EP3634133A1 - Procédé de sélection de colonies d'abeilles présentant le caractère vsh et composition et kit pour sa mise en uvre - Google Patents

Procédé de sélection de colonies d'abeilles présentant le caractère vsh et composition et kit pour sa mise en uvre

Info

Publication number
EP3634133A1
EP3634133A1 EP18749422.4A EP18749422A EP3634133A1 EP 3634133 A1 EP3634133 A1 EP 3634133A1 EP 18749422 A EP18749422 A EP 18749422A EP 3634133 A1 EP3634133 A1 EP 3634133A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
substance
methyl
ethyl
bees
colony
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP18749422.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fanny MONDET
Yves Le Conte
Alison Mercer
Dominique BESLAY
Didier CRAUSER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
University of Otago
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
University of Otago
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA, University of Otago filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP3634133A1 publication Critical patent/EP3634133A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N35/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having two bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. aldehyde radical
    • A01N35/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having two bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. aldehyde radical containing aliphatically bound aldehyde or keto groups, or thio analogues thereof; Derivatives thereof, e.g. acetals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/02—Saturated carboxylic acids or thio analogues thereof; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention is in the field of beekeeping, and more particularly the protection of bees against the parasite Varroa destructor and the selection of colonies resistant to this parasite.
  • the present invention relates to a method for determining whether a bee colony has the specific hygienic character of the parasite Varroa destructor, as well as the use of particular substances for such a determination.
  • the invention also relates to a composition adapted to the implementation of such a method, as well as a kit for this implementation.
  • the parasite Varroa destructor has become the main pathogenic threat of insects of the species Apis mellifera, commonly named, and referred to in this description, for convenience, by the terms “honey bees", “honey bees” "Or simply” bees ".
  • This parasite which will be referred to in the present description also by the simple term Varroa, reproduces on developing broods, transmitting on this occasion to the latter several viral species. This causes significant damage in bee colonies, because broods then produce dysfunctional and very short-lived adults, disrupting the social balance of the colony. In the absence of control of this parasite, infested colonies of bees usually disappear in 2 to 3 years.
  • VSH behavior for Varroa Sensitive Hygiene English - specific hygienic behavior of Varroa.
  • the alveoli containing Varroa females accompanied by immature are preferentially targeted by bees carrying the VSH character. This VSH behavior allows bees to eliminate immature varroa mites.
  • Varroa females in VSH-expressing honeybee colonies frequently fail in their reproductive cycles. This failure of Varroa reproduction is called SMR (for the English Suppressed mite reproduction).
  • the present invention aims at remedying the drawbacks of the solutions proposed by the prior art for evaluating whether a bee colony is resistant to the Varroa parasite, in particular to the disadvantages described above, by proposing a method for determining in vivo, directly in the hive, if a colony of bees of the species Apis mellifera has the specific hygienic character of the parasite Varroa destructor, this method being easy to implement, preferably by beekeepers themselves, and moreover at low cost.
  • Said substance is in particular chosen from:
  • the substance is applied in the hive in such a way that it can be detected by the bee, for example in an olfactory manner.
  • the application of the substance (s) in the hive is not limited in particular to conditions ensuring that the bee can come into contact with the substance (s).
  • the reference response level depends on several parameters, including the type of response analyzed, the particular substance (s) used, their applied concentration in the hive, the method of application, etc. . For a given set of operating parameters, it is within the skills of a person skilled in the art to determine, for a given type of response, the level of reference response which is indicative of the fact that the colony of bees tested has the character specific hygienic of the parasite Varroa destructor. For this purpose, a person skilled in the art may for example carry out, prior to the implementation of the method according to the invention, comparative tests on colonies of guinea pig bees, more particularly to implement on these colonies of bees.
  • the method according to the present invention proves particularly simple to implement, in vivo and directly in the hive, which makes it quite suitable for implementation by the beekeepers themselves.
  • the type of response analyzed is chosen so as not to require complex and expensive analysis equipment or a long and constraining analysis procedure.
  • the method according to the invention thus constitutes a particularly practical tool for estimating the resistance potential of bee colonies to the parasite Varroa destructor, by identifying colonies having a behavior of detection and cleaning parasitized brood cells.
  • the process according to the invention constitutes an effective tool for assisting the selection of bee colonies whose breeding must be promoted.
  • the method according to the invention may furthermore respond to one or more of the characteristics described below, implemented individually or in each of their technically operating combinations.
  • the application of the substance into the hive is carried out by applying this substance to an element in the hive, and the level of response of the bee colony to the hive. exposure to this substance is a level of destruction of this element by the bee colony.
  • the analysis of such a type of response that is to say the level of destruction of a given element, which reflects particularly well the natural VSH behavior of bees, whose natural reaction in the presence of Varroa parasite is to uncapping and cleaning infested broods provides a particularly reliable assessment of the VSH character of the bee colony.
  • the carrier element of the substance (s) according to the invention may as well be a constituent element of the hive, such as a capped brood frame, an object outside the hive, which is introduced into the beehive for the purposes of the process according to the invention.
  • the application of the substance (s) on this element can be carried out in any conventional manner in itself, for example by spraying, dipping, injection, etc.
  • the substance (s) may in particular be used in a composition comprising them in a physiologically compatible vehicle, that is to say harmless to bees, and preferably having no effect significant on their behavior.
  • This vehicle may as well be in liquid form, in which the substance or substances are solubilized and / or in suspension, or in solid form, in which the substance or substances are dispersed in powder form.
  • the reference response level is a reference numerical value.
  • the method according to the invention then comprises quantifying a level of response of the bee colony to exposure to said substance according to the invention, and then comparing the value thus obtained to a reference threshold value, which has been predetermined to be indicative of the fact that the bee colony has the specific hygienic character of the parasite Varroa destructor, especially as indicated above.
  • the reference response level may otherwise be of any type, and in particular consist of a reference template, which is intended to be compared, for example visually, with the element used as a test in the hive, and whose level of destruction is analyzed in the context of the invention.
  • the determination of the level of response of the bee colony following its exposure to the substance is carried out after at least 1 hour, preferably after at least 2 hours, or after at least 8 hours, or after at least 24 hours, and for example after at least 48 hours, exposure of the bee colony to said substance.
  • the application of the substance in the hive is performed at a capped brood frame of the hive.
  • This application can be performed by injection of the substance (s) in cells of this frame, or alternatively, by spraying the substance (s) on this frame.
  • This latter method is particularly preferred in the context of the invention, because simple and quick to implement.
  • This step can be carried out away from the hive, the frame being removed from the hive before reintroducing into the hive once treated. Preferably, it is carried out in situ, where appropriate by extracting the frame of the hive entirely, or only partially.
  • the application of the substance (s) at a frame of the hive may consist of spraying the substance (s) on a surface of the frame equivalent to 100 cells.
  • the level of response of the bee colony to the exposure to the substance can then be a rate of cells of the frame having been uncapped by the bee colony further. the application of the substance, in relation to the total number of cells to which the substance has been applied.
  • the reference level of response is a threshold rate, above which any result is indicative of a colony of bees carrying the VSH character, and for which and below which any result is indicative of a colony of non-bearer bees of the VSH trait. It has been established by the present inventors that this threshold level is about 55% of cells bee-capped, relative to the total cells at which the substance has been applied. It may vary according to several parameters, in particular depending on the particular substance used, its concentration applied in the hive, application methods, etc.
  • the application of the substance in the hive is carried out by introducing into the hive an outer element destructible by the bees, carrying this substance in such a way that the bees of the colony can detect its presence in the hive, for example olfactory way.
  • the element is impregnated with the substance.
  • the level of response of the bee colony to the exposure to the substance is then the proportion of the element that was destroyed by the bee colony following introduction into the hive. the element carrying the substance (s) according to the invention.
  • This proportion may in particular be determined by calculating a difference in mass between the known initial mass of the element and its final mass, after a given time of presence in the hive.
  • the amount of substance applied in the hive for carrying out the method according to the invention depends on the particular substance and the chosen method of application.
  • the method comprises the simultaneous application of at least two or more of these substances, or even all of these substances.
  • the process may comprise the simultaneous application of a plurality of these substances, any number and any combination of these substances falling within the scope of the invention.
  • the method comprises the application in the hive of at least one substance chosen from tricosan-2-one, pentacosan-2-one and tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate and nonacosan-2-one; in particular at least two, at least three, at least four or at least five of these substances, or all of these six substances.
  • This substance (s) may be applied in the hive in combination with one or more substances selected from methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, stearate ethyl, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate; especially in combination with at least two, at least three, at least four, at least five, at least six or at least seven of these substances; or in combination with a mixture of methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate.
  • the process according to the invention may, in addition, or otherwise, comprise the application in the hive of at least two substances chosen from methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate; in particular at least three, at least four, at least five, at least six or at least seven of these substances; or a mixture of methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate.
  • the substance (s) may be used alone, on a support, in particular a solid support, or in a composition containing them in a vehicle that is physiologically compatible with implementation in the presence of bees.
