EP3911356A1 - La decorine pour son utilisation dans le traitement du diabete - Google Patents

La decorine pour son utilisation dans le traitement du diabete

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Publication number
EP3911356A1
EP3911356A1 EP19848929.6A EP19848929A EP3911356A1 EP 3911356 A1 EP3911356 A1 EP 3911356A1 EP 19848929 A EP19848929 A EP 19848929A EP 3911356 A1 EP3911356 A1 EP 3911356A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
decorin
cells
diabetes
pharmaceutical composition
islets
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19848929.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Karim BOUZAKRI
Michel PINGET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre Europeen dEtude du Diabete CEED
Original Assignee
Centre Europeen dEtude du Diabete CEED
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre Europeen dEtude du Diabete CEED filed Critical Centre Europeen dEtude du Diabete CEED
Publication of EP3911356A1 publication Critical patent/EP3911356A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to the field of health and relates more particularly to the treatment of diabetes.
  • WHO World Health Organization
  • Type 1 diabetes also called insulin-dependent diabetes, begins after the insulin-producing cells of the pancreas are destroyed by the patient's immune system: beta cells. This then results in a significant decrease in the amount of insulin produced by the body, thereby causing an increase in the level of glucose in the blood. There are many acute symptoms, including polyuria (excessive excretion of urine), polydipsia (intense thirst), constant hunger, and weight loss.
  • the first option is insulin therapy, based on the daily administration of insulin by injection with an insulin pen or by infusion with insulin pumps. This type of treatment is very restrictive and has a strong impact on the quality of life of patients.
  • pancreas transplantation This surgical treatment is reserved for diabetic patients suffering from serious renal complications and having to undergo dialysis.
  • the pancreas transplant is usually associated with the transplant of another organ, usually the kidney.
  • the operation has the advantage of completely replacing insulin injections. It therefore allows an improved quality and life expectancy, as well as a reduction in complications linked to diabetes.
  • this technique has many limitations such as graft rejection, the need for lifelong immunosuppressive therapy, infections or internal bleeding. To this is added a very heavy surgical procedure under general anesthesia, presenting a significant risk of morbidity.
  • the third option is the transplantation of pancreatic islets. This approach involves transplanting secretory cells from the pancreas into a diabetic recipient.
  • This technique overcomes certain limitations of the pancreas transplant, by transplanting only the endocrine fraction of the pancreas: the cells of the pancreatic islets.
  • This alternative has the advantage of being minimally invasive, rapid and causes fewer complications related to the surgical intervention. It ensures the stabilization of glucose metabolism, a significant decrease in severe hypoglycemic episodes and the normalization of glycated hemoglobin levels (Shapiro AM et al., 2000, The New England Journal of Medicine, N ° 343, p. 230-238 ; Pepper AR et al., 2013, World Journal of Transplantation, N ° 3, p. 48-53).
  • This technique is particularly recommended for patients whose diabetes is particularly unstable (severe hypoglycaemia, episodes of coma) thus putting into play their vital prognosis, for which insulin injections are not a possible therapeutic track.
  • pancreatic islets The transplantation of pancreatic islets takes place in several stages. First, the donor pancreas is surgically removed and transported to an establishment capable of isolating the pancreatic islets. Mechanical and enzymatic digestion is performed to separate the different tissues that make up the pancreas. The islets are purified and separated from the other tissues using a discontinuous Ficoll gradient. The islets thus isolated are cultured for 12 to 48 hours before being transplanted. In the recipient patient, pancreatic islet transplantation is a procedure performed under local anesthesia in 30 to 45 minutes. The pancreatic islets are injected into the liver of the recipient patient through a catheter placed in the portal vein. The islets then embolize in the liver where they release insulin.
  • pancreatic islets Although the transplantation of pancreatic islets is a promising method, it knows today several limits, in particular related to the survival of the pancreatic islets. In fact, during the various stages of this transplantation, the cells are no longer vascularized and the cell mortality rate is high. In particular, the quantity of living cells decreases after the brain death of the donor, during the preservation of the pancreas, during the digestion of the organ and the isolation of the islets, then during the implantation in the recipient patient. Thus, before islet transplantation into the recipient, only 50% of the donor's pancreatic islets are still viable. The loss of islets that are still functional is also very important during implantation, in particular due to an inflammatory reaction, oxidative stress and especially a defect in vascularization in the recipient patient. It is for these reasons that, at the present time, it is necessary to use two or three donors to transplant a sufficient quantity of islets into the recipient and obtain lasting insulin dependence.
  • decorin is an interesting candidate for solving the problem of early mortality of transplanted cells by promoting an anti-inflammatory reaction, more revascularization rapid pancreatic islets in recipient patients as well as the secretion of insulin by the cells of these islets, thus allowing the treatment of diabetes and insulin-independence of patients. More generally, the inventors have demonstrated the interest of decorin in the treatment of diabetes for its capacity to decrease the mortality of the cells of the pancreatic islets and to improve the synthesis and the secretion of insulin by these cells. In addition, the inventors show that decorin protects the pancreatic cells from the loss of function and cell death observed in type 2 diabetes.
  • One aspect of the invention relates to decorin or a pharmaceutical composition comprising decorin, for use as a medicament in the treatment of diabetes.
  • the diabetes is type 1 diabetes, type 2 diabetes or gestational diabetes.
  • the invention relates to decorin or a pharmaceutical composition comprising decorin, for its use in the treatment of a subject grafted or likely to be grafted with pancreatic islet cells.
  • the invention also relates to decorin or a pharmaceutical composition comprising decorin, for its use in combination with immunosuppressive therapy and / or anti-inflammatory treatment concomitant with or following the transplantation of islet cells in a subject, or for its use in combination with an anti-diabetic active ingredient.
  • the immunosuppressive therapy and / or the anti-inflammatory treatment are chosen from thymoglobulin, anti-TNF ⁇ , rapamune, calcineurin inhibitors, T lymphocyte depleting agents or combinations thereof.
  • the immunosuppressive therapy and / or the anti-inflammatory treatment is a combination of thymoglobulin and rituximab.
  • the antidiabetic active agent is chosen from insulin, metformin, sulfonylureas, tolbutamide, acetohexamide, tolazamide, chlorpropamide, glibenclamide, glimepiride, glipizide, glicazide, glycopyramide, gliquidone , alpha-glucosidase inhibitors, acarbose, miglitol, voglibose, thiazolidinediones, pioglitazone, rosiglitazone, meglitinides, repaglinide, nateglinide, an incretino-mimic, a glucagon-like peptide analogue, exenatide or its derivatives, taspoglutide, liraglutide, semaglutide, a dipeptidyl peptidase-4 inhibitor, vildagliptin, sitagliptin, saxaglip
  • the invention also relates to decorin or a pharmaceutical composition for its use in the treatment of a subject grafted with pancreatic islet cells.
  • the grafted pancreatic islet cells were treated with decorin.
  • the pharmaceutical composition used according to the invention can comprise human cells and decorin as an active substance.
  • the cells are chosen from endocrine cells and pancreatic islet cells.
  • FIG 2 represents the effect of decorin on the functionality of the pancreatic islets.
  • A Secretion of glucagon by pancreatic islets treated with decorin (Decorin) or not (CTL) and incubated in the presence of 2.8 mM (black column) or 16.7 mM of glucose (white column). The secretion is represented as a percentage relative to the total glucagon content of the islets.
  • B Secretion of insulin by the pancreatic islets treated with decorin (Decorin) or not (CTL) and incubated in the presence of 2.8 mM (black column) or 16.7 mM of glucose (white column). The secretion is represented as a percentage relative to the total insulin content of the islets.
  • C Secretion of glucagon by pancreatic islets treated with decorin (Decorin) or not (CTL) and incubated in the presence of 2.8 mM (black column) or 16.7 mM of glucose (white column). The secretion is represented as a
  • FIG 4 represents the protein expression of IGF-1R (A) and of p-IGFR-1R (B).
  • the black and white columns represent the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin, respectively.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • n 6 independent experiments; * p ⁇ 0.05 versus CTL.
  • FIG 6 represents the protein expression of IRS-1 (A) and p-IRS-1 (B).
  • the black and white columns represent the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin, respectively.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • FIG 8 represents the protein expression of IRS-2 (A) and p-IRS-2 (B).
  • the black and white columns represent respectively the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • n 6 independent experiments; ** p ⁇ 0.01 versus CTL.
  • FIG 10 represents the protein expression of Akt (A) and p-Akt (B).
  • the black and white columns represent respectively the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with the decorin.
  • CTL control
  • n 12 independent experiments.
  • FIG 11 represents the study of the activation of Akt. Relationship between the expression of p-Akt and Akt.
  • the black and white columns represent the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin, respectively.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • n ll independent experiments; *** p ⁇ 0.001 versus CTL.
  • FIG 12 represents the protein expression of FoxOl (A) and p-FoxOl (B).
  • the black and white columns represent the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin, respectively.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • n 7 independent experiments; ** p ⁇ 0.01 versus CTL.
  • FIG 13 represents the study of the activation of FoxOl. Relationship between the expression of p-FoxOl and FoxOl.
  • the black and white columns represent the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin, respectively.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • n 7 independent experiments; ** p ⁇ 0.01 versus CTL.
  • FIG 14 represents the protein expression of NF-kB p65 (A) and of p-NF-kB p65 (Ser536) (B).
  • the black and white columns represent the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin, respectively.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • FIG 16 represents the protein expression of SIRT1 (A) and PGCla (B).
  • the black and white columns represent the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin, respectively.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • FIG 17 represents the protein expression of HIF-Ia (A) and of HIF-2a (B).
  • the black and white columns represent the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin, respectively.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • FIG 18 represents the protein expression of PHD1 (A), PHD2 (B) and PHD3 (C).
  • the black and white columns represent respectively the control (CTL) and islet processing conditions pancreatic with decorin.
  • CTL control
  • n 12 independent experiments.
  • FIG 19 represents the protein expression of the VEGFR2 receptor (A) and of its phosphorylated form (B).
  • the black and white columns represent the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin, respectively.
  • CTL control
  • the results are presented in the mean ⁇ SEM form.
  • FIG 20 represents the study of the secretion of VEGF-A over time.
  • the black and dotted curves represent respectively the control (CTL) and treatment of the pancreatic islets with decorin.
  • the secretion of VEGF is represented as a percentage over time, 2 hours post treatment.
  • FIG 21A represents the increase in body weight gain of STZ rats post transplant with decorin.
  • FIG 21B represents the increase in body weight gain of STZ rats post transplant with decorin.
  • FIG 22A represents the improvement of the glycemic regulation of STZ rats post transplantation with decorin.
  • FIG 22B represents the improvement of the glycemic regulation of STZ rats post transplantation with decorin.
  • FIG 23A represents the effect of decorin on the c-peptidemia of STZ rats post transplantation. Evolution of the c-petidemia over time measured in pmol / L for the SHAM ( ⁇ ), control ( ⁇ ), decorin (A), control + decorin (T) and decorin + decorin ( ⁇ ) groups.
  • FIG 26 represents the insulin requirement of rats after induction of diabetes by destruction of pancreatic beta cells and transplant of islets.
  • SHAM destruction of beta cells and no transplantation
  • control destruction of beta cells + islet transplantation
  • Decorin destruction of beta cells + islet transplantation pretreated with decorin 24h
  • control + decorin destruction of beta cells + transplantation of islets with injection of the recipient with decorin every 24 hours
  • decorin + decorin destruction of beta cells + transplantation of pretreated islets with injection of the recipient every 24 hours.
  • Decorin is abbreviated as "decorin”.
  • FIG 27 represents the impact in humans of decorin on insulin secretion in a control and inflammatory situation (48h TNF-ALPHA).
  • FIG 28 represents the impact in humans of decorin on survival and apoptosis in a control and inflammatory situation (Cytomix 48h TNF-alpha + Interferon gamma + IL1-beta). Decorin is abbreviated as "decorin”.
  • FIG 29 represents the impact in humans of decorin on insulin secretion in a control situation and rich in fat (palmitate 48H). Decorin is abbreviated as "decorin”.
  • FIG 30 represents the impact in humans of decorin on survival and apoptosis in a control situation rich in fat (48 hours). Decorin is abbreviated as “decorin”.
  • FIG 31 represents the impact in humans of decorin on insulin secretion in a control situation and rich in sugar (glucose 16.7 mM 48H). Decorin is abbreviated as "decorin”.
  • FIG 32 represents the impact in humans of decorin on insulin secretion in islets isolated from donors with type 2 diabetes.
  • the present invention relates to decorin or a pharmaceutical composition comprising decorin, for use as a medicament in the treatment of diabetes, the treatment of diabetes may further include transplanting pancreatic islets.
  • results obtained by these methods make it possible to identify a direct or indirect effect on the beta-pancreatic cell as such but does not at all reflect the effects on the whole islet which is composed of a mixture of different cell types (alpha , beta, delta, exocrine cell).
  • the results obtained on the sorted beta cell model do not make it possible to predict any effect on the native island.
  • the inventors demonstrate here the importance of the effect of decorin at the level of native complete islets.
  • Decorin refers to a myokine.
  • Decorin belongs to the family of small leucine-rich proteoglycans (SLRP) and consists of a protein nucleus containing leucine repeats with a glycosaminoglycan chain (GAG) consisting of chondroitin sulfate (CS) or dermatan sulfate (DS).
  • GAG glycosaminoglycan chain
  • Leucine residues allow it to attach to a large number of cellular receptors. It is thus capable of triggering the corresponding signaling cascades.
  • decorin is an endocrine factor produced by muscles, which is able to attach to the surface of beta cells in the pancreas.
  • the alternative names for this protein are PG-S2, PG40 or Bone Proteoglycan II.
  • Decorin can be found in the form of different isoforms produced by alternative splicing. These are isoforms A (consensus sequence), B, C, D and E. Decorin is described in the databases under the following accession numbers: Gene ID: 1634, UniGene: Hs.156316 and Hs. 530910. This protein is also described under the accession number UniProt P07585.
  • RNA sequences for human decorin are for example NM_001920.4 (isoform A), NM_133503.3 (isoform A), NM_133504.3 (isoform B), NM_133505.3 (isoform C), NM_133506.3 (isoform D) and NM_133507.3 (isoform E).
  • the protein sequence references are for example NP_001911.1 (isoform A), NP_598010.1 (isoform A), NP_598011.1 (isoform B), NP_598012.1 (isoform C), NP_598013.1 (isoform D) and NP_598014. 1 (isoform E).
  • the decorin according to the invention is the type A isoform.
  • the decorin generally comprises a signal peptide in position 1- 16 and a propeptide in position 17-30.
  • the decorin preferably comprises the sequence between positions 17-359 or 31-359.
  • Decorin optionally includes the signal peptide and / or the pro
  • a sequence of human decorin is in particular described in SEQ. ID NO: 1.
  • substitution designates the replacement of one amino acid residue with another chosen from among 20 natural standard amino acid residues, rare natural amino acid residues and amino acid residues unnatural.
  • substitution refers to the replacement of an amino acid residue with another chosen from among the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C , F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S and T).
  • the substitution (s) can be conservative or non-conservative substitutions.
  • conservative substitution refers to a substitution of one amino acid residue for another which has similar chemical or physical properties (size, charge or polarity). Examples of conservative substitutions are presented in the following tables.
  • myokine is meant a soluble substance produced and released by muscle cells in response to muscle contractions. These molecules have the ability to act directly or indirectly on several organs, leading to the necessary metabolic changes during or after physical exercise.
  • diabetes here refers to a chronic disease that occurs when the pancreas does not produce enough insulin or when the body is unable to use the insulin it produces efficiently.
  • Diabetes is a disorder of the assimilation, use and storage of sugars provided by food. This results in hyperglycemia, characterized by a high level of glucose in the blood, generally greater than 1.26 g / L of blood.
  • type 1 diabetes which affects around 6% of diabetics
  • type 2 diabetes which affects 92%.
  • the other types of diabetes concern the remaining 2% (MODY, LADA or diabetes secondary to certain diseases or taking medication).
  • Type 1 diabetes or “insulin-dependent diabetes” means a particular form of diabetes, generally considered to be an autoimmune disease, which results from the disappearance of beta cells from the pancreas, resulting in a total deficiency of insulin. As glucose cannot enter the cells, it returns to the blood, which leads to a sharp increase in blood sugar, characterized by a glucose level well above 1.26 g / L of blood.
  • Type 2 diabetes or “non-insulin-dependent diabetes” means a particular form of diabetes, resulting either from insulinopenia when the pancreas produces insufficient insulin, or from insulin resistance when this insulin is not not able to act enough to regulate blood sugar. In both cases, the blood sugar is not regulated.
  • gestational diabetes is meant a particular form of diabetes which is a glucose tolerance disorder leading to hyperglycemia of varying severity, starting or first diagnosed in a woman during pregnancy.
  • Gestational diabetes appears in particular in women who have little-known diabetes and whom pregnancy will reveal, or in women who develop diabetes only during pregnancy, a disorder which most often disappears after the baby is born.
  • diabetes complication all the states, conditions, disorders or diseases which result from the consequences of hyperglycemia relating to diabetes. Almost all parts of the body and organs can be affected by diabetes and / or poorly controlled blood sugar. Hyperglycemia can in particular weaken the walls of the blood vessels which supply tissues and / or organs with oxygen and nutrients. Complications of diabetes include acute complications such as diabetic ketoacidosis and hyperosmolar conditions, as well as long-term complications such as eye disorders, kidney disease and cardiovascular disease. The complications are more particularly described below in the paragraph “Diabetes and complications targeted by the present invention”.
  • insulin is meant here a protein hormone secreted by the b cells of the pancreatic islets. It helps regulate blood sugar by promoting the uptake of glucose in muscle cells, liver or fat cells. It is a hypoglycemic hormone.
  • hypoglycemia is meant here a low level of glucose in the blood, generally less than 0.60 g / L of blood.
  • pancreatic islet cells or “islet cells from Langerhans” here refer to the endocrine cells of the pancreas, grouped into spherical clusters. The islets are mainly composed of beta cell and alpha cell. The latter secrete insulin and glucagon respectively.
  • treatment refers to obtaining a desired pharmacological and / or physiological effect.
  • the effect may be prophylactic in terms of total or partial prevention of a disease or symptom and / or may be therapeutic in terms of partial or complete cure of a disease and / or an adverse effect attributable to disease.
  • treatment covers any treatment of a disease in a mammal, in particular in a human, to: reduce the incidence and / or the risk of relapse of the disease during a symptom-free period; relieve or reduce a symptom of the disease; prevent the disease from occurring in a subject who may be predisposed to the disease but who has not yet been diagnosed as having it; inhibit the disease, that is, stop its development (for example, reduce the rate of disease progression); reduce the frequency of episodes of the disease; slow the development of the disease and relieve the disease, that is, cause a total or partial regression of the disease.
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount which results in an improvement in the condition of an organ or subject, or in a decrease in disease, disorder or symptoms of the disease or disorder.
  • the terms “individual”, “host”, “subject” and “patient” are used herein interchangeably, and designate a mammal, more particularly an animal subject and more particularly a human.
  • the subject may have diabetes.
  • Donor refers to the people from whom the pancreatic islets are removed. They may be deceased persons, particularly in a state of brain death (mainly due to trauma, cerebrovascular accidents, anoxia or intoxication) or a living subject.
  • recipient refers to a subject who has undergone or is likely to undergo a pancreatic islet cell transplant, said cells from a donor.
  • the recipient has diabetes.
  • a "pharmaceutical composition” means a preparation of one or more of the active agents with other optional chemical components such as physiologically suitable carriers and / or excipients.
  • the purpose of a pharmaceutical composition is to facilitate the administration of the active agent to an organism.
  • the compositions of the present invention may be in a form suitable for any route of administration or conventional use.
  • the pharmaceutical composition according to the invention includes the pharmaceutical compositions used in human medicine and pharmaceutical compositions used in animal medicine, ie veterinary compositions.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the terms "pharmaceutically acceptable carrier” or “pharmaceutically acceptable excipient” or “pharmaceutically acceptable carrier” are interchangeable and include any compounds or combinations of compounds which are known to those skilled in the art as being useful in the formulation of pharmaceutical or veterinary compositions.
  • physiologically acceptable or “pharmaceutically acceptable” means any medium or additive which does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active substance (here, decorin), and which is not excessively toxic to the patient or subject, at the concentrations to which it is administered and / or which do not produce an adverse reaction when administered to a human or animal.
  • a physiologically acceptable vehicle, carrier or excipient may be suitable for administration to humans and / or animals (particularly mammals).
  • active substance designates a substance or molecule which, in a composition, a mixture or a medium generates a particular and desired effect on cells or on a subject.
  • the active substance is opposed to the “inert” ingredients having no particular pharmacological activity, in particular the excipients as well as to the secondary compounds, having or not having a pharmacological effect, which serve as support or adjuvant for the active substance main, and which act only to enhance the effect of the active substance directly (by acting on the active substance) or indirectly (by acting on the conditions or disorders involved in the disease).
  • drug as used herein includes drugs for human and animal use in human and veterinary medicine and refers to any pharmacologically acceptable substance which provides a therapeutic and / or beneficial effect.
  • medicine used here is not necessarily limited to substances requiring market authorization.
  • transplant means an intervention, in particular a surgical intervention which consists in transferring an organ, a tissue or cells from one individual to another.
  • these terms refer to a heterograft and / or to an allograft.
  • a transplant consists of replacing a diseased organ or tissue with a healthy organ or tissue, called a “graft” or “transplant” and coming from a donor subject.
  • the graft corresponds to the pancreatic islets removed from the donor patient and / or to the purified pancreatic islet cells intended to be transplanted in the recipient patient.
  • the graft may correspond to pancreatic islets that have been prepared from stem cells.
  • embryonic stem cell refers to cells derived from the internal cell mass of the blastocyst and which have the capacity to lead to the formation of all the tissues of the organism (mesoderm, endoderm, ectoderm), including to cells of the germ line.
  • the pluripotency of embryonic stem cells can be assessed by the presence of markers such as the transcription factors OCT4 and NANOG and surface markers such as SSEA3 / 4, Tra-1-60 and Tra-1-81.
  • induced pluripotent stem cell refers to pluripotent stem cells obtained by genetic reprogramming of differentiated somatic cells, and having a morphology and a potential for self-renewal and pluripotency partly similar to that of embryonic stem cells. These cells are in particular positive for the pluripotency markers, in particular the staining with alkaline phosphatase and the expression of the proteins NANOG, SOX2, OCT4 and SSEA3 / 4.
  • adjuvant of a therapy or “adjuvant of a treatment”
  • a treatment which supplements a principal treatment generally a “treatment of first intention” or “standard treatment”
  • recurrence recurrence
  • medium a composition which allows the maintenance and / or the culture of viable and / or functional pancreatic islet cells.
  • This medium can be specific for the separation, isolation, culture and control of pancreatic islet cells.
  • the cells find in this medium the essential components for their survival and / or their multiplication such as amino acids, vitamins, inorganic salts, glucose.
  • this medium is optimized for the in vitro culture of pancreatic islets.
  • “Maintaining the viability of pancreatic islet cells” or “preserving the viability of pancreatic islet cells” means maintaining the survival and / or functionality of the pancreatic islet cells, and / or decreased occurrence and / or frequency of apoptosis of pancreatic islet cells.
  • nucleic acid means a phosphate diester of a polymeric form of ribonucleosides (adenosine, guanosine, uridine or cytidine; "RNA molecules”) or deoxyribonucleosides (deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxythymidine, or deoxycytidine; "DNA molecules”), or any phosphodiester analog thereof, such as phosphorothioates and thioesters, in single stranded form or in double stranded form.
  • Nucleic acid can thus be a deoxyribonucleic acid or a ribonucleic acid. They may be sequences of natural or artificial origin, and in particular genomic DNA, cDNA, mRNA, hybrid amino acid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences, modified or not.
  • nucleic acid construct and “vector” are equivalent and refer to a nucleic acid molecule which serves to transfer and / or express a nucleic acid sequence, such as a DNA or RNA, in a host cell.
  • a vector may include an origin of replication, a selectable marker and optionally a site suitable for the insertion of a sequence or a gene.
  • a vector can be either a self-replicating extra-chromosomal vector or a vector which integrates into the genome of the host cell. It can also include expression elements comprising, for example, a promoter, a ribosomal translation initiation sequence, an initiation codon, a termination codon and / or a transcription termination sequence.
  • nucleic acid constructs capable of directing the expression of the nucleic acid sequence to which they are operably linked can also be called here "expression vectors".
  • the nucleic acid construct can be a vector for stable or transient expression of a gene or sequence.
  • sequence identity or “identity” or “percentage of identity” refers to the percentage of identical amino acid residues between the two sequences compared, this percentage being obtained after implementation of the better alignment (optimum alignment) between the two sequences. Sequence identity is determined by comparing the sequences when they are aligned so as to maximize overlap and identity while minimizing sequence interruptions.
  • the percentage of identity with respect to the reference sequence will be calculated by dividing (i) the total number of identical residues aligned between the two sequences by (ii) the total number of residues contained in the reference sequence, then by multiplying by 100 the quotient obtained.
  • sequence identity can be determined using any of the many global or local alignment algorithms, depending on the length of the two sequences. Sequences of similar length are preferably aligned using global alignment algorithms (eg Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48: 443, 1970) which optimally align the sequences over the entire length, while sequences of substantially different lengths are preferably aligned using a local alignment algorithm, for example the Smith and Waterman algorithm (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math.
  • Alignment for the purpose of determining the percentage identity of amino acid sequences can be carried out by any method known to a person skilled in the art, for example using software available on Internet sites such as http: // blast.ncbi.nlm. nih.gov or http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. Those skilled in the art can readily determine the appropriate parameters for measuring alignment.
  • the decorin according to the invention is a myokine, in particular a mammalian myokine, preferably a human myokine, preferably the isoform A of human decorin, even more preferably the decorin described by SEQ ID No: 1 or a fragment or functional variant thereof.
  • the present invention also relates to any protein exhibiting modifications, such as mutants, variants or homologs, having the same effect or activity as the decorin according to the invention.
  • the terms “homologous”, “variant”, “biological equivalent” or “mutant” are interchangeable and refer to a protein having a sequence homology or identity with the nucleotide sequence of decorin according to the invention, said functional variant retaining the biological activity of the protein from which it is derived.
  • the term “mutation” includes natural or induced mutations, including at least alterations including deletions, insertions, substitutions known to those of skill in the art, including a genetic modification introduced into a nucleotide or amino acid sequence.
  • a variant has at least about 70%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% of sequence homology or identity with the reference protein (also called “parent sequence”), and exhibits a biological activity substantially equivalent to this.
  • reference protein also called “parent sequence”
  • variant or equivalent is also meant a polypeptide or protein sequence which differs from that of a reference sequence by at least one modification or mutation of amino acid.
  • decorin can comprise a sequence having an identity percentage of at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% with the sequence of mature decorin (that is to say without the signal peptide and the propeptide), more specifically for humans with the sequence between positions 31-359 of SEQ ID NO: 1.
  • decorin can include the mature decorin sequence (more specifically for humans with the sequence between positions 31-359 of SEQ ID NO: 1) and also present 1 to 20 modifications chosen from a substitution, a deletion or an addition of an amino acid.
  • the substitutions are conservative.
  • the decorin according to the invention can comprise 1 to 20 conservative substitutions, preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 conservative substitutions relative to SEQ ID No. 1 or a fragment corresponding to amino acids 17-359 or 31-359 thereof.
  • the decorin according to the invention can particularly comprise the substitution T268M or E273Q.
  • decorin is a biologically active fragment of decorin.
  • biologically active fragment is meant here a protein or polypeptide fragment which exhibits a biological activity substantially equivalent to decorin.
