EP3303225A1 - Procédé d'inhibition du développement de microorganismes - Google Patents

Procédé d'inhibition du développement de microorganismes

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Publication number
EP3303225A1
EP3303225A1 EP16730457.5A EP16730457A EP3303225A1 EP 3303225 A1 EP3303225 A1 EP 3303225A1 EP 16730457 A EP16730457 A EP 16730457A EP 3303225 A1 EP3303225 A1 EP 3303225A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
frequency
voltage
electrode
medium
electrodes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP16730457.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pascal Xavier
Jean Angelidis
Eric CHAMBEROD
Dominique Rauly
Jean MARTINS
Erwann VINCE
Hakima Belbachir
Xavier PAIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kalliste
Universite Grenoble Alpes
Original Assignee
Kalliste
Universite Grenoble Alpes
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Filing date
Publication date
Application filed by Kalliste, Universite Grenoble Alpes filed Critical Kalliste
Publication of EP3303225A1 publication Critical patent/EP3303225A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/005—Combined electrochemical biological processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/46—Treatment of water, waste water, or sewage by electrochemical methods
    • C02F1/461—Treatment of water, waste water, or sewage by electrochemical methods by electrolysis
    • C02F1/467—Treatment of water, waste water, or sewage by electrochemical methods by electrolysis by electrochemical disinfection; by electrooxydation or by electroreduction
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F24—HEATING; RANGES; VENTILATING
    • F24D—DOMESTIC- OR SPACE-HEATING SYSTEMS, e.g. CENTRAL HEATING SYSTEMS; DOMESTIC HOT-WATER SUPPLY SYSTEMS; ELEMENTS OR COMPONENTS THEREFOR
    • F24D17/00—Domestic hot-water supply systems
    • F24D17/0073—Arrangements for preventing the occurrence or proliferation of microorganisms in the water
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F24—HEATING; RANGES; VENTILATING
    • F24H—FLUID HEATERS, e.g. WATER OR AIR HEATERS, HAVING HEAT-GENERATING MEANS, e.g. HEAT PUMPS, IN GENERAL
    • F24H1/00—Water heaters, e.g. boilers, continuous-flow heaters or water-storage heaters
    • F24H1/18—Water-storage heaters
    • F24H1/20—Water-storage heaters with immersed heating elements, e.g. electric elements or furnace tubes
    • F24H1/201—Water-storage heaters with immersed heating elements, e.g. electric elements or furnace tubes using electric energy supply
    • F24H1/203—Water-storage heaters with immersed heating elements, e.g. electric elements or furnace tubes using electric energy supply with electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2103/00—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated
    • C02F2103/003—Wastewater from hospitals, laboratories and the like, heavily contaminated by pathogenic microorganisms
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F24—HEATING; RANGES; VENTILATING
    • F24H—FLUID HEATERS, e.g. WATER OR AIR HEATERS, HAVING HEAT-GENERATING MEANS, e.g. HEAT PUMPS, IN GENERAL
    • F24H2250/00—Electrical heat generating means
    • F24H2250/10—Electrodes

Definitions

  • the invention relates to the inhibition of the development of microorganisms, for example bacteria, in a medium, and in particular a liquid medium.
  • the treated liquid may in particular be waste water from a domestic, industrial or hospital installation, or any other liquid, including liquids for agri-food use.
  • bacteria bathed in a culture medium are placed between two electrodes between which an AC voltage is applied whose frequency is successively set at 0.1 MHz, 1 MHz, 5 MHz, 10 MHz, 20 MHz, 30 MHz and 50 MHz. MHz.
  • a test lasting several hours is carried out, and the evolution of the bacterial population is monitored by optical density measurements, using a spectrophotometer, on samples taken.
  • this patent application indicates a decrease in the minimum inhibitory concentration of an antibiotic, in this case chloramphenicol, placed in the culture medium, in the presence of an electric field of frequency equal to 10 MHz.
  • a method for treating a medium, in particular a liquid medium, aimed at limiting bacterial growth, or even reducing the concentration of microorganisms, without requiring their prior identification, and limiting the use of chemical agents, is therefore sought.
  • An effective method is also sought for a wide variety of microorganisms regardless of the environment in which they are bathed.
  • WO2011 / 132021 provides a first solution to this problem, by describing a method for preventing the formation of bacteria or algae in water, as an alternative to the use of chemical agents such as chlorine.
  • a voltage is applied to the water to be treated, between two electrodes partially immersed.
  • a processor applies positive voltage slots at a frequency between 0 and 100 kHz.
  • One protocol, presented in this document as optimal, is to perform a frequency sweep between 0 and 100 kHz by gradually increasing the frequency by increments of 500 Hz every 30 seconds. The range 0 - 100 kHz can thus be addressed in a time varying between 1.5 hours and 2 hours.
  • the inventors propose a different method, much simpler to implement, having a better efficiency and able to address an even higher frequency dynamics.
  • An object of the invention is a method for treating a medium, in particular a liquid medium, comprising microorganisms, the medium being disposed between a first electrode and a second electrode, inside an enclosure, each electrode being extending into said enclosure, in contact with said medium, each electrode being connected to an electrical circuit capable of establishing a voltage between said electrodes, according to at least one frequency, the method being characterized in that: said frequency varies, in a time interval, between a minimum frequency and a maximum frequency, maximum frequency being at least ten times greater than the minimum frequency, so as to inhibit the development of said microorganisms in the medium.
