestives supérieures (ORL), tels que le cancer des lèvres, le cancer de la cavité buccale, le cancer de l’oropharynx et le cancer du nasopharynx ; les cancers des glandes endocrines, tels que le cancer de la thyroïde, le cancer des glandes surrénales et les tumeurs neuroendocrines extra-digestives et pulmonaires ; les cancers des glandes exocrines, tels que le cancer du sein et le cancer du pancréas ; les cancers touchant le thorax, tels que le cancer de la plèvre et le cancer du poumon ; les cancers digestifs, tels que le cancer de l’œsophage, le cancer de l’estomac, le cancer de l’intestin grêle, le cancer du côlon et le cancer du rectum et/ou du canal anal ; les cancers génitaux, tels que le cancer de la prostate, le cancer du col de l’utérus, le cancer de l’endomètre, le cancer du vagin et le cancer de la vulve ; les cancers urinaires, tels que le cancer du rein et le cancer de la vessie ; les sarcomes, tels que le sarcome des tissus mous, les tumeurs stromales gastro intestinales (GIST) et le sarcome de l’os ; les cancers de la peau, tel que le mélanome, les cancers hépatobiliaires, tels que le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome, la liste n’étant pas limitative. Avantageusement, le cancer est une tumeur solide, en particulier un carcinome hépatocellulaire et/ou des métastases associées.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif dans la fabrication d'un médicament destiné à la prévention des tumeurs solides, et en particulier des carcinomes hépatocellulaires, et/ou les récidives de cancer et/ou des métastases associées.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de traitement curatif du cancer et/ou des métastases associées chez des patients nécessitants une administration, comprenant l'administration auxdits patients de cellules souches humaines génétiquement modifiées ou d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tel que défini précédemment. Au sens de la présente invention, le terme « traitement » ou « traitement curatif » est défini comme un traitement conduisant à une guérison ou un traitement qui allège, améliore et/ou élimine, réduit et/ou stabilise les symptômes d'une maladie ou la souffrance qu'elle provoque.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de traitement curatif du cancer et/ou les récidives de cancer et/ou des métastases associées chez des patients nécessitants une administration, comprenant l'administration auxdits patients de cellules souches humaines génétiquement modifiées ou d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tel que défini précédemment et un second principe actif tel que défini précédemment.
Avantageusement, le cancer est un cancer à tumeurs solides. Par « tumeur solide » au sens de la présente invention, on entend un carcinome ou un sarcome. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le cancer est un cancer choisi parmi : les cancers touchant le système nerveux central, tels que les astrocytomes et les gliomes ; les cancers des voies aérodigestives supérieures (ORL), tels que le cancer des lèvres, le cancer de la cavité buccale, le cancer de l’oropharynx et le cancer du nasopharynx ; les cancers des glandes endocrines, tels que le cancer de la thyroïde, le cancer des glandes surrénales et les tumeurs neuroendocrines extra-digestives et pulmonaires ; les cancers des glandes exocrines, tels que le cancer du sein et le cancer du pancréas ; les cancers touchant le thorax, tels que le cancer de la plèvre et le cancer du poumon ; les cancers digestifs, tels que le cancer de l’œsophage, le cancer de l’estomac, le cancer de l’intestin grêle, le cancer du côlon et le cancer du rectum et/ou du canal anal ; les cancers génitaux, tels que le cancer de la prostate, le cancer du col de l’utérus, le cancer de l’endomètre, le cancer du vagin et le cancer de la vulve ; les cancers urinaires, tels que le cancer du rein et le cancer de la vessie ; les sarcomes, tels que le sarcome des tissus mous, les tumeurs stromales gastro intestinales (GIST) et le sarcome de l’os ; les cancers de la peau, tel que le mélanome, les cancers hépatobiliaires, tels que le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome, la liste n’étant pas limitative. Avantageusement, le cancer est une tumeur solide, en particulier un carcinome hépatocellulaire et/ou des métastases associées.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de traitement curatif d’une tumeur solide, avantageusement des carcinomes hépatocellulaires et/ou les métastases associées, chez des patients nécessitants une administration, comprenant l'administration auxdits patients de cellules souches humaines génétiquement modifiées ou d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tel que défini précédemment.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de traitement curatif d’une tumeur solide, avantageusement des carcinomes hépatocellulaires et/ou les métastases associées, chez des patients nécessitants une administration, comprenant l'administration auxdits patients de cellules souches humaines génétiquement modifiées ou d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tel que défini précédemment et un second principe actif tel que défini précédemment. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif dans la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer et/ou des métastases associées.
