EP3193938A1 - Utilisation conjointe d'un inhibiteur de trka et d'un inhibiteur de epha2 pour une utilisation dans le traitement de cancers solides et méthode de pronostic de la survie de patient souffrant d'un cancer solide - Google Patents

Utilisation conjointe d'un inhibiteur de trka et d'un inhibiteur de epha2 pour une utilisation dans le traitement de cancers solides et méthode de pronostic de la survie de patient souffrant d'un cancer solide

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EP3193938A1
EP3193938A1 EP15771188.8A EP15771188A EP3193938A1 EP 3193938 A1 EP3193938 A1 EP 3193938A1 EP 15771188 A EP15771188 A EP 15771188A EP 3193938 A1 EP3193938 A1 EP 3193938A1
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EP
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trka
inhibitor
epha2
cancer
cells
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Withdrawn
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EP15771188.8A
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Robert TOILLON
Xuefen LE BOURHIS
Cyril CORBET
Léo AUBERT
Matthieu Guilbert
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Universite Lille 1 Sciences et Technologies
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Universite Lille 1 Sciences et Technologies
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Definitions

  • the present invention relates to the joint use of a TrkA inhibitor and an EphA2 inhibitor for use in the treatment of solid cancers and to a prognosis method for the survival of a patient suffering from solid cancer.
  • inhibitor of TrkA and an inhibitor of EphA2 for use in the treatment of solid cancers are also relates to a method for predicting the survival of a patient suffering from a solid cancer.
  • the progression of a cancer involves many stages, depending in particular on the size of the primary tumor but also on the ability of tumor cells to metastasize in organs distant from the primary tumor. There are many reasons to explain the large number of failures in the therapeutic treatment of cancers. In many cases, the therapeutic failure is associated with the activation of transduction signals under receptors with tyrosine kinase activity (1).
  • Tyrosine kinase receptors also known as growth factor receptors, are a sub-family of protein kinases that act specifically on protein tyrosine residues. These transmembrane glycoproteins are composed of a highly variable extracellular domain capable of binding the ligand, a transmembrane domain allowing for anchoring in the cell membrane and an intracellular (cytoplasmic) domain that contains the tyrosine kinase activity and allows the signal transduction within the cell.
  • RTKs can be classified into several subclasses according to the characteristics of the extracellular receptor tyrosine kinase region.
  • anti-tumor therapies targeting growth factors, their receptors (receptors with tyrosine kinase activity), or the effectors of their signaling allowed the development of anticancer drugs.
  • NGF Nerve Growth Factor
  • TrkA receptors Tropomyosin receptor kinase A
  • p75 NTR p75 Neurotrophin Receptor
  • proNGF NGF precursor
  • breast cancer see, for example, US 2009068200 Al
  • TrkA receptor is not only activated by the NGF but also by its precursor, the proNGF.
  • proNGF is correlated with ganglionic invasion.
  • proNGF would increase the migratory and invasive capabilities of breast cancer cells in vitro (3).
  • proNGF pro-invasive growth factor
  • sortilin a Vps10P domain transmembrane receptor
  • TrkA receptor a Vps10P domain transmembrane receptor
  • Phosphorylation of TrkA induces Src and Akt proteins, which play a role in cancer development (3).
  • proNGF / TrkA axis plays an important role in the tumor progression of solid cancers (carcinomas or sarcomas), especially breast cancer.
  • TrkA inhibitors such as for example lataurtinib and its derivatives
  • Treatments using TrkA inhibitors are therefore not used for solid tumors.
  • TrkA inhibitor and on the other hand, of an EpbA2 inhibitor, made it possible to effectively treat certain forms of cancers, especially solid cancers and especially breast cancer.
  • the inventors have succeeded in demonstrating, very surprisingly, a signaling platform in breast cancer cells, causing resistance to commonly used TrkA tyrosine kinase inhibitors.
  • TrkA receptor associates directly with the EphA2 receptor under the effect of the fixation of the proNGF on the sortilin and that the TrkA / EpfiA2 complex is at the origin of the activation of a signaling, independent of the TrkA phosphorylation hitherto known and targeted by lestaurtinib.
  • the concomitant detection of TrkA and Eph2 also confirms the importance of the signaling induced by this complex. Indeed the presence of the complex is associated with a significant decrease in the overall survival of patients.
  • the invention thus relates to an inhibitor of EpbA2 for use in the treatment of solid cancer treated with a TrkA inhibitor.
  • the invention also relates to a TrkA inhibitor for use in the treatment of solid cancer treated with an EpbA2 inhibitor.
  • TrkA inhibitor inhibits the TrkA phosphorylation-dependent signaling pathways that have been known to date.
  • the proNGF by binding to the sortiline, causes the activation of the TrkA receptor, in turn inducing signaling pathways dependent on its phosphorylation.
  • the phosphorylation of TrkA in particular allows the activation of the Akt protein, which plays a major role in the invasion of cancer cells.
  • TrkA is part of the Trk kinases, subfamily RTK. Trk kinases comprise three isoforms with strong homology: TrkA, TrkB and TrkC, and are activated by growth factors, neurotrophins. TrkA is usually activated by NGF, but also by its precursor, the proNGF.
  • TrkA inhibitor a TrkA antagonist, a TrkA receptor expression inhibitor, an inhibitor of TrkA tyrosine kinase activity or a molecule preventing the attachment of signaling adapter molecules.
  • a TrkA inhibitor refers to an inhibitor of TrkA tyrosine kinase activity or a TrkA antagonist.
  • the TrkA inhibitor is an inhibitor of the TrkA tyrosine kinase activity
  • said inhibitor is a small, low molecular weight organic molecule (natural or non-natural).
  • small organic molecule refers to a molecule (natural or otherwise) of a size comparable to organic molecules generally used in the pharmaceutical field. This term excludes biological macromolecules (eg proteins, nucleic acids, etc.).
  • a small organic molecule according to the invention has a size less than about 10,000 Da, preferably less than 5000 Da, more preferably less than 2000 Da and more preferably less than about 1000 Da.
  • TrkA inhibitors are well known to those skilled in the art (see, for example,
  • the TrkA inhibitor according to the invention is chosen from K252a (see for example Lelkes et al (6)) and CEP-701 (see for example Ruggeri B et al (7)).
  • the TrkA inhibitor is an alkyne derivative (see, for example, Wang et al (5), WO2006044823, Cee VJ et al (8)). According to a particular embodiment, the TrkA inhibitor is a pyrazole derivative
  • the TrkA inhibitor is a pyrazole urea derivative (see, for example, Wang et al (5), WO2007064872, WO2007059202, WO2005110994).
  • the TrkA inhibitor is an aminothiazole derivative (see, for example, Wang et al (5), Das J et al (10), WO200250071, Kim SH et al (11)).
  • the TrkA inhibitor is a pyrrolotriazine derivative (see, for example, Wang et al (5), WO2007061882, Ghose AK et al (12), WO2008057994).
  • the TrkA inhibitor is an indolocarbazole derivative (see, for example, Wang et al (5)) such as CEP-701 or ettaurtinib (see, for example, Ruggeri B et al (7)) or analogs (3 'S) -epi-K-252a (see, for example, Gingrich DE et al (13)) or 7-oxo-indenopyrrolocarbazoles substituted at position 13 (see for example Tripathy R et al (14)) .
  • indolocarbazole derivative see, for example, Wang et al (5)
  • CEP-701 or ettaurtinib see, for example, Ruggeri B et al (7)
  • analogs (3 'S) -epi-K-252a see, for example, Gingrich DE et al (13)
  • 7-oxo-indenopyrrolocarbazoles substituted at position 13 see for example Tripathy R et al (14)
  • the TrkA inhibitor is a fused pyrazolyl cyclic derivative (see, for example, Wang et al (5), JP2003231687).
  • the TrkA inhibitor is a tetrahydropyrrolopyrazole derivative (see, for example, Wang et al (5)), comprising, in particular, a bicyclic 1,4,5,6-tetrahydropyrrolo [3,4-c] pyrazole such as PHA-739358 (see, for example, WO200505427, Fancelli D et al (17)).
  • the TrkA inhibitor is an imidazopyridazine derivative (see, for example, Wang et al (5), WO200852734).
  • the TrkA inhibitor is an isothiazole derivative (see, for example, Wang et al (5), WO2004011461, Lippa B et al (18)).
  • the TrkA inhibitor is a pyrrolopyrimidine derivative (see, for example, Wang et al (5)), such as CE-245677 (see, for example, WO2004056830, WO2005116035).
  • the TrkA inhibitor is an azaindole derivative (see, for example, Wang et al (5), WO2008080001, WO2008063888).
  • the TrkA inhibitor is GNF-5837 (see, for example, Albaugh et al (19)).
  • the TrkA inhibitor is (2E) -3- [3,5-bis (1,1-dimethylethyl) -4-hydroxyphenyl] -2-cyano-2-propenethioamide, known as name AG 789.
  • said inhibitor according to the invention is a TrkA antagonist.
  • An antagonist is typically any substance, a simple or complex compound, of natural or synthetic origin which is opposed to the activation of the TrkA receptor and which opposes in particular the induction of the biological response which is obtained with a natural ligand of this receptor. In general, such an antagonist alters signaling or recruitment of TrkA partners into the cell.
  • the TrkA antagonist is an anti-TrkA antibody that neutralizes TrkA or an anti-TrkA fragment thereof that neutralizes TrkA.
  • Anti-TrkA antibodies are known to those skilled in the art.
  • Antibodies directed against TrkA may be produced according to methods known to those skilled in the art, in particular by administering an antigen or epitope to a selected host animal, for example a pig, a cow, a horse, a rabbit, a goat, a sheep or a mouse.
  • a selected host animal for example a pig, a cow, a horse, a rabbit, a goat, a sheep or a mouse.
  • Various adjuvants known in the state of the art can be used to improve the production of the antibody.
  • the antibody according to the invention may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody is preferred.
  • Monoclonal antibodies against TrkA can be prepared and isolated by any suitable method, for example by the hybridoma technique originally described by Kohler and Milstein (1975) (20); the EBV hybridoma technique (Cole et al., 1985) (21), etc.
  • methods described for the production of single-chain antibodies can be adapted to produce single-chain anti-TrkA antibodies.
  • Antagonists which can be used according to the invention also include the antibody fragments, for example but not limited to F (ab ') 2 fragments, which can be generated by digestion with pepsin of an immunoglobulin, the fragments Fab can be generated by reduction of disulfide bridges of F (ab ') 2 fragments, scFv fragments.
  • F (ab ') 2 fragments which can be generated by digestion with pepsin of an immunoglobulin
  • the fragments Fab can be generated by reduction of disulfide bridges of F (ab ') 2 fragments, scFv fragments.
  • Fab and / or scFv expression libraries can be produced to enable rapid identification of fragments with the desired specificity for TrkA.
  • Humanized anti-TrkA antibodies and antibody fragments can also be prepared according to techniques known to those skilled in the art.
  • a "humanized antibody” refers to a human immunoglobulin (recipient antibody) in which residues of a hypervariable region (CDRs) are replaced by residues of a hypervariable region of a non-human species (donor antibody) as a mouse, rat, rabbit etc, which has the specificity, affinity and desired capacity.
  • the FR residues of the human immunoglobulin are replaced by the corresponding non-human residues.
  • humanized antibodies may include residues not found in the recipient or donor antibodies. These modifications are made to improve the performance of the antibody.
  • the humanized antibody will optionally comprise at least a portion of a constant region of an immunoglobulin (Fc), typically that of a human immunoglobulin.
  • Fc immunoglobulin
  • Methods for producing humanized antibodies are described, for example, by Winter (US Pat. No. 5,225,539) and Boss (Celltech, US Pat. No. 4,816,397).
  • the TrkA antagonist is selected from aptamers.
  • Aptamers are a class of molecules that represent an alternative to antibodies in terms of molecular recognition.
  • Aptamers are oligonucleotides or oligopeptide sequences having the ability to recognize virtually any class of target molecules with high affinity and specificity.
  • Such ligands can be isolated for example via a Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) system from a library of randomized sequences, as described by Tuerk C. Gold L. (22).
  • the library of randomized sequences can be obtained by combinatorial chemical synthesis of DNA. In this library, each member is a linear oligomer, optionally chemically modified, of single sequence.
  • neutralizing aptamers of TrkA are selected.
  • the TrkA antagonist is a natural ligand of TrkA that has been modified to prevent the binding of a natural ligand of TrkA.
  • Natural ligands of TrkA are, for example, the Nerve Growth Factor (NGF), its precursor (proNGF), and neurotrophin 3 (NT3) (23).
  • NGF Nerve Growth Factor
  • proNGF nerve growth Factor
  • NT3 neurotrophin 3
  • One skilled in the art knows how to modify natural ligands of said receptor so as to produce antagonistic molecules.
  • TrkA inhibitor is a TrkA antagonist
  • another embodiment according to the invention relates to an inhibitor of the expression of the TrkA receptor (ie of the TrkA receptor gene).
  • Small interfering RNAs can be used according to the invention as inhibitors of TrkA receptor gene expression.
  • TrkA receptor gene expression can be reduced by contacting a subject or a cell with small double-stranded RNA fragments (dsRNA), or a vector or genetic construct inducing the production of small double-stranded RNA fragments, so that the expression of the TrkA receptor gene is specifically inhibited (ie interference by RNA or RNAi)
  • dsRNA small double-stranded RNA fragments
  • Methods for selecting a dsRNA or a vector encoding dsRNA are known in the state of the art for genes whose sequence is known (see, for example, WO 01/36646, and WO 01/68836).
  • Ribozymes may also be used according to the invention as inhibitors of TrkA receptor gene expression. Ribozymes are enzymatic RNA molecules capable of catalyzing the specific cleavage of RNA. The mechanism of action of ribozymes involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to the complementary target RNA, followed by endonucleolytic cleavage. Pin-or-hammer pattern ribozymes that specifically and effectively catalyze endonucleolytic cleavage of the TrkA receptor mRNA sequences can therefore be used according to the invention.
  • Cleavage-specific sites in any target RNA can be initially identified by scanning the target molecule for cleavage sites, which typically include the following sequences, GUA, GUU and GUC. Once identified, short AR sequences having between 15 and 20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site can be evaluated to predict structural characteristics, such as secondary structure, that may render the oligonucleotide sequence unsuitable. . The suitability of the target can also be assessed by testing its accessibility to hybridization with complementary oligonucleotides using, for example, ribonuclease protection techniques.
  • siR A antisense oligonucleotides and ribozymes that can be used as inhibitors of TrkA receptor gene expression can be prepared according to known methods. Chemical synthesis methods can be used such as, for example, phosphoramadite solid phase chemical synthesis. Alternatively, antisense RNA molecules can be generated by in vitro or in vivo transcription of the DNA sequences encoding the RNA molecule. Such DNA sequences can be incorporated into a wide variety of vectors that incorporate appropriate RNA polymerase promoters such as T7 or SP6 polymerase promoters. Modifications can be introduced into the oligonucleotides according to the invention in order to increase their intracellular stability and their half-life.
  • Alterations that may be made include, but are not limited to, the addition of flanking regions of ribonucleotides or deoxyribonucleotide at the 5 'and / or 3' end of the molecule, or the use of phosphorothiorate or 2'- 0-methyl rather than phosphodiesterase linkages in the oligonucleotide backbone.
  • SiRNAs and ribozymes of the invention can be delivered in vivo alone or in combination with a vector.
  • Vector is understood to mean any vehicle capable of facilitating the transfer of the siRNA or ribozyme to the cells, and preferably the cells expressing the TrkA receptor.
  • the vector transports the nucleic acid to the cells with reduced degradation compared to the degradation that would result in the absence of the vector.
  • the vectors that can be used according to the invention include, but are not limited to, plasmids, phagemids, viruses, and other vehicles derived from viral or bacterial sources and that have been manipulated by insertion or incorporation of siRNA or sequences. nucleic acid ribozyme. Such vectors are well known to those skilled in the art. It is finally possible to use as a TrkA inhibitor a molecule preventing the attachment of the signaling adapter molecules.
  • signaling adapter molecule is meant molecules that interact with the TrkA receptor by interaction domains to trigger intracellular signaling.
  • Signaling adapter molecules of the TrkA receptor are, for example, shc, FRS2, PLCgammal and Grb2 proteins. These inhibitors may for example be of a peptide nature, generally obtained by the synthesis of all or part of a signaling molecule which would have a dominant negative effect on the binding of cellular adapters. These molecules may also be organic mimetics, ie nonpeptide analogs, whose conformation makes it possible to recognize the sequence of the TrkA receptor to bind to it and prevent the competition binding of the signaling partner (56).