  • the voltage applied to the electrodes comprises, in said time interval, a plurality of frequency components, extending between a minimum frequency and a maximum frequency, the maximum frequency being at least ten times greater than the minimum frequency.
  • the maximum frequency can be at least 100 times or 1000 times higher than the minimum frequency.
  • the applied voltage is preferably alternating, alternating between positive and negative values.
  • the applied voltage preferably has a zero average value. It can vary sinusoidally.
  • the time interval may in particular be less than 1 hour, or even 30 minutes, or even 20 minutes, or even 1 minute or even 5 seconds or even 1 second.
  • the voltage, or bias voltage simultaneously comprises a plurality of frequency components, between said minimum frequency and said maximum frequency. It can in particular be produced by a white noise generator.
  • the minimum frequency is preferably greater than 10 Hz.
  • the voltage generates, between the first electrode and the second electrode, an electric field whose maximum amplitude is preferably less than 10 V / cm.
  • the first and second electrodes are preferably metallic, and comprise a metal, in particular selected from stainless steel, platinum or gold. They can extend one parallel to the other.
  • the medium may in particular comprise an active ingredient capable of inhibiting the growth of microorganisms, preferably obtained from natural plant substances. This medium may especially comprise eugenol, and possibly eugenol acetate.
  • Another object of the invention is a device for implementing the method as previously described, comprising: an enclosure adapted to receive a medium comprising microorganisms, a first electrode and a second electrode, each electrode being connected to a electrical circuit, the device being characterized in that, the electric circuit comprises a generator capable of producing, at the terminals of said electrodes, a voltage whose frequency varies, in a time interval of less than 1 minute, between a minimum frequency and a maximum frequency , the maximum frequency being at least 10 times greater than the minimum frequency.
  • the electrodes may in particular be made of stainless steel.
  • the generator may comprise a source of current or voltage capable of generating, across said electrodes, a voltage in the form of a white noise.
  • FIG. 1 represents a first example of a device for implementing a method of inhibiting the development of bacteria in a liquid medium.
  • FIGS 2 and 3 show variants of this example, with electrodes of different geometries.
  • FIG. 4 represents experimental results showing the evolution of the bacterial concentration as a function of time for various tests carried out.
  • FIG. 5 represents experimental results showing the inhibition of ATP (Adenosine Triphosphate) synthesis as a function of time for various tests carried out.
  • FIG. 1 describes a first example of a device capable of implementing a method that is the subject of the invention.
  • An enclosure 11 comprises a medium 10, for example a liquid, and microorganisms 12 bathed in this liquid.
  • the medium may also be an agar.
  • the microorganisms 12 are Escherichia coli type bacteria.
  • Medium 10 is a liquid culture medium called LB (acronym for Luria-Bertani).
  • Two electrodes 21 and 22 are immersed in the liquid medium 10.
  • they have a parallelepipedal shape of length 8 cm, height 3 cm and thickness 0.5 mm.
  • the electrodes are spaced apart by an inter-electrode distance D of 1 cm.
  • the electrodes are, in this example, stainless steel.
  • Other metal electrodes could be usable, for example platinum or gold.
  • Stainless steel appears as a good compromise cost / performance. In addition, stainless steel does not release toxic ions.
  • the electrodes extend parallel to each other.
  • the electrodes are connected to an electrical circuit 20.
  • the electrical circuit 20 comprises an AC power supply 23 producing an alternating current, so as to generate, between the terminals of the electrodes 21, 22, a potential difference, or alternating polarization voltage U, .
  • the medium between the electrodes is then subjected to an alternating electric field E.
  • the frequency of the voltage is greater than 10 Hz, and preferably greater than 100 Hz or even 1 kHz.
  • the power supply, or generator, 23 here is a source of white noise, that is to say a source producing a zero average value signal, and whose power spectral density is constant over a given frequency band.
  • the width of the frequency band, according to which the power spectral density is constant, can range from one to three decades or more. Typically, this frequency band extends between 10 kHz and 10 MHz. By constant is meant not deviating from the same value to fluctuations, these fluctuations can reach 10 to 20% of said value.
  • the electric field E established between the electrodes 21 and 22 has a multitude of spectral components.
  • the inventors have estimated that the microorganisms present in the liquid medium are capable of being sensitive to at least one of these spectral components, the effect of the electric field E, to this spectral component, being then able to inhibit their development.
  • a frequency is selected from an extended frequency range, at the end of a learning phase, during which a particular microorganism is subjected, successively, to different frequencies, the exposure at each frequency having a duration of a few minutes or a few hours. This makes it possible to determine the frequency with which the bacteria that one wishes to eliminate is the most sensitive. We can speak of a frequency optimum. This optimum being selected, an electric field is then applied at this optimum frequency to inhibit bacterial growth.
  • the method which is the subject of the invention results from a different approach, since it comprises the application of a signal comprising simultaneously, or in a close time interval, a plurality of spectral components, in an extended spectral band, preferably greater than 1 decade, and typically between 2 and 5 decades, and preferably between 3 and 4 decades.
  • Most of the microorganisms present in the sample are then targeted, without any need to identify them beforehand, and to establish the optimal frequency with respect to each one of them.
  • a frequency optimum for a bacterium may depend on the medium in which the latter is placed. By modifying the medium, the frequency optimum can then vary. Since it addresses a wide frequency range, preferably extending over several decades, the method of the invention is more robust with respect to such variations.
  • the white noise generator 23 can easily be manufactured using, for example, a reverse-biased Zener diode in the vicinity of an avalanche voltage.
