EP3899669A1 - Procédé de caractérisation d'une particule à partir d'un hologramme - Google Patents

Procédé de caractérisation d'une particule à partir d'un hologramme

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EP3899669A1
EP3899669A1 EP19842872.4A EP19842872A EP3899669A1 EP 3899669 A1 EP3899669 A1 EP 3899669A1 EP 19842872 A EP19842872 A EP 19842872A EP 3899669 A1 EP3899669 A1 EP 3899669A1
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EP
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image
sample
particle
interest
diffraction
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Pierre BLANDIN
Cédric ALLIER
Olivier CIONI
Lionel Herve
Pierre Joly
Jean-Marc Dinten
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Iprasense Sas
Horiba ABX SAS
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
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Iprasense Sas
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Horiba ABX SAS
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
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Publication date
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Definitions

  • the technical field of the invention is the characterization of particles, for example biological particles, from an image.
  • the image of the sample can be acquired according to an imaging configuration without a lens, no image forming optics being disposed between the sample and the image sensor.
  • each particle produces a diffraction pattern, the latter representing a signature of the particle.
  • the document WO2008090330 describes such a configuration, when the source used is a light-emitting diode. In this document, it is shown that this imaging modality confers a high field of observation, and allows rapid identification of cells or bacteria using a simple device.
  • Document US7465560 describes a device making it possible to identify bacterial colonies as a function of a diffraction pattern formed on an image sensor.
  • the bacterial colony examined is illuminated using a laser beam.
  • This document shows that a diffraction pattern constitutes a signature of a bacterial colony.
  • a diffraction pattern can be classified, for example by using a decomposition according to Zernike polynomials. This is for example described in US8787633 or in WO2014184390.
  • the image acquired by the image sensor can be the subject of a reconstruction, called holographic reconstruction, making it possible to obtain a sharper image of the particles.
  • holographic reconstruction makes it possible to obtain a sharper image of the particles.
  • sophisticated algorithms of holographic propagation making it possible to obtain a so-called reconstructed image of the sample, are described in WO2016189257 or in WO2017162985.
  • a difficulty may arise when the sample contains a high concentration of particles. Indeed, on the image acquired by the image sensor, the diffraction figures corresponding respectively to each particle, can be superimposed. As a result, a characterization of the particles, from their respective diffraction figures, becomes more difficult to implement.
  • the inventors have sought to improve the methods described above, by allowing a characterization of particles from the diffraction patterns associated with each of them.
  • the method is particularly suitable for a sample in which, due to the density of the particles, the diffraction patterns associated with each of them overlap.
  • a first object of the invention is a method for characterizing a particle present in a sample, the sample lying between an image sensor and a light source, the image sensor extending along a plane of detection, the method comprising the following steps:
  • step f application of a propagation operator to the extracted complex image formed during step e), so as to obtain, in a propagation plane, an elementary diffraction pattern of the particle selected during step c ), so that the elementary diffraction pattern obtained is isolated from elementary diffraction patterns of other particles present in the sample;
  • the elementary diffraction pattern can take the form of a complex image.
  • the propagation plane can be the detection plane. However, it may also be a plane located at a distance from the sample less than or greater than the distance between the sample and the detection plane. According to one embodiment,
  • step c) comprises, at each iteration, an application of a holographic propagation operator to an image of the exposure light wave, in the detection plane, so as to obtain a complex expression of the light wave exposure, in at least one plane along which the sample extends, forming the complex image;
  • Step d) comprises, from the reconstructed complex image, obtaining an observation image, the particle of interest being selected on the observation image.
  • Step f) can include the application of a holographic propagation operator to the region of interest selected during step e), so as to obtain the elementary diffraction figure, corresponding to the particle of interest, in the propagation plane, the part of the reconstructed complex image located outside the region of interest not being propagated.
  • the method can include an estimate of a distance between the particle of interest and the detection plane, so that during step f), the propagation operator takes into account the distance thus estimated.
  • step f) the propagation is carried out by considering a predetermined propagation distance.
  • a complex elementary diffraction figure is obtained, in the reconstruction plane, of the particle selected during step c).
  • the characterization is then carried out from the phase or module of the complex elementary diffraction figure, or from its real part or from its imaginary part.
  • Step g) may include the determination of an axial profile, representing a radial average of the elementary diffraction pattern.
  • Step g) can include:
  • step f a comparison of the elementary diffraction figure, obtained during step f), with at least one diffraction figure modeled by considering a particle whose refractive index and / or size are known;
  • step f taking into account diffraction figures obtained using known particles, or modeled diffraction figures, during a phase d 'learning.
  • step g) comprises a decomposition of the elementary diffraction figure, according to a base of Zernike polynomials, so as to obtain coordinates of the elementary diffraction figure in the base;
  • the characterization of the particle of interest is carried out as a function of the coordinates of the elementary detection figure.
  • the characterization can be carried out as a function of modeled diffraction figures, for each diffraction figure corresponding to a particle of which a parameter is known, the parameter being a size and / or a refractive index, the characterization aiming to determine a value of the parameter for the particle of interest analyzed.
  • the modeling can notably be based on an assumption according to which the particle is spherical.
  • the method can include an iterative adjustment of the parameter of the particle, each iteration comprising:
  • a set of parameters is taken into account, the set of parameters comprising a distance between the particle and the detection plane.
  • a second object of the invention is a device for observing a sample, the sample comprising particles, the device comprising:
  • a light source configured to illuminate the sample
  • a sample holder configured to receive the sample
  • an image sensor arranged such that when the sample is placed on the support, it extends between the image sensor and the light source, the image sensor being configured to acquire an image of the 'sample;
  • a processor configured to implement steps c) to f) or c) to g) of a method according to the first object of the invention, from an image acquired by the image sensor.
  • no image forming optics are disposed between the image sensor and the processor.
  • the device comprises an optical system extending between the sample and the image sensor, the optical system defining an image plane and an object plane, the device comprising means for adjusting the optical system, or the sample, or the image sensor, so that:
  • the detection plane is offset from the image plane
  • Figure 1 shows a first device for implementing the invention.
  • FIG. 2 shows the main steps of a method implementing the invention
  • FIG. 3A is an example of an image acquired by the sensor.
  • FIG. 3B is an image of the module of a complex image reconstructed, in a plane along which the sample extends, from the image acquired by the sensor.
  • FIG. 3C is an image of the phase of a complex image reconstructed, in a plane along which the sample extends, from the image acquired by the sensor.
  • Figure 3D is an image of the module of a complex image extracted from a region of interest, corresponding to a particle of interest, of the reconstructed complex image.
  • FIG. 3E is an image of the phase of a complex image extracted from a region of interest, corresponding to a particle of interest, of the reconstructed complex image.
  • FIG. 3F shows an image of the module of a diffraction figure propagated from the extracted complex image.
  • Figure 4 shows an example of a radial mean representative of the modulus of a diffraction pattern.
  • FIG. 5A illustrates the results of tests carried out on a sample comprising blood particles.
  • FIG. 5B illustrates the results of tests carried out on a sample comprising blood particles.
  • FIG. 5C illustrates the results of tests carried out on a sample comprising blood particles.
  • FIG. 5D illustrates the results of tests carried out on a sample comprising blood particles.
  • Figure 6 shows another device for implementing the invention.
  • FIG. 1 represents an example of a device according to the invention.
  • a light source 11 is configured to emit a light wave 12, known as an incident light wave, propagating in the direction of a sample 10, along an axis of propagation Z.
  • the light wave is emitted according to a spectral band of illumination Dl.
  • Sample 10 is a sample that we wish to characterize. It includes in particular a 10m medium in which 10 p particles are immersed.
  • the medium 10m can be a liquid medium. It can include a body fluid, obtained for example from blood or urine or lymph or cerebrospinal fluid. It can also be a culture medium, comprising nutrients allowing the development of microorganisms or cells.
  • particle is meant in particular, and in a non-exhaustive manner:
  • a cell whether it is a culture cell or a body cell, for example a blood cell;
  • a microorganism for example a bacterium or a yeast or a microalga
  • a solid particle for example a microbead, the microbead being able to be functionalized, so as to promote grafting with an analyte
  • a particle forming an emulsion in the 10m medium in particular a particle insoluble in the 10m medium, an example being a lipid droplet in an aqueous medium.
  • a 10 p particle can be solid or liquid.
  • the invention relates more particularly to particles whose size is less than 1 mm, or even 100 ⁇ m, even 50 ⁇ m.
  • particle size is meant a diameter or a diagonal.
  • a determine the nature of a particle that is to say classify this particle among one or more predetermined classes
  • an optical property of one or more particles for example the refractive index or an optical transmission property, or an optical thickness (product of the thickness by the refractive index);
  • the method can also include a count of particles according to their characterization.
  • the sample 10 is, in this example, contained in a fluid chamber 15.
  • the fluid chamber 15 is for example a fluid chamber of the Countess or Cellvision, Gene type.
  • Frame ® of thickness e 100 pm.
  • the thickness e of the sample 10, along the propagation axis typically varies between 10 ⁇ m and 1 cm, and is preferably between 20 ⁇ m and 500 ⁇ m.
  • the sample extends along a plane Pi 0 , called the plane of the sample, perpendicular to the axis of propagation Z.
  • the plane of the sample is defined by the axes X and Y represented in FIG. 1.
  • the sample is maintained on a support 10s at a distance d from an image sensor 16.
  • the concentration of particles can vary between 50 per microliter and 100,000 per microliter.
  • the distance D between the light source 11 and the fluid chamber 15 is preferably greater than 1 cm. It is preferably between 2 and 30 cm.
  • the light source 11, seen by the sample is considered to be punctual. This means that its diameter (or its diagonal) is preferably less than a tenth, better a hundredth of the distance between the fluid chamber 15 and the light source.
  • the light source is a light emitting diode. It is generally associated with diaphragm 18, or spatial filter.
  • the aperture of the diaphragm is typically between 5 pm and 1 mm, preferably between 50 pm and 500 pm.
  • the diaphragm is supplied by Thorla bs under the reference P150S and its diameter is 150 ⁇ m.