  • inhibitors can also, by their binding, prevent activation of the TrkA receptor by inhibiting the conformational changes necessary for the activation of TrkA (for example, by allosteric antagonist such as AR-786 developed by Array Biopharm).
  • allosteric antagonist such as AR-786 developed by Array Biopharm.
  • the synthesis and use of such analog peptides and their organic mimetics to inhibit intracellular signaling are known to those skilled in the art (see for example EP2060265 B1).
  • TrkA inhibitor in the treatment of cancer remains of limited effectiveness in that signaling pathways independent of TrkA phosphorylation also mediate cancer cell invasion.
  • EpbA2 thus makes it possible to inhibit a signaling pathway that is independent of TrkA phosphorylation.
  • Ephrin 2 receptor type A (EphA2) is a receptor with tyrosine kinase activity of 135 kDa.
  • Group A ephrins are bound to the cell membrane of the source cell by a glycosyl-phospatidylinositol, while group B ephrines have a trmnmembr y domain.
  • EphA2 inhibitor means an EphA2 antagonist, an inhibitor of EphA2 receptor expression, or a molecule preventing the attachment of signaling adapter molecules.
  • an inhibitor of EpbA2 refers to an EphA2 antagonist or an inhibitor of EphA2 receptor expression, more preferably an inhibitor of EpbA2 refers to an inhibitor of EphA2 receptor expression.
  • an inhibitor of EphA2 tyrosine kinase activity is not considered an "EphA2 inhibitor”.
  • said inhibitor according to the invention is an EphA2 antagonist.
  • An antagonist is typically any substance, simple or complex compound, of natural or synthetic origin that opposes activation of the EphA2 receptor. In general, such an antagonist alters the signaling or recruitment of EphA2 partners in the cell.
  • the EphA2 antagonist is an anti-EphA2 antibody that neutralizes
  • EphA2 or an anti-EphA2 fragment thereof that neutralizes EphA2.
  • Anti-EphA2 antibodies are known to those skilled in the art. One can for example refer to the application WO2009028639, the application WO0112840 or the application WO2008010101.
  • Antibodies directed against EphA2 can also be produced according to methods known to those skilled in the art. We can thus refer to the preceding paragraphs mentioning such methods of production also applicable here.
  • the antibody according to the invention may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody is preferred.
  • Monoclonal antibodies directed against EphA2 can be produced and isolated according to methods known to those skilled in the art. We can also refer here to the previous paragraphs mentioning such methods of production also applicable here.
  • Antagonists which can be used according to the invention also include antibody fragments, for example but not limited to Fab, F (ab ') 2 , scFv fragments.
  • Antibody or humanized anti-EphA2 antibody fragments may also be prepared according to techniques known to those skilled in the art. We can also refer here to the preceding paragraphs mentioning such methods of production, also applicable here. For this invention, neutralizing antibodies of EphA2 are selected.
  • the EphA2 antagonist is selected from aptamers.
  • Aptamers can be produced according to methods known to those skilled in the art. We can thus refer to the preceding paragraphs mentioning such methods.
  • the EphA2 antagonist is a natural ligand of EphA2 that has been modified to prevent binding of a natural EphA2 ligand.
  • a natural ligand of EphA2 is ephrin Al.
  • Other natural ligands are, with lower affinities, members of the ephrin A family.
  • One skilled in the art knows how to modify natural ligands of the receptor so as to produce antagonistic molecules. For example, it is possible to use a natural ligand or a fragment of natural ligand, preferably ephrin Al, coupled to the Fc portion of an antibody (also called ephrin Al-Fc) (55).
  • said inhibitor according to the invention is an inhibitor of the expression of the EphA2 receptor (i.e. of the EphA2 receptor gene).
  • Small interfering RNAs can be used according to the invention as inhibitors of the expression of the EphA2 receptor gene.Expression of the EphA2 receptor gene can be reduced by contacting a subject or a cell with small double-stranded rRNA fragments (dsRNA), or a vector or genetic construct inducing the production of small double-stranded RNA fragments, such that expression of the EphA2 receptor gene is specifically inhibited ( ie, interference by RNA or RNAi.)
  • dsRNA small double-stranded rRNA fragments
  • Methods for selecting a dsRNA or a vector encoding dsRNA are known in the state of the art, reference may be made to the preceding paragraphs referring to such methods. Haifa Shen et al (25).
  • Ribozymes can also be used according to the invention as inhibitors of the expression of the EphA2 receptor gene.
  • the siR A antisense oligonucleotides and ribozymes that can be used as inhibitors of EphA2 receptor gene expression can be prepared and selected according to known methods. We can refer to the previous paragraphs which mention such methods, also applicable here.
  • EphA2 a molecule preventing the attachment of the signaling adapter molecules.
  • signaling adapter molecule molecules that interact with receptors by interaction domains to trigger intracellular signaling.
  • EphA2 receptor signaling adapter molecules are, for example, Shc, Fakl, ephexin 4.
  • these inhibitors may be of a peptide nature, generally obtained by the synthesis of all or part of a signaling molecule that would have a negative dominant effect. on the binding of cellular adapters.
  • These molecules can also be organic mimetics, i.e.
  • non-peptide analogs whose conformation makes it possible to recognize the sequence of the EphA2 receptor to bind to it and prevent the competition's binding of the signaling partner.
  • These inhibitors can also by their binding prevent the activation of the EphA2 receptor by inhibiting the conformational changes necessary for the activation of EphA2 (for example by allosteric antagonist ALW-II-41-27 (26)).
  • ALW-II-41-27 allosteric antagonist ALW-II-41-27
  • EphA2 is expressed on the cell surface and binds to its ligand, ephrin-Al. Ligand / receptor interaction contributes to tissue homeostasis.
  • the overexpression of EphA2 has previously been reported to play a determining role in the invasive and oncogenic capacities of breast cancer cells (27).
  • the EphA2 receptor has been associated with a basal type phenotype and aggressive behavior in tumor cells (27,28).
  • the proNGF by attaching itself to spellkin, recruits TrkA but also that TrkA associates directly with EphA2.
  • the proNGF thus causes the direct association of the sortiline / TrkA complex and EphA2.
  • the inventors have discovered that the complex associating the Sortilin, TrkA and EphA2 formed induced signaling pathways independent of TrkA phosphorylation, such as activation of the Src protein, also involved in cancer cell invasion.
  • EphA2 thus makes it possible, for example, to inhibit the activation of the Src protein, as well as all the EphA2-induced pro-tumor signaling, for example Ras-dependent signaling and MAP kinases (29). , of Vav2-RhoA (30), Stat 5 (31).
  • a treatment based on the use of a TrkA inhibitor and an EpbA2 inhibitor makes it possible to act synergistically and effectively against cancer by overcoming the resistance phenomena that were put in place with a treatment.
  • a treatment based on an inhibitor of TrkA alone for example a treatment with lestaurtinib.
  • proNGF receptors with tyrosine kinase activity are activated here by the effect of proNGF, that is to say an unreacted tyrosine kinase receptor ligand. It has indeed been demonstrated by the inventors that these signaling pathways are specifically activated by proNGF, the NGF activating the Akt and Src proteins in a manner dependent on the phosphorylation of TrkA, without requiring the sortilin or EphA2. ProNGF therefore does not act similarly to NGF, and induces the invasion of cancer cells in a very specific way.
  • cancer treatment is meant any treatment that can, for example, suppress a tumor or metastases, reduce the risk of recurrence, slow tumor development or metastasis, and / or treat the symptoms of the disease.
  • the cancers targeted by the present invention are in particular those in which the TrkA and EphA2 receptors are expressed, and more preferably the combination of TrkA and EphA2 receptors.
  • the detection of cancers targeted by the present invention can be carried out according to techniques known to those skilled in the art. Typically, the TrkA and EphA2 receptors are detected.
  • the combination of protein complexes in particular the combination of TrkA and EphA2 receptors, and optionally TrkA and EphA2 receptors and of sortilin, is also detected.
  • the "receptor to be detected” is called the TrkA and / or EphA2 receptor.
  • the TrkA and EphA2 receptors can be detected in a biological sample by detection of TrkA / EphA2 AR m, by direct detection of TrkA / EpfiA2 proteins or by demonstration of TrkA activation. / EpfiA2.
  • a biological sample used for the direct detection of TrkA / EphA2 may be a biological fluid or tissue from a tumor biopsy or metastasis of the patient.
  • a biological fluid used according to the present invention include blood, bone marrow, milk, cerebrospinal fluid, urine and effusions.
  • the biological fluid may require a particular treatment, especially if they are circulating tumor cells that express the receptor to be detected.
  • the biological fluid can be pretreated to isolate circulating tumor cells or circulating cell fragments (exosomes or microvesicles) contained in said biological fluid.
  • isolated the circulating tumor cells is meant to obtain a cell fraction enriched in circulating tumor cells.
  • the treatment of the fluid to isolate the circulating tumor cells may for example be carried out by cell sorting in a flow cytometer, by enrichment on Ficoll, by enrichment with magnetic beads coated with specific antibodies, or by any other known specific enrichment method. of the skilled person.
  • Circulating cell fragments can be prepared from preparative methods such as ultracentrifugation or other chromatographic methods, flow cytometry for isolating or enriching known to those skilled in the art.
  • the circulating tumor cells can be isolated by a Ficoll cell separation technique associated with blood cell depletion using anti-CD45 antibodies coupled to beads. Magnetics (Dynal Biotech ASA, Norway).
  • the direct detection of the receptor can then be carried out directly from circulating tumor cells isolated from the biological fluid by any means well known to those skilled in the art, for example by immunocyto-chemical labeling of these cells with an antibody or by flow cytometry.
  • the biological sample is tissue, typically derived from tumor biopsy or patient metastasis
  • direct detection of the receptor can be performed directly on the resulting sections without prior treatment of the tissue.
  • the direct detection of the targeted receptor can be implemented by any means known to those skilled in the art, in particular by mass spectrometry or by immunological tests.
  • the immunoassay may be any test widely known to those skilled in the art involving immunological reactions, i.e., reactions between a receptor and a specific binding partner of the receptor.
  • Mass spectrometry can be used for the direct detection of TrkA in the biological sample.
  • the principle and implementation of mass spectrometry are widely known to those skilled in the art.
  • the biological sample is passed through a mass spectrometer and the spectrum obtained is compared with that of the receiver to be detected (for example, TrkA or EphA2).
  • Detection can also be done by labeling membrane proteins (eg with biotin) for streptavidin / biotin affinity capture.
  • Immunological tests are also well known to those skilled in the art and include immunological reactions, namely reactions between the receptor to be detected and a specific binding partner of the receptor to be detected.
  • the specific binding partners of the receiver to be detected are any partner likely to bind to the receiver.
  • binding partner antibodies are typically either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies. Techniques for obtaining such antibodies are well known to those skilled in the art.
  • examples of anti-TrkA antibodies are known and are available in particular in the catalog of Cell Signaling or Alomone.
  • anti-EphA2 antibodies are also known and available especially in the catalog of Cell Signaling or Santa Cruz.
  • a labeling of the specific binding partners of the receptor to be detected may be performed for the revelation of the receptor / binding partner binding.
  • labeling of the binding partners is meant the fixing of a marker capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • markers consists of enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, chromophores. as fluorescent compounds, luminescent, dyes; fluorescent molecules such as alexa or phycocyanins; radioactive molecules containing radioactive isotopes elements such as P, S or I etc.
  • enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, chromophores.
  • fluorescent compounds luminescent, dyes
  • fluorescent molecules such as alexa or phycocyanins
  • radioactive molecules containing radioactive isotopes elements such as P, S or I etc.
  • Indirect labeling systems can also be used, such as, for example, ligands capable of reacting with an anti-ligand.
  • Ligand / anti-ligand pairs are well known to those skilled in the art, for example biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / polynucleotide complement.
  • the anti-ligand can be detectable directly by the markers described above or can itself be detectable by a ligand / anti-ligand.
  • immunological tests as defined above, mention may be made of "sandwich” methods such as ELISA, IRMA and RIA, the so-called competition and direct immuno-detection methods such as immunohistochemistry, immunocytochemistry, Western-blot, Dot-blot.
  • Another mode of detecting the presence of the receptor to be detected consists in culturing, in the presence of the biological sample, cells sensitive to the receptor to be detected, which constitutes a particular embodiment of the invention.
  • Another particular embodiment of detecting the presence of the receptor to be detected in the biological samples consists in detecting the mRNA of said receptor to be detected in said sample.
  • mRNA preferably from circulating cells or circulating cell fragments in a biological fluid as defined above. It may for example be implemented by hybridization reactions between the target mRNA and a nucleic acid capable of binding with the target mRNA.
  • Nucleic acid is understood to mean oligonucleotides, deoxyribo nucleic acids and ribo nucleic acids, as well as their derivatives.
  • oligonucleotide refers to a sequence of at least 2 nucleotides (deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or both), natural or modified, capable of hybridizing, under appropriate hybridization conditions, with an at least partially complementary oligonucleotide.
  • modified nucleotide is meant, for example, a nucleotide comprising a modified base and / or having a modification at the level of the internucleotide link and / or at the level of the backbone.
  • a modified base mention may be made of inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine and bromo-5-deoxyuridine.
  • a modified internucleotide linkage may be the phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate and alkylphosphodiester linkages.
  • Alpha-oligonucleotides such as those described in FR-A-2 607 507, the LNAs such as phosphorothioate-LNA and 2'-thio-LNA described in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (32), and the PNAs (33), are examples of oligonucleotides consisting of nucleotides whose backbone is modified.
  • the revelation of the hybridization reactions can be carried out by labeling the binding nucleic acids, as previously illustrated.
  • the target mRNA can be extracted by methods known to those skilled in the art, and then optionally amplified, for example by RT-PCR or by NASBA (34).
  • the detection of the association of protein complexes can also be carried out by any means known to those skilled in the art, in particular by immunoassays. Typically, the method of proximity ligation assays (PLA) or Duolink® can be used. The detection of protein complexes may also implement bivalent reagents.
  • a solid cancer targeted by the present invention is a solid cancer having cancer cells expressing the EphA2 and TrkA receptors, which is selected from breast cancer (35, 36), prostate cancer ( 37,38), colon cancer (36,37), cancer of the tongue (36,39), cancer of the oropharyngeal sphere (39,39), thyroid cancer (40,41) , pancreatic cancer (36,42), neuroblastoma (36,43), glioma (44), skin cancer (melanoma) (36,45).
  • a cancer targeted by the present invention is cancer of the breast, the prostate or the oropharyngeal sphere (tumors of the tongue, the oral cavity, the pharynx and the larynx). More preferably, a cancer targeted by the present invention is breast cancer.
  • An object of the invention relates to a method of treating a solid cancer in a patient treated with a TrkA inhibitor as previously described, comprising a step of administering to said patient a therapeutically active and tolerable amount of a pharmaco logical point of view of an EpbA2 inhibitor as previously described.
  • patient is intended to mean a human affected, or caused to be affected, by a solid cancer targeted by the present invention as previously defined.
  • therapeutically active amount of an inhibitor according to the invention means an amount of inhibitor sufficient to treat such a cancer, having an acceptable benefit / risk ratio for drug treatment.
  • the amount of inhibitor (s) and compositions according to the present invention as well as the frequency of administration may be determined by clinical studies, by the doctor or by the pharmacist.
  • the amount “therapeutically active” specific to each patient may depend on a number of factors such as the nature and severity of the disorder to be treated, the inhibitor used, the composition used, age, weight, condition general health, sex and diet of the patient, the mode of administration, the duration of treatment (single-dose or multiple doses), the drugs used in combination and other factors well known to medical specialists.
  • the TrkA inhibitor according to the invention and the EphA2 inhibitor according to the invention can be administered simultaneously or sequentially.
  • EpbA2 according to the invention may be combined in a pharmaceutical composition or may be separated, for example as a combination product (kit).
  • An object of the invention thus relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a TrkA inhibitor as described above, an inhibitor of EpbA2 as described above and at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • One particular embodiment relates to such a pharmaceutical composition for use in the treatment of solid cancer.
  • the TrkA inhibitor and the EpbA2 inhibitor in therapeutically active amounts, are combined with one or more pharmaceutically acceptable carriers, and optionally sustained release matrices, such as biodegradable polymers, in order to to form therapeutic compositions.