  • decorin can be chosen from decorin with the signal peptide and the propeptide (in particular SEQ ID NO: 1 for humans), decorin without the signal peptide and with the propeptide (in particular 17-359 of SEQ ID NO: 1 for humans), or decorin without the signal peptide and the propeptide (in particular 31-359 of SEQ ID NO: 1 for humans).
  • decorin will preferably be a decorin of the same species.
  • the decorin will be a human decorin.
  • the invention relates to decorin or to a pharmaceutical composition comprising it for its use as a medicament in the treatment of diabetes, for example type 1, type 2 diabetes or gestational diabetes, preferably in treatment of type 1 diabetes.
  • decorin makes it possible to improve the synthesis and the secretion of insulin by the cells of the pancreatic islets, in particular in response to a stimulation by glucose, and to decrease the mortality of the cells. of these islets.
  • decorin makes it possible to increase the secretion of insulin by the cells of the pancreatic islets in response to stimulation by glucose, and to decrease the mortality of the cells of these islets when they are subjected to the effect of cytokines pro -inflammatory like TNF-alpha, INF-gamma or ILl-beta, fatty acids like palmitate, or an excessive amount of sugar.
  • the present invention also relates to the use of decorin to reduce in a diabetic patient the effects of inflammation, in particular of pro-inflammatory cytokines such as TNF-alpha, INF-gamma or ILl-beta, on the secretion of insulin in response to stimulation by glucose, and on the mortality of the cells of these islets induced by this inflammation.
  • the present invention further relates to the use of decorin for reducing in a diabetic patient the effects of a fatty diet on the secretion of insulin in response to stimulation by glucose, and on the cell mortality of these islets.
  • the medicament is intended to be administered to the diabetic subject before, during and / or following a transplantation of pancreatic islet cells.
  • decorin is intended to be administered to a recipient patient, in particular for the purpose of facilitating the taking of a graft of pancreatic islet cells.
  • the patient treated with decorin is a patient grafted with pancreatic islet cells.
  • the grafted pancreatic islet cells were treated prior to the graft with decorin.
  • the inventors have clearly demonstrated an extremely beneficial effect of the treatment of a patient transplanted with decorin, especially when the grafts were treated with decorin before the transplant.
  • decorin is intended to be administered to a donor patient, in particular with the aim of preserving the viability of the pancreatic islets which will be removed.
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence coding for decorin according to the invention for its use in the treatment of diabetes or a complication of diabetes.
  • the nucleic acid sequence codes for decorin as described above or a fragment or variant thereof.
  • a coding sequence for decorin is described in SEQ ID NO: 2.
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence coding for decorin according to the invention as described above for its use in the treatment of diabetes a complication of diabetes.
  • these are expression vectors comprising, in addition to a nucleic acid sequence in accordance with the invention, regulatory sequences making it possible to control transcription and / or translation.
  • the vector according to the invention will notably comprise elements for regulating the expression of the sequence coding for decorin according to the invention, such as promoters and activator sequences ("enhancers”) as well as initiation sequences and stopping the appropriate transcription.
  • the vectors according to the invention may include one or more origins of replication in cellular hosts in which their amplification and / or expression is sought and / or selection markers.
  • the vectors comprising the amino acid sequence encoding decorin may or may not be viral vectors.
  • Viral vectors are well known to those skilled in the art and can for example comprise baculoviral, adenoviral, parvoviral, retroviral, lentiviral vectors or vectors derived from adeno-associated viruses, for example described in Giannoukakis et al., Diabetes 48: 2107-2121 (1999); Efrat, Eur. J. of Endocrinol 138: 129-133 (1998); Stone et al., J. Endocinol 164: 103-118 (2000); Castro et al., Baillieres BestPrac. Res. Clin. Endocrinol Metab.
  • the vectors according to the invention include in particular ubiquitous, constitutive or inducible promoters, such as ubiquitous promoters (for example HPRT, vimentin, a-actin, tubulin), the promoters of intermediate filaments (for example desmin, neurofilaments, keratin , GFAP) tissue-specific promoters (eg, the promoter of the liver albumin gene) or the early promoter of Cytomegalovirus (Boshart et al., 1985, Cell 41: 521-530).
  • ubiquitous promoters for example HPRT, vimentin, a-actin, tubulin
  • the promoters of intermediate filaments for example desmin, neurofilaments, keratin , GFAP
  • tissue-specific promoters eg, the promoter of the liver albumin gene
  • Cytomegalovirus Boshart et al., 1985, Cell 41: 521-530.
  • the nucleic acid sequence or the vector further comprises a CRISPR-Cas system, preferably a CRISPR-Cas9 system, in particular intended for use in gene therapy in the treatment of diabetes, in particular for introduce the nucleic acid sequence encoding decorin into the genome of a target cell.
  • a CRISPR-Cas system preferably a CRISPR-Cas9 system, in particular intended for use in gene therapy in the treatment of diabetes, in particular for introduce the nucleic acid sequence encoding decorin into the genome of a target cell.
  • the CRISPR system contains two distinct elements, namely i) an endonuclease and ii) a guide RNA.
  • the nucleic acid sequence or the vector comprising it can be transduced into a host cell.
  • one aspect of the invention relates to a cell comprising the nucleic acid sequence coding for decorin according to the invention for its use in the treatment of diabetes or of a complication of diabetes.
  • the introduction of the nucleic acid sequence or of the vector according to the invention into a host cell can be carried out in vitro, according to techniques well known to those skilled in the art such as electroporation, to transform or transfect cells. , either in primary culture or in the form of cell lines.
  • the introduction of the nucleic acid sequence or of the vector according to the invention can be carried out in cells in vivo, in particular in a subject suffering from diabetes.
  • the host cell is a eukaryotic cell, more preferably a human cell. Any cell in the human body or any cell suitable for transplanting pancreatic islets can be used.
  • the cells are stem cells or endocrine cells, in particular pancreatic islet cells or liver cells, preferably the cells are beta and / or alpha cells of the pancreatic islets.
  • the cells are beta cells of the pancreatic islets.
  • the cells are alpha cells of the pancreatic islets.
  • the cell comprising a nucleic acid sequence coding for decorin according to the invention or a vector comprising the latter is a stem cell.
  • the stem cells are preferably obtained by differentiation from pluripotent stem cells, in particular embryonic stem cells (ES) or induced pluripotent stem cells (iPS or hiPSC) for example obtained by dedifferentiation.
  • ES embryonic stem cells
  • iPS or hiPSC induced pluripotent stem cells
  • Embryonic stem cells can be obtained without destroying the embryo from which they originate, for example using the technique described by Chung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2 (2): 113-117).
  • the embryonic stem cells are non-human embryonic stem cells.
  • the embryonic stem cells used in the invention are human embryonic stem cells, preferably obtained without destruction of the embryo from which they originate.
  • the embryos used are preferably supernumerary embryos obtained within the framework of a parental project after obtaining regulatory and ethical authorizations in accordance with the laws in force.
  • stem cells adapt particularly to their environment thanks to their ability to differentiate in situ.
  • the cell comprising a nucleic acid sequence coding for decorin according to the invention or a vector comprising the latter is a precursor of pancreatic islet cells, in particular beta cells of pancreatic islets.
  • this cell is a liver cell.
  • the cell comprising a nucleic acid sequence coding for decorin according to the invention or a vector comprising the latter is a neuroendocrine cell, such as those which are found in the pituitary glands and adrenal. In fact, these cells have the secretory machinery necessary for regulated secretion of polypeptide hormones.
  • decorin, a variant or a fragment thereof, a nucleic acid sequence coding for decorin, a vector comprising this nucleic acid sequence, or a cell comprising the sequence of nucleic acid or the vector is included in a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition comprises decorin, a nucleic acid sequence encoding decorin, a vector comprising this nucleic acid sequence, or a cell comprising the nucleic acid sequence or the vector, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition according to the invention may be a pharmaceutical composition intended for use in human medicine or for veterinary use.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising decorin, a nucleic acid sequence coding for decorin, a vector comprising this nucleic acid sequence, or a cell comprising the nucleic acid sequence or the vector, for use in the treatment of diabetes, in particular in the treatment of type 1 diabetes, type 2 diabetes or gestational diabetes, as well as in the treatment of at least one complication of diabetes.
  • the invention also relates to the use of decorin, of a nucleic acid sequence coding for decorin, of a vector comprising this nucleic acid sequence, or of a cell comprising the sequence d nucleic acids or the vector, for the preparation of a pharmaceutical composition intended for use as a medicament, in particular as an antidiabetic medicament or as an anti-inflammatory medicament.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition as described above for its use as a medicament in the treatment of diabetes or a complication of diabetes.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition for its use as a medicament in the treatment of type 1 diabetes or a complication thereof.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition for its use as a medicament in the treatment of type 2 diabetes or a complication thereof.
  • the medicament is intended to be administered before, during and / or following a transplant of pancreatic islet cells.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising decorin for its use as a medicament in the treatment of gestational diabetes or a complication thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising decorin as the main active substance, that is to say that decorin is the substance of the composition which has the desired activity and / or effect .
  • decorin is an active substance of the pharmaceutical composition by its activity on the cells of the pancreatic islets, in particular on the synthesis and secretion of insulin, on the survival of the cells and / or on the improvement of the vascularization of the islets pancreatic.
  • the pharmaceutical composition may also contain at least one additional pharmaceutical active principle or be intended to be used in combination with at least one additional active principle.
  • active pharmaceutical ingredient means any compound or substance the administration of which has a therapeutic effect or a beneficial effect on the health or general condition of a patient or of a subject to whom it is administered.
  • pharmaceutical active ingredients which may be present in a pharmaceutical composition of the present invention or used in combination with this pharmaceutical composition include, without limitation, anti-inflammatory drugs, immunosuppressive agents, anti-diabetic agents, antibiotics, antipyretic agents, antiemetic agents, antihistamine agents, vitamins, antispasmodic agents, antiulcer agents or combinations thereof.
  • the medicament according to the invention can thus be administered in combination with another medicament, such as an anti-inflammatory agent, an immunosuppressive agent, an antibiotic agent, an antipyretic agent, an antihistamine agent, vitamins, an antispasmodic agent or an agent. antiulcer.
  • another medicament such as an anti-inflammatory agent, an immunosuppressive agent, an antibiotic agent, an antipyretic agent, an antihistamine agent, vitamins, an antispasmodic agent or an agent. antiulcer.
  • decorin a nucleic acid sequence coding for decorin, a vector comprising this nucleic acid molecule, or a cell comprising the nucleic acid sequence or the vector, or the pharmaceutical composition comprising it.
  • the composition can also comprise an anti-diabetic active principle.
  • the present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising decorin, a nucleic acid sequence encoding decorin, a vector comprising this nucleic acid molecule, or a cell comprising the nucleic acid sequence or the vector, and a anti-diabetic active ingredient.
  • the present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising decorin and an anti-diabetic active principle.
  • the composition can be intended to be used for the treatment of diabetes in combination with such an active ingredient.
  • the present invention therefore relates to a kit comprising decorin and an anti-diabetic active principle for simultaneous, separate or sequential use, in particular in the treatment of diabetes.
  • the anti-diabetic active ingredient can be chosen from the following non-exhaustive list: insulin, metformin, sulfonylureas such as tolbutamide, acetohexamide, tolazamide, chlorpropamide, glibenclamide, glimepiride, glipizide, glicazide, glycopyramide and gliquidone, alpha-glucosidase inhibitors such as acarbose, miglitol and voglibose, thiazolidinediones such as pioglitazone and rosiglitazone, meglitinides such as repaglinide and nateglinide, an incretinimimetic, an analogue of glucagon-like peptide like exenatide or its derivatives, taspoglutide, liraglutide, semaglutide, a dipeptidyl peptidase-4 inhibitor like vildagliptin, si
  • the present invention also relates to decorin or a pharmaceutical composition for use in the treatment of diabetes in the context of transplantation of pancreatic islet cells.
  • this relates to recipient subjects, that is to say grafted or susceptible to be grafted with pancreatic islet cells.
  • the decorin or the composition according to the invention can be combined with conventional agents used to promote the engraftment of pancreatic islet cells, in particular molecules inducing immunosuppression or reduction of inflammation. .
  • compositions include in particular immunosuppressive compositions and / or anti-inflammatory compositions. These compositions also include thymoglobulin to promote induction, anti-TNF ⁇ to control the early inflammatory reaction, rapamune at the start of transplantation to benefit from its anti-macrophagic role, calcineurin inhibitors or combinations of these -this. A particular combination includes a combination of thymoglobulin and rituximab. These compositions can also comprise various T lymphocyte depleting agents.
  • the invention relates to decorin or a pharmaceutical composition comprising decorin for its use as adjuvant of an immunosuppressive therapy or of an anti-inflammatory treatment concomitant or following the transplantation of islet cells pancreatic in a recipient patient.
  • decorin as an adjuvant makes it possible to increase the probability of taking a graft of pancreatic islet cells, to promote vascularization of pancreatic islet cells and / or to promote insulin secretion by transplanted pancreatic islet cells.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is intended to be administered to a recipient patient, in particular for the purpose of facilitating the taking of a graft of pancreatic islet cells, of promoting vascularization of pancreatic islet cells and / or promote insulin secretion by transplanted pancreatic islet cells.
  • decorin is used with the aim of reducing the occurrence and / or the frequency of apoptosis in pancreatic islet cells which are intended to be transplanted or have been transplanted in the recipient.
  • the decorin or the pharmaceutical composition may be administered to the subject capable of being transplanted with pancreatic islet cells before the transplant and / or to the subject having received a pancreatic islet cell transplant concomitantly with the transplant and / or after the transplant.
  • the present invention relates to a method of treating a patient who has received a pancreatic islet cell transplant, comprising the administration of a therapeutically effective amount of decorin, so as to increase insulin secretion by transplanted pancreatic islet cells and / or increase the viability of transplanted pancreatic islet cells or decrease apoptosis.
  • the method of treating a diabetic subject includes transplanting pancreatic islet cells into the patient and administering a therapeutically effective amount of decorin, so as to increase the secretion of insulin by the d cells.
  • the method for treating a diabetic subject comprises bringing pancreatic islet cells intended to be grafted into the patient into contact with decorin, grafting the pancreatic islet cells treated in the patient and the administration of a therapeutically effective amount of decorin, so as to increase insulin secretion by the transplanted pancreatic islet cells and / or to increase the viability of the transplanted pancreatic islet cells or reduce apoptosis.
  • the pharmaceutical composition is intended to be administered to a donor patient, in particular for the purpose of preserving the viability of the pancreatic islets which are intended to be removed, that is to say to reduce the occurrence and / or the frequency of apoptosis in pancreatic islet cells that are taken from the donor.
  • compositions according to the present invention may vary depending on the route of administration and the dosage for which the composition is intended to be used.
  • the composition according to the invention can in particular be in solid, semi-solid or liquid form.
  • a composition according to the invention may be in any form suitable for administration to a mammal, in particular man, for example in the form of tablets, tablets, lozenges, dragees, capsules, capsules, pills, aggregates, powder, suspensions, emulsions, syrups, ointments, ampoule of liquid, bottle with a dropper and other similar forms of liquid or powder preparations intended to be taken in measured units of small amount, injectable solutions or suppositories.
  • excipients such as water, 2,3-butanediol, Ringer's solution, isotonic solutions of sodium chloride, synthetic mono or diglycerides, and oleic acid are often used for formulation injections.
  • Suitable carriers can also be chosen from magnesium carbonate, magnesium stearate, talc, sugar, lactose, pectin, dextrin, starch, gelatin, gum tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose , a low melting wax and cocoa butter.
  • the solid compositions can be formulated in the presence of an inert excipient such as sodium citrate, and optionally of additives such as, for example, binding agents, humectants, disintegrating agents, absorption accelerators, lubricating agents , etc.
  • additives such as, for example, binding agents, humectants, disintegrating agents, absorption accelerators, lubricating agents , etc.
  • Other forms suitable include solid form preparations which are intended to be processed shortly before use into liquid form preparations.
  • the physiologically acceptable vehicle can be a liquid, and the composition according to the invention is in the form of a solution.
  • Liquid vehicles are used in the preparation of solutions, solvents, dispersion media, suspensions, emulsions, syrups, elixirs and compositions under pressure.
  • Suitable liquid or gel-based carriers include, but are not limited to: water and physiological saline solutions; emulsions or suspensions, including saline and buffered media, urea; alcohols (for example, methanol, ethanol, propanol, butanol); glycols (for example, ethylene glycol, propylene glycol and the like), non-aqueous solvents such as propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable or seed oils such as olive oil, and organic esters injectables such as ethyl oleate.
  • water-based vehicles have a neutral pH (for example, pH 7.0 ⁇ 1.0 or 0.5 pH units).
  • Liquid compositions including for example emulsions, microemulsions, solutions, suspensions, syrups, or elixirs can be formulated in particular in the presence of solvents, solubilizing agents, emulsifiers, oils, fatty acids, and / or other additives such as, for example, suspending agents, preservatives, sweeteners, natural or synthetic flavors, viscosifying agents, stabilizing and / or thickening agents and / or food-grade coloring agents, which must all be compatible with the maintenance of decorin activity.
  • the emulsions can be prepared in aqueous solutions of propylene glycol or can contain emulsifying agents such as lecithin, sorbitan monooleate or acacia.
  • emulsifying agents such as lecithin, sorbitan monooleate or acacia.
  • Well known thickening agents can also be added to compositions such as corn starch, natural or synthetic gums, resins, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, guar gum, xanthan gum and the like.
  • Preservatives can also be included in the composition, including methylparaben, propylparaben, benzyl alcohol and ethylenediamine tetraacetate salts.
  • the composition of the excipient can be changed as long as it does not significantly interfere with the pharmacological activity of decorin.
  • the decorin or the pharmaceutical composition according to the invention can be used for human or animal medicine purposes, the subject under consideration possibly being in particular a mammal, more particularly any animal subject such as a laboratory animal (for example, non-human primate, rat , mouse, hamster, guinea pig), a pet or farm animal (dogs, cats, horses, etc.), or a human.
  • the subject may have diabetes, especially type 1 diabetes, type 2 diabetes, gestational diabetes, or be at risk of developing diabetes.
  • the subject has been diagnosed as being type 1 or type 2 diabetic.
  • the recipient patient has been diagnosed as being type 1 or type 2 diabetic.
  • the donor subject of pancreatic islet cells is not diabetic.
  • the donor is a healthy individual.
  • the donor subject When the donor subject is a human, the donor fulfills the requirements relating to organ donation known to those skilled in the art.
  • the characteristics that allow the pancreas to be offered for organ or islet transplantation by a human donor are defined by a weight greater than 10 kg, an age less than 65 years, the absence of a history of diabetes, increase in liver transaminases greater than 3 times normal and cardiac arrest.
  • compositions according to the present invention can be administered using any combination of dosage and route of administration effective to achieve the desired therapeutic effect.
  • the exact amount to be administered and the frequency of administration will depend in particular on the type of subject, human or animal, depending on the age, weight, general condition of the patient or animal, the nature and the severity of diabetes.
  • the route of administration can be chosen according to the nature and severity of the diabetes and / or according to the age and / or health of the patient.
  • composition according to the invention can be administered systemically, orally, by inhalation or by injection, for example by intravenous, intramuscular, subcutaneous, transdermal, intraarterial route.
  • composition according to the invention can be administered in one or more times, that is to say in the form of a single dose or of multiple doses.
  • composition according to the invention can be administered in the form of several doses.
  • the composition according to the invention can be administered chronically.
  • the administration of the decorin, the drug or the composition comprising the decorin is at regular intervals.
  • the composition is administered to the subject at a frequency of between one dose per day and one dose per week, in particular one dose every 2, 3, 4, 5, 6 or 7 days.
  • the frequency of administration may be several doses per day, for example 2, 3, 4 or 5 doses per day.
  • the daily doses can be divided to facilitate administration, for example with one administration in the morning and another in the evening. Diabetes treatment
  • the present invention relates to a method of treating diabetes comprising the administration of a therapeutically effective amount of decorin or of a pharmaceutical composition comprising decorin according to the present invention, a nucleic acid sequence encoding the latter. , a vector comprising this nucleic acid sequence, or a cell comprising said nucleic acid sequence or said vector, to a subject who is diabetic or capable of developing diabetes.
  • the present invention relates to a method of treating diabetes comprising the administration of a therapeutically effective amount of decorin or of a pharmaceutical composition according to the invention and the transplantation of Langerhans islet cells to a diabetic subject.
  • Langerhans islet cell cells are transplanted using the usual procedure in the art. In particular, they are transplanted into the liver of the recipient patient, where they will be implanted intraportally.
  • the treatment methods according to the invention generally involve the administration to an individual in need of an effective amount of decorin, of a pharmaceutical formulation or composition according to the invention, either in order to limit or delay diabetes and its symptoms and / or limit or delay the onset of diabetes complications, either to reduce inflammation or to promote the taking of pancreatic islet transplants.
  • Methods of treating diabetes include methods of treating individuals who have been diagnosed with diabetes, methods of reducing the risk of complications of diabetes in an individual who has been diagnosed with diabetes and who have received treatment conventional, in particular individuals having undergone or being likely to undergo a transplantation of pancreatic islet cells.
  • the therapeutically effective or sufficient amount of decorin or of a pharmaceutical composition according to the invention is an amount making it possible to obtain the desired effect, namely an effect promoting the increase in the secretion of insulin by pancreatic islets and / or an effect reducing inflammation and / or an effect promoting the viability of pancreatic islet cells, in particular that of transplanted pancreatic islets and / or their vascularization.
  • the therapeutically effective or sufficient amount of decorin or of a pharmaceutical composition according to the invention can be an amount making it possible to increase the duration of insulin independence of a diabetic patient, in particular that of a recipient patient. having undergone a pancreatic islet cell transplant.
  • the therapeutically effective or sufficient amount of decorin or of a pharmaceutical composition according to the invention is an amount which makes it possible to delay the onset of complications of diabetes in a diabetic patient, in particular that of a recipient patient who has undergone a transplant of pancreatic islet cells.
  • a "therapeutically effective amount" of decorin or a composition according to the invention is an amount which reduces the severity of a symptom and / or reduces a measurable parameter associated with diabetes by at least about 10%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80 %, or at least about 90% or more, in comparison with the symptom (for example, severity of the symptom), or in comparison with the measurable parameter associated with diabetes, in the absence of treatment of the subject.
  • the measurable parameter is blood sugar.
  • a "therapeutically effective amount" of decorin or a pharmaceutical composition according to the invention is an amount which reduces inflammation by at least about 10%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, or at least about 90% or more, in comparison with the symptom (for example, the severity of the symptom), or in comparison with the inflammatory condition of a diabetic patient who has not been treated with decorin or with a pharmaceutical composition comprising it.
  • a "therapeutically effective amount" of decorin or a pharmaceutical composition according to the invention is an amount which increases the cell viability of the islet cells by at least about 10%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, or at least about 90 % or more, in comparison with the viability of the pancreatic islet cells in the absence of treatment of the subject with decorin or with a pharmaceutical composition according to the invention.
  • a "therapeutically effective amount" of decorin or a pharmaceutical composition according to the invention is an amount which increases the vascularization of the pancreatic islet cells by at least about 10%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, or at least about 90 % or more, in comparison with the vascularization of the pancreatic islet cells in the absence of treatment of the subject with decorin or with a pharmaceutical composition according to the invention.
  • the present invention can be used in circumstances where it is desired to improve the viability of pancreatic islet cells regardless of the underlying diabetic condition.
  • An advantage of the present invention is that it can be used to promote the viability and / or vascularization of pancreatic islet cells, by administration of decorin, a pharmaceutical composition or a drug comprising decorin, a nucleic acid sequence encoding decorin, a vector comprising this nucleic acid sequence, or a cell comprising said nucleic acid sequence or said vector, before, during and / or after transplantation of pancreatic islet cells.
  • the invention relates to a method for increasing the quality and / or the survival time of pancreatic islet cells, comprising the administration to a donor and / or recipient subject of a pharmaceutical composition according to the invention, so that the quality and / or the survival time of the graft is increased.
  • the graft corresponds to the pancreatic islet cells before and / or after purification.
  • the invention also relates to the use of decorin to promote the revascularization of the pancreatic islets after transplantation in a recipient patient.
  • the present invention relates to decorin, a nucleic acid sequence encoding decorin, a vector comprising this nucleic acid sequence, or a cell comprising said nucleic acid sequence or said vector, for the preparation of a drug or a composition intended for the treatment of diabetes, in particular within the framework of a transplantation of pancreatic islet cells in humans. It also relates to a method making it possible to promote the taking of the graft of the pancreatic islet cells in a patient, the method comprising the administration of a therapeutically effective amount of decorin or of a pharmaceutical composition according to the invention and transplantation of pancreatic islet cells.
  • the donor patient is treated with decorin, a pharmaceutical composition or a drug comprising decorin, a nucleic acid sequence coding for decorin, a vector comprising this nucleic acid sequence, before removal. pancreatic islets.
  • the recipient patient is treated with decorin, a pharmaceutical composition or a drug comprising decorin, a nucleic acid sequence encoding decorin, a vector comprising this nucleic acid sequence, or a cell. comprising said nucleic acid sequence or said vector, before, during and / or after transplantation of the pancreatic islets.
  • the administration of decorin or of a composition according to the invention to the recipient patient can thus take place before, during and / or after the recipient patient has undergone transplantation of the pancreatic islet cells.
  • the recipient patient can be administered decorin or a pharmaceutical composition according to the invention in combination with pancreatic islet cells.
  • these pancreatic islet cells come from an individual donor having been treated with decorin, a pharmaceutical composition or a drug comprising decorin, a nucleic acid sequence coding for decorin or a vector comprising this sequence nucleic acids, before removal of the pancreatic islets.
  • the pancreatic islet cells may have been cultured in a medium comprising decorin before their transplantation into the recipient patient.
  • the invention also relates to the administration or transplantation of pancreatic islet cells which have been brought into contact with decorin or with a composition comprising decorin, a nucleic acid sequence coding for decorin or a vector comprising this nucleic acid sequence, in a recipient patient, preferably a patient suffering from diabetes, in particular type 1 diabetes.
  • the invention also relates to gene therapy methods for the treatment of diabetes, allowing the introduction of a nucleic acid sequence encoding decorin according to the present invention, in order to induce the secretion of decorin in the circulation.
  • Gene therapy consists in correcting a deficiency or an anomaly (for example a mutation, an aberrant expression) or in ensuring the expression of a protein of interest by introducing its nucleic acid sequence into the affected cell or organ.
  • This nucleic acid sequence can be introduced either ex vivo in a cell extracted from an individual, the cell then being introduced into the target organ or tissue of the individual after its transformation, or directly in vivo in the cells of the tissue. or the appropriate body.
  • cells are derived from a diabetic subject or from a donor subject and subjected to genetic manipulation in order to transfer there a sequence coding for decorin or for a variant thereof or a vector comprising this sequence.
  • these cells are eukaryotic cells, in particular human cells chosen from stem cells, endocrine cells, pancreatic islet cells or liver cells.
  • the cells are pancreatic islet cells, in particular beta cells.
  • the invention relates to gene therapy of pancreatic islet cells ex vivo.
  • the transfer into the cells of the nucleic sequence coding for decorin or of the vector comprising it can be carried out by electroporation, by biolistics or by liposomes, these methods being able to be optimized for the transfection of cells of pancreatic islets ( Levine et al., Diabetes Metab. Rev. 13: 209-246 (1997)).
  • the CRISPR / Cas system can be used to modify target cells.
  • the transfer into cells can also be carried out with viral vectors, preferably vectors having a tropism for the target cells, for example those of the pancreatic islets or of the hepatic cells.
