EP3405899A1 - Procédé de classification d'un échantillon biologique - Google Patents

Procédé de classification d'un échantillon biologique

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EP3405899A1
EP3405899A1 EP17705020.0A EP17705020A EP3405899A1 EP 3405899 A1 EP3405899 A1 EP 3405899A1 EP 17705020 A EP17705020 A EP 17705020A EP 3405899 A1 EP3405899 A1 EP 3405899A1
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EP
European Patent Office
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group
descriptors
programmed
curve
measurement
Prior art date
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EP17705020.0A
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German (de)
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EP3405899B1 (fr
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Jean-Christophe AVARRE
Christelle REYNES
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Montpellier
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Publication of EP3405899A1 publication Critical patent/EP3405899A1/fr
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    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
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    • G—PHYSICS
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    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/20—Supervised data analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method of classifying a biological sample, and an associated device.
  • Such a device allows a user to classify a biological sample from several possible groups.
  • the field of the invention is that of biological classification.
  • Document WO2013 / 166373 describes a method for determining the regulatory status of the IL-6 / STAT3 signaling pathway in a cell sample or in a subject.
  • the regulatory status of the IL-6 / STAT3 signaling pathway in a cell sample or in a subject can be analyzed based on the level of expression of one or more of 16 genes of an expression signature.
  • Biomarker expression is preferably determined by RT-PCR using SYBR Green methods, and expression data is analyzed and compared to a control sample by the use of the random forest method.
  • the determination of the selected variables here the 16 genes is specific to the problem and must be manually performed for each new problem.
  • Some technical problems may arise for a method of classifying a biological sample in a group, especially when the number of possible groups is important, for example:
  • the object of the present invention is to solve at least one of these problems. Presentation of the invention
  • This objective is achieved with a method of classifying a biological sample of measurement, comprising:
  • said at least one measurement curve (preferably an acquisition of several DNA fusion curves of the biological sample of measurement, also called technical replicates), typically each measurement curve comprising different points, each point corresponding to a quantity proportional or representative of a rate or quantity of denaturation of the DNA of the measurement sample as a function of a temperature,
  • the acquisition of at least one DNA fusion curve of the biological measurement sample may comprise the acquisition of at least one melting curve of a result of a PCR obtained in the simultaneous presence of several pairs of samples.
  • primers targeting several DNA target molecules corresponding for example to several pathogens. This is called “multiplexing" conditions.
  • This embodiment is useful for accelerating searches, for example for many pathogens very rarely present together in the same biological sample.
  • the rare cases, for example of several pathogens present together in a sample, are identified: typically, the melting curve has as many inflection points as there are pathogens present; different "definite groups" can then combine the different combinations of presence of these different pathogens.
  • the determination may include a random forest method determination.
  • the method according to the invention may comprise a training comprising:
  • reference curves an acquisition of different DNA fusion curves, referred to as reference curves, from different reference biological samples belonging to different initial groups known and determined before learning, and then
  • a forest construction using the random forest method comprising a construction of several trees using the random forest method, each tree comprising, at each node, the use of one of the descriptors associated with a threshold and making it possible to separate the reference curves into two subsets, each leaf of each tree corresponding to only one group among the different possible groups.
  • the determination of the descriptors may include:
  • the elimination of certain descriptors may include, for each set of descriptors exhibiting two by two a Pearson correlation coefficient greater than 0.95, a conservation of a single descriptor.
  • the method according to the invention can comprise:
  • the method according to the invention can comprise:
  • the method according to the invention may furthermore comprise a calculation of a confidence index of the step of determining a membership of the biological measurement sample to a given group.
  • the calculation of the confidence index can include:
  • the method according to the invention may furthermore comprise, after the step of determining a membership of the biological measurement sample to a particular group, a refusal to assign the biological measurement sample to any group whatsoever. according to the value of the confidence index.
  • a device for classifying a biological measurement sample comprising:
  • each measurement curve preferably comprising different points, each point corresponding to a quantity proportional or representative of a rate or quantity of denaturation of the DNA of the measurement sample as a function of a temperature ,
  • the means arranged and / or programmed for the determination preferably comprise means arranged and / or programmed for a determination by a random forest method.
  • the device according to the invention may comprise means arranged and / or programmed for learning comprising:
  • reference curves means arranged and / or programmed for acquisition of different DNA fusion curves, referred to as reference curves, from different reference biological samples belonging to different known initial groups and determined before learning, and then
  • each tree comprising, at each node, the use of one of the descriptors associated with a threshold and for separating the reference curves into two subsets, each sheet of each tree corresponding to only one group among the different possible groups.
  • the means arranged and / or programmed for the determination of the descriptors may comprise:
  • the means arranged and / or programmed for the elimination of certain descriptors may comprise means arranged and / or programmed for, for each set of descriptors exhibiting two by two a Pearson correlation coefficient greater than 0.95, a conservation of a single descriptor.
  • the device according to the invention can comprise:
  • the device according to the invention can comprise:
  • the device according to the invention may furthermore comprise means arranged and / or programmed for calculating a confidence index of the step of determining a membership of the biological measurement sample to a given group.
  • the means arranged and / or programmed for calculating the confidence index preferably comprise:
  • the device according to the invention may furthermore comprise means arranged and / or programmed for, after the step of determining a membership of the biological measurement sample to a particular group, a refusal to affect the biological sample. to any group based on the value of the confidence index.
  • FIG. 1 is a flowchart of a preferred embodiment of the method according to the invention
  • FIG. 2 illustrates several so-called “reference" melting curves 12 for learning of the method embodiment of the invention
  • FIG. 3 illustrates:
  • FIG. 4 illustrates several reference fusion curves (technical replicates) of several samples (biological replicates) all belonging to the initial group "Mycobacterium fortuitum",
  • FIG. 5 illustrates several reference merge curves
  • FIG. 6 illustrates an example of a tree of a random forest, generated in one case with three descriptors ⁇ , ⁇ and ⁇ and with two possible groups (group 1 and group 2); the affirmative answer to the question of each node is to choose the subsequent branch of left; the negative answer to the question of each node corresponds to choosing the next branch of right;
  • FIG. 7 graphically illustrates the principle of a confidence indicator according to the invention
  • FIG. 8 is a ROC curve associated with the use of the confidence index based on the intra-group proximities for discriminating the observations assigned to the right group or not, and
  • FIG. 9 schematically illustrates an embodiment of device 100 according to the invention.
  • variants of the invention comprising only a selection of characteristics described or illustrated subsequently isolated from the other characteristics described or illustrated (even if this selection is isolated within a sentence including these other characteristics), if this selection of characteristics is sufficient to confer a technical advantage or to differentiate the invention from the state of the invention. prior art.
  • This selection comprises at least one preferably functional characteristic without structural details, and / or with only a part of the structural details if this part alone is sufficient to confer a technical advantage or to differentiate the invention from the state of the art. earlier.
  • the objective of this embodiment is to be able to discriminate different species.
  • a discrimination of different species of the genus Mycobacterium is chosen.
  • a “biological sample” is any type of sample containing, or likely to contain, biological material.
  • it is a sample likely to contain mycobacteria and / or a sample likely to contain deoxyribonucleic acid (or "DNA”), or traces of DNA of mycobacteria. Principle of obtaining a melting curve.
  • the so-called “high resolution DNA fusion” molecular biology technique is also referred to as “HRM” (for "high resolution melting”).
  • HRM high resolution melting
  • This HRM technique is performed from double-stranded DNA.
  • a fragment of the DNA in which mutations of interest are likely to be localized, is amplified by a PCR reaction (for "polymerase chain reaction”).
  • the sample then contains a large number of copies of the DNA fragment targeted and amplified by the PCR reaction.
  • the HRM analysis then consists in precisely and controlled heating of the amplified DNA fragment by PCR to cause its denaturation. The monitoring of the denaturation of the DNA, during the HRM analysis, thus makes it possible to determine a specific fusion profile of the target DNA fragment.
  • the "melting profile” (also called “melting curve”) corresponds to the evolution of the denaturation of one (or average of each) DNA molecule as a function of temperature.
  • a melting curve is not necessarily a graphical curve, but may be a list or an array of values of several points of this curve during this denaturation of one (or on average of each ) DNA molecule as a function of temperature.
  • the PCR reaction comprises, for example, the repetition of the cycle consisting of the following 3 steps:
  • the three steps constituting the PCR cycle correspond to steps:
  • the cycle is typically repeated 40 to 50 times, preferably 45 times.
  • Said PCR reaction is preferably preceded by an initial denaturation step of the DNA contained in said biological sample, preferably at 95 ° C for 10 minutes.
  • This initial denaturation step is a heating step performed before the PCR cycle. It makes it possible to prepare the DNA of the sample, which will serve as a matrix during the amplification reaction, in particular in completely dehybridizing the double-stranded DNA, breaking the secondary structures of the DNA or activating the DNA polymerase.
  • Said PCR reaction is for example carried out using a reaction mixture comprising at least:
  • Said PCR reaction is for example followed by a progressive heating step between 60 ° C. and 100 ° C., preferably from 65 ° C. to 95 ° C., to carry out a denaturation of said amplification product, and obtain a melting profile. said amplification product.
  • This progressive heating step corresponds to a heating of the sample carried out in a controlled manner, during which the temperature gradually increases stepwise over time, such as for example an increase of 0.2 ° C./second.
  • the denaturation of said amplification product is typically followed by means of a fluorescent marker, preferably selected from LC Green, LC Green Plus, ResoLight, EvaGreen, Chromofy, and SYTO 9.
  • a fluorescent marker preferably selected from LC Green, LC Green Plus, ResoLight, EvaGreen, Chromofy, and SYTO 9.
  • the amplification and melting steps were performed using the LightCycler® 480 master kit (Roche) high resolution fusion kit.
  • the reaction mixture consists of 2X Master Mix, MgCl 2 , sense and antisense primers, genomic DNA and water, in a final volume of 10 ⁇ l.
  • the amplification procedure consists of an initial denaturation followed by 45 cycles of denaturation, hybridization and elongation.
  • the melting program is carried out by heating at 95 ° C for 1 minute, cooling to 40 ° C for 1 min, followed by applying a temperature increase of 65 to 95 ° C with a step speed. 0.2 ° C / sec and continuous fluorescence measurement. Each reaction was carried out in triplicate in 96-well plates, with the system
  • Each H RM assay includes a negative control where the DNA template has been replaced with water. It will be appreciated that, advantageously for the invention, it is easier to obtain a melting curve than to measure the expression of a subset of genes. Learning
  • the method embodiment of the invention comprises a learning 6 comprising:
  • reference curves an acquisition 1 of different DNA fusion curves, called reference curves, from different reference biological samples belonging to different known “initial groups” and determined before learning, then a determination 2, 3 of descriptors to from the reference curves and then
  • a construction 8 of a forest according to the random forest method comprising a construction of several trees according to the random forest method, each tree comprising, at each node, the use of one of the descriptors associated with a threshold and making it possible to separate the reference curves into two subsets, each leaf of each tree corresponding to only one group among the different possible groups.