  • the signal produced by the Zener diode can then be amplified by a low noise amplifier, or several amplifiers arranged in series, before being applied to the electrodes 21 and 22.
  • the generator 23 is a generator capable of producing, in a sufficiently short time interval, and preferably simultaneously, an electric current having multiple frequency components, extending over at least one or even two decades, and preferably over at least three decades or more.
  • the voltage applied between the electrodes is preferably alternating, that is to say having an alternation between positive values and negative values, this alternation being preferably periodic.
  • the average value of the applied voltage is preferably as low as possible, so as to avoid the appearance of a electrolysis effect.
  • the voltage may also have an alternation, in particular periodic, values lower and higher than a fixed value.
  • the frequency of the signal produced by the generator 23 varies, in a time interval of less than 1 hour, between a minimum frequency (f m in) and a maximum frequency (f max), the maximum frequency f ma x being at least twice or even 10 times, or at least 100 times greater than the minimum frequency f m in.
  • a time interval of 1 hour corresponds to a duration greater than twice the cell division time.
  • the process is all the more effective as the time interval during which the multiple frequencies are applied is low.
  • the time interval can be reduced to 30 minutes, or 20 minutes, or 10 minutes, or 1 minute, or be less than 5 seconds or even 1 second. This makes it possible to address an extended frequency range, exceeding a decade, and preferably reaching several decades, in a small time interval.
  • the first electrode 21 is in the form of a bar, with a diameter of less than 1 cm, for example 0.5 mm, whereas the second electrode 22 has an annular shape, coaxial with the first electrode.
  • FIG. 3 represents another embodiment, in which the electrodes 21 and 22 are in the form of a "comb" or "interdigitated".
  • Each electrode has a lateral section 21A, 22A of which a plurality of arms 21B, 22B protrude, each arm preferably extending parallel to one another. Preferably, each arm extends perpendicularly to the lateral section to which it is connected.
  • the electrodes 21 and 22 are disposed face to face, so that an arm of an electrode extends between two adjacent arms of the other electrode. This embodiment is suitable for processing larger volumes.
  • the distance D between the two electrodes 21 and 22 is preferably centimeter, being between 0.5 cm and 15 or even 20 cm. Beyond this, the voltage must increase, knowing that the electric field E between two electrodes preferably has an amplitude of a few V / cm, preferably between 1 and 10 V / cm.
  • a biocidal product has been added to the culture medium.
  • This is the biocide whose reference is Bioscreen BS 33, supplied by the company Hightech Bio Activities Holding GM BH. Its composition is described in patent FR2867947. It consists essentially of eugenol, and to a lesser extent eugenol acetate, these components being in particular obtained from clove. The use of such a biocide, obtained with the aid of natural plant substances, limits the harmful effects on the environment.
  • configuration 1 no treatment: the sample comprises the culture medium as previously described; This is the control configuration; configuration 2: application of the alternating voltage as previously described to the sample; Configuration 3: addition of the biocide described above, diluted to l / 8 -th, and application of the alternating voltage, in a manner similar to the configuration 2.
  • FIG. 4 represents the evolution of the bacterial concentration in the medium, in the configurations 1, 2 and 3, as a function of time, the measurement points being made at t 0 , t 0 + 30 min, t 0 + 60 min , t 0 + 120 min, t 0 + 240 min and t 0 + 360 min, t 0 representing the beginning of the experiment, and corresponding to abscissa 0 in figure 4.
  • the abscissae are expressed in minutes while each ordinate represents the bacterial concentration normalized by the concentration in the control sample (configuration 1), at the same time.
  • Each ordinate represents, as a percentage, the evolution of the bacterial population relative to the control sample of the configuration 1.
  • the margins of error are not represented.
  • the quantification of the bacterial population was carried out by sampling at different times, then dilution and spreading of the sample on agar, before visual counting of the colonies formed 24h to 48 h after the spreading.
  • Configuration No. 2 application of an electric field alone
  • Configuration No. 3 biocide combination and electric field
  • ATPmetry measurements (luminescence Adenosine triphospate assay) were performed on each sample at to, to + 120 min, to + 240 min and to + 360 min, to representing the beginning of the experiment, and corresponding to the abscissa 0 in Figure 5.
  • bioluminescence measurements were performed, representative of the concentration of ATP in the sample. These measurements are representative of the energy released by the metabolism of the bacteria contained in the sample.
  • Figure 5 shows the results of these measurements, for the three configurations studied.
  • the x-axis represents the elapsed time since the beginning of the experiment, the y-axis representing, in arbitrary scale, the measured intensity of the luminescence signal.
  • Configurations 2 and 3 are distinguished by a markedly less marked increase in ATP concentration, reflecting the effect of the electric field alone or, better, in combination with a biocide, for the inhibition of bacterial growth.
  • the samples were subjected to a temperature control by observation using a thermal camera. No significant heating was observed.
  • the method described can be applied to any liquid which it is desired to control or reduce the bacterial proliferation, in the laboratory or on an industrial scale, for example in the agri-food field, the treatment of water, for example domestic water or swimming pool water, or the treatment of other liquid effluents.
  • microfluidic cards suitable for carrying out analyzes or processes on biological samples.
  • the electrodes can be integrated in such cards during the manufacture of the latter, by implementing conventional microfabrication techniques for the deposition of a metal or a conductive material.
  • the method can be used upstream of biological processes, treatment or analysis, in order to eliminate or reduce the amount of bacteria in the treated sample.