  • the invention relates to a method of treating diabetes in a diabetic subject comprising the steps consisting in: a) providing one or more pancreatic islet cells, preferably purified pancreatic islet cells, b) introduction into cells of a nucleic acid sequence coding for decorin or of a vector comprising said sequence, c) transplantation of the modified cells of step b) in the recipient diabetic subject in amounts sufficient to promote the survival of grafted pancreatic islet cells, to promote the production of insulin by these cells and / or treat diabetes in the individual.
  • pancreatic islet cells can be obtained from a donor patient or from the recipient patient himself.
  • the transformed pancreatic islet cells comprising a nucleic acid sequence coding for decorin or a variant thereof can come from different patients or from the same patient.
  • the increase in the survival of cells transformed with the nucleic acid sequence coding for decorin or a variant thereof which are transplanted in the recipient is at least 20%, 50% or 75%, compared to cells which have not been transformed with a nucleic acid sequence coding for decorin. Comparisons in cell survival can be made at any time after a transplant, for example, a week, a month, three months, six months, a year, five years, etc.
  • cells transformed with the nucleic acid sequence encoding decorin or a variant thereof decorate the production of insulin sufficient to treat diabetes in the recipient for more than a week, preferably three months, more preferably one year; and ideally for the whole life of the recipient of these cells.
  • Diabetes is characterized by a fasting blood sugar level greater than or equal to 1.26 g / l, checked twice. There are several tests to detect or monitor diabetes. The diagnosis of diabetes is based on the clinic, the presence of hyperglycemia, and the questioning of the patient. The reference examination carried out in a medical analysis laboratory is a blood test measuring blood sugar or blood sugar, which varies according to food intake. Testing for glycosuria, which is to look for albumin and sugar in the urine, is also helpful in detecting diabetes.
  • Type 1 diabetes occurs in young, overweight patients. The presence of another type 1 diabetes in the family (in 1 in 10 cases) or of another associated autoimmune disease (in 1 in 10) reinforces the diagnosis. Type 1 diabetes is usually accompanied by cardinal syndrome and ketonuria.
  • Type 2 diabetes occurs in patients generally over 40, overweight predominantly abdominal.
  • the presence of a family history of type 2 diabetes, the existence of hypertension, hypertriglyceridemia, hypertension and HDL-cholesterolemia are frequently associated with hyperglycemia in type 2 diabetes. 2 and reinforce the diagnosis.
  • Gestational diabetes occurs in pregnant women. Pregnancy is inherently diabetogenic because there is physiologically during this period a state of insulin resistance which can progressively worsen during pregnancy. Gestational diabetes can be asymptomatic or have symptoms similar to those of other types of diabetes.
  • a first fasting blood glucose test in the first trimester of pregnancy is recommended to detect pre-pregnancy diabetes that has gone unnoticed.
  • a second test called HGPO Hydrophilicity and Low
  • a blood glucose value above the defined thresholds (0.92g / L on an empty stomach; or 1.80g / L after 1 hour of oral glucose load; or 1.53g / L after 2 hours) is sufficient to diagnose gestational diabetes.
  • gestational diabetes must be monitored and treated because it poses a risk for the mother (premature delivery, risk of developing type II diabetes after childbirth) as well as for the child (respiratory distress, neonatal hypoglycemia, risk of developing type II diabetes).
  • the invention also relates to decorin or a pharmaceutical composition according to the invention for use with a view to preventing and / or delaying the onset and / or limiting the progression of at least one of the complications of diabetes.
  • Complications include acute complications such as diabetic ketoacidosis, hyperosmolar coma, severe hypoglycemia, retinopathy, nephropathy, renal failure, cardiovascular disease, in particular coronary artery disease, obliterating arteriopathy of the lower limbs , stroke / TIA or other peripheral arterial vascular damage related to atherosclerosis, mouth infections, foot ulcers, infections or plantar perforation.
  • the invention also relates to decorin or a composition comprising decorin for use with a view to improving the worsening factors of diabetes or the associated comorbidities, in particular hypertension, insulin resistance, obesity , overweight, hyperlipidemia or depression.
  • the invention also relates to decorin or a pharmaceutical composition according to the invention for use in the treatment of a diabetes complication chosen from the group consisting of diabetic ketoacidosis, hyperosmolar coma, severe hypoglycemia , nephropathy, renal failure, cardiovascular diseases, in particular coronary artery disease, obliterating arterial disease of the lower limbs, stroke / TIA or other peripheral arterial vascular disease in connection with atherosclerosis, mouth infections, foot ulcers, infections or plantar perforation.
  • the invention also relates to decorin or a composition comprising decorin for use with a view to improving the worsening factors of diabetes or the associated comorbidities, in particular hypertension, insulin resistance, obesity , overweight, hyperlipidemia or depression.
  • the invention also relates to decorin or a composition comprising decorin for use with a view to improving the overall glycemic balance, in particular the reduction of hypoglycaemia and hyperglycaemia, the improvement of HbAlc and other parameters of the invention. evaluation of the glycemic balance (TIR for example).
  • the invention also relates to the preparation and use of a culture, preservation or transformation medium for pancreatic islet cells, the medium comprising decorin.
  • Decorin is present in this medium as an active substance, that is to say having an effect on the cells of pancreatic islets, in particular on their survival, quality and their capacity to secrete insulin, and / or having an effect on decreasing inflammation.
  • Isolation and purification of human pancreatic islets requires a 5 to 7 hour multi-step process to extract and purify the fraction of pancreatic islets that will be transplanted to the recipient patient. Enzyme digestion, gentle mechanical shearing, controlled purification and culture are the established approach for the preparation of a final product enriched in islet cells.
  • the final preparation of the islets before their implantation consists of their incubation in a culture medium for 24 to 72 hours, in order to allow quality control of the evaluation of the release of the product, as well as the launching of the immunosuppressive treatment in the recipient before the transplant.
  • This islet culture period helps minimize the number of dead or apoptotic cells and their by-products, which when transplanted could trigger and / or increase inflammation, exposing newly transplanted islets to harmful cytokines.
  • pancreatic islet cells in culture allows them to be shipped to distant clinical transplant centers and also allows the concentration of expertise in isolating and purifying islets in regional facilities. treatment of human cells, thereby reducing the costs associated with treating the pancreas and transplanting islet cells.
  • the invention relates to a culture, preservation or transformation medium for pancreatic islet cells comprising or consisting essentially of decorin, the use of decorin to prepare pancreatic islet cells intended to be transplanted in a diabetic patient, a method of preparing pancreatic islet cells intended to be transplanted in a diabetic patient as well as a graft comprising pancreatic islet cells prepared by this method or comprising decorin.
  • the culture, preservation or transformation medium for pancreatic islet cells does not include collagen.
  • the method for preparing pancreatic islet cells intended to be transplanted into a diabetic patient comprising bringing ex vivo contact of pancreatic islet cells with the medium or the composition comprising decorin.
  • the method includes the steps of providing cells of the pancreatic islets and contacting said cells with decorin.
  • the cells of the pancreatic islets were obtained by sampling from the donor subject. Cells can be contacted with decorin directly after collection from the donor, once purified, or both at the time of collection and purification of the cells.
  • the pancreatic islet cells have been prepared from stem cells, in particular by inducing their differentiation into pancreatic islet cells.
  • the invention relates to a method for maintaining or increasing the viability of pancreatic islet cells ex vivo, comprising a step of bringing pancreatic islet cells into contact with decorin as an active substance.
  • the invention also relates to the use of decorin to preserve or increase the viability of pancreatic islet cells ex vivo.
  • the invention relates to an ex vivo method for preparing pancreatic islet cells intended to be transplanted in a diabetic patient, said method comprising:
  • pancreatic islet cells optionally, bringing the pancreatic islet cells into contact with decorin
  • pancreatic islet cells possibly in the presence of decorin
  • all the steps are carried out in the presence of decorin.
  • decorin is used in pretreatment in the donor subject, during the removal of islets from the donor, in culture of pancreatic islets in vitro before transplantation, in pretreatment in the recipient subject, in post-transplant treatment in the recipient and / or throughout the life of the transplant in the recipient subject.
  • the invention relates to a composition or a graft comprising decorin and pancreatic islet cells.
  • the pancreatic islet cells may have been prepared by the method detailed above or may have been prepared by the method currently conventionally used for the preparation of a graft of pancreatic islet cells.
  • these cells may have been transformed with a nucleic acid sequence coding for decorin according to the invention or with a vector comprising this sequence, in particular after their purification according to the method described above.
  • the invention also relates to a method of treating diabetes in a diabetic subject, said method comprising the transplantation of a composition comprising purified pancreatic islet cells and a medium comprising decorin in a recipient subject, preferably a subject diabetic recipient.
  • the invention also relates to a method of treating diabetes in a diabetic subject, said method comprising:
  • pancreatic islets from a donor patient
  • pancreatic islet cells possibly in the presence of decorin
  • pancreatic islet cells with a nucleic acid sequence coding for decorin according to the invention or with a vector comprising this sequence
  • pancreatic islet cells preferably in a medium comprising decorin
  • composition comprising purified pancreatic islet cells and optionally decorin
  • the method comprising at least one step carried out in the presence of decorin.
  • all the steps are carried out in the presence of decorin.
  • decorin is used in pretreatment in the donor subject, during the removal of islets from the donor, in culture of pancreatic islets in vitro before transplantation, in pretreatment in the recipient subject, in post-transplant treatment in the recipient and / or throughout the life of the transplant in the recipient subject.
  • the invention relates to a method for promoting the production of insulin in a diabetic subject, said method comprising the transplantation of a composition or a graft comprising pancreatic islet cells and decorin.
  • the invention relates to a method for increasing the duration of insulin independence of a patient, for reducing the risks of hypoglycemia or hyperglycemia, and / or for increasing the stabilization of glycemia, said method comprising transplanting a composition or a graft comprising pancreatic islet cells and decorin.
  • the invention relates to decorin for use in preserving, increasing and / or maintaining the viability of pancreatic islet cells and / or increasing insulin secretion by pancreatic islet cells and / or decreasing inflammation.
  • the cells of the pancreatic islets are present in a graft or in a composition intended to be transplanted.
  • Decorin is in particular for acting on the cells of the pancreatic islets between the time of the removal of the islets from the donor patient and their transplantation into the recipient patient. More specifically, it can be used to act on the cells of the pancreatic islets between the time of the removal of islets from the donor patient and the time of purification of the islets, and / or between the time of purification of the cells of the pancreatic islets and the time of their transplant in a recipient patient.
  • a proteomic study made it possible to identify the factors / myokines secreted by the muscle. This study made it possible to study the precise molecular mechanisms at the origin of the effects induced by certain myokines in a “control” situation and after induction of insulin resistance or even diabetes in animals. This proteomic study revealed a myokine that attracted the attention of the inventors: decorin.
  • the effects of decorin on the survival of the pancreatic islets were assessed, in particular in relation to apoptosis.
  • the TUNEL method was used. This method allows fluorescent labeling of cells whose DNA is fragmented and which are therefore in apoptosis.
  • the cell nucleus was also labeled with DAPI, approximately 1000 cells were counted for each sample.
  • the islets are cultivated in the absence or presence of decorin for 24 hours, then histological sections and TUNEL labeling are carried out.
  • Pancreatic islets of Rat are cultivated in mediums more or less rich in glucose (2.8 or 16.7 mM glucose). The amount of insulin or glucagon released into the medium is then determined by the ELISA method.
  • the impact of treatment with decorin on the secretion of insulin by the pancreatic islets was evaluated.
  • the role of insulin is to promote the storage of glucose in the body's reserve organs when blood sugar is high.
  • the functionality test shows an improvement in insulin secretion in the presence of decorin compared to the control condition (CTL).
  • CTL control condition
  • This difference in statistical power reflects better management of insulin secretion when the islets are in the presence of decorin for 24 hours.
  • IGF-1R Insulin-like Growth Factor 1 Receptor
  • the total protein content is recovered after the lysis of the pancreatic islet cells.
  • the first is that decorin binds directly to IGF-1R and causes its activation.
  • the second hypothesis is that the increase in the secretion of insulin by decorin causes the binding of this hormone on its IGF-1R receptor and thus increases its activation.
  • increased activation of IGF-1R is beneficial for the cells of the pancreatic islets, since it makes it possible to trigger signaling pathways for cell survival, insulin secretion but also angiogenesis.
  • the first step in this signaling pathway is the activation of the IGF-1R substrates: IRS-1 and IRS-2.
  • Insulin Receptor Substrate 1 and 2 are inactive proteins linked to the intramembrane part of the IGF-1R receptor.
  • insulin or decorin (according to the hypotheses above) binds to this receptor, the phosphate group of the receptor is transmitted to proteins 1RS 1 and 2 (becoming p-IRS-1 and p-IRS2, active proteins). They will then trigger cellular reactions, causing the entry of glucose into the cell, cell survival and growth.
  • the active form of IRS-1 and p-IRS-1 was studied.
  • IRS 1 and 2 On human islets, the expression and activation of IRS 1 and 2 were studied with three repetitions. As in the Rat, the protein expression of the inactive forms IRS-1 and IRS-2 is not modified. On the other hand, the expression of p-IRS-1 and p-IRS-2 is increased thanks to decorin.
  • IRS-1 and 2 When IRS-1 and 2 are activated, several intracellular signaling pathways are activated.
  • the MAPK / ERK pathway the transcription of growth, proliferation and cell survival genes is activated
  • the PI3K / AKT pathway transcription of cell survival and protein synthesis genes.
  • Akt insulin synthesis and secretion are also activated. This signaling pathway is interesting, since the Akt protein is involved in the regulation of a large number of survival proteins such as FoxOl and NF-kB p65. Akt is made active when it receives a phosphate group after the activation of IRS-1 or I RS-2, it then becomes phospho-Akt (p-Akt). p-Akt can then in turn activate different signaling pathways for cell survival and inhibit the mechanisms of apoptosis.
  • Akt When Akt is activated, this protein can regulate the activity of a large number of proteins, among them FoxOl.
  • FoxOl is a transcription factor that regulates genes involved in apoptosis. This protein is phosphorylated by p-Akt, which will cause its exclusion from the nucleus, thus blocking the transcription of the apoptosis genes (Oellerich M. F., Potente M., 2012).
  • N F-KB is a transcription factor composed of several subunits (p65, RelB, c-Rel, p50 and p52). Depending on the associations between the subunits, the attachment to the target genes is different. Here, the p65 subunit of NF-kB has been studied. If p65 and p50 form a complex, then the genes targeted by this transcription factor are genes for cell survival. When the p65 subunit is phosphorylated (phospho-p65), then the transcribed genes are pro-inflammatory and therefore deleterious for the cell.
  • phospho-p65 phosphorylated
  • This molecule therefore does not promote the transcription of pro-inflammatory genes via the phosphorylation of p65.
  • the protein expression of p65 thanks to decorin is interesting since in this inactive form, p65 can bind to another subunit of this complex (p50) and thus promote the transcription of genes for cell survival.
  • SIRT1 makes it possible to protect the pancreatic beta cells against inflammation (Prud'homme GJ et al. 2014).
  • the activity of SIRT1 is dependent on the amount of nutrients in the cell. The lower it is, the more SIRT1 is activated (low NAD + / NADH ratio) (Oellerich MF, Potente M., 2012).
  • the amount of nutrients supplied to the cells is low since the vascular system is not yet sufficiently developed. Thanks to decorin, the expression of SIRT1 is increased, which will increase its actions tenfold during the transplantation of islets, thus promoting the mechanisms of cell survival.
  • SIRT1 positively regulates the p65 subunit of NF-kB but also regulates the increase in protein expression of PGCla.
  • This protein binds to a transcription factor that regulates the genes involved in the management of energy metabolism. It increases the biogenesis and the function of the mitochondria, it also plays a role in the vascularization mechanisms.
  • HIF-Ia and 2a Hypoxia Inducible Factors pathway
  • PLDs Prolyl Hydroxylase Domain
  • HIF-Ia and HIF-2a are subunits of the transcription factors HIF-1 or HIF-2. After binding with the HIF-Ib subunit, these protein complexes can bind to the promoter regions of genes specific for angiogenesis (such as the VEGF gene for example). They therefore play a major role in the development and growth of blood vessels.
  • PHDs are a family of enzymes comprising three proteins: PHD 1, 2 and 3, which, in normoxia (normal amount of oxygen in the blood, allowing normal activity of the cells), promote the degradation of the proteins HIF-Ia and 2a by using oxygen as a substrate.
  • the HIF pathway is not solely responsible for the mechanisms of vascularization and angiogenesis.
  • the inventors thus became interested in another major pathway for angiogenesis: the signaling pathway for VEGF-A and its receptor VEGF-Receptor 2 (VEGF-R2).
  • VEGF-R2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2
  • VEGF-R2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2
  • the study of the phosphorylated form (active form) of VEGF-R2 also shows a significant difference. After treatment with decorin, there is an increase in the amount of VEGF-R2 and a significant increase in the activation of this receptor. It is interesting to increase the number of receptors since in this way the islets will be more receptive to the induction of angiogenesis by VEGF when they are transplanted.
  • Figure 27 shows that decorin potentiates insulin secretion in response to glucose and protects from the effect of TNF-alpha on insulin secretion in islets of human Langerhans.
  • the 10 independent preparations of human islets were treated with decorin in a control situation and after a pretreatment with TNF-alpha 20 nM for 24 h.
  • Figure 28 shows that decorin increases the survival of the pancreatic beta cell and protects it from death induced by a mix of pro-inflammatory cytokines known to induce cell death in diabetes.
  • the islets of human Langerhans were treated and then underwent double labeling: a TUNEL labeling marking the dead cells and an insulin labeling marking the beta-pancreatic cells.
  • the 10 independent preparations of human islets were treated with decorin in a control situation and after a pretreatment with TNF-alpha + gamma interferon + IL-lbeta (20 nM for 24 h).
  • N 10
  • Figure 29 shows that decorin potentiates insulin secretion in response to glucose and protects from the effect of excess fat (palmitate: 500mM final) on insulin secretion in the islets of human Langerhans.
  • the 10 independent preparations of human islets were treated with decorin in a control situation and after a pretreatment with palmitate for 48 h.
  • Figure 30 shows that decorin increases the survival of pancreatic beta cells and protects them from death induced by fatty acids which mimic the circulating conditions of a diabetic patient.
  • the islets of human Langerhans were treated and then a double marking was made: a so-called TUNEL marking marking the dead cells and an insulin marking marking the beta-pancreatic cells.
  • the 10 independent preparations of human islets were treated with decorin in a control situation and after a pretreatment with palmitate for 48 h.
  • N 10
  • FIG. 31 shows that decorin potentiates the secretion of insulin in response to glucose and protects from the effect of an excess of sugar (glucose: 16.7 mM final) on the secretion of insulin in the islets of human Langerhans.
  • the 10 independent preparations of human islets were treated with decorin in a control situation and after a glucose pretreatment for 48 h.
  • FIG. 32 shows that decorin restores the secretion of insulin in isolated human islets in patients with type 2 diabetes.
  • the islets of human Langerhans were treated with decorin for 24 hours before the measurement of secretion of insulin in response to glucose.
  • N 2
  • results obtained on the islets of Rat show that the use of decorin on the islets can improve the survival, the function and the angiogenesis of the pancreatic islets.
  • the study is carried out on Wistar rats.
  • the rats are housed according to collective standards: by five in cages, in a room at 23 ⁇ 1 ° C and in light / dark cycle of 12h. Rats are fed with standard kibbles (SAFE-A04, Villemoisson-sur-Orge, France), food and water are available ad libitum (free feeding mode, generally until satiety).
  • Experiments on rats are carried out in accordance with the principles and rules of European legislation relating to the protection of animals. The protocol was deposited with the ministry and evaluated by the Regional Committee of Ethics in matter of Animal Experimentation of France (CREMEAS) of reference of file 2015042216149683.
  • CREMEAS Regional Committee of Ethics in matter of Animal Experimentation of France
  • pancreatic islets Isolation of pancreatic islets is carried out on male Wistar rats of body weight varying from 200 to 220 g, previously anesthetized with Imalgene ® (Ketamine, Marial, Lyon, France) supplemented with Rompun ® (Xylazine 2%, Bayer, Puteaux, France) intraperitoneally at the rate of 100 mI / 100 g of body weight.
  • Imalgene ® Ketamine, Marial, Lyon, France
  • Rompun ® Xylazine 2%, Bayer, Puteaux, France
  • Isolation of pancreatic islets is carried out according to the method described by Sutton et al. (Sutton R. et al. 1986). The ventral buttonhole is cut out, then the pancreas is cleared from the other organs. After ligating the common bile duct to the duodenal mouth, 10 ml of type XI collagenase (Sigma-Aldrich, St-Louis, USA) at a rate of 1 mg / ml, are injected into the animal's pancreas via a catheter in the common bile duct at the hepatic mouth.
  • type XI collagenase Sigma-Aldrich, St-Louis, USA
  • pancreas is completely removed and the pancreatic islets are then separated from the exocrine tissue by centrifugation, using a discontinuous Ficoll gradient.
  • the purified islets are cultured overnight in 25 cm 2 flasks in M199 medium * (Gibco ®, Saint Aubin, France) supplemented with 10% FCS (Sigma-Aldrich) and 1% ABAM for 24 h at 37 ° C, 5% CO 2 and in a humid atmosphere.
  • pancreatic islets contained in the flanges are then cultured in 24-well plates at a density of 250 islets per well.
  • the culture medium is M199 supplemented as described above.
  • the culture medium for human islets is CMRL-1066 supplemented as described above.
  • the culture media may or may not contain decorin (R&D, Systems, Minneapolis, USA) at the final concentration of 1 pg / ml.
  • the culture is done for 24 hours at 37 ° C, 5% C02 and in a humid atmosphere. After 24 hours of incubation, the following tests were carried out.
  • the islets were isolated and cultured in the absence or presence of decorin in a 24-well plate at a concentration of 1250 islets per well, at 37 ° C. and 5% CO 2.
  • OCT Optimal Cutting Temperature
  • Ruptures at the ends of the 3-OH strands of DNA, generated during apoptosis, are detected using the TUNEL technique (Terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated deoxyuridine 5-triphosphate nick-end labeling) according to the manufacturer's protocol ( In situ cell death detection kit, Roche).
  • the cells were co-labeled with a monoclonal anti-insulin antibody (Cell Signaling Technology) and the cell nucleus was labeled with DAPI.
  • the number of TUNEL-positive cells was determined by counting after observation under a fluorescent microscope. For each experiment, approximately 1000 cells were counted with the ImageJ software. Study of proliferation by immunostaining of KI67
  • the histological section slides are produced and the KI67 labeling is carried out. This protein is only synthesized when the cells are in the division phase.
  • the cells were labeled with an anti-KI67 antibody (Novus Biologicals) used at a 1: 100 dilution in phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cell nucleus was labeled with DAPI.
  • Culture media with glucose concentrations of 2.8 and 16.7 mM are prepared from a Krebs solution (115 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 3.4 mM CaCI2, 1.2 mM KH2PO4, 2.1 mM MgS04, 21.2 mM NaHC03, 13.5 mM Hepes, [pH 7.4]) supplemented with 10% FCS.
  • 10 islets are removed and synchronized for 30 minutes in the 2.8 mM glucose medium, then cultured for 1 h in the 2.8 mM medium and finally 1 h in the 16.7 mM glucose, at 37 ° C. and 5% CO 2. After these incubations, the islets are placed in an acid-ethanol solution to measure the total insulin and glucagon content of the islets which was not secreted during the test. The culture medium supernatant and the ethanol-acid are stored at -20 ° C. until the assays. The amount of insulin or glucagon in each sample is determined by the ELISA method according to the manufacturer's protocol (Mercodia AB, Uppsala, Sweden). Islet secretion is expressed as a percentage of the total insulin or glucagon content.
  • the total protein content is extracted from the cultured islets using lysis buffer supplemented with a protease inhibitor (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). The samples were centrifuged at 10,000g for 10 minutes and the protein concentration in each sample was determined by a Bradford assay, with BSA as a standard.
  • the antibodies used are the following: monoclonal anti-phospho-IRSl Tyr628 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA); polyclonal anti-phospho-IRS2 Tyr978 (RayBiotech, Norcross, USA); anti-Akt monoclonal (Cell Signaling Technology, Leiden, NETHERLANDS); monoclonal anti-phospho-Akt Ser473 (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-phospho-AS160 Ser / Thr (Cell Signaling Technology); anti-NF-kB p65 monoclonal (Cell Signaling Technology); monoclonal anti-phospho-NF-kB p65 Ser536 (Cell Signaling Technology); monoclonal anti-FoxOl (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-phospho-FoxOl Thr24 / Fox03a Thr32 (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-SIRTl (Cell Signaling Technology); anti-PGCla polyclonal (Abcam, Cambridge, USA); poly
  • the membranes are then rinsed three times five minutes with TBS-T, then incubated for 1 hour at room temperature with the secondary antibodies diluted 1: 10,000 in a solution of TBS-T and 5% BSA.
  • the secondary antibodies diluted 1: 10,000 in a solution of TBS-T and 5% BSA.
  • an anti-Rabbit immunoglobulin G (IgG) antibody is used coupled with a horseradish peroxidase enzyme (Horseradish Peroxidase, HRP) (Sigma), or an anti-mouse IgG antibody coupled with HRP (Sigma).
  • the membranes are rinsed as described above and the activity of HRP is detected after adding the Super Signal TM West Femto Maximum Sensitivity Substrate substrate (Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA).
  • the light emission is then captured by a camera (Chemidoc, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) and images are taken.
  • the light energy emitted by the HRP enzyme is analyzed semi-quantitatively using the ImageJ software.
  • the light intensity relative to each protein is normalized using b-actin.
  • the islets were isolated and cultured in the absence or presence of decorin in a 24-well plate at a concentration of 500 islets per well, at 37 ° C. and 5% CO 2. After 2, 4, 8, 12, or 24 hours of culture, the supernatant is removed and stored at -20 ° C until the dosage of VEGF-A.
  • the amount of VEGF-A in the samples was determined by the ELISA method according to the manufacturer's protocol (RayBiotech). The protein concentration of each well was determined and the amount of VEGF-A was normalized by the total amount of protein.
  • Islet transplant was performed in male Lewis rats (200 g), inbred strain, in order to evade immunological rejection reactions. Diabetes was induced by a single intraperitoneal injection of 75 mg / kg of streptozotocin (STZ, Sigma-Aldrich) diluted in sterile physiological saline. The animals were considered diabetic after two consecutive measurements of blood sugar> 3 g / L using a blood glucose meter (Accu-chek Performa, Roche). The rats were then divided into 9 groups of 6 animals per group and metabolic monitoring was carried out for 2 months.
  • Diabetic rats received a daily subcutaneous insulin injection of 6UI (blood sugar> 3 g / L) or 3UI (2 g / L> blood sugar ⁇ 3 g / L) diluted in daily sterile physiological saline (Lantus SoloStar ® with 100 IU / mL of insulin glargine, Sanofi, Paris, France).
  • Metabolic control was monitored for 56 days after transplantation.
  • a comparative study between the groups was carried out concerning, on the one hand the appearance of insulin independence and on the other hand the daily insulin requirements.

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Abstract

La présente invention concerne de la décorine ou une composition comprenant de la décorine pour son utilisation dans le traitement du diabète, de type 1 (notamment dans le cadre d'une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques), de type 2 ou du diabète gestationnel.