  • a classification tree a sheet always corresponds to a single group which is, in general, the majority group of observations that "fall” in this sheet. The peculiarity of pure leaves is that all the observations of the reference sample that "fall” in this sheet belong to the same group.
  • the "possible groups”, among which we will then seek to classify an unknown biological sample consist of the different "initial groups” of the different reference biological samples used during the learning stage, possibly modified (for example by least one group separation step and / or at least one group unification step as described later for group rationalization).
  • the "possible groups” comprise at least a portion of the different "initial groups”
  • library of standardized learning fusion profiles with assignment, for each, to a predefined initial group Each initial group must be represented by several biological replicates. Each biological replicate must be represented by several technical replicates.
  • Determination of the descriptors Then, one proceeds to the determination of the descriptors.
  • Descriptor determination 2, 3 firstly comprises a preliminary determination of descriptors from "reference” D (T) fusion curves (Denaturation "D” of DNA (typically in% or in fluorescence signal). depending on the temperature "T”), for which we consider:
  • i th percentile the temperature of a standard melting curve which i% of the denaturation of the DNA took place.
  • the fusion curves stricto sensu are additionally derived data enabling the curves to be described more precisely:
  • the determination 2, 3 of the descriptors comprises:
  • the method embodiment of the invention can be applied to a large number of problems or applications of varied learning complexity. It may be necessary to discriminate groups that are genetically more or less close. It is therefore impossible, a priori, to know if all the initial groups will be differentiable by their melting curves. Therefore, when learning a step of "rationalization of groups" is inserted. It makes it possible to define the perimeter of the initial groups differentiable or not. This step is the result of two main findings:
  • the method embodiment of the invention (specifically learning 6) comprises:
  • an identification of several reference curves corresponding to the same initial group called ambiguous group (as for example the initial group "M. fortuitum” ( Figure 4), the initial group "M. kansasii”), and having profiles separated into several subgroups; this identification is for example implemented using an intra-group distance criterion for which a threshold is defined, and
  • the method embodiment of the invention (more specifically learning 6) comprises:
  • the "group rationalization" stage may, in addition, be iterative, after construction of the random forest described below.
  • a first step after optimization of the parameters, we apply the method of Random Forests adapted in cross validation in two blocks. The biological replicates assigned to the wrong group are then identified. For each of these replicates, a new group is created that groups this misplaced replicate and the closest biological replicate to the wrongly assigned group. So we created a "hybrid” group with a double label. This is repeated until all biological replicates of the training sample are correctly assigned. At the end of this step, a number of groups having one or more "labels" are obtained.
  • this step may comprise the creation of hybrid groups comprising several initial groups. But, it is very valuable in a predictive context with a large number of groups to have the opportunity to significantly reduce the number of possibilities. Especially since with this method, we do not force the whole group to merge with another but we reason on the scale of the biological replicate. Thus, if an initial group is heterogeneous with a subset of biological replicates that is close to another group, two final possible groups will ultimately be obtained: a final group comprising only replicates of the initial group and a hybrid final group .
  • Learning 6 finally includes construction of the forest according to the random forest method.
  • this random forest method is here adapted to the structure of the data in technical replicates / biological replicates according to the invention.
  • the technical replicates make it possible to account for the technical variability of obtaining the fusion profiles (rather limited variability).
  • Biological variability is at the heart of learning because it reflects the variability to which the method embodiment of the invention will be confronted under real conditions of use. It is related to the differences of sequences that can be observed between individuals of the same possible group.
  • Each node 17 corresponds to a question asked with respect to a descriptor, typically: does this descriptor have a value less (or less than or equal to) a threshold?
  • Each sheet 18 corresponds to one of the k possible final groups. Learning the confidence index:
  • the Random Forests method makes it possible to calculate proximities between observations by studying the number of trees in which two observations "fall” in the same sheet. This proximity is used to calculate a confidence indicator of the prediction and thus to possibly refuse to assign an observation to one of the possible groups.
  • the distribution of the proximities two by two of all the pairs of biological replicas of the learning library belonging to the same possible group is calculated.
  • the proximities between biological replicates are defined by the minimum value of the proximities calculated between its technical replicates (the so-called complete link method).
  • This distribution can be smoothed by a kernel method. This operation is repeated for each possible group, thus obtaining a distribution of intra-group distances specific to each group.
  • Prediction is the current step of the method embodiment of the invention. Its purpose is to apply the decision rule to a biological sample in order to obtain an assignment to one of the possible final groups (also called “classes") obtained at the end of the apprenticeship (especially after the rationalization of groups), this allocation being accompanied by a confidence indicator. So we have :
  • a set of fusion profiles obtained from the same biological "measurement” sample.
  • the objective of the method embodiment of the invention is then, from the description of "measurement" samples by their melting curve, to decide whether or not to assign this individual to one of the k final possible groups defined during the learning (supervised method) and to assign a confidence indicator to the proposed decision.
  • the method embodiment according to the invention comprises an acquisition (9) of at least one normalized curve (as seen above) of DNA fusion of the biological measurement sample, said at least one measurement curve.
  • each measurement curve comprising different points, each point corresponding to a proportional quantity (for example a fluorescence signal) or representative of a rate (typically in%) or of a denaturation amount of the sample DNA measuring according to a temperature;
  • this acquisition may comprise the realization of the PCR and the melting curve itself (in the laboratory), and / or a simple download of data (computer data, for example) from this melting curve.
  • carrying out the PCR for this melting curve can be obtained in the simultaneous presence of several pairs of primers targeting several DNA target molecules. This is called “multiplexing" conditions.
  • the embodiment of the method according to the invention further comprises a determination 10, by the method of random forests based on the forest of trees constructed during the learning phase, of a membership of the biological sample of measurement to a group defined among k different final possible groups.
  • This determination comprises an analysis, by the method of random forests based on the forest of trees constructed during the learning phase, of descriptors resulting from the at least one measurement curve, the descriptors comprising:
  • the technical replicates of the biological sample of measurement are submitted independently to the random forest and a possible group is assigned to each of them.
  • the biological sample of measurement is assigned to the majority group among the predicted groups for each technical replicate.
  • the confidence index can be used to decide.
  • the quality of the method embodiment of the invention is conditioned by the quality of the initial training library. The more it is rich in biological variability, the more the learning will be precise and generalizable to a great diversity of new samples.
  • the method embodiment of the invention comprises a calculation of a confidence index of the step of determining a membership of the measurement biological sample to a specific group.
  • Random forests have the advantage of providing proximity measurements between observations.
  • proximity for more details on this well-known notion of "proximity" in the random forest method, reference can be made, for example, to references [3] and [4].
  • the distribution of the mean proximities of the reference merging curves of the same possible group was calculated. Then, when a biological measurement sample is assigned to a possible group, its average proximity to the biological replicates of that group is calculated and compared to the proximities of the reference melting curves of that possible group. It is then possible to calculate the percentage of reference melting curves whose proximity is less than that of the measurement fusion curve to be predicted. This percentage is an estimate of the probability of belonging to the predicted group and is used as a confidence index.
  • FIG. 7 illustrates the principle of this index with two possible groups 22, 23 to which reference reference curves (cross) respectively 32 and 33 belong.
  • the sample corresponding to the curves 13a is considered to belong to the group 22, and the method embodiment according to the invention confirms that the determined group is indeed the group 22.
  • the sample corresponding to curves 13b does not belong to group 22 or group 23, and preferably the method embodiment according to the invention comprises a refusal to assign the biological measurement sample to the determined group 22 and even possibly to any group.
  • the mean proximity to the reference biological replicates of the group to which it has been assigned is calculated by the same method. We then use the global distribution obtained previously to calculate the estimate of the probability of belonging to this group. . If the new observation passes this step, the probability of belonging to this possible group is provided to the user at the same time as the predicted group.
  • This figure 8 is of excellent quality. Indeed, with reference to FIG. 7, if a threshold value equal to 0.14 is used for the confidence index, then all the observations having an index lower than this threshold (symbolized by the loop 19) are poor observations. ranked when only a well ranked observation at an index above this threshold. Thanks to this index one can therefore very satisfactorily identify well-ordered observations.
  • the proximity to all the possible groups can again be calculated predicted at least once (on all trees in the forest) for a biological replicate. If one of these possible groups exhibits an index greater than the threshold of 0.14, this measurement curve can be marked as possibly belonging to the possible group having the maximum index value.
  • the confidence index can be used to separate two possible groups that would have been assigned the same number of times to a measurement fusion curve.
  • the calculation of the confidence index includes: a calculation of a distribution of mean proximities between reference curves belonging to the determined group,
  • the method embodiment of the invention comprises (as a result providing step 11, typically displayed on a screen or stored in a computer or electronic memory) a refusal or not to assign the biological sample of measurement to any possible group according to the value of the index of confidence, more exactly:
  • step 10 of descriptor analysis application of the random forest, determination of the determined group among the several possible groups, calculation of the confidence index and decision to confirm the assignment of the biological measurement sample to the determined group or refusal to assign the biological measurement sample to any group,
  • Figure 9 schematically illustrates an embodiment of device 100 according to the invention arranged and programmed to implement this embodiment of the method according to the invention.
  • the device 100 comprises means 102 arranged for and programmed to implement each of the following steps:
  • step 10 of descriptor analysis application of the random forest, determination of the determined group among the several possible groups, calculation of the confidence index and decision to confirm the assignment of the biological measurement sample to the determined group or refusal to assign the biological measurement sample to any group
  • the device 100 comprises means 101 and 102 arranged for and / or programmed to implement:
  • the acquisition step 9 of at least one measurement curve is the acquisition step 9 of at least one measurement curve.
  • the means 102 comprise a computer, and / or a central or computing unit, and / or an analog electronic circuit (preferably dedicated), and / or a digital electronic circuit (preferably dedicated), and / or a microprocessor (of dedicated preference), and / or software means. These means 102 also preferably comprise a screen or printing means or data export means for the step 11 of supplying or displaying the result.
  • the means 101 comprise a PCR machine, and / or according to the variant may comprise computer means (software combined with a USB port, an SD card reader, a connection to a computer network, etc.) arranged and programmed to load and read DNA fusion curves.