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Abstract

L'invention concerne un dispositif et un procédé permettant l'inhibition du développement de microorganismes, tels des bactéries, dans un milieu, et en particulier 5 un milieu liquide. Plus précisément, le procédé comprend l'application d'une tension au milieu liquide, la fréquence de ladite tension variant, dans un intervalle temporel inférieur, entre une fréquence minimale et une fréquence maximale, la fréquence maximale pouvant être au moins deux fois ou au moins dix fois supérieure à la fréquence minimale.

Description

Procédé d'inhibition du développement de microorfianismes
Domaine technique
L'invention se rapporte à l'inhibition du développement de microorganismes, par exemple des bactéries, dans un milieu, et en particulier un milieu liquide. Le liquide traité peut notamment être de l'eau usée, issue d'une installation domestique, industrielle ou hospitalière, ou tout autre liquide, y compris des liquides à usage agroalimentaire.
Description de l'art antérieur Afin de limiter l'utilisation de produits chimiques, le recours à des méthodes physiques pour limiter le développement de microorganismes pathogènes, comme des bactéries, est étudié depuis plusieurs dizaines d'années. En effet, il s'avère que certains procédés ont un effet inhibiteur sur le développement de ces microorganismes. Parmi les méthodes investiguées, citons l'application d'ondes ultrasons, de lumière, d'un gradient de température ou d'un champ magnétique.
L'application de courants électriques faibles, continus ou à faible fréquence s'est également avérée efficace. Par exemple, dans la publication Costerton, «Mechanism of Electrical Enhancement of Efficacy of Antibiotics in Killing Biofilm Bacteria», Antimicrobial Agents and Chemotherapy, dec 1994, on a montré que l'application d'un courant continu à la surface d'une électrode métallique permettait d'éliminer un biofilm bactérien formé sur cette surface. Par ailleurs, cette publication met en évidence une efficacité remarquable lors de l'application combinée d'un courant électrique continu et d'un antibiotique. Cet effet de synergie est désigné par le terme « effet bioélectrique ».
Mais l'application de courants continus peut libérer des ions dans le milieu liquide, par électrolyse, ces derniers pouvant s'avérer toxiques à l'égard de cellules saines.
Récemment, la combinaison d'un champ électrique alternatif et d'un antibiotique, pour inhiber la croissance de bactéries, a été étudiée. Par exemple, la demande de brevet US2012/0184895 décrit l'application d'un champ électrique alternatif d'amplitude faible (quelques V/cm) et d'un antibiotique sur des bactéries de type Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa.
Dans ce document, des bactéries baignant dans un milieu de culture sont placées entre deux électrodes entre lesquelles on applique une tension alternative dont la fréquence est successivement fixée à 0.1 MHz, 1 MHz, 5 MHz, 10 MHz, 20 MHz, 30 MHz et 50 MHz. A chaque fréquence, un essai d'une durée de plusieurs heures est réalisé, et l'évolution de la population bactérienne est contrôlée par des mesures de densité optique, à l'aide d'un spectrophotomètre, sur des échantillons prélevés.
Le document conclut que la fréquence de 10 MHz permet une inhibition maximale de la croissance bactérienne, et cela pour les deux types de bactéries étudiés. Cet effet est attribué à l'action de forces électrostatiques, en particulier des forces diélectrophorétiques agissant sur la membrane des cellules lors de la division cellulaire. Ces forces semblent notamment agir sur l'étranglement se formant entre les deux cellules filles, lors de la télophase, et induire une rupture de la membrane cellulaire. Lorsque la cellule en division est orientée parallèlement aux lignes de champ, l'intensité des forces est maximale. Parallèlement, des modélisations de ces forces ont été réalisées, mettant en évidence une intensité maximale à une fréquence de 2 MHz pour Pseudomonas aeruginosa , et à une fréquence de 7 MHz pour Staphylococcus aureus.
Par ailleurs, cette demande de brevet signale une diminution de la concentration minimale inhibitrice d'un antibiotique, en l'occurrence le chloramphenicol, placé dans le milieu de culture, en présence d'un champ électrique de fréquence égale à 10 MHz.
Il ressort de ce document que l'application d'un champ électrique alternatif a des effets indéniables sur la limitation de la prolifération bactérienne, mais qu'il existe une fréquence optimale pour chaque type de bactérie. Ainsi, chaque type de microorganisme semble avoir sa propre « sensibilité fréquentielle », qu'il est nécessaire de déterminer par des essais similaires à ceux décrits ci-dessus. En effet, rien ne dit qu'une fréquence optimale pour un microorganisme sera optimale pour un autre microorganisme. De plus, il n'est pas établi qu'une fréquence optimale à l'égard d'un microorganisme dans un milieu donné sera également optimale, à l'égard du même microorganisme, dans un autre milieu. Par ailleurs, dans les installations industrielles, on peut rencontrer différents types de microorganismes, et les techniques de purification doivent viser l'ensemble des microorganismes susceptibles d'être rencontrés, La méthode préconisée dans le document décrit ci-dessus, si elle semble efficace pour Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus, ne le sera pas forcément pour d'autres espèces.
On recherche donc un procédé de traitement d'un milieu, en particulier un milieu liquide, visant à limiter la croissance bactérienne, voire à réduire la concentration en microorganismes, sans nécessiter leur identification préalable, et en limitant le recours à des agents chimiques. On recherche également un procédé efficace à l'égard d'une grande variété de microorganismes, et cela indépendamment du milieu dans lequel ils baignent.