  • this vehicle is chosen so as to solubilize the substance (s) according to the invention. It is further preferably chosen so as not to have a substantial impact on the behavior of the bees.
  • the method according to the invention can be applied to one or more colonies of the same apiary.
  • the results that can be obtained for each of the colonies tested, in terms of the level of response to the exposure to the substance (s), can be compared with each other, so as to determine which colonies present the specific hygienic character of parasite Varroa destructor ⁇ e most important.
  • the present invention relates to the use of at least one substance chosen from tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, and hexacosyl acetate, nonacosan-2-one, methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, linoleate and methyl linolenate, or any of their mixtures, to determine whether a bee colony of the species Apis mellifera has the specific hygienic character of parasite Varroa destructor.
  • This substance may especially be a mixture of methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate.
  • This use may meet one or more of the features described above with reference to the method provided by the present invention for determining whether a bee colony of the Apis mellifera species of a hive exhibits the specific hygienic character of the parasite. Varroa destructor.
  • compositions in particular in solid form or in liquid form, particularly suitable for the implementation of a method according to the invention.
  • This composition contains at least one substance chosen from tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate and nonacosan-2-one.
  • It contains, for example, at least one substance chosen from: tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate, nonacosyl 2-one and a mixture of methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate, in a vehicle physiologically compatible with use in the presence of bees of the species Apis mellifera.
  • Physiologically compatible means that the vehicle has no toxicity to bees, and preferably no substantial impact on their behavior.
  • This vehicle may as well be in liquid form as in solid form, for example pulverulent.
  • the vehicle is in liquid form, and the substance (s) are soluble therein. They may otherwise be in suspension.
  • the vehicle used is isohexane.
  • composition according to the invention may contain a single substance chosen from tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate, nonacosan -2-one, methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate .
  • the composition contains at least nonacosan-2-one, alone or in admixture with one or more of the tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate, methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate
  • composition according to the invention contains, for example, at least nonacosan-2-one and a mixture of methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate; optionally with one or more of the tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate.
  • It may, for example, contain at least one nonacosan-2-one and at least one substance, preferably at least two substances, or at least three substances, at least four substances, or preferably at least five substances, among the tricosan-2 -one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one and hexacosyl acetate.
  • the composition does not contain, as a substance according to the invention, a mixture of methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, stearate of ethyl oleate, ethyl lineate, methyl linolenate, excluding tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate and nonacosan-2-one.
  • composition according to the invention may especially contain at least one substance chosen from tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate and nonacosan-2-one. It may contain at least two, at least three, at least four or at least five of these substances, or all of these six substances.
  • composition according to the invention may for example contain a mixture of tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate and nonacosan-2-one, as well as a or a plurality of substances selected from methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate .
  • composition according to the invention may otherwise contain a mixture of methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate, and one or more substances selected from tricosan-2 -one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate and nonacosan-2-one.
  • composition according to the invention may otherwise, for example, contain, as a substance according to the invention, only tetracosyl acetate and hexacosyl acetate, as a mixture.
  • This or these substance (s) may be in the composition according to the invention in combination with one or more of the substances chosen from methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate; especially in combination with at least two, at least three, at least four, at least five, at least six or at least seven of these substances; or in combination with a mixture of methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate.
  • composition according to the invention may otherwise contain, as substances according to the invention, only substances selected from tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosamine and 2- one, hexacosyl acetate and nonacosan-2-one, especially only these six substances in mixture with each other.
  • composition according to the invention may also contain at least two substances chosen from methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate and ethyl oleate. , ethyl linoleate and methyl linolenate, for example at least three, at least four, at least five, at least six or at least seven of these substances.
  • composition according to the invention may contain the following substances, in the following respectively associated proportions, expressed by weight relative to the total weight of these substances: tricosan-2-one (4.8%), pentacosan -2-one (1 1, 9%), tetracosyl acetate (1 1, 9%), heptacosan-2-one (47.6%), hexacosyl acetate (9.5%) and nonacosyl 2-one (14.3%).
  • composition according to the invention may contain the following substances, in the following respectively associated proportions, expressed by weight relative to the total weight of these substances: methyl palmitate (8.1%), ethyl palmitate (27.0%) %), methyl stearate (8.1%), methyl oleate (8.1%), ethyl stearate (21.6%), ethyl oleate (5.4%), ethyl linoleate ( 19.0%) and methyl linolenate (2.7%).
  • kits for implementing a method according to the invention comprises: at least one substance chosen from tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate and nonacosan-2 -one, methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate, or any of their mixtures; for example at least one substance selected from tricosan-2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate, nonacosan-2-one and a mixture of methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl
  • this kit preferably contains the level of reference response indicative of the fact that the bee colony has the specific hygienic character of the parasite Varroa destructor, associated with the particular mode of application of the substance (s) in the hive corresponding to the implementation instructions provided.
  • the kit comprises an element that can be destroyed by the bees, and capable of conveying the substance (s) in such a way that the bees of the colony can detect its presence when the element is introduced into the hive.
  • This element is particularly capable of being impregnated with the substance (s).
  • the element and the substance (s), in particular in the form of a composition containing them in a suitable vehicle, may be present in the kit separately, and intended to be assembled by the user himself, especially the beekeeper, for example extemporaneously.
  • the element may be present in the kit in a form in which the element already carries the substance, so that the bees of the colony can detect its presence when the element is introduced into the hive.
  • the element may be present in the kit in pre-impregnated form with the substance (s) according to the invention.
  • the kit according to the invention may further comprise a reference element, also called template element, or reference template, indicative of the fact that the bee colony has the specific hygienic character of the parasite Varroa destructor.
  • This reference element is intended to be compared with the element carrying the substance (s) according to the invention having been implemented according to the invention, that is to say having been introduced into the beehive, to determine, in particular visually or by comparative weighing, whether the tested bee colony is or is not carrying the HSV trait.
  • FIG. 1 shows a bar graph representing the response of bee colonies, expressed as the rate of uncapping (plus or minus the standard error SE), by the colonies of bees, after 48 hours of exposure to the following compositions , injected into the lids of frames of the hive: isohexane ("Iso", negative control), extract of dead nymphs ("NM”, positive control), composition according to the invention ("C1") at different dilution rates ;
  • Iso negative control
  • NM extract of dead nymphs
  • C1 composition according to the invention
  • FIG. 2 shows bar graphs, representing the response of bee colonies, expressed as the rate of uncapping (plus or minus the standard SE error), by the bee colonies, after 48 hours of exposure to the compositions. following, injected into the lids of frames of the hive: isohexane ("Iso", negative control), extract of dead nymphs ("NM”, positive control), and different compositions according to the invention, for different concentrations (concentrations in substances according to the invention 3 times more important in b / than a /);
  • Iso isohexane
  • NM extract of dead nymphs
  • FIG. 3 shows a bar graph, representing the response of bee colonies, expressed as the rate of uncapping (plus or minus the standard SE error), by the bee colonies, after 48 hours of exposure to the compositions. following, injected into the lids of frames of the hive: isohexane ("Iso", negative control), extract of dead nymphs ("NM1", positive control), and various compositions according to the invention (C1 0 , C220, C3, Cl30, C230, C4);
  • FIG. 4 shows graphs illustrating the results obtained for colonies of bees tested in parallel for their SMR score on the one hand, and by the method according to the invention on the other hand, the result then being expressed in FIG. rate of desoperculation by bee colonies after 48 hours of exposure to the composition according to the invention, injected into the lids of frames of the hive; for different compositions according to the invention: a / C1 0 , b / C2 2 o and cl C3.
  • Substances / combinations of substances were solubilized in isohexane and exposed to brood by injection of 1 ⁇ . of the composition obtained through the opercle of alveoli containing nymphs with white to pink eyes using a Hamilton syringe.
  • the first step was the validation of the bioassay.
  • the treatments were considered as negative controls if after injection they did not trigger more hygienic activity on the treated cells than on untreated cells.
  • Three different negative controls were tested: pierced cells (cells injected with 1 ⁇ l of air), isohexane (alveoli injected with 1 ⁇ l of isohexane), extracts of non-parasitized nymphs (cells injected with 1 ⁇ l of extract from non-parasitized nymphs at the violet-eye stage). None of the three controls triggered significant hygienic activity compared to cells that were not handled.
  • the negative control from isohexane was chosen as a negative control for the following experiments.
  • the validation of the field behavioral test also required the identification of a biological extract containing odors to which bees may be naturally exposed in a colony, and which, when injected through the lid of the brood cells, would trigger a high level of hygienic activity.
  • Preliminary tests have shown that the injection of an extract obtained from 10 dead nymphs prepared in isohexane triggers a quasi-systematic hygienic type response, with an average of 85% of the targeted treated cells. This response is significantly higher than that obtained for the negative control.
  • the extracts of dead nymphs were therefore used as a positive control in the field test.