  • these means 101 are connected or are part of the means 102.
  • the invention is not limited to the examples which have just been described and numerous adjustments can be made to these examples without departing from the scope of the invention. .
  • the invention is applicable to any biological sample, in particular human, animal, plant, viral, bacterial, archaeal, fungal, yeast, viroid, eukaryotic, or protozoan .
  • biological sample in particular human, animal, plant, viral, bacterial, archaeal, fungal, yeast, viroid, eukaryotic, or protozoan .
  • the various features, shapes, variants and embodiments of the invention can be associated with each other.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de classification d'un échantillon biologique de mesure, comprenant : -une acquisition d'au moins une courbe de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure, dite au moins une courbe de mesure, -une détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé parmi différents groupes possibles, par une analyse de descripteurs issus de l'au moins une courbe de mesure, caractérisé en ce que les descripteurs comprennent un ou plusieurs points de la dérivée première de chaque courbe de mesure et/ou comprennent un ou plusieurs points de la dérivée seconde de chaque courbe de mesure et/ou un ou plusieurs points de chaque courbe de mesure et/ou un ou plusieurs percentiles de chaque courbe de mesure. L'invention concerne aussi un dispositif (100) mettant en œuvre ce procédé.

Description

« Procédé de classification d'un échantillon biologique »
Domaine technique
La présente invention concerne un procédé de classification d'un échantillon biologique, et un dispositif associé.
Un tel dispositif permet à un utilisateur de classifier un échantillon biologique parmi plusieurs groupes possibles. Le domaine de l'invention est celui de la classification biologique.
Etat de la technique antérieure
On connaît le document WO2013/166373, qui décrit un procédé de la détermination du statut de régulation de la voie de signalisation IL- 6/STAT3 dans un échantillon cellulaire ou chez un sujet. Le statut de régulation de la voie de signalisation IL-6/STAT3 dans un échantillon cellulaire ou chez un sujet peut être analysé sur la base du niveau d'expression d'un ou plusieurs parmi 16 gènes d'une signature d'expression. L'expression de biomarqueurs est de préférence déterminée par RT-PCR à l'aide de procédés SYBR Green, et des données d'expression sont analysées et comparées à un échantillon témoin par l'utilisation de la méthode à forêt aléatoire. La détermination des variables sélectionnées (ici les 16 gènes) est spécifique à la problématique et doit être manuellement réalisée pour chaque nouvelle problématique.
Certains problèmes techniques peuvent se poser pour un procédé de classification d'un échantillon biologique dans un groupe, notamment lorsque le nombre de groupes possibles est important, par exemple :
- Comment améliorer la finesse de la classification ? et/ou
- Comment être capable de traiter un échantillon qui n'appartient à aucun groupe connu ?
- Comment automatiser le procédé, sans sélection manuelle de variables ?
Le but de la présente invention est de résoudre au moins un de ces problèmes. Exposé de l'invention
Cet objectif est atteint avec un procédé de classification d'un échantillon biologique de mesure, comprenant :
- une acquisition d'au moins une courbe de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure, dite au moins une courbe de mesure (de préférence une acquisition de plusieurs courbes de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure, aussi appelées réplicats techniques), typiquement chaque courbe de mesure comprenant différents points, chaque point correspondant à une grandeur proportionnelle ou représentative d'un taux ou d'une quantité de dénaturation de l'ADN de l'échantillon de mesure en fonction d'une température,
- une détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé parmi différents groupes possibles, par une analyse de descripteurs issus de l'au moins une courbe de mesure,
caractérisé en ce que les descripteurs comprennent :
- un ou plusieurs (de préférence plusieurs) point(s) de la dérivée première de chaque courbe de mesure et/ou comprennent un ou plusieurs (de préférence plusieurs) point(s) de la dérivée seconde de chaque courbe de mesure, et/ou
- un ou plusieurs (de préférence plusieurs) point(s) de la dérivée première de chaque courbe de mesure et comprennent un ou plusieurs (de préférence plusieurs) point(s) de la dérivée seconde de chaque courbe de mesure, et/ou
- un ou plusieurs point(s) de chaque courbe de mesure, et/ou
- un ou plusieurs percentile(s) de chaque courbe de mesure.
L'acquisition d'au moins une courbe de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure peut comprendre l'acquisition d'au moins une courbe de fusion d'un résultat d'une PCR obtenue en présence simultanée de plusieurs couples d'amorces ciblant plusieurs molécules cibles d'ADN, correspondants par exemple à plusieurs pathogènes. On parle alors de conditions de « multiplexage ». Ce mode de réalisation est utile pour accélérer les recherches, par exemple pour plusieurs pathogènes très rarement présents en commun dans un même échantillon biologique. Les cas rares, par exemple de plusieurs pathogènes présents en commun dans un échantillon, sont identifiés : typiquement, la courbe de fusion a autant de points d'inflexion que de pathogènes présents ; différents « groupes déterminés » peuvent alors réunir les différentes combinaisons de présence de ces différents pathogènes.
La détermination peut comprendre une détermination par une méthode des forêts aléatoires. Le procédé selon l'invention peut comprendre un apprentissage comprenant :
- une acquisition de différentes courbes de fusion d'ADN, dites courbes de référence, à partir de différents échantillons biologiques de référence appartenant à différents groupes initiaux connus et déterminés avant l'apprentissage, puis
une détermination des descripteurs à partir des courbes de référence, puis
une construction d'une forêt selon la méthode des forêts aléatoires, comprenant une construction de plusieurs arbres selon la méthode des forêts aléatoires, chaque arbre comprenant, à chaque nœud, l'utilisation d'un des descripteurs associé à un seuil et permettant de séparer les courbes de référence en deux sous- ensembles, chaque feuille de chaque arbre ne correspondant qu'à un seul groupe parmi les différents groupes possibles.
La détermination des descripteurs peut comprendre :
- une détermination préliminaire de descripteurs, puis
- une élimination de certains descripteurs redondants.
L'élimination de certains descripteurs peut comprendre, pour chaque ensemble de descripteurs exhibant deux à deux un coefficient de corrélation de Pearson supérieur à 0,95, une conservation d'un seul descripteur.
Le procédé selon l'invention peut comprendre :
- après l'acquisition de différentes courbes de référence (et/ou de préférence avant la construction des arbres), une identification de plusieurs courbes de référence correspondant au même groupe initial, dit groupe ambigu, et présentant des profils séparés en plusieurs sous-groupes, et - une séparation de ce groupe ambigu en plusieurs groupes possibles. Le procédé selon l'invention peut comprendre :
- après l'acquisition de différentes courbes de référence (et/ou de préférence après la construction des arbres), une identification de plusieurs courbes de référence correspondant à plusieurs groupes initiaux, dit groupes confondus, et présentant des profils réunis en un seul groupe, et
- une unification de ces groupes confondus en un unique groupe possible.
Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre un calcul d'un indice de confiance de l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé. Le calcul de l'indice de confiance peut comprendre :
- un calcul d'une distribution de proximités moyennes entre courbes de référence appartenant au groupe déterminé,
- un calcul d'une proximité moyenne de l'au moins une courbe de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et
- un calcul d'un taux de courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et ayant une proximité moyenne aux autres courbes de référence appartenant au groupe déterminé inférieure à la proximité moyenne de l'au moins une courbe de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé.
Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, après l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé, un refus d'affecter l'échantillon biologique de mesure à quelque groupe que ce soit en fonction de la valeur de l'indice de confiance.
Suivant encore un autre aspect de l'invention, il est proposé un dispositif de classification d'un échantillon biologique de mesure, comprenant :
- des moyens agencés et/ou programmés pour une acquisition d'au moins une courbe de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure, dite au moins une courbe de mesure (de préférence une acquisition de plusieurs courbes de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure, aussi appelées réplicats techniques), typiquement chaque courbe de mesure comprenant de préférence différents points, chaque point correspondant à une grandeur proportionnelle ou représentative d'un taux ou d'une quantité de dénaturation de l'ADN de l'échantillon de mesure en fonction d'une température,
- des moyens agencés et/ou programmés pour une détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé parmi différents groupes possibles, par une analyse de descripteurs issus de l'au moins une courbe de mesure,
caractérisé en ce que les descripteurs comprennent :
- un ou plusieurs (de préférence plusieurs) point(s) de la dérivée première de chaque courbe de mesure et/ou comprennent un ou plusieurs (de préférence plusieurs) point(s) de la dérivée seconde de chaque courbe de mesure, et/ou
- un ou plusieurs (de préférence plusieurs) point(s) de la dérivée première de chaque courbe de mesure et comprennent un ou plusieurs (de préférence plusieurs) point(s) de la dérivée seconde de chaque courbe de mesure, et/ou
- un ou plusieurs point(s) de chaque courbe de mesure, et/ou
- un ou plusieurs percentile(s) de chaque courbe de mesure.
Les moyens agencés et/ou programmés pour la détermination comprennent de préférence des moyens agencés et/ou programmés pour une détermination par une méthode des forêts aléatoires. Le dispositif selon l'invention peut comprendre des moyens agencés et/ou programmés pour un apprentissage comprenant :
- des moyens agencés et/ou programmés pour une acquisition de différentes courbes de fusion d'ADN, dites courbes de référence, à partir de différents échantillons biologiques de référence appartenant à différents groupes initiaux connus et déterminés avant l'apprentissage, puis
- des moyens agencés et/ou programmés pour une détermination des descripteurs à partir des courbes de référence, puis des moyens agencés et/ou programmés pour une construction d'une forêt selon la méthode des forêts aléatoires, comprenant des moyens agencés et/ou programmés pour une construction de plusieurs arbres selon la méthode des forêts aléatoires, chaque arbre comprenant, à chaque nœud, l'utilisation d'un des descripteurs associé à un seuil et permettant de séparer les courbes de référence en deux sous-ensembles, chaque feuille de chaque arbre ne correspondant qu'à un seul groupe parmi les différents groupes possibles.
Les moyens agencés et/ou programmés pour la détermination des descripteurs peuvent comprendre :
- des moyens agencés et/ou programmés pour une détermination préliminaire de descripteurs,
- des moyens agencés et/ou programmés pour, après la détermination préliminaire, une élimination de certains descripteurs redondants.
Les moyens agencés et/ou programmés pour l'élimination de certains descripteurs peuvent comprendre des moyens agencés et/ou programmés pour, pour chaque ensemble de descripteurs exhibant deux à deux un coefficient de corrélation de Pearson supérieur à 0,95, une conservation d'un seul descripteur.