  • the diaphragm can be replaced by an optical fiber, a first end of which is placed opposite the light source 11 and a second end of which is placed opposite the sample 10.
  • the device represented in FIG. 1 also includes a diffuser 17 , disposed between the light source 11 and the diaphragm 18.
  • the function of such a diffuser is to distribute the light beam produced by an elementary light source 11 according to a cone of angle a.
  • the use of such a diffuser is described in WO2016078946.
  • the angle of diffusion a varies between 10 ° and 80 °.
  • the light source can be a laser source, such as a laser diode. In this case, it is not useful to associate a spatial filter or a diffuser.
  • the light source is a laser source, it is advantageously used as described in application WO2017109428.
  • the emission spectral band D1 of the incident light wave 12 has a width less than 100 nm, or even less than 50 nm.
  • spectral bandwidth is meant a width at half height of said spectral band.
  • the sample 10 is placed between the light source 11 and the image sensor 16 previously mentioned.
  • the image sensor 16 defines a detection plane Po, preferably extending parallel to, or substantially parallel to the plane Pio along which extends the sample.
  • substantially parallel means that the two elements may not be strictly parallel, an angular tolerance of a few degrees, less than 20 ° or 10 ° being allowed.
  • the image sensor 16 is able to form an image lo of the sample 10 according to the detection plane Po.
  • it is an image sensor 16 comprising a matrix of pixels, of CCD or CMOS type.
  • the detection plane Po preferably extends perpendicularly to the axis of propagation Z of the incident light wave 12.
  • the distance d between the sample 10 and the pixel matrix of the image sensor 16 is preferably between 50 pm and 2 cm, preferably between 100 pm and 2 mm.
  • the particles 10 p present in the sample can generate a diffracted wave 13, capable of producing, at the level of the detection plane. Po, interference, in particular with a part 12 ′ of the incident light wave 12 transmitted by the sample. Furthermore, the sample can absorb part of the incident light wave 12.
  • the light wave 14, transmitted by the sample, and to which the image sensor 16 is exposed designated by the term "wave exposure ", may include:
  • each interference pattern can be associated with a particle 10 p of the sample.
  • the processor is a microprocessor connected to a programmable memory 22 in which is stored a sequence of instructions for perform the image processing and calculation operations described in this description.
  • the processor can be coupled to a screen 24 allowing the display of images acquired by the image sensor 16 or calculated by the processor 20.
  • each interference figure can be used to characterize the particle with which it is associated. This is described in documents US8787633 or WO2014184390 cited in the prior art. However, when the quantity of particles present in the sample is large, the interference figures overlap, which no longer allows correct characterization by implementing the methods of the prior art.
  • CMOS IDS UI-1924LE sensor comprising 3840 by 2748 pixels, the size of each pixel being 1.67 pm x 1.67 pm, providing a useful detection area of approximately 30 mm 2 ;
  • distance between the sample and the image sensor between 1 mm and 1.5 mm.
  • Step 100 acquisition of the image I 0 by the image sensor.
  • Image I 0 comprises different elementary diffraction figures superimposed on each other.
  • FIG. 3A represents such an image.
  • the methods of characterizing diffraction patterns presented in the documents of the prior art are not applicable, because of the too high density of the particles in the sample.
  • Step 110 reconstruction of a complex image A 10 in the plane of the sample. From the image I 0 obtained during step 100, a holographic reconstruction algorithm is used to obtain a complex image A 10 , preferably in a reconstruction plane Pi 0 , along which the sample extends.
  • the complex image A 10 corresponds to a complex expression of the exposure light wave 14 in the reconstruction plane considered.
  • This step can in particular to implement an iterative algorithm as described in WO2017162985, and more precisely in steps 110 to 150 described in this application.
  • the acquired image, or of an image resulting from a previous iteration is propagated in the reconstruction plane, in this case the plane of the sample, at each iteration.
  • a complex image propagated in the plane of the sample is thus obtained.
  • a noise level in the reconstructed complex image is then determined, then a complex image is adjusted in the plane of the sample, making it possible to reduce the noise level in the complex image propagated in the plane of the sample.
  • the adjustment is carried out by minimizing a criterion quantifying a level of noise in the complex image propagated in the plane of the sample.
  • the adjustment notably consists in adjusting the phase of the exposure light wave, in the plane of the sample.
  • the complex image estimated in the detection plane, during each iteration is used, during the next iteration, by being propagated in the plane of the sample. The inventors have observed that the implementation of such an iterative algorithm leads to particularly efficient results.
  • an iterative algorithm can be implemented as described in WO2016189257. Such an algorithm assumes that an image of the sample is formed in several spectral bands.
  • the phase of the exposure light wave 14 is gradually adjusted in the detection plane.
  • the adjustment of the phase is carried out by iterations by averaging, during each iteration, the phase of light waves reconstructed in the plane of the sample, according to different spectral bands.
  • the adjustment of the phase is carried out by iteration so as to minimize, during each iteration, the noise of reconstruction of a complex image reconstructed in the plane of the sample.
  • observation image I 10 is an image making it possible to visually represent the complex reconstructed image A 10. It may be:
  • I 10 Im (A 10 ), Im designating the operator imaginary part;
  • an observation image is an image formed of scalar quantities obtained from a complex image, the latter being formed of complex quantities.
  • FIGS. 3B and 3C respectively represent an observation image I 10 corresponding to the module or to the phase of a part of a complex image A 10 reconstructed, in the plane of the sample, from the hologram represented on Figure 3A.
  • the observation image I 10 of FIG. 3B obtained by the module of the reconstructed complex image, makes it possible to separate each particle from one another. It makes it possible to select a particle of interest 10 p, i which one wishes to characterize.
  • Step 120 selection of a region of interest ROI, ⁇ , corresponding to the particle of interest 10 pi .
  • observation image I 10 is obtained from a complex image A 10 reconstructed in a reconstruction plane Pi 0 passing through the sample 10.
  • the spatial resolution of the image of observation I 10 allows an easy separation of the particles 10 p between them.
  • a user can select a particle.
  • the selection can also be made by a microprocessor, by applying an image segmentation algorithm, so as to isolate regions of interest from the background of the image.
  • the segmentation can be carried out by thresholding, for example an Otsu thresholding or a Bradley thresholding.
  • the region of interest ROh then corresponds to a particle, or to a group of particles close to each other, forming the same trace on the complex reconstructed image, the latter case corresponding in particular to the formation of a bacterial colony.
  • step 120 there is a region of interest ROh of the observation image / 10 , which corresponds to a particle of interest 10 p, i which one wishes to characterize.
  • the region of interest ROh can also be applied to the complex reconstructed image A 10 , so as to extract from this image only the region of interest corresponding to the particle of interest 10 pi .
  • the region of interest ROI is centered on the particle of interest 10 pi , or on the group of particles considered.
  • Step 130 Extraction of a part of the complex image located in the region of interest ROI, selected during step 120, so as to obtain a complex image extracted A 10 i .
  • the part of the image thus extracted forms a thumbnail.
  • Figures 3D and 3E respectively show the mod mod (A 10 i ) and the arg phase (A 10 i ) of the extracted complex image Zl 10 i .
  • the extracted complex image includes the region of interest ROh of the complex reconstructed image Aw.
  • the pixels arranged around the region of interest are representative of an average background level obtained in the reconstructed complex image A 10 .
  • the pixels of the extracted complex image A 10 i arranged around the region of interest ROI can be fixed at an arbitrary value, for example a gray level equal to 1.
  • the propagation plan can in particular be the detection plan, which is considered below. However, this is not necessary.
  • the propagation plane, in which the extracted complex image is propagated can be different from the detection plane.
  • the region of interest ROh is extracted from a complex image A 10 obtained according to a holographic reconstruction algorithm comprising a gradual adjustment of the phase of the exposure light wave. It can therefore be assumed that in the region of interest extracted, the value of the phase is correctly estimated. Also, the exposure light wave 14 is correctly described in the region of interest extracted ROh.
  • the region of interest ROh can then be propagated by simply using a holographic propagation operator h, known in the field of holography, for example a Fresnel operator, such as:
  • z represents a coordinate along the propagation axis Z.
  • the propagation can comprise a convolution of the complex image extracted, comprising the region of interest ROI ,, by the propagation operator h, so that:
  • a 0 is the elementary diffraction figure obtained in the detection plane Po;
  • a 10 i is the complex image extracted, comprising the region of interest ROh, from the reconstructed complex image A 10 .
  • the region of interest ROI, of the complex image A 10 is propagated in the propagation plane (in this example the propagation plane), so as to obtain an elementary diffraction pattern corresponding to the particle d interest isolated from other particles.
  • This step makes it possible to obtain an image representing the elementary diffraction figure A oi corresponding to the particle of interest 10 p, i without this figure being superimposed on the diffraction figures corresponding to the other particles 10 p of the sample, in particular the particles arranged in the vicinity of the particle of interest 10 p, i .
  • An elementary diffraction pattern is obtained, which allows a more reliable characterization of the particle of interest 10 pi .
  • the elementary diffraction figure A oi is a complex image, that is to say formed of complex amplitudes, from which we can extract the module, or the phase, or the real part, or the imaginary part, so as to obtain an observation diffraction figure I Q i .
  • FIG. 3F is an observation diffraction figure I Q i obtained from the module of an elementary diffraction figure A 0 i , the latter being obtained by propagation of the complex image extracted A 10 i represented in the 3D figures and 3E, in the propagation plane, which in this example is the detection plane.
  • the particles are not necessarily coplanar.
  • several observation images I 10 z are formed with each observation image being associated with a reconstruction distance z relative to the detection plane Po.
  • Each image d 'observation / 10 z results from a complex image A 10 z obtained by the implementation of an iterative holographic reconstruction algorithm from the image I 0 formed in the detection plane Po.
  • the difference between two distances of successive reconstruction z can be between a few pm and a few tens of pm.
  • the distance z can be determined by numerical focusing, consisting in determining the distance at which the trace of the particle of interest 10 p, i , on the different observation images / 10 z , is the sharpest.