Description

DESCRIPTION
LA DECORINE POUR SON UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DU DIABETE
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte au domaine de la santé et concerne plus particulièrement le traitement du diabète.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
Actuellement, une personne meurt du diabète toutes les six secondes. En 2017, l'estimation de l'OMS fait état de 466 millions de personnes atteintes du diabète dans le monde et de 3,5 millions en France (à cela s'ajoute entre 500 000 et 800 000 diabétiques qui s'ignorent). Le diabète est une maladie chronique qui apparaît lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d'insuline ou que l'organisme n'utilise pas correctement l'insuline qu'il produit. S'en suit un trouble de l'assimilation, de l'utilisation et du stockage du glucose apporté lors des différents repas de la journée. Il en résulte alors une augmentation du taux de glucose dans le sang, c'est l'hyperglycémie. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), si la glycémie est supérieure à 1,26 g/L à jeun, alors le patient est diabétique. Il existe de nombreuses formes de diabètes, les principales étant le diabète de type 1, le diabète de type 2 et le diabète gestationnel.
Le diabète de type 1, aussi appelé diabète insulino-dépendant, se déclare après la destruction des cellules du pancréas productrices d'insuline par le système immunitaire du malade : les cellules bêta. Il en résulte alors une diminution importante de la quantité d'insuline produite par le corps, provoquant ainsi une augmentation du taux de glucose dans le sang. Les symptômes aigus sont nombreux, notamment une polyurie (excrétion excessive d'urine), une polydipsie (soif intense), une faim constante ainsi qu'une perte de poids.
Pour traiter les patients diabétiques, plusieurs solutions thérapeutiques existent.
La première option est l'insulinothérapie, reposant sur l'administration pluriquotidienne d'insuline en injection par un stylo à insuline ou en perfusion par des pompes à insuline. Ce type de traitement est très contraignant et impacte fortement la qualité de vie des patients.
La deuxième option est la transplantation de pancréas. Ce traitement chirurgical est réservé aux patients diabétiques atteints de graves complications rénales et devant subir des dialyses. Dans ce cas, la greffe de pancréas est généralement associée à la greffe d'un autre organe, en général le rein. L'opération a pour avantage de remplacer totalement les injections d'insuline. Elle permet donc une qualité et une espérance de vie améliorée, ainsi qu'une diminution des complications liées au diabète. Malheureusement, cette technique connaît de nombreuses limites comme le rejet du greffon, la nécessité d'un traitement immunosuppresseur à vie, des infections ou encore des hémorragies internes. A ceci s'ajoute un acte chirurgical très lourd sous anesthésie générale, présentant un risque de morbidité non négligeable. La troisième option est la transplantation d'îlots pancréatiques. Cette approche consiste à transplanter les cellules sécrétrices du pancréas chez un receveur diabétique. Cette technique permet de s'affranchir de certaines limites de la greffe de pancréas, en transplantant seulement la fraction endocrine du pancréas : les cellules des îlots pancréatiques. Cette alternative a l'avantage d'être peu invasive, rapide et provoque moins de complications liées à l'intervention chirurgicale. Elle assure la stabilisation du métabolisme du glucose, une diminution significative des épisodes hypoglycémiques sévères et la normalisation des niveaux d’hémoglobine glyquée (Shapiro A.M. et al., 2000, The New England Journal of Medecine, N°343, p. 230-238. ; Pepper A.R. et al., 2013, World Journal of Transplantation, N°3, p. 48-53). Cette technique est particulièrement recommandée pour les patients dont le diabète est particulièrement instable (hypoglycémies sévères, épisodes de coma) mettant ainsi en jeu leur pronostic vital, pour lesquels les injections d'insuline ne sont pas une piste thérapeutique envisageable.
La transplantation d'îlots pancréatiques se déroule en plusieurs étapes. Tout d'abord, le pancréas du donneur est prélevé chirurgicalement et transporté jusqu'à un établissement capable d'effectuer l'isolement des îlots pancréatiques. Une digestion mécanique et enzymatique est réalisée pour séparer les différents tissus qui composent le pancréas. Les îlots sont purifiés et séparés des autres tissus grâce à un gradient discontinu de Ficoll. Les îlots ainsi isolés sont mis en culture pendant 12 à 48h avant d'être transplantés. Chez le patient receveur, la transplantation d'îlots pancréatiques est une procédure s'effectuant sous anesthésie locale en 30 à 45 minutes. Les îlots pancréatiques sont injectés dans le foie du patient receveur grâce à un cathéter placé dans la veine porte. Les îlots s'embolisent ensuite dans le foie où ils libérèrent de l'insuline.
Bien que la transplantation d'îlots pancréatiques soit une méthode prometteuse, elle connaît aujourd'hui plusieurs limites, notamment liées à la survie des îlots pancréatiques. En effet, lors des différentes étapes de cette transplantation, les cellules ne sont plus vascularisées et le taux de mortalité cellulaire est élevé. En particulier, la quantité de cellules vivantes diminue après la mort cérébrale du donneur, lors de la préservation du pancréas, lors de la digestion de l'organe et de l'isolement des îlots, puis lors de l'implantation chez le patient receveur. Ainsi, avant la transplantation d'îlots chez le receveur, seulement 50% des îlots pancréatiques du donneur sont encore viables. La perte d'îlots encore fonctionnels est également très importante à l'implantation, notamment en raison d'une réaction inflammatoire, de stress oxydant et surtout d'un défaut de vascularisation chez le patient receveur. C'est pour ces raisons qu'à l'heure actuelle, il faut recourir à deux ou trois donneurs pour transplanter une quantité suffisante d'îlots chez le receveur et obtenir une insulinodépendance durable.
Ainsi, il existe un besoin de développer de nouvelles stratégies de traitement du diabète, et notamment de mettre à disposition un médicament et une méthode permettant la préservation des cellules des îlots pancréatiques avant et/ou après leur transplantation pour favoriser le traitement du diabète. RESUME DE L'INVENTION
Face au problème posé par la diminution d'ilots pancréatiques viables lors d'une transplantation, les inventeurs montrent ici que la décorine est une candidate intéressante pour résoudre le problème de mortalité précoce des cellules transplantées en favorisant une réaction anti-inflammatoire, une revascularisation plus rapide des îlots pancréatiques dans les patients receveurs ainsi que la sécrétion d'insuline par les cellules de ces îlots, permettant ainsi le traitement du diabète et l'insulino-indépendance des patients. Plus généralement, les inventeurs ont démontré l'intérêt de la décorine dans le traitement du diabète pour sa capacité à diminuer la mortalité des cellules des îlots pancréatiques et améliorer la synthèse et la sécrétion d'insuline par ces cellules. De plus, les inventeurs montrent que la décorine protège les cellules pancréatiques de la perte de fonction et la mort cellulaire observés dans un diabète de type 2.
Un aspect de l'invention concerne de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète. De préférence, le diabète est le diabète de type 1, le diabète de type 2 ou le diabète gestationnel.
Particulièrement, l'invention concerne de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, pour son utilisation dans le traitement d'un sujet greffé ou susceptible d'être greffé avec des cellules d’îlots pancréatiques.
L'invention concerne également de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, pour son utilisation en combinaison avec une thérapie immunosuppressive et/ou un traitement anti-inflammatoire concomitant ou suivant la transplantation de cellules d’îlots pancréatiques chez un sujet, ou pour son utilisation en combinaison avec un principe actif antidiabétique.
De préférence, la thérapie immunosuppressives et/ou le traitement anti-inflammatoires sont choisis parmi de la thymoglobuline, des anti-TNFa, de la rapamune, des inhibiteurs des calcineurines, des agents dépléteurs de lymphocyte T ou des combinaisons de ceux-ci. De manière préférée, la thérapie immunosuppressives et/ou le traitement anti-inflammatoires est une combinaison de thymoglobuline et de rituximab.
De préférence, l'actif antidiabétique est choisi parmi l'insuline, la metformine, des sulfonylurées, le tolbutamide, l'acétohexamide, le tolazamide, le chlorpropamide, le glibenclamide, le glimépiride, le glipizide, le glicazide, le glycopyramide, le gliquidone, des inhibiteurs d'alpha-glucosidase, l'acarbose, le miglitol, le voglibose, des thiazolidinediones, le pioglitazone, le rosiglitazone, des méglitinides, le répaglinide, le natéglinide, un incrétino-mimétique, un analogue du glucagon-like peptide, l'exénatide ou ses dérivés, le taspoglutide, le liraglutide, le semaglutide, un inhibiteur de la dipeptidyl peptidase-4, le vildagliptine, le sitagliptine, le saxagliptine, le linagliptine, l'allogliptine, le septagliptine, un analogue de l'amyline, le pamlintide, un inhibiteur du transporteur de sodium glucose, l'empaglifozine, la dapaglifozine, la canamycine, ou une combinaison de ceux-ci. L'invention est aussi relative à de la décorine ou une composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement d'un sujet donneur de cellules d’îlots pancréatiques avant les prélèvements desdites cellules.
En particulier, l'invention est aussi relative à de la décorine ou une composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement d'un sujet greffé avec des cellules d’îlots pancréatiques. De préférence, les cellules d’îlots pancréatiques greffées ont été traitées avec de la décorine.
La composition pharmaceutique utilisée selon l'invention peut comprendre des cellules humaines et de la décorine en tant que substance active. En particulier, les cellules sont choisies parmi des cellules endocrines et des cellules d'ilots pancréatiques.
Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l’invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.
De plus, diverses autres caractéristiques de l’invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l’invention.
DESCRIPTION DES DESSINS
[Fig 1] représente l'impact de la décorine sur la viabilité des îlots pancréatiques. Evaluation de l'apoptose par mesure des cellules TUNEL positives réalisée sur coupes d'îlots pancréatiques de 10 pm. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.
[Fig 2] représente l'effet de la décorine sur la fonctionnalité des îlots pancréatiques. A. Sécrétion de glucagon par les îlots pancréatiques traités avec de la décorine (Décorine) ou non (CTL) et incubés en présence de 2.8 mM (Colonne noire) ou de 16.7 mM de glucose (Colonne blanche). La sécrétion est représentée en pourcentage par rapport au contenu total en glucagon des îlots. B. Sécrétion d'insuline par les îlots pancréatiques traités avec de la décorine (Décorine) ou non (CTL) et incubés en présence de 2.8 mM (Colonne noire) ou de 16.7 mM de glucose (Colonne blanche). La sécrétion est représentée en pourcentage par rapport au contenu total en insuline des îlots. C. Contenu total en glucagon des îlots pancréatiques. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. D. Contenu total en insuline des îlots pancréatiques. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=10 et 12 expérimentations indépendante ; * p < 0.05, ** p < 0.01 16.7mM versus 2.8mM de glucose. [Fig 3] représente l'évaluation de l'index de stimulation des îlots pancréatiques. A. Rapport entre la sécrétion d'insuline obtenue lors de l'incubation des îlots pancréatiques avec 16.7 mM versus 2.8 mM de glucose. B. Rapport entre la sécrétion de glucagon obtenue lors de l'incubation des îlots pancréatiques avec 2.8 mM versus 16.7 mM de glucose. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=8 et 10 expérimentations indépendantes.
[Fig 4] représente l'expression protéique d'IGF-lR (A) et de p-IGFR-lR (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.
[Fig 5] représente l'étude de l'activation du récepteur IGF-1R. Rapport entre l'expression de p-IGF-lR et IGF-1R. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; ** p < 0.01 versus CTL.
[Fig 6] représente l'expression protéique d'IRS-l (A) et de p-IRS-1 (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 et n=7 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.
[Fig 7] représente l'étude de l'activation d'IRS-l. Rapport entre l'expression de p-IRS-1 et IRS-1. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.
[Fig 8] représente l'expression protéique d'IRS-2 (A) et de p-IRS-2 (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec de la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; ** p < 0.01 versus CTL.
[Fig 9] représente l'étude de l'activation d'IRS-2. Rapport entre l'expression de p-IRS-2 et IRS-2. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes.
[Fig 10] représente l'expression protéique d'Akt (A) et de p-Akt (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=12 expérimentations indépendantes.
[Fig 11] représente l'étude de l'activation d'Akt. Rapport entre l'expression de p-Akt et Akt. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=ll expérimentations indépendantes ; *** p < 0.001 versus CTL.
[Fig 12] représente l'expression protéique de FoxOl (A) et de p-FoxOl (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=7 expérimentations indépendantes ; ** p < 0.01 versus CTL.
[Fig 13] représente l'étude de l'activation de FoxOl. Rapport entre l'expression de p-FoxOl et FoxOl. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=7 expérimentations indépendantes ; ** p < 0.01 versus CTL.
[Fig 14] représente l'expression protéique de NF-kB p65 (A) et de p-NF-kB p65 (Ser536) (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=7 et n=8 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.
[Fig 15] représente l'étude de l'activation de NF-kB p65. Rapport entre l'expression de p-NF-kB p65 (Ser536) et NF-kB p65. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=7 expérimentations indépendantes.
[Fig 16] représente l'expression protéique de SIRT1 (A) et de PGCla (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=4 et n=7 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.
[Fig 17] représente l'expression protéique de HIF-Ia (A) et de HIF-2a (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=12 et n=ll expérimentations indépendantes ; *** p < 0.001 versus CTL.
[Fig 18] représente l'expression protéique de PHD1 (A), de PHD2 (B) et de PHD3 (C). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=12 expérimentations indépendantes.
[Fig 19] représente l'expression protéique du récepteur VEGFR2 (A) et de sa forme phosphorylée (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 et n=7 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.
[Fig 20] représente l'étude de la sécrétion de VEGF-A au cours du temps. Les courbes noires et en pointillés représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. La sécrétion de VEGF est représentée en pourcentage par rapport au temps, 2h post traitement. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes.
[Fig 21A] représente l'augmentation la prise de poids corporel des rats STZ post transplantation avec la décorine. A. Gain de poids corporel au cours du temps mesuré en gramme par rapport à t=0 post transplantation (10000 IEQ : opti) pour les groupes SHAM (·), contrôle (■), décorine (A ), contrôle + décorine ( T ) et décorine + décorine (¨).
[Fig 21B] représente l'augmentation la prise de poids corporel des rats STZ post transplantation avec la décorine. B. Gain de poids corporel évalué sur l'ensemble des 56 jours de suivi métabolique et représenté par l'aire sous la courbe pour les groupes SHAM, contrôle, décorine, contrôle + décorine et décorine + décorine ayant été transplanté avec 5000 (sub) ou 10000 IEQ. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=3 à 5 expérimentations indépendante ; * p < 0.05, ** p < 0.01 versus décorine opti. La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».
[Fig 22A] représente l'amélioration de la régulation glycémique des rats STZ post transplantation avec la décorine. A. Evolution de la glycémie au cours du temps mesuré en g/L pour les groupes SHAM (·), contrôle (■), décorine ( A ), contrôle + décorine ( T ) et décorine + décorine (¨).
[Fig 22B] représente l'amélioration de la régulation glycémique des rats STZ post transplantation avec la décorine. B. Glycémie évaluée sur l'ensemble des 56 jours de suivi métabolique et représentée par l'aire sous la courbe pour les groupes SHAM, contrôle, décorine, contrôle + décorine et décorine + décorine ayant été transplanté avec 5000 (sub) ou 10000 IEQ. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=3 à 5 expérimentations indépendante ; * p < 0.05, ** p < 0.01 versus décorine opti. La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».
[Fig 23A] représente l'effet de la décorine sur la c-peptidémie des rats STZ post transplantation. Evolution de la c-petidémie au cours du temps mesuré en pmol/L pour les groupes SHAM (·), contrôle (■), décorine ( A ), contrôle + décorine ( T ) et décorine + décorine (¨). [Fig 23B] représente l'effet de la décorine sur la c-peptidémie des rats STZ post transplantation. C- peptidémie évaluée sur l'ensemble des 56 jours de suivi métabolique et représentée par l'aire sous la courbe pour les groupes SHAM, contrôle, décorine, contrôle + décorine et décorine + décorine ayant été transplanté avec 5000 (sub) ou 10000 IEQ. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=3 à 5 expérimentations indépendante ; * p < 0.05, ** p < 0.01 versus décorine opti. Dans la figure 23B, la décorine est abrégée sous le terme «decorin».
[Fig 24] représente l'augmentation de l'insulino-indépendance des rats STZ post transplantation avec traitement à la décorine : Insulino-indépendance exprimée en pourcentage d'animaux ayant atteint une normoglycéme (Glycémie < 2 g/L) par rapport à l'ensemble des animaux de chaque des groupes SHAM ou transplantés (Contrôle ou décorine ayant reçu 5000 (sub) ou 10000 IEQ (opti)). n=3 à 5 expérimentations indépendantes. La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».
[Fig 25] représente l'impact de la décorine sur les besoins en insuline des rats STZ post transplantation. Répartition spatiale des besoins en insuline quotidiens reçu tout au long de l'étude par les animaux SHAM ou transplantés (Contrôle ou décorine ayant reçu 10000 IEQ (opti)) selon 3 axes représentant les doses en insuline injectées (0 Ul, 3 Ul ou 6 Ul). Cette répartition est représentée en pourcentage d'animaux ayant reçu l'une des 3 doses par rapport à l'ensemble des animaux de chacun des groupes représentés. n=3 à 5 expérimentations indépendantes.
[Fig 26] représente le besoin en insuline des rats après induction d'un diabète par destruction des cellules beta pancréatiques et greffe d'ilots. Les groupes suivants sont étudiés: SHAM: destruction des cellules beta et pas de transplantation; contrôle: destruction de cellules beta + transplantation îlots, Décorine: destruction de cellules beta + transplantation îlots prétraités à la décorine 24h; contrôle+décorine: destruction de cellules beta + transplantation d'ilots avec injection du receveur à la décorine toutes les 24h; décorine+décorine: destruction de cellules beta + transplantation d'ilots prétraités avec injection du receveur toutes les 24h. La décorine est abrégée sous le terme « decorin».
[Fig 27] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la sécrétion d'insuline en situation contrôle et inflammatoire (48h TNF-ALPHA).
[Fig 28] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la survie et l'apoptose en situation contrôle et inflammatoire (Cytomix 48h TNF-alpha + Interféron gamma+ILl-beta). La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».
[Fig 29] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la sécrétion d'insuline en situation contrôle et riche en gras (palmitate 48H). La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».
[Fig 30] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la survie et l'apoptose en situation contrôle et riche en gras (48h). La décorine est abrégée sous le terme « decorin ». [Fig 31] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la sécrétion d'insuline en situation contrôle et riche en sucre (glucose 16,7 mM 48H). La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».
[Fig 32] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la sécrétion d'insuline chez des îlots isolés à partir de donneurs atteints de diabète de type 2.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Introduction
La présente invention concerne de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète, le traitement du diabète pouvant comprendre en outre la transplantation d'ilots pancréatiques.
Il faut noter que toutes les études de la présente demande ont été réalisées sur des îlots humains non altérés non dissociés, non triés et non manipulés chimiquement. Ceci se distingue d'études réalisées sur des cellules betas pures triées par FACS et par exemple mises en culture sur matrice extracellulaire (804G), riche en laminine 5. En effet, cette matrice permet de protéger les cellules bêta-pancréatiques de la mort cellulaire et augmente la sécrétion d'insuline induite par le glucose en activant la voie des intégrines B1 et perturbant ainsi la signalisation intracellulaire et la physiologie de la cellule. Les résultats obtenus par ces méthodes permettent d'identifier un effet direct ou indirect sur la cellule bêta-pancréatique en tant que telle mais ne reflète absolument pas les effets sur l'ilot entier qui est composé d'un mélange de différents types cellulaires (alpha, beta, delta, cellule exocrine). Les résultats obtenus sur le modèle de cellule béta trié ne permettent pas de prédire un quelconque effet sur l'ilot natif. A contrario, les inventeurs démontrent ici l'importance de l'effet de la décorine au niveau d'ilots complets natifs.
Définitions
Le terme « décorine » se rapporte ici à une myokine. La décorine appartient à la famille des petits protéoglycanes riches en leucine (SLRP) et consiste en un noyau protéique contenant des répétitions de leucine avec une chaîne glycosaminoglycane (GAG) constituée de chondroïtine sulfate (CS) ou de dermatane sulfate (DS). Les résidus leucine lui permettent de se fixer à un grand nombre de récepteurs cellulaires. Elle est ainsi capable de déclencher les cascades de signalisation correspondantes. En particulier, la décorine est un facteur endocrinien produit par les muscles, qui est capable de se fixer à la surface des cellules bêta du pancréas. Les noms alternatifs de cette protéine sont PG-S2, PG40 ou Protéoglycane osseux II. La décorine peut se retrouver sous la forme de différents isoformes produits par épissage alternatif. Il s'agit des isoformes A (séquence consensus), B, C, D et E. La décorine est décrite dans les bases de données sous les numéros d'accessions suivants : Gene ID : 1634, UniGene : Hs.156316 et Hs.530910. Cette protéine est également décrite sous le numéro d'accession UniProt P07585. Les références des séquences ARN pour la décorine humaine sont par exemple NM_001920.4 (isoforme A), NM_133503.3 (isoforme A), NM_133504.3 (isoforme B), NM_133505.3 (isoforme C), NM_133506.3 (isoforme D) et NM_133507.3 (isoforme E). Les références des séquences protéiques sont par exemple NP_001911.1 (isoforme A), NP_598010.1 (isoforme A), NP_598011.1 (isoforme B), NP_598012.1 (isoforme C), NP_598013.1 (isoforme D) et NP_598014.1 (isoforme E). De préférence, la décorine selon l'invention est l'isoforme de type A. La décorine comprend généralement un peptide signal en position 1- 16 et un propeptide en position 17-30. La décorine comprend de préférence la séquence entre les positions 17-359 ou 31-359. La décorine comprend facultativement le peptide signal et/ou le propeptide.
Une séquence de la décorine humaine est en particulier décrite dans la SEQ. ID NO : 1.
Le terme « substitution », tel qu’utilisé ici désigne le remplacement d’un résidu d’acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d’acides aminés standard naturels, les résidus d’acides aminés naturels rares et d’acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d’un résidu d’acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d’acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminépar un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions conservatives sont présentés dans les tableaux suivants.
[Table 1]
[Table 2]
Groupes de substitution conservative alternatifs [Table 3]
Classification fonctionnelle et physique supplémentaire des acides aminés
Par « myokine », on entend une substance soluble produite et libérée par les cellules des muscles en réponse aux contractions musculaires. Ces molécules ont la capacité d'agir directement ou indirectement sur plusieurs organes, conduisant aux changements métaboliques nécessaires pendant ou après un exercice physique.
Le terme « diabète » se rapporte ici à une maladie chronique qui survient lorsque le pancréas neproduit pas assez d’insuline ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser efficacement l’insuline qu’il produit. Le diabète est un trouble de l'assimilation, de l'utilisation et du stockage des sucres apportés par l'alimentation. Ceci se traduit par une hyperglycémie, caractérisée par un taux de glucose élevé dans le sang, généralement supérieur à 1,26 g/L de sang. On distingue principalement deux types de diabète : le diabète de type 1 qui touche environ 6% des diabétiques et le diabète de type 2 qui en touche 92 %. Les autres types de diabète concernent les 2 % restants (MODY, LADA ou diabète secondaire à certaines maladies ou prises de médicaments).
On entend par « diabète de type 1 » ou « diabète insulino-dépendant » une forme particulière de diabète, généralement considérée comme une maladie auto-immune, qui résulte de la disparition des cellules bêta du pancréas, entraînant une carence totale en insuline. Le glucose ne pouvant entrer dans les cellules retourne dans le sang, ceci entraîne une forte augmentation de la glycémie, caractérisée par un taux de glucose bien supérieur à 1,26 g/L de sang.
On entend par « diabète de type 2 » ou « diabète non insulino-dépendant » une forme particulière de diabète, résultant soit d'une insulinopénie lorsque le pancréas fabrique insuffisamment de l'insuline, soit d'une insulinorésistance lorsque cette insuline n'est pas capable d'agir suffisamment pour réguler la glycémie. Dans les deux cas, la glycémie n'est pas régulée.
On entend par « diabète gestationnel » une forme particulière de diabète qui est un trouble de la tolérance glucidique conduisant à une hyperglycémie de sévérité variable, débutant ou diagnostiqué pour la première fois chez une femme pendant la grossesse. Le diabète gestationnel apparaît en particulier chez des femmes qui ont un diabète méconnu et que la grossesse va révéler ou chez des femmes qui développent un diabète uniquement à l'occasion de la grossesse, trouble qui disparaît le plus souvent après la naissance du bébé.
Par « complication du diabète » sont entendus tous les états, conditions, troubles ou maladies qui résultent des conséquences d'une hyperglycémie relative au diabète. Pratiquement toutes les parties du corps et des organes peuvent subir les contrecoups d’un diabète et/ ou d'une glycémie mal contrôlée. L'hyperglycémie peut en particulier affaiblir les parois des vaisseaux sanguins qui approvisionnent les tissus et/ou les organes en oxygène et en éléments nutritifs. Les complications du diabète englobent les complications aigües telles que l'acidocétose diabétique et les états hyperosmolaires, ainsi que les complications à long terme telles que les troubles oculaires, les néphropathies et les maladies cardio vasculaires. Les complications sont plus particulièrement décrites ci-après dans le paragraphe « Diabètes et complications ciblées par la présente invention ».
Par « insuline », on entend ici une hormone protéique sécrétée par les cellules b des îlots pancréatiques. Elle permet de réguler la glycémie en favorisant la captation du glucose dans les cellules du muscle, du foie ou dans les cellules adipeuses. C'est une hormone hypoglycémiante.
Par « hypoglycémie » est entendu ici un taux de glucose bas dans le sang, généralement inférieur à 0,60 g/L de sang. Les termes « cellules d'îlots pancréatiques » ou « cellules d'îlots de Langerhans » se rapporte ici aux cellules endocrines du pancréas, regroupées en amas sphériques. Les îlots sont composés en majorité de cellule bêta et de cellule alpha. Ces dernières sécrètent respectivement l'insuline et le glucagon.
Le terme "traitement" se rapporte ici à l’obtention d’un effet pharmacologique et/ou physiologique souhaité. L’effet peut être prophylactique en termes de prévention totale ou partielle d’une maladie ou d’un symptôme et/ou peut être thérapeutique en termes de guérison partielle ou complète d’une maladie et/ou d’un effet indésirable attribuable à la maladie. Le terme « traitement » tel qu'utilisé ici couvre tout traitement d’une maladie chez un mammifère, en particulier chez un humain, pour : réduire l’incidence et/ou le risque de rechute de la maladie pendant une période sans symptômes; soulager ou réduire un symptôme de la maladie; empêcher la maladie de se produire chez un sujet qui peut être prédisposé à la maladie mais qui n’a pas encore été diagnostiqué comme l’ayant; inhiber la maladie, c'est-à-dire stopper son développement (par exemple, réduire le taux de progression de la maladie); réduire la fréquence des épisodes de la maladie; ralentir le développement de la maladie et soulager la maladie, c'est-à-dire provoquer une régression totale ou partielle de la maladie.
L'expression "quantité thérapeutiquement efficace", telle qu’utilisée ici, se réfère à une quantité qui résulte en une amélioration de l'état d'un organe ou d'un sujet, ou en une diminution de la maladie, du trouble ou des symptômes de la maladie ou du trouble en question.
Les termes «individu», «hôte», «sujet» et «patient», sont utilisés ici de manière interchangeable, et désignent un mammifère, plus particulièrement un sujet animal et plus particulièrement encore un humain. Le sujet peut souffrir de diabète.
Les termes « donneur », « patient donneur » et « sujet donneur » sont utilisés ici de manière interchangeable et réfère aux personnes chez qui les îlots pancréatiques sont prélevés. Il peut s'agir de personnes décédées, particulièrement en état de mort encéphalique (principalement due à des traumatismes, accidents vasculaires cérébraux, anoxies ou intoxications) ou de sujet vivant.