  • Negative controls included injection of 1 ⁇ . of air, of 1 ⁇ . isohexane ("Iso") or 1 ⁇ . extracts of non-parasitized nymphs (NP).
  • the positive control consisted of 1 ⁇ . of dead nymphs (NM) extract.
  • the NM extract was prepared for this purpose by immersion of 10 dead nymphs in 2 ml of isohexane for 10 min, recovery of the extract, then concentration under a stream of nitrogen and addition of 1 ⁇ . isohexane.
  • compositions according to the invention Several compositions have been prepared using different substances / mixtures of substances according to the invention.
  • the compounds methyl palmitate, ethyl palmitate, methyl stearate, methyl oleate, ethyl stearate, ethyl oleate, ethyl linoleate and methyl linolenate were purchased from Sigma-Aldrich, and the tricosane compounds.
  • 2-one, pentacosan-2-one, tetracosyl acetate, heptacosan-2-one, hexacosyl acetate and nonacosan-2-one have been synthesized by Omega-Cat System (Rennes, France).
  • the purity of the compounds varied between 94 and 99%.
  • the identity of all compounds was verified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).
  • GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
  • the compounds were solubilized in isohexane, except for 2-heptacosanone and 2-nonacosanone which were solubilized in a first time in cyclohexane. All dilutions were made with pure isohexane for all compounds. The compounds and mixtures were tested in different concentrations.
  • composition designated C1
  • C1 contains the following compounds, in the following proportions by weight, relative to the total weight of these compounds in the composition: tricosan-2-one (4.8%), pentacosan-2-one (1 , 9%), tetracosyl acetate (1 1, 9%), heptacosan-2-one (47.6%), hexacosyl acetate (9.5%) and nonacosan-2-one (14.3%). %).
  • This composition is used at the following different dilutions in the isohexane: undiluted (C1 5 o), diluted 1, 67 times (C1 3 o), diluted 2.5 times (C1 20 ), diluted 5 times (C1 10 ), diluted 10 times (C1 5 ), diluted 50 times (C1 i), and diluted 100 times (Cl os).
  • the comparison of the response obtained for each dose of composition injected indicates that a significant response is obtained when the dilution ratios of 10 times or less of the composition C1 are used.
  • the highest dose tested triggers a response similar to that obtained with the positive control ("NM").
  • composition C1 at the dilution rates of 5 times (C1 10) and 1.67 times (C130) was used.
  • TrCO tricosan-2-one
  • PCO pentacosan-2-one
  • TCA tetracosyl acetate
  • HPCO heptacosan-2-one
  • HCA hexacosyl acetate
  • NCO nonacosacan 2-one
  • composition C1 described in Example 1, at the dilution rates of 5 times (C1 10) and of 1.67 times (C1 ⁇ );
  • composition C2 containing, in isohexane: methyl palmitate 900 mg / l, ethyl palmitate 3000 mg / l, methyl stearate 900 mg / l, methyl oleate 900 mg / l, ethyl stearate 2400 mg / ml ethyl oleate 600 mg / l, ethyl linoleate 2100 mg / l and linolenate 300 mg / l; undiluted (C2 30) or diluted 1, 5 times (C2 20);
  • composition C3 containing, in isohexane: tricosan-2-one 200 mg / l, pentacosan-2-one 500 mg / l, tetracosyl acetate 500 mg / l, heptacosan-2-one 2000 mg / l, acetate of hexacosyl 400 mg / l, nonacosan-2-one 600 mg / l, methyl palmitate 600 mg / l, ethyl palmitate 2000 mg / l, methyl stearate 600 mg / l, methyl oleate 600 mg / l, ethyl stearate 1600 mg / l, ethyl oleate 400 mg / l, ethyl linoleate 1400 mg / l and methyl linolenate 200 mg / l; undiluted;
  • composition C4 containing, in isohexane: tricosan-2-one 600 mg / l, pentacosan-2-one 1500 mg / l, tetracosyl acetate 1500 mg / l, heptacosan-2-one 6000 mg / l, acetate of hexacosyl 1200 mg / l, nonacosan-2-one 1800 mg / l, methyl palmitate 900 mg / l, ethyl palmitate 3000 mg / l, methyl stearate 900 mg / l, methyl oleate 900 mg / l, ethyl stearate 2400 mg / l, ethyl oleate 600 mg / l, ethyl linoleate 2100 mg / l and linolenate 300 mg / l; undiluted.
  • compositions C1 i 0 , C2 2 o and C3 the number of colonies tested was 9.
  • the number of colonies tested was 17.
  • Iso isohexane alone
  • NM dead nymph extract
  • compositions C1-i 0 (18 colonies), C2 2 o (17 colonies), and C3 (9 colonies) according to the invention, described in Example 3, were used.
  • a reference value can be established, expressed in the form of a threshold uncapping rate, above which it can be determined by comparison with the SMR score (of which it is known from the prior art that it is greater than 0.5 for bees carrying the character VSH), that the colony of bees tested is carrying the VSH character.
  • this threshold level is 63%, for the composition C2 2 where it is 55%, and for the composition C3 it is 62%.

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor VSH. Ce procédé comprend l'application dans la ruche d'au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan- 2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle, de sorte à réaliser l'exposition de la colonie d'abeilles à cette substance; la détermination d'un niveau de réponse de la colonie d'abeilles à cette exposition; et la comparaison du niveau de réponse ainsi déterminé avec un niveau de réponse de référence indicatif d'une colonie d'abeilles porteuse du caractère VSH. Ce procédé constitue avantageusement un outil d'aide à la sélection des colonies d'abeilles.

Description

PROCÉDÉ DE SÉLECTION DE COLONIES D'ABEILLES PRÉSENTANT LE CARACTÈRE VSH ET COMPOSITION ET KIT POUR SA MISE EN ŒUVRE
La présente invention s'inscrit dans le domaine de l'apiculture, et plus particulièrement de la protection des abeilles contre le parasite Varroa destructor et de la sélection des colonies résistantes à ce parasite.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour déterminer si une colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, ainsi que l'utilisation de substances particulières pour une telle détermination. L'invention concerne également une composition adaptée à la mise en œuvre d'un tel procédé, ainsi qu'un kit pour cette mise en œuvre. Depuis quelques années, le parasite Varroa destructor est devenu la principale menace pathogène des insectes de l'espèce Apis mellifera, communément nommés, et désignés dans la présente description, pour plus de commodité, par les termes « abeilles à miel », « abeilles domestiques », ou encore simplement « abeilles ». Ce parasite, que l'on désignera dans la présente description également par le simple terme Varroa, se reproduit sur les couvains en développement, transmettant à cette occasion à ces derniers plusieurs espèces virales. Ceci entraine des dommages importants dans les colonies d'abeilles, car les couvains engendrent alors des adultes dysfonctionnels et à très courte durée de vie, désorganisant l'équilibre social de la colonie. En l'absence de contrôle vis-à-vis de ce parasite, les colonies d'abeilles infestées disparaissent généralement en 2 à 3 ans.
Cependant, il existe certaines colonies d'abeilles à miel qui présentent la capacité de survivre naturellement à l'infestation par le parasite Varroa destructor. Cette capacité est fortement associée à l'expression de deux caractères liés entre eux. Les colonies résistantes sont ainsi capables de détecter la présence du Varroa à travers l'opercule du couvain en développement et de nettoyer le couvain parasité. Cette forme de comportement hygiénique est connue sous le nom de comportement VSH (pour l'anglais Varroa Sensitive Hygiène - comportement hygiénique spécifique du Varroa). Les alvéoles contenant des femelles Varroa accompagnées d'immatures sont préférentiellement ciblées par les abeilles porteuses du caractère VSH. Ce comportement VSH permet aux abeilles d'éliminer les varroas immatures. S'il ne tue généralement pas les femelles Varroa fondatrices qui infestent les alvéoles ciblées, il perturbe toutefois la reproduction de ces femelles. Par conséquent, les femelles Varroa situées dans des colonies d'abeilles exprimant le caractère VSH se retrouvent fréquemment en échec dans leurs cycles de reproduction. Cet échec de reproduction du Varroa est appelé SMR (pour l'anglais Suppressed mite reproduction).
A partir de cette découverte, l'art antérieur a cherché à développer des procédés de sélection des colonies d'abeilles résistantes au Varroa, afin de favoriser l'élevage de ces colonies, moins difficiles à maintenir en vie que les autres, ou d'éviter de traiter inutilement, contre l'infestation par le parasite Varroa, des colonies qui y sont naturellement résistantes.
Selon un de ces procédés, notamment décrit dans la publication de Villa et al., 2009, dans Journal of Apicultural Research 48(3):162-167, l'évaluation du caractère VSH des colonies d'abeilles est réalisée par le biais d'une procédure qui implique de placer un cadre de couvain fortement infesté en Varroa dans la colonie à tester. Après un temps d'incubation, le cadre est récupéré et l'infestation réévaluée, pour déterminer si les abeilles de la colonie ont procédé ou non à un nettoyage des alvéoles parasitées. Un tel procédé est cependant contraignant à mettre en œuvre, et il requiert de posséder un grand nombre de « colonies donneuses » infestées en Varroa.