  • pharmaceutically acceptable carrier or excipient refers to a solid, semi-solid, diluent, encapsulant material, or other non-toxic formulation.
  • sterile phosphate buffered saline solutions are pharmaceutically acceptable.
  • the pharmaceutically acceptable carriers can usually comprise one or more compounds, for example selected from excipients, preservatives, solubilizers, buffering agents, albumin, etc.
  • excipients are, for example, starch, gelatin, stearic acid, calcium or magnesium stearate and the like.
  • the form of the pharmaceutical composition, the mode of administration, the dosage and the dosage may depend, inter alia, on the cancer to be treated, its symptoms, severity, age, weight and / or sex. patient.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be formulated so as to be administered orally, sublingually, subcutaneously, intramuscularly, intratumorally, intravenously, topically, locally, intratracheally, intranasally, transdermally, rectally, intraocularly , Intra-auricular, the inhibitors according to the invention can be administered, individually or in combination, in unit dosage form.
  • the unit dosage forms may be, for example, tablets, capsules, granules, powders, injectable oral solutions or suspensions, transdermal patches, sublingual, oral, intratracheal, intraocular forms of administration.
  • intranasal, intra-auricular, by inhalation topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intratumoral or intravenous administration forms, rectal administration forms or implants.
  • topical administration one can consider creams, gels, ointments, lotions or eye drops.
  • Another subject of the invention relates to a combination product comprising:
  • One particular embodiment relates to such a combination product for use in the treatment of solid cancer.
  • Such a combination product or kit allows administration of the TrkA and EphA2 inhibitors according to the invention simultaneously, i.e. at the same time, or separated in time, i.e. successively.
  • the invention also relates to a method for predicting the survival of a patient suffering from a solid cancer comprising a step of detecting the expression of TrkA and EphA2 in a biological sample of the patient, the coexpression of TrkA and EphA2 being associated with a poor survival prognosis of the patient.
  • the step of detecting the expression of TrkA and EphA2 is carried out by the detection of a TrkA / EpfiA2 complex.
  • TrkA / EpfiA2 complex the co-expression of TrkA and EphA2, in particular the presence of a TrkA / EphA2 complex is associated with a significant decrease in the overall survival of patients.
  • a biological sample used for the detection of TrkA / EpfiA2 is typically a sample from a tumor biopsy or metastasis of the patient.
  • TrkA and EphA2 can be carried out by any means known to those skilled in the art.
  • Detection of the TrkA / EphA2 complex can be carried out by any means known to those skilled in the art, in particular by immunoassays. Typically, the method of proximity ligation assay (PLA) or Duolink® can be used. The detection of the complex may also implement bivalent reagents recognizing both TrkA and EphA2.
  • Figure 1 Study of the pro-invasive effects of NGF and proNGF on cancerous epithelial cells. Invasion tests were performed on cancer cells of the tongue (CAL 27, CAL 33), larynx (SQ20B), pharynx (FaDu), prostate (DU145, PC3) and breast (MDA-MB-). 231), inoculated in a Boyden chamber and treated with NGF (16nM) or proNGF NC (0.5 nM) for 20h. Untreated cells represent control and determine a basal invasion of 100%.
  • Figure 2 Study of receptor expression in cancer epithelial cells.
  • the levels of protein expression of EphA2, sortilin, p75NTR, and TrkA receptors were measured by Western blot on proNGF-sensitive cells (CAL 33, DU 145, PC3, and MDA-MB-231 cells). 50 ⁇ g of total proteins are loaded.
  • FIG. 3 Study of the implication of EphA2 on the pro-invasive effects of proNGF.
  • the invasion test is carried out on MDA-MB-231 (A), DU145 (B) and PC3 (C) cells transfected with a siRNA directed against EphA2 (siEphA2), TrkA (siTrkA) or a random siRNA (siCRTL) .
  • the untreated transfected-siCTRL cells serve as control and determine a basal invasion of 100% (white bar).
  • the error bars represent the standard deviation.
  • * p ⁇ 0.001 for proNGF or NGF treatment vs no treatment
  • the efficiency of siRNAs is measured by Western blot using specific antibodies against TrkA, EphA2, and actin (charge control).
  • TrkA / EphA2 complex The expression of the TrkA / EphA2 complex is associated with a decrease in the overall survival of patients in breast cancer.
  • the expression of the TrkA / EphA2 complex was sought by Proximity ligation assays on 182 breast tumors (tissue microarrays CBA4 (Superbiochips) and Hbre-Duc 150 on-01 (US Biomax)).
  • the expression of the complex was graded in zero (no labeling) expression, weak or very weak (from 0 to 5 complexes detected per cell on average, average 5 to 15 complexes per cell on average, more than 15 complexes per cell in average).
  • Figure 5 Identification of proteins associated with TrkA in mass spectrometry.
  • FIG. 6 Study of the formation of a complex between TrkA, EphA2 and sortilin by immunoprecipitation in MDA-MB-231 HA-TrkA cells.
  • MDA-MB-231 cells HA-TrkA are treated with 0.5 nM proNGF NC or 16 nM NGF (5 and 30 min).
  • HA-TrkA, spellkin and EphA2 are immunoblot using the anti-HA, anti-sortilin and anti-EphA2 antibodies, respectively.
  • Figure 7 Study of the impact of a sequential invalidation of each of the TrkA, sortilin, EphA2 receptors in the formation of the TrkA / sortiline / EphA2 complex under treatment with proNGF.
  • MDA-MB-231 HA-TrkA cells were transfected with siTrkA and then treated with N.C. proNGF. Sortiline is immunoprecipitated, EphA2 and HA-TrkA immunoblot.
  • MDA-MB-231 HA-TrkA or kinase-dead HA-TrkA cells are treated with N.C. proNGF
  • the recruitment of sortilin and EphA2 is determined after anti-HA immunoprecipitation.
  • the efficacy of mutagenesis was verified with an anti-phospho-tyrosine antibody.
  • HA-TrkA cells are treated with proNGF N.C in the presence or absence of 1 ⁇ of neurotensin.
  • HA-TrkA is immunoprecipitated with the anti-HA antibody and the sortilin and EphA2 are immunoblot.
  • D. MDA-MB-231 HA-TrkA cells are transfected with siEphA2 and then treated with N.C. proNGF (30 min). The recruitment of sortilin and EphA2 is determined after anti-HA immunoprecipitation.
  • FIG. 8 Study of the role of TrkA and EphA2 in the activation of Akt and Src proteins.
  • the MDA-MB-231 cells were treated respectively with a TrkA inhibitor (K252a), an anti-EphA2 siRNA (siEphA2), a PI3-K inhibitor (LY294002) and a Src inhibitor (SKI-1).
  • MDA-MB-231 HA-TrkA cells are treated with proNGF NC (A) or NGF (D) (30 min) in the presence or absence of 10 nM K252a, 15 ⁇ LY294002 and 50 nM SKI- 1.
  • proNGF NC A
  • NGF D
  • the phosphorylation of Akt and Src is determined by the use of phospho-specific antibodies. Equicharge is verified with Akt and Src antibodies.
  • MDA-MB-231 HA-TrkA cells or kinase-dead HA-TrkA cells are treated with proNGF NC (B) or NGF (E) (5 and 30 min). Phosphorylation of Akt and Src is measured by Western blot.
  • C and F The phosphorylation of Akt and Src was determined in the total lysates from siEphA2 transfected MDA-MB-231 cells and treated for 30 min with either proNGF NC (C) or NGF (F).
  • Figure 9 Study on the inhibition of TrkA and EphA2 on tumor development in vivo.
  • Tumor volumes are evaluated by measuring length (1) and width (w) and then calculating volume via the formula ⁇ / 6 ⁇ 1 ⁇ W ⁇ (1 + w) / 2; the Mann and Whitney test was performed between the control group and CEP-701 (a), between the control groups and siEphA2 (b), between the control groups and CEP-701 + siEphA2 (c), and between the siEphA2 groups and CEP-701 + if EphA2 (d) *, P ⁇ 0.05; **, P ⁇ 0.01; ns: not significant.
  • SiTrkA 7.5 microg / mouse
  • siEphA2 7.5 microg / mouse
  • TrkA 7.5 microg / mouse
  • siEphA2 7.5 microg / mouse
  • Figure 10 Study of the effect of lataurtinib (TrkA inhibitor) and EphrinAl-Fc (EpbA2 inhibitor) and the combination of treatment on breast cancer cell invasion.
  • the invasion test is performed on MDA-MB-231 cells.
  • Unstimulated (“non stim") cells of proNGF serve as control and determine a basal invasion of 100% (white bar).
  • Example 1 - EphA2 is involved in the cellular invasion of various proNGF-induced cancer cell lines by functional interaction with the sorcine / TrkA complex.
  • Reagents were provided by Sigma (France), cell culture media were obtained from Invitrogen (France). Cell culture plastics and consumables come from BD-Falcon (France) and Greiner (France). Human recombinant ⁇ NGF is provided by Scil Proteins (Germany), human recombinant proNGF (proNGF N.C.) recombinant by Alomone Labs (Israel) and the pharmacological inhibitor K252a is obtained from Calbiochem (UK). The antibodies come from Cell Signaling Technology (France) except the anti-HA (Covance, France) and anti-sortiline (R & D Systems, France) antibodies. Cell cultures were provided by Sigma (France), cell culture media were obtained from Invitrogen (France). Cell culture plastics and consumables come from BD-Falcon (France) and Greiner (France). Human recombinant ⁇ NGF is provided by Scil Proteins (Germany), human recombinant proNGF (proNGF N
  • the CAL 27, CAL 33, SQ20B and FaDu cell lines were provided by the Oscar Lambret Center (Lille), and the DU145 and PC3 (prostate cancer lines), and MDA cell lines.
  • -MB-231 (breast cancer lines) are from the American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA).
  • MDA-MB-231 HA-TrkA The breast cancer line (MDA-MB-231) overexpressing HA-TrkA (hereinafter referred to as "MDA-MB-231 HA-TrkA") was established in the laboratory, by stable overexpression of the TrkA receptor (variant 1 NM 001012331.1) which shows a silent mutation at position 799, CAA gives CAG (Thr ⁇ Gln), and a sequence conflict at position 263 (Val ⁇ Leu) (listed in Swiss Prot) with a HA tag (Hemagglutinin: Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala) in the N-terminal position.
  • siR A sequences used against EphA2 (siEphA2) at 100 pmol for each transfection, and against TrkA (pool of 3 siTrkA 1, 2 and 3) are presented in Table 1.
  • the siRNA transfections were performed using INTERFERin. TM according to the manufacturer's instructions (POL409-10, Polyplus transfection, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France).
  • the cells were lysed (lysis buffer: 40 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0, 120 mM NaCl, 10 mM NaPP1, 50 mM NaF, 1.5 mM Na3V04, 1% Triton X 100, 0.1% SDS, 1 mM PMSF, 10% glycerol and 1 / 100th of protease inhibitor cocktail (Sigma) (20 min, 4 ° C)). The lysates are recovered and clarified by centrifugation (12,000 g, 10 min, 4 ° C). The supernatant is then stored at -80 ° C until used.
  • lysis buffer 40 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0, 120 mM NaCl, 10 mM NaPP1, 50 mM NaF, 1.5 mM Na3V04, 1% Triton X 100, 0.1% SDS, 1 mM PMSF, 10% glycerol and 1 / 100th of
  • the protein extracts are diluted to 2 ⁇ g. ⁇ L -1 in Laemmli IX buffer (7 min, 100 ° C.) and then deposited and separated on SDS-PAGE (3.6% acrylamide concentration gel and separation gel 7, 5% to 10% acrylamide (thickness 1 mm), 180 V, 10 min then 200 V constant until the exit of the migration front).
  • Proteins separated in SDS-PAGE are transferred by semi-dry transfer method (buffer: 48 mM Tris base, 39 mM glycine, 1.64 mM SDS, 20% methanol (v / v), 14 V, 15 min per gel) or liquid (buffer: 25 mM Tris base and 192 mM glycine, 15% methanol (v / v), 100 V, 30 min) on nitrocellulose membranes (0.45 ⁇ , Whatman, Germany) or PVDF (0.45 ⁇ , Immobilon P, Millipore, France ).
  • the PVDF membrane is "activated" beforehand (methanol, 10 min, 20 ° C.).
  • the membranes are then saturated (TBS-T, 5% BSA, 1 h, 20 ° C.) and then incubated (16 h, 4 ° C.) with the primary antibody chosen.
  • the membranes are finally washed (TBS-T), incubated (1 h, 20 ° C) with a secondary antibody (diluted to 1/5 000 (anti-rabbit) or 1/10 000 (anti-mouse) in 5% Bovine Albumin Serum) coupled with HRP (Horse Radish Peroxidase), then revealed with the Super Signal® West Pico Kit (Pierce).
  • the membranes are placed in an image analyzer (LAS 4000, Fuji), connected to a computer that allows image generation (Image reader LAS 4000 software).
  • the antibody directed against EphA2 is sc-924 (Santa Cruz), the antibody directed against sortiline is BD Bioscience 612101, the antibody against TrkA is 14024 (Santa Cruz), the antibody directed against HA is MMS-101R (Covance), the antibody directed against Akt is Cell signaling 4691, the antibody directed against phospho-Akt (Ser 473) is Cell signaling 9271, the antibody directed against Src is Cell signaling 2109 (WB), l Antibody directed against PhosphoSrc (Tyr416) is Cell signaling 2105, the antibody directed against actin is Sigma A2066.
  • the beads (Protein G-agarose, Millipore) were washed twice (12000 g, 1 min, 4 ° C) and taken up in PBS IX (50%> (v / v)). Protein samples (1 mg) were pre-clarified (1 h, 4 ° C, on wheel (10 rpm)) with 100 ⁇ l of beads and 5 ⁇ g of isotype antibody (mouse IgG2b), centrifuged (12,000 g 2 min, 4 ° C), then the supernatant was incubated (2 h, 4 ° C, on a wheel (10 rpm)) with 5 ⁇ g of ⁇ -HA 12CA5 antibody (Roche).
  • the beads (100 ⁇ l, 50%) in PBS IX) were added directly to the antibody / protein complexes and then incubated (2 h, 4 ° C., on a wheel (10 rpm)).
  • the antibody / antigen / bead complexes were then centrifuged (12000 g, 5 min, 4 ° C), washed three times (lysis buffer, 4 ° C), and then dissociated by addition of 2X Laemmli buffer (25 mM Tris HCl, 0.8% SDS, 4% glycerol, 1% ⁇ -mercaptoethanol, pH 6.8) (7 min, 100 ° C).
  • the antibody directed against EphA2 is sc-924 (Santa Cruz)
  • the antibody against the sortilin is BD Bioscience 612101
  • the antibody directed against HA is Roche 11 666 606 001.
  • the cells (20,000 cells per well) were inoculated into Labtek® which had been treated beforehand with alcohol / hydrochloric acid (absolute ethanol + 2% HCl). The cells were then weaned (0.1% FCS, 1 hour, 37 ° C.) and then treated or not with proNGF N.C. (0.5 nM) or NGF (16 nM) for 5 min.
  • PLA probes oligo labeled anti-mouse or anti-rabbit probes "plus” and anti-rabbit or anti-goat "Less” (Olink Bioscience) diluted 1: 5 in a solution of 4%> BSA
  • the choice of PLA probes depends on the primary antibodies used After two 5-minute washes with TBS-T, the signal is detected by the kit Detection System Duolink® (O link Bioscience) according to the supplier's instructions.
  • the cells were also incubated with Hoechst 33258 (1 mM in PBS IX) and then the samples were mounted on slide with the fluorescence mounting medium (Dako).
  • the PLA images are obtained by means of a fluorescence microscope (100X immersion objective, excitation: 562 nm, emission: 624 nm, Eclipse Ti microscope, Nikon, France) then analyzed with the NIS-Elements BR software. from Nikon.
  • a red fluorescent dot reflects an interaction between the two proteins (less than 40 nm apart, quantitative method).
  • Labeling of microarrays is performed using the Brightfield PLA Kit (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's recommendations. The images were acquired using the Eclipse TiU microscope, Nikon (100X objective).
  • the antibody directed against EphA2 is AF-3035 (R & D Systems)
  • the antibody against the sortilin is AF 3154 (R & D Systems)
  • the antibody against TrkA is Alomone labs ANT-018.