Le dispositif selon l'invention peut comprendre :
- des moyens agencés et/ou programmés pour, après l'acquisition de différentes courbes de référence (et/ou de préférence avant la construction des arbres), une identification de plusieurs courbes de référence correspondant au même groupe initial, dit groupe ambigu, et présentant des profils séparés en plusieurs sous-groupes, et
- des moyens agencés et/ou programmés pour une séparation de ce groupe ambigu en plusieurs groupes possibles.
Le dispositif selon l'invention peut comprendre :
- des moyens agencés et/ou programmés pour, après l'acquisition de différentes courbes de référence (et/ou de préférence après la construction des arbres), une identification de plusieurs courbes de référence correspondant à plusieurs groupes initiaux, dit groupes confondus, et présentant des profils réunis en un seul groupe, et
- des moyens agencés et/ou programmés pour une unification de ces groupes confondus en un unique groupe possible.
Le dispositif selon l'invention peut comprendre en outre des moyens agencés et/ou programmés pour un calcul d'un indice de confiance de l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé. Les moyens agencés et/ou programmés pour le calcul de l'indice de confiance comprennent de préférence:
- des moyens agencés et/ou programmés pour un calcul d'une distribution de proximités moyennes entre courbes de référence appartenant au groupe déterminé,
- des moyens agencés et/ou programmés pour un calcul d'une proximité moyenne de l'au moins une courbe de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et
- des moyens agencés et/ou programmés pour un calcul d'un taux de courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et ayant une proximité moyenne aux autres courbes de référence appartenant au groupe déterminé inférieure à la proximité moyenne de l'au moins une courbe de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé.
Le dispositif selon l'invention peut comprendre en outre des moyens agencés et/ou programmés pour, après l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé, un refus d'affecter l'échantillon biologique de mesure à quelque groupe que ce soit en fonction de la valeur de l'indice de confiance.
Description des figures et modes de réalisation
D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée de mises en œuvre et de modes de réalisation nullement limitatifs, et des dessins annexés suivants :
- la figure 1 est un organigramme d'un mode de réalisation préféré de procédé selon l'invention, - la figure 2 illustre plusieurs courbes de fusion 12 dites « de référence », pour un apprentissage du mode de réalisation de procédé selon l'invention,
- la figure 3 illustre :
° plusieurs courbes de fusion normalisées 13 (réplicats
« techniques ») dites « de mesure » d'un échantillon dont on cherche à déterminer l'appartenance à un groupe déterminé parmi plusieurs groupes possibles,
° les percentiles 14 de ces courbes de mesure
° les dérivées premières 15 de ces courbes de mesure
° les dérivées secondes 16 de ces courbes de mesure
- la figure 4 illustre plusieurs courbes de fusion de référence (réplicats techniques) de plusieurs échantillons (réplicats biologiques) appartenant tous au groupe initial « Mycobacterium fortuitum »,
- la figure 5 illustre plusieurs courbes de fusion de référence
(réplicats techniques) de plusieurs échantillons (réplicats biologiques) appartenant au groupe initial « M. avium» ou « M. szulgai »,
- la figure 6 illustre un exemple d'un arbre d'une forêt aléatoire, généré dans un cas à trois descripteurs α, β et δ et avec deux groupes possibles (groupe 1 et groupe 2) ; la réponse affirmative à la question de chaque nœud correspond à choisir la branche subséquente de gauche ; la réponse négative à la question de chaque nœud correspond à choisir la branche subséquente de droite ;
- la figure 7 illustre graphiquement le principe d'un indicateur de confiance selon l'invention,
- la figure 8 est une courbe ROC associée à l'utilisation de l'indice de confiance basé sur les proximités intra-groupe pour discriminer les observations affectées au bon groupe ou non, et
- la figure 9 illustre schématiquement un mode de réalisation de dispositif 100 selon l'invention.
Ces modes de réalisation n'étant nullement limitatifs, on pourra notamment considérer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites ou illustrées par la suite isolées des autres caractéristiques décrites ou illustrées (même si cette sélection est isolée au sein d'une phrase comprenant ces autres caractéristiques), si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure. Cette sélection comprend au moins une caractéristique de préférence fonctionnelle sans détails structurels, et/ou avec seulement une partie des détails structurels si cette partie uniquement est suffisante pour conférer un avantage technique ou à différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure.
On va donc décrire, en référence aux figures 1 à 8, un mode de réalisation préféré de procédé selon l'invention. Dans la suite de la présente description, l'expression « procédé selon l'invention » désignera uniquement ce mode de réalisation nullement limitatif.
L'objectif de ce mode de réalisation est de pouvoir discriminer différentes espèces. On choisit pour exemple nullement limitatif une discrimination de différentes espèces du genre Mycobacterium .
Dans ce mode de réalisation, un "échantillon biologique" correspond à tout type d'échantillon contenant, ou susceptible de contenir, de la matière biologique. De préférence, il s'agit d'un échantillon susceptible de contenir des mycobactéries et/ou d'un échantillon susceptible de contenir de l'acide désoxyribonucléique (ou « ADN »), ou des traces d'ADN de mycobactéries. Principe d'obtention d'une courbe de fusion.
Dans ce mode de réalisation, la technique de biologie moléculaire dite de « fusion d'ADN à haute résolution » est également nommée "HRM" (pour « high resolution melting »). Cette technique HRM est réalisée à partir d'ADN double brin. Avant l'analyse par HRM, un fragment de l'ADN, dans lequel sont susceptibles d'être localisées des mutations d'intérêt, est amplifié par une réaction PCR (pour « polymerase chain reaction »). L'échantillon contient alors un grand nombre de copies du fragment d'ADN ciblé et amplifié par la réaction PCR. L'analyse HRM consiste ensuite à chauffer de manière précise et contrôlée le fragment d'ADN amplifié par PCR pour provoquer sa dénaturation. Le suivi de la dénaturation de l'ADN, lors de l'analyse HRM, permet ainsi de déterminer un profil de fusion spécifique du fragment d'ADN cible.
Le « profil de fusion » (aussi appelé « courbe de fusion ») correspond à l'évolution de la dénaturation d'une (ou en moyenne de chaque) molécule d'ADN en fonction de la température. Au sens de l'invention, une courbe de fusion n'est pas nécessairement une courbe graphique, mais peut être une liste ou un tableau de valeurs de plusieurs points de cette courbe au cours de cette dénaturation d'une (ou en moyenne de chaque) molécule d'ADN en fonction de la température.
La réaction PCR comprend par exemple la répétition du cycle constitué des 3 étapes suivantes :
- une étape à une température de 90°C à 99°C, pendant 5 à 30 secondes,
suivie d'une étape à une température de 58°C à 64°C, pendant 5 à 30 secondes,
suivie d'une étape à une température de 70 à 74°C, pendant 5 secondes à 1 minute.
Les trois étapes constituant le cycle de PCR correspondent respectivement à des étapes :
- de dénaturation de l'ADN (de 90°C à 99°C),
- d'hybridation de l'ADN avec les amorces (de 58°C à 64°C),
- et d'élongation de l'ADN par l'ADN polymérase à partir des amorces
(de 70°C à 74°C).
Le cycle est typiquement répété de 40 à 50 fois, de préférence 45 fois.
Ladite réaction PCR est de préférence précédée d'une étape de dénaturation initiale de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, de préférence à 95°C pendant 10 minutes.
Cette étape de dénaturation initiale est une étape de chauffage effectuée avant le cycle PCR. Elle permet de préparer l'ADN de l'échantillon, qui va servir de matrice durant la réaction d'amplification, notamment en déshybridant complètement l'ADN double brin, en cassant les structures secondaires de l'ADN ou encore en activant l'ADN polymérase.
Ladite réaction PCR est par exemple effectuée en utilisant un mélange réactionnel comprenant au moins :
- l'ADN contenu dans l'échantillon biologique
du MgCI2 à raison de 3 mM,
les amorces à raison de 0,4 μΜ, et
au moins une unité d'ADN polymérase.
Ladite réaction PCR est par exemple suivie d'une étape de chauffage progressif entre 60°C et 100°C, de préférence de 65°C à 95°C, pour réaliser une dénaturation dudit produit d'amplification, et obtenir un profil de fusion dudit produit d'amplification .
Cette étape de chauffage progressif correspond à un chauffage de l'échantillon réalisé de manière contrôlée, au cours duquel la température augmente progressivement par paliers au cours du temps, comme par exemple une augmentation de 0,2°C/seconde.
La dénaturation dudit produit d'amplification est typiquement suivie à l'aide d'un marqueur fluorescent, de préférence choisi parmi le LC Green, le LC Green Plus, le ResoLight, l'EvaGreen, le Chromofy, et le SYTO 9.
Les étapes d'amplification et de fusion ont été réalisées en utilisant le kit de fusion haute résolution LightCycler® 480 master kit (Roche) . Le mélange réactionnel est composé de 2X Master Mix, MgCI2, d'amorces sens et antisens, d'ADN génomique et d'eau, dans un volume final de 10 pl . La procédure d'amplification consiste en une dénaturation initiale suivie par 45 cycles de dénaturation, hybridation et élongation . Après amplification, le programme de fusion est réalisé par chauffage à 95°C pendant 1 minute, refroidissement à 40°C pendant 1 min, suivi de l'application d'une augmentation de température de 65 à 95°C avec une vitesse de palier de 0,2°C/s et d'une mesure de la fluorescence en continu . Chaque réaction a été effectuée en triple dans des plaques à 96 puits, avec le système
LightCycler® 480 (Roche) . Chaque analyse H RM inclut un contrôle négatif où la matrice d'ADN a été remplacée par de l'eau . On notera que, de manière avantageuse pour l'invention, il est plus facile d'obtenir une courbe de fusion que de mesurer l'expression d'un sous- ensemble de gènes. Apprentissage
Comme illustré sur la figure 1, le mode de réalisation de procédé selon l'invention comprend un apprentissage 6 comprenant :
- une acquisition 1 de différentes courbes de fusion d'ADN, dites courbes de référence, à partir de différents échantillons biologiques de référence appartenant à différents « groupes initiaux » connus et déterminés avant l'apprentissage, puis une détermination 2, 3 de descripteurs à partir des courbes de référence, puis
une construction 8 d'une forêt selon la méthode des forêts aléatoires, comprenant une construction de plusieurs arbres selon la méthode des forêts aléatoires, chaque arbre comprenant, à chaque nœud, l'utilisation d'un des descripteurs associé à un seuil et permettant de séparer les courbes de référence en deux sous- ensembles, chaque feuille de chaque arbre ne correspondant qu'à un seul groupe parmi les différents groupes possibles. Dans un arbre de classification une feuille correspond toujours à un seul groupe qui est, en général, le groupe majoritaire des observations qui "tombent" dans cette feuille. La particularité des feuilles pures est que toutes les observations de l'échantillon de référence qui "tombent" dans cette feuille appartiennent au même groupe.