  • the region of interest ROI, corresponding to each particle of interest 10 p, i is extracted from the observation image / 10 z. formed at the distance z t associated with the particle.
  • the propagation of the region of interest ROI is then carried out by taking into account, in the propagation operator, the propagation distance z t associated with the particle of interest 10 p, i .
  • the propagation of the complex image extracted is carried out by considering a constant and predetermined propagation distance.
  • the particles of interest 10 p, i are propagated according to different propagation planes.
  • the invention thus allows, for each particle of interest 10 p, i a formation of an elementary diffraction figure A oi taking into account the distance z ; between the particle of interest and the detection plane Po.
  • the particle of interest 10 pi is characterized using the elementary diffraction figure A oi resulting from step 140.
  • the characterization of the particle of interest 10 p, i is carried out from diffraction figures corresponding to known particles, the latter being either modeled or acquired experimentally.
  • the characterization can constitute a classification of the particle of interest 10 p, i from predetermined particle classes.
  • the classification can assume a learning phase, carried out using one or more training samples, comprising known particles.
  • the characterization may use deep learning type techniques, usually designated by the term "deep learning”.
  • a classification is implemented which supposes a reduction in the dimensionality of the elementary diffraction figure A oi .
  • a first solution is to perform a radial average of the elementary diffraction pattern, by considering for example the module or the phase of the diffraction pattern.
  • This solution is particularly suitable for spherical objects. Indeed, each diffraction figure has a certain symmetry around a center of the diffraction figure. It is possible to present the diffraction pattern according to a radial mean, consisting in averaging the value of the pixels located at the same distance from the center of the diffraction pattern.
  • FIG. 4 represents such a radial mean (curve a), obtained by considering the module of the elementary diffraction figure.
  • the radial mean takes the form of an intensity profile developed in the detection plane, transverse to the elementary diffraction pattern, and passing through the center of the latter.
  • the brace shows the part of the radial mean with a signal-to-noise ratio and sufficient spatial sampling to be able to be used to characterize the particle of interest.
  • the use of the radial mean makes it possible to bring back the information present in the elementary diffraction figure in the form of a function whose variable r represents the distance with respect to the center of the diffraction figure.
  • the variable r corresponds to the abscissa of Figure 4.
  • Another solution is a projection of an observation image resulting from the elementary diffraction figure A oi , according to a base of Zernike polynomials.
  • the elementary diffraction pattern is decomposed according to a predetermined number of Zernike polynomials Z TM n being an integer corresponding to the order of the polynomial, m being an integer such that m ⁇ n and such that n— m is even .
  • Zernike polynomials are known to those skilled in the art, and their use has been described in US8787633 or in WO2014184390.
  • the decomposition makes it possible to obtain coordinates in a base defined by the considered polynomials.
  • the decomposition is carried out under 15 polynomials, we obtain a vector Vi of dimension (15, 1).
  • the classification of the elementary diffraction figure A oi is carried out using the vector resulting from the decomposition.
  • one carries out a decomposition of the module and the phase of the elementary diffraction figure A oi one obtains a vector of dimension (30, 1).
  • geometric parameter it is understood a perimeter, a radius or diameter, an area, an eccentricity, an estimate of the volume from the area.
  • the geometric parameter of the particle can be obtained by considering the complex image A 10 reconstructed in the plane of the sample, during step 120, or an observation image I 10 obtained from the complex image reconstructed .
  • a dimension of the particle of interest has been estimated from the image of the module of the complex image extracted A 10 i represented in FIG. 3D.
  • an optical characteristic for example an absorbance level, a value of refractive index or of diffraction power.
  • the elementary diffraction figure A oi or its projection, whether it is a radial mean or a base of polynomials, can be compared to diffraction figures obtained experimentally using known calibration particles. It can also be compared to diffraction figures obtained by numerical modeling. According to such an embodiment, a database is created comprising modeled diffraction figures. For this, we take into account several parameter values of a particle. Then we model, by numerical modeling, a diffraction figure obtained at the level of the detection plane. Such modeling can notably be based on Mie theory.
  • Mie's theory is an elastic diffusion model allowing to obtain a solution to Maxwell's equations describing a light wave diffracted by a spherical particle illuminated by a monochromatic incident light wave of wavelength l.
  • Re and Im are respectively the real part and imaginary part operators.
  • the particle is also characterized by its size (radius or diameter).
  • the particles analyzed are spherical, or made spherical by the addition of a spherizing agent.
  • a progressive adjustment of the parameters of the modeled particle, in particular the refractive index and the size is carried out so that the modeled diffraction figure progressively approaches the elementary diffraction figure corresponding to the particle. of interest.
  • the progressive adjustment can be done by iteration, by determining, with each iteration, a difference between the elementary diffraction figure and a modeled diffraction figure. The difference can be gradually reduced by implementing a gradient descent type algorithm. This makes it possible to carry out a progressive adjustment of the modeling parameters so as to progressively reduce the difference between the modeled diffraction figure and the elementary diffraction figure.
  • the modeling parameters can be: the size (radius or diameter), the refractive index, and possibly the distance between the particle and the detection plane. The more the distance between the particle and the detection plane is known, the more precisely the elementary diffraction pattern is reconstructed.
  • curve b has been represented, corresponding to a radial average of the modulus of an elementary diffraction figure simulated by Mie theory, for a particle of radius 2.59 pm and of refractive index 1.43 . This illustrates the possibility of characterizing a particle of interest, from modeled elementary diffraction figures.
  • the classification of an elementary diffraction figure obtained for a particle of interest can be carried out by an algorithm of SVM type (Support Vector Machine), after a learning phase carried out on the basis of figures of diffraction models.
  • SVM type Small Vector Machine
  • Other classification algorithms notably supervised, for example by PCA (Principal Component Analysis), can also be applied.
  • modeled diffraction figures can also be envisaged during the characterization by a decomposition according to a base of polynomials.
  • the inventors have implemented a method as previously described for characterizing blood particles, in this case red blood cells.
  • Each sample consisted of blood diluted 1/600 th in a sphering reagent.
  • the concentration of red blood cells, before dilution, was 2.41 10 6 red blood cells per mm 3 .
  • the average globular volume was 92 pm 3 .
  • the sample extended over a range of distances between 1050 and 1200 ⁇ m from the image sensor. Steps 100 to 150, previously described, were applied. 1000 particles of interest have been distinguished, each of them corresponding to a red blood cell.
  • a distance z, of each particle of interest relative to the detection plane has been estimated, using complex images reconstructed at different distances.
  • An elementary diffraction figure A oi has been formed for each particle of interest, taking into account the distance having been associated with it.
  • the inventors have established a relationship between the refractive index, at 405 nm, and the hemoglobin concentration in a particle.
  • the radius we considered the radius, the refractive index (depending on the hemoglobin concentration) as well as the distance from the detection plane.
  • FIG. 5A represents a distribution of the hemoglobin level of the particles (ordinate axis) as a function of the distance from the detection plane (abscissa axis).
  • the hemoglobin level is expressed in g / dL.
  • FIG. 5B represents a distribution of the particle radius (ordinate axis) as a function of the distance from the detection plane (abscissa axis). The particle radius is expressed in pm.
  • FIG. 5C represents a histogram of the number of particles (ordinate axis) as a function of the distance from the detection plane (abscissa axis). The distance is expressed in pm.
  • the method described above was implemented on different types of blood particles (red blood cells, white blood cells, platelets) placed in a sample of blood purified in Dextran.
  • Dextran has the effect of causing aggregation of red blood cells, which leads to sedimentation of the latter.
  • the supernatant plasma depleted in red blood cell compared to the initial blood, is recovered. It is then diluted to l / 10 'th in PBS tampn.
  • the concentration of white blood cells, red blood cells and platelets was respectively 5.1 10 3 per mm 3 , 0.02 10 6 per mm 3 , 198.10 3 per mm 3 .
  • elementary diffraction figures have been formed by implementing steps 100 to 150 described above.
  • FIG. 5D positions each particle of interest characterized in a reference frame whose abscissa axis corresponds to the radius (in pm) and the ordinate axis represents the rate hemoglobin. This identifies red blood cells (set a), white blood cells (set b) and platelets (set c).
  • the inventors implemented the method as previously described on different samples, comprising different types of white blood cells (leukocytes), divided into four classes:
  • class 1 lymphocytes
  • class 2 monocytes
  • class 3 neutrophils
  • class 4 eosinophils.
  • the following table shows the classification results.
  • the classes associated with each row and each column correspond respectively to the real classes and to the classes determined by measurement. The classification performance was deemed satisfactory.
  • Figure 6 shows schematically another device allowing an implementation of the invention.
  • the device of Figure 6 includes an optical system 19 for image formation.
  • the optical system 19 defines an image plane and an object plane.
  • the optical system can be a lens or objective.
  • the image sensor When acquiring the image of the sample, the image sensor is arranged in a defocused configuration.
  • the detection plane is offset from the image plane and / or the plane along which the sample extends is offset from the object plane.
  • the offset is generally small, preferably being less than 1mm, and typically in the range 50 ⁇ m - 500 ⁇ m.
  • the invention may be implemented on different types of samples, for example in the field of diagnostics, biology, or environmental control, or in different industrial sectors, for example the food industry or the control of processes.

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Abstract

Procédé de caractérisation d'une particule présente (10p) dans un échantillon (10), l'échantillon s'étendant entre un capteur d'image (16) et une source de lumière (11), le capteur d'image s'étendant selon un plan de détection (Po), le procédé comportant: - illumination de l'échantillon par la source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant selon un axe de propagation (Z); - acquisition d'une image de l'échantillon par le capteur d'image (20), le capteur d'image étant exposé à une onde lumineuse d'exposition (14), l'image comportant une pluralité de figures de diffraction élémentaires, chaque figure de diffraction élémentaire correspondant à une particule; - à partir de l'image acquise, reconstruction d'une image complexe représentative d'une amplitude complexe de l'onde lumineuse d'exposition, dans une surface de reconstruction passant par l'échantillon; - sélection d'une région d'intérêt de l'image complexe, la région d'intérêt sélectionnée correspondant à une particule d'intérêt; - formation d'une image extraite à partir de la région d'intérêt sélectionnée lors de l'étape d); - caractérisation de la particule d'intérêt en fonction de la région d'intérêt ainsi extraite.