Le document WO2011/132021 apporte une première solution à ce problème, en décrivant un procédé pour prévenir la formation de bactéries ou d'algues dans l'eau, de façon alternative à l'utilisation d'agents chimiques tels le chlore. Pour cela, une tension est appliquée à l'eau à traiter, entre deux électrodes partiellement immergées. Un processeur applique des créneaux positifs de tension selon une fréquence comprise entre 0 et 100 kHz. Un protocole, présenté dans ce document comme étant optimal, consiste à effectuer un balayage en fréquence entre 0 et 100 kHz en augmentant progressivement la fréquence par des incréments de 500 Hz toutes les 30 secondes. La plage 0 - 100 kHz peut ainsi être adressée dans une durée variant entre 1.5 heure et 2 heures.
Les inventeurs proposent un procédé différent, bien plus simple à mettre en œuvre, présentant une meilleure efficacité et pouvant adresser une dynamique de fréquence encore plus élevée.
Un objet de l'invention est un procédé de traitement d'un milieu, notamment un milieu liquide, comprenant des microorganismes, le milieu étant disposé entre une première électrode et une deuxième électrode, à l'intérieur d'une enceinte, chaque électrode s'étendant dans ladite enceinte, au contact dudit milieu, chaque électrode étant reliée à un circuit électrique apte à établir une tension entre lesdites électrodes, selon au moins une fréquence, le procédé étant caractérisé en ce que : ladite fréquence varie, dans un intervalle temporel, entre une fréquence minimale et une fréquence maximale, la fréquence maximale étant au moins dix fois supérieure à la fréquence minimale, de façon à inhiber le développement desdits microorganismes dans le milieu.
Autrement dit, la tension appliquée aux électrodes comprend, dans ledit intervalle temporel, une pluralité de composantes fréquentielles, s'étendant entre une fréquence minimale et une fréquence maximale, la fréquence maximale étant au moins dix fois supérieure à la fréquence minimale.
La fréquence maximale peut être au moins 100 fois ou 1000 fois supérieure à la fréquence minimale.
La tension appliquée est de préférence alternative, alternant entre des valeurs positives et des valeurs négatives. La tension appliquée a de préférence une valeur moyenne nulle. Elle peut varier de façon sinusoïdale.
L'intervalle temporel peut notamment être inférieur à 1 heure, voire 30 minutes, voire 20 minutes, voire 1 minute ou encore 5 secondes voire 1 seconde.
De préférence, la tension, ou tension de polarisation, comporte simultanément une pluralité de composantes fréquentielles, entre ladite fréquence minimale et ladite fréquence maximale. Elle peut en particulier être produite par un générateur de bruit blanc.
La fréquence minimale est de préférence supérieure à 10 Hz.
La tension génère, entre la première électrode et la deuxième électrode, un champ électrique dont l'amplitude maximale est de préférence inférieure à 10 V/cm.
Les première et deuxième électrodes sont de préférence métalliques, et comportent un métal, en particulier choisi parmi l'acier inoxydable, le platine ou l'or. Elles peuvent s'étendre l'une parallèlement à l'autre. Le milieu peut notamment comporter un principe actif apte à inhiber la croissance des microorganismes, de préférence obtenu à partir de substances végétales naturelles. Ce milieu peut notamment comprendre de l'eugenol, et éventuellement de l'acétate d'eugenol. Un autre objet de l'invention est un dispositif pour la mise en œuvre du procédé tel que précédemment décrit, comportant : une enceinte, apte à recevoir un milieu comprenant des microorganismes, une première électrode et une deuxième électrode, chaque électrode étant reliée à un circuit électrique, le dispositif étant caractérisé en ce que, le circuit électrique comporte un générateur apte à produire, aux bornes desdites électrodes, une tension dont la fréquence varie, dans un intervalle temporel inférieur à 1 minute, entre une fréquence minimale et une fréquence maximale, la fréquence maximale étant au moins 10 fois supérieure à la fréquence minimale.
Les électrodes peuvent notamment être réalisées en acier inoxydable.
Le générateur peut comporter une source de courant ou de tension apte à générer, aux bornes des dites électrodes, une tension prenant la forme d'un bruit blanc.
Description des fifiures La figure 1 représente un premier exemple de dispositif pour mettre en œuvre un procédé d'inhibition du développement de bactéries dans un milieu liquide.
Les figures 2 et 3 présentent des variantes de cet exemple, avec des électrodes de différentes géométries.
La figure 4 représente des résultats expérimentaux montrant l'évolution de la concentration bactérienne en fonction du temps pour différents essais réalisés.
La figure 5 représente des résultats expérimentaux montrant l'inhibition de la synthèse d'ATP (Adénosine Triphosphate) en fonction du temps, pour différents essais réalisés.
Description détaillée La figure 1 décrit un premier exemple de dispositif apte à mettre en œuvre un procédé objet de l'invention.
Une enceinte 11 comprend un milieu 10, par exemple un liquide, et des microorganismes 12 baignant dans ce liquide. Le milieu 10 peut également être une gélose.
Dans cet exemple, les microorganismes 12 sont des bactéries de type Escherichia coli. Le milieu 10 est un milieu de culture liquide dit LB (acronyme de Luria-Bertani).