  • the Boyden chambers (Transwell®, BD Bio sciences, France) were covered with a biological matrix (rat type I collagen diluted to 400 ⁇ g.mL-1 in EMEM-0 medium, 1% FCS, Millipore). . The cells were then seeded at 100,000 cells / well on the PET membranes (polyethylene terephthalate, 0: 10.5 mm, porosity: 8 ⁇ ) of the Boyden chambers and maintained in EMEM-0 medium. FCS. The cells were treated with K252a (10 nM) in the upper part of Transwell®, with or without NGF (16 nM) or proNGF NC (0.5 nM) in the lower part.
  • Non-invasive cells (upper side of the Transwell®) were removed by scraping.
  • the number of invasive cells was estimated after staining with Hoechst 33258 (1 mM, 30 min, 20 ° C) by counting their nuclei by fluorescence microscopy out of a total of 5 randomly selected fields (10X objective, excitation: 345 nm; emission: 478 nm; Eclipse Ti) thanks to the ImageJ software. Each experiment was performed in triplicate. Statistical analysis of the results was performed by ANOVA analysis of variance (Bonferroni post-test).
  • the gels were fixed (16 hr, 20 ° C) (25% ethanol (v / v) and 2% 85% H3PO4 (v / v)), washed three times (2% d 85% (v / v) H 2 PO 4, 20 min, 20 ° C) and pre-quenched in a 2% 85% (v / v) H 3 PO 4 solution, 1.1 M (NH 4) 2 SO 4, 17 % ethanol (30 min, 20 ° C). They were then stained in the same solution supplemented with 0.05 g of Coomassie blue G250 (48 h, 20 ° C., with stirring).
  • the spots of interest are excised, rinsed with ultrapure water and decolorized by successive baths of a solution of acetonitrile (ACN) / NH4HCO3 at 50 mM (50/50, v / v, 20 ° C., with stirring). After total decolorization, the spots are dehydrated (100% ACN, 3 ⁇ 10 min, 20 ° C.) and then rehydrated (100 mM NH 4 HCO 3, 10 min, 20 ° C.).
  • ACN acetonitrile
  • the gel pieces are washed successively in a solution of ACN / formic acid (45/10, v / v) (two washes) and then in a solution of ACN / formic acid (95/5, v / v).
  • the supernatants are collected, grouped with the previous one and the whole evaporated at Speed-Vac.
  • the nanoLC-nanoESI-MS / MS analyzes are performed on an ion trap (LCQ).
  • the samples are first desalted and then concentrated on a reverse phase precolumn Cl 8 (a length of 5 mm and an internal 0 of 0.3 mm, LC Packings Dionex) with a solvent A (H20 / ACN, 95/5, v / v; 0.1% formic acid), delivered by the Switchos® pumping system (LC Packings Dionex) at a flow rate of 10 ⁇ / min for 3 min.
  • the peptides are separated on a Cl 8 Pepmap column (15 cm x 75 ⁇ of internal 0, LC Packings Dionex). A constant flow rate is applied (200 nL / min).
  • the peptides are eluted in 45 min using a linear gradient of 5 to 70% of a solvent B (H 2 O / ACN, 20/80, v / v, 0.08%) of formic acid).
  • a voltage of 1.5 kV is applied at the level of the nano-electrospray needle (external 0: 360 ⁇ , internal 0: 20 ⁇ , internal 0 of the tip of the needle: 10 ⁇ , covered with a conducting alloy , New Objective, Wil, Switzerland).
  • the analyzes are performed in positive mode.
  • Data acquisition is performed in automatic peptide sequencing mode consisting of alternating MS spectrum between m / z 500-2000 and MS / MS spectrum of the most intense ion of the previous MS spectrum.
  • MS / MS spectra are acquired with an isolation window of the parent ion of 2 uma and with a collision energy of 35%.
  • MS / MS.raw files are converted to .dta files using Bioworks 3.1 (Thermo Electron) software.
  • the .dta files are then compiled using the merge.bat software downloadable via the Mascot Daemon software version 2.1.6 (www.matrixscience.com) for the interrogation of databases on SwissProt 51.4 (252616 sequences).
  • the search parameters are as follows: Homo sapiens (taxonomy), a site authorized "missed cleavage" by trypsin, carbamidomethylation, oxidation of methionines and phosphorylation of residues Ser, Thr and Tyr (variable modifications), 2 Da (mass tolerance peptides) and 0.8 Da (mass tolerance of MS / MS).
  • the Robust Multichip Average (RMA) standardization method 48 was used with the non-parametric quantile algorithm.
  • RMA Robust Multichip Average
  • the expression levels of NTRK1 have been standardized within each data set taking into account the luminal population A, the molecular subtype of tumors being defined by PAM50 "Predictor" (49).
  • PAM50 "Predictor"
  • the over-regulation of NTR 1 is defined by the expression increase above the median level.
  • NRTK1 The correlations between the expression of NRTK1 and the histoclinical variables including the age of the patients at the time of diagnosis ( ⁇ 50 years vs> 50), the pathological state of the axillary lymph node (pN: negative vs positive), the tumor size (pT: pT1 vs pT2-3), stage (I vs 2-3), immunocyto chemistry (IHC) estrogen receptor alpha (ER), progesterone receptor (PR), status of ERBB2 receptor (positive vs negative) for each patient, and non-metastatic lifespan (MFS) for patients with no metastasis at diagnosis were sought. Survival without metastasis is calculated from the date of diagnosis to the date of the first discovered metastasis.
  • IHC immunocyto chemistry
  • ER estrogen receptor alpha
  • PR progesterone receptor
  • MFS non-metastatic lifespan
  • NGF and proNGF are observed to increase the cellular invasion of cancer lines CAL33, DU145, PC3 and MDA-MB-231.
  • the tumor cells FaDu and CAL27 do not respond to any of the growth factors, whereas the cellular invasion of SQ20B is only induced during the treatment with NGF (FIG. 1).
  • EphA2 The involvement of EphA2 in the pro-invasive effects of proNGF was assessed using a Boyden chamber on EphA2 overexpressing cells (DU145, PC3 and MDA-MB-231). As shown in Figure 3, siEphA2 abolished proNGF-induced invasion in DU145, PC3 and MDA-MB-231 cells. These results indicate that EphA2 is involved in proNGF-induced invasion of cells overexpressing EphA2.
  • DNA microarrays correlates the expression of the sortilin, TrkA and EphA2 receptors with a poor prognosis in breast cancer ( Figure 4 A). . Indeed, the expression of the three receptors induces a significant decrease in survival without metastasis in patients.
  • the intensity of the PLA marking was scored as no signal, very weak / weak and medium / strong.
  • the results are presented in the form of a Kaplan Meier graph. The results show that the association of TrkA and EphA2 receptors revealed by the Duolink® technique is correlated with a significant decrease (Log Rank Test, p ⁇ 0.0001) in the overall survival of the patients. The detection of the TrkA / EphA2 complex is therefore correlated with a poor prognosis in breast cancer. Immunoprecipitation tests
  • TrkA The formation of a complex between TrkA, EphA2 and sortilin was analyzed by immunoprecipitation in MD A-MB-231 HA-TrkA cells as well as PLA (Proximity Ligation Assay) assays.
  • the association of the 3 receptors in the complex was first demonstrated in mass spectrometry, the proteins immunoprecipitated by an antibody directed against HA-TrkA were identified (FIG. 5).
  • the mass spectrometry analysis provides an irrefutable way of demonstrating the presence, in the complex formed by the action of proNGF, of TrkA, of sortilin and of EphA2.
  • PLA assays performed on MD A-MB-231 cells were performed to confirm the interaction between sorbitin and HA-TrkA and between HA-TrkA and EphA2 in MD A-MB-231 HA-TrkA cells (results not shown). In the absence of proNGF, no PLA signal was visualized suggesting that these receptors do not form a preexisting complex.
  • the PLA tests show an interaction between the sortiline and TrkA and between EphA2 and TrkA, which indicates that TrkA interacts directly with the sortiline and EphA2, and this at a distance of less than 40nm (results not shown) .
  • NGF In comparison to proNGF, NGF induces no PLA signal in MDA-MB-231 cells, revealing the absence of receptor complex (results not shown).
  • TrkA expression was inhibited by interfering RNAs (siTrkA) ( Figure 7A). TrkA and EphA2 are normally co-immunoprecipitated with the sortiline after 5 min of proNGF treatment. In contrast, cells treated with anti-TrkA interfering RNA (siTrkA) do not show an association between EphA2 and TrkA with the sortilin, indicating that the sortiline does not form a complex with EphA2 in the absence of TrkA.
  • TrkA, sortiline and EphA2 do not form a preexisting complex
  • TrkA / EphA2 complex needs, as a prerequisite, the proNGF / sortiline combination
  • TrkA is necessary for the formation of this receptor complex, regardless of its phosphorylation state
  • proNGF induces the association between sortilin and TrkA, subsequently inducing EphA2 recruitment on the sorcine / TrkA complex.
  • TrkA and EphA2 are involved differently in the activation of proNGF-induced Akt and Src proteins.
  • Akt and Src proteins are both involved in the pro-invasive effect of proNGF.
  • TrkA inhibitor K252a
  • siEphA2 an anti-EphA2 siR A
  • SKI-1 an inhibitor of PI3-K
  • EphA2 The involvement of EphA2 in Akt and Src activation was determined by transient cell transfection with anti-EphA2 interfering RNA ( Figure 8C). Inhibition of EphA2 decreases the phosphorylation of Src induced by proNGF but not that of Akt.
  • NGF increases phosphorylation of Akt and Src while TrkA inhibitor K252a inhibits this activation (Figure 8D). This result was confirmed by the use of a TrkA Kinase-Dead mutant (FIG. 8E). Activations of Src and Akt by NGF are not interconnected as for proNGF ( Figure 8D). Unlike proNGF, the effects of NGF on Src and Akt are independent of EphA2 ( Figure 8F). Inhibition of EphA2 only reduces basal activation of phospho-Akt and phospho-Src but not NGF-induced phosphorylation. Indeed, NGF is able to increase phosphorylation of Akt and Src even in cells where EphA2 expression is inhibited. These results show that activation of Akt and Src are downstream of TrkA in the presence of NGF.
  • proNGF-induced Src activation requires both TrkA and EphA2 but is independent of TrkA phosphorylation.
  • proNGF-induced Akt activation is dependent on phosphorylation of TrkA but not EphA2.
  • NGF signaling requires only TrkA to activate Akt and Src without any involvement of EphA2.
  • Example 3 The TrkA / EphA2 complex is involved in the development and aggressiveness of tumors in vivo
  • Example 1 Tumor line xenograft assays on immuno-deficient mice were performed using MDA-MB-231 cells.
  • mice used are SCID females of six weeks old.
  • the MDA-MB-231 HA-TrkA cells (3 ⁇ 10 6 ) are injected subcutaneously into the flanks of the mice.
  • the mice are then randomly distributed in the experimental groups (7 mice in the control group and 6 in the others). 14 days after inoculation of the cells, the animals are treated three times with an interval of 3 days between each injection.
  • CEP-701 (Calbiochem) is dissolved in a mixture (40% polyethylene glycol 1000, 10% povidone C30 and 2% benzyl alcohol in distilled water) and injected intraperitoneally (10 mg / kg).
  • EphA2 siR A 7.5 micro g / mouse
  • in vivo jetPEI® Polyplus transfection
  • the tumor volume is measured according to the following formula: ⁇ / 6 x length x width x (width + length) / 2.
  • Statistical analyzes are performed using the Mann and Whitney test and the GraphPad Prism 5.01 software.
  • mice used are SCID females of six weeks old.
  • the MDA-MB-231 HA-TrkA cells (3 ⁇ 10 6 ) are injected subcutaneously into the flanks of the mice.
  • the mice are then randomly distributed in the experimental groups (10 mice / group). 14 days after inoculation of the cells, the animals are treated five times with an interval of 3 days between each injection.
  • the siRNAs EphA2 and TrkA (7.5 micro g / mouse) are injected near the tumor mass using in vivo jetPEI® (Polyplus transfection) according to the manufacturer's recommendations.
  • the tumor volume is measured according to the following formula: ⁇ / 6 x length x width x (width + length) / 2. Survival is represented as a Kaplan Meier graph.
  • TrkA inhibitor has previously been shown to decrease the growth of xenografted tumors with MDA-MB-231 cells overexpressing TrkA (34).
  • K252a analogue CEP-701 at 10mg / kg was used to ensure a moderate decrease in tumor growth.
  • tumor volume is slightly but significantly reduced by CEP-701 treatment compared to control.
  • Targeting EpbA2 also greatly reduces the growth of xenografted tumors.
  • the combined treatment CEP-701 / siEphA2 induces a significant decrease in tumor burden in comparison with CEP-701 alone or siEphA2 alone.
  • Example 4 A Combination Therapy of a TrkA Inhibitor (Lestaurtinib) and an EphA2 Inhibitor (EphrinAl-Fc) Decreases the Invasion of Breast Cancer Cells
  • the invasion test is performed on MDA-MB-231 cells. Unstimulated proNGF cells serve as control and determine a basal invasion of 100% (white bar in Figure 10). For treatments, the following concentrations are applied: 0.5 nM proNGF NC, 10 nM lestaurtinib, Ephrin Al-Fc (1 microg / ml), DMSO 1/000 th vol / vol for unstimulated conditions (Non stim). For statistics, the error bars represent the standard deviation. * p ⁇ 0.001 for the combination of ettaurtinib + Ephrin Al-Fc treatment vs the unstimulated treatments alone (lestaurtinib or Ephrin Al-Fc).
  • Example 5 The TrkA / EphA2 complex is also found in several types of tumors Unless otherwise indicated, the products, reagents and cell cultures are the same as those of Example 1.
  • T4-stage oral tumor samples (NO, MO) with bone infiltration (obtained from the pathology department of the University Hospital of Lille) are deparaffected by ClaRal (xylene derivative) baths (1 x 12 h and 1 x 5 h). The sections are then rehydrated by successive baths: ClaRal / 100% ethanol (1: 1) (1 x 5 min), 100% ethanol (2 x 5 min), 96% ethanol (2 x 5 min), ethanol 70% (2 x 5 min), distilled H 2 O (1 x 5 min).
  • Blocking of endogenous peroxidases is achieved by a solution of hydrogen peroxide supplied in the Duolink In Situ® Brightfield Reagent Detection Kit (DUO92012, Sigma-Aldrich) for 10 min at 20 ° C. The sections were then washed with TBS (20 mM Tris base, 137 mM NaCl) (2 x 5 min) and then incubated with a blocking solution provided in the Duolink® kit (Blocking solution, 1h, 20 ° C). The primary anti-TrkA antibodies diluted 1/25 (ANT-018; Alomone Labs) and anti-EphA2 diluted 1: 50 (AF3035; RD Systems) were then incubated in the blocking solution at 4 ° C overnight.
  • the ligation step is carried out according to the supplier's recommendations. After two 5 min washings with solution A, amplification of the probes is carried out with a polymerase (1 / 80th in amplification buffer IX, 2h 37 ° C.). Signal detection and counterstaining are performed according to the protocol established by the supplier. The sections are then washed three times for 5 min in distilled water and then dehydrated by successive baths of 70% ethanol (2 ⁇ 5 min), ethanol 96% (2 ⁇ 5 min), ethanol 100 ml. % (2 x 5 min), ClaRal / ethanol 100% (1: 1) (1 x 5 min) and ClaRal (2 x 10 min).
  • TrkA and EphA2 were detected by immunohistochemical staining and the TrkA / Epha2 combination was detected by PLA (Duolink®) in a tumor of the oral cavity. While the adjacent epithelium and tumor masses show TrkA and EphA2 labeling, only the tumor mass is positive (punctiform labeling) for PLA (results not shown). This highlights a similar mechanism of action of TrkA and EphA2 in tumors of the oral cavity as in breast tumors.
  • TrkA and EphA2 act on the invasion and growth of cancer cells, justifying the interest of a combination between a TrkA inhibitor and an inhibitor. EphA2 to fight against these forms of solid cancer.
  • Trk kinase inhibitors Tao Wang, Dingwei Yu & Michelle L Lamb, 2009 Informa UK Ltd ISSN 1354-3776 Cancer Discovery, AstraZeneca R & D Boston, Waltham, Massachusetts, USA;
  • TrkA tyrosine kinase activity J Med Chem 2005; 48: 3776-83.