Description

Description
Titre : Procédé de caractérisation d'une particule à partir d'un hologramme.
DOMAINE TECHNIQUE
Le domaine technique de l'invention est la caractérisation de particules, par exemple des particules biologiques, à partir d'une image.
ART ANTERIEUR
L'imagerie holographique connaît, depuis plusieurs années, des développements importants, en particulier dans le domaine de l'analyse d'échantillons. Un grand nombre d'applications a été décrit, pour caractériser des échantillons, en particulier des échantillons destinés à des applications en biologie ou pour du diagnostic. De nombreuses publications concernent par exemple des échantillons comportant des particules, l'objectif étant de caractériser les particules.
Selon une configuration répandue, l'image de l'échantillon peut être acquise selon une configuration d'imagerie sans lentille, aucune optique de formation d'image n'étant disposée entre l'échantillon et le capteur d'image. Sur l'image acquise par le capteur d'image, chaque particule produit une figure de diffraction, cette dernière représentant une signature de la particule. Le document W02008090330 décrit une telle configuration, lorsque la source utilisée est une diode électroluminescente. Dans ce document, il est montré que cette modalité d'imagerie confère un champ d'observation élevé, et permet une identification rapide de cellules ou de bactéries à l'aide d'un dispositif simple.
Le document US7465560 décrit un dispositif permettant d'identifier des colonies bactériennes en fonction d'une figure de diffraction formée sur un capteur d'image. Dans ce document, la colonie bactérienne examinée est illuminée à l'aide d'un faisceau laser. Ce document montre qu'une figure de diffraction constitue une signature d'une colonie bactérienne. Une figure de diffraction peut faire l'objet d'une classification, par exemple en ayant recours à une décomposition selon des polynômes de Zernike. Cela est par exemple décrit dans US8787633 ou dans WO2014184390.
L'image acquise par le capteur d'image peut faire l'objet d'une reconstruction, dite reconstruction holographique, permettant d'obtenir une image plus nette des particules. Des algorithmes sophistiqués de propagation holographique, permettant d'obtenir une image, dite reconstruite, de l'échantillon, sont décrits dans WO2016189257 ou dans WO2017162985.
L'application de tels algorithmes peut permettre d'obtenir une image complexe de l'échantillon. Cette dernière peut faire l'objet d'une segmentation, à des fins de numération de particules, comme décrit dans WO2018115734. En formant une pluralité d'images complexes de l'échantillon, il est possible d'établir des profils parallèlement à l'axe de propagation de la lumière, pour caractériser des particules. Cela est par exemple décrit dans WO2018215337.
Une difficulté peut survenir lorsque l'échantillon comporte une concentration élevée de particules. En effet, sur l'image acquise par le capteur d'image, les figures de diffraction correspondant respectivement à chaque particule, peuvent se superposer. De ce fait, une caractérisation des particules, à partir de leurs figures de diffractions respectives, devient plus difficile à mettre en oeuvre.
Les inventeurs ont cherché à perfectionner les procédés décrits ci-avant, en permettant une caractérisation de particules à partir de figures de diffraction associées à chacune d'entre elles. Le procédé est particulièrement adapté à un échantillon dans lequel du fait de la densité des particules, les figures de diffraction associées à chacune d'entre elles se superposent.
EXPOSE DE L'INVENTION
Un premier objet de l’invention est un procédé de caractérisation d’une particule présente dans un échantillon l’échantillon s'étendant entre un capteur d'image et une source de lumière, le capteur d'image s'étendant selon un plan de détection, le procédé comportant les étapes suivantes:
a) illumination de l'échantillon par la source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente se propageant selon un axe de propagation;
b) acquisition d'une image de l'échantillon par le capteur d'image, le capteur d'image étant exposé à une onde lumineuse d'exposition, l'image comportant une pluralité de figures de diffraction élémentaires, chaque figure de diffraction élémentaire correspondant à une particule ;
c) à partir de l'image acquise, reconstruction d'une image complexe représentative d'une amplitude complexe de l'onde lumineuse d'exposition, dans au moins une surface de reconstruction passant, de préférence, par l'échantillon, la reconstruction étant effectuée en mettant en oeuvre un algorithme de reconstruction itératif, l'algorithme comportant, lors de chaque itération, une mise à jour d'une phase de l'onde lumineuse d'exposition dans le plan de détection ou dans la surface de reconstruction;
d) sélection d'une région d'intérêt de l'image complexe, la région d'intérêt sélectionnée correspondant à une particule d'intérêt;
e) formation d'une image complexe extraite à partir de la région d'intérêt sélectionnée lors de l'étape d) ;
f) application d'un opérateur de propagation à l'image complexe extraite formée lors de l'étape e), de façon à obtenir, dans un plan de propagation, une figure de diffraction élémentaire de la particule sélectionnée lors de l'étape c), de telle sorte que la figure de diffraction élémentaire obtenue soit isolée de figures de diffraction élémentaires d'autres particules présentes dans l'échantillon ;
g) caractérisation de la particule d'intérêt en fonction de la figure de diffraction élémentaire résultant de l'étape f).
Lors de l'étape f), la figure de diffraction élémentaire peut prendre la forme d'une image complexe. On peut alors obtenir une représentation de la figure élémentaire, en considérant le module ou la phase de l'image complexe, ou encore sa partie réelle ou sa partie imaginaire.
Lors de l'étape f), le plan de propagation peut être le plan de détection. Mais il peut également s'agir d'un plan situé à une distance de l'échantillon inférieure ou supérieur à la distance entre l'échantillon et le plan de détection. Selon un mode de réalisation,
l'étape c) comprend, à chaque itération, une application d'un opérateur de propagation holographique à une image de l'onde lumineuse d'exposition, dans le plan de détection, de façon à obtenir une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition, dans au moins un plan selon lequel s'étend l'échantillon, formant l'image complexe;
- l'étape d) comporte, à partir de l'image complexe reconstruite, l'obtention d'une l'image d'observation, la particule d'intérêt étant sélectionnée sur l'image d'observation.
L'étape f) peut comprendre l'application d'un opérateur de propagation holographique à la région d'intérêt sélectionnée lors de l'étape e), de façon à obtenir la figure de diffraction élémentaire, correspondant à la particule d'intérêt, dans le plan de propagation, la partie de l'image complexe reconstruite, située en dehors de la région d'intérêt n'étant pas propagée. Le procédé peut comporter une estimation d'une distance entre la particule d'intérêt et le plan de détection, de telle sorte que lors de l'étape f), l'opérateur de propagation prenne en compte la distance ainsi estimée.
Lors de l'étape f), la propagation est effectuée en considérant une distance de propagation prédéterminée.
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape f), on obtient une figure de diffraction élémentaire complexe, dans le plan de reconstruction, de la particule sélectionnée lors de l'étape c). Lors de l'étape g), la caractérisation est alors effectuée à partir de la phase ou du module de la figure de diffraction élémentaire complexe, ou de sa partie réelle ou de sa partie imaginaire.
L'étape g) peut comporter la détermination d'un profil axial, représentant une moyenne radiale de la figure de diffraction élémentaire.
L'étape g) peut comporter :
une comparaison de la figure de diffraction élémentaire, obtenue lors de l'étape f), avec au moins une figure de diffraction correspondant à une particule connue;
ou une comparaison de la figure de diffraction élémentaire, obtenue lors de l'étape f), avec au moins une figure de diffraction modélisée en considérant une particule dont l'indice de réfraction et/ou la taille sont connus ;
ou une classification de la figure de diffraction élémentaire, obtenue lors de l'étape f), en prenant en compte des figures de diffraction obtenues à l'aide de particules connues, ou des figures de diffraction modélisées, au cours d'une phase d'apprentissage.
Selon un mode de réalisation,
l'étape g) comporte une décomposition de la figure de diffraction élémentaire, selon une base de polynômes de Zernike, de manière à obtenir des coordonnées de la figure de diffraction élémentaire dans la base;
la caractérisation de la particule d'intérêt est effectuée en fonction des coordonnées de la figure de détection élémentaire.
Lors de l'étape g), la caractérisation peut être réalisée en fonction de figures de diffraction modélisées, à chaque figure de diffraction correspondant une particule dont un paramètre est connu, le paramètre étant une taille et/ou un indice de réfraction, la caractérisation visant à déterminer une valeur du paramètre pour la particule d'intérêt analysée. La modélisation peut notamment se baser sur une hypothèse selon laquelle la particule est sphérique. Le procédé peut comporter un ajustement itératif du paramètre de la particule, chaque itération comprenant :
i) une prise en compte d'un paramètre ou d'un ensemble de paramètres de la particule ; ii) une obtention d'une figure de diffraction modélisée selon le paramètre ou l'ensemble de paramètres pris en compte;
iii) une détermination d'un écart entre la figure de diffraction modélisée et la figure de diffraction élémentaire résultant de l'étape f);
iv) une estimation d'un paramètre, ou d'un ensemble de paramètres, visant à réduire l'écart ainsi déterminé, le paramètre ou l'ensemble de paramètres estimés étant pris en compte lors de l'itération suivante.
Selon un mode de réalisation, lors des étapes i) à iv), on prend en compte un ensemble de paramètres, l'ensemble de paramètre comportant une distance entre la particule et le plan de détection.
Un deuxième objet de l'invention est un dispositif d'observation d'un échantillon, l'échantillon comportant des particules, le dispositif comportant :
une source de lumière, configurée pour illuminer l'échantillon ;
un support d'échantillon, configuré pour recevoir l'échantillon ;
un capteur d'image, disposé de telle sorte que lorsque l'échantillon est disposé sur le support, il s'étend entre le capteur d'image et la source de lumière, le capteur d'image étant configuré pour acquérir une image de l'échantillon ;
un processeur, configuré pour mettre en oeuvre les étapes c) à f) ou c) à g) d'un procédé selon le premier objet de l'invention, à partir d'une image acquise par le capteur d'image.
Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d'image n'est disposée entre le capteur d'image et le processeur.
Selon un mode de réalisation, le dispositif comporte un système optique s'étendant entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique définissant un plan image et un plan objet, le dispositif comportant un moyen d'ajustement du système optique, ou de l'échantillon, ou du capteur d'image, de telle sorte que :
le plan de détection soit décalé du plan image ;
et/ou le plan objet soit décalé d'un plan d'échantillon, selon lequel s'étend l'échantillon. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous.
FIGURES
La figure 1 montre un premier dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention.
La figure 2 montre les principales étapes d'un procédé mettant en oeuvre l'invention
La figure 3A est un exemple d'image acquise par le capteur.
La figure 3B est une image du module d'une image complexe reconstruite, dans un plan selon lequel s'étend l'échantillon, à partir de l'image acquise par le capteur.
La figure 3C est une image de la phase d'une image complexe reconstruite, dans un plan selon lequel s'étend l'échantillon, à partir de l'image acquise par le capteur.
La figure 3D est une image du module d'une image complexe extraite à partir d'une région d'intérêt, correspondant à une particule d'intérêt, de l'image complexe reconstruite.
La figure 3E est une image de la phase d'une image complexe extraite à partir d'une région d'intérêt, correspondant à une particule d'intérêt, de l'image complexe reconstruite.
La figure 3F montre une image du module d'une figure de diffraction propagée à partir de l'image complexe extraite.
La figure 4 montre un exemple de moyenne radiale représentative du module d'une figure de diffraction.
La figure 5A illustre des résultats d'essais réalisés sur un échantillon comportant des particules sanguines.
La figure 5B illustre des résultats d'essais réalisés sur un échantillon comportant des particules sanguines.
La figure 5C illustre des résultats d'essais réalisés sur un échantillon comportant des particules sanguines.
La figure 5D illustre des résultats d'essais réalisés sur un échantillon comportant des particules sanguines.
La figure 6 montre un autre dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention.
EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est configurée pour émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale d’illumination Dl.
L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Il comprend notamment un milieu 10m dans lequel baignent des particules 10p. Le milieu 10m peut être un milieu liquide. Il peut comprendre un liquide corporel, obtenu par exemple à partir de sang ou d’urine ou de lymphe ou de liquide céphalorachidien. Il peut également s'agir d'un milieu de culture, comportant des nutriments permettant le développement de microorganismes ou de cellules. Par particule, on entend notamment, et de façon non exhaustive :
une cellule, qu'il s'agisse d'une cellule de culture ou une cellule corporelle, par exemple une cellule sanguine ;
un microorganisme, par exemple une bactérie ou une levure ou une microalgue ; une particule solide, par exemple une microbille, la microbille pouvant être fonctionnalisée, de façon à favoriser un greffage avec un analyte ;
une particule formant une émulsion dans le milieu 10m, en particulier une particule insoluble dans le milieu 10m, un exemple étant une gouttelette lipidique dans un milieu aqueux.
Une particule 10p peut être solide ou liquide. L'invention s'adresse plus particulièrement à des particules dont la taille est inférieure à 1 mm, voire à 100 pm, voire 50 pm. Par taille de particule, on entend un diamètre ou une diagonale.
Par caractériser, on entend notamment :
une déterminer la nature d'une particule, c'est-à-dire classer cette particule parmi une ou plusieurs classes prédéterminées ;
déterminer l’état d'une particule, parmi un ou plusieurs états prédéterminés ;
estimer une taille d'une particule, ou sa forme, ou son volume ou tout autre paramètre géométrique ;
estimer une propriété optique d'une ou plusieurs particules, par exemple l'indice de réfraction ou une propriété de transmission optique, ou une épaisseur optique (produit de l’épaisseur par l’indice de réfraction) ;
le procédé peut également comprendre un dénombrement de particules en fonction de leur caractérisation.
L'échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une chambre fluidique de type Countess ou Cellvision, Gene Frame® d'épaisseur e=100 pm. L'épaisseur e de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation, varie typiquement entre 10 pm et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 pm et 500 pm. L'échantillon s'étend selon un plan Pi0, dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Le plan de l’échantillon est défini par les axes X et Y représentés sur la figure 1. L’échantillon est maintenu sur un support 10s à une distance d d’un capteur d’image 16. La concentration de particules peut varier entre 50 par microlitre et 100000 par microlitre.
La distance D entre la source de lumière 11 et la chambre fluidique 15 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière 11, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre la chambre fluidique 15 et la source de lumière. Sur la figure 1, la source de lumière est une diode électroluminescente. Elle est généralement associée à diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 pm et 1 mm, de préférence entre 50 pm et 500 pm. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorla bs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 pm. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Le dispositif représenté sur la figure 1 comporte également un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11 selon un cône d'angle a. Le recours à un tel diffuseur est décrit dans WO2016078946. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 80°. Alternativement, la source de lumière peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n’est pas utile de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur. Lorsque la source de lumière est une source laser, elle est avantageusement utilisée comme décrit dans la demande WO2017109428.
De préférence, la bande spectrale d'émission Dl de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm, voire inférieure à 50 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale.
L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et le capteur d'image 16 précédemment évoqué. Le capteur d’image 16 définit un plan de détection Po, s'étendant de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au plan Pio selon lequel s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise.
Le capteur d'image 16 est apte à former une image lo de l’échantillon 10 selon le plan de détection Po. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image 16 comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection Po s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 pm et 2 cm, de préférence comprise entre 100 pm et 2 mm.
On remarque, dans ce mode de réalisation, l'absence d'optique de grossissement ou de formation d’image entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image, leur fonction étant d’optimiser l’efficacité de détection.
Comme évoqué dans les demandes citées dans l’art antérieur, sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les particules 10p présentes dans l’échantillon peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection Po, des interférences, en particulier avec une partie 12’ de l'onde lumineuse incidente 12 transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 16, désignée par le terme "onde d’exposition", peut comprendre :
une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par chaque particule de l’échantillon ;
une composante 12’ résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l’échantillon. Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection. Aussi, l’image acquise par le capteur d’image comporte des figures d’interférences (ou figures de diffraction), chaque figure d’interférence pouvant être associée à une particule 10p de l’échantillon.
Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image l0 acquise par le capteur d'image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20.
Lorsque les figures d’interférence sont suffisamment éloignées les unes des autres, chaque figure d’interférence peut permettre de caractériser la particule à laquelle elle est associée. Cela est décrit dans les documents US8787633 ou WO2014184390 cités dans l’art antérieur. Cependant, lorsque la quantité de particules présente dans l’échantillon est importante, les figures d’interférence se superposent, ce qui ne permet plus une caractérisation correcte en mettant en oeuvre les méthodes de l’art antérieur.
Les inventeurs ont conçu une méthode convenant particulièrement à la situation dans laquelle les figures de diffraction élémentaire de chaque particule se superposent. Les principales étapes de la méthode sont décrites sur la figure 2. Ces étapes sont décrites en lien avec les figures 3A à 3F. Ces figures ont été obtenues en utilisant un échantillon de sang purifié avec du Dextran. Le Dextran a pour effet d’entraîner une agrégation des globules rouges, ce qui entraîne une sédimentation de ces derniers. Le plasma surnageant, appauvri en globule rouge par rapport au sang initial, est récupéré. Il est ensuite dilué dans un tampon PBS (Phosphate Buffer Saline - Tampon Phosphate Salin) à pH physiologique. Les conditions expérimentales étant les suivantes source de lumière : source laser à 405 nm ;
capteur d’image : capteur CMOS IDS UI-1924LE, comportant 3840 par 2748 pixels, la taille de chaque pixel étant de 1.67 pm x 1.67 pm, conférant une surface utile de détection d’environ 30 mm2 ;
distance entre l’échantillon et le capteur d’image : entre 1 mm et 1.5 mm.
Etape 100 : acquisition de l’image I0 par le capteur d’image. L’image I0 comporte différentes figures de diffraction élémentaires se superposant l’une à l’autre. La figure 3A représente une telle image. A l’évidence, les méthodes de caractérisation de figures de diffraction présentées dans les documents de l’art antérieur ne sont pas applicables, du fait de la densité trop importante des particules dans l’échantillon.
Etape 110 : reconstruction d’une image A10 complexe dans le plan de l’échantillon. A partir de l’image I0 obtenue lors de l’étape 100, on utilise un algorithme de reconstruction holographique pour obtenir une image complexe A10, de préférence dans un plan de reconstruction Pi0, selon lequel s'étend l'échantillon. L'image complexe A10 correspond à une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition 14 dans le plan de reconstruction considéré. Cette étape peut notamment mettre en œuvre un algorithme itératif tel que décrit dans WO2017162985, et plus précisément dans les étapes 110 à 150 décrites dans cette demande.
Au cours de cet algorithme itératif, on effectue, à chaque itération, une propagation de l'image acquise, ou d'une image résultant d'une itération précédente, dans le plan reconstruction, en l'occurrence le plan de l'échantillon. On obtient ainsi une image complexe propagée dans le plan de l'échantillon. On détermine alors un niveau de bruit dans l'image complexe reconstruite, puis on ajuste une image complexe, dans le plan de l'échantillon, permettant de réduire le niveau de bruit dans l'image complexe propagée dans le plan de l'échantillon. L'ajustement est réalisé en minimisant un critère quantifiant un niveau de bruit dans l'image complexe propagée dans le plan de l'échantillon. L'ajustement consiste notamment à ajuster la phase de l'onde lumineuse d'exposition, dans le plan de l'échantillon. L'image complexe estimée dans le plan de détection, lors de chaque itération, est utilisée, lors de l'itération suivante, en étant propagée dans le plan de l'échantillon. Les inventeurs ont observé que la mise en œuvre d'un tel algorithme itératif conduisait à des résultats particulièrement performants.
De façon alternative, on peut mettre en œuvre un algorithme itératif tel que décrit dans WO2016189257. Un tel algorithme suppose qu'une image de l'échantillon soit formée dans plusieurs bandes spectrales.