Les « groupes possibles », parmi lesquels on va ensuite chercher à classer un échantillon biologique inconnu, consistent en les différents « groupes initiaux » des différents échantillons biologiques de référence utilisés lors de l'étape d'apprentissage, éventuellement modifiés (par exemple par au moins une étape de séparation de groupe et/ou au moins une étape d'unification de groupes tels que décrits par la suite pour la rationalisation des groupes). De préférence, les « groupes possibles » comprennent au moins une partie des différents « groupes initiaux » Cette phase d'apprentissage est réalisée une fois pour chaque type d'application (avec possibilité éventuelle de répétition de cette phase pour inclusion de nouveaux échantillons de référence et/ou de nouveaux groupes) . Elle a pour objectif de définir les groupes possibles (finaux) et de construire la règle de décision, avec :
- en entrées de l'étape d'apprentissage : librairie de profils de fusion d'apprentissage normalisés avec affectation, pour chacun, à un groupe initial prédéfini. Chaque groupe initial doit être représenté par plusieurs réplicats biologiques. Chaque réplicat biologique doit être représenté par plusieurs réplicats techniques.
- en sorties de l'étape d'apprentissage : règle de décision d'affectation
Importation du signal normalisé : pour l'étape d'acquisition 1 des différentes courbes de fusion d'ADN « de référence » servant à l'apprentissage, on utilise le protocole d'obtention de courbe de fusion précédemment décrit et en appliquant une méthode de normalisation telle que proposée par exemple par le logiciel associé au LightCycler® 480 (Roche), 6 séries d'expériences ont été menées à différentes dates permettant la production de 417 profils H RM (c'est-à-dire 417 courbes de fusion de référence) correspondant à 19 espèces (ou « groupes initiaux ») de Mycobacterium différentes. Chaque espèce est représentée par plusieurs réplicats techniques de plusieurs réplicats biologiques (2 à 20 réplicats biologiques par espèce) . On appelle « réplicats biologiques » les différents échantillons biologiques provenant de différents individus d'une même espèce. On appelle « réplicats techniques » d'un même réplicat biologique les différentes courbes de fusion obtenues à partir du même échantillon biologique. L'entrée du logiciel est un fichier texte contenant les coordonnées des profils de fusion après normalisation par le logiciel en sortie de machine.
La répartition des réplicats biologiques entre les espèces est donnée dans la Table 1 et la représentation des courbes de référence normalisées 12 associées à l'ensemble des réplicats techniques pour les différents réplicats biologiques est donnée dans la Figure 2. Espèce Nombre de réplicats biologiques
"M. abscessus" 3
"M. avium" 20
"M. bohemicum" 4
"M. bovis" 4
"M. chelonae" 4
"M. flavescens" 3
"M. fortuitum" 5
"M. gastri" 4
"M. gordonae" 5
"M. haemophilum" 3
"M. immunogenicum" 3
"M. kansasii" 9
"M. marinum" 4
"M. phlei" 4
"M. phocaicum" 4
"M. pseudoschottsi" 3
"M. smegmatis" 6
"M. szulgai" 4
"M. wolinski" 3
TOTAL 95
Table 1
Ces 19 espèces forment les 19 groupes initiaux.
Détermination des descripteurs : ensuite, on procède à la détermination des descripteurs. La détermination 2, 3 des descripteurs comprend d'abord une détermination préliminaire 2 des descripteurs à partir des courbes de fusion « de référence » D(T) (Dénaturation « D » de l'ADN (typiquement en % ou en signal de fluorescence) en fonction de la température « T »), pour laquelle on considère :
- Les points de mesure de chaque courbe de fusion normalisée (180 points dans le cas présent). On obtient ainsi 180 descripteurs qui permettent de caractériser chaque courbe de fusion.
- les percentiles (101 quantiles, de 0 à 100) : on nomme ieme percentile, la température d'une courbe de fusion normalisée à laquelle i% de la dénaturation de l'ADN a eu lieu. On obtient ainsi 101 descripteurs (obtenus par interpolation entre les points de mesure) correspondant aux 101 percentiles, et qui permettent de caractériser chaque courbe de fusion .
On adjoint en outre aux courbes de fusion stricto sensu, pour la détermination préliminaire 2 des descripteurs, des données dérivées permettant de décrire les courbes avec plus de précision :
• la dérivée numérique première de chaque courbe de fusion normalisée ^Β{Τ) ^ obtient ainsi, pour une courbe de fusion établie dT
initialement sur 180 points (i.e. 180 valeurs de taux de dénaturation), 178 descripteurs supplémentaires, qui permettent de caractériser chaque dérivée première de courbe de fusion .
• la dérivée numérique seconde de chaque courbe de fusion normalisée . On obtient ainsi, pour une courbe de fusion établie dT2
initialement sur 180 points (i.e. 180 valeurs de taux de dénaturation), 176 descripteurs supplémentaires, et qui permettent de caractériser chaque dérivée seconde de courbe de fusion .
On obtient finalement :
180+ 101 + 178+ 176= 635 descripteurs pour décrire chaque courbe de fusion ou réplicat technique.
La détermination 2, 3 des descripteurs comprend :
- la détermination préliminaire 2 de descripteurs précédemment décrite, puis
- une élimination 3 de certains descripteurs redondants.
La redondance de l'information est préjudiciable à l'apprentissage des groupes possibles. Or, il existe de très fortes corrélations entre valeurs successives sur une courbe de fusion ou sur ses dérivées. C'est pourquoi n'est conservé qu'un seul descripteur par ensemble de descripteurs exhibant deux à deux un coefficient de corrélation de Pearson supérieur à 0,95. Ainsi, l'élimination 3 de certains descripteurs comprend, pour chaque ensemble de descripteurs exhibant deux à deux un coefficient de corrélation de Pearson supérieur à 0,95, une conservation d'un seul descripteur. On retient finalement 208 descripteurs (parmi les 635 initiaux) après élimination des descripteurs redondants, dont : - 38 points de courbes de fusion
- 12 percentiles
- 59 points de la dérivée première
- 99 points de la dérivée seconde.
L'emplacement de chaque descripteur sélectionné est donné par des traits verticaux sur la Figure 3.
Ceci illustre bien l'avantage du procédé selon l'invention : on voit en effet que les dérivées (première et seconde, en particulier seconde) des courbes de fusion sont très riches en informations discriminantes permettant de déterminer qu'un échantillon biologique appartient à un groupe possible donné, car elles comprennent une grande partie des descripteurs finalement retenus. Cela se traduit par une discrimination plus fine des profils de fusion.
Rationalisation des groupes :
Le mode de réalisation de procédé selon l'invention peut être appliqué à un grand nombre de problèmes ou d'applications de complexité d'apprentissage variée. Il peut être amené à devoir discriminer des groupes génétiquement plus ou moins proches. Il est donc impossible, a priori, de savoir si tous les groupes initiaux seront différentiables par leurs courbes de fusion. C'est pourquoi, lors de l'apprentissage une étape de « rationalisation des groupes » est insérée. Elle permet de définir le périmètre des groupes initiaux différenciables ou non. Cette étape est le résultat de deux constatations principales :
certains groupes initiaux sont constitués de sous-groupes hétérogènes ;
certains groupes initiaux ne sont pas différentiables les uns des autres par leurs courbes de fusion.
Sur la Figure 2, on constate que :
1) les réplicats biologiques ou techniques peuvent présenter des profils très différents à l'intérieur d'un même groupe initial. Ce phénomène apparaît dans deux des groupes initiaux, notamment le groupe initial « M. fortuitum » illustré la Figure 4. Ainsi chacun de ces deux groupes initiaux est donc séparé en plusieurs (deux dans le cas présent) sous-groupes possibles pour l'apprentissage, cela permet de faciliter le travail d'apprentissage ; et
2) tous les réplicats biologiques ou techniques de groupes initiaux différents peuvent être assez compacts.
Ainsi, dans le cas 1) ci-dessus, le mode de réalisation de procédé selon l'invention (plus précisément l'apprentissage 6) comprend :
- après l'acquisition de d ifférentes courbes de référence (mais de préférence avant la construction des arbres), une identification de plusieurs courbes de référence correspondant au même groupe initial, dit groupe ambigu (comme par exemple le groupe initial « M . fortuitum » (figure 4), le groupe initial « M . kansasii »), et présentant des profils séparés en plusieurs sous-groupes ; cette identification est par exemple mise en œuvre en utilisant un critère de distance intra-groupe pour lequel est défini un seuil, et
- une séparation 4 de ce groupe ambigu en plusieurs groupes possibles 12a et 12 b.
De même, dans le cas 2) ci-dessus, le mode de réalisation de procédé selon l'invention (plus précisément l'apprentissage 6) comprend :
- après l'acquisition de d ifférentes courbes de référence (mais de préférence après la construction des arbres, la fusion ou unification des groupes pouvant nécessiter une première construction des arbres), une identification de plusieurs courbes de référence correspondant à plusieurs groupes initiaux, dit groupes confondus, et présentant des profils réunis en un seul groupe ; cette identification est par exemple mise en œuvre en utilisant des taux d'erreur d'apprentissage : si on fait des erreurs sur un groupe, on peut associer des observations mal classées aux observations dont elles sont le plus proche pour former un groupe fusionné ou unifié, et
- une unification 5 de ces groupes confondus en un unique groupe possible ;
Dans ce mode de réalisation de procédé selon l'invention, les groupes initiaux « M . szulgai » 12c et « M . avium » 12d et sont par exemple très proches, mais ne sont au final pas unifiés malgré leur proximité, grâce à la grande finesse d'analyse du procédé selon l'invention . On obtient au final les 21 groupes possibles finaux suivants listés dans la table 2 :
Nom de chacun des groupes possibles finalement utilisés dans la méthode des
forêts aléatoires
"M. abscessus"
"M. avium"
"M. bohemicum"
"M. bovis"
"M. chelonae"
"M. flavescens"
"M. fortuitum 1"
"M. fortuitum 2"
"M. gastri"
"M. gordonae"
"M. haemophilum"
"M. immunogenicum"
"M. kansasii 1"
"M. kansasii 2"
"M. marinum"
"M. phlei"
"M. phocaicum"
"M. pseudoschottsi"
"M. smegmatis"
"M. szulgai"
"M. wolinski"
Table 2
L'étape de « rationalisation des groupes » peut, en outre, être itérative, après construction de la forêt aléatoire décrite ci-après. Dans un premier temps, après optimisation des paramètres, on applique la méthode des Forêts Aléatoires adaptée en validation croisée en deux blocs. On repère alors les réplicats biologiques qui sont affectés au mauvais groupe. Pour chacun de ces réplicats, on crée un nouveau groupe rassemblant ce réplicat mal affecté et le réplicat biologique le plus proche du groupe affecté à tort. On a donc créé un groupe « hybride » comportant une double étiquette. On recommence jusqu'à ce que tous les réplicats biologiques de l'échantillon d'apprentissage soient correctement affectés. On obtient à l'issue de cette étape un certain nombre de groupes ayant une ou plusieurs « étiquettes » .