Les termes « receveur », « patient receveur », « sujet receveur », « sujet greffé », « sujet susceptible d'être greffé » réfèrent à un sujet ayant subi ou étant susceptible de subir une transplantation de cellules d'îlots pancréatiques, lesdites cellules provenant d'un donneur. De préférence, le receveur souffre de diabète.
Telle qu’utilisée ici, une "composition pharmaceutique" désigne une préparation d’un ou plusieurs des agents actifs avec d’autres composants chimiques optionnels tels que des supports physiologiquement appropriés et/ou des excipients. Le but d’une composition pharmaceutique est de faciliter l’administration de l’agent actif à un organisme. Les compositions de la présente invention peuvent se présenter sous une forme appropriée pour toute voie d’administration ou d’utilisation conventionnelle. La composition pharmaceutique selon l'invention englobe les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine humaine et les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine animale, c'est à dire les compositions vétérinaires. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Tel qu’utilisé ici, les termes « support pharmaceutiquement acceptable » ou « excipient pharmaceutiquement acceptable » ou « véhicule pharmaceutiquement acceptable » sont interchangeables et comprennent tous composés ou combinaisons de composés qui sont connus de l’homme de l’art comme étant utiles dans la formulation de compositions pharmaceutiques ou vétérinaires. Dans le contexte de la présente invention, on entend par « physiologiquement acceptable » ou « pharmaceutiquement acceptable », tout milieu ou additif qui n’interfère pas avec l’efficacité de l’activité biologique de la substance active (ici, la décorine), et qui n’est pas excessivement toxique pour le patient ou sujet, aux concentrations auxquelles il est administré et/ou qui ne produisent pas de réaction indésirable lorsqu'elles sont administrées à un humain ou à un animal. Un véhicule, un support ou un excipient physiologiquement acceptable peut être approprié à l'administration aux humains et/ou aux animaux (en particulier aux mammifères).
Le terme « substance active », tel qu'utilisé ici, désigne une substance ou molécule qui, dans une composition, un mélange ou un milieu engendre un effet particulier et recherché sur des cellules ou sur un sujet. La substance active s'oppose aux ingrédients « inertes » n'ayant pas d’activité pharmacologique particulière, notamment les excipients ainsi qu'aux composés secondaires, ayant ou non un effet pharmacologique, qui servent de support ou d'adjuvant à la substance active principale, et qui n'agissent seulement que pour renforcer l'effet de la substance active de manière directe (en agissant sur la substance active) ou de manière indirecte (en agissant sur les conditions ou troubles impliqués dans la maladie).
Le terme "médicament", tel qu’utilisé ici, englobe des médicaments à usage humain et animal en médecine humaine et vétérinaire et fait référence à toute substance acceptable sur le plan pharmacologique qui procure un effet thérapeutique et/ou bénéfique. Le terme "médicament" utilisé ici n’est pas nécessairement limité aux substances nécessitant une autorisation de mise sur le marché.
Par « transplantation » ou « greffe », on entend une intervention, en particulier une intervention chirurgicale qui consiste à transférer un organe, un tissu ou des cellules d'un individu à l'autre. En particulier, ces termes font référence à une hétérogreffe et/ou à une allogreffe. De préférence, une transplantation consiste à remplacer un organe ou tissu malade par un organe ou tissu sain, appelé « greffon » ou « transplant » et provenant d’un sujet donneur. Dans le contexte de l'invention, le greffon correspond aux îlots pancréatiques prélevés chez le patient donneur et/ou aux cellules d'ilots pancréatiques purifiées destinées à être transplantées chez le patient receveur. Par exemple, le greffon peut correspondre à des îlots pancréatiques qui ont été préparés à partir de cellules souches. Tel qu'utilisé ici, le terme de « cellule souche embryonnaire » se réfère à des cellules dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste et qui ont la capacité de conduire à la formation de tous les tissus de l'organisme (mésoderme, endoderme, ectoderme), y compris aux cellules de la lignée germinale. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4 et NANOG et des marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81.
Tel qu'utilisé ici, le terme de « cellule souche pluripotente induite » (CSPi, ou iPS), se réfère à des cellules souches pluripotentes obtenues par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées, et présentant une morphologie et un potentiel d'autorenouvèlement et de pluripotence en partie similaires à ceux des cellules souches embryonnaires. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, notamment la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Les procédés permettant l'obtention des cellules souches pluripotentes induites sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits dans les articles de Yu et al (Science, 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 2007, 131(5): 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106).
Par « adjuvant d'une thérapie » ou « adjuvant d'un traitement », on entend un traitement qui complète un traitement principal (généralement un « traitement de première intention » ou « traitement standard ») afin renforcer l'effet thérapeutique recherché, afin de prévenir ou de retarder la réapparition (récidive) de la maladie, ou afin de diminuer les risques de complications découlant de la maladie ou du traitement.
Par « milieu », « milieu de culture » ou « milieu de conservation », on entend une composition qui permet le maintien et/ou la culture de cellules d'îlots pancréatiques viables et/ou fonctionnels. Ce milieu peut être spécifique à la séparation, l’isolation, la culture et le contrôle des cellules des îlots pancréatiques. En principe, les cellules trouvent dans ce milieu les composants indispensables pour leur survie et/ou leur multiplication tels que des acides aminés, des vitamines, des sels inorganiques, du glucose. En particulier, ce milieu est optimisé pour la culture in vitro d'îlots pancréatiques.
Par « maintien de la viabilité des cellules d'îlots pancréatiques » ou « préservation de la viabilité des cellules d'îlots pancréatiques », on entend le maintien de la survie et/ou de la fonctionnalité des cellules des îlots pancréatiques, et/ou la diminution de l'occurrence et/ou de la fréquence d'apoptose des cellules des îlots pancréatiques.
Dans le cadre de la présente demande on entend par "acide nucléique" un diester de phosphate d’une forme polymérique de ribonucléosides (adénosine, guanosine, uridine ou cytidine; "molécules ARN") ou de désoxyribonucléosides (désoxyadénosine, désoxyguanosine, désoxythymidine, or désoxycytidine; "molécules ADN"), ou un analogue phosphodiester quelconque de ceux-ci, tels que des phosphorothioates et des thioesters, sous forme simple brin ou sous forme double brin. L’acide nucléique peut ainsi être un acide désoxyribonucléique ou un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, de séquences d'acides aminés hybrides ou de séquences synthétiques ou semi synthétiques, modifiés ou non.
Tels qu’utilisés ici, les termes "construction d’acide nucléique" et "vecteur" sont équivalents et font référence à une molécule d’acide nucléique qui sert à transférer et/ou exprimer une séquence d’acides nucléiques, telle qu’un ADN ou un ARN, dans une cellule hôte. Un vecteur peut comprendre une origine de réplication, un marqueur sélectionnable et éventuellement un site approprié pour l’insertion d’une séquence ou d’un gène. Un vecteur peut être soit un vecteur extra-chromosomal auto-réplicatif, soit un vecteur qui s’intégre dans le génome de la cellule hôte. Il peut également comprendre des éléments d’expression comprenant, par exemple, un promoteur, une séquence d’initiation de la traduction ribosomale, un codon d'initiation, un codon de terminaison et/ou une séquence de terminaison de la transcription. Les vecteurs capables de diriger l’expression de la séquence d’acide nucléique auxquels ils sont liés de manière opérationnelle peuvent également être appelés ici "vecteurs d’expression". La construction d’acide nucléique peut être un vecteur pour l’expression stable ou transitoire d’un gène ou d’une séquence. Tel qu’utilisé ici, le terme "identité de séquence" ou "identité" ou « pourcentage d'identité » se réfère au pourcentage de résidus d’acides aminés identiques entre les deux séquences comparées, ce pourcentage étant obtenu après mise en oeuvre du meilleur alignement (alignement optimum) entre les deux séquences. L’identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. Notamment, le pourcentage d'identité par rapport à la séquence de référence sera calculé en divisant (i) le nombre total de résidus identiques alignés entre les deux séquences par (ii) le nombre total de résidus contenus dans la séquence de référence, puis en multipliant par 100 le quotient obtenu. En particulier, l’identité de séquence peut être déterminée en utilisant l’un quelconque des nombreux algorithmes d’alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d’alignement global (ex. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d’alignement local, par exemple l’algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) ou l’algorithme d’AltschuI (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L’alignement dans le but de déterminer le pourcentage d’identité de séquences d’acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. nih.gov ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L’homme de l’art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l’alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d’identité de séquence d’acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme EMBOSS Needle d'alignement de séquences par paires qui crée un alignement global optimal de deux séquences en utilisant l'algorithme de Needleman-Wunsch dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut : Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gap penalty = false, End gap open = 10 and End gap extend = 0.5.
Tel qu'utilisé ici, le terme "comprenant" ou "comprend" est utilisé en référence à des substances, composés ou procédés qui sont essentiels à l'invention, mais qui sont ouverts à l'inclusion d'éléments non spécifiques, essentiels ou non.
Le terme "et/ou" tel qu'il est utilisé ici doit être considéré comme une description spécifique de chacune des deux caractéristiques ou composants spécifiés, avec ou sans l'autre. Par exemple, «A et/ou B» doit être considéré comme une divulgation spécifique de chacun des éléments suivants: (i) A, (ii) B et (iii) A et B, comme si chacun d'eux était présenté individuellement.
Décorine
La décorine selon l'invention est une myokine, en particulier une myokine de mammifère, de préférence une myokine humaine, de manière préférée l'isoforme A de la décorine humaine, de manière encore plus préférée la décorine décrite par la SEQ ID No : 1 ou un fragment ou variant fonctionnel de celle-ci.
Il est entendu que la présente invention concerne également toute protéine présentant des modifications, tels que des mutants, des variants ou des homologues, ayant le même effet ou activité que la décorine selon l'invention. Les termes « homologue », « variant », « équivalent biologique » ou « mutant » sont interchangeables et réfèrent à une protéine ayant une homologie ou une identité de séquence avec la séquence nucléotidique de la décorine selon l'invention, ledit variant fonctionnel conservant l’activité biologique de la protéine dont il est issu. Tel qu’utilisé ici, le terme "mutation" comprend des mutations naturelles ou induites, comprenant au moins des altérations comprenant des délétions, des insertions, des substitutions connues de l’homme de l’art, y compris une modification génétique introduite dans une séquence de nucléotides ou d’acides aminés. Par exemple, un variant présente au moins environ 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'homologie ou d'identité de séquence avec la protéine de référence (encore appelée « séquence parente »), et présente une activité biologique sensiblement équivalente à celle-ci. Par "variant" ou "équivalent", on entend également une séquence polypeptidique ou protéique qui diffère de celle d’une séquence de référence par au moins une modification ou mutation d’acide aminé.
Ainsi, la décorine peut comprendre une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% avec la séquence de la décorine mature (c'est-à-dire sans le peptide signal et le propeptide), plus spécifiquement pour l'homme avec la séquence entre les positions 31-359 de la SEQ ID NO :1. De manière alternative, la décorine peut comprendre la séquence mature de la décorine (plus spécifiquement pour l'homme avec la séquence entre les positions 31-359 de la SEQ ID NO : 1) et présenter en outre 1 à 20 modifications choisies parmi une substitution, une délétion ou une addition d'un acide aminé. De préférence, les substitutions sont conservatives.
En particulier, la décorine selon l'invention peut comprendre 1 à 20 substitutions conservatives, de préférence 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions conservatives par rapport à la SEQ ID No.l ou un fragment correspondant aux acides aminés 17-359 ou31-359 de celle-ci. La décorine selon l'invention peut particulièrement comprendre la substitution T268M ou E273Q.
Selon un mode de réalisation, la décorine est un fragment biologiquement actif de la décorine. Par « fragment biologiquement actif » on entend ici un fragment protéique ou polypeptidique qui présente une activité biologique sensiblement équivalente à la décorine. Ainsi, la décorine peut être choisie parmi la décorine avec le peptide signal et le propeptide (notamment la SEQ ID NO : 1 pour l'homme), la décorine sans le peptide signal et avec le propeptide (notamment 17-359 de la SEQ ID NO : 1 pour l'homme), ou la décorine sans le peptide signal et le propeptide (notamment 31-359 de la SEQ ID NO : 1 pour l'homme).
Suivant le sujet traité, la décorine sera de préférence une décorine de la même espèce. Ainsi, si le sujet à traiter est un patient humain, la décorine sera une décorine humaine.
En particulier, l'invention concerne de la décorine ou d'une composition pharmaceutique la comprenant pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète, par exemple du diabète de type 1, de type 2 ou le diabète gestationnel, de préférence dans le traitement du diabète de type 1.
En effet, dans le contexte du traitement du diabète, la décorine permet d'améliorer la synthèse et la sécrétion d'insuline par les cellules des îlots pancréatiques, en particulier en réponse à une stimulation par le glucose, et de diminuer la mortalité des cellules de ces îlots. Notamment, la décorine permet d'augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules des îlots pancréatiques en réponse à une stimulation par le glucose, et de diminuer la mortalité des cellules de ces îlots lorsqu'ils sont soumis à l'effet de cytokines pro-inflammatoires comme TNF-alpha, INF-gamma or ILl-beta, d'acides gras comme le palmitate, ou d'une quantité excessive de sucre. Ainsi, la présente invention est également relative à l'utilisation de la décorine pour diminuer chez un patient diabétique les effets de l'inflammation, en particulier de cytokines pro-inflammatoires comme TNF-alpha, INF-gamma or ILl-beta, sur la sécrétion d'insuline en réponse à une stimulation par le glucose, et sur la mortalité des cellules de ces îlots induites par cette inflammation. La présente invention est en outre relative à l'utilisation de la décorine pour diminuer chez un patient diabétique les effets d'une alimentation grasse sur la sécrétion d'insuline en réponse à une stimulation par le glucose, et sur la mortalité des cellules de ces îlots.
Selon un mode de réalisation privilégié, le médicament est destiné à être administré au sujet diabétique avant, pendant et/ou à la suite d’une transplantation de cellules d'îlots pancréatiques. En particulier, la décorine est destinée à être administrée à un patient receveur, notamment dans le but de faciliter la prise de la greffe des cellules d'îlots pancréatiques.
Dans un mode de réalisation le patient traité par la décorine est un patient greffé avec des cellules d'îlots pancréatiques. De préférence, les cellules d'îlots pancréatiques greffées ont été traitées préalablement à la greffe avec de la décorine. En effet, les inventeurs ont clairement démontré un effet extrêmement bénéfique du traitement d'un patient greffé par la décorine, tout particulier lorsque les greffons ont été traités avec la décorine avant la greffe.
Alternativement ou parallèlement, la décorine est destinée à être administrée à un patient donneur, notamment dans le but de préserver la viabilité des îlots pancréatiques qui seront prélevés.
Acides nucléiques et Vecteurs pour l'expression de la décorine
La présente invention concerne également une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention pour son utilisation dans le traitement du diabète ou d'une complication du diabète. De préférence, la séquence d'acides nucléiques code pour la décorine telle que décrite ci-dessus ou un fragment ou un variant de celle-ci. Par exemple, une séquence codante pour la décorine est décrite dans la SEQ ID NO : 2.
L’invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement du diabète d'une complication du diabète.
De préférence, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre une séquence d'acides nucléiques conforme à l’invention, des séquences régulatrices permettant d’en contrôler la transcription et/ou la traduction. Notamment, le vecteur selon l’invention comprendra notamment des éléments de régulation de l’expression de la séquence codant pour la décorine selon l'invention, tels que des promoteurs et des séquences activatrices ("enhancers") ainsi que des séquences d’initiation et d’arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs selon l’invention pourront comprendre une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification et/ou leur expression est recherchée et/ou des marqueurs de sélection.
En particulier, les vecteurs comprenant la séquence d'acides aminés codant pour la décorine peuvent être des vecteurs viraux ou non. Les vecteurs viraux sont bien connus de l'homme du métier et peuvent comprendre par exemple des vecteurs baculoviraux, adénoviraux, parvoviraux, rétroviraux, lentiviraux ou des vecteurs dérivés de virus adéno-associés, par exemple décrits dans Giannoukakis et al., Diabètes 48:2107-2121 (1999); Efrat, Eur. J. ofEndocrinol 138:129-133 (1998); Stone et al., J. Endocinol 164:103- 118 (2000); Castro et al., Baillieres BestPrac. Res. Clin. Endocrinol Metab. 13:431-449 (1999); Becker et al., J Biol. Chem. 59:21234-21238 (1994); Csete et al., Transplantation 59:263-268 (1995); Sigalla et al., Hum. Gen. Ther. 8:1625-1634 (1997); Leibowitz et al., Diabètes 48:745-753 (1999); Guo et al., Cell Transplant 8:661-671 (1999).
Les vecteurs selon l'invention comprennent en particulier des promoteurs eucaryotes ubiquitaires, constitutifs ou inductibles, tels que des promoteurs ubiquitaires (par exemple HPRT, vimentine, a-actine, tubuline), les promoteurs des filaments intermédiaires (par exemple desmine, neurofilaments, kératine, GFAP) les promoteurs spécifiques de tissus (par exemple le promoteur du gène de l'albumine du foie) ou le promoteur précoce du Cytomégalovirus (Boshart et al., 1985, Cell 41 :521-530).
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur comprend en outre un système CRISPR-Cas, de préférence un système CRISPR-Cas9, notamment destiné à être utilisé en thérapie génique dans le traitement du diabète, en particulier pour introduire la séquence d'acide nucléique codant pour la décorine dans le génome d'une cellule cible. De préférence, le système CRISPR contient deux éléments distincts, à savoir i) une endonucléase et ii) un ARN guide.
Cellules
La séquence d'acides nucléiques ou le vecteur la comprenant peuvent être transduits dans une cellule hôte. Ainsi, un aspect de l'invention concerne une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention pour son utilisation dans le traitement du diabète ou d'une complication du diabète.
L’introduction de la séquence d'acides nucléiques ou du vecteur selon l’invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l’homme du métier tel que l'électroporation, pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. Alternativement l’introduction de la séquence d'acides nucléiques ou du vecteur selon l’invention peut être réalisée dans des cellules in vivo, en particulier chez un sujet atteint de diabète.
De préférence, la cellule hôte est une cellule eucaryote, de manière préférée une cellule humaine. Toute cellule du corps humain ou toute cellule appropriée pour une transplantation d'ilots pancréatiques peut être utilisée. De préférence, les cellules sont des cellules souches ou des cellules endocrines, en particulier des cellules d'ilots pancréatiques ou des cellules du foie, de manière préférée les cellules sont des cellules bêta et/ou alpha des îlots pancréatiques. De manière préférée, les cellules sont des cellules bêta des îlots pancréatiques. Alternativement, les cellules sont des cellules alpha des îlots pancréatiques.
Selon un aspect particulier, la cellule comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou un vecteur comprenant celle-ci est une cellule souche. Les cellules souches sont de préférence obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, en particulier des cellules souches embryonnaires (ES) ou des cellules souches pluripotentes induites (iPS ou hiPSC) par exemple obtenue par dédifférenciation.
Les cellules souches embryonnaires peuvent être obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la technique décrite par Chung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2): 113-117). Dans un mode de réalisation particulier, et pour des raisons légales ou éthiques, les cellules souches embryonnaires sont des cellules souches embryonnaires non humaines. Dans un autre mode de réalisation particulier, les cellules souches embryonnaires utilisées dans l'invention sont des cellules souches embryonnaires humaines, de préférence obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues. Les embryons utilisés sont de préférence des embryons surnuméraires obtenus dans le cadre d'un projet parental après obtention des autorisations réglementaires et éthiques conformes aux lois en vigueur.
Un avantage de l’utilisation de cellules souches par rapport à des cellules d’îlots différenciées est que les cellules souches s'adaptent particulièrement à leur environnement grâce à leur capacité à se différencier in situ.
Alternativement, la cellule comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou un vecteur comprenant celle-ci est un précurseur de cellules d’îlots pancréatiques, en particulier de cellules bêta d’îlots pancréatiques. Dans un autre mode de réalisation, cette cellule est une cellule du foie.
Dans un autre mode de réalisation, la cellule comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou un vecteur comprenant celle-ci est une cellule neuroendocrine, telles que celles que l’on trouve dans les glandes pituitaires et adrénales. En effet, ces cellules possèdent la machinerie sécrétoire nécessaire pour une sécrétion régulée d’hormones polypeptidiques.
Compositions pharmaceutiques et médicament
Selon un aspect de l'invention, la décorine, un variant ou un fragment de celle-ci, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, est comprise dans une composition pharmaceutique. Typiquement, la composition pharmaceutique comprend la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, et un support pharmaceutiquement acceptable.
La composition selon l'invention peut être une composition pharmaceutique destinée à un usage en médecine humaine ou un usage vétérinaire. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, d'une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, d'un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou d'une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, pour son utilisation dans le traitement du diabète, en particulier dans le traitement du diabète de type 1, du diabète de type 2 ou du diabète gestationnel, ainsi que dans le traitement d'au moins une complication du diabète.
Selon un aspect, l'invention concerne également l'utilisation de la décorine, d'une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, d'un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou d'une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être utilisée comme médicament, en particulier comme médicament antidiabétique ou comme médicament anti-inflammatoire.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète ou d'une complication du diabète. En particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète de type 1 ou d'une complication de celui-ci. Alternativement, l'invention concerne une composition pharmaceutique pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète de type 2 ou d'une complication de celui-ci. Selon un mode de réalisation particulier, le médicament est destiné à être administré avant, pendant et/ou à la suite d’une transplantation de cellules d'îlots pancréatiques. Alternativement, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète gestationnel ou d'une complication de celui-ci.
Selon un aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant de la décorine en tant que substance active principale, c'est-à-dire que la décorine est la substance de la composition qui a l'activité et/ou l'effet recherché. Notamment, la décorine est une substance active de la composition pharmaceutique par son activité sur les cellules des îlots pancréatiques, en particulier sur la synthèse et sécrétion d'insuline, sur la survie des cellules et/ou sur l'amélioration de la vascularisation des îlots pancréatiques.
Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique peut, en outre, contenir au moins un principe actif pharmaceutique supplémentaire ou être destinée à être utilisée en combinaison avec au moins un principe actif supplémentaire. On entend par « principe actif pharmaceutique», tout composé ou substance dont l’administration a un effet thérapeutique ou un effet bénéfique à la santé ou condition générale d’un patient ou d’un sujet auquel il est administré. Des exemples de principes actifs pharmaceutiques qui peuvent être présents dans une composition pharmaceutique de la présente invention ou utilisés en combinaison avec cette composition pharmaceutique incluent, sans limitation, des anti-inflammatoires, des agents immunosuppressifs, des agents antidiabétiques, des antibiotiques, des agents antipyrétiques, des agents antiémétiques, des agents antihistaminiques, des vitamines, des agents antispasmodiques, des agents antiulcéreux ou des combinaisons de ceux-ci. Le médicament selon l'invention peut ainsi être administré en association avec un autre médicament, tel qu’un agent anti inflammatoire, un agent immunosuppressif, un agent antibiotique, un agent antipyrétique, un agent antihistaminique, des vitamines, un agent antispasmodique ou un agent antiulcéreux.
Plus particulièrement, la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette molécule d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, ou la composition pharmaceutique le/la comprenant peut être utilisée en combinaison avec un ou plusieurs traitements ou médicaments utilisés pour le traitement du diabète, en particulier un principe actif antidiabétique. Ainsi, la composition peut comprendre en outre un principe actif antidiabétique. La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette molécule d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, et un principe actif antidiabétique. En particulier, la présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant de la décorine et un principe actif antidiabétique.
De manière alternative, la composition peut être destinée à être utilisée pour le traitement du diabète en combinaison avec un tel principe actif. La présente invention concerne donc un kit comprenant la décorine et un principe actif antidiabétique pour une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle, notamment dans le traitement du diabète.
Par exemple, le principe actif antidiabétique peut être choisi dans la liste non-exhaustive suivante : insuline, metformine, des sulfonylurées comme le tolbutamide, l'acétohexamide, le tolazamide, le chlorpropamide, le glibenclamide, le glimépiride, le glipizide, le glicazide, le glycopyramide et le gliquidone, des inhibiteurs d'alpha-glucosidase comme l'acarbose, le miglitol et le voglibose, des thiazolidinediones comme le pioglitazone et le rosiglitazone, des méglitinides comme le répaglinide et le natéglinide, un incrétino-mimétique, un analogue du glucagon-like peptide comme l'exénatide ou ses dérivés, le taspoglutide, le liraglutide, le semaglutide, un inhibiteur de la dipeptidyl peptidase-4 comme le vildagliptine, le sitagliptine, le saxagliptine, le linagliptine, l'allogliptine, et le septagliptine, un analogue de l'amyline comme le pamlintide, un inhibiteur du transporteur de sodium glucose comme l'empaglifozine, la dapaglifozine, la canamycine, ou une combinaison de ceux-ci.
En outre, la présente invention concerne également de la décorine ou une composition pharmaceutique pour une utilisation dans le traitement du diabète dans le cadre d'une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques. Ainsi, ceci concerne des sujets receveurs, c'est-à-dire greffés ou susceptibles d'être greffés avec des cellules d’îlots pancréatiques. Dans ce mode de réalisation particulier, la décorine ou la composition selon l'invention peut être combinée avec des agents conventionnels utilisés pour favoriser la prise de la greffe des cellules des îlots pancréatiques, notamment des molécules induisant une immunosuppression ou une réduction de l'inflammation.
Ces médicaments ou compositions comprennent notamment des compositions immunosuppressives et/ou des compositions anti-inflammatoires. Ces compositions comprennent en outre de la thymoglobuline pour favoriser l'induction, des anti-TNFa pour contrôler la réaction inflammatoire précoce, de la rapamune en début de greffe pour bénéficier de son rôle anti-macrophagique, des inhibiteurs des calcineurines ou des combinaisons de ceux-ci. Une combinaison particulière comprend une combinaison de thymoglobuline et de rituximab. Ces compositions peuvent également comprendre différents agents dépléteurs de lymphocyte T.
Ainsi, selon un aspect particulier, l'invention concerne de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation comme adjuvant d'une thérapie immunosuppressive ou d'un traitement anti-inflammatoire concomitant ou suivant la transplantation de cellules d'ilots pancréatique chez un patient receveur. L'utilisation de la décorine en tant qu'adjuvant permet d'augmenter la probabilité de la prise de la greffe des cellules d'ilots pancréatiques, de favoriser la vascularisation des cellules d'ilots pancréatiques et/ou de favoriser la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées.
Ainsi, la composition pharmaceutique selon l'invention est destinée à être administrée à un patient receveur, notamment dans le but de faciliter la prise de la greffe des cellules d'îlots pancréatiques, de favoriser la vascularisation des cellules d'ilots pancréatiques et/ou de favoriser la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées. En particulier, la décorine est utilisée dans le but de diminuer l'occurrence et/ou la fréquence d'apoptose chez les cellules d'ilots pancréatique qui sont destinées à être transplantées ou ont été transplantées chez le receveur.
La décorine ou la composition pharmaceutique pourra être administrée au sujet susceptible d'être greffé avec des cellules d'îlots pancréatiques avant la greffe et/ou au sujet ayant reçu une greffe de cellules d'îlots pancréatiques de manière concomitante à la greffe et/ou après la greffe.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention est relative à une méthode de traitement d'un patient ayant reçu une greffe de cellules d'îlots pancréatiques, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine, de manière à augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées et/ou d'augmenter la viabilité des cellules d'ilots pancréatiques transplantée ou d'en diminuer l'apoptose. Plus précisément, la méthode de traitement d'un sujet diabétique comprend la greffe de cellules d’îlots pancréatiques chez le patient et l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine, de manière à augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées et/ou d'augmenter la viabilité des cellules d'ilots pancréatiques transplantée ou d'en diminuer l'apoptose. Dans un mode de réalisation tout particulier, la méthode de traitement d'un sujet diabétique comprend la mise en contact des cellules d’îlots pancréatiques destinées à être greffées chez le patient avec de la décorine, la greffe des cellules d’îlots pancréatiques traités chez le patient et l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine, de manière à augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées et/ou d'augmenter la viabilité des cellules d'ilots pancréatiques transplantée ou d'en diminuer l'apoptose.