Selon de tels algorithmes, on ajuste progressivement la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14, dans le plan de détection. Dans WO2016189257, l'ajustement de la phase est effectué par itérations en moyennant, au cours de chaque itération, la phase d'ondes lumineuses reconstruites dans le plan de l'échantillon, selon différentes bandes spectrales. Dans WO2017162985, l'ajustement de la phase est effectué par itération de façon à minimiser, lors de chaque itération, le bruit de reconstruction d'une image complexe reconstruite dans le plan de l'échantillon.
Suite à la mise en œuvre de l'algorithme de reconstruction holographique, on peut obtenir une image /10, dite image d'observation de l'échantillon, à partir de l'image complexe reconstruite /10. L'image d'observation I10 est une image permettant de représenter visuellement l'image complexe reconstruite A10. Il peut s'agir :
d'une image du module de l'image complexe reconstruite : I10 = mod(A10 ), mod désignant l'opérateur module ;
ou d'une image de la phase de l'image complexe reconstruite : I10 = arg(A10), arg désignant l'opérateur argument ; ou d'une image de la partie réelle de l'image complexe reconstruite : I10 = Re(A10 ), Re désignant l'opérateur partie réelle;
ou d'une image de la partie imaginaire de l'image complexe reconstruite : I10 = Im(A10), Im désignant l'opérateur partie imaginaire;
ou une combinaison des images précédemment citées.
D'une façon générale, une image d'observation est une image formée de grandeurs scalaires obtenues à partir d'une l'image complexe, cette dernière étant formée de grandeurs complexes.
Les figures 3B et 3C représentent respectivement une image d'observation I10 correspondant au module ou à la phase d'une partie d'une image complexe A10 reconstruite, dans le plan de l'échantillon, à partir de l'hologramme représenté sur la figure 3A. L'image d'observation I10 de la figure 3B, obtenue par le module de l'image complexe reconstruite, permet de séparer chaque particule l'une de l'autre. Elle permet de sélectionner une particule d'intérêt 10p,i que l'on souhaite caractériser.
Etape 120 : sélection d'une région d'intérêt ROI ,·, correspondant à la particule d'intérêt 10p i.
Un intérêt de l'image d'observation I10 est qu'elle est obtenue à partir d'une image complexe A10 reconstruite dans un plan de reconstruction Pi0 passant par l'échantillon 10. La résolution spatiale de l'image d'observation I10 permet une séparation aisée des particules 10p entre elles. A partir de l'image d'observation /10, un utilisateur peut sélectionner une particule. La sélection peut également se faire par un microprocesseur, en appliquant un algorithme de segmentation d'image, de façon à isoler des régions d'intérêt du fond de l'image. La segmentation peut être réalisée par seuillage, par exemple un seuillage d'Otsu ou un seuillage de Bradley. La région d'intérêt ROh correspond alors à une particule, ou à un groupe de particules rapprochées les unes des autres, formant une même trace sur l'image complexe reconstruite, ce dernier cas correspondant notamment à la formation d'une colonie bactérienne.
A l'issue de l'étape 120, on dispose d'une région d'intérêt ROh de l'image d'observation /10, qui correspond à une particule d'intérêt 10p,i que l'on souhaite caractériser. La région d'intérêt ROh peut également être appliquée à l'image complexe reconstruite A10, de façon à extraire, de cette image, uniquement la région d'intérêt correspondant à la particule d'intérêt 10p i.
De préférence, la région d'intérêt ROI , est centrée sur la particule d'intérêt 10p i, ou sur le groupe de particules considéré.
Etape 130 Extraction d'une partie de l'image complexe située dans la région d'intérêt ROI , sélectionnée lors de l'étape 120, de façon à obtenir une image complexe extraite A10 i. La partie de l'image ainsi extraite forme une vignette. Les figures 3D et 3E montrent respectivement le module mod(A10 i) et la phase arg(A10 i) de l'image complexe extraite Zl10 i.Sur ces figures, l'image complexe extraite comporte la région d'intérêt ROh de l'image complexe reconstruite Aw. Les pixels disposés autour de la région d'intérêt sont représentatifs d'un niveau de fond moyen obtenu dans l'image complexe reconstruite A10. De façon alternative, les pixels de l'image complexe extraite A10 i disposés autour de la région d'intérêt ROI , peuvent être fixés à une valeur arbitraire, par exemple un niveau de gris égal à 1. Etape 140
Propagation, dans un plan de propagation, de l'image complexe extraite A10 i. Le plan de propagation peut notamment être le plan de détection, ce qui est considéré ci-dessous. Cependant, cela n'est pas nécessaire. Le plan de propagation, dans lequel l'image complexe extraite est propagée, peut être différent du plan de détection. La région d'intérêt ROh est extraite à partir d'une image complexe A10 obtenue selon un algorithme de reconstruction holographique comportant un ajustement progressif de la phase de l'onde lumineuse d'exposition. On peut donc supposer que dans la région d'intérêt extraite, la valeur de la phase est correctement estimée. Aussi, l'onde lumineuse d'exposition 14 est décrite de façon correcte dans la région d'intérêt extraite ROh. La région d'intérêt ROh peut alors être propagée en utilisant simplement un opérateur de propagation holographique h, connu dans le domaine de l'holographie, par exemple un opérateur de Fresnel, tel que :
x, y désignent des coordonnées dans le plan de détection Po;
z représente une coordonnée selon l'axe de propagation Z.
La propagation peut comprendre une convolution de l'image complexe extraite, comportant la région d'intérêt ROI,, par l'opérateur de propagation h, de telle sorte que :
A0,i O, y, z) = A10 i (x, y, z) * h
où :
A0 est la figure de diffraction élémentaire obtenue dans le plan de détection Po ;
A10 i est l'image complexe extraite, comportant la région d'intérêt ROh, de l'image complexe reconstruite A10. Selon cette étape, seule la région d'intérêt ROI , de l'image complexe A10 est propagée dans le plan de propagation (dans cet exemple le plan de propagation), de façon à obtenir une figure de diffraction élémentaire correspondant à la particule d'intérêt isolée des autres particules.
Cette étape permet d'obtenir une image représentant la figure de diffraction élémentaire Ao i correspondant à la particule d'intérêt 10p,i sans que cette figure soit superposée aux figures de diffraction correspondant aux autres particules 10p de l'échantillon, en particulier les particules disposées dans le voisinage de la particule d'intérêt 10p,i. On obtient une figure de diffraction élémentaire, ce qui permet une caractérisation plus fiable de la particule d'intérêt 10p i. La figure de diffraction élémentaire Ao i est une image complexe, c'est-à-dire formée d'amplitudes complexes, dont on peut extraire le module, ou la phase, ou la partie réelle, ou la partie imaginaire, de façon à obtenir une figure de diffraction d'observation IQ i.
La figure 3F est une figure de diffraction d'observation IQ i obtenue à partir du module d'une figure de diffraction élémentaire A0 i, cette dernière étant obtenue par propagation de l'image complexe extraite A10 i représentée sur les figures 3D et 3E, dans le plan de propagation, qui est dans cet exemple le plan de détection.
Les particules ne sont pas forcément coplanaires. Aussi, selon un mode de réalisation, au cours de l'étape 110, on forme plusieurs images d'observations I10 z à chaque image d'observation étant associée une distance de reconstruction z par rapport au plan de détection Po. Chaque image d'observation /10 z résulte d'une image complexe A10 z obtenue par la mise en oeuvre d'un algorithme itératif de reconstruction holographique à partir de l'image I0 formée dans le plan de détection Po. L'écart entre deux distances de reconstruction z successives peut être compris entre quelques pm et quelques dizaines de pm. Pour chaque particule d'intérêt 10p,i on peut déterminer une distance zt par rapport au plan de détection. La distance z, peut être déterminée par une focalisation numérique, consistant à déterminer la distance à laquelle la trace de la particule d'intérêt 10p,i, sur les différentes images d'observation /10 z, est la plus nette. Selon ce mode de réalisation, la région d'intérêt ROI , correspondant à chaque particule d'intérêt 10p,i est extraite de l'image d'observation /10 z. formée à la distance zt associée à la particule.
Lors de l'étape 140, la propagation de la région d'intérêt ROI , est alors effectuée en prenant en compte, dans l'opérateur de propagation, la distance de propagation zt associée à la particule d'intérêt 10p,i. De façon alternative, quelle que soit la distance z; associée à la particule d'intérêt 10p i, la propagation de l'image complexe extraite est réalisée en considérant une distance de propagation constante et prédéterminée. Ainsi, en fonction de la distance zt qui leur est associée, les particules d'intérêt 10p,i sont propagées selon différents plans de propagation.
L'invention permet ainsi, pour chaque particule d'intérêt 10p,i une formation d'une figure de diffraction élémentaire Ao i en prenant en compte la distance z; entre la particule d'intérêt et le plan de détection Po.
Etape 150. Caractérisation
Au cours de cette étape, la particule d'intérêt 10p i est caractérisée en utilisant la figure de diffraction élémentaire Ao i résultant de l'étape 140.
La caractérisation de la particule d'intérêt 10p,i est effectuée à partir de figures de diffraction correspondant à des particules connues, ces dernières étant soit modélisées, soit acquises de façon expérimentale.
La caractérisation peut constituer en une classification de la particule d'intérêt 10p,i parmi des classes de particules prédéterminées. La classification peut supposer une phase d'apprentissage, effectuée en utilisant un ou plusieurs échantillons d'apprentissage, comportant des particules connues.
La caractérisation peut faire appel à des techniques de type apprentissage profond, usuellement désignées par le terme "deep learning".
Selon un mode de réalisation, on met en oeuvre une classification supposant une réduction de la dimensionnalité de la figure de diffraction élémentaire Ao i.