Bien entendu, cette étape peut comprendre la création de groupes hybrides comportant plusieurs groupes initiaux. Mais, il est très précieux dans un contexte de prédiction avec un grand nombre de groupes d'avoir la possibilité de réduire de façon importante le nombre de possibilités. D'autant plus qu'avec cette méthode, on ne force pas l'ensemble du groupe à fusionner avec un autre mais on raisonne à l'échelle du réplicat biologique. Ainsi, si un groupe initial est hétérogène avec un sous-ensemble de réplicats biologiques qui se rapproche d'un autre groupe, on obtiendra au final deux groupes possibles finaux : un groupe final ne comportant que des réplicats du groupe initial et un groupe final hybride.
Définition d'une méthode de prédiction et détermination des paramètres de la méthode d'apprentissage :
L'apprentissage 6 comprend enfin la construction 8 de la forêt selon la méthode des forêts aléatoires.
Le fonctionnement de cette méthode des forêts aléatoires est ici adapté à la structure des données en réplicats techniques / réplicats biologiques selon l'invention . Les réplicats techniques permettent de rendre compte de la variabilité technique de l'obtention des profils de fusion (variabilité assez limitée) . La variabilité biologique est au cœur de l'apprentissage car elle reflète la variabilité à laquelle le mode de réalisation de procédé selon l'invention sera confronté en conditions réelles d'utilisation . Elle est liée aux différences de séquences que l'on peut observer entre individus d'un même groupe possible.
Pour discriminer les k différents groupes possibles (k= 21 groupes possibles dans cet exemple, cf table 2), on utilise donc la méthode bien connue des forêts aléatoires (cf références [2], [3], [4] pour plus de détails concernant les généralités bien connues de cette méthode des forêts aléatoires) . Cette méthode, basée sur les arbres de classification, a pour principe de construire plusieurs arbres de classification en utilisant pour chaque arbre un sous-ensemble des n courbes de fusion de référence (aussi appelées « observations ») de départ (n =417 courbes de fusion de référence dans cet exemple) et, pour chaque nœud de l'arbre, un sous- ensemble des p descripteurs (aussi appelées « variables ») de départ (p = 208 descripteurs dans cet exemple) . Cette méthode dépend de deux paramètres : - ntree le nombre d'arbres construits, c'est-à-dire le nombre total d'arbres impliqués dans la règle de décision finale et
- mtry le nombre de descripteurs étudiés à chaque nœud de chaque arbre, avec mtry < p , c'est-à-dire le nombre de descripteurs aléatoirement choisis parmi l'ensemble des descripteurs disponibles lors de l'apprentissage de chaque nœud de chaque arbre.
Ces deux paramètres sont déterminés lors d'une étape d'optimisation 7 par validation croisée en deux blocs sur les données d'apprentissage (courbes de référence) . Pour cette étape 7 (qui fait partie de l'apprentissage 6), et pour chaque utilisation de validation croisée, on travaille à l'échelle du réplicat biologique, c'est-à-dire qu'à chaque étape de la validation croisée, les réplicats techniques d'un réplicat biologique sont soit tous affectés au bloc d'apprentissage, soit tous affectés au bloc de validation . Cette contrainte a l'avantage de mimer au plus près les conditions réelles d'apprentissage. Les paramètres choisis sont ceux qui maximisent les pourcentages de bien classés moyens obtenus sur 100 répartitions aléatoires en blocs apprentissage/test. Ainsi, pour chaque valeur possible du couple {ntree, mtry), on construit une forêt (avec plusieurs arbres) selon la méthode des forêts aléatoires sur la base de la moitié des n observations, puis on teste cette forêt sur l'autre moitié des n observations dont on connaît déjà en réalité l'appartenance ou non à chacun des k groupes possibles ; on sélectionne alors la valeur du couple {ntree, mtry) ayant construit les forêts qui donnent en moyenne (puisqu'on réalise 100 répartitions aléatoires dont 100 forêts pour chaque couple de valeurs) les meilleurs résultats. On obtient un nombre optimal de ntree= 1000 arbres et de mtry= 10 variables par nœud .
On construit alors les ntree= 1000 arbres de la forêt aléatoire en utilisant les n =417 observations.
Pour la construction de chaque arbre :
- on tire aléatoirement 100 observations (ou courbes de référence) parmi les n =417 disponibles, et
- à chaque nœud 17 de chaque arbre, on tire aléatoirement mtry= 10 descripteurs parmi les p= 208 disponibles, et on sélectionne, parmi les mtry = 10 descripteurs tirés, le descripteur et le seuil associé qui ensemble optimisent l'indice de Gini; il y a autant de nœuds que nécessaire pour que chaque fin de ramification 18 ou « feuille » 18 soit pure, c'est-à-dire que les observations qui y "tombent" appartiennent toutes au même groupe initial.
La figure 6 illustre un exemple d'arbre d'une forêt aléatoire, dans un cas à trois descripteurs α, β et δ (p = 3) et avec deux groupes possibles (k=2, groupe 1 et groupe 2). Cet arbre, même s'il ne correspond pas au cas du mode de réalisation de procédé selon l'invention de la figure 2 (k=21 groupes possibles, p = 208 descripteurs, avec des arbres beaucoup trop grands pour être illustrés) illustre parfaitement le principe des arbres construits dans ce mode de réalisation de procédé selon l'invention.
Chaque nœud 17 correspond à une question posée par rapport à un descripteur, typiquement : est ce que ce descripteur a une valeur inférieure (ou inférieure ou égale) à un seuil ?
Par exemple :
- Pour chacun des descripteurs faisant partie des points de courbes de fusion (38 descripteurs) : est-ce que le pourcentage de dénaturation (ou autre unité arbitraire de la courbe de fusion), pour une valeur de température spécifique à ce descripteur, a une valeur inférieure (ou inférieure ou égale) à un seuil donné ?
- Pour chacun des descripteurs faisant partie des percentiles (12 descripteurs) : est-ce que la température, pour une valeur de pourcentage de dénaturation (ou autre unité arbitraire de la courbe de fusion) spécifique à ce descripteur, a une valeur inférieure (ou inférieure ou égale) à un seuil donné?
- Pour chacun des descripteurs faisant partie des points de la dérivée première (59 descripteurs) : est-ce que la dérivée première de la courbe de fusion, pour une valeur de température spécifique à ce descripteur, a une valeur inférieure (ou inférieure ou égale) à un seuil donné?
- Pour chacun des descripteurs faisant partie des points de la dérivée seconde (99 descripteurs) : est-ce que la dérivée seconde de la courbe de fusion, pour une valeur de température spécifique à ce descripteur, a une valeur inférieure (ou inférieure ou égale) à un seuil donné?
Chaque feuille 18 correspond à un des k groupes possibles finaux. Apprentissage de l'indice de confiance :
Par construction, la méthode des Forêts Aléatoires permet de calculer des proximités entre observations par l'étude du nombre d'arbres dans lesquels deux observations « tombent » dans la même feuille. Cette proximité est utilisée pour calculer un indicateur de confiance de la prédiction et donc pour refuser éventuellement d'affecter une observation à un des groupes possibles.
Ainsi, après la construction de la forêt aléatoire, lors de la phase d'apprentissage 6, on calcule la distribution des proximités deux à deux de tous les couples de réplicats biologiques de la librairie d'apprentissage appartenant à un même groupe possible. On définit les proximités entre réplicats biologiques par la valeur minimale des proximités calculées entre ses réplicats techniques (méthode dite du lien complet). Cette distribution peut être lissée par une méthode à noyaux. On répète cette opération pour chaque groupe possible, on obtient ainsi une distribution des distances intra-groupes spécifique à chaque groupe.
Prédiction : classification d'un échantillon biologique inconnu, dit « de mesure »
La prédiction est l'étape courante du mode de réalisation de procédé selon l'invention. Elle a pour objectif d'appliquer la règle de décision à un échantillon biologique afin d'obtenir une affectation à l'un des groupes possibles finaux (aussi appelés « classes ») obtenus en sortie de l'apprentissage (notamment après l'étape de rationalisation des groupes), cette affectation étant assortie d'un indicateur de confiance. On a donc :
- en entrées de l'étape de prédiction : un ensemble de profils de fusion (réplicats techniques) obtenus à partir d'un même échantillon biologique « de mesure ».
- en sorties de l'étape de prédiction : décision d'affectation de l'échantillon « de mesure » avec indicateur de confiance, ou éventuellement un refus d'affectation à l'un quelconque des groupes possibles.
En effet, l'objectif du mode de réalisation de procédé selon l'invention est ensuite, à partir de la description d'échantillons « de mesure » par leur courbe de fusion, de décider d'affecter ou non cet individu à l'un des k groupes possibles finaux définis lors de l'apprentissage (méthode supervisée) et d'affecter un indicateur de confiance à la décision proposée.
Ainsi, le mode de réalisation de procédé selon l'invention comprend une acquisition (9) d'au moins une courbe normalisée (comme vu précédemment) de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure, dite au moins une courbe de mesure, chaque courbe de mesure comprenant différents points, chaque point correspondant à une grandeur proportionnelle (par exemple un signal de fluorescence) ou représentative d'un taux (typiquement en %) ou d'une quantité de dénaturation de l'ADN de l'échantillon de mesure en fonction d'une température ; cette acquisition peut comprendre la réalisation de la PCR et de la courbe de fusion elle- même (en laboratoire), et/ou un simple téléchargement de données (informatiques par exemple) de cette courbe de fusion.
De manière optionnelle, la réalisation de la PCR pour cette courbe de fusion peut être obtenue en présence simultanée de plusieurs couples d'amorces ciblant plusieurs molécules cibles d'ADN. On parle alors de conditions de « multiplexage ».