Selon un autre procédé proposé par l'art antérieur, notamment décrit dans la publication de Villa et al., 2016, dans Apidologie 47(6)771 -778, le potentiel de résistance des colonies d'abeilles au Varroa est plutôt évalué en utilisant un test d'évaluation du caractère SMR des abeilles. Ce test consiste à évaluer, sur un cadre de couvain operculé, la proportion de femelles Varroa qui sont en échec de reproduction. Cependant, même si ce test est plus simple à mettre en œuvre que le procédé décrit ci-dessus, il est très chronophage et en pratique impossible à réaliser sur un grand nombre de colonies sur le terrain.
A l'heure actuelle, aucun outil pratique d'utilisation n'est donc à la disposition des apiculteurs pour estimer le potentiel de résistance au Varroa de leurs colonies d'abeilles à miel.
La présente invention vise à remédier aux inconvénients des solutions proposées par l'art antérieur pour évaluer si une colonie d'abeilles est résistante au parasite Varroa, notamment aux inconvénients exposés ci-avant, en proposant un procédé pour déterminer in vivo, directement dans la ruche, si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, ce procédé étant facile à mettre en œuvre, de préférence par les apiculteurs eux-mêmes, et qui plus est à faible coût.
De manière tout à fait surprenante, il a été découvert par les présents inventeurs que certains composés particuliers déclenchent le comportement VSH des abeilles porteuses de ce caractère, par mise en présence de ces composés avec ces abeilles. L'analyse du degré de réponse des abeilles à cette mise en présence permet alors avantageusement de déterminer si la colonie concernée est ou non porteuse du caractère VSH. Ainsi, selon un premier aspect, il est proposé selon la présente invention un procédé pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera d'une ruche présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, dit caractère VSH. Ce procédé comprend :
- l'application dans la ruche d'au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan- 2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, ou l'un quelconque de leurs mélanges, de sorte à réaliser l'exposition de la colonie d'abeilles à ladite substance, - la détermination d'un niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à ladite substance,
- et la comparaison du niveau de réponse ainsi déterminé avec un niveau de réponse de référence indicatif du fait que la colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor.
Ladite substance est notamment choisie parmi :
- la tricosan-2-one,
- la pentacosan-2-one,
- l'acétate de tétracosyle, - l'heptacosan-2-one,
- l'acétate d'hexacosyle,
- la nonacosan-2-one
- et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.
Par exposition de la colonie d'abeilles à ladite substance, on entend ici que la substance est appliquée dans la ruche de manière telle qu'elle puisse être détectée par l'abeille, par exemple de manière olfactive. L'application de la ou des substance(s) dans la ruche ne se limite notamment pas à des conditions assurant que l'abeille puisse venir en contact avec la ou les substance(s).
Comme indiqué ci-avant, il a été découvert par les présents inventeurs que l'exposition d'une colonie d'abeilles à chacune des substances listées ci- dessus déclenche le comportement VSH des abeilles lorsque la colonie est porteuse de ce caractère. L'analyse du comportement de la colonie, suite à une exposition à l'une ou plusieurs de ces substances, permet de ce fait avantageusement de déterminer de manière relativement simple si elle présente ou non ce caractère VSH. A cet effet, il peut être mis en œuvre l'analyse de tout type de réponse permettant de refléter un comportement de nettoyage par la colonie d'abeilles. La réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition au(x) substance(s), dont le niveau est évalué selon la présente invention, peut ainsi être déterminée de plusieurs façons. Il entre dans les compétences de l'homme du métier de choisir le type de réponse qui sera analysé dans le cadre du procédé selon l'invention, notamment en fonction des conditions choisies pour l'application du ou des substance(s) dans la ruche. Des exemples de types de réponse pouvant entrer dans le cadre de l'invention sont décrits plus avant dans la présente description.
Le niveau de réponse de référence dépend de plusieurs paramètres, notamment du type de réponse analysé, de la ou des substance(s) particulière(s) mises en œuvre, de leur concentration appliquée dans la ruche, de la méthode d'application, etc. Pour un ensemble de paramètres opératoires donné, il entre dans les compétences de l'homme du métier de déterminer, pour un type de réponse donné, le niveau de réponse de référence qui est indicatif du fait que la colonie d'abeilles testée présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor. A cet effet, l'homme du métier peut par exemple effectuer, préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention, des tests comparatifs sur des colonies d'abeilles cobayes, plus particulièrement de mettre en œuvre sur ces colonies d'abeilles, d'une part le procédé selon l'invention dans les conditions opératoires choisies, et d'autre part un procédé de l'art antérieur, par exemple le procédé de mesure du caractère SMR, tel que décrit ci-avant et dans la publication de Villa et al., 2016, de sorte à déterminer, pour les colonies d'abeilles classées comme résistantes au Varroa par le test de l'art antérieur, quel est le niveau de réponse de référence pour le procédé selon l'invention, en fonction du type de réponse particulier sélectionné.
Une fois le niveau de réponse de référence obtenu pour un type de réponse donné, le procédé selon la présente invention s'avère particulièrement simple à mettre en œuvre, in vivo et directement dans la ruche, ce qui le rend tout à fait adapté à une mise en œuvre par les apiculteurs eux-mêmes.
De préférence, le type de réponse analysé est choisi pour ne pas nécessiter de matériel d'analyse complexe et coûteux, ni de procédure d'analyse longue et contraignante. Le procédé selon l'invention constitue ainsi un outil particulièrement pratique d'estimation du potentiel de résistance des colonies d'abeilles domestiques au parasite Varroa destructor, par identification des colonies ayant un comportement de détection et de nettoyage des alvéoles de couvain parasitées. Le procédé selon l'invention constitue en particulier à ce titre un outil efficace d'aide à la sélection des colonies d'abeilles dont l'élevage doit être favorisé.
Le procédé selon l'invention peut en outre répondre à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-après, mises en œuvre isolément ou en chacune des leurs combinaisons techniquement opérantes.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'application de la substance dans la ruche est réalisée par application de cette substance sur un élément dans la ruche, et le niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à cette substance est un niveau de destruction de cet élément par la colonie d'abeilles. L'analyse d'un tel type de réponse, c'est-à- dire du niveau de destruction d'un élément donné, qui reflète particulièrement bien le comportement VSH naturel des abeilles, dont la réaction naturelle en présence du parasite Varroa est de procéder à une désoperculation et un nettoyage des couvains infestés, permet d'obtenir une évaluation du caractère VSH de la colonie d'abeilles particulièrement fiable.
L'élément porteur de la ou des substance(s) selon l'invention peut aussi bien être un élément constitutif de la ruche, tel qu'un cadre de couvain operculé, qu'un objet extérieur à la ruche, qui est introduit dans la ruche pour les besoins du procédé selon l'invention.
L'application de la ou des substance(s) sur cet élément peut être réalisée de toute manière classique en elle-même, par exemple par pulvérisation, trempage, injection, etc. A cet effet, la ou les substance(s) peuvent notamment être mises en œuvre dans une composition les comprenant dans un véhicule physiologiquement compatible, c'est-à-dire inoffensif pour les abeilles, et de préférence n'ayant pas d'effet significatif sur leur comportement. Ce véhicule peut aussi bien être sous forme liquide, dans lequel la ou les substances sont solubilisées et/ou en suspension, que sous forme solide, dans laquelle la ou les substances sont dispersées sous forme pulvérulente.
Préférentiellement, le niveau de réponse de référence est une valeur numérique de référence. Le procédé selon l'invention comprend alors la quantification d'un niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à ladite substance selon l'invention, puis la comparaison de la valeur ainsi obtenue à une valeur seuil de référence, qui a été prédéterminée pour être indicative du fait que la colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, notamment comme indiqué ci-avant. Le niveau de réponse de référence peut autrement être de tout type, et notamment consister en un gabarit de référence, qui est destiné à être comparé, par exemple visuellement, à l'élément ayant servi de test dans la ruche, et dont le niveau de destruction est analysé dans le cadre de l'invention.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, la détermination du niveau de réponse de la colonie d'abeilles suite à son exposition à la substance est réalisée après au moins 1 heure, de préférence après au moins 2 heures, ou après au moins 8 heures, ou encore après au moins 24 heures, et par exemple après au moins 48 heures, d'exposition de la colonie d'abeilles à ladite substance. Une telle caractéristique assure avantageusement une fiabilité importante du procédé selon l'invention, en termes d'évaluation de la présence du caractère VSH pour la colonie d'abeilles testée.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'application de la substance dans la ruche est réalisée au niveau d'un cadre de couvain operculé de la ruche. Cette application peut être réalisée par injection de la ou des substance(s) dans des alvéoles de ce cadre, ou encore, et préférentiellement, par pulvérisation de la ou des substance(s) sur ce cadre. Cette dernière méthode est particulièrement préférée dans le cadre de l'invention, car simple et rapide à mettre en œuvre. Cette étape peut être réalisée à l'écart de la ruche, le cadre étant ôté de cette dernière au préalable, puis réintroduit dans la ruche une fois traité. Préférentiellement, elle est réalisée in situ, le cas échéant en extrayant le cadre de la ruche entièrement, ou partiellement seulement.