Une première solution est d'effectuer une moyenne radiale de la figure de diffraction élémentaire, en considérant par exemple le module ou la phase de la figure de diffraction. Cette solution est particulièrement adaptée aux objets sphériques. En effet, chaque figure de diffraction présente une certaine symétrie autour d'un centre de la figure de diffraction. Il est possible de présenter la figure de diffraction selon une moyenne radiale, consistant à effectuer une moyenne de la valeur des pixels situés à une même distance du centre de la figure de diffraction. La figure 4 représente une telle moyenne radiale (courbe a), obtenue en considérant le module de la figure de diffraction élémentaire. La moyenne radiale prend la forme d'un profil d'intensité élaboré dans le plan de détection, transversalement à la figure de diffraction élémentaire, et passant par le centre de cette dernière. Sur la figure 4, l'accolade montre la partie de la moyenne radiale présentant un rapport signal à bruit et un échantillonnage spatial suffisants pour pouvoir être utilisée afin de caractériser la particule d'intérêt. L'utilisation de la moyenne radiale permet de ramener l'information présente dans la figure de diffraction élémentaire sous la forme d'une fonction dont la variable r représente la distance par rapport au centre de la figure de diffraction. La variable r correspond à l'abscisse de la figure 4.
Une autre solution est une projection d'une image d'observation résultant de la figure de diffraction élémentaire Ao i, selon une base de polynômes de Zernike. Dans ce cas, la figure de diffraction élémentaire est décomposée selon un nombre prédéterminé de polynômes de Zernike Z™ n étant un entier correspondant à l'ordre du polynôme, m étant un entier tel que m < n et tel que n— m est pair.
Les polynômes de Zernike sont connus de l'homme du métier, et leur utilisation a été décrite dans US8787633 ou dans WO2014184390. On peut par exemple obtenir, à partir de la figure de diffraction élémentaire Ao i, deux images d'observation représentant respectivement le module et la phase de la figure de diffraction élémentaire. Chaque image est décomposée selon les 15 premiers polynômes de Zernike
y 0 y— 1 y y— 2 y 0 y y— 3 y— 1 y y— 4 y— 2 y 0 y y
3 3 / ^4
La décomposition permet d'obtenir des coordonnées dans une base définie par les polynômes considérés. Lorsque la décomposition est effectuée sous 15 polynômes, on obtient un vecteur Vi de dimension (15, 1). La classification de la figure de diffraction élémentaire Ao i est effectuée en utilisant le vecteur résultant de la décomposition. Lorsqu'on effectue une décomposition du module et de la phase de la figure de diffraction élémentaire Ao i, on obtient un vecteur de dimension (30, 1).
On peut ajouter, au vecteur issu de la décomposition dans la base de polynômes, un terme représentant une dimension ou, de façon plus générale, un paramètre géométrique de la particule d'intérêt. Par paramètre géométrique, il est entendu un périmètre, un rayon ou diamètre, une aire, une excentricité, une estimation du volume à partir de l'aire. Le paramètre géométrique de la particule peut être obtenu en considérant l'image complexe A10 reconstruite dans le plan de l'échantillon, lors de l'étape 120, ou une image d'observation I10 obtenue à partir de l'image complexe reconstruite. Dans l'exemple représenté en lien avec les figures 3A à 3F, on a estimé une dimension de la particule d'intérêt à partir de l'image du module de l'image complexe extraite A10 i représentée sur la figure 3D. On peut également ajouter, au vecteur issu de la décomposition dans la base de polynômes, une caractéristique optique, par exemple un niveau d'absorbance, une valeur d'indice de réfraction ou de pouvoir de diffraction.
La figure de diffraction élémentaire Ao i, ou sa projection, qu'il s'agisse d'une moyenne radiale ou d'une base de polynômes, peut être comparée à des figures de diffraction obtenues expérimentalement en utilisant des particules de calibration connues. Elle peut également être comparée à des figures de diffraction obtenues par modélisation numérique. Selon un tel mode de réalisation, on constitue une base de données comportant des figures de diffraction modélisées. Pour cela, on prend en compte plusieurs valeurs de paramètres d'une particule. Puis on modélise, par une modélisation numérique, une figure de diffraction obtenue au niveau du plan de détection. Une telle modélisation peut notamment se basée sur la théorie de Mie. La théorie de Mie est un modèle de diffusion élastique permettant d'obtenir une solution aux équations de Maxwell décrivant une onde lumineuse diffractée par une particule sphérique illuminée par une onde lumineuse incidente monochromatique de longueur d'onde l. Outre sa forme sphérique, la particule est caractérisée par un indice de réfraction n, ce dernier pouvant notamment être un indice de réfraction complexe : n = Re(n) + jlm(n),
Avec j2 = -1. Re et Im sont respectivement les opérateurs partie réelle et partie imaginaire. La particule est également caractérisée par sa taille (rayon ou diamètre).
Lorsqu'on utilise des figures de diffraction modélisées par la théorie de Mie, il est préférable que les particules analysées soient sphériques, ou rendues sphériques par l'adjonction d'un agent sphérisant.
Selon une variante, on réalise un ajustement progressif des paramètres de la particule modélisée, en particulier l'indice de réfraction et la taille, de façon à ce que la figure de diffraction modélisée se rapproche progressivement de la figure de diffraction élémentaire correspondant à la particule d'intérêt. L'ajustement progressif peut se faire par itération, en déterminant, à chaque itération, un écart entre la figure de diffraction élémentaire et une figure de diffraction modélisée. L'écart peut être progressivement réduit en mettant en oeuvre un algorithme de type descente de gradient. Cela permet d'effectuer un ajustement progressif des paramètres de modélisation de façon à réduire progressivement l'écart entre la figure de diffraction modélisée et la figure de diffraction élémentaire. Les paramètres de modélisation peuvent être : la taille (rayon ou diamètre), l'indice de réfraction, et éventuellement la distance entre la particule et le plan de détection. Plus la distance entre la particule et le plan de détection est connue, plus la figure de diffraction élémentaire est reconstruite de façon précise.
Sur la figure 4, on a représenté une courbe (courbe b), correspondant à une moyenne radiale du module d'une figure de diffraction élémentaire simulée par la théorie de Mie, pour une particule de rayon 2.59 pm et d'indice de réfraction 1.43. Cela illustre la possibilité de caractériser une particule d'intérêt, à partir de figures de diffraction élémentaires modélisées.
Par ailleurs, le fait de pouvoir modéliser une figure de diffraction élémentaire permet de modéliser différentes particules, de différents paramètres, en particulier la taille et l'indice de réfraction. Cela laisse également la possibilité d'effectuer des interpolations entre des figures de diffraction élémentaires modélisées entre deux valeurs différentes d'un même paramètre.
La classification d'une figure de diffraction élémentaire obtenue pour une particule d'intérêt, peut être effectuée par un algorithme de type SVM (Support Vector Machine - Machines à Supports de Vecteurs), après une phase d'apprentissage réalisée sur la base de figures de diffraction modélisées. D'autres algorithmes de classification, notamment supervisés, par exemple par PCA (Principal Component Analysis - Analyse en Composantes Principales), peuvent également être appliqués.
Le recours à des figures de diffraction modélisées peut également être envisagé lors de la caractérisation par une décomposition selon une base de polynômes.
Les inventeurs ont mis en oeuvre un procédé tel que précédemment décrit pour caractériser des particules sanguines, en l'occurrence des globules rouges. Chaque échantillon était constitué de sang dilué au l/600'eme dans un réactif sphérisant. La concentration en globules rouges, avant dilution, était de 2.41 106 globules rouges par mm3. Le volume globulaire moyen était de 92 pm3. L'échantillon s'étendait selon une plage de distances comprises entre 1050 et 1200 pm par rapport au capteur d'image. Les étapes 100 à 150, précédemment décrites, ont été appliquées. On a distingué 1000 particules d'intérêt, chacune d'entre elle correspondant à un globule rouge. On a estimé, à l'aide d'images complexes reconstruites à différentes distances, une distance z, de chaque particule d'intérêt par rapport au plan de détection. Une figure de diffraction élémentaire Ao i a été formée pour chaque particule d'intérêt, en tenant compte de la distance lui ayant été associée.
On a ensuite déterminé un profil radial formant une moyenne radiale de chaque figure de diffraction élémentaire, tel que celui décrit en lien avec la figure 4. On a mis en oeuvre un algorithme d'ajustement, de façon à déterminer progressivement les paramètres d'une particule sphérique dont le profil radial, formé à partir de la figure de diffraction modélisée dans le plan de détection, se rapproche du profil radial formé à partir de la figure de diffraction élémentaire.
Les inventeurs ont établi une relation entre l'indice de réfraction, à 405 nm, et la concentration en hémoglobine dans une particule. Lors de la modélisation de figures de diffraction, on a considéré le rayon, l'indice de réfraction (dépendant de la concentration en hémoglobine) ainsi que la distance par rapport au plan de détection.
La figure 5A représente une distribution du taux d'hémoglobine des particules (axe des ordonnées) en fonction de la distance par rapport au plan de détection (axe des abscisses). Le taux d'hémoglobine est exprimé en g/dL.
La figure 5B représente une distribution du rayon des particules (axe des ordonnées) en fonction de la distance par rapport au plan de détection (axe des abscisses). Le rayon des particules est exprimé en pm.
La figure 5C représente un histogramme du nombre de particules (axe des ordonnées) en fonction de la distance par rapport au plan de détection (axe des abscisses). La distance est exprimée en pm.
La méthode décrite ci-avant a été mise en oeuvre sur différents types de particules sanguines (globules rouges, globules blancs, plaquettes) disposées dans un échantillon de sang purifié dans du Dextran. Comme préala blement indiqué, le Dextran a pour effet d'entraîner une aggrégation des globules rouges, ce qui entraîne une sédimentation de ces derniers. Le plasma surnageant, appauvri en globule rouge par rapport au sang initial, est récupéré. Il est ensuite dilué au l/10'eme dans un tampn PBS. Durant cet essai, la concentration en globules blancs, globules rouges et plaquettes était respectivement 5.1 103 par mm3, 0.02 106 par mm3, 198.103 par mm3. Pour différentes particules d'intérêt, on a formé des figures de diffraction élémentaires en mettant en oeuvre les étapes 100 à 150 décrites ci-avant. A partir de chaque figure de diffraction élémentaire, on a estimé une taille ainsi qu'un indice de réfraction, ce dernier dépendant du taux d'hémoglobine. Dans le cas des globules blancs et des plaquettes qui ne contiennent pas d'hémoglobine, cette concentration n'a pas de signification, mais elle est reliée à l'indice optique. La figure 5D positionne chaque particule d’intérêt caractérisée dans un repère dont l’axe des abscisses correspond au rayon (en pm) et l’axe des ordonnées représente le taux d'hémoglobine. Cela permet d'identifier les globules rouges (ensemble a), les globules blancs (ensemble b) ainsi que les plaquettes (ensemble c).