Alternativement ou parallèlement, la composition pharmaceutique est destinée à être administrée à un patient donneur, notamment dans le but de préserver la viabilité des îlots pancréatiques qui sont destinés à être prélevés, c'est-à-dire pour diminuer l'occurrence et/ou la fréquence d'apoptose chez les cellules d'ilots pancréatique qui sont prélevé chez le donneur.
Formulation de la composition pharmaceutique
La formulation d’une composition selon la présente invention peut varier en fonction de la voie d’administration et du dosage pour lesquels la composition est destinée à être utilisée. La composition selon l'invention peut notamment être sous forme solide, semi-solide ou liquide. Après formulation avec au moins un véhicule ou excipient physiologiquement acceptable, une composition selon l’invention peut être sous toute forme appropriée pour l’administration à un mammifère, en particulier l’homme, par exemple sous la forme de tablettes, comprimés, pastilles, dragées, capsules, gélules, pilules, granulats, poudre, suspensions, émulsions, sirops, onguents, ampoule de liquide, flacon muni d’un compte-goutte et autres formes analogues de préparations liquides ou en poudres destinées à être prises en unités mesurées de faible quantité, solutions injectables ou suppositoires.
L’homme de l’art sait sélectionner les véhicules et excipients les plus appropriés à la préparation d’un type donné de formulation. Ainsi, par exemple, les excipients tels que l’eau, le 2,3-butanediol, la solution de Ringer, les solutions isotoniques de chlorure de sodium, les mono ou diglycérides synthétiques, et l’acide oléique sont souvent utilisés pour la formulation de préparations injectables. Des supports appropriés peuvent également être choisis parmi le carbonate de magnésium, le stéarate de magnésium, le talc, le sucre, le lactose, la pectine, la dextrine, l’amidon, la gélatine, la gomme adragante, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique, une cire à bas point de fusion et le beurre de cacao.
Les compositions solides peuvent être formulées en présence d’un excipient inerte comme le citrate de sodium, et éventuellement d’additifs tels que par exemple des agents liants, des agents humectants, des agents de désintégration, des accélérateurs d’absorption, des agents lubrifiants, etc. D’autres formes appropriées comprennent des préparations sous forme solide qui sont destinées à être transformées peu avant leur utilisation en préparations sous forme liquide.
Le véhicule physiologiquement acceptable peut être un liquide, et la composition selon l'invention est sous la forme d’une solution. Les véhicules liquides sont utilisés dans la préparation de solutions, de solvants, de milieux de dispersion, de suspensions, d'émulsions, de sirops, d'élixirs et de compositions sous pression. Les supports liquides ou à base de gel appropriés comprennent, sans s'y limiter: l'eau et les solutions salines physiologiques; les émulsions ou les suspensions, y compris les solutions salines et les milieux tamponnés, l'urée; des alcools (par exemple, méthanol, éthanol, propanol, butanol); des glycols (par exemple, l’éthylène glycol, le propylène glycol et similaires), des solvants non aqueux comme le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales ou de graines telles que l’huile d’olive, et des esters organiques injectables tels que l’oléate d’éthyle. Généralement, les véhicules à base d’eau possèdent un pH neutre (par exemple, pH 7,0 ± 1,0 ou 0,5 unité de pH). Les compositions liquides, y compris par exemple les émulsions, microémulsions, solutions, suspensions, sirops, ou élixirs peuvent être formulés notamment en présence de solvants, d’agents solubilisants, d’émulsifiants, d’huiles, d’acides gras, et/ou d’autres additifs comme par exemple des agents de suspension, des conservateurs, des édulcorants, des arômes naturels ou synthétiques, des agents viscosifiants, des agents stabilisants et/ou épaississants et/ou des agents colorants de qualité alimentaire, qui doivent tous être compatibles avec le maintien de l'activité de la décorine.
Les émulsions peuvent être préparées dans des solutions aqueuses de propylène glycol ou peuvent contenir des agents émulsifiants tels que la lécithine, le monooléate de sorbitan ou l’acacia. Des agents épaississants bien connus peuvent également être ajoutés aux compositions telles que l’amidon de maïs, des gommes naturelles ou synthétiques, des résines, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique, la gomme de guar, la gomme de xanthane et analogues. Des conservateurs peuvent également être inclus dans la composition, y compris le méthylparabène, le propylparabène, l’alcool benzylique et les sels d’éthylène diamine tétra-acétate. Ces compositions peuvent également comprendre un plastifiant tel que le glycérol ou le polyéthylène glycol (par exemple, dans une gamme de masse moléculaire de MW = 800 à 20 000). La composition de l'excipient peut être modifiée aussi longtemps qu’elle n’interfère pas de manière significative avec l’activité pharmacologique de la décorine.
Sujet et régime d'administration
La décorine ou la composition pharmaceutique selon l’invention peuvent être employées à des fins de médecine humaine ou animale, le sujet considéré pouvant notamment être un mammifère, plus particulièrement tout sujet animal comme un animal de laboratoire (par exemple, primate non humain, rat, souris, hamster, cobaye), un animal de compagnie ou d'élevage (chiens, chats, chevaux, etc..), ou encore un humain. Le sujet peut souffrir du diabète, en particulier du diabète de type 1, du diabète de type 2 du diabète gestationnel ou être susceptible de développer un diabète. De préférence, le sujet a été diagnostiqué comme étant diabétique de type 1 ou de type 2. En particulier, le patient receveur été diagnostiqué comme étant diabétique de type 1 ou de type 2.
Alternativement, le sujet donneur des cellules d'ilots pancréatique n'est pas diabétique. De préférence, le donneur est un individu sain.
Lorsque le sujet donneur est un humain, le donneur remplit les exigences relatives au don d'organes connues de l'homme du métier. Par exemple, les caractéristiques qui permettent la proposition du pancréas pour greffe d'organe ou d'îlots par un donneur humain sont définies par un poids supérieur à 10 kg, un âge inférieur à 65 ans, l'absence d'antécédent de diabète, d'augmentation des transaminases hépatiques supérieure à 3 fois la normale et d'arrêt cardiaque.
Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent être administrées en utilisant toute combinaison de dosage et de voie d’administration efficace pour obtenir l’effet thérapeutique désiré. La quantité exacte à administrer et la fréquence d'administration dépendront notamment du type de sujet, humain ou animal, en fonction de l’âge, du poids, de la condition générale du patient ou de l'animal, de la nature et de la gravité du diabète. La voie d’administration peut être choisie en fonction de la nature et de la gravité du diabète et/ou en fonction de l’âge et/ou de la santé du patient.
La composition selon l'invention peut être administrée de manière systémique, par voie orale, par inhalation ou par injection, par exemple par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, transdermique, intra-artérielle.
La composition selon l'invention peut être administrée en une ou plusieurs fois, c'est-à-dire sous la forme d'une dose unique ou de doses multiples. En particulier, la composition selon l'invention peut être administrée sous la forme de plusieurs doses.
Dans un mode de réalisation, la composition selon l'invention peut être administrée de manière chronique. De préférence, l’administration de la décorine, du médicament ou de la composition comprenant la décorine est à intervalles réguliers. De préférence, la composition est administrée au sujet à une fréquence comprise entre une dose par jour et une dose par semaine, en particulier une dose tous les 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 jours. Alternativement, la fréquence d'administration peut être de plusieurs doses par jour, par exemple 2, 3, 4 ou 5 doses par jour. Selon l'âge du sujet ou son état physiologique, les doses journalières peuvent être fractionnées pour faciliter l'administration, par exemple avec une administration le matin et une autre le soir. Traitement du diabète
La présente invention est relative à une méthode de traitement du diabète comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine ou d'une composition pharmaceutique comprenant de la décorine selon la présente invention, une séquence d'acides nucléiques codant pour celle-ci, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant ladite séquence d'acides nucléiques ou ledit vecteur, à un sujet diabétique ou susceptible de développer un diabète.
En particulier, la présente invention concerne une méthode de traitement du diabète comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention et la transplantation de cellules d'ilots de Langerhans à un sujet diabétique. Les cellules de cellules d'ilots de Langerhans sont transplantées en utilisant la procédure habituelle dans le domaine. Notamment, elles sont transplantées dans le foie du patient receveur, où elles vont s'implanter par voie intraportale.
Les méthodes de traitement selon l'invention impliquent généralement l’administration à un individu qui en a besoin d’une quantité efficace de décorine, d’une formulation ou composition pharmaceutique selon l'invention, soit afin de limiter ou retarder le diabète et ses symptômes et/ou de limiter ou retarder l'apparition des complications du diabète, soit pour réduire l'inflammation, soit pour favoriser la prise de la greffe d'ilots pancréatiques.
Les méthodes de traitement du diabète comprennent des méthodes de traitement d’individus chez lesquels on a diagnostiqué un diabète, des méthodes de réduction du risque de complications du diabète chez un individu chez qui on a diagnostiqué du diabète et qui ont été soignés par des traitements conventionnels, en particulier des individus ayant subi ou étant susceptibles de subir une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques.
En particulier, la quantité thérapeutiquement efficace ou suffisante de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention, est une quantité permettant d'obtenir l'effet recherché, à savoir un effet favorisant l'augmentation de la sécrétion d'insuline par des îlots pancréatiques et/ou un effet diminuant l'inflammation et/ou un effet favorisant la viabilité des cellules des îlots pancréatiques, en particulier celle des îlots pancréatiques transplantés et/ou leur vascularisation.
Notamment, la quantité thérapeutiquement efficace ou suffisante de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention, peut être une quantité permettant d'augmenter la durée d'insulino- indépendance d'un patient diabétique, en particulier celle d'un patient receveur ayant subi une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques. De préférence, la quantité thérapeutiquement efficace ou suffisante de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention, est une quantité permettant de retarder l'apparition de complications du diabète chez un patient diabétique, en particulier celle d'un patient receveur ayant subi une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques.
Dans une méthode de traitement du diabète, une "quantité thérapeutiquement efficace" de décorine ou d'une composition selon l'invention est une quantité qui réduit la sévérité d’un symptôme et/ou réduit un paramètre mesurable associé au diabète d’au moins environ 10%, au moins environ 20%, au moins environ 25%, au moins environ 30%, au moins environ 40%, au moins environ 50%, au moins environ 60%, au moins environ 70%, au moins environ 80%, ou au moins environ 90% ou plus, en comparaison avec le symptôme (par exemple, la sévérité du symptôme), ou en comparaison avec le paramètre mesurable associé au diabète, en l’absence de traitement du sujet. De préférence, le paramètre mesurable est la glycémie.
Dans une autre méthode de traitement du diabète, une "quantité thérapeutiquement efficace" de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention est une quantité qui réduit l'inflammation d’au moins environ 10%, au moins environ 20%, au moins environ 25%, au moins environ 30%, au moins environ 40%, au moins environ 50%, au moins environ 60%, au moins environ 70%, au moins environ 80%, ou au moins environ 90% ou plus, en comparaison avec le symptôme (par exemple, la sévérité du symptôme), ou en comparaison avec la condition inflammatoire d'un patient diabétique n'ayant pas été traité avec de la décorine ou par une composition pharmaceutique la comprenant.
Dans une autre méthode de traitement du diabète, une "quantité thérapeutiquement efficace" de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention est une quantité qui augmente la viabilité des cellules des îlots pancréatiques d’au moins environ 10%, au moins environ 20%, au moins environ 25%, au moins environ 30%, au moins environ 40%, au moins environ 50%, au moins environ 60%, au moins environ 70%, au moins environ 80%, ou au moins environ 90% ou plus, en comparaison avec la viabilité des cellules des îlots pancréatiques en l’absence de traitement du sujet par de la décorine ou par une composition pharmaceutique selon l'invention.
Dans une autre méthode de traitement du diabète, une "quantité thérapeutiquement efficace" de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention est une quantité qui augmente la vascularisation des cellules des îlots pancréatiques d’au moins environ 10%, au moins environ 20%, au moins environ 25%, au moins environ 30%, au moins environ 40%, au moins environ 50%, au moins environ 60%, au moins environ 70%, au moins environ 80%, ou au moins environ 90% ou plus, en comparaison avec la vascularisation des cellules des îlots pancréatiques en l'absence de traitement du sujet par de la décorine ou par une composition pharmaceutique selon l'invention. La présente invention peut être utilisée dans des circonstances où l'on souhaite améliorer la viabilité des cellules des îlots pancréatiques indépendamment de la condition diabétique sous-jacente. Un avantage de la présente invention est qu'elle peut être utilisée pour favoriser la viabilité et/ou la vascularisation des cellules d'ilots pancréatique, par administration de la décorine, d’une composition pharmaceutique ou d’un médicament comprenant la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant ladite séquence d'acides nucléiques ou ledit vecteur, avant, pendant et/ou après la transplantation des cellules d'ilots pancréatique.
Selon un aspect, l'invention concerne une méthode pour augmenter la qualité et/ou la durée de survie de cellules d’îlots pancréatiques, comprenant l’administration à un sujet donneur et/ou receveur d’une composition pharmaceutique selon l'invention, de telle sorte que la qualité et/ou la durée de survie du greffon soit augmentée. De préférence, le greffon correspond aux cellules d'ilots pancréatiques avant et/ou après purification.
Ainsi, l'invention concerne également l'utilisation de la décorine pour favoriser la revascularisation des îlots pancréatiques après transplantation chez un patient receveur.
Particulièrement, la présente invention concerne la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant ladite séquence d'acides nucléiques ou ledit vecteur, pour la préparation d'un médicament ou d'une composition destinée au traitement du diabète, notamment dans le cadre d'une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques chez l'homme. Elle concerne également une méthode permettant de favoriser la prise de la greffe des cellules d'ilots pancréatiques chez un patient, la méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de la décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention et la transplantation des cellules d'ilots pancréatiques.
Dans un mode de réalisation, le patient donneur est traité par de la décorine, une composition pharmaceutique ou un médicament comprenant la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, avant le prélèvement des îlots pancréatiques.
Dans un mode de réalisation, le patient receveur est traité par de la décorine, une composition pharmaceutique ou un médicament comprenant la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant ladite séquence d'acides nucléiques ou ledit vecteur, avant, pendant et/ou après la transplantation des îlots pancréatiques. L'administration de décorine ou d'une composition selon l'invention au patient receveur peut ainsi avoir lieu avant, pendant et/ou après que le patient receveur ait subi la transplantation des cellules des îlots pancréatiques. Ainsi, selon un aspect particulier, le patient receveur peut se voir administrer de la décorine ou une composition pharmaceutique selon l'invention en combinaison avec des cellules d'ilots pancréatiques. De préférence, ces cellules d'ilots pancréatiques proviennent d'un individu donneur ayant été traité avec de la décorine, une composition pharmaceutique ou un médicament comprenant la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine ou un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, avant le prélèvement des îlots pancréatiques. Alternativement ou additionnement, les cellules d'ilots pancréatiques peuvent avoir été cultivées dans un milieu comprenant de la décorine avant leur transplantation chez le patient receveur.
L'invention concerne également l'administration ou la transplantation de cellules d'ilots pancréatiques ayant été mis en contact avec de la décorine ou avec une composition comprenant de la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine ou un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, chez un patient receveur, de préférence un patient souffrant de diabète, en particulier un diabète de type 1.
L’invention concerne également des procédés de thérapie génique destinés au traitement du diabète, permettant l'introduction d'une séquence d’acides nucléiques codant pour de la décorine selon la présente invention, afin d'induire la sécrétion de la décorine dans la circulation sanguine et/ou au niveau d'un tissus ou d'un organe, de préférence le pancréas et/ou le foie.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (par exemple une mutation, expression aberrante) ou à assurer l’expression d’une protéine d’intérêt par introduction de sa séquence en acides nucléiques dans la cellule ou l’organe affecté. Cette séquence en acides nucléiques peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite d'un individu, la cellule étant alors introduite dans l'organe ou le tissu cible de l'individu après sa transformation, soit directement in vivo dans les cellules du tissu ou l'organe approprié.
En particulier, des cellules sont issues d’un sujet diabétique ou d'un sujet donneur et soumises à une manipulation génétique pour y transférer une séquence codant pour la décorine ou pour un variant de celle-ci ou un vecteur comprenant cette séquence. De préférence, ces cellules sont des cellules eucaryotes, en particulier des cellules humaines choisies parmi des cellules souches, des cellules endocrines, des cellules d'ilots pancréatiques ou des cellules du foie. De manière préférée, les cellules sont des cellules d'ilots pancréatiques, en particulier des cellules bêta.
Ainsi, selon un aspect particulier, l'invention concerne une thérapie génique de cellules d'ilots pancréatiques ex vivo. Dans ce contexte, le transfert dans les cellules de la séquence nucléique codant pour la décorine ou du vecteur la comprenant, peut être réalisée par électroporation, par biolistique ou par liposomes, ces méthodes pouvant être optimisées pour la transfection de cellules d'ilots pancréatiques (Levine et al., Diabètes Metab. Rev. 13:209-246 (1997)). Dans un mode de réalisation particulier, le système CRISPR /Cas peut être utilisé pour modifier les cellules cibles. Le transfert dans les cellules peut également être réalisé avec des vecteurs viraux, de préférence des vecteurs ayant un tropisme pour les cellules cibles, par exemple celles des îlots pancréatiques ou des cellules hépatiques.
Selon un aspect particulier, l'invention concerne une méthode de traitement du diabète chez un sujet diabétique comprenant les étapes consistant à : a) fournir une ou plusieurs cellules d'ilots pancréatiques, de préférence des cellules d'ilots pancréatiques purifiées, b) l'introduction dans les cellules d'une séquence d’acide nucléique codant pour la décorine ou d'un vecteur comprenant ladite séquence, c) la transplantation des cellules modifiées de l'étape b) chez le sujet diabétique receveur en quantités suffisantes pour favoriser la survie des cellules d'ilots pancréatiques greffés, pour favoriser la production d'insuline par ces cellules et/ou traiter le diabète chez l’individu.
En particulier, les cellules d'ilots pancréatiques peuvent être issues d'un patient donneur ou du patient receveur lui-même. Ainsi, les cellules d'ilots pancréatiques transformées comprenant une séquence d'acides nucléique codant pour la décorine ou un variant de celle-ci peuvent provenir de différents patients ou d'un même patient.
De préférence, l’augmentation de la survie des cellules transformées avec la séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine ou un variant de celle-ci qui sont transplantées chez le receveur est d’au moins 20 %, 50 % ou 75 %, par rapport à des cellules n'ayant pas été transformées avec une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine. Des comparaisons dans le taux de survie de cellules peuvent être effectuées à tout moment après une transplantation, par exemple, une semaine, un mois, trois mois, six mois, un an, cinq ans, etc.
Dans certains modes de réalisation, les cellules transformées avec la séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine ou un variant de celle-ci favorisent la production d’insuline en quantités suffisantes pour traiter le diabète chez le receveur pendant plus d’une semaine, de préférence trois mois, de manière plus souhaitable un an; et idéalement pour la vie entière du sujet receveur de ces cellules.
Les diabètes et les complications ciblées par l'invention
Le diabète se caractérise par un taux de sucre dans le sang à jeun supérieur ou égal à 1,26 g/l, vérifié à deux reprises. Il existe plusieurs tests pour détecter ou surveiller un diabète. Le diagnostic du diabète est basé sur la clinique, la présence d'une hyperglycémie, et l'interrogatoire du patient. L'examen de référence pratiqué en laboratoire d'analyses médicales est une prise de sang mesurant la glycémie ou le taux de sucre sanguin, qui varie selon les apports alimentaires. L'examen de la glycosurie, qui consiste à rechercher l'albumine et le sucre dans les urines, est également utile pour détecter un diabète.
Le diabète de type 1 survient chez des patients jeunes et sans surpoids. La présence d'un autre cas de diabète de type 1 dans la famille (dans 1 cas sur 10) ou d'une autre maladie auto-immune associée (dans 1 cas sur 10) renforce le diagnostic. Le diabète de type 1 est généralement accompagné d'un syndrome cardinal et d'une cétonurie.
Le diabète de type 2 survient chez des patients généralement de plus de 40 ans, en surpoids à prédominance abdominal. La présence d'antécédents familiaux de diabète de type 2, l'existence d'une HTA, d'une hypertriglycéridémie, d'une hypertension artérielle et d'une hypo HDL-cholestérolémie sont fréquemment associés à l'hyperglycémie dans le diabète de type 2 et renforcent le diagnostic.
Le diabète gestationnel survient chez des femmes enceintes. La grossesse est par nature diabétogène car il existe physiologiquement pendant cette période un état d'insulinorésistance qui peut s'aggraver progressivement au cours de la grossesse. Le diabète gestationnel peut être asymptomatique ou présenter des symptômes similaires à ceux des autres types de diabète. Un premier test de glycémie à jeun au premier trimestre de la grosses est recommandé pour détecter un diabète antérieur à la grossesse qui est passé inaperçu. Un second test appelé HGPO (Hyperglycémie provoquée par voir orale) est réalisé entre la 24e et la 28e semaine d'aménorrhée à 75g de glucose. Une valeur de glycémie supérieure aux seuils définis (0,92g/L à jeun ; ou l,80g/L lh après la charge orale en glucose ; ou l,53g/L 2h après) suffit à diagnostiquer un diabète gestationnel. Dans ce cas, le diabète gestationnel doit être surveillé et traité car il comporte un risque pour la mère (accouchement prématuré, risque de développer un diabète de type II post accouchement) comme pour l'enfant (détresse respiratoire, hypoglycémie néonatale, risque de développer un diabète de type II).
L'invention concerne également de la décorine ou une composition pharmaceutique selon l'invention pour une utilisation en vue de prévenir et/ou retarder l’apparition et/ou limiter la progression d’au moins une des complications du diabète. Les complications concernent notamment les complications aigues telles que l'acidocétose diabétique, le coma hyperosmolaire, l'hypoglycémie sévère, la rétinopathie, la néphropathie, l'insuffisance rénale, les maladies cardiovasculaires, en particulier la coronaropathie, l'artériopathie oblitérante des membres inférieurs, les AVC/AIT ou autres atteintes vasculaires artérielles périphériques en lien avec l'athérosclérose, les infections de la bouches, les ulcères du pied, les infections ou le mal perforant plantaire. L'invention concerne également de la décorine ou une composition comprenant de la décorine pour une utilisation en vue d'améliorer les facteurs d'aggravation du diabète ou les comorbidités associées, notamment l'hypertension, la résistance à l'insuline, l'obésité, le surpoids, l'hyperlipidémie ou la dépression.
De préférence, l'invention concerne également de la décorine ou une composition pharmaceutique selon l'invention pour une utilisation dans le traitement d'une complication du diabète choisie dans le groupe constitué par l'acidocétose diabétique, le coma hyperosmolaire, l'hypoglycémie sévère, la néphropathie, l'insuffisance rénale, les maladies cardiovasculaires, en particulier la coronaropathie, l'artériopathie oblitérante des membres inférieurs, les AVC/AIT ou autres atteintes vasculaires artérielles périphériques en lien avec l'athérosclérose, les infections de la bouches, les ulcères du pied, les infections ou le mal perforant plantaire. L'invention concerne également de la décorine ou une composition comprenant de la décorine pour une utilisation en vue d'améliorer les facteurs d'aggravation du diabète ou les comorbidités associées, notamment l'hypertension, la résistance à l'insuline, l'obésité, le surpoids, l'hyperlipidémie ou la dépression.
L'invention concerne également de la décorine ou une composition comprenant de la décorine pour une utilisation en vue d'améliorer l'équilibre glycémique global, notamment la diminution des hypoglycémies et des hyperglycémies, l'amélioration de l'HbAlc et des autres paramètres d'évaluation de l'équilibre glycémique (TIR par exemple).
Préservation des îlots pancréatiques
L'invention concerne également la préparation et l'utilisation d'un milieu de culture, de préservation ou de transformation des cellules d'ilots pancréatiques, le milieu comprenant de la décorine. La décorine est présente dans ce milieu en tant que substance active, c'est-à-dire ayant un effet sur les cellules d'ilots pancréatiques, notamment sur leur survie, qualité et leur capacité à sécréter de l'insuline, et/ou ayant un effet sur la diminution de l'inflammation.
L’isolation et la purification d’îlots pancréatiques humains nécessitent un processus en plusieurs étapes de 5 à 7 h pour extraire et purifier la fraction d’îlots pancréatiques qui sera transplantée au patient receveur. Une digestion enzymatique, un cisaillement mécanique doux, une purification et une culture contrôlés sont l'approche établie pour la préparation d'un produit final enrichi en cellules d'îlots.
La préparation finale des îlots avant leur implantation consiste en leur incubation dans un milieu de culture pendant 24 à 72 heures, afin de permettre le contrôle de la qualité de l’évaluation de la libération du produit, ainsi que le lancement du traitement immunosuppresseur chez le receveur avant la greffe. Cette période de culture d'îlots permet de minimiser le nombre de cellules mortes ou apoptotiques et de leurs sous-produits, qui une fois transplantés pourraient déclencher et/ou augmenter l'inflammation, exposant les îlots nouvellement transplantés à des cytokines nocives.
La capacité de la décorine de préserver la viabilité des cellules d'îlots pancréatiques en culture permet de les expédier vers des centres de transplantation cliniques distants et permet également de concentrer les compétences en matière d'isolation et de purification des îlots dans les installations régionales de traitement des cellules humaines, réduisant ainsi les coûts associés au traitement des pancréas et du repiquage de cellules d'îlots.
Ainsi, selon un aspect particulier, l'invention concerne un milieu de culture, de préservation ou de transformation des cellules d'ilots pancréatiques comprenant ou consistant essentiellement en de la décorine, l'utilisation de la décorine pour préparer des cellules d'ilots pancréatiques destinées à être transplantées chez un patient diabétique, une méthode de préparation de cellules d'ilots pancréatiques destinées à être transplantées chez un patient diabétique ainsi qu'un greffon comprenant des cellules d'ilots pancréatiques préparé par cette méthode ou comprenant de la décorine. En particulier, le milieu de culture, de préservation ou de transformation des cellules d'ilots pancréatiques ne comprend pas de collagène.
La méthode de préparation de cellules d'ilots pancréatiques destinées à être transplantées chez un patient diabétique comprenant la mise en contact ex vivo de cellules d'ilots pancréatiques avec le milieu ou la composition comprenant de la décorine. Ainsi, la méthode comprend les étapes de fournir des cellules des îlots pancréatiques et de mettre en contact lesdites cellules avec de la décorine. Dans un premier aspect, les cellules des îlots pancréatiques ont été obtenues par prélèvement chez le sujet donneur. Les cellules peuvent être mises en contact avec la décorine directement après leur prélèvement du donneur, une fois purifiées, ou à la fois au moment du prélèvement et de la purification des cellules. Dans un autre aspect, les cellules des îlots pancréatiques ont été préparées à partir de cellules souches, notamment en induisant leur différentiation en cellules des îlots pancréatiques.
Selon un aspect, l'invention concerne un procédé pour maintenir ou augmenter la viabilité de cellules d’îlots pancréatiques ex vivo, comprenant une étape consistant à mettre en présence des cellules d’îlots pancréatiques avec de la décorine en tant que substance active.