  • Tyrosine phosphorylation profiling reveals the signaling network characteristics of Basai breast cancer cells. Cancer Res. 2010; 70: 9391-401.

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Abstract

L'invention concerne un inhibiteur de EphA2 pour son utilisation dans le traitement de cancer solide traité par un inhibiteur de TrkA, et un inhibiteur de TrkA pour son utilisation dans le traitement de cancer solide traité par un inhibiteur de EpbA2. L'invention concerne également une méthode de pronostic de la survie d'un patient souffrant d'un cancer solide comprenant une étape de détection de l'expression de TrkA et de EphA2 au sein d'un échantillon biologique du patient, la co-expression de TrkA et de EphA2 étant associée à un mauvais pronostic de survie du patient.

Description

Utilisation conjointe d'un inhibiteur de TrkA et d'un inhibiteur de EphA2 pour une utilisation dans le traitement de cancers solides et méthode de pronostic de la survie de patient souffrant d'un cancer solide L'invention concerne l'utilisation conjointe d'un inhibiteur de TrkA et d'un inhibiteur de EphA2 pour une utilisation dans le traitement de cancers solides. L'invention concerne également une méthode de pronostic de la survie de patient souffrant d'un cancer solide.
La progression d'un cancer implique de nombreuses étapes, dépendant notamment de la taille de la tumeur primaire mais également de la capacité des cellules tumorales à métastaser dans des organes distants de la tumeur primaire. De multiples raisons peuvent permettre d'expliquer le nombre important d'échecs dans le traitement thérapeutique des cancers. Dans de nombreux cas, l'échec thérapeutique est associé à l'activation de signaux de transduction sous les récepteurs à activité tyrosine kinase (1).
Les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), également appelés récepteurs des facteurs de croissance, constituent une sous-famille des protéines kinase, agissant spécifiquement sur les résidus tyrosine de protéines. Ces glycoprotéines transmembranaires sont composées d'un domaine extracellulaire très variable capable de fixer le ligand, d'un domaine transmembranaire permettant l'ancrage dans la membrane cellulaire et d'un domaine intracellulaire (cytoplasmique) qui renferme l'activité tyrosine kinase et permet la transduction du signal au sein de la cellule. Ces RTK peuvent être classés en plusieurs sous- classes selon les caractéristiques de la région extracellulaire des récepteurs tyrosine kinases.
Ainsi, l'émergence des thérapies anti-tumorales ciblant les facteurs de croissance, leurs récepteurs (récepteurs à activité tyrosine kinase), ou les effecteurs de leur signalisation a permis le développement de médicaments anticancéreux.
Dans ce contexte, de nombreuses études ont étudié le rôle du Nerve Growth Factor (NGF) dans différents types de cancer, notamment dans le cancer du sein. Le NGF est le membre prototypique de la famille des neurotrophines qui agit via les récepteurs TrkA (Tropomyosin receptor kinase A) et p75NTR (p75 Neurotrophin Receptor). Le NGF a été démontré comme jouant un rôle dans les cellules non-neuronales, en particulier dans plusieurs types de cellules cancéreuses. Par exemple, il a été mis en évidence que le NGF favoriserait le développement tumoral dans des modèles précliniques de souris (2). Des études plus récentes ont permis de décrire que le précurseur du NGF, le proNGF, est également exprimé, de façon spécifique, dans différents types de cancer, en particulier le cancer du sein (voir par exemple la demande US 2009068200 Al), et que le récepteur TrkA n'est pas seulement activé par le NGF mais également par son précurseur, le proNGF. Il a en outre été démontré que l'expression du proNGF dans les tumeurs mammaires est corrélée à l'envahissement ganglionnaire. De plus, le proNGF augmenterait les capacités migratoires et invasives des cellules cancéreuses de sein in vitro (3).
Il a dernièrement été mis en évidence par des chercheurs que l'action pro-invasive du proNGF dans les cellules tumorales mammaires est liée à sa fixation sur la sortiline, un récepteur transmembranaire à domaine VpslOp, et à l'activation du récepteur TrkA. La phosphorylation de TrkA induirait les protéines Src et Akt, jouant un rôle dans le développement cancéreux (3).
Les recherches menées jusqu'à présent suggèrent donc que l'axe proNGF/TrkA intervient de manière importante dans la progression tumorale de cancers solides (carcinomes ou sarcomes), notamment du cancer du sein.
Toutefois, il a été mis en évidence que des traitements utilisant des inhibiteurs de TrkA, comme par exemple le lestaurtinib et ses dérivés, n'ont qu'une efficacité limitée comme le montrent les études cliniques réalisées (4). Les traitements utilisant des inhibiteurs de TrkA ne sont donc pas utilisés pour les tumeurs solides.
Il existe donc toujours un besoin de nouveaux traitements de cancers solides, notamment du cancer du sein.
Or, les inventeurs ont découvert, après de nombreuses recherches, que l'utilisation d'une part, d'un inhibiteur de TrkA, et d'autre part, d'un inhibiteur de EpbA2, permettait de traiter de manière efficace certaines formes de cancers, en particulier les cancers solides et tout particulièrement le cancer du sein. En effet, les inventeurs ont réussi à mettre en évidence, de manière très surprenante, une plateforme de signalisation dans les cellules cancéreuses du sein, à l'origine d'une résistance aux inhibiteurs de tyrosine kinase TrkA communément utilisés.
Ainsi, il a été démontré que, dans les cellules cancéreuses issues de cancers solides, notamment dans les cellules cancéreuses du sein, le récepteur TrkA s'associe directement au récepteur EphA2 sous l'effet de la fixation du proNGF sur la sortiline et que le complexe TrkA/EpfiA2 est à l'origine de l'activation d'une signalisation, indépendante de la phosphorylation de TrkA jusqu'ici connue et ciblée par le lestaurtinib. La détection concomitante de TrkA et Eph2 confirme également l'importance de la signalisation induite par ce complexe. En effet la présence du complexe est associée avec une diminution significative de la survie globale des patients. L'invention concerne donc un inhibiteur de EpbA2 pour son utilisation dans le traitement de cancer solide traité par un inhibiteur de TrkA.
L'invention concerne également un inhibiteur de TrkA pour son utilisation dans le traitement de cancer solide traité par un inhibiteur de EpbA2.
L'utilisation des deux inhibiteurs permet d'inhiber, de manière efficace et synergique, des voies de signalisation distinctes induites sous l'effet du proNGF.
L'inhibiteur de TrkA permet d'inhiber les voies de signalisation, dépendantes de la phosphorylation de TrkA, qui étaient connues jusqu'à présent. Comme précédemment mentionné, il a en effet déjà été démontré que le proNGF, en se fixant sur la sortiline, provoque l'activation du récepteur TrkA, induisant à son tour des voies de signalisations dépendantes de sa phosphorylation. Il a ici été confirmé par les inventeurs que la phosphorylation de TrkA permet notamment l'activation de la protéine Akt, intervenant de manière importante dans l'invasion des cellules cancéreuses.
Comme évoqué précédemment, TrkA fait partie des kinases Trk, sous-famille des RTK. Les kinases Trk comprennent trois isoformes présentant une forte homologie : TrkA, TrkB et TrkC, et sont activées par des facteurs de croissance, les neurotrophines. TrkA est habituellement activé par le NGF, mais également par son précurseur, le proNGF.
Selon l'invention, on entend par « inhibiteur de TrkA», un antagoniste de TrkA, un inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. De préférence, un inhibiteur de TrkA se réfère à un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou un antagoniste de TrkA. Selon un premier mode de réalisation particulier dans lequel l'inhibiteur de TrkA est un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA, ledit inhibiteur est une petite molécule organique à faible poids moléculaire (naturelle ou non).
Le terme « petite molécule organique » se rapporte à une molécule (naturelle ou non) d'une taille comparable aux molécules organiques généralement utilisées dans le domaine pharmaceutique. Ce terme exclut les macromolécules biologiques (par exemple, les protéines, acides nucléiques etc.). De préférence, une petite molécule organique selon l'invention a une taille inférieure à environ 10000 Da, de préférence inférieure à 5000 Da, de préférence encore inférieure à 2000 Da et de préférence encore inférieure à environ 1000 Da. De tels inhibiteurs de TrkA sont bien connus de l'homme du métier (voir par exemple,
Wang et al. (5), ou WO 2008/052062 dont le contenu est incorporé par référence), ou peuvent facilement être générés par l'homme du métier.
De manière préférentielle, l'inhibiteur de TrkA selon l'invention est choisi entre K252a (voir par exemple Lelkes et al. (6)) et CEP-701 (voir par exemple Ruggeri B et al. (7)).
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé alcyne (voir par exemple Wang et al. (5), WO2006044823, Cee VJ et al. (8)). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé de pyrazole
(voir par exemple Wang et al. (5)), et notamment des dérivés pyrazolopyrimidine (voir par exemple WO2005103010, WO2006082392, WO20061 17560), ou est un dérivé de purine (voir par exemple WO2006087530, WO2006087538, Hudkins RL et al. (9)). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé de pyrazole urée (voir par exemple Wang et al. (5), WO2007064872, WO2007059202, WO2005110994).
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé aminothiazole (voir par exemple Wang et al. (5), Das J et al. (10); WO200250071 ; Kim SH et al. (11))
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé pyrrolotriazine (voir par exemple Wang et al. (5), WO2007061882; Ghose AK et al. (12), WO2008057994).
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé indolocarbazole (voir par exemple Wang et al. (5)) comme le CEP-701 ou lestaurtinib (voir par exemple Ruggeri B et al. (7)) ou des analogues (3 'S)-epi-K-252a (voir par exemple, Gingrich DE et al. (13)) ou des 7-oxo-indénopyrrolocarbazoles substitués en position 13 (voir par exemple Tripathy R et al. (14)).
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé cyclique pyrazolyle condensé (voir par exemple Wang et al. (5), JP2003231687).
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé tétrahydropyrrolopyrazole (voir par exemple Wang et al. (5)), comprenant notamment un 1,4,5, 6-tetrahydropyrrolo[3,4-c] pyrazole bicyclique comme le PHA-739358 (voir par exemple, WO200505427 ; Fancelli D et al. (17)).
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé imidazopyridazine (voir par exemple Wang et al. (5), WO200852734).
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé isothiazole (voir par exemple Wang et al. (5), WO2004011461 ; Lippa B et al. (18)).
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé pyrrolopyrimidine (voir par exemple Wang et al. (5)), comme le CE-245677 (voir par exemple, WO2004056830, WO2005116035). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé azaindole (voir par exemple Wang et al. (5), WO2008080001, WO2008063888). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est le GNF-5837 (voir par exemple Albaugh et al. (19)).
Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est le (2E)-3-[3,5- bis(l,l-diméthyléthyle)-4-hydroxyphényle]-2-cyano-2-propènethioamide, connu sous le nom AG 789.
Selon un autre mode de réalisation, ledit inhibiteur selon l'invention est un antagoniste de TrkA. Un antagoniste est typiquement toute substance, composé simple ou complexe, d'origine naturelle ou synthétique qui s'oppose à l'activation du récepteur TrkA et qui s'oppose notamment à l'induction de la réponse biologique que l'on obtient avec un ligand naturel de ce récepteur. En général, un tel antagoniste altère la signalisation ou le recrutement des partenaires de TrkA dans la cellule.
Selon un exemple, l'antagoniste de TrkA est un anticorps anti-TrkA qui neutralise TrkA ou un fragment anti-TrkA de celui-ci qui neutralise TrkA.
Des anticorps anti-TrkA sont connus de l'homme du métier. On peut par exemple se référer à la demande WO 2013183032 ou à la demande WO 2009098238A. Des anticorps dirigés contre TrkA peuvent être produits selon des méthodes connues de l'homme du métier, notamment en administrant un antigène ou un épitope à un animal hôte choisi, par exemple un porc, une vache, un cheval, un lapin, une chèvre, un mouton ou encore une souris. Différents adjuvants connus dans l'état de la technique peuvent être utilisés pour améliorer la production de l'anticorps. Bien que l'anticorps selon l'invention puisse être un anticorps polyclonal, un anticorps monoclonal est préféré. Des anticorps monoclonaux contre TrkA peuvent être préparés et isolés selon n'importe quelle méthode appropriée, par exemple selon la technique de l'hybridome initialement décrite par Kohler et Milstein (1975) (20); la technique de l'hybridome EBV (Cole et al. 1985) (21), etc. De manière alternative, des méthodes décrites pour la production d'anticorps à une seule chaîne (voir par exemple le brevet US 4, 946, 778) peuvent être adaptées pour produire des anticorps à une seule chaîne anti-TrkA.
Des antagonistes pouvant être utilisés selon l'invention incluent également les fragments d'anticorps, par exemple mais de manière non limitative, les fragments F(ab')2, pouvant être générés par digestion avec de la pepsine d'une immunoglobuline, les fragments Fab pouvant être générés par réduction des ponts disulfures des fragments F(ab')2, les fragments scFv. De manière alternative, des banques d'expression Fab et/ou scFv peuvent être produites pour permettre une identification rapide des fragments ayant la spécificité souhaitée pour TrkA.
Des anticorps anti-TrkA humanisés et des fragments d'anticorps peuvent également être préparés selon des techniques connues de l'homme du métier. Un « anticorps humanisé » se rapporte à une immunoglobuline humaine (anticorps receveur) dans lequel les résidus d'une région hypervariable (CDRs) sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce non-humaine (anticorps donneur) comme une souris, un rat, un lapin etc, qui a la spécificité, l'affinité et la capacité désirée. Selon certains exemples, les résidus FR de l'immunoglobuline humaine sont remplacés par les résidus non-humains correspondants. En outre, des anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus non trouvés dans les anticorps receveurs ou donneurs. Ces modifications sont faites pour améliorer les performances de l'anticorps. L'anticorps humanisé comprendra éventuellement au moins une portion d'une région constante d'une immunoglobuline (Fc), typiquement celle d'une immunoglobuline humaine. Des méthodes pour produire des anticorps humanisés sont décrites par exemple par Winter (brevet US 5,225,539) et Boss (Celltech, brevet US 4,816,397).
Pour cette invention, des anticorps neutralisants de TrkA sont sélectionnés.
Dans un autre mode de réalisation, l'antagoniste de TrkA est choisi parmi les aptamères. Les aptamères sont une classe de molécules qui représentent une alternative aux anticorps en terme de reconnaissance moléculaire. Les aptamères sont des oligonucléotides ou des séquences oligopeptidiques ayant la capacité de reconnaître virtuellement toute classe de molécules cibles avec une haute affinité et spécificité. De tels ligands peuvent être isolés par exemple via un système SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) d'une bibliothèque de séquences randomisées, comme décrit par Tuerk C. and Gold L. (22). La bibliothèque de séquences randomisées peut être obtenue par synthèse chimique combinatoire d'ADN. Dans cette bibliothèque, chaque membre est un oligomère linéaire, éventuellement modifié chimiquement, de séquence unique. Pour cette invention, des aptamères neutralisants de TrkA sont sélectionnés.
Selon un autre exemple, l'antagoniste de TrkA est un ligand naturel de TrkA ayant été modifié de manière à empêcher la fixation d'un ligand naturel de TrkA. Des ligands naturels de TrkA sont par exemple le Nerve Growth Factor (NGF), son précurseur (proNGF), et la neurotrophine 3 (NT3) (23). L'homme du métier sait comment modifier des ligands naturels dudit récepteur de manière à produire des molécules antagonistes.
Bien que le mode de réalisation selon lequel l'inhibiteur de TrkA est un antagoniste de TrkA soit préféré, un autre mode de réalisation selon l'invention se rapporte à un inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA (i.e. du gène du récepteur TrkA).
De petits ARN interférents (siRNA pour « Small inhibitory RNA") peuvent être utilisés selon l'invention comme inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur TrkA. L'expression du gène du récepteur TrkA peut être réduite en mettant en contact un sujet ou une cellule avec des petits fragments d'ARN à double brin (dsRNA), ou un vecteur ou une construction génétique induisant la production de petits fragments d'ARN à double brin, de telle façon que l'expression du gène du récepteur TrkA soit spécifiquement inhibée (i.e. interférence par ARN ou RNAi). Des méthodes pour sélectionner un dsRNA ou un vecteur codant pour dsRNA sont connues dans l'état de la technique pour les gènes dont la séquence est connue (voir par exemple les demandes WO 01/36646, et WO 01/68836).