Avantageusement, le cancer est un cancer à tumeurs solides. Par « tumeur solide » au sens de la présente invention, on entend un carcinome ou un sarcome. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le cancer est un cancer choisi parmi : les cancers touchant le système nerveux central, tels que les astrocytomes et les gliomes ; les cancers des voies aérodigestives supérieures (ORL), tels que le cancer des lèvres, le cancer de la cavité buccale, le cancer de l’oropharynx et le cancer du nasopharynx ; les cancers des glandes endocrines, tels que le cancer de la thyroïde, le cancer des glandes surrénales et les tumeurs neuroendocrines extra-digestives et pulmonaires ; les cancers des glandes exocrines, tels que le cancer du sein et le cancer du pancréas ; les cancers touchant le thorax, tels que le cancer de la plèvre et le cancer du poumon ; les cancers digestifs, tels que le cancer de l’œsophage, le cancer de l’estomac, le cancer de l’intestin grêle, le cancer du côlon et le cancer du rectum et/ou du canal anal ; les cancers génitaux, tels que le cancer de la prostate, le cancer du col de l’utérus, le cancer de l’endomètre, le cancer du vagin et le cancer de la vulve ; les cancers urinaires, tels que le cancer du rein et le cancer de la vessie ; les sarcomes, tels que le sarcome des tissus mous, les tumeurs stromales gastro intestinales (GIST) et le sarcome de l’os; les cancers de la peau, tel que le mélanome, les cancers hépatobiliaires, tels que le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome, la liste n’étant pas limitative.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de cellules souches humaines génétiquement modifiées en tant que principe actif dans la fabrication d'un médicament destiné au traitement des tumeurs solides, et en particulier des carcinomes hépatocellulaires, et/ou des métastases associées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Cellule souche humaine génétiquement modifiée, dans laquelle ladite cellule souche humaine comprend un acide nucléique exogène comprenant une région codant pour une protéine de fusion comprenant une protéine cytochrome P450 2B6 humaine mutante (CYP2B6*) de SEQ ID No.1 ou un variant ou un fragment de celle-ci ; et une protéine NADPH-cytochrome P450 réductase de SEQ ID No.2 ou un variant ou un fragment de celle- ci ; liée de manière fonctionnelle à un promoteur, ledit acide nucléique exogène ayant été inséré dans un des gènes sphère de sécurité « safe harbor » de ladite cellule souche humaine et caractérisée en ce que ladite cellule souche humaine génétiquement modifiée n’étant pas une cellule souche humaine embryonnaire.
2. Cellule souche humaine génétiquement modifiée selon la revendication 1 , dans laquelle ladite cellule souche humaine est choisie parmi les cellules souches mésenchymateuses (MSC), les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules souches mésenchymateuses induites (iMSC).
3. Cellule souche humaine génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le gène sphère de sécurité « safe harbor » choisi parmi : le site AAVS1 du chromosome 19, le site CCR5 du chromosome 3, le site hROSA26 du chromosome 3, le site 323 du chromosome 1 , le site 325 du chromosome 8, le site 289 du chromosome 1 , le site
227 du chromosome 1 , le site 229 du chromosome 2, le site 253 du chromosome 2, le site
255 du chromosome 5, le site 257 du chromosome 7, le site 259 du chromosome 14, le site 261 du chromosome 17, le site 263 du chromosome X, le site 317 du chromosome 2, le site 303 du chromosome 2 , le site 331 du chromosome 3, le site 283 du chromosome 4, le site
231 du chromosome 4, le site 315 du chromosome 5, le site 327 du chromosome 5, le site
305 du chromosome 5, le site 307 du chromosome 16, le site 309 du chromosome 20, le site 285 du chromosome 6, le site 233 du chromosome 6, le site 311 du chromosome 6, le site 299 du chromosome 6, le site 301 du chromosome 7, le site 293 du chromosome 8, le site 319 du chromosome 11 , le site 333 du chromosome 12, le site 295 du chromosome 12, le site 329 du chromosome 12, le site 297 du chromosome 17, le site 291 du chromosome 22, le site 313 du chromosome X et le site 321 du chromosome X.
4. Cellule souche humaine génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le promoteur est un promoteur constitutif, de préférence le promoteur EF1-a.
5. Cellule souche humaine génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit acide nucléique exogène comprend en outre un gène marqueur de sélection.
6. Cellule souche humaine génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle la cellule souche humaine a été obtenue par transduction rétrovirale avec un vecteur viral comprenant l’acide nucléique exogène.
7. Procédé d’obtention et de sélection de cellules souches génétiquement modifiées selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes de : a) transduction des cellules souches humaines avec un vecteur viral comprenant l’acide nucléique exogène, ledit acide nucléique comprend un gène marqueur de sélection, b) mise en culture des cellules souches humaines dans un milieu de culture prédéfini, c) sélection les cellules souches humaines génétiquement modifiées exprimant le gène marqueur de sélection à leur surface membranaire.
8. Composition pharmaceutique comprenant la cellule souche humaine génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comme principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
9. Composition pharmaceutique selon la revendication 8, comprenant en outre au moins un second principe actif.
10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, dans laquelle le second principe actif est un agent anti-cancéreux.
11. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu’elle est sous une forme adaptée pour son administration par voie trans-artérielle.
12. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 8 à 11 pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer et/ou les récidives de cancer et/ou des métastases associées, de préférence des tumeurs solides, de préférence les carcinomes hépatocellulaires, et/ou des métastases associées.
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