A titre d'exemple, l'application de la ou des substance(s) au niveau d'un cadre de la ruche peut consister en la pulvérisation de la ou des substance(s) sur une surface du cadre équivalent à 100 alvéoles.
Le niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à la substance, qui est déterminé dans le cadre de l'invention, peut alors être un taux d'alvéoles du cadre ayant été désoperculées par la colonie d'abeilles en suite de l'application de la substance, par rapport au nombre total d'alvéoles au niveau desquelles la substance a été appliquée.
Dans un tel mode de mise en œuvre, le niveau de réponse de référence est un taux seuil, au-dessus duquel tout résultat est indicatif d'une colonie d'abeilles porteuse du caractère VSH, et pour lequel et en-dessous duquel tout résultat est indicatif d'une colonie d'abeilles non porteuse du caractère VSH. Il a été établi par les présents inventeurs que ce taux seuil est d'environ 55 % d'alvéoles désoperculées par les abeilles, par rapport au total des alvéoles au niveau desquelles la substance a été appliquée. Il peut varier en fonction de plusieurs paramètres, notamment en fonction de la substance particulière mise en œuvre, de sa concentration appliquée dans la ruche, des modalités d'application, etc.
Dans d'autres modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'application de la substance dans la ruche est réalisée par introduction dans la ruche d'un élément externe destructible par les abeilles, véhiculant cette substance de manière telle que les abeilles de la colonie puissent détecter sa présence dans la ruche, par exemple de manière olfactive. Préférentiellement, l'élément est imprégné de la substance.
Parmi les éléments répondant à une telle définition, on peut citer à titre d'exemples les objets en matériau mou, tels qu'en paraffine, en carton, etc., qui offrent par ailleurs l'avantage de pouvoir être facilement imprégnés par la substance à appliquer dans la ruche.
Dans une telle configuration, le niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à la substance est alors la proportion de l'élément qui a été détruite par la colonie d'abeilles en suite de l'introduction dans la ruche de l'élément transportant la ou les substance(s) selon l'invention.
Cette proportion peut notamment être déterminée par calcul d'une différence de masse entre la masse initiale connue de l'élément et sa masse finale, après un temps donné de présence dans la ruche.
De manière générale, la quantité de substance appliquée dans la ruche pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention dépend de la substance particulière et de la méthode d'application choisie.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, une seule des substances choisies parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, est appliquée dans la ruche.
Dans d'autres modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, le procédé comprend l'application simultanée d'au moins deux de ces substances, voire plus, et même de la totalité, de ces substances.
Plus généralement, le procédé peut comprendre l'application simultanée d'une pluralité de ces substances, tout nombre et toute combinaison de ces substances entrant dans le cadre de l'invention.
Lorsque plusieurs substances de la liste ci-dessus sont mises en œuvre simultanément, elles peuvent se trouver dans toutes proportions les unes par rapport aux autres.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, le procédé comprend l'application dans la ruche d'au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one ; en particulier au moins deux, au moins trois, au moins quatre ou au moins cinq de ces substances, ou encore l'ensemble de ces six substances. Cette ou ces substance(s) peuvent être appliquée(s) dans la ruche en combinaison avec une ou plusieurs des substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle ; en particulier en combinaison avec au moins deux, au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins six ou au moins sept de ces substances ; ou encore en combinaison avec un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.
Le procédé selon l'invention peut en outre, ou autrement, comprendre l'application dans la ruche d'au moins deux substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle ; en particulier d'au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins six ou au moins sept de ces substances ; ou encore un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.
Des combinaisons de substances particulières pouvant être mises en œuvre dans le cadre de l'invention sont par exemple les suivantes :
- un mélange d'acétate de tétracosyle et d'acétate d'hexacosyle, à l'exclusion de toute autre des substances selon l'invention ; - les substances suivantes, dans les proportions en poids suivantes, par rapport au poids total de ces substances : tricosan-2-one (4,8%), pentacosan-2-one (1 1 ,9%), acétate de tétracosyle (1 1 ,9%), l'heptacosan-2-one (47,6%), acétate d'hexacosyle (9,5%) et nonacosan-2-one (14,3%) ; à l'exclusion de toute autre des substances selon l'invention ;
- les substances suivantes, dans les proportions en poids suivantes, par rapport au poids total de ces substances : palmitate de méthyle (8,1 %), palmitate d'éthyle (27,0%), stéarate de méthyle (8,1 %), oléate de méthyle (8,1 %), stéarate d'éthyle (21 ,6%), oléate d'éthyle (5,4%), linoléate d'éthyle (19,0%) et linolénate de méthyle (2,7%) ; à l'exclusion de toute autre des substances selon l'invention.
La ou les substance(s) peuvent être mises en œuvre seules, sur un support, en particulier un support solide, ou dans une composition les contenant dans un véhicule physiologiquement compatible avec une mise en œuvre en présence d'abeilles. Préférentiellement, ce véhicule est choisi de sorte à solubiliser la ou les substance(s) selon l'invention. Il est en outre de préférence choisi de sorte à ne pas avoir d'impact substantiel sur le comportement des abeilles.
Le procédé selon l'invention peut être appliqué à une ou plusieurs colonies d'un même rucher. Les résultats qu'il permet d'obtenir pour chacune des colonies testées, en termes de niveau de réponse à l'exposition à la ou aux substance(s), peuvent être comparés les uns aux autres, de sorte à déterminer quelles colonies présentent le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor \e plus important. Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, ou l'un quelconque de leurs mélanges, pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor. Cette substance peut notamment être un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle. Cette utilisation peut répondre à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence au procédé proposé par la présente invention pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera d'une ruche présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor.
Un autre aspect de la présente invention est une composition, se présentant notamment sous forme solide ou sous forme liquide, particulièrement adaptée à la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention. Cette composition contient au moins une substance choisie parmi la tricosan-2- one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, ou l'un quelconque de leurs mélanges, dans un véhicule physiologiquement compatible avec une utilisation en présence des abeilles de l'espèce Apis mellifera. Elle contient par exemple au moins une substance choisie parmi : la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, - l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle, dans un véhicule physiologiquement compatible avec une utilisation en présence des abeilles de l'espèce Apis mellifera.
On entend par physiologiquement compatible, le fait que le véhicule ne présente aucune toxicité vis-à-vis des abeilles, et de préférence aucun impact substantiel sur leur comportement.
Ce véhicule peut aussi bien se présenter sous forme liquide que sous forme solide, par exemple pulvérulente.
Préférentiellement, le véhicule est sous forme liquide, et la ou les substances(s) y sont solubles. Elles peuvent autrement s'y trouver en suspension.
A titre d'exemple, le véhicule mis en œuvre est l'isohexane.
La composition selon l'invention peut contenir une seule substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle.
Elle peut autrement contenir au moins deux, voire plus, et même l'ensemble, de ces substances, en mélange les unes avec les autres. Tout nombre et toute combinaison de ces substances entre dans le cadre de l'invention.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la composition contient au moins de la nonacosan-2-one, seule ou en mélange avec l'un ou plusieurs de la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle
La composition selon l'invention contient par exemple au moins de la nonacosan-2-one et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle ; le cas échéant avec l'un ou plusieurs de la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle.
Elle peut par exemple contenir au moins de la nonacosan-2-one et au moins une substance, de préférence au moins deux substances, ou au moins trois substances, au moins quatre substances, ou préférentiellement au moins cinq substances, parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one et l'acétate d'hexacosyle.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la composition ne contient pas, en tant que substance conforme à l'invention, un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle, linolénate de méthyle, à l'exclusion de tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one.
La composition selon l'invention peut notamment contenir au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2- one. Elle peut notamment contenir au moins deux, au moins trois, au moins quatre ou au moins cinq de ces substances, ou encore l'ensemble de ces six substances.
La composition selon l'invention peut par exemple contenir un mélange de tricosan-2-one, pentacosan-2-one, acétate de tétracosyle, heptacosan-2-one, acétate d'hexacosyle et nonacosan-2-one, ainsi qu'une ou plusieurs substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle. La composition selon l'invention peut autrement contenir un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle, ainsi qu'une ou plusieurs substances choisies parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one.
La composition selon l'invention peut autrement par exemple contenir, en tant que substance conforme à l'invention, uniquement l'acétate de tétracosyle et l'acétate d'hexacosyle, en mélange. Cette ou ces substance(s) peuvent se trouver dans la composition selon l'invention en combinaison avec une ou plusieurs des substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle ; en particulier en combinaison avec au moins deux, au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins six ou au moins sept de ces substances ; ou encore en combinaison avec un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.