Des ribozymes peuvent également être utilisés selon l'invention comme inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur TrkA. Les ribozymes sont des molécules d'ARN enzymatique capables de catalyser le clivage spécifique de l'ARN. Le mécanisme d'action des ribozymes implique l'hybridation de séquence spécifique de la molécule ribozyme à l'ARN cible complémentaire, suivie par un clivage endonucléolytique. Les ribozymes à motif en épingle ou en marteau qui catalysent spécifiquement et efficacement le clivage endonucléolytique des séquences ARNm du récepteur TrkA peuvent donc être utilisés selon l'invention. Les sites spécifiques de clivage dans tout ARN cible peuvent être initialement identifiés en scannant la molécule cible pour les sites de clivage, qui comprennent généralement les séquences suivantes, GUA, GUU et GUC. Une fois identifiés, de courtes séquences d'AR ayant entre 15 et 20 ribonucléotides correspondant à la région du gène cible contenant le site de clivage peuvent être évaluées pour prédire les caractéristiques structurales, comme la structure secondaire, qui peuvent rendre la séquence oligonucléotidique non appropriée. Le caractère approprié de la cible peut être aussi évaluée en testant son accessibilité à l'hybridation avec des oligonucléotides complémentaires en utilisant, par exemple, des techniques de protection ribonucléase.
Les oligonucléotides anti-sens siR A et les ribozymes pouvant être utilisés en tant qu'inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur TrkA peuvent être préparés selon des méthodes connues. Des méthodes de synthèse chimique peuvent être utilisées comme par exemple, la synthèse chimique en phase solide phosphoramadite. De manière alternative, des molécules d'ARN anti-sens peuvent être générées par transcription in vitro ou in vivo des séquences ADN codant la molécule d'ARN. De telles séquences d'ADN peuvent être incorporées dans une large variété de vecteurs qui incorporent des promoteurs d'ARN polymérase appropriés comme les promoteurs polymérase T7 ou SP6. Des modifications peuvent être introduites dans les oligonucléotides selon l'invention afin d'augmenter leur stabilité intracellulaire et leur demi-vie. Des modifications pouvant être effectuées incluent, mais ne sont pas limitées à, l'addition de régions flanquantes de ribonucléotides ou désoxyribonucléotide à l'extrémité 5' et/ou 3' de la molécule, ou l'utilisation de phosphorothiorate ou de 2'-0-méthyle plutôt que des liaisons phosphodiestérases dans le squelette oligonucléotidique. Des siRNA et ribozymes de l'invention peuvent être délivrés in vivo seuls ou en association avec un vecteur. On entend par « vecteur » tout véhicule capable de faciliter le transfert du siRNA ou du ribozyme aux cellules, et de préférence les cellules exprimant le récepteur TrkA. De préférence, le vecteur transporte l'acide nucléique aux cellules avec une dégradation réduite par rapport à la dégradation qui résulterait en absence du vecteur. En général, les vecteurs pouvant être utilisés selon l'invention incluent, mais ne sont pas limités à, les plasmides, phagémides, virus, et autres véhicules dérivés de sources virales ou bactériennes et ayant été manipulés par insertion ou incorporation du siRNA ou des séquences d'acide nucléique du ribozyme. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier. Il est enfin possible d'utiliser comme inhibiteur de TrkA une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. Par « molécule adaptatrice de signalisation », on entend des molécules qui interagissent avec le récepteur TrkA par des domaines d'interaction pour enclencher la signalisation intracellulaire. Des molécules adaptatrices de signalisation du récepteur TrkA sont par exemple les protéines shc, FRS2, PLCgammal, Grb2. Ces inhibiteurs peuvent par exemple être de nature peptidique, généralement obtenus par la synthèse de tout ou partie d'une molécule de signalisation qui aurait un effet dominant négatif sur la liaison des adaptateurs cellulaires. Ces molécules peuvent aussi être des mimétiques organiques, i.e. analogues non peptidiques, dont la conformation permet de reconnaître la séquence du récepteur TrkA pour s'y fixer et empêcher la fixation par compétition du partenaire de signalisation (56). Ces inhibiteurs peuvent aussi, par leur liaison, empêcher l'activation du récepteur TrkA en inhibant les changements de conformation nécessaire à l'activation de TrkA (par exemple, par antagoniste allostérique comme le AR-786 développé par Array Biopharm). La synthèse et l'utilisation de tels peptides analogues et de leurs mimétiques organiques pour inhiber les signalisations intracellulaires sont connues par l'homme de métier (voir par exemple EP2060265 Bl).
L'utilisation seule d'un inhibiteur de TrkA dans le traitement de cancer reste d'une efficacité limitée en ce que des voies de signalisation indépendantes de la phosphorylation de TrkA interviennent également dans l'invasion des cellules cancéreuses. L'utilisation supplémentaire d'un inhibiteur de EpbA2 permet ainsi d'inhiber une voie de signalisation indépendante de la phosphorylation de TrkA.
Le récepteur 2 Ephrine de type A (EphA2) est un récepteur à activité tyrosine kinase de 135 kDa. Les éphrines du groupe A sont liées à la membrane de la cellule source par un glycosyl-phospatidylinositol, tandis que les éphrines du groupe B ont un domaine tr ansmembr anair e .
On entend par « inhibiteur de EphA2 », un antagoniste de EphA2, un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2, ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. De préférence, un inhibiteur de EpbA2 se réfère à un antagoniste de EphA2 ou un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2, de préférence encore un inhibiteur de EpbA2 se réfère à un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2. Dans le cadre de la présente invention, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de EphA2 n'est pas considéré comme un « inhibiteur de EphA2 ».
Selon un mode de réalisation particulier, ledit inhibiteur selon l'invention est un antagoniste de EphA2. Un antagoniste est typiquement toute substance, composé simple ou complexe, d'origine naturelle ou synthétique qui s'oppose à l'activation du récepteur EphA2. En général, un tel antagoniste altère la signalisation ou le recrutement des partenaires de EphA2 dans la cellule. Par exemple, l'antagoniste de EphA2 est un anticorps anti-EphA2 qui neutralise
EphA2 ou un fragment anti-EphA2 de celui-ci qui neutralise EphA2.
Des anticorps anti-EphA2 sont connus de l'homme du métier. On peut par exemple se référer à la demande WO2009028639, la demande WO0112840 ou à la demande WO2008010101.
Des anticorps dirigés contre EphA2 peuvent aussi être produits selon des méthodes connues de l'homme du métier. On peut ainsi se référer aux paragraphes précédents mentionnant de telles méthodes de production également applicables ici.
Bien que l'anticorps selon l'invention puisse être un anticorps polyclonal, un anticorps monoclonal est préféré. Des anticorps monoclonaux dirigés contre EphA2 peuvent être produits et isolés selon des méthodes connues de l'homme du métier. On peut ici aussi se référer aux paragraphes précédents mentionnant de telles méthodes de production également applicables ici.
Des antagonistes pouvant être utilisés selon l'invention incluent également les fragments d'anticorps, par exemple mais de manière non limitative, les fragments Fab, F(ab')2, scFv.
Des anticorps ou des fragments d'anticorps anti-EphA2 humanisés peuvent également être préparés selon des techniques connues de l'homme du métier. On peut ici aussi se référer aux paragraphes précédents mentionnant de telles méthodes de production, également applicables ici. Pour cette invention, des anticorps neutralisants de EphA2 sont sélectionnés.
Selon un autre exemple, l'antagoniste de EphA2 est choisi parmi les aptamères. Des aptamères peuvent être produits selon des méthodes connues de l'homme du métier. On peut ainsi se référer aux paragraphes précédents mentionnant de telles méthodes.
Pour cette invention, des aptamères neutralisants de EphA2 sont sélectionnés. Selon un autre exemple, l'antagoniste de EphA2 est un ligand naturel de EphA2 ayant été modifié de manière à empêcher la fixation d'un ligand naturel de EphA2. Un ligand naturel de EphA2 est ainsi l'éphrine Al . D'autres ligands naturels sont, avec des affinités plus faibles, les membres de la famille des éphrines A. L'homme du métier sait comment modifier des ligands naturels du récepteur de manière à produire des molécules antagonistes. Par exemple, il est possible d'utiliser un ligand naturel ou un fragment de ligand naturel, de préférence l'éphrin Al, couplé à la partie Fc d'un anticorps (aussi appelé éphrine Al-Fc) (55).
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit inhibiteur selon l'invention est un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2 (i.e. du gène du récepteur EphA2).
De petits ARN interférents (siRNA pour « Small inhibitory RNA") peuvent être utilisés selon l'invention comme inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur EphA2. L'expression du gène du récepteur EphA2 peut être réduite en mettant en contact un sujet ou une cellule avec des petits fragments dARN à double brin (dsRNA), ou un vecteur ou une construction génétique induisant la production de petits fragments d'ARN à double brin, de telle façon que l'expression du gène du récepteur EphA2 soit spécifiquement inhibée (i.e. interférence par ARN ou RNAi). Des méthodes pour sélectionner un dsRNA ou un vecteur codant pour dsRNA sont connues dans l'état de la technique. On peut se référer aux paragraphes précédents évoquant de telles méthodes. On peut également se référer à la publication Haifa Shen et al. (25).
Des ribozymes peuvent également être utilisés selon l'invention comme inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur EphA2. Les oligonucléotides anti-sens siR A et les ribozymes pouvant être utilisés en tant qu'inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur EphA2 peuvent être préparés et sélectionnés selon des méthodes connues. On peut se référer aux paragraphes précédents qui mentionnent de telles méthodes, également applicables ici.
Il est enfin possible d'utiliser comme inhibiteur de EphA2 une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. Par « molécule adaptatrice de signalisation », on entend des molécules qui interagissent avec les récepteurs par des domaines d'interaction pour enclencher la signalisation intracellulaire. Des molécules adaptatrices de signalisation du récepteur EphA2 sont par exemple Shc, Fakl, ephexin 4. Par exemple, ces inhibiteurs peuvent être de nature peptidique, généralement obtenus par la synthèse de tout ou partie d'une molécule de signalisation qui aurait un effet dominant négatif sur la liaison des adaptateurs cellulaires. Ces molécules peuvent aussi être des mimétiques organiques, i.e. analogues non peptidiques, dont la conformation permet de reconnaître la séquence du récepteur EphA2 pour s'y fixer et empêcher la fixation par compétition du partenaire de la signalisation. Ces inhibiteurs peuvent aussi par leur liaison empêcher l'activation du récepteur EphA2 en inhibant les changements de conformation nécessaires à l'activation de EphA2 (par exemple par antagoniste allostérique ALW-II-41-27 (26)). La synthèse et l'utilisation de tels peptides analogues et de leurs mimétiques organiques pour inhiber les signalisations intracellulaires sont connues par l'homme de métier (voir par exemple EP2060265 Bl).
Il est généralement connu que, dans les cellules normales épithéliales du sein, EphA2 est exprimée à la surface cellulaire et se lie à son ligand, ephrin-Al . L'interaction ligand/récepteur contribue à l'homéostasie tissulaire. La surexpression de EphA2 avait précédemment été reportée comme jouant un rôle déterminant dans les capacités invasives et oncogéniques des cellules cancéreuses de sein (27). Le récepteur EphA2 a été associé avec un phénotype de type basai et un comportement agressif dans les cellules tumorales (27,28).
Or, il a ici été mis en évidence par les inventeurs que le proNGF, en se fixant sur la sortiline, recrute TrkA mais également que TrkA s'associe directement avec EphA2. Le proNGF provoque donc l'association directe du complexe sortiline/TrkA et de EphA2. Comme mentionné précédemment, les inventeurs ont découvert que le complexe associant la sortiline, TrkA et EphA2 formé induit des voies de signalisation indépendantes de la phosphorylation de TrkA, comme par exemple l'activation de la protéine Src, intervenant elle aussi dans l'invasion des cellules cancéreuses. Contrairement à ce qui était précédemment imaginé, les inventeurs ont ainsi mis en évidence que Src n'est pas induite par la phosphorylation de TrkA mais par une signalisation indépendante de cette phosphorylation, nécessitant le recrutement de EphA2 sur le complexe sortiline/TrkA. L'inhibition de TrkA seul ne permettait donc pas d'inhiber efficacement cette protéine Src. Src est d'ailleurs une oncoprotéine dont l'activation dans les cellules cancéreuses est souvent associée à une résistance aux thérapies.
L'inhibition d'EphA2 permet donc, par exemple, d'inhiber l'activation de la protéine Src, ainsi que toutes les signalisations pro-tumorales induites par EphA2 comme par exemple les signalisations dépendantes de Ras et des MAP-kinases (29), de Vav2-RhoA (30), Stat 5 (31).
Ainsi, un traitement basé sur l'utilisation d'un inhibiteur de TrkA et d'un inhibiteur de EpbA2 permet d'agir, de manière synergique et efficace, contre le cancer en surmontant les phénomènes de résistance qui se mettaient en place avec un traitement basé sur un inhibiteur de TrkA seul, par exemple un traitement à base de lestaurtinib.
Par ailleurs, les récepteurs à activité tyrosine kinase sont ici activés sous l'effet du proNGF, c'est-à-dire un ligand des récepteurs à activité tyrosine kinase n'ayant pas subi de maturation. Il a en effet été mis en évidence par les inventeurs que ces voies de signalisation sont spécifiquement activées par le proNGF, le NGF activant lui les protéines Akt et Src de manière dépendante à la phosphorylation de TrkA, sans nécessiter la sortiline ou EphA2. Le proNGF n'agit donc pas de manière similaire au NGF, et induit l'invasion des cellules cancéreuses d'une manière bien spécifique. On entend par « traitement de cancer » tout traitement capable, par exemple, de supprimer une tumeur ou des métastases, réduire le risque de récidive, ralentir le développement d'une tumeur ou des métastases, et/ou traiter les symptômes de la maladie. Les cancers visés par la présente invention sont notamment ceux dans lesquels sont exprimés les récepteurs TrkA et EphA2, et de préférence en outre l'association des récepteurs TrkA et EphA2. La détection des cancers visés par la présente invention peut se faire selon des techniques connues de l'homme du métier. Typiquement, les récepteurs TrkA et EphA2 sont détectés. De préférence, l'association de complexes protéiques, notamment l'association des récepteurs TrkA et EphA2, et éventuellement des récepteurs TrkA et EphA2 et de la sortiline, est également détectée. Par la suite, on appelle « récepteur à détecter » le récepteur TrkA et/ou EphA2.
Par exemple, mais de manière non limitative, les récepteurs TrkA et EphA2 peuvent être détectés dans un échantillon biologique par détection des AR m de TrkA/EphA2, par détection directe des protéines TrkA/EpfiA2 ou par mise en évidence de l'activation de TrkA/EpfiA2.
Un échantillon biologique utilisé pour la détection directe de TrkA / EphA2 peut être un fluide biologique ou un tissu provenant de la biopsie d'une tumeur ou des métastases du patient.
A titre de fluide biologique utilisable selon la présente invention, on peut citer le sang, la moelle osseuse, le lait, le liquide céphalo-rachidien, les urines et les épanchements.
Le fluide biologique peut nécessiter un traitement particulier, notamment si ce sont des cellules tumorales circulantes qui expriment le récepteur à détecter. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le fluide biologique peut être préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes ou des fragments de cellules circulantes (exosomes ou microvésicules) contenues dans ledit fluide biologique. Par « isoler les cellules tumorales circulantes », on entend obtenir une fraction cellulaire enrichie en cellules tumorales circulantes. Le traitement du fluide pour isoler les cellules tumorales circulantes peut par exemple être effectué par tri cellulaire dans un cytomètre de flux, par enrichissement sur Ficoll, par enrichissement par billes magnétiques recouvertes d'anticorps spécifiques, ou par toute autre méthode d'enrichissement spécifique connue de l'homme du métier. Les fragments de cellules circulantes peuvent être préparés à partir de méthodes préparatives comme l'ultracentrifugation ou toutes autres méthodes chromatographiques, de cytométrie en flux permettant de les isoler ou de les enrichir connues par l'homme de métier.
Dans le cas où l'échantillon biologique est du sang ou de la moelle osseuse, les cellules tumorales circulantes peuvent être isolées grâce à une technique de séparation cellulaire sur Ficoll associée à une déplétion des cellules sanguines utilisant des anticorps anti- CD45 couplés à des billes magnétiques (Dynal Biotech ASA, Norvège). La détection directe du récepteur peut alors être effectuée directement à partir de cellules tumorales circulantes isolées du fluide biologique par tout moyen bien connu de l'homme du métier, par exemple par marquage immunocyto chimique de ces cellules avec un anticorps ou par cytométrie de flux.