L'invention concerne également l'utilisation de la décorine pour préserver ou augmenter la viabilité des cellules d’îlots pancréatiques ex vivo.
En particulier, l'invention concerne un procédé ex vivo de préparation de cellules d'ilots pancréatiques destinées à être transplantées chez un patient diabétique, ledit procédé comprenant :
- la fourniture de cellules d'ilots pancréatiques,
- facultativement, la mise en contact des cellules d'ilots pancréatiques avec de la décorine,
- la purification des cellules d'ilots pancréatiques, éventuellement en présence de décorine ; et
- la culture des cellules d'ilots pancréatiques, de préférence dans un milieu comprenant de la décorine, le procédé comprenant au moins une étape qui est réalisée en présence de décorine.
Dans un mode de réalisation particulier, toutes les étapes sont réalisées en présence de décorine. Notamment, la décorine est utilisée en prétraitement chez le sujet donneur, au court du prélèvement d'ilots chez le donneur, en culture d'ilots pancréatiques in vitro avant la transplantation, en prétraitement chez le sujet receveur, en traitement post-greffe chez le receveur et/ou tout a long de la vie de la greffe chez le sujet receveur. Par ailleurs, l'invention concerne une composition ou un greffon comprenant de la décorine et des cellules d'ilots pancréatiques. Les cellules d'ilots pancréatiques peuvent avoir été préparées par la méthode ci- dessus détaillée ou avoir été préparées par la méthode actuellement classiquement mise en oeuvre pour la préparation de greffon de cellules d'ilots pancréatiques. Optionnellement, ces cellules peuvent avoir été transformées avec une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou avec un vecteur comprenant cette séquence, en particulier après leur purification selon la méthode décrite ci-dessus.
Ainsi l'invention concerne également un procédé de traitement du diabète chez un sujet diabétique, ledit procédé comprenant la transplantation d'une composition comprenant des cellules d’îlots pancréatiques purifiées et un milieu comprenant de la décorine chez un sujet receveur, de préférence un sujet receveur diabétique.
En particulier, l'invention concerne également un procédé de traitement du diabète chez un sujet diabétique, ledit procédé comprenant :
- le prélèvement d'ilots pancréatiques chez un patient donneur,
- facultativement, la mise en contact des îlots pancréatiques prélevés avec de la décorine,
- la purification des cellules d'ilots pancréatiques, éventuellement en présence de décorine ;
- facultativement, la transformation des cellules d'ilots pancréatiques avec une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou avec un vecteur comprenant cette séquence,
- la culture des cellules d'ilots pancréatiques, de préférence dans un milieu comprenant de la décorine, et
- la transplantation chez un sujet receveur de la composition comprenant des cellules d’îlots pancréatiques purifiées et facultativement de la décorine,
le procédé comprenant au moins une étape réalisée en présence de décorine.
Dans un mode de réalisation particulier, toutes les étapes sont réalisées en présence de décorine. Notamment, la décorine est utilisée en prétraitement chez le sujet donneur, au court du prélèvement d'ilots chez le donneur, en culture d'ilots pancréatiques in vitro avant la transplantation, en prétraitement chez le sujet receveur, en traitement post-greffe chez le receveur et/ou tout a long de la vie de la greffe chez le sujet receveur.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour favoriser la production d’insuline chez un sujet diabétique, ledit procédé comprenant la transplantation d'une composition ou un greffon comprenant des cellules d’îlots pancréatiques et de la décorine.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour augmenter la durée d'insulino- indépendance d'un patient, pour diminuer les risques d'hypoglycémie ou d'hyperglycémie, et/ou pour augmenter la stabilisation de la glycémie, ladite méthode comprenant la transplantation d'une composition ou un greffon comprenant des cellules d'ilots pancréatiques et de la décorine. L'invention concerne de la décorine pour son utilisation pour préserver, augmenter et/ou maintenir la viabilité des cellules des îlots pancréatiques et/ou augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules des îlots pancréatiques et/ou diminuer l'inflammation. En particulier, les cellules des îlots pancréatiques sont présentes dans un greffon ou dans une composition destinée à être transplantée. La décorine est en particulier pour agir sur les cellules des îlots pancréatiques entre le moment du prélèvement des îlots chez le patient donneur et leur transplantation chez le patient receveur. Plus spécifiquement, elle peut être utilisée pour agir sur les cellules des îlots pancréatiques entre le moment du prélèvement des îlots chez le patient donneur et le moment de la purification des îlots, et/ou entre le moment de la purification des cellules des îlots pancréatiques et le moment de leur transplantation chez un patient receveur.
EXEMPLES
Les figures et exemples suivants sont présentés de manière à fournir à l’homme du métier une divulgation et une description complètes de la manière de réaliser et d’utiliser la présente invention. Ils et ne sont pas destinés à limiter la portée de ce que les inventeurs considèrent comme leur invention et ne représente pas forcément toutes les expériences effectuées. Bien que la présente invention ait été décrite en se référant à ses modes de réalisation spécifiques, l’homme du métier comprendra que divers changements peuvent être apportés et que des équivalents peuvent être substitués sans s'écarter de l'esprit et de la portée véritables de l'invention. De nombreuses modifications peuvent être apportées pour adapter une situation, une composition, une méthode, une ou plusieurs étapes d'une méthode, à l’objectif, à l’esprit et au cadre de la présente invention. Toutes ces modifications éventuelles entrent dans le cadre des revendications annexées.
Dans le cadre de l'invention, une étude protéomique a permis d'identifier les facteurs/myokines sécrétés par le muscle. Cette étude a permis d'étudier les mécanismes moléculaires précis à l'origine des effets induits par certaines myokines en situation « contrôle » et après induction de l'insulinorésistance voire du diabète chez l'animal. Cette étude protéomique a révélé une myokine qui a attiré toute l'attention des inventeurs : la décorine.
1.1. Effets de la décorine sur l'apoptose et la prolifération des cellules des îlots pancréatiques
Dans un premier temps, les effets de la décorine sur la survie des îlots pancréatiques ont été évalués, en particulier en lien avec l'apoptose. Pour déterminer l'effet de la décorine sur l'apoptose des cellules, la méthode TUNEL a été utilisée. Cette méthode permet de marquer de manière fluorescente les cellules dont l'ADN est fragmenté et qui sont donc en apoptose. Le noyau des cellules a également été marqué avec du DAPI, environ 1000 cellules ont été comptées pour chaque échantillon. Les îlots sont cultivés en absence ou présence de décorine pendant 24 heures, puis des coupes histologiques et un marquage TUNEL sont réalisés. Le taux d'apoptose des cellules non-traitées est de 14,51 ± 4,46% alors que celui des cellules traitées avec la décorine est de seulement 4,51 ± 1,14% (n=6, * p<0,05, figure 1). L'analyse de ce marquage montre que la décorine permet de diminuer significativement l'apoptose. Un traitement avec la décorine pendant 24h permet donc une meilleure survie des îlots pancréatiques.
Dans un second temps, l'effet de la décorine sur la prolifération des cellules des îlots pancréatiques a été évalué. S'intéresser à la prolifération permet de savoir si la décorine entraîne ou non la division incontrôlée des cellules, pouvant notamment mener au développement de tumeurs. Un marquage du KI67 est réalisé sur des coupes histologiques d'îlots. Cette protéine est uniquement synthétisée lors de la division des cellules. Ainsi, si les cellules sont marquées positivement pour cette protéine alors elles sont en division. La décorine n'a pas d'impact sur la prolifération des cellules de l'îlot.
1.2. Effets de la décorine sur la fonctionnalité des îlots pancréatiques
Des îlots pancréatiques de Rat sont cultivés dans des milieux plus ou moins riches en glucose (2,8 ou 16,7 mM glucose). La quantité d'insuline ou de glucagon libérée dans le milieu est ensuite déterminée par la méthode ELISA.
L'impact d'un traitement avec la décorine sur la sécrétion de l'insuline par les îlots pancréatiques a été évalué. L'insuline a pour rôle de favoriser le stockage du glucose dans les organes de réserve du corps lorsque la glycémie est élevée. Les résultats montrent que la quantité d'insuline libérée dans le milieu de culture avec 2,8 mM glucose est bien plus faible que lorsque le milieu est riche en sucre avec 16,7 mM de glucose (n=10, * p<0,05 et *** p<0,001, figure 2 et 3), et ce, pour les deux conditions.
Le test de fonctionnalité montre une amélioration de la sécrétion d'insuline en présence de la décorine par rapport à la condition contrôle (CTL). L'analyse statistique montre que la différence entre 2,8 mM et 16,7 mM glucose est d'une probabilité p<0,05 (*, n=10) pour la condition CTL et d'une probabilité p<0,001 (***, n=10) pour la condition décorine. Cette différence de puissance statistique traduit une meilleure gestion de la sécrétion d'insuline lorsque les îlots sont en présence de la décorine pendant 24h. Parallèlement, la quantité totale d'insuline produite lors du test de fonctionnalité est aussi étudiée (n=10, figure 2 et 3). La quantité d'insuline totale produite par les îlots semble plus importante après traitement avec la décorine.
L'impact d'un traitement avec la décorine sur la sécrétion du glucagon par les îlots pancréatiques a ensuite été évalué.
Le glucagon, à l'inverse de l'insuline, a pour rôle de favoriser la libération du glucose des tissus de stockage vers le sang lorsque la glycémie est faible. Il est donc logique d'avoir une quantité de glucagon libérée dans le milieu de culture avec 2,8 mM de glucose plus élevée que lorsque le milieu est riche en sucre avec 16,7 mM de glucose (n=12, NS : non-significatif et ** p<0,01, figure 2 et 3). Le test de fonctionnalité semble montrer une diminution de la sécrétion de glucagon pour les conditions 2,8 mM glucose et 16,7 mM glucose après traitement pendant 24h avec la décorine.
Parallèlement, la quantité totale de glucagon produite lors du test de fonctionnalité est aussi étudiée (n=12, figure 2). Le test statistique confirme que la décorine ne modifie pas la quantité de glucagon synthétisée par les îlots pancréatiques.
1.3. Effets de la décorine sur les voies de signalisation de la survie et de la fonction des îlots pancréatiques
Une approche mécanistique par Western Blot permet de comprendre les résultats obtenus pour l'étude de l'apoptose et le test de fonctionnalité. Pour cela, l'expression des protéines de la voie de signalisation IGF-1R / 1RS / Akt a été étudiée.
Le récepteur membranaire Insulin-like Growth Factor 1 Receptor (ou IGF-1R) est un des récepteurs sur lesquels l'insuline peut se fixer et provoquer son activation. IGF-1R acquière alors un groupement phosphate et devient phospho-IGF-lR (p-IGF-lR). Il en résulte alors l'activation des voies de signalisation liées à ce récepteur (Hakuno F., Takahashi S-L, 2018).
Après traitement avec ou sans décorine, le contenu total en protéines est récupéré après la lyse des cellules des îlots pancréatiques.
En condition décorine l'expression d'IGF-lR est de 98 ± 13% par rapport au CTL (n=6, figure 4). Parallèlement, l'étude de la forme phosphorylée de cette protéine (p-IGF-lR) montre une modification de son expression protéique : 144 ± 17% par rapport au CTL (n=6, *p<0,05, figure 4). Le rapport de p-IGF- 1R sur IGF-1R montre une augmentation de l'activation d'IGF-lR par la décorine : 156 ± 22% par rapport au CTL (n=6, ** p<0,01, figure 5).
Pour expliquer cette augmentation de l'activation, deux hypothèses se dégagent. La première est que la décorine se fixe directement sur IGF-1R et provoque son activation. La seconde hypothèse est que l'augmentation de la sécrétion de l'insuline par la décorine provoque la fixation de cette hormone sur son récepteur IGF-1R et augmente ainsi son activation. Dans les deux cas, une activation accrue d'IGF-lR est bénéfique pour les cellules des îlots pancréatiques, puisqu'elle permet de déclencher des voies de signalisation de survie cellulaire, de sécrétion d'insuline mais également d'angiogenèse. La première étape de cette voie de signalisation est l'activation des substrats d'IGF-lR : IRS-1 et IRS-2.
Les Insulin Receptor Substrate 1 et 2 (IRS-1 et IRS-2) sont des protéines inactives liées à la partie intra- membranaire du récepteur IGF-1R. Lorsque l'insuline ou la décorine (selon les hypothèses ci-dessus) se fixe sur ce récepteur, le groupement phosphate du récepteur est transmis aux protéines 1RS 1 et 2 (devenant p-IRS-1 et p-IRS2, protéines actives). Elles vont alors déclencher réactions cellulaires, provoquant l'entrée du glucose dans la cellule, la survie et la croissance cellulaire. Après 24h de culture avec la décorine, l'analyse d'IRS-l par Western Blot montre une expression protéique de 109 ± 13% par rapport au CTL (n=6, figure 6). Parallèlement, la forme active d'IRS-l et p-IRS- 1 a été étudiée. La décorine permet d'améliorer l'activation de cette protéine : 144 ± 13% par rapport au CTL (n=7, * p<0,05, figure 6). Le rapport de p-IRS-1 sur IRS-1 montre une amélioration de l'activation d'IRS- 1 par la décorine : 162 ± 29% par rapport au CTL (n=6, * p<0,05, figure 7).
Pour IRS-2, on ne constate pas de différence significative entre les deux conditions, l'expression protéique de IRS-2 après traitement avec la décorine est de 136 ± 34% par rapport au CTL (n=12, figure 8). En revanche, l'expression de la forme active d'IRS-2, p-IRS-2, est augmentée de manière significative grâce à la décorine : 142 ± 12% par rapport au CTL (n=7, ** p<0,01, figure 8). Le rapport de la forme active (p-IRS- 2) sur la forme totale (IRS-2) montre que la décorine semble augmenter l'activation d'IRS-2 : 169 ± 29% par rapport au CTL (n=7, figure 9).
Sur des îlots humains, l'expression et l'activation d'IRS 1 et 2 ont été étudiées avec trois répétitions. De la même manière que chez le Rat, l'expression protéique des formes inactives IRS-1 et IRS-2 n'est pas modifiée. En revanche, l'expression de p-IRS-1 et p-IRS-2 est augmentée grâce à la décorine.
Lorsqu'IRS-l et 2 sont activés, plusieurs voies de signalisation intracellulaires sont enclenchées,
La voie MAPK/ERK : la transcription de gènes de croissance, prolifération et survie cellulaire est activée,
La voie PI3K/AKT : la transcription de gènes de survie cellulaire et de synthèse de protéine.
Les mécanismes de synthèse et de sécrétion d'insuline sont également activés. Cette voie de signalisation est intéressante, puisque la protéine Akt est impliquée dans la régulation d'un grand nombre de protéines de survie comme FoxOl et NF-kB p65. Akt est rendue active lorsqu'elle reçoit un groupement phosphate après l'activation de IRS-1 ou I RS-2, elle devient alors phospho-Akt (p-Akt). p-Akt peut alors à son tour activer différentes voies de signalisation de la survie cellulaire et inhiber les mécanismes de l'apoptose.
Akt est exprimé de manière identique dans les deux conditions : 100 ± 8% par rapport au CTL (n=12, figure 10). La décorine n'a donc pas d'effet sur la synthèse protéique d'Akt. En revanche, l'activation de Akt est modifiée : 181 ± 41% par rapport au CTL (n=12, figure 10). Le rapport p-Akt sur Akt montre une différence significative entre les deux conditions : 209 ± 49% par rapport au CTL (n=12, *** p<0,001, figure 11). On peut donc conclure que la décorine permet une activation plus importante d'Akt.
Lorsqu'Akt est activée, cette protéine peut réguler l'activité d'un grand nombre de protéines, parmi elles, FoxOl. FoxOl est un facteur de transcription qui régule des gènes impliqués dans l'apoptose. Cette protéine est phosphorylée par p-Akt, ce qui va provoquer son exclusion du noyau, bloquant ainsi la transcription des gènes de l'apoptose (Oellerich M. F., Potente M., 2012).
L'analyse de FoxOl a montré une diminution significative de l'expression de cette protéine après 24h de traitement à la décorine : 67 ± 6% par rapport au CTL (n=7, ** p<0,01, figure 12). Parallèlement, la forme inactive de FoxOl (p-FoxOl) a été étudiée. L'expression de la forme inactive est identique dans les deux conditions : 104 ± 5% par rapport au CTL (n=7, figure 12). Le rapport de la forme inactive sur la forme active montre une inactivation significative grâce à la décorine : 163 ± 18% par rapport au CTL (n=7, ** p<0,01, figure 13).
Ces résultats sont donc cohérents avec ceux obtenus pour Akt et sa forme active p-Akt. En effet, Akt rend inactif FoxOl et provoque son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome. Dans la littérature, il a été montré qu'une inactivation de FoxOl permet de favoriser la survie cellulaire et les mécanismes de vascularisation (Oellerich M. F., Potente M., 2012). Parallèlement, une étude a montré que l'inactivation de FoxOl joue également un rôle positif dans les mécanismes de synthèse et de sécrétion de l'insuline (Nakae J et al., 2002). Akt régule également l'expression protéique de la sous-unité p65 du complexe NF- KB. N F-KB est un facteur de transcription composé de plusieurs sous-unités (p65, RelB, c-Rel, p50 et p52). En fonction des associations entre les sous-unités, la fixation sur les gènes cibles est différente. Ici, la sous- unité p65 de NF-kB a été étudiée. Si p65 et p50 forment un complexe, alors les gènes ciblés par ce facteur de transcription sont des gènes de la survie cellulaire. Lorsque la sous-unité p65 est phosphorylée (phospho-p65), alors les gènes transcrits sont pro-inflammatoires et donc délétères pour la cellule.
L'analyse de NF-kB p65 par Western Blot montre une augmentation de ce facteur grâce à la décorine : 151 ± 18% par rapport au CTL (n=7, * p<0,05, figure 14). Parallèlement, l'étude de la forme phosphorylée de p65 ne montre pas de modification de l'expression protéique : 146 ± 38% par rapport au CTL (n=8, figure 14). Par ailleurs, le rapport p-p65 sur la forme totale p65 ne montre pas de changement d'expression : 116 ± 37% par rapport au CTL (n=7, figure 15). Il n'y a donc pas d'augmentation de la phosphorylation de la protéine p65 du complexe NF-kB après exposition à la décorine pendant 24h.
Cette molécule ne favorise donc pas la transcription de gènes pro-inflammatoires via la phosphorylation de p65. En revanche, l'expression protéique de p65 grâce à la décorine est intéressante puisque sous cette forme inactive, p65 peut se fixer à une autre sous-unité de ce complexe (p50) et ainsi favoriser la transcription de gènes de la survie cellulaire.
Pour approfondir ces résultats, d'autres mécanismes intracellulaires de survie ont été investigués, notamment avec l'étude de SIRT1. Cette protéine est une déacétylase qui joue un rôle positif dans la régulation du métabolisme, la réparation de l'ADN, les mécanismes de vieillesse et de survie cellulaire (Oellerich M. F., Potente M., 2012). SIRT1 permet ainsi de contrôler de nombreuses voies de signalisation comme celles de NF-kB mais aussi celles de PGCla. Elle permet également d'activer la voie de signalisation de HIF-2a, une des voies de l'angiogenèse permettant le développement de vaisseaux sanguins. L'analyse de SIRT1 montre une augmentation significative de son expression après exposition à la décorine : 167 ± 42% par rapport au CTL (n=4, * p<0,05, figure 16). Il a été montré dans la littérature que l'augmentation de l'expression de SIRT1 permet de protéger les cellules bêta pancréatiques contre l'inflammation (Prud'homme GJ et al. 2014). L'activité de SIRT1 est dépendante de la quantité de nutriments dans la cellule. Plus elle est faible et plus SIRT1 est activée (rapport NAD+/NADH faible) (Oellerich M. F., Potente M., 2012). Or, lors de la transplantation d'îlots pancréatiques, la quantité de nutriments apportée aux cellules est faible puisque le système vasculaire n'est pas encore suffisamment développé. Grâce à la décorine, l'expression de SIRT1 est augmentée, ce qui permettra de décupler ses actions lors de la transplantation d'îlots, favorisant ainsi les mécanismes de survie cellulaire.
SIRT1 régule de manière positive la sous-unité p65 de NF-kB mais régule également l'augmentation de l'expression protéique de PGCla. Cette protéine se lie à un facteur de transcription qui régule les gènes impliqués dans la gestion du métabolisme énergétique. Elle augmente la biogenèse et la fonction des mitochondries, elle joue également un rôle dans les mécanismes de vascularisation.
L'analyse de PGCla montre une surexpression après exposition à la décorine : 168 ± 10% par rapport au CTL (n=7, * p<0,05, figure 16). Une augmentation de l'expression protéique de PGCla grâce à la décorine permet donc de jouer sur plusieurs mécanismes importants après une transplantation d'îlots : efficacité de la cellule (fonction des mitochondries, menant ainsi à une amélioration de la survie) et angiogenèse. Les résultats obtenus pour cette protéine sont cohérents puisqu'il est établi que SIRT1 peut se fixer à PGCla et l'activer (Rodgers JT et al., 2005). Une étude a également montré que PGCla peut réguler positivement la production de VEGF et donc augmenter l'angiogenèse dans un modèle de muscles squelettiques (Arany Z et al., 2008).
1.4. Effets de la décorine sur l'angiogenèse des îlots pancréatiques
Dans un premier temps, l'une des voies majeures de l'angiogenèse : la voie des Hypoxia Inducible Factors (HIF-Ia et 2a) ainsi que des enzymes impliquées dans leurs régulations, les Prolyl Hydroxylase Domain (PHDs) ont été étudiées par Western blot.
HIF-Ia et HIF-2a sont des sous-unités des facteurs de transcription HIF-1 ou HIF-2. Après fixation avec la sous-unité HIF-Ib, ces complexes protéiques peuvent se lier sur les régions promotrices de gènes spécifiques de l'angiogenèse (comme le gène du VEGF par exemple). Elles jouent donc un rôle majeur dans le développement et la croissance des vaisseaux sanguins. L'étude de HIF-Ia ne montre pas de différence significative entre les deux conditions : 117 ± 20% par rapport au CTL (n=12, figure 17). En revanche, l'étude de HIF-2a montre une surexpression de cette protéine grâce à décorine : 163 ± 6% par rapport au CTL (n=ll, *** p<0,0001, figure 17).
Pour compléter ces données l'effet de la décorine sur l'expression de HIF-2a a été étudié, notamment via une action sur les PHDs. Les PHDs sont une famille d'enzymes comprenant trois protéines : PHD 1, 2 et 3, qui, en normoxie (quantité normale d'oxygène dans le sang, permettant une activité normale des cellules), favorisent la dégradation des protéines HIF-Ia et 2a en utilisant l'oxygène comme substrat.
En revanche, en hypoxie, l'oxygène est rare, faute de substrat les PHD ne peuvent plus dégrader HIF-la ou 2a : les mécanismes pro-angiogéniques sont alors enclenchés.
Après 24h de traitement avec la décorine, on ne constate pas de modification de l'expression de ces trois protéines par rapport à la condition contrôle. PHD1 : 125 ± 15%, PHD2 123 ± 16% et PHD3 109 ± 10% (n=12, figure 18). La surexpression de HIF-2a par la décorine ne passe donc pas par une action sur les PHDs.
Une surexpression de HIF-2a sans modification de l'expression des PHDs permet la transcription des gènes de l'angiogenèse. La décorine semble donc avoir un impact sur les mécanismes de développement de vaisseaux sanguins au sein des îlots pancréatiques.
La voie des HIFs n'est pas la seule responsable des mécanismes de vascularisation et d'angiogenèse. Les inventeurs se sont ainsi intéressés à une autre voie majeure de l'angiogenèse : la voie de signalisation du VEGF-A et de son récepteur le VEGF-Receptor 2 (VEGF-R2).
Le VEGF-R2 (Vascular Endothélial Growth Factor Receptor 2) est un récepteur membranaire sur lequel peut se fixer le facteur de croissance VEGF. La fixation de cette protéine sur son récepteur permet de déclencher des réactions cellulaires (survie, prolifération, perméabilité vasculaire, modification du cytosquelette) et donc de stimuler l'angiogenèse. L'étude de VEGF-R2 montre une différence significative grâce à la décorine : 120 ± 9% par rapport au CTL (n=6, * p<0,05, figure 19). Parallèlement, l'étude de la forme phosphorylée (forme active) de VEGF-R2 montre également une différence significative. Après traitement avec la décorine, on constate une augmentation de la quantité de VEGF-R2 et une augmentation significative de l'activation de ce récepteur. Il est intéressant d'augmenter le nombre de récepteur puisque de cette manière, les îlots seront plus réceptifs à l'induction de l'angiogenèse par le VEGF lorsqu'ils seront transplantés.
Enfin, pour compléter l'étude des effets de la décorine sur les mécanismes de l'angiogenèse des îlots pancréatiques, la sécrétion du VEGF-A en fonction du temps de culture a été étudiée. Pour cela, des îlots de Rat ont été traités avec la décorine pendant 2, 4, 8, 12 ou 24h. A ces différents temps, le milieu de culture est prélevé et la quantité de VEGF-A présente dans le milieu est déterminée par la méthode ELISA. Les cellules sont également collectées et la quantité de protéines est déterminée pour chaque échantillon afin de normaliser les résultats.
Les résultats sont présentés sous la forme pourcentage par rapport à la condition CTL au temps 2h (% par rapport au CTL 2h, n=6, figure 20). Sur ce graphique, on peut tout d'abord observer une sécrétion identique pour les deux conditions entre 2h et 12h de traitement. Mais au bout de 24h de traitement avec la décorine, la sécrétion de VEGF-A est augmentée (CTL = 1896 ± 61% et décorine = 1992 ± 152%).
1.5 Effets de la Décorine sur des animaux modèles du diabète
L'efficacité de la greffe d'îlots a été évaluée pendant 56 jours post-transplantation chez des rats en contrôlant le poids corporel (Fig. 21 A et B, n = 3 à 5), la glycémie (Fig. 22 A et B, n = 3 à 5), la c-peptidémie C (Fig. 23 A et B, n = 3 à 5), l'apparition de l'insulino-indépendance (Fig. 24 A et B, n = 3 à 5) et l'évolution des besoins en insuline (Fig. 25 A et B, n = 3 à 5).
Premièrement, le prétraitement des îlots pancréatiques avec la décorine, additionné ou non d'injections de cette myokine, semble augmenter le gain de poids corporel au cours du temps par rapport au groupe contrôle, et ceci à partir de 14 jours post-transplantation (Fig. 21 A, n = 3 à 5). L'effet de la décorine sur le gain de poids est confirmé par la mesure des aires sous la courbe (Fig. 21 B, n = 3 à 5). En effet, les résultats obtenus sur l'ensemble de l'étude, montrent un gain de poids corporel significativement augmenté pour les rats transplantés avec des îlots prétraités avec la décorine (Condition optimale) versus contrôles suboptimale (p < 0.01, n=3 à 5), contrôle optimale (p < 0.01, n=3 à 5) et décorine suboptimale (p < 0.001, n=3 à 5). De plus, aucune différence statistique n'est obtenue entre le contrôle « suboptimale » et le « contrôle optimale ». Par ailleurs, étant donné que cette différence n'est plus statistique entre le groupe décorine optimale et les autres groupes ayant reçu en complément l'injection de décorine, ceci conforte démontre encore que la décorine à un effet positif sur le gain de poids corporel. Néanmoins, il reste à déterminer si ce gain est lié à une amélioration de la fonction du greffon ou bien à une augmentation de la masse musculaire.