Deux électrodes 21 et 22 sont plongées dans le milieu liquide 10. Dans ce premier exemple, elles ont une forme parallélépipédique de longueur 8 cm, de hauteur 3 cm et d'épaisseur 0.5 mm. Les électrodes sont espacées d'une distance inter-électrode D de 1 cm. Les électrodes sont, dans cet exemple, en acier inoxydable. D'autres électrodes métalliques pourraient être utilisables, par exemple en platine ou en or. L'acier inoxydable apparaît comme un bon compromis coût / performances. De plus, l'acier inoxydable ne libère pas d'ions toxiques. Les électrodes s'étendent parallèlement l'une par rapport à l'autre.
Les électrodes sont reliées à un circuit électrique 20. Le circuit électrique 20 comporte une alimentation électrique 23 produisant un courant alternatif, de façon à générer, entre les bornes des électrodes 21, 22, une différence de potentiel, ou tension de polarisation U, alternative. Le milieu situé entre les électrodes est alors soumis à un champ électrique alternatif E.
Afin d'éviter des échauffements ou la production d'ions toxiques dans le liquide par électrolyse, la fréquence de la tension est supérieure à 10 Hz, et préférablement supérieure à 100 Hz voire 1 kHz.
L'alimentation électrique, ou générateur, 23 est ici une source de bruit blanc, c'est-à- dire une source produisant un signal de valeur moyenne nulle, et dont la densité spectrale de puissance est constante sur une bande de fréquence donnée. La largeur de la bande de fréquence, selon laquelle la densité spectrale de puissance est constante peut s'étendre sur une à 3 décades, voire davantage. Typiquement, cette bande de fréquence s'étend entre 10 kHz et 10 MHz. Par constant, on entend ne s'écartant pas d'une même valeur à des fluctuations près, ces fluctuations pouvant atteindre 10 à 20 % de ladite valeur.
Le fait d'utiliser un tel générateur permet d'adresser une plage fréquentielle étendue, tout en étant de conception simple. De ce fait, et c'est un élément important de l'invention, le champ électrique E établi entre les électrodes 21 et 22 présente une multitude de composantes spectrales. Les inventeurs ont estimé que les microorganismes présents dans le milieu liquide sont susceptibles d'être sensibles à au moins une de ces composantes spectrales, l'effet du champ électrique E, à cette composante spectrale, étant alors apte à inhiber leur développement. Dans les procédés de l'art antérieur, on sélectionne une fréquence parmi une plage fréquentielle étendue, à l'issue d'une phase d'apprentissage, au cours de laquelle un microorganisme particulier est soumis, successivement, à différentes fréquences, l'exposition à chaque fréquence ayant une durée de quelques minutes ou quelques heures. Cela permet de déterminer la fréquence à laquelle la bactérie que l'on souhaite éliminer est la plus sensible. On peut parler d'un optimum fréquentiel. Cet optimum étant sélectionné, on applique alors un champ électrique à cette fréquence optimale pour inhiber la croissance bactérienne.
Le procédé objet de l'invention résulte d'une approche différente, puisqu'il comprend l'application d'un signal comportant simultanément, ou dans un intervalle de temps rapproché, une pluralité de composantes spectrales, dans une bande spectrale étendue, de préférence supérieure à 1 décade, et typiquement entre 2 et 5 décades, et de préférence entre 3 et 4 décades. On cible alors la majeure partie des microorganismes présents dans l'échantillon, sans qu'il soit besoin de les identifier préalablement, et d'établir la fréquence optimale à l'égard sur chacun d'entre eux. Par ailleurs, un optimum fréquentiel pour une bactérie peut dépendre du milieu dans lequel cette dernière est placée. En modifiant le milieu, l'optimum fréquentiel peut alors varier. Puisqu'il adresse une plage fréquentielle large, s'étendant de préférence selon plusieurs décades, le procédé objet de l'invention est plus robuste à l'égard de telles variations. Le générateur de bruit blanc 23 peut aisément être fabriqué en mettant en œuvre, par exemple, une diode Zener polarisée en inverse, au voisinage d'une tension d'avalanche. Le signal produit par la diode Zener peut alors être amplifié par un amplificateur bas bruit, ou plusieurs amplificateurs disposés en série, avant d'être appliqué aux électrodes 21 et 22.
Mais même si cela constitue le mode de réalisation préféré, notamment parce qu'un générateur de bruit blanc est simple à réaliser, en utilisant des composants électroniques peu onéreux, il n'est pas nécessaire que le signal appliqué aux électrodes soit un bruit blanc. Ainsi, selon une variante, le générateur 23 est un générateur apte à produire, dans un intervalle temporel suffisamment court, et de préférence simultanément, un courant électrique ayant de multiples composantes fréquentielles, s'étendant sur au moins une voire deux décades, et de préférence sur au moins trois décades, voire davantage.
Quel que soit le mode de réalisation, la tension appliquée entre les électrodes est de préférence alternative, c'est-à-dire présentant une alternance entre des valeurs positives et des valeurs négatives, cette alternance étant de préférence périodique. Cela permet de réduire la valeur moyenne de la tension appliquée au milieu liquide 10 s'étendant entre les électrodes 21 et 22. La valeur moyenne de la tension appliquée est de préférence aussi faible que possible, de façon à éviter l'apparition d'un effet d'électrolyse. La tension peut également présenter une alternance, notamment périodique, de valeurs inférieures et supérieures à une valeur fixe.
D'une façon générale, la fréquence du signal produit par le générateur 23 varie, dans un intervalle temporel inférieur à 1 heure, entre une fréquence minimale (fmin) et une fréquence maximale (fmax), la fréquence maximale fmax étant au moins 2 fois, voire 10 fois, voire au moins 100 fois supérieure à la fréquence minimale fmin.