Lorsque l'échantillon biologique est du tissu, provenant typiquement de la biopsie de la tumeur ou des métastases du patient, la détection directe du récepteur peut être effectuée directement sur les coupes obtenues, sans traitement préalable dudit tissu.
La détection directe du récepteur visé peut être mise en œuvre par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par spectrométrie de masse ou par tests immunologiques. Le test immunologique peut être tout test largement connu de l'homme du métier impliquant des réactions immunologiques, à savoir des réactions entre un récepteur et un partenaire de liaison spécifique du récepteur.
La spectrométrie de masse peut être utilisée pour la détection directe de TrkA dans l'échantillon biologique. Le principe et la mise en œuvre de la spectrométrie de masse sont largement connus de l'homme du métier.
Par exemple, l'échantillon biologique, éventuellement traité au préalable (par exemple par passage sur un support d'immunocapture, comportant un des partenaires de liaison du récepteur, par exemple un anticorps), est passé dans un spectromètre de masse et le spectre obtenu est comparé avec celui du récepteur à détecter (par exemple, TrkA ou EphA2). La détection peut également se faire par marquage des protéines membranaires (par exemple à la biotine) pour une capture par affinité streptavidine/biotine. Des tests immunologiques sont également bien connus de l'homme du métier et incluent des réactions immunologiques, à savoir des réactions entre le récepteur à détecter et un partenaire de liaison spécifique du récepteur à détecter. Les partenaires de liaison spécifiques du récepteur à détecter sont tout partenaire susceptible de se lier au récepteur. A titre d'exemple, on peut citer les anticorps, les fractions d'anticorps, les récepteurs et toute autre protéine capable de se lier au récepteur à détecter. Les anticorps partenaires de liaison sont typiquement soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux. Des techniques d'obtention de tels anticorps sont bien connues de l'homme du métier. Par ailleurs, des exemples d'anticorps anti-TrkA sont connus et sont disponibles notamment dans le catalogue de Cell signaling ou de Alomone. Des exemples d'anticorps anti-EphA2 sont également connus et disponibles notamment dans le catalogue de Cell Signaling ou Santa Cruz. Un marquage des partenaires de liaison spécifiques du récepteur à détecter pourra être effectué pour la révélation de la liaison récepteur/partenaire de liaison. Par « marquage des partenaires de liaison », on entend la fixation d'un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs consiste en des enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la α-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, des chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants ; des molécules fluorescentes telles que l'alexa ou les phycocyanines ; des molécules radioactives contenant des isotopes radioactifs des éléments comme le P, le S ou le I etc.
Des systèmes indirects de marquage peuvent également être utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Des couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, par exemple biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. L'anti-ligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits précédemment ou peut être lui-même détectable par un ligand/anti-ligand.
A titre d'exemple de tests immunologiques tels que définis ci-dessus, on peut citer les méthodes « sandwich » telles qu'ELISA, IRMA et RIA, les méthodes dites de compétition et les méthodes d'immuno détection directe comme l'immunohistochimie, l'immunocytochimie, le Western-blot, le Dot-blot.
Un autre mode de détection de la présence du récepteur à détecter consiste en la culture, en présence de l'échantillon biologique, de cellules sensibles au récepteur à détecter, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
Un autre mode de réalisation particulier de détection de la présence du récepteur à détecter dans les échantillons biologiques consiste en la détection de l'ARNm dudit récepteur à détecter dans ledit échantillon.
La détection d'ARNm, de préférence à partir de cellules circulantes ou de fragments de cellules circulantes dans un fluide biologique comme défini précédemment, est largement connue de l'homme du métier. Elle peut par exemple être mise en œuvre par des réactions d'hybridation entre l'ARNm cible et un acide nucléique capable de liaison avec l'ARNm cible.
On entend par acide nucléique les oligonucléotides, les acides désoxyribo nucléiques et les acides ribo nucléiques, ainsi que leurs dérivés. Le terme « oligonucléotide » désigne un enchaînement d'au moins 2 nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou les deux), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par « nucléotide modifié », on entend par exemple un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5- désoxyuridine. De manière uniquement illustrative, une liaison internucléotidique modifiée peut être les liaisons phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate et alkylphosphodiester. Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A-2 607 507, les LNA tels que phosphorothioate-LNA and 2'-thio-LNA décrits dans Bioorganic & Médicinal Chemistry Letters (32), et les PNA (33), sont des exemples d'oligonucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié. La révélation des réactions d'hybridation peut être effectuée par marquage des acides nucléiques de liaison, comme illustré précédemment. Avant hybridation avec l'acide nucléique de liaison, l'ARNm cible peut être extrait par des méthodes connues de l'homme du métier, puis éventuellement amplifié, comme par exemple par RT-PCR ou par NASBA (34). La détection de l'association de complexes protéiques peut également être effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par des tests immuno logiques. Typiquement, la méthode de proximity ligation assays (PLA) ou Duolink® peut être utilisée. La détection des complexes protéiques pourra également mettre en oeuvre des réactifs bivalents.
D'une manière avantageuse, un cancer solide visé par la présente invention, est un cancer solide présentant des cellules cancéreuses exprimant les récepteurs EphA2 et TrkA, qui est choisi parmi le cancer du sein (35, 36), le cancer de la prostate (37,38), le cancer du colon (36,37), le cancer de la langue (36,39), le cancer de la sphère oro-pharyngée (39,39), le cancer de la thyroïde (40,41), le cancer du pancréas (36,42), le neuroblastome (36,43), le gliome (44), le cancer de la peau (mélanome) (36,45). De manière préférentielle, un cancer visé par la présente invention est le cancer du sein, de la prostate ou de la sphère oro-pharyngée (tumeurs de la langue, de la cavité buccale, du pharynx et du larynx). De préférence encore, un cancer visé par la présente invention est le cancer du sein.
Un objet de l'invention se rapporte à une méthode de traitement d'un cancer solide chez un patient traité par un inhibiteur TrkA tel que précédemment décrit, comprenant une étape d'administration audit patient d'une quantité thérapeutiquement active et tolérable d'un point de vue pharmaco logique d'un inhibiteur d'EpbA2 tel que précédemment décrit.
Un objet de l'invention concerne également une méthode de traitement d'un cancer solide chez un patient traité par un inhibiteur de EpbA2 tel que précédemment décrit, comprenant une étape d'administration audit patient d'une quantité thérapeutiquement active d'un inhibiteur de TrkA tel que précédemment décrit.
Le terme « patient » est entendu comme un humain affecté, ou amené à être affecté, par un cancer solide visé par la présente invention, tel que précédemment défini.
Le terme « quantité thérapeutiquement active » d'un inhibiteur selon l'invention signifie une quantité d'inhibiteur suffisante pour traiter un tel cancer, ayant un rapport bénéfïce/risque acceptable pour un traitement médicamenteux. La quantité d'inhibiteur(s) et de compositions selon la présente invention ainsi que la fréquence d'administration pourront être déterminées par des études cliniques, par le médecin ou par le pharmacien. La quantité "thérapeutiquement active" spécifique à chacun des patients pourra dépendre d'un certain nombre de facteurs comme la nature et la sévérité du désordre à traiter, l'inhibiteur utilisé, la composition utilisée, l'âge, le poids, l'état de santé général, le sexe et le régime du patient, le mode d'administration, la durée du traitement (en monodose ou en plusieurs doses), les médicaments utilisés en combinaison et d'autres facteurs bien connus des spécialistes médicaux.
Typiquement, l'inhibiteur de TrkA selon l'invention et l'inhibiteur de EphA2 selon l'invention peuvent être administrés de manière simultanée ou séquentielle. De manière avantageuse, l'inhibiteur de TrkA selon l'invention et l'inhibiteur de
EpbA2 selon l'invention peuvent être combinés dans une composition pharmaceutique ou peuvent être séparés, par exemple sous forme de produit de combinaison (kit).
Un objet de l'invention se rapporte ainsi à une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de TrkA tel que précédemment décrit, un inhibiteur de EpbA2 tel que précédemment décrit et au moins un support pharmaceutiquement acceptable.
Un mode de réalisation particulier se rapporte à une telle composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement de cancer solide.
Dans la composition pharmaceutique selon l'invention, l'inhibiteur de TrkA et l'inhibiteur de EpbA2, en quantités thérapeutiquement actives, sont combinés avec un ou plusieurs supports pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération prolongée, comme des polymères biodégradables, afin de former des compositions thérapeutiques.
On entend par « pharmaceutique » ou « pharmaceutiquement acceptable » toute entité moléculaire et composition qui ne produisent pas de réaction allergique, négative ou toute autre réaction désirée lors de l'administration à un mammifère, notamment un humain. Un support ou excipient pharmaceutiquement acceptable se réfère ainsi à un solide, semi-solide, diluant, matériel encapsulant, ou autre quelconque formulation non toxique. Par exemple, des solutions salines tamponnées au phosphate et stériles sont pharmaceutiquement acceptables. Les supports pharmaceutiquement acceptables peuvent habituellement comprendre un ou plusieurs composés, par exemple choisis parmi des excipients, conservateurs, solubilisants, agents tampon, albumine etc. Des excipients connus sont par exemple de l'amidon, gélatine, acide stéarique, stéarate de calcium ou de magnésium etc.
La forme de la composition pharmaceutique, le mode d'administration, le dosage et la posologie peuvent dépendre, entre autres, du cancer à traiter, de ses symptômes, de sa sévérité, de l'âge, du poids et/ou du sexe du patient.
De façon non limitative, la composition pharmaceutique selon l'invention peut être formulée de façon à pouvoir être administrée par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intratumorale, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra-auriculaire, les inhibiteurs selon l'invention pouvant être administrés, de manière individuelle ou en combinaison, sous forme unitaire d'administration. Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales injectables, des timbres transdermiques (« patch »), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire, intratumorale ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres.
Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes habituelles des domaines considérés.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un produit de combinaison comprenant :
- un inhibiteur de TrkA tel que précédemment décrit, et
- un inhibiteur de EphA2 tel que précédemment décrit. Un mode de réalisation particulier se rapporte à un tel produit de combinaison pour son utilisation dans le traitement de cancer solide.
Un tel produit de combinaison ou kit permet l'administration des inhibiteurs de TrkA et de EphA2 conformes à l'invention de manière simultanée, i.e. au même moment, ou séparée dans le temps, i.e. successivement.
L'invention concerne également une méthode de pronostic de la survie d'un patient souffrant d'un cancer solide comprenant une étape de détection de l'expression de TrkA et de EphA2 au sein d'un échantillon biologique du patient, la co-expression de TrkA et de EphA2 étant associée à un mauvais pronostic de survie du patient.
Typiquement, l'étape de détection de l'expression de TrkA et de EphA2 est réalisée par la détection d'un complexe TrkA/EpfiA2. En effet, la co-expression de TrkA et de EphA2, en particulier la présence d'un complexe TrkA/EphA2 est associée avec une diminution significative de la survie globale des patients.
Un échantillon biologique utilisé pour la détection de TrkA/EpfiA2 est typiquement un échantillon provenant d'une biopsie d'une tumeur ou des métastases du patient.
La détection de la co-expression de TrkA et de EphA2 peut être effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier.
La détection du complexe TrkA/EphA2 peut être effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par des tests immuno logiques. Typiquement, la méthode de proximity ligation assay (PLA) ou Duolink® peut être utilisée. La détection du complexe pourra également mettre en œuvre des réactifs bivalents reconnaissant à la fois TrkA et EphA2.
FIGURES
Figure 1 : Etude des effets pro-invasifs du NGF et proNGF sur des cellules épithéliales cancéreuses. Les tests d'invasion ont été réalisés sur des cellules cancéreuses de la langue (CAL 27, CAL 33), du larynx (SQ20B), du pharynx (FaDu), de prostate (DU145, PC3) et de sein (MDA-MB-231), ensemencées en chambre de Boyden et traitées avec du NGF (16nM) ou du proNGF N.C (0.5 nM) pendant 20h. Les cellules non traitées représentent le contrôle et déterminent une invasion basale de 100 %. Figure 2 : Etude de l'expression des récepteurs dans des cellules épithéliales cancéreuses. Les niveaux d'expression protéique des récepteurs EphA2, sortiline, p75NTR, et TrkA ont été mesurés par western blot sur des cellules sensibles au proNGF (cellules CAL 33, DU 145, PC3, et MDA-MB-231). 50 μg de protéines totales sont chargés.
Figure 3 : Etude de l'implication d'EphA2 sur les effets pro-invasifs du proNGF. Le test d'invasion est réalisé sur des cellules MDA-MB-231 (A), DU145 (B) et PC3 (C) transfectées avec un siRNA dirigé contre EphA2 (siEphA2), TrkA (siTrkA) ou un siRNA aléatoire (siCRTL). Les cellules transfectées-siCTRL non traitées servent de contrôle et déterminent une invasion basale de 100% (barre blanche). Pour les statistiques, les barres d'erreurs représentent l'écart type. * p<0.001 pour le traitement proNGF ou NGF vs sans traitement ; § p<0.001 pour l'expérimental vs le contrôle sous traitement au proNGF. L'efficacité des siRNA est mesurée par western-blot via l'utilisation d'anticorps spécifiques contre TrkA, EphA2, et actine (contrôle de charge).
Figure 4 :
A-Corrélation de l'expression de la Sortiline (SORTI), TrkA (NTR 1) et EphA2 avec la survie sans métastase par analyse microarrays (SORTI), EphA2 et TrkA (NTR 1) après surrégulation de la Sortiline, TrkA et EphA2 (courbe du dessous) ou sans sur-régulation (courbe du dessus).
B- L'expression du complexe TrkA/EphA2 est associée à une diminution de la survie globale des patients dans le cancer du sein. L'expression du complexe TrkA/EphA2 a été recherchée par Proximity ligation assays sur des 182 tumeurs du sein (tissue microarrays CBA4 (Superbiochips) et Hbre-Duc 150 sur-01 (US Biomax)). L'expression du complexe a été gradée en expression nulle (pas de marquage) faible ou très faible (de 0 à 5 complexes détectés par cellules en moyenne ; moyen 5 à 15 complexes par cellule en moyenne ; fort plus de 15 complexes par cellule en moyenne). La survie globale est reportée sous forme d'un graphique de Kaplan Meier, la signifïcativité est obtenue par un test Log Rank (n= 182, p< 0,0001).
Figure 5 : Identification des protéines associées à TrkA en spectrométrie de masse.
Figure 6 : Etude de la formation d'un complexe entre TrkA, EphA2 et la sortiline par immunoprécipitation dans les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA. Les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA sont traitées avec 0.5 nM de proNGF N.C ou 16 nM de NGF (5 et 30 min). HA- TrkA, la sortiline et EphA2 sont immunoblottés en utilisant respectivement les anticorps anti- HA, anti-sortiline et anti-EphA2. Figure 7 : Etude de l'impact d'une invalidation séquentielle de chacun des récepteurs TrkA, sortiline, EphA2 dans la formation du complexe TrkA/sortiline/EphA2 sous traitement au proNGF.
A. Les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA ont été transfectées avec siTrkA et ensuite traitées avec du proNGF N.C. La sortiline est immunoprécipitée, EphA2 et HA-TrkA sont immunoblottés.
B. Les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA ou kinase-dead HA-TrkA sont traitées avec du proNGF N.C. Le recrutement de la sortiline et d'EphA2 est déterminé après immunoprécipitation anti-HA. L'efficacité de la mutagenèse a été vérifiée avec un anticorps anti-phospho-tyrosine.
C. Les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA sont traitées avec du proNGF N.C en présence ou non de 1 μΜ de neurotensine. HA-TrkA est immunoprécipité avec l'anticorps anti-HA et la sortiline et l'EphA2 sont immunoblottés.
D. Les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA sont transfectées avec siEphA2 et ensuite traitées avec du proNGF N.C. (30 min). Le recrutement de la sortiline et d'EphA2 est déterminé après immunoprécipitation anti-HA.
Figure 8 : Etude du rôle de TrkA et d'EphA2 dans l'activation des protéines Akt et Src. Les cellules MDA-MB-231 ont été traitées respectivement avec un inhibiteur de TrkA (K252a), un siRNA anti-EphA2 (siEphA2), un inhibiteur de PI3-K (LY294002) et un inhibiteur de Src (SKI-1).