Un prétraitement des îlots pancréatiques avec la décorine et/ou une injection quotidienne de décorine améliore le contrôle glycémique des rats transplantés par rapport aux animaux ayant reçu une greffe classique (Fig. 22 A, n = 3 à 5). En effet, dès 14 jours, la glycémie du groupe contrôle est plus importante que les autres groupes transplantés avec un décrochage remarquable après 28 jours. Cet effet bénéfique de la décorine est confirmé par l'analyse des aires sous la courbe (Fig. 22 B, n = 3 à 5). En effet, seules les groupes « décorine optimale » (p < 0.001), contrôle optimale + injection de décorine (p < 0.05) et décorine optimale + injection de décorine (p < 0.001) présentent une glycémie significativement inférieure au groupe contrôle suboptimale. De plus, la plus grande significativité obtenue pour le groupe décorine optimale + injection de décorine (p < 0.001) que le groupe contrôle optimale + injection de décorine (p < 0.05) versus contrôle suboptimale démontre que le prétraitement des îlots avec de la décorine associé à une injection de cette myokine pourrait être encore plus bénéfique pour la fonctionnalité du greffon. Ces résultats sont renforcés par l'étude de la c-peptidémie au cours du temps (Fig. 23 A, n = 3 à 5) et de l'analyse des aires sous la courbe (Fig. 23 B, n = 3 à 5). Enfin, les études de l'obtention de l'insulinoindépendance (Fig. 24, n = 3 à 5) et des besoins en insuline (Fig. 25, n = 3 à 5) durant le déroulement du suivi, prouvent l'impact favorable de la décorine sur la fonction du greffon que ce soit en prétraitement uniquement ou associé à une injection quotidienne de la décorine (effet potentialisateur de l'association prétraitement/injection). En effet, dès 7 jours post greffe, 20% des animaux deviennent insulino-indépendant pour le groupe « décorine optimale + injection de décorine » contre 14 jour pour les groupes recevant une injection de décorine. Par ailleurs, les groupes « décorine optimale » avec ou sans injection présentent un pourcentage d'animaux insulino-indépendant supérieur aux autres groupes, avec un maintien du pourcentage d'animaux insulino-indépendant au minima à 80% à 56 jours post-transplantation. Ainsi, au vu de ces résultats sur le contrôle métabolique, il semble que la prise de poids corporel observée avec le traitement à la décorine pourrait être liée à une amélioration de la survie et de la fonction du greffon.
1.6. Etude in vivo montrant l'intérêt de la décorine sur la survie de la greffe d'ilots après transplantation au niveau hépatique après induction d'un diabète de type 1
En comparant la figure 26A et 26B, on peut constater que les rats receveurs de la transplantation d'ilots ont une greffe d'ilots survivant et fonctionnant beaucoup plus longtemps lorsqu'un prétraitement des îlots a été réalisé et que le récipient de la greffe a reçu une injection de décorine toutes les 24h. On peut néanmoins observer qu'un prétraitement de l'ilot avant transplantation a un fort impact sur la survie, la fonction de la greffe et l'indépendance à l'insuline du receveur.
Ainsi, on peut nettement voir ici qu'un prétraitement à la décorine augmente la fonction et la survie des îlots transplantés in vivo (control vs décorine). De plus, l'injection de décorine chez le receveur toutes les 24h en plus du prétraitement des îlots transplantés augmente de manière importante la fonction de la greffe et l'insulino-indépendance du receveur.
1.7 Etude de l'impact de la décorine lors de conditions diabétogènes
Les îlots humains sont traités soit à la décorine soit exposés à différentes solutions mimant les conditions diabétogènes (inflammation, acide gras et sucre). On peut voir ici qu'un traitement à la décorine potentialise la sécrétion d'insuline et protège l'ilot humain des effets néfastes de l'inflammation, des acides gras et de l'hyperglycémie sur la sécrétion d'insuline mais aussi sur la survie des cellules bêta- pancréatiques.
En particulier, la Figure 27 montre que la décorine potentialise la sécrétion d'insuline en réponse au glucose et protège de l'effet du TNF-alpha sur la sécrétion d'insuline dans les îlots de Langerhans humains. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au TNF-alpha 20 nM pendant 24h. Les îlots humains ont été traités sous leurs formes natives (pas de dissociation ou isolement cellulaire); N=10. La figure 28 montre que la décorine augmente la survie de la cellule beta pancréatique et la protège de la mort induite par un mix de cytokines pro-inflammatoires connues pour induire la mort cellulaire lors du diabète. Les îlots de Langerhans humains ont été traités et ont ensuite subi un double marquage : un marquage TUNEL marquant les cellules mortes et un marquage insuline marquant les cellules beta- pancréatiques. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au TNF-alpha +interféron gamma+IL-lbeta (20 nM pendant 24h). N=10
La figure 29 montre que la décorine potentialise la sécrétion d'insuline en réponse au glucose et protège de l'effet d'un excès de gras (palmitate : 500mM finale) sur la sécrétion d'insuline dans les îlots de Langerhans humains. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au palmitate pendant 48h. Les îlots humains ont été traités sous leurs formes natives (pas de dissociation ou d'isolement cellulaire); N=10.
La figure 30 montre que la décorine augmente la survie des cellules beta pancréatiques et les protège de la mort induite par les acides gras qui miment les conditions circulantes d'un patient diabétique. Les îlots de Langerhans humains ont été traités et ensuite un double marquage a été fait : un marquage dit TUNEL marquant les cellules mortes et un marquage insuline marquant les cellules beta-pancréatiques. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au palmitate pendant 48h. N=10
La figure 31 montre que la décorine potentialise la sécrétion d'insuline en réponse au glucose et protège de l'effet d'un excès de sucre (glucose : 16,7mM finale) sur la sécrétion d'insuline dans les îlots de Langerhans humains. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au glucose pendant 48h. Les îlots humains ont été traités sous leurs formes natives (pas de dissociation ou d'isolement cellulaire); N=10.
1.8 Effet de la décorine chez les sujets atteints de diabète de type II.
Des îlots humains ont été isolés chez des patients diabétiques de type 2. Les îlots sont incubés ou non avec de la décorine pendant 24h. On peut voir ici sur les deux préparations qu'un traitement à la décorine restaure une sécrétion à l'insuline en réponse au glucose.
En particulier, la figure 32 montre que la décorine restaure la sécrétion d'insuline dans les îlots humains isolés chez des patients diabétiques de type 2. Les îlots de Langerhans humain ont été traités à la décorine pendant 24h avant la mesure de la sécrétion d'insuline en réponse au glucose. N=2
Conclusion
L'étude de l'apoptose par la méthode TUNEL a montré que la décorine permet de diminuer de manière significative l'apoptose des cellules des îlots pancréatiques. La décorine potentialise la sécrétion de l'insuline en réponse à une stimulation au glucose. Cette augmentation est corrélée à une diminution de la sécrétion du glucagon. Pour expliquer les effets positifs de la décorine sur la survie et la fonctionnalité des îlots pancréatiques, les inventeurs se sont intéressés aux mécanismes intracellulaires par la méthode du Western Blot, en particulier en lien avec la voie de signalisation d'IGF-lR. Les mécanismes de l'angiogenèse ont été étudiés, en particulier l'expression des protéines impliquées dans les deux principales voies de l'angiogenèse : la voie des HIFs et celle du VEGF. L'étude de sécrétion du VEGF-A sur 24h par les îlots montre que la décorine semble améliorer cette sécrétion et pourrait ainsi favoriser le mécanisme de vascularisation.
Ainsi, les résultats obtenus sur les îlots de Rat montrent que l'utilisation de la décorine sur les îlots peut améliorer la survie, la fonction et l'angiogenèse des îlots pancréatiques.
Les résultats obtenus in vivo chez le rat montrent que la décorine est un candidat très intéressant pour optimiser la survie et la fonction du greffon post-transplantation mais également lors de la préparation de celui-ci et participe au maintien de l'insulino-dépendance chez des rats transplantés.
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Animaux
L’étude est réalisée sur des rats Wistar. Les rats sont hébergés selon les normes collectives : par cinq dans des cages, dans une salle à 23 ± 1°C et en cycle lumière/obscurité de 12h. Les Rats sont nourris avec des croquettes standards (SAFE-A04, Villemoisson-sur-Orge, France), la nourriture et l’eau sont disponibles ad libitum (mode d'alimentation libre, généralement jusqu'à satiété). Les expérimentations sur les Rats sont effectuées conformément aux principes et règles de la législation Européenne relative à la protection des animaux. Le protocole a été déposé au ministère et évalué par le Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS) de référence de dossier 2015042216149683.
Toutes les expériences in vivo ont été réalisées conformément aux principes et directives de la législation française sur le bien-être des animaux (Décret 2013-118, 02/01/2013). Les expériences proposées ont été évaluées par le comité d’éthique français numéro CEEA-35 et les protocoles ont été approuvés par le gouvernement français en vertu de l'autorisation n°2018040316185500. Les rats Lewis ont été fournis par la société Charles River (Saint-Germain-Nuelles, France). Les rats ont été logés dans des cages collectives standard, dans une salle à température contrôlée (22 ± 1 ° C) avec un cycle de 12 h de lumière / 12 h d’obscurité. Ils ont été nourris avec des granulés standard SAFE-A04 (Villemoisson-sur-Orge, France). La nourriture et l’eau étaient disponibles ad libitum.
Prélèvement des îlots pancréatiques de Rat
L'isolement d'îlots pancréatiques est réalisé sur des Rats Wistar mâles de poids corporel variant de 200 à 220 g, préalablement anesthésiés avec de l'Imalgène® (Kétamine, Marial, Lyon, France) complété avec du Rompun® (Xylazine 2 %, Bayer, Puteaux, France) par voie intrapéritonéale à raison de 100 mI/100 g de poids corporel.
L'isolement d'îlots pancréatiques est réalisé selon la méthode décrite par Sutton et al. (Sutton R. et al. 1986). Une découpe de la boutonnière ventrale est réalisée, puis le pancréas est dégagé des autres organes. Après avoir ligaturé le canal cholédoque à l'embouchure duodénale, 10 ml de collagénase de type XI (Sigma-Aldrich, St-Louis, USA) à raison de 1 mg/ml, sont injectées dans le pancréas de l'animal via un cathéter dans le canal cholédoque à l'embouchure hépatique. Le pancréas est entièrement prélevé et les îlots pancréatiques sont ensuite séparés du tissu exocrine par centrifugation, à l'aide d'un gradient discontinu de Ficoll. Les îlots purifiés sont cultivés pendant une nuit dans des flasques 25 cm2 dans du milieu M199* (Gibco®, Saint Aubin, France) supplémenté avec 10% de SVF (Sigma-Aldrich) et 1% d'ABAM pendant 24h à 37°C, 5% de CO 2 et en atmosphère humide.
Traitements des îlots pancréatiques
Les îlots pancréatiques contenus dans les flasques sont ensuite cultivés dans des plaques 24 puits à une densité de 250 îlots par puit. Pour les îlots de Rat, le milieu de culture est le M199 supplémenté comme décrit précédemment. Le milieu de culture pour les îlots humains est le CMRL-1066 supplémenté comme décrit précédemment. Les milieux de culture contiennent ou non de la décorine (R&D, Systems, Minneapolis, USA) à la concentration finale de 1 pg/ml. La culture se fait pendant 24h à 37°C, 5% de C02 et en atmosphère humide. Après 24h d'incubation, les tests suivants ont été réalisés.
Etude de l'apoptose par immunofluorescence
Les îlots ont été isolés et cultivés en absence ou présence de décorine dans une plaque 24 puits à une concentration de 1250 îlots par puits, à 37°C et 5% C02.
Les îlots sont récupérés et placés dans un composé Optimal Cutting Température (OCT) avant d'être solidifiés dans l'azote liquide. Des sections de 10 pm sont réalisées avec un microtome-cryostat (Leica CM3050 s) et fixées sur des lames pour analyses.
Les ruptures aux extrémités des brins 3-OH de l'ADN, générées lors de l'apoptose, sont détectées en utilisant la technique TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated deoxyuridine 5- triphosphate nick-end labeling) selon le protocole du fabricant (In situ cell death détection kit, Roche).
Les cellules ont été co-marquées avec un anticorps monoclonal anti-insuline (Cell Signaling Technology) et le noyau des cellules a été marqué avec du DAPI. Le nombre de cellules TUNEL-positives a été déterminé par comptage après observation au microscope à fluorescence. Pour chaque expérience, environ 1000 cellules ont été comptées avec le logiciel ImageJ. Etude de la prolifération par immunomarquage du KI67
Les lames de coupes histologiques sont réalisées et le marquage du KI67 est réalisé. Cette protéine est synthétisée uniquement lorsque les cellules sont en phase de division. Les cellules ont été marquées avec un anticorps anti-KI67 (Novus Biologicals) utilisé à la dilution 1 :100 dans du tampon phosphate salin (PBS). Le noyau des cellules a été marqué avec du DAPI.
Test de fonctionnalité
Des milieux de culture aux concentrations en glucose de 2,8 et 16,7 mM sont préparés à partir d'une solution de Krebs (115 mM NaCI, 4,7 mM KCI, 3,4 mM CaCI2, 1,2 mM KH2P04, 2,1 mM MgS04, 21,2 mM NaHC03, 13,5 mM Hepes, [pH 7,4]) supplémenté avec 10% de SVF.
10 îlots sont prélevés et synchronisés pendant 30 minutes dans le milieu 2,8 mM glucose, puis cultivés lh dans le milieu 2,8 mM et finalement lh dans le 16,7 mM glucose, à 37°C et 5% C02. Après ces incubations, les îlots sont placés dans une solution d'acide-éthanol pour mesurer le contenu total en insuline et glucagon des îlots qui n'a pas été sécrété lors du test. Le surnageant des milieux de culture et l'acide- éthanol sont conservés à -20°C jusqu'aux dosages. La quantité d'insuline ou de glucagon de chaque échantillon est déterminée par la méthode ELISA selon le protocole du fabricant (Mercodia AB, Uppsala, Sweden). La sécrétion des îlots est exprimée en pourcentage du contenu total en insuline ou glucagon.
Western Blotting
Le contenu total en protéines est extrait des îlots cultivés grâce à du tampon de lyse complété avec un inhibiteur de protéase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Les échantillons ont été centrifugés à 10 000g pendant 10 minutes et la concentration en protéines dans chaque échantillon a été déterminée par un dosage de Bradford, avec la BSA comme étalon.
Pour chaque échantillon, 20 pg de protéines sont déposés dans les puits d'un gel 4-12% SDS- polyacrylamide (SDS-PAGE). Les protéines sont séparées par électrophorèse et transférées sur une membrane PVDF (Milipore). Les sites aspécifiques de la membrane sont bloqués avec une solution Tris- Buffered Saline et 0,1% Tween 20 (TBS-T) contenant 5% de lait, pendant lh et à température ambiante. La membrane est ensuite incubée avec une solution d'anticorps primaires pendant la nuit et à 4°C. Les anticorps primaires sont dilués au 1:1000 dans une solution de TBS-T contenant 5% de BSA.
Les anticorps utilisés sont les suivants : monoclonal anti-phospho-IRSl Tyr628 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA); polyclonal anti-phospho-IRS2 Tyr978 (RayBiotech, Norcross, USA); monoclonal anti- Akt (Cell Signaling Technology, Leiden, NETHERLANDS); monoclonal anti-phospho-Akt Ser473 (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-phospho-AS160 Ser/Thr (Cell Signaling Technology); monoclonal anti-NF-kB p65 (Cell Signaling Technology); monoclonal anti-phospho-NF-kB p65 Ser536 (Cell Signaling Technology); monoclonal anti-FoxOl (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-phospho-FoxOl Thr24/Fox03a Thr32 (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-SIRTl (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-PGCla (Abcam, Cambridge, USA); polyclonal anti-PHDl, polyclonal anti-PHD2, et polyclonal anti-PHD3 (Novus Biologicals); monoclonal anti-HIF-la (Novus Biologicals); monoclonal anti- H I F-2ot (Novus Biologicals); polyclonal anti-VEGF Receptor 2 (Abcam); polyclonal anti-phospho-VEGF Receptor 2 Tyrl054/Tyrl059 (Abcam); polyclonal anti-IGF-l Receptor (Novus Biologicals); monoclonal anti-phospho-IGF-l Recepto^/lnsulin Receptor b Tyrll50/1151 (Cell Signaling); polyclonal anti^-actine dilution 1:10000 (Abcam).
Les membranes sont ensuite rincées trois fois cinq minutes avec du TBS-T, puis incubées lh à température ambiante avec les anticorps secondaires dilués au 1 : 10000 dans une solution de TBS-T et 5% de BSA. En fonction de l'espèce qui produit les anticorps primaires, on utilise soit un anticorps immunoglobuline G (IgG) anti-Rabbit couplé avec une enzyme peroxydase de raifort (Horseradish Peroxidase, HRP) (Sigma), soit un anticorps IgG anti-souris couplé avec une HRP (Sigma).
Les membranes sont rincées comme décrit précédemment et l'activité de la HRP est détectée après ajout du substrat Super Signal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA). L'émission lumineuse est ensuite captée par une caméra (Chemidoc, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) et des images sont prises.
L'énergie lumineuse émise par l'enzyme HRP est analysée de manière semi-quantitative en utilisant le logiciel ImageJ. L'intensité lumineuse relative à chaque protéine est normalisée grâce à la b-actine.
Cinétique de sécrétion de VEGF-A
Les îlots ont été isolés et cultivés en absence ou en présence de décorine dans une plaque 24 puits à une concentration de 500 îlots par puits, à 37°C et 5% C02. Après 2, 4, 8, 12, ou 24h de culture, le surnageant est prélevé et stocké à -20°C jusqu'au dosage du VEGF-A.
La quantité de VEGF-A dans les échantillons é été déterminée par la méthode ELISA selon le protocole du fabricant (RayBiotech). La concentration en protéine de chaque puit a été déterminée et la quantité de VEGF-A a été normalisée par la quantité totale de protéine.
Transplantation d'îlots
La greffe d'îlots a été réalisée chez des rats Lewis mâles (200 g), souche consanguine, afin de se soustraire des réactions immunologiques de rejet. Le diabète a été induit par une injection intrapéritonéale unique de 75 mg / kg de streptozotocine (STZ, Sigma-Aldrich) diluée dans du sérum physiologique stérile. Les animaux ont été considérés comme diabétiques après deux mesures consécutives de la glycémie > 3 g/L à l'aide d'un lecteur de glycémie (Accu-chek Performa, Roche). Les rats ont été ensuite divisés en 9 groupes de 6 animaux par groupe et un suivi métabolique fut réalisé pendant 2 mois. Concernant la transplantation d'îlots pancréatiques, après anesthésie gazeuse à l'isoflurane, les rats diabétiques ont subi une laparotomie suivi d'une injection intraportale soit de milieu CMRL seul (groupe SHAM), soit d'îlots pancréatiques, à raison de 5000 IEQ/kg (condition suboptimale, permet rapidement d'identifier des différences entre les groupes) ou de 10000 IEQ/kg (condition optimale, comparable à ce qui est réalisé en clinique). Ainsi, parmi les rats transplantés, nous trouvons les groupes contrôle (sans pré-traitement des îlots) et décorine (pré-traitement des îlots avec 1 pg/mL de décorine pendant 24h) en quantité suboptimale ou optimale et ayant reçu ou non une injection intrapéritonéale quotidienne de 1 pg/mL de décorine.
Les rats diabétiques ont reçu une injection quotidienne sous-cutanée d’insuline de 6UI (glycémie > 3 g/L) ou de 3UI (2 g/L > glycémie < 3 g/L) diluée dans du sérum physiologique stérile quotidien (Lantus SoloStar® avec 100 Ul / mL d’insuline glargine, Sanofi, Paris, France).
Suivi métabolique
Le contrôle métabolique a été surveillé pendant 56 jours après la transplantation. Le gain de poids corporel (gramme par rapport à t=0 post transplantation), la glycémie (g/L) et la c-peptidémie (pmol/L) ont été évalué au cours du temps mais également sur l'ensemble des 56 jours de suivi métabolique par la mesure de l'aire sous la courbe. Pour compléter ces données, une étude comparative entre les groupes a été réalisée concernant, d'une part l'apparition de l'insulinoindépendance et d'autre part les besoins quotidiens en insuline.
Analyse statistique des résultats
Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le logiciel Statistica (StatSoft, Maisons-Alfort, France). Pour analyser les résultats, un test non-paramétrique de Mann-Whitney est utilisé. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM et le nombre de répétitions est indiqué pour chaque graphique. Une valeur de p inférieure à 0,05 a été considérée comme significativement statistique. Pour la représentation graphique, la valeur de p est notée comme suit : p<0,05 avec *, p<0,01 avec ** et p<0,001 avec ***.
Les tests statistiques des expériences in vivo ont été réalisés avec le logiciel GraphPad Prism version 7. Les différences entre les groupes ont été évaluées à l’aide d’une analyse de variance (One way ANOVA), suivie du test de comparaisons multiple de Tukey. Les tests post-hoc ne sont exécutés que si F atteint P <0,05 et qu’aucune inhomogénéité de variance significative n'est présente. Les données ont été rapportées en tant que moyenne ± SEM pour le nombre de répétitions indiqué et qu’une valeur p de <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Claims

Revendications
1. Décorine ou composition pharmaceutique comprenant de la décorine, pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète.
2. Décorine ou composition pharmaceutique pour une utilisation selon la revendication 1, dans laquelle le diabète est le diabète de type 1.
3. Décorine ou composition pharmaceutique pour une utilisation selon la revendication 1, dans laquelle le diabète est le diabète de type 2.
4. Décorine ou composition pharmaceutique pour une utilisation selon la revendication 1, dans laquelle le diabète est le diabète gestationnel.
5. Décorine ou composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1-4, pour son utilisation en combinaison avec une thérapie immunosuppressive et/ou un traitement anti-inflammatoire concomitant ou suivant la transplantation de cellules d’îlots pancréatiques chez un sujet.
6. Décorine ou composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation selon la revendication 5, dans laquelle la thérapie immunosuppressives et/ou le traitement anti-inflammatoires sont choisis parmi de la thymoglobuline, des anti-TNFa, de la rapamune, des inhibiteurs des calcineurines, des agents dépléteurs de lymphocyte T ou des combinaisons de ceux-ci.
7. Décorine ou composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation selon la revendication 5, dans laquelle la thérapie immunosuppressives et/ou le traitement anti-inflammatoires est une combinaison de thymoglobuline et de rituximab.
8. Décorine ou composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1-7, pour son utilisation en combinaison avec un principe actif antidiabétique.
9. Décorine ou composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation selon la revendication 8, dans laquelle l'actif antidiabétique est choisi parmi l'insuline, la metformine, des sulfonylurées, le tolbutamide, l'acétohexamide, le tolazamide, le chlorpropamide, le glibenclamide, le glimépiride, le glipizide, le glicazide, le glycopyramide, le gliquidone, des inhibiteurs d'alpha-glucosidase, l'acarbose, le miglitol, le voglibose, des thiazolidinediones, le pioglitazone, le rosiglitazone, des méglitinides, le répaglinide, le natéglinide, un incrétino-mimétique, un analogue du glucagon-like peptide, l'exénatide ou ses dérivés, le taspoglutide, le liraglutide, le semaglutide, un inhibiteur de la dipeptidyl peptidase-4, le vildagliptine, le sitagliptine, le saxagliptine, le linagliptine, l'allogliptine, le septagliptine, un analogue de l'amyline, le pamlintide, un inhibiteur du transporteur de sodium glucose, l'empaglifozine, la dapaglifozine, la canamycine, ou une combinaison de ceux-ci.
10. Décorine ou composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation selon l'une des revendications 1-3 et 5-9, pour son utilisation dans le traitement d'un sujet greffé ou susceptible d'être greffé avec des cellules d’îlots pancréatiques.
11. Décorine ou composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation selon la revendication 10, pour son utilisation dans le traitement d'un sujet greffé avec des cellules d’îlots pancréatiques.
12. Décorine ou composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation selon la revendication 10 or 11, caractérisée en ce que les cellules d’îlots pancréatiques greffées ont été traitées avec de la décorine.
13. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1-
12, ladite composition pharmaceutique comprenant des cellules humaines et de la décorine en tant que substance active.
14. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 13, dans laquelle les cellules sont choisies parmi des cellules endocrines et des cellules d'ilots pancréatiques.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7304033B2 (en) * 2001-05-23 2007-12-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for protecting allogeneic islet transplant using soluble CTLA4 mutant molecules

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3854307B2 (ja) * 1991-12-04 2006-12-06 ザ バーナム インスティテュート 細胞外マトリックスの蓄積を防止するためのトランスフォーミング増殖因子βの阻害
CA2781309A1 (fr) * 2009-12-04 2011-06-09 Euclid Systems Corporation Composition et procedes pour la prevention et le traitement d'une degenerescence maculaire, d'une retinopathie diabetique et d'un oedeme maculaire diabetique
US10759865B2 (en) * 2017-08-22 2020-09-01 Eyal Levit Treatment of diabetes mellitus

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7304033B2 (en) * 2001-05-23 2007-12-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for protecting allogeneic islet transplant using soluble CTLA4 mutant molecules

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOUZAKRI KARIM ET AL: "Decorin: a new positive component of skeletal muscle to beta cell communication which prevent TNF-alpha and insulin resistance condition medium effect on beta cells", POSTER FOR ABSTRACT NO: 346; 52ND EASD ANNUAL MEETING, 15 September 2016 (2016-09-15), pages 1 - 1, XP093252642, Retrieved from the Internet <URL:https://provided.by.applicant> *
BOUZAKRI KARIM ET AL: "Silencing Mitogen-activated Protein 4 Kinase 4 (MAP4K4) Protects Beta Cells from Tumor Necrosis Factor-[alpha]-induced Decrease of IRS-2 and Inhibition of Glucose-stimulated Insulin Secretion", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 284, no. 41, 1 October 2009 (2009-10-01), US, pages 27892 - 27898, XP093245987, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.M109.048058 *
HAMMAR EVA ET AL: "<mark>Extracellular matrix protects pancreatic</mark> [beta]-<mark>cells against apoptosis</mark>: <mark>Role</mark> of <mark>short</mark>- and <mark>long</mark>-<mark>term signaling pathways</mark>", DIABETES, vol. 53, no. 8, 1 August 2004 (2004-08-01), pages 2034 - 2041, XP093246017, ISSN: 0012-1797, Retrieved from the Internet <URL:https://watermark.silverchair.com/zdb00804002034.pdf?token=AQECAHi208BE49Ooan9kkhW_Ercy7Dm3ZL_9Cf3qfKAc485ysgAAA1EwggNNBgkqhkiG9w0BBwagggM-MIIDOgIBADCCAzMGCSqGSIb3DQEHATAeBglghkgBZQMEAS4wEQQMcV5vMA7SfBQXitAEAgEQgIIDBHymoBv7Dan8rj0LLYBXOx-et_ThXhGiRDGpn3_76aEAvUZ2gtTPPqj4J2awcKieDdkoIP11mae_NPptUE7ro> DOI: 10.2337/diabetes.53.8.2034 *
KESSLER ET AL: "La therapie cellulaire du diabete de type 1. Situation actuelle et perspective", MEDECINE NUCLEAIRE, ELSEVIER, PARIS, FR, vol. 34, no. 10, 1 October 2010 (2010-10-01), pages 589 - 596, XP027320430, ISSN: 0928-1258, [retrieved on 20100923] *
RUTTI SABINE ET AL: "Angiogenin and Osteoprotegerin are type II muscle specific myokines protecting pancreatic beta-cells against proinflammatory cytokines", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 8, no. 1, 3 July 2018 (2018-07-03), US, XP093246030, ISSN: 2045-2322, Retrieved from the Internet <URL:https://www.nature.com/articles/s41598-018-28117-2> DOI: 10.1038/s41598-018-28117-2 *
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