Le mode de réalisation de procédé selon l'invention comprend en outre une détermination 10, par la méthode des forêts aléatoires basée sur la forêt d'arbres construite lors de la phase d'apprentissage, d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé parmi k différents groupes possibles finaux. Cette détermination comprenant une analyse, par la méthode des forêts aléatoires basée sur la forêt d'arbres construite lors de la phase d'apprentissage, de descripteurs issus de l'au moins une courbe de mesure, les descripteurs comprenant :
o un ou plusieurs points de chaque courbe de mesure et/ou o tout ou partie des 101 percentiles des taux de dénaturation de chaque courbe de mesure, et/ou o un ou plusieurs points (typiquement au moins 30 points) de la dérivée première de chaque courbe de mesure et/ou o un ou plusieurs points (typiquement au moins 30 points) de la dérivée seconde de chaque courbe de mesure.
Les réplicats techniques de l'échantillon biologique de mesure sont soumis indépendamment à la forêt aléatoire et un groupe possible est affecté à chacun d'eux. Par défaut, l'échantillon biologique de mesure est affecté au groupe majoritaire parmi les groupes prédits pour chaque réplicat technique. En cas de groupes multiples, l'indice de confiance pourra être utilisé pour trancher.
Les forêts aléatoires étant des méthodes stochastiques (plusieurs applications peuvent donner des résultats différents), on applique plusieurs fois (3 fois dans ce mode de réalisation) cette méthode pour prédire l'affectation de l'échantillon biologique.
L'emplacement de chaque descripteur est donné par des traits verticaux sur la Figure 3.
La figure 3 illustre :
- en haut à gauche, trois courbes de fusion de mesure 13 (trois réplicats techniques) d'un même échantillon de mesure dont on cherche à déterminer l'appartenance à l'un des k groupes possibles;
- en haut à droite, trois courbes 14 illustrant les percentiles correspondants aux trois réplicats techniques 13;
- en bas à gauche, les trois dérivées premières 15 des trois courbes de fusion de mesure 13, et
- en bas à droite, les trois dérivées secondes 16 des trois courbes de fusion de mesure 13.
Calcul d'un indicateur de confiance :
La qualité du mode de réalisation de procédé selon l'invention est conditionnée par la qualité de la librairie initiale d'apprentissage. Plus celle- ci est riche de variabilité biologique, plus l'apprentissage sera précis et généralisable à une grande diversité de nouveaux échantillons.
Toutefois, quelle que soit la qualité de la librairie d'apprentissage, lors de la prédiction de nouveaux échantillons, il est toujours possible de rencontrer des échantillons qui lui sont totalement étrangers. Dans ce cas-là, les méthodes classiques d'apprentissage fourniront tout de même une prédiction en affectant le nouvel échantillon au groupe possible dont il est le plus proche. Le mode de réalisation de procédé selon l'invention doit être capable de refuser d'affecter un nouvel échantillon à quelque groupe possible que ce soit.
Pour cela, le mode de réalisation de procédé selon l'invention comprend un calcul d'un indice de confiance de l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé.
L'objectif de cette étape de calcul d'un indicateur de confiance est double :
quantifier la fiabilité des prédictions rendues ;
autoriser un réplicat biologique à prédire à n'être affecté à aucun groupe possible.
Les forêts aléatoires ont l'avantage de fournir des mesures de proximité entre observations. Pour plus de détails sur cette notion bien connue de « proximité » dans la méthode des forêts aléatoires, on peut par exemple se référer aux références [3] et [4].
Ces mesures sont utilisées pour fournir l'indice de confiance. En effet, si l'observation à prédire est proche des observations du groupe possible auquel elle est affectée alors la qualité de la classification est potentiellement meilleure que si l'observation à prédire est éloignée des observations du groupe possible auquel elle est affectée. Ce principe a été utilisé pour construire l'indice de confiance.
Sur les données d'apprentissage, on a calculé la distribution des proximités moyennes des courbes de fusion de référence d'un même groupe possible. Ensuite, quand un échantillon biologique de mesure est affecté à un groupe possible, on calcule sa proximité moyenne aux réplicats biologiques de ce groupe et on la compare aux proximités des courbes de fusion de référence de ce groupe possible. On peut alors calculer le pourcentage de courbes de fusion de référence dont la proximité est inférieure à celle de la courbe de fusion de mesure à prédire. Ce pourcentage est une estimation de la probabilité d'appartenance au groupe prédit et est utilisé comme indice de confiance.
La figure 7 illustre le principe de cet indice avec deux groupes possibles 22, 23 auxquels appartiennent des courbes de fusion de référence (croix) respectivement 32 et 33.
Dans le cas où la (ou chacune des ou la moyenne des) courbe(s) de mesure 13a (triangle) :
- est plus proche du groupe 22 que du groupe 23 et
- a sa proximité aux courbes de fusion 32 du groupe 22 conforme aux proximités que l'on observe entre les courbe de fusion 32 du groupe 22 ; alors l'échantillon correspondant aux courbes 13a est considéré comme appartenant au groupe 22, et le mode de réalisation de procédé selon l'invention confirme que le groupe déterminé est bien le groupe 22.
Dans le cas où la (ou chacune des ou la moyenne des) courbe(s) de mesure 13b (triangle) :
- est plus proche du groupe 22 que du groupe 23, mais
- a sa proximité aux courbes de fusion 32 du groupe 22 bien inférieure aux proximités que l'on observe entre courbes de fusion 32 du groupe 22,
alors l'échantillon correspondant au courbes 13b n'appartient ni au groupe 22 ni au groupe 23, et de préférence le mode de réalisation de procédé selon l'invention comprend un refus d'affecter l'échantillon biologique de mesure au groupe déterminé 22 et même éventuellement à quelque groupe que ce soit.
Lors de la phase d'apprentissage, la distribution des proximités deux à deux de tous les couples de réplicats biologiques de la librairie d'apprentissage appartenant à un même groupe a été calculée.
Lors de l'étape de prédiction, pour toute nouvelle observation (i.e. pour toute nouvelle courbe de fusion « de mesure »), on calcule, par la même méthode, sa proximité moyenne aux réplicats biologiques de référence du groupe auquel il a été affecté. On utilise alors la distribution globale obtenue précédemment pour calculer l'estimation de la probabilité d'appartenance à ce groupe. . Si la nouvelle observation passe cette étape, la probabilité d'appartenance à ce groupe possible est fournie à l'utilisateur en même temps que le groupe prédit.
La possibilité d'appliquer cette dernière étape est bien entendu conditionnée par une taille suffisante de la librairie d'apprentissage.
La Figure 8 montre la courbe ROC (pour « Receiver Operating Characteristic » ou « caractéristique de fonctionnement du récepteur ») associée à cet indice (AUC=0.9988, AUC étant l'aire sous la courbe ROC ou « area under the curve »).
Cette figure 8 est d'excellente qualité. En effet, en référence à la figure 7, si on utilise une valeur seuil égale à 0,14 pour l'indice de confiance alors, toutes les observations ayant un indice inférieur à ce seuil (symbolisée par la boucle 19) sont des observations mal classées alors que seule une observation bien classée à un indice supérieur à ce seuil. Grâce à cet indice on peut donc identifier de façon très satisfaisante les observations bien classées.
Dans le cas d'affectations à plusieurs groupes possibles (suite aux différentes applications des forêts aléatoires ou aux résultats contradictoires des différents réplicats techniques) ou d'un indice de confiance faible, on peut à nouveau calculer la proximité à l'ensemble des groupes possibles prédits au moins une fois (sur l'ensemble des arbres de la forêt) pour un réplicat biologique. Si l'un de ces groupes possibles exhibe un indice supérieur au seuil de 0,14, on peut marquer cette courbe de mesure comme appartenant probablement au groupe possible ayant la valeur d'indice maximale.
En appliquant cette règle aux courbes de référence pour tester son efficacité, on « récupère » des courbes de fusion que l'on avait affecté en majorité à la mauvaise espèce mais pour lesquelles la bonne espèce avait été prédite au moins une fois et avec laquelle l'indice de confiance calculé est supérieur à 0,14.
Enfin, on peut utiliser l'indice de confiance pour départager deux groupes possibles qui auraient été affectés le même nombre de fois à une courbe de fusion de mesure.
Ainsi, pour résumer, le calcul de l'indice de confiance comprend : - un calcul d'une distribution de proximités moyennes entre courbes de référence appartenant au groupe déterminé,
- un calcul d'une proximité moyenne de l'échantillon biologique de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et
- un calcul d'un taux de courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et ayant une proximité moyenne aux autres courbes de référence appartenant au groupe déterminé inférieure à la proximité moyenne de l'au moins une courbe de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé.
Après l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé, le mode de réalisation de procédé selon l'invention comprend (en tant qu'étape de fourniture de résultat 11, typiquement affiché sur un écran ou mémorisé dans une mémoire informatique ou électronique) un refus ou non d'affecter l'échantillon biologique de mesure à quelque groupe possible que ce soit en fonction de la valeur de l'indice de confiance, plus exactement :
- un refus d'affecter l'échantillon biologique de mesure à quelque groupe possible que ce soit si l'indice de confiance est inférieur à une valeur seuil, ou
- une acceptation d'affecter l'échantillon biologique de mesure à un des groupes possibles finaux si l'indice de confiance est supérieur à une valeur seuil
En cumulant les résultats bruts de la forêt aléatoire et l'utilisation de l'indice de confiance, on parvient à bien affecter 95,74% des observations. Quant aux 4,26% d'observations restantes, elles sont clairement identifiées par le mode de réalisation de procédé selon l'invention comme étant suspectes pour ce qui est de leur affectation.
Dans le cas des courbes de la figure 3, l'échantillon est identifié comme appartenant au groupe "abscessus".
Dans ce mode de réalisation de procédé selon l'invention, chacune des étapes suivantes:
- acquisition 1
- détermination des descripteurs 2,3 - rationalisation des groupes 4, 5
- apprentissage 6
- optimisation des paramètres 7
- construction de la forêt aléatoire 8
- acquisition 9
- étape 10 d'analyse des descripteurs, application de la forêt aléatoire, détermination du groupe déterminé parmi les plusieurs groupes possibles, calcul de l'indice de confiance et décision de confirmer l'affectation de l'échantillon biologique de mesure au groupe déterminé ou refus d'affecter l'échantillon biologique de mesure à quelque groupe que ce soit,
- fourniture ou affichage du résultat 11
n'est pas réalisée de manière purement abstraite ou purement intellectuelle mais implique l'utilisation d'un moyen technique (tout comme, de manière générale, toutes les autres étapes de ce mode de réalisation de procédé selon l'invention).
La figure 9 illustre schématiquement un mode de réalisation de dispositif 100 selon l'invention agencé et programmé pour mettre en œuvre ce mode de réalisation de procédé selon l'invention.