La composition selon l'invention peut autrement ne contenir, en tant que substances conformes à l'invention, que des substances choisies parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2- one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one, notamment uniquement ces six substances en mélange les unes avec les autres.
La composition selon l'invention peut en outre contenir au moins deux substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, par exemple au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins six ou au moins sept, de ces substances.
Lorsque la composition selon l'invention contient plusieurs substances selon l'invention, toutes les proportions relatives de ces substances les unes par rapport aux autres entrent dans le cadre de l'invention. A titre d'exemple, une composition selon l'invention peut contenir les substances suivantes, dans les proportions respectivement associées suivantes, exprimées en poids par rapport au poids total de ces substances : tricosan-2-one (4,8%), pentacosan-2-one (1 1 ,9%), acétate de tétracosyle (1 1 ,9%), l'heptacosan-2-one (47,6%), acétate d'hexacosyle (9,5%) et nonacosan-2-one (14,3%).
Une autre composition selon l'invention peut contenir les substances suivantes, dans les proportions respectivement associées suivantes, exprimées en poids par rapport au poids total de ces substances : palmitate de méthyle (8,1 %), palmitate d'éthyle (27,0%), stéarate de méthyle (8,1 %), oléate de méthyle (8,1 %), stéarate d'éthyle (21 ,6%), oléate d'éthyle (5,4%), linoléate d'éthyle (19,0%) et linolénate de méthyle (2,7%).
Un autre aspect de l'invention concerne un kit pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention. Ce kit comprend : - au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, ou l'un quelconque de leurs mélanges ; par exemple au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle ; de préférence sous forme d'une composition selon l'invention, répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites dans la présente description,
- et des instructions de mise en œuvre de cette ou ces substance(s), et préférentiellement de cette composition, pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, conformément au procédé selon l'invention.
En particulier, ce kit contient de préférence le niveau de réponse de référence indicatif du fait que la colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, associé au mode d'application particulier de la ou des substance(s) dans la ruche correspondant aux instructions de mise en œuvre fournies.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le kit comporte un élément destructible par les abeilles, et apte à véhiculer la ou les substance(s) de manière telle que les abeilles de la colonie puissent détecter sa/leur présence lorsque l'élément est introduit dans la ruche. Cet élément est notamment apte à être imprégné par la ou les substance(s).
L'élément et la/les substance(s), en particulier sous forme d'une composition la/les contenant dans un véhicule adapté, peuvent être présents dans le kit séparément, et destinés à être assemblés par l'utilisateur lui-même, en particulier l'apiculteur, par exemple extemporanément.
Autrement, ils peuvent être présents dans le kit sous une forme dans laquelle l'élément véhicule déjà la substance, de manière telle que les abeilles de la colonie puissent détecter sa présence lorsque l'élément est introduit dans la ruche. En particulier, l'élément peut être présent dans le kit sous forme pré- imprégnée par la/les substance(s) selon l'invention.
Le kit selon l'invention peut en outre comporter un élément de référence, également nommé élément gabarit, ou gabarit de référence, indicatif du fait que la colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor. Cet élément de référence est destiné à être comparé à l'élément véhiculant la/les substance(s) selon l'invention ayant été mises en œuvre selon l'invention, c'est-à-dire ayant été introduite(s) dans la ruche, pour déterminer, en particulier de manière visuelle ou par pesée comparative, si la colonie d'abeilles testée est ou non porteuse du caractère VSH. En particulier, s'il est observé qu'à l'issue d'un temps de séjour déterminé dans la ruche (ce temps étant indiqué dans les instructions de mise en œuvre du kit), l'élément testé a été détruit par les abeilles en proportion telle qu'il est plus petit, ou plus léger, que l'élément de référence, il sera déterminé que la colonie d'abeilles présente le caractère VSH. Si au contraire, il est observé qu'à l'issue de ce temps de séjour, l'élément testé a été détruit par les abeilles en proportion telle qu'il est identique ou plus gros, ou plus lourd, que l'élément de référence, il sera déterminé que la colonie d'abeilles ne présente pas le caractère VSH.
Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 à 4, dans lesquelles :
- la figure 1 montre un graphe en barres représentant la réponse de colonies d'abeilles, exprimée en taux de désoperculation (plus ou moins l'erreur standard SE), par les colonies d'abeilles, après 48 h d'exposition aux compositions suivantes, injectées dans les opercules de cadres de la ruche : isohexane (« Iso », contrôle négatif), extrait de nymphes mortes (« NM », contrôle positif), composition conforme à l'invention (« C1 ») à différents taux de dilution ;
- la figure 2 montre des graphes en barres, représentant la réponse de colonies d'abeilles, exprimée en taux de désoperculation (plus ou moins l'erreur standard SE), par les colonies d'abeilles, après 48 h d'exposition aux compositions suivantes, injectées dans les opercules de cadres de la ruche : isohexane (« Iso », contrôle négatif), extrait de nymphes mortes (« NM », contrôle positif), et différentes compositions conformes à l'invention, pour des concentrations différentes (concentrations en substances selon l'invention 3 fois plus importantes en b/ qu'en a/) ;
- la figure 3 montre un graphe en barres, représentant la réponse de colonies d'abeilles, exprimée en taux de désoperculation (plus ou moins l'erreur standard SE), par les colonies d'abeilles, après 48 h d'exposition aux compositions suivantes, injectées dans les opercules de cadres de la ruche : isohexane (« Iso », contrôle négatif), extrait de nymphes mortes (« NM1 », contrôle positif), et différentes compositions conformes à l'invention (C1 0, C220, C3, CI 30, C230, C4) ;
- et la figure 4 montre des graphes illustrant les résultats obtenus pour des colonies d'abeilles testées en parallèle pour leur score SMR d'une part, et par le procédé selon l'invention d'autre part, le résultat s'exprimant alors en taux de désoperculation par les colonies d'abeilles après 48 h d'exposition à la composition selon l'invention, injectée dans les opercules de cadres de la ruche ; pour différentes compositions selon l'invention : a/ C1 0, b/ C22o et cl C3. MATERIEL ET METHODES
Procédé selon l'invention
Design du test et validations préliminaires
Les substances / combinaisons de substances ont été solubilisées dans l'isohexane et exposées au couvain par injection d'1 μί. de la composition obtenue à travers l'opercule d'alvéoles contenant des nymphes aux yeux blancs à rosés à l'aide d'une seringue Hamilton.
Des essais préliminaires en laboratoire ont permis de contrôler que l'injection de solvant à travers l'opercule (70 à 100 alvéoles par échantillon) n'altère pas la survie des nymphes en développement. Le taux de survie a été estimé en mesurant le nombre d'alvéoles qui émergent à la fin de la métamorphose. Les cadres étaient conservés dans une étuve (34 °C) après injection et jusqu'à émergence. Les alvéoles contrôles (sans injection) ont montré un taux d'émergence de 95,9% (± 4 % - n = 6) et les alvéoles percées (groupe contrôle dans lequel un trou a été réalisé dans l'opercule avec la seringue) de 93% (± 7% - n = 3). 93,5% (± 6% - n = 6) des alvéoles injectées avec 1 μ\- d'isohexane émergeaient, alors que seulement 15% (± 1 2% - n = 3) des alvéoles injectées avec 5 μί. d'isohexane émergeaient.
Les tests de terrain ont par conséquent été réalisés avec l'injection de 1 μ\- de composition dans chaque alvéole. Cette validation préliminaire a également permis de s'assurer que si une activité de comportement hygiénique était enregistrée dans le test de terrain, elle n'était pas ciblée sur du couvain mort.
Afin de contrôler l'âge du couvain dans les alvéoles recevant les traitements et pour assurer l'homogénéité entre les réplicas d'alvéoles et de colonies, sur chaque cadre de couvain prélevé, quelques alvéoles operculées ont été ouvertes afin de vérifier que le couvain était au stade nymphal, 3 à 6 jours après operculation. Les essais ont été réalisés sur un total de 1 12 cadres appartenant à 46 colonies différentes. Sur chaque cadre, 15 ou 30 alvéoles operculées ont été injectées pour chaque condition de traitement. La position de chaque alvéole injectée a été marquée sur une feuille plastique transparente afin d'assurer le suivi de l'activité de désoperculation/nettoyage. 2, 4, 24 et 48 h après réintroduction des cadres dans leurs colonies d'origine, les cadres ont été vérifiés pour la réponse de désoperculation ou nettoyage. A la fin de la période d'observation de 48 h, la proportion totale d'alvéoles ciblées a été estimée.
Validation du test par contrôles positif et négatif
La première étape a consisté en la validation du bio-essai. Les traitements ont été considérés comme des contrôles négatifs si après injection ils ne déclenchaient pas plus d'activité hygiénique sur les alvéoles traitées que sur des alvéoles non traitées. Trois contrôles négatifs différents ont été testés : alvéoles percées (alvéoles injectées avec 1 μί. d'air), isohexane (alvéoles injectées avec 1 μί. d'isohexane), extraits de nymphes non-parasitées (alvéoles injectées avec 1 μί. d'extrait de nymphes non-parasitées au stade yeux violets). Aucun des trois contrôles n'a déclenché d'activité hygiénique significative en comparaison des alvéoles qui n'ont pas été manipulées. Le contrôle négatif à partir d'isohexane a été choisi comme contrôle négatif pour les expériences suivantes.