En considérant que le temps de division cellulaire est compris entre 15 minutes et 30 minutes, un intervalle temporel d'1 heure correspond à une durée supérieure à deux fois le temps de division cellulaire. Le procédé est d'autant plus efficace que l'intervalle temporel, durant lequel les multiples fréquences sont appliquées, est faible. Ainsi, l'intervalle temporel peut être réduit à 30 minutes, ou 20 minutes, ou 10 minutes, ou 1 minute, ou être inférieur à 5 secondes ou même 1 seconde. Cela permet d'adresser une plage fréquentielle étendue, dépassant une décade, et atteignant de préférence plusieurs décades, dans un intervalle temporel faible. La figure 2 représente un autre mode de réalisation, dans lequel les électrodes 21 et 22 sont placées selon une configuration coaxiale : la première électrode 21 est en forme de barreau, de diamètre inférieur à 1 cm, par exemple 0,5 mm, tandis que la deuxième électrode 22 a une forme annulaire, coaxiale de la première électrode.
La figure 3 représente un autre mode de réalisation, dans lequel les électrodes 21 et 22 sont en forme de « peigne », ou « interdigitées ». Chaque électrode présente un tronçon latéral 21A, 22A duquel une pluralité de bras 21B, 22B font saillie, chaque bras s'étendant de préférence l'un parallèlement à l'autre. De préférence, chaque bras s'étend perpendiculairement au tronçon latéral auquel il est relié. Les électrodes 21 et 22 sont disposées face à face, de telle sorte qu'un bras d'une électrode s'étend entre deux bras adjacents de l'autre électrode. Ce mode de réalisation est adapté au traitement de volumes plus importants.
Quel que soit le mode de réalisation, la distance D entre les deux électrodes 21 et 22 est de préférence centimétrique, en étant comprise entre 0.5 cm et 15 voire 20 cm. Au-delà, la tension doit augmenter, sachant que le champ électrique E entre deux électrodes a de préférence une amplitude de quelques V/cm, de préférence comprise entre 1 et 10 V/cm.
Essais
Des essais expérimentaux ont été réalisés, en utilisant une configuration telle que représentée sur la figure 1, la tension appliquée ayant un spectre fréquentiel de bruit blanc entre 10 kHz et 10 M Hz, et une amplitude de 5 V. Les électrodes étant espacées de 1 cm, l'amplitude maximale du champ électrique E entre les deux électrodes s'élève à 5 V/cm.
Dans certaines configurations, un produit biocide a été ajouté dans le milieu de culture. Il s'agit du biocide dont la référence est Bioscreen BS 33, fourni par la société Hightech Bio Activities Holding GM BH. Sa composition est décrite dans le brevet FR2867947. I l comprend essentiellement de l'eugenol, et, dans une moindre mesure de l'acétate d'eugenol, ces composants étant notamment obtenus à partir de clou de girofle. L'utilisation d'un tel biocide, obtenu à l'aide de substances végétales naturelles, limite les effets néfastes sur l'environnement.
Trois configurations sont étudiées : configuration 1 : aucun traitement : l'échantillon comporte le milieu de culture tel que précédemment décrit ; I l s'agit de la configuration témoin ; configuration 2 : application de la tension alternative telle que précédemment décrite à l'échantillon ; configuration 3 : ajout du biocide précédemment décrit, dilué au l/8lème, et application de la tension alternative, de façon analogue à la configuration 2.
La concentration initiale en bactéries Escherichia coli s'élève à 5 108 bactéries par ml. La température de chaque échantillon a été maintenue à 20°C durant les essais. La figure 4 représente l'évolution de la concentration bactérienne dans le milieu, dans les configurations 1, 2 et 3, en fonction du temps, les points de mesure étant réalisés à t0, t0 + 30 min, t0 + 60 min, t0 + 120 min, t0 + 240 min et t0 + 360 min, t0 représentant le début de l'expérience, et correspondant à l'abscisse 0 sur la figure 4. Les abscisses sont exprimées en minutes tandis que chaque ordonnée représente la concentration bactérienne normalisée par la concentration dans l'échantillon témoin (configuration 1), au même instant. Chaque ordonnée représente, sous forme de pourcentage, l'évolution de la population bactérienne relativement à l'échantillon témoin de la configuration 1. Les marges d'erreur ne sont pas représentées.
La quantification de la population bactérienne a été réalisée par prélèvement à différents instants, puis dilution et étalement du prélèvement sur gélose, avant comptage visuel des colonies formées 24h à 48 h après l'étalement.
La configuration n° 2 (application d'un champ électrique seul) conduit à une réduction de la concentration bactérienne, d'environ 25% en 6 heures, par rapport à l'échantillon témoin. La configuration n° 3 (combinaison biocide et champ électrique) conduit à une réduction de la concentration bactérienne d'environ 40% en 6 heures, par rapport à l'échantillon témoin.
Cet essai montre que l'application d'un champ électrique alternatif, présentant simultanément des composantes spectrales comprises entre 10 kHz et 10 MHz, permet de réduire la croissance bactérienne dans un échantillon au bout de quelques heures. Un autre point remarquable est que l'effet du biocide sur la prolifération bactérienne améliore significativement l'effet du champ électrique. Cela confirme l'effet de synergie entre le biocide et l'application d'un champ électrique, effet désigné dans l'art antérieur par « effet bioélectrique ».