Le dispositif 100 comprend des moyens 102 agencés pour et programmés pour mettre en œuvre chacune des étapes suivantes:
- détermination des descripteurs 2,3
- rationalisation des groupes 4, 5
- optimisation des paramètres 7
- construction de la forêt aléatoire 8
- étape 10 d'analyse des descripteurs, application de la forêt aléatoire, détermination du groupe déterminé parmi les plusieurs groupes possibles, calcul de l'indice de confiance et décision de confirmer l'affectation de l'échantillon biologique de mesure au groupe déterminé ou refus d'affecter l'échantillon biologique de mesure à quelque groupe que ce soit
- fourniture ou affichage du résultat 11. Le dispositif 100 comprend des moyens 101 et 102 agencés pour et/ou programmés pour mettre en œuvre :
- l'étape d'apprentissage 6 et plus précisément l'étape d'acquisition 1 des courbes de référence,
- l'étape d'acquisition 9 d'au moins une courbe de mesure.
Les moyens 102 comprennent un ordinateur, et/ou une unité centrale ou de calcul, et/ou un circuit électronique analogique (de préférence dédié), et/ou un circuit électronique numérique (de préférence dédié), et/ou un microprocesseur (de préférence dédié), et/ou des moyens logiciels. Ces moyens 102 comprennent en outre de préférence un écran ou des moyens d'impression ou des moyens d'export de données pour l'étape 11 de fourniture ou affichage du résultat.
Les moyens 101 comprennent une machine PCR, et/ou selon la variante peut comprendre des moyens informatiques (logiciel combiné à un port USB, un lecteur de carte SD, une connexion à un réseau informatique, etc..) agencés et programmés pour charger et lire des courbes de fusion d'ADN . Ainsi ces moyens 101 sont connectés ou font partie des moyens 102. Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention .
Par exemple, une autre preuve du concept a été réalisée sur d'autres microorganismes incluant Coxiella burnetii, Chlamydophila spp, Neospora caninum, Toxoplasma gondii, et Anaplasmose avec le même succès. Les expériences ont démontré que la méthode développée permettait d'identifier les différents pathogènes, y compris en conditions de multiplexage c'est-à-dire via une amplification par PCR en présence simultanée de tous les couples d'amorces ciblant les molécules cibles d'ADN de tous les (cinq) pathogènes précédemment cités.
De manière générale, l'invention est applicable sur n'importe quel échantillon biologique, notamment humain, animal, végétal, viral, bactérien, d'archée, fongique, de levure, de viroïde, d'un eucaryote, ou d'un protozoaire. Bien entendu, les différentes caractéristiques, formes, variantes et modes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres.
Références citées :
[ 1] : WO2013/166373
[2] : « Random Forests », Léo Breiman, paru dans « Machine learning », 45, 5-32, 2001.
[3] : « Classification and Régression by RandomForest », Andy Liaw and Matthew Wiener, R News, vol . 2/3, December 2002, ISSN 1609-3631.
[4] : « Manual on setting up, using, and understanding random
Forests V3.1 », Léo Breiman, 2002

Claims

REVENDICATIONS
Procédé de classification d'un échantillon biologique de mesure, comprenant :
- une acquisition (9) d'au moins une courbe de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure, dite au moins une courbe de mesure,
- une détermination ( 10) d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé parmi différents groupes possibles, par une analyse de descripteurs issus de l'au moins une courbe de mesure,
caractérisé en ce que les descripteurs comprennent un ou plusieurs points de la dérivée seconde de chaque courbe de mesure.
Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les descripteurs comprennent un ou plusieurs points de la dérivée première de chaque courbe de mesure.
Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les descripteurs comprennent un ou plusieurs points de chaque courbe de mesure.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les descripteurs comprennent un ou plusieurs percentiles de chaque courbe de mesure.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la détermination ( 10) comprend une détermination par une méthode des forêts aléatoires.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend un apprentissage (6) comprenant :
- une acquisition ( 1) de différentes courbes de fusion d'ADN, dites courbes de référence, à partir de différents échantillons biologiques de référence appartenant à différents groupes initiaux, puis
une détermination (2, 3) des descripteurs à partir des courbes de référence, puis
- une construction (8) d'une forêt selon la méthode des forêts aléatoires, comprenant une construction de plusieurs arbres selon la méthode des forêts aléatoires, la ou les variable(s) étudiée(s) à chaque nœud de chaque arbre comprenant un ou plusieurs des descripteurs, chaque feuille de chaque arbre ne correspondant qu'à un seul groupe parmi les différents groupes possibles.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la détermination (2, 3) des descripteurs comprend :
- une détermination préliminaire (2) de descripteurs, puis
- une élimination (3) de certains descripteurs redondants.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'élimination (3) de certains descripteurs comprend, pour chaque ensemble de descripteurs exhibant deux à deux un coefficient de corrélation de Pearson supérieur à 0,95, une conservation d'un seul descripteur.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend :
- après l'acquisition de différentes courbes de référence, une identification de plusieurs courbes de référence correspondant au même groupe initial, dit groupe ambigu, et présentant des profils séparés en plusieurs sous- groupes, et
- une séparation (4) de ce groupe ambigu en plusieurs groupes possibles. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend :
- après l'acquisition de différentes courbes de référence, une identification de plusieurs courbes de référence correspondant à plusieurs groupes initiaux, dit groupes confondus, et présentant des profils réunis en un seul groupe, et
- une unification (5) de ces groupes confondus en un unique groupe possible.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un calcul d'un indice de confiance de l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le calcul de l'indice de confiance comprend :
- un calcul d'une distribution de proximités moyennes entre courbes de référence appartenant au groupe déterminé, - un calcul d'une proximité moyenne de l'au moins une courbe de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et
- un calcul d'un taux de courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et ayant une proximité moyenne aux autres courbes de référence appartenant au groupe déterminé inférieure à la proximité moyenne de l'au moins une courbe de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, après l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé, un refus d'affecter l'échantillon biologique de mesure à quelque groupe que ce soit en fonction de la valeur de l'indice de confiance.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'acquisition d'au moins une courbe de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure comprend l'acquisition d'au moins une courbe de fusion d'un résultat d'une PCR obtenue en présence simultanée de plusieurs couples d'amorces ciblant plusieurs molécules cibles d'ADN.
15. Dispositif (100) de classification d'un échantillon biologique de mesure, comprenant :
- des moyens (101) agencés et/ou programmés pour une acquisition (9) d'au moins une courbe de fusion d'ADN de l'échantillon biologique de mesure, dite au moins une courbe de mesure,
- des moyens (102) programmés pour une détermination (10) d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé parmi différents groupes possibles, par une analyse de descripteurs issus de l'au moins une courbe de mesure,
caractérisé en ce que les descripteurs comprennent un ou plusieurs points de la dérivée seconde de chaque courbe de mesure.
16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que les descripteurs comprennent un ou plusieurs points de la dérivée première de chaque courbe de mesure.
17. Dispositif selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que les descripteurs comprennent un ou plusieurs points de chaque courbe de mesure. 18. Dispositif l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que les descripteurs comprennent un ou plusieurs percentiles de chaque courbe de mesure.
19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que les moyens (102) programmés pour la détermination (10) comprennent des moyens (102) programmés pour une détermination (10) par une méthode des forêts aléatoires.
20. Dispositif selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens (101, 102) agencés et/ou programmés pour un apprentissage (6) comprenant :
- des moyens (101) agencés et/ou programmés pour une acquisition (1) de différentes courbes de fusion d'ADN, dites courbes de référence, à partir de différents échantillons biologiques de référence appartenant à différents groupes initiaux, puis
- des moyens (102) agencés et/ou programmés pour une détermination (2, 3) des descripteurs à partir des courbes de référence, puis
- des moyens (102) agencés et/ou programmés pour une construction (8) d'une forêt selon la méthode des forêts aléatoires, comprenant des moyens (102) agencés et/ou programmés pour une construction de plusieurs arbres selon la méthode des forêts aléatoires, la ou les variable(s) étudiée(s) à chaque nœud de chaque arbre comprenant un ou plusieurs des descripteurs, chaque feuille de chaque arbre ne correspondant qu'à un seul groupe parmi les différents groupes possibles.
21. Dispositif selon la revendication 20, caractérisé en ce que les moyens (102) programmés pour la détermination (2, 3) des descripteurs comprennent :
- des moyens (102) programmés pour une détermination préliminaire (2) de descripteurs,
- des moyens (102) programmés pour, après la détermination préliminaire, une élimination (3) de certains descripteurs redondants.
22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé en ce que les moyens (102) programmés pour l'élimination (3) de certains descripteurs comprennent des moyens (102) programmés pour, pour chaque ensemble de descripteurs exhibant deux à deux un coefficient de corrélation de Pearson supérieur à 0,95, une conservation d'un seul descripteur. 23. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend :
- des moyens (102) programmés pour, après l'acquisition de différentes courbes de référence, une identification de plusieurs courbes de référence correspondant au même groupe initial, dit groupe ambigu, et présentant des profils séparés en plusieurs sous-groupes, et
- des moyens (102) programmés pour une séparation (4) de ce groupe ambigu en plusieurs groupes possibles.
24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend :
- des moyens (102) programmés pour, après l'acquisition de différentes courbes de référence, une identification de plusieurs courbes de référence correspondant à plusieurs groupes initiaux, dit groupes confondus, et présentant des profils réunis en un seul groupe, et
- des moyens (102) programmés pour une unification (5) de ces groupes confondus en un unique groupe possible.
25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 15 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens (102) programmés pour un calcul d'un indice de confiance de l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé.
26. Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que les moyens (102) programmés pour le calcul de l'indice de confiance comprennent :
- des moyens (102) programmés pour un calcul d'une distribution de proximités moyennes entre courbes de référence appartenant au groupe déterminé, - des moyens (102) programmés pour un calcul d'une proximité moyenne de l'au moins une courbe de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et
- des moyens (102) programmés pour un calcul d'un taux de courbes de référence appartenant au groupe déterminé, et ayant une proximité moyenne aux autres courbes de référence appartenant au groupe déterminé inférieure à la proximité moyenne de l'au moins une courbe de mesure avec les courbes de référence appartenant au groupe déterminé.
27. Dispositif selon la revendication 25 ou 26, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens (102) programmés pour, après l'étape de détermination d'une appartenance de l'échantillon biologique de mesure à un groupe déterminé, un refus d'affecter l'échantillon biologique de mesure à quelque groupe que ce soit en fonction de la valeur de l'indice de confiance.
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