La validation du test comportemental de terrain a également nécessité d'identifier un extrait biologique contenant des odeurs auxquelles les abeilles peuvent être naturellement exposées dans une colonie, et qui, une fois injectées à travers l'opercule des alvéoles de couvain, déclencheraient un niveau élevé d'activité hygiénique. Des essais préliminaires ont montré que l'injection d'un extrait obtenu à partir de 10 nymphes mortes préparé dans l'isohexane déclenchait une réponse de type hygiénique quasi-systématique, avec en moyenne 85% des alvéoles traitées ciblées. Cette réponse est significativement plus élevée que celle obtenue pour le contrôle négatif. Les extraits de nymphes mortes ont donc été utilisés comme contrôle positif dans le test de terrain. La proportion d'alvéoles injectées ciblées par le comportement hygiénique (désoperculation et/ou nettoyage) a été comparée à la proportion d'alvéoles non injectées ciblées par le comportement durant la même plage de temps. Les contrôles négatifs incluaient l'injection d'1 μί. d'air, d'1 μί. d'isohexane (« Iso ») ou d'1 μί. d'extraits de nymphes non parasitées (NP). Le contrôle positif était constitué d'1 μί. d'extrait de nymphes mortes (NM). L'extrait NM a été à cet effet préparé par immersion de 10 nymphes mortes dans 2 mL d'isohexane pendant 10 min, récupération de l'extrait, puis concentration sous un flux d'azote et ajout d'1 μί. d'isohexane.
Préparation de compositions selon l'invention Plusieurs compositions ont été préparées en utilisant différentes substances / mélanges de substances selon l'invention. Les composés palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle ont été achetés chez Sigma-AIdrich, et les composés tricosan-2-one, pentacosan-2-one, acétate de tétracosyle, heptacosan-2-one, acétate d'hexacosyle et nonacosan-2-one ont été synthétisés à façon par Omega-Cat System (Rennes, France). La pureté des composés variait entre 94 et 99 %. L'identité de tous les composés a été vérifiée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). Les composés ont été solubilisés dans l'isohexane, sauf pour la 2- heptacosanone et la 2-nonacosanone qui ont été solubilisées dans un premier temps dans le cyclohexane. Toutes les dilutions ont été réalisées avec de l'isohexane pur, pour tous les composés. Les composés et les mélanges ont été testés en différentes concentrations.
Evaluation du caractère SMR Sur 18 des colonies utilisées pour le test de terrain, le caractère SMR a été mesuré de façon concomitante. Dans chaque colonie, un cadre contenant du couvain operculé à un stade de développement tardif a été échantillonné puis disséqué au laboratoire. Les alvéoles ont été ouvertes avec précaution, sous une loupe binoculaire et la présence de Varroa recherchée. Lorsqu'une alvéole était parasitée, le contenu de la famille Varroa était décrit avec précision afin de déterminer si la femelle fondatrice aurait pu produire au moins une femelle fécondée au moment de l'émergence de l'abeille, selon le protocole décrit dans la publication de Villa et al., 2016, citée ci-avant. Cette procédure a été répétée jusqu'à ce que 35 alvéoles infestées soient décrites au moins, et la proportion d'alvéoles infestées contenant des Varroa en reproduction effective calculée, de sorte à obtenir le score SMR.
Analyses statistiques
Toutes les analyses statistiques et les figures ont été générées dans l'environnement R (Version 3.3.1 ). Dans les tests comportementaux de terrain, les colonies ont été considérées comme l'individu statistique. Les analyses ont été réalisées à l'aide de modèle linéaires mixtes (LMEM - package Ime4). Dans le bio-essai, la proportion d'alvéoles ciblées par un comportement hygiénique a été analysée en fonction des traitements. Afin de prendre en compte le fait que différentes alvéoles traitées pouvaient appartenir à la même colonie, l'identité des alvéoles au sein des colonies expérimentales a été incluse comme facteur aléatoire, et l'effet du traitement comme une variable explicative fixe. La relation entre la réponse obtenue dans le test SMR et dans le procédé selon l'invention a été analysée à l'aide de régressions linéaires (LM). EXEMPLE 1 - mélange de substances selon l'invention Il a été réalisé l'exposition de nymphes saines à un stimulus chimique par une composition conforme à la présente invention, de sorte à évaluer le comportement de désoperculation / nettoyage des alvéoles.
Cette composition, désignée C1 , contient les composés suivants, dans les proportions en poids suivantes, par rapport au poids total de ces composés dans la composition : tricosan-2-one (4,8%), pentacosan-2-one (1 1 ,9%), acétate de tétracosyle (1 1 ,9%), l'heptacosan-2-one (47,6%), acétate d'hexacosyle (9,5%) et nonacosan-2-one (14,3%).
Pour la composition mère (C15o) la quantité totale de composés dans l'isohexane est de 21000 ng^L.
Cette composition est mise en œuvre aux différentes dilutions suivantes dans l'isohexane : non diluée (C15o), diluée 1 ,67 fois (C13o), diluée 2,5 fois (C120), diluée 5 fois (C1 10), diluée 10 fois (C15), diluée 50 fois (C1 i), et diluée 100 fois (Cl o.s).
La réponse de l'exposition de colonies d'abeilles à ces différentes dilutions de la composition C1 a été analysée. Chaque dilution a été testée sur 12 colonies non apparentées.
A titre de validation, il a également été testé l'isohexane seul (« Iso »), et le contrôle positif extrait de nymphes mortes (« NM »). L'injection de la composition déclenche une réponse dose- dépendante, comme on peut l'observer sur la figure 1 , qui montre l'activité de désoperculation mesurée en fonction de la dose de composés injectée (n = 12 colonies) (LMEM : χ2 = 87.08, p < 10"15).
La comparaison de la réponse obtenue pour chaque dose de composition injectée indique qu'une réponse significative est obtenue lorsque les taux de dilution de 10 fois ou moins de la composition C1 sont utilisés. La plus haute dose testée déclenche une réponse similaire à celle obtenue avec le contrôle positif ("NM").
Dans les essais suivants, la composition C1 aux taux de dilution de 5 fois (C1 10) et 1 ,67 fois (C130) a été utilisée.
EXEMPLE 2 - Composés selon l'invention testés seuls ou par paires
Les composés suivants : tricosan-2-one (TrCO), pentacosan-2-one (PCO), acétate de tétracosyle (TCA), l'heptacosan-2-one (HPCO), acétate d'hexacosyle (HCA) et nonacosan-2-one (NCO), ont été testés séparément. La combinaison de composés « acétate de tétracosyle (TCA) / acétate d'hexacosyle (HCA) » a également été testée.
A titre comparatif, ont également été testés : la composition C1 de l'Exemple 1 diluée 5 fois (« C1 10 ») ou 1 ,67 fois (« C130 »), l'isohexane (« Iso ») et un extrait de nymphes mortes (« NM »).
Les différents composés ont été mis en solution dans l'isohexane, aux concentrations suivantes :
- expérience a/ (33 colonies) : tricosan-2-one 200 mg/l ; pentacosan- 2-one 500 mg/l ; acétate de tétracosyle 500 mg/l ; l'heptacosan-2-one 2000 mg/l ; acétate d'hexacosyle 400 mg/l ; nonacosan-2-one 600 mg/l ; combinaison d'acétate de tétracosyle 500 mg/l et d'acétate d'hexacosyle 400 mg/l (en comparaison avec la composition C1 10) ;
- expérience b/ (22 colonies) : tricosan-2-one 600 mg/l ; pentacosan- 2-one 1500 mg/l ; acétate de tétracosyle 1500 mg/l ; l'heptacosan-2-one 6000 mg/l ; acétate d'hexacosyle 1200 mg/l ; nonacosan-2-one 1800 mg/l ; combinaison d'acétate de tétracosyle 1500 mg/l et d'acétate d'hexacosyle 1200 mg/l (en comparaison avec la composition C13o)-
Les résultats obtenus, en termes de taux de désoperculation par les abeilles sont montrés sur la figure 2, en a/ pour l'expérience a/, et en b/ pour l'expérience b/.
On y observe que des résultats assez similaires ont été obtenus dans les deux expériences. Il y a un effet traitement significatif (LMEM : %2ioeq = 366.75, p < 10"15 ; %2 3oeq = 247.28, p < 10"15) pour tous les composés testés. Cela indique que l'ensemble de ces composés conformes à l'invention peuvent être utilisés pour évaluer le caractère VSH de colonies d'abeilles domestiques.