Parallèlement au dénombrement des bactéries par méthode visuelle, des mesures par ATPmétrie (dosage de l'Adénosine Triphospate par luminescence) ont été réalisées, sur chaque échantillon, à to, to + 120 min, to + 240 min et to + 360 min, to représentant le début de l'expérience, et correspondant à l'abscisse 0 sur la figure 5. Après prélèvement, lyse et récupération du culot, des mesures par bioluminescence ont été réalisées, représentatives de la concentration en ATP dans l'échantillon. Ces mesures sont représentatives de l'énergie libérée par le métabolisme des bactéries contenues dans l'échantillon.
La figure 5 représente les résultats de ces mesures, pour les trois configurations étudiées. L'axe des abscisses représente le temps écoulé depuis le début de l'expérience, l'axe des ordonnées représentant, en échelle arbitraire, l'intensité mesurée du signal de luminescence.
Sur l'échantillon témoin (configuration 1), on observe un accroissement de la concentration d'ATP, indiquant une croissance bactérienne soutenue. Les configurations 2 et 3 se distinguent par un accroissement nettement moins marqué de la concentration d'ATP, ce qui témoigne de l'effet du champ électrique seul ou, mieux, en combinaison avec un biocide, pour l'inhibition de la croissance bactérienne. Par ailleurs, les échantillons ont fait l'objet d'un contrôle de la température par observation à l'aide d'une caméra thermique. Aucun échauffement significatif n'a été observé.
Enfin, un dosage d'ions a été réalisé sur prélèvements, par ICP-OES (acronyme de Inductively Coupled Plasma - Optical Emission Spectrometry, signifiant couplage plasma induit par haute fréquence - spectrométrie optique). Ce dosage n'a pas révélé d'augmentation significative de la concentration en ions métalliques dans le milieu.
Le procédé décrit pourra s'appliquer à tout liquide dont on souhaite maîtriser ou réduire la prolifération bactérienne, en laboratoire ou à l'échelle industrielle, par exemple dans le domaine agroalimentaire, le traitement de l'eau, par exemple l'eau domestique ou l'eau de piscines, ou le traitement d'autres effluents liquides.
A l'échelle millimétrique ou microscopique, il pourra être intégré dans des cartes microfluidiques aptes à la mise en œuvre d'analyses ou de procédés sur des échantillons biologiques. Les électrodes peuvent être intégrées à de telles cartes lors de la fabrication de cette dernière, en mettant en œuvre des techniques de microfabrication usuelles permettant le dépôt d'un métal ou d'un matériau conducteur.
Le procédé peut être en particulier mis en œuvre en amont de processus biologiques, de traitement ou d'analyse, afin d'éliminer ou de réduire la quantité de bactéries dans l'échantillon traité.

Claims

Revendications
1. Procédé de traitement d'un milieu (10) comprenant des microorganismes (12), le milieu étant disposé entre une première électrode (21) et une deuxième électrode (22), à l'intérieur d'une enceinte (11), - chaque électrode s'étendant dans ladite enceinte, au contact dudit milieu (10), chaque électrode étant reliée à un circuit électrique (20) apte à établir une tension (U), selon au moins une fréquence (f), entre lesdites électrodes, le procédé étant caractérisé en ce que : ladite fréquence (f) varie, dans un intervalle temporel inférieur à une minute, entre une fréquence minimale (fmin) et une fréquence maximale (fmax), la fréquence maximale (fmax) étant au moins dix fois supérieure à la fréquence minimale (fmin), de façon à inhiber le développement desdits microorganismes dans le milieu.
2. Procédé de traitement selon la revendication 1, dans lequel ledit intervalle temporel est inférieur à 5 secondes ou 1 seconde.
3. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la tension (U) comporte simultanément une pluralité de composantes fréquentielles, entre la fréquence minimale (fmin) et la fréquence maximale (fmax).
4. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la tension (U) est produite par un générateur de bruit blanc (23).
5. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la fréquence maximale (fmax) est au moins cent fois ou mille fois supérieure à la fréquence minimale (fmin).
6. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la fréquence minimale (fmin) est supérieure à 10 Hz.
7. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la tension (U) génère, entre la première et la deuxième électrode, un champ électrique (E) dont l'amplitude maximale est inférieure à 10 V/cm.
8. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les première et deuxième électrodes sont métalliques, et comportent un métal choisi parmi l'acier inoxydable, le platine ou l'or.
9. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le milieu comporte également un principe actif apte à inhiber la croissance des microorganismes.
10. Procédé de traitement selon la revendication 9, dans lequel le principe actif est obtenu à partir de substances naturelles végétales.
11. Dispositif pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant : une enceinte, apte à recevoir un milieu (10) comprenant des microorganismes (12), une première électrode (21) et une deuxième électrode (22), chaque électrode étant reliée à un circuit électrique (20), le dispositif étant caractérisé en ce que, le circuit électrique (20) comporte un générateur (23) apte à produire, aux bornes desdites électrodes (21, 22), une tension dont la fréquence (f) varie, dans un intervalle temporel inférieur à une minute, entre une fréquence minimale (fmin) et une fréquence maximale (fmax), la fréquence maximale (fmax) étant au moins dix fois supérieure à la fréquence minimale (fmin).
12. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel ledit intervalle temporel est inférieur à 5 secondes ou à 1 seconde.
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, dans lequel le générateur (23) comprend une source de courant ou de tension apte à générer, aux bornes des dites électrodes, une tension (U) prenant la forme d'un bruit blanc.
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que les électrodes (21 ,22) sont réalisées en acier inoxydable.
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