Dans un autre essai, les inventeurs ont mis en oeuvre la méthode telle que précédemment décrite sur différents échantillons, comportant différents types de globules blancs (leucocytes), répartis en quatre classes :
classe 1 : lymphocytes ;
classe 2 : monocytes ;
classe 3 : neutrophiles ;
classe 4 : éosinophiles. Des échantillons de sang purifiés ont été préparés et des particules correspondant à des globules blancs ont été caractérisées. Dans ces échantillons, les globules rouges ont été lysés, et le sang a été dilué au l/10'eme (dilution dans un réactif de lyse Whitediff - kit commercial Horiba). La caractérisation a été effectuée en mettant en oeuvre les étapes 100 à 150 décrites ci-dessus, chaque figure de diffraction élémentaire isolée étant obtenue en décomposant les images du module et de la phase selon des polynômes de Zernike, jusqu'à l'ordre n = 4. On a obtenu, pour chaque décomposition, 30 coordonnées (15 pour le module, 15 pour la phase). On a également déterminé le diamètre de chaque globule blanc, ce dernier étant estimé à partir de l'image complexe reconstruite dans le plan de l'échantillon, et plus particulièrement à partir de l'image du module. On disposait, pour chaque classe, d'une base de données de figures de diffraction obtenues de façon expérimentale sur des échantillons purifiés (un seul type de globules blancs - ou une classe - largement prépondérant dans l'échantillon >80%). Cette base de données a servi pour l'apprentissage de la classification. La classification a été effectuée sur la base d’un algorithme de type SVM.
Le tableau suivant représente les résultats de la classification. Les classes associées à chaque ligne et à chaque colonne correspondent respectivement aux vraies classes et aux classes déterminées par mesure. La performance de classification a été jugée satisfaisante.
Tableau 1
La figure 6 schématise un autre dispositif permettant une mise en œuvre de l'invention. Contrairement au dispositif représenté sur la figure 1, le dispositif de la figure 6 comporte un système optique 19 de formation d'image. Le système optique 19 définit un plan image et un plan objet. Le système optique peut être une lentille ou un objectif. Lors de l'acquisition de l'image de l'échantillon, le capteur d'image est disposé selon une configuration défocalisée. Le plan de détection est décalé par rapport au plan image et/ou le plan selon lequel s'étend l'échantillon est décalé par rapport au plan objet. Le décalage est généralement faible, en étant de préférence inférieur à 1 mm, et typiquement dans une plage 50 pm - 500 pm. L'invention pourra être mise en œuvre sur différents types d'échantillons, par exemple dans le domaine du diagnostic, de la biologie, ou du contrôle de l'environnement, ou dans différents secteurs industriels, par exemple l'agroalimentaire ou le contrôle de procédés.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de caractérisation d'une particule présente (10p) dans un échantillon (10), l'échantillon s'étendant entre un capteur d'image (16) et une source de lumière (11), le capteur d'image s'étendant selon un plan de détection (Po), le procédé comportant les étapes suivantes:
a) illumination de l'échantillon par la source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant selon un axe de propagation (Z) ;
b) acquisition d'une image de l'échantillon (/0) par le capteur d'image (20), l'image comportant une pluralité de figures de diffraction élémentaires, chaque figure de diffraction élémentaire correspondant à une particule ;
c) à partir de l'image acquise (/0), reconstruction d'une image complexe (Zl10) représentative d'une amplitude complexe de l'onde lumineuse d'exposition, dans au moins une surface de reconstruction (Pi0) passant par l'échantillon, la reconstruction étant effectuée en mettant en oeuvre un algorithme de reconstruction itératif, l'algorithme comportant, lors de chaque itération, une mise à jour d'une phase de l'onde lumineuse d'exposition (14) dans le plan de détection (Po) ou dans la surface de reconstruction (Pio);
d) sélection d'une région d'intérêt (/?0/,j de l'image complexe, la région d'intérêt sélectionnée correspondant à une particule d'intérêt (10p,i);
e) formation d'une image complexe extraite (A10 i) à partir de la région d'intérêt (ROh) sélectionnée lors de l'étape d);
f) application d'un opérateur de propagation (h) à l'image complexe extraite [Aw>i) formée lors de l'étape e), de façon à obtenir, dans au moins un plan de propagation, une figure de diffraction élémentaire (Ao i) de la particule sélectionnée lors de l'étape c), de telle sorte que la figure de diffraction élémentaire obtenue soit isolée de figures de diffraction élémentaires d'autres particules présentes dans l'échantillon;
g) caractérisation de la particule d'intérêt (10p,i) en fonction de la figure de diffraction élémentaire (Ao i) résultant de l'étape f).
2. Procédé selon la revendication 1, lequel lors de l'étape f), le plan de propagation est le plan de détection.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : • l'étape c) comprend, à chaque itération, une application d'un opérateur de propagation holographique à une image de l'onde lumineuse d'exposition (14), dans le plan de détection, de façon à obtenir une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition, dans au moins un plan selon lequel s'étend l'échantillon, formant l'image complexe ( A10 );
• l'étape d) comporte, à partir de l'image complexe reconstruite {A10), l'obtention d'une l'image d'observation (I10), la particule d'intérêt (10p,i) étant sélectionnée sur l'image d'observation.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape f) comprend l'application d'un opérateur de propagation holographique à la région d'intérêt (ROh) sélectionnée lors de l'étape e), de façon à obtenir la figure de diffraction élémentaire (Ao i), correspondant à la particule d'intérêt, dans le plan de propagation, la partie de l'image complexe reconstruite {A10), située en dehors de la région d'intérêt (ROh) n'étant pas propagée.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une estimation d'une distance entre la particule d'intérêt et le plan de détection, de telle sorte que lors de l'étape f), l'opérateur de propagation prenne en compte la distance ainsi estimée.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lors de l'étape f), la propagation est effectuée en considérant une distance de propagation prédéterminée.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape f), on obtient une figure de diffraction élémentaire complexe, dans le plan de reconstruction, de la particule sélectionnée lors de l'étape c).
8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel lors de l'étape g), la caractérisation est effectuée à partir de la phase ou du module de la figure de diffraction élémentaire complexe, ou de sa partie réelle ou de sa partie imaginaire.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape g) comporte la détermination d'un profil axial, représentant une moyenne radiale de la figure de diffraction élémentaire.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape g) comporte :
• une comparaison de la figure de diffraction élémentaire (Ao i), obtenue lors de l'étape f), avec au moins une figure de diffraction correspondant à une particule connue; « ou une comparaison de la figure de diffraction élémentaire (Ao i), obtenue lors de l'étape f), avec au moins une figure de diffraction modélisée en considérant une particule dont l'indice de réfraction et/ou la taille sont connus ;
• ou une classification de la figure de diffraction élémentaire (Ao i), obtenue lors de l'étape f), en prenant en compte des figures de diffraction obtenues à l'aide de particules connues, ou des figures de diffraction modélisées, au cours d'une phase d'apprentissage.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
• l'étape g) comporte une décomposition de la figure de diffraction élémentaire (Ao i) selon une base de polynômes de Zernike, de manière à obtenir des coordonnées de la figure de diffraction élémentaire dans la base;
• la caractérisation de la particule d'intérêt est effectuée en fonction des coordonnées de la figure de détection élémentaire.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape g), la caractérisation est réalisée en fonction de figures de diffraction modélisées, à chaque figure de diffraction correspondant une particule dont un paramètre est connu, le paramètre étant une taille et/ou un indice de réfraction, la caractérisation visant à déterminer une valeur du paramètre pour la particule d'intérêt analysée.
13. Procédé selon la revendication 12, comportant un ajustement itératif du paramètre de la particule, chaque itération comprenant :
i) une prise en compte d'un paramètre ou d'un ensemble de paramètres de la particule ;
ii) une obtention d'une figure de diffraction modélisée selon le paramètre ou l'ensemble de paramètres pris en compte;
iii) une détermination d'un écart entre la figure de diffraction modélisée et la figure de diffraction élémentaire résultant de l'étape f); iv) une estimation d'un paramètre, ou d'un ensemble de paramètres, visant à réduire l'écart ainsi déterminé, le paramètre ou l'ensemble de paramètres estimés étant pris en compte lors de l'itération suivante.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel lors des étapes i) à iv), on prend en compte un ensemble de paramètres, l'ensemble de paramètre comportant une distance entre la particule et le plan de détection.
15. Dispositif d'observation d'un échantillon (10), l'échantillon comportant des particules, le dispositif comportant :
• une source de lumière (11), configurée pour illuminer l'échantillon ;
• un support d'échantillon (10s), configuré pour recevoir l'échantillon ;
• un capteur d'image (16), disposé de telle sorte que lorsque l'échantillon est disposé sur le support, il s'étend entre le capteur d'image et la source de lumière, le capteur d'image étant configuré pour acquérir une image de l'échantillon ;
• un processeur (20), configuré pour mettre en oeuvre les étapes c) à f) ou c) à g) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, à partir d'une image acquise par le capteur d'image.
16. Dispositif selon la revendication 15, dans lequel aucune optique de formation d'image n'est disposée entre le capteur d'image et le processeur.
17. Dispositif selon la revendication 15, comportant un système optique (19) s'étendant entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique définissant un plan image et un plan objet, le dispositif comportant un moyen d'ajustement du système optique, ou de l'échantillon, ou du capteur d'image, de telle sorte que :
• le plan de détection soit décalé du plan image ;
• et/ou le plan objet soit décalé d'un plan d'échantillon, selon lequel s'étend l'échantillon.
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