EXEMPLE 3 - mélanges de substances selon l'invention
Il a été testé les compositions suivantes : - composition C1 décrite dans l'Exemple 1 , aux taux de dilution de 5 fois (C1 10) et de 1 ,67 fois (C1∞) ;
- composition C2 contenant, dans l'isohexane : palmitate de méthyle 900 mg/l, palmitate d'éthyle 3000 mg/l, stéarate de méthyle 900 mg/l, oléate de méthyle 900 mg/l, stéarate d'éthyle 2400 mg/l, oléate d'éthyle 600 mg/l, linoléate d'éthyle 2100 mg/l et linolénate de méthyle 300 mg/l ; non diluée (C230) ou diluée 1 ,5 fois (C220) ;
- composition C3 contenant, dans l'isohexane : tricosan-2-one 200 mg/l, pentacosan-2-one 500 mg/l, acétate de tétracosyle 500 mg/l, heptacosan-2-one 2000 mg/l, acétate d'hexacosyle 400 mg/l, nonacosan-2-one 600 mg/l, palmitate de méthyle 600 mg/l, palmitate d'éthyle 2000 mg/l, stéarate de méthyle 600 mg/l, oléate de méthyle 600 mg/l, stéarate d'éthyle 1600 mg/l, oléate d'éthyle 400 mg/l, linoléate d'éthyle 1400 mg/l et linolénate de méthyle 200 mg/l ; non diluée ;
- composition C4 contenant, dans l'isohexane : tricosan-2-one 600 mg/l, pentacosan-2-one 1500 mg/l, acétate de tétracosyle 1500 mg/l, heptacosan-2-one 6000 mg/l, acétate d'hexacosyle 1200 mg/l, nonacosan-2- one 1800 mg/l, palmitate de méthyle 900 mg/l, palmitate d'éthyle 3000 mg/l, stéarate de méthyle 900 mg/l, oléate de méthyle 900 mg/l, stéarate d'éthyle 2400 mg/l, oléate d'éthyle 600 mg/l, linoléate d'éthyle 2100 mg/l et linolénate de méthyle 300 mg/l ; non diluée.
Pour les compositions C1 i0, C22o et C3, le nombre de colonies testées a été de 9. Pour les compositions C13o, C23o et C4, le nombre de colonies testées a été de 17.
A titre comparatif, il a également été testé l'isohexane seul (« Iso ») et l'extrait de nymphes mortes tel que décrit dans l'Exemple 1 (« NM »).
Les résultats obtenus, en termes de taux de désoperculation par les colonies d'abeilles, sont montrés sur la figure 3.
Comme on peut l'observer sur cette figure, pour toutes les compositions selon l'invention testées, l'effet traitement est significatif (LMEM : χ2 = 204.25, p < 10"15).
EXEMPLE 4 - Comparaison avec le taux SMR des colonies testées
Le procédé selon l'invention, et le test SMR décrit par l'art antérieur, ont été mis en œuvre en parallèle sur les mêmes colonies d'abeilles. La corrélation entre la réponse obtenue dans le test SMR de référence
(score SMR) et la réponse obtenue par le procédé selon l'invention (taux de désoperculation) a été analysée.
A cet effet, ont été mises en œuvre les compositions C1 -i0 (18 colonies), C22o (17 colonies), et C3 (9 colonies) selon l'invention, décrites dans l'Exemple 3.
Pour chaque colonie testée, il a été calculé d'une part le score SMR obtenu par le protocole décrit dans l'art antérieur, dans la publication de Villa et al., 2016, citée ci-avant, et d'autre part le taux de désoperculation obtenu conformément à l'invention. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 4, en a/ pour la composition C1 -m, en b/ pour la composition C22o et en cl pour la composition C3.
On observe que lorsque la composition selon l'invention C1 0 est appliquée, l'association entre les résultats du procédé selon l'invention et le score SMR est significative (LM : F = 14.49, p = 0.00155) et le degré de corrélation relativement élevé (r2 = 0.44) (Figure 4, a/).
Lorsque la composition C22o est appliquée, une relation linéaire significative est également obtenue (LM : F = 8.93, p = 0.008681 ) (Figure 4, b/). Le degré de corrélation le plus élevé avec le score SMR est détecté pour la composition C3 (LM : F = 14.29, p = 0.0069, r2 = 0.62, n = 9) (Figure 4, c/).
Pour chacune des compositions selon l'invention testées, on observe qu'il peut être établi une valeur de référence, exprimée sous forme d'un taux de désoperculation seuil, au-dessus duquel on peut déterminer, par comparaison avec le score SMR (dont il est connu de l'art antérieur qu'il est supérieur à 0,5 pour les abeilles porteuses du caractère VSH), que la colonie d'abeilles testée est porteuse du caractère VSH. Pour la composition C1 i0, ce taux seuil est de 63 %, pour la composition C22o il est de 55 %, et pour la composition C3 il est de 62 %.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera d'une ruche présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, caractérisé en ce qu'il comprend :
- l'application dans ladite ruche d'au moins une substance choisie parmi : o la tricosan-2-one, o la pentacosan-2-one, o l'acétate de tétracosyle, o l'heptacosan-2-one, o l'acétate d'hexacosyle, o la nonacosan-2-one o et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle, de sorte à réaliser l'exposition de ladite colonie d'abeilles à ladite substance,
- la détermination d'un niveau de réponse de ladite colonie d'abeilles à l'exposition à ladite substance,
- et la comparaison du niveau de réponse ainsi déterminé avec un niveau de réponse de référence indicatif du fait que ladite colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor.
2. Procédé selon la revendication 1 , selon lequel l'application de ladite substance dans la ruche est réalisée par application de ladite substance sur un élément dans la ruche, et le niveau de réponse de ladite colonie d'abeilles à l'exposition à ladite substance est un niveau de destruction dudit élément par ladite colonie d'abeilles.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, selon lequel la détermination d'un niveau de réponse de ladite colonie d'abeilles à l'exposition à ladite substance est réalisée après au moins 1 heure, de préférence au moins 8 heures, d'exposition de la colonie d'abeilles à ladite substance.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel l'application de ladite substance dans la ruche est réalisée au niveau d'un cadre de couvain operculé de la ruche.
5. Procédé selon la revendication 4, selon lequel l'application de ladite substance dans la ruche est réalisée par pulvérisation de ladite substance sur ledit cadre de couvain operculé.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 5, selon lequel le niveau de réponse de ladite colonie d'abeilles à l'exposition à ladite substance est un taux d'alvéoles dudit cadre ayant été désoperculées par ladite colonie d'abeilles en suite de ladite application, par rapport au nombre total des alvéoles au niveau desquelles ladite substance a été appliquée.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel l'application de ladite substance dans la ruche est réalisée par introduction dans la ruche d'un élément externe destructible par lesdites abeilles et véhiculant ladite substance de manière telle que les abeilles de ladite colonie d'abeilles puissent détecter sa présence dans la ruche.
8. Procédé selon la revendication 7, selon lequel le niveau de réponse de ladite colonie d'abeilles à l'exposition à ladite substance est une proportion dudit élément détruite par ladite colonie d'abeilles en suite de ladite introduction.
9. Utilisation d'une substance choisie parmi : - la tricosan-2-one,
- la pentacosan-2-one,
- l'acétate de tétracosyle,
- l'heptacosan-2-one,
- l'acétate d'hexacosyle,
- la nonacosan-2-one
- et un mélange de palmitate de méthyle, de palmitate d'éthyle, de stéarate de méthyle, d'oléate de méthyle, de stéarate d'éthyle, d'oléate d'éthyle, de linoléate d'éthyle et de linolénate de méthyle, pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor.
10. Composition caractérisée en ce qu'elle contient au moins une substance choisie parmi :
- la tricosan-2-one,
- la pentacosan-2-one,
- l'acétate de tétracosyle,
- l'heptacosan-2-one,
- l'acétate d'hexacosyle,
- la nonacosan-2-one
- et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle, dans un véhicule physiologiquement compatible avec une utilisation en présence d'abeilles de l'espèce Apis mellifera.
11. Composition selon la revendication 10, contenant au moins deux substances choisies parmi : - la tricosan-2-one,
- la pentacosan-2-one,
- l'acétate de tétracosyle,
- l'heptacosan-2-one, - l'acétate d'hexacosyle,
- la nonacosan-2-one
- et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.
12. Composition selon la revendication 10, contenant au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one.
13. Kit pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins une substance choisie parmi :
• la tricosan-2-one,
• la pentacosan-2-one,
• l'acétate de tétracosyle,
• l'heptacosan-2-one, · l'acétate d'hexacosyle,
• la nonacosan-2-one
• et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle, - et des instructions de mise en œuvre de ladite substance pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera d'une ruche présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor.
14. Kit selon la revendication 13, comportant un élément destructible par lesdites abeilles apte à véhiculer ladite substance de manière telle que les abeilles de ladite colonie d'abeilles puissent détecter sa présence.
15. Kit selon la revendication 14, dans lequel ledit élément véhicule ladite substance de manière telle que les abeilles de ladite colonie d'abeilles puissent détecter sa présence.
16. Kit selon l'une quelconque des revendications 14 à 15, comportant un élément de référence indicatif du fait que ladite colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor.
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