A et D. Les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA sont traitées avec du proNGF N.C. (A) ou du NGF (D) (30 min) en présence ou non de 10 nM K252a, 15 μΜ LY294002 et 50 nM SKI-1. La phosphorylation de Akt et Src est déterminée par l'utilisation d'anticorps phospho- spécifïques. L'équicharge est vérifiée avec les anticorps Akt et Src.
B et E. Les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA ou kinase-dead HA-TrkA sont traitées avec du proNGF N.C. (B) ou du NGF (E) (5 et 30 min). La phosphorylation de Akt et Src est mesurée par Western-blot. C et F. La phosphorylation d'Akt et de Src a été déterminée dans les lysats totaux issus des cellules MDA-MB-231 transfectées avec siEphA2 et traitées 30 min avec du proNGF N.C. (C) ou du NGF (F). Figure 9 : Etude sur l'inhibition de TrkA et EphA2 sur le développement tumoral in vivo. Les tumeurs se sont développées sans aucune intervention pendant 14 jours et ont ensuite été soumises à 3 injections (tous les 3 jours, flèches noires) de solvant (contrôle), CEP-701 ( 10mg/kg), siEphA2 (7,5 microg/souris) ou CEP-701 (10mg/kg) et siEphA2 (7,5 micro g/souris). Les expériences ont été arrêtées 31 jours après la première injection du traitement pour des considérations éthiques après la mort d'une des souris contrôles. A) Les volumes des tumeurs sont évaluées en mesurant la longueur (1) et la largeur (w) et ensuite en calculant le volume via la formule π/6 x 1 x W x (l+w)/2 ; le test de Mann et Whitney a été effectué entre le groupe contrôle et CEP-701 (a), entre les groupes contrôles et siEphA2 (b), entre les groupes contrôles et CEP-701 + siEphA2 (c), et entre les groupes siEphA2 et CEP- 701 + si EphA2 (d)*, P < 0.05 ; **, P < 0.01 ; ns : non significatif. B) Etude de l'inhibition de l'expression des récepteurs par siRNA sur la survie globale des souris SCID. Les tumeurs se sont développées sans aucune intervention pendant 14 jours et ont ensuite été soumises à 5 injections (J 14, J 17, J20, J23 , J26) de SiTrkA (7,5 microg/souris), siEphA2 (7,5 microg/souris), si TrkA (7,5 microg/souris) et siEphA2 (7,5 microg/souris). Pour des considérations éthiques, les points limites ont été défini pour un volume tumoral n'excédant pas 2,5 cm3 et une durée maximale de 90 jours après l'inoculation des cellules tumorales. Au- delà de ces points limites les souris sont euthanasiées. Les volumes des tumeurs sont évaluées en mesurant la longueur (1) et la largeur (w) et ensuite en calculant le volume via la formule π/6 x 1 x W x (l+w)/2 ; La survie est représentée sous forme d'un graphique de Kaplan Meier. La signifïcativité a été mesurée par le test Log Rank (P= 0,0022). Les survie médiane sont respectivement de 40 jours dans le contrôle, 53 jours en présence de siTrkA, 49 jours en présence de si EphA2 et 57,5 en présence de siTrkA et si EphA2.
Figure 10 : Etude de l'effet du lestaurtinib (inhibiteur de TrkA) et de EphrinAl-Fc (inhibiteur de EpbA2) et de la combinaison de traitement sur l'invasion des cellules cancéreuse de sein. Le test d'invasion est réalisé sur des cellules MDA-MB-231. Les cellules non stimulées (« non stim ») de proNGF servent de contrôle et déterminent une invasion basale de 100% (barre blanche). EXEMPLES
Exemple 1 - EphA2 est impliqué dans l'invasion cellulaire de diverses lignées de cellules cancéreuses induite par proNGF par une interaction fonctionnelle avec le complexe sortiline/TrkA.
Des recherches antérieures avaient démontré que de nombreuses cellules cancéreuses épithéliales répondent au NGF ou au proNGF (24, 25, 51-54). Les effets du NGF et du proNGF sur la capacité d'invasion de différentes lignées cancéreuses ont donc été testés.
Les expériences ont été effectuées sur des cellules cancéreuses de la langue (CAL27, CAL33), du larynx (SQ20B), du pharynx (FaDu), de la prostate (DU145, PC3) et du sein (MDA-MB-231). Produits et réactifs
Les réactifs ont été fournis par Sigma (France), les milieux de culture cellulaire ont été obtenus auprès d'Invitrogen (France). Les plastiques et consommables de culture cellulaire proviennent de BD-Falcon (France) et Greiner (France). Le β NGF recombinant humain est fourni par Scil Proteins (Allemagne), le proNGF non clivable (proNGF N.C.) recombinant humain par Alomone Labs (Israël) et l'inhibiteur pharmaco logique K252a est obtenu auprès de Calbiochem (Grande Bretagne). Les anticorps proviennent de Cell Signaling Technology (France) hormis les anticorps anti-HA (Covance ; France) et anti-sortiline (R&D Systems ; France). Cultures cellulaires
Les lignées cellulaires CAL 27, CAL 33, SQ20B et FaDu (lignées cancéreuses des voies aéro-digestives supérieures) ont été fournies par le Centre Oscar Lambret (Lille), et les lignées cellulaires DU145 et PC3 (lignées cancéreuses de prostate), et MDA-MB-231 (lignées cancéreuses de sein) proviennent de Γ « American Tissue Culture Collection » (ATCC, Manassas, VA, USA).
Les cellules ont été maintenues en milieu essentiel minimal de Eagle (MDA-MB-231), milieu de Dulbecco (CAL 27, CAL 33 et SQ20B), milieu RPMI 1640 (DU145, PC3 et FaDu) contenant 10% de sérum de veau fœtal inactivé (S VF) (Hyclone, France), 2 mM de L- glutamine, 1% d'acides aminés non essentiels, 40 UI/ml de pénicilline, 40 μg/ml de streptomycine, 50 μg/ml de gentamycine et en présence de ZellShield™ (IX, Biovalley, France) (37°C, 5% C02 en atmosphère saturée en humidité). La lignée cancéreuse de sein (MDA-MB-231) surexprimant HA-TrkA (nommée par la suite « MDA-MB-231 HA-TrkA ») a été établie au sein du laboratoire, par surexpression stable du récepteur TrkA (variant 1 NM 001012331.1) qui montre une mutation silencieuse en position 799, CAA donne CAG (Thr→Gln), et un conflit de séquence en position 263 (Val→Leu) (répertoriée dans Swiss Prot) avec une étiquette HA (Hemagglutinine : Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala) en position N terminale.
Test d'invalidation séquentielle
Les séquences de siR A utilisées contre EphA2 (siEphA2) à 100 pmol pour chaque transfection, et contre TrkA (pool de 3 siTrkA 1, 2 et 3) sont présentées dans le tableau 1. Les transfections des siRNA ont été réalisées au moyen de INTERFERin™ selon les instructions du fabricant (POL409-10, Polyplus transfection, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France).
Tableau 1
Western Blot
Après traitement, les cellules ont été lysées (tampon de lyse : 40 mM HEPES pH 7,5 ; 1 mM EDTA pH 8,0 ; 120 mM NaCl ; 10 mM NaPPi ; 50 mM NaF ; 1,5 mM Na3V04 ; 1% Triton X 100 ; 0,1% SDS ; 1 mM PMSF ; 10% glycérol et l/100ème de cocktail d'inhibiteurs de protéases (Sigma) (20 min ; 4°C)). Les lysats sont récupérés et clarifiés par centrifugation (12 000 g ; 10 min ; 4°C). Le surnageant est alors stocké à -80°C jusqu'à son utilisation. Les extraits protéiques sont dilués à 2 μg.μL-l dans un tampon Laemmli IX (7 min ; 100°C) puis déposés et séparés sur SDS-PAGE (gel de concentration 3,6% d'acrylamide et gel de séparation 7,5% à 10% d'acrylamide (épaisseur 1 mm) ; 180 V ; 10 min puis 200 V constants ; jusqu'à la sortie du front de migration). Les protéines séparées en SDS-PAGE sont transférées selon la méthode de transfert semi sec (tampon : 48 mM Tris base, 39 mM glycine, 1,64 mM SDS, 20% méthanol (v/v) ; 14 V ; 15 min par gel) ou liquide (tampon : 25 mM Tris base et 192 mM glycine ; 15% méthanol (v/v) ; 100 V ; 30 min) sur membranes de nitrocellulose (0,45 μιη; Whatman; Allemagne) ou PVDF (0,45 μιη ; Immobilon P ; Millipore ; France). La membrane de PVDF est «activée» au préalable (méthanol ; 10 min ; 20°C). Les membranes sont ensuite saturées (TBS-T ; 5% SAB ; 1 h ; 20°C) puis incubées (16 h ; 4°C) avec l'anticorps primaire choisi. Les membranes sont enfin lavées (TBS-T), incubées (1 h ; 20°C) avec un anticorps secondaire (dilué au 1/5 OOOème (anti-lapin) ou au 1/10 OOOème (anti-souris) dans 5% Sérum albumine bovine) couplé à la HRP (Horse Radish Peroxydase), puis révélées avec le kit Super Signal® West Pico (Pierce). Les membranes sont placées dans un analyseur d'image (LAS 4000 ; Fuji), relié à un ordinateur qui permet la génération d'image (logiciel Image reader LAS 4000).
L'anticorps dirigé contre EphA2 est le sc-924 (Santa Cruz), l'anticorps dirigé contre la sortiline est le BD Bioscience 612101, l'anticorps dirigé contre TrkA est se 14024 (Santa Cruz), l'anticorps dirigé contre HA est MMS-101R (Covance), l'anticorps dirigé contre Akt est Cell signaling 4691, l'anticorps dirigé contre phospho-Akt (Ser 473) est Cell signaling 9271, l'anticorps dirigé contre Src est Cell signaling 2109 (WB), l'anticorps dirigé contre PhosphoSrc (Tyr416) est Cell signaling 2105, l'anticorps dirigé contre l'actine est Sigma A2066.
Immunoprécipitation
Les billes (Protéine G-agarose, Millipore) ont été lavées deux fois (12 000 g ; 1 min ; 4°C) et reprises dans du PBS IX (à 50%> (v/v)). Les échantillons protéiques (1 mg) ont été pré-clarifiés (1 h ; 4°C ; sur roue (10 rpm)) avec 100 μΐ de billes et 5 μg d'anticorps isotypique (IgG2b de souris), centrifugés (12 000 g ; 2 min ; 4°C), puis le surnageant a été incubé (2 h ; 4°C ; sur roue (10 rpm)) avec 5 μg d'anticorps a-HA 12CA5 (Roche). Les billes (100 μΐ, à 50%) dans PBS IX) ont été ajoutées directement aux complexes anticorps/protéines puis incubées (2 h ; 4°C ; sur roue (10 rpm)). Les complexes anticorps/antigènes/billes ont ensuite été centrifugés (12 000 g ; 5 min ; 4°C), lavés trois fois (tampon de lyse ; 4°C), puis dissociés par addition de tampon Laemmli 2X (25 mM Tris-HCl, 0,8%> SDS, 4% glycérol, 1% β-mercaptoéthanol, pH 6,8) (7 min ; 100°C). Enfin, après centrifugation (12 000 g ; 10 min ; 4°C), le surnageant a été conservé à -20°C. L'anticorps dirigé contre EphA2 est le sc-924 (Santa Cruz), l'anticorps dirigé contre la sortiline est le BD Bioscience 612101, l'anticorps dirigé contre HA est Roche 11 666 606 001. PLA In situ (Proximity Ligation Assay) dans les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA, MDA-MB-231. DU145. PC3 et les tissus microarrays.
Les cellules (20 000 cellules par puits) ont été ensemencées dans des Labtek® qui ont été traitées préalablement à l'alcool/acide chlorhydrique (éthanol absolu + 2% d'HCl). Les cellules ont ensuite été sevrées (0,1% SVF ; 1 h ; 37°C) puis traitées ou non avec du proNGF N.C. (0,5 nM) ou du NGF (16 nM) pendant 5 min. Après une étape de fixation (Paraformaldéhyde (PFA) 4% dans PBS IX (Phosphate Buffered Saline : 2,7 mM KC1, 8 mM Na2HP04, 1,8 mM KH2P04, 137 mM NaCl, pH 7,4 ; 30 min ; 20°C), les cellules ont été incubées avec une solution de blocage (TBS-T : 20 mM Tris base, 137 mM NaCl, 0,1% de Tween 20, pH 7,6, 4%> de Sérum Albumine Bovine (SAB) ; 1 h; 20°C puis avec les anticorps primaires anti-HA, anti-sortiline et anti-EphA2 dilués au l/50ème (anti-sortiline et anti-HA) ou au l/100ème (anti-EphA2) dans la solution de blocage. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois au PBS IX pendant 5 min puis incubées pendant 2 h à 37°C avec les sondes PLA oligo marquées anti- souris ou anti- lapin « plus » et anti- lapin ou anti-chèvre « moins » (Olink Bioscience) diluées au l/5ème dans une solution de 4%> SAB. Le choix des sondes PLA dépend des anticorps primaires utilisés. Après deux lavages de 5 min au TBS-T, le signal est détecté par le kit de détection 613 Duolink® (Olink Bioscience) selon les instructions du fournisseur. Afin de visualiser les noyaux, les cellules ont également été incubées avec du Hoechst 33 258 (1 mM dans PBS IX) puis les échantillons ont été montés sur lame avec le milieu de montage pour fluorescence (Dako). Les images du PLA (points fluorescents rouges) sont obtenues grâce à un microscope à fluorescence (objectif à immersion 100X, excitation : 562 nm, émission : 624 nm, microscope Eclipse Ti ; Nikon, France) puis analysées avec le logiciel NIS-Elements BR de Nikon. Un point fluorescent rouge reflète une interaction entre les deux protéines (distantes de moins de 40 nm ; méthode quantitative).
Le marquage des tissus microarrays est effectué en utilsant le kit PLA Brightfield (Sigma- Aldrich) selon les recommandations du fabricant. Les images ont été acquises à l'aide du microscope Eclipse TiU, Nikon (objectif 100X). L'anticorps dirigé contre EphA2 est le AF-3035 (R&D Systems), l'anticorps dirigé contre la sortiline est le AF 3154 (R&D Systems), l'anticorps dirigé contre TrkA est Alomone labs ANT-018.
Test d'invasion In vitro Les chambres de Boyden (Transwell® ; BD Bio sciences ; France) ont été recouvertes d'une matrice biologique (collagène de type I de rat dilué à 400 μg.mL-l dans du milieu EMEM-0, 1% SVF ; Millipore). Les cellules ont ensuite été ensemencées à raison de 100 000 cellules/puits sur les membranes en PET (polyethylene terephtalate ; 0 : 10,5 mm ; porosité : 8 μιη) des chambres de Boyden et maintenues dans un milieu EMEM-0, 1 % SVF. Les cellules ont été traitées avec du K252a (10 nM) dans la partie supérieure du Transwell®, avec ou non du NGF (16 nM) ou du proNGF N.C. (0,5 nM) dans la partie inférieure. Après 20 h de culture, elles sont lavées deux fois avec du PBS IX et fixées (méthanol glacé ; 15 min ; - 20°C). Les cellules non invasives (face supérieure du Transwell®) ont été éliminées par raclage. Le nombre de cellules invasives a été estimé après coloration au Hoechst 33 258 (1 mM ; 30 min ; 20°C) en comptant leurs noyaux par microscopie à fluorescence sur un total de 5 champs choisis de manière aléatoire (objectif 10X ; excitation : 345 nm ; émission : 478 nm ; Eclipse Ti) grâce au logiciel ImageJ. Chaque expérience a été réalisée en triplicata. L'analyse statistique des résultats a été réalisée par analyse de variance ANOVA (post-test Bonferroni).
Coloration des gels au bleu de Coomassie colloïdal
Après migration, les gels ont été fixés (16 h, 20°C) (25% d'éthanol (v/v) et 2% d'H3P04 à 85% (v/v)), lavés trois fois (2% d'H3P04 à 85% (v/v) ; 20 min, 20°C) et pré- trempés dans une solution 2% d'H3P04 à 85% (v/v), 1 , 1 M de (NH4)2S04, 17% d'éthanol (30 min, 20°C). Ils ont ensuite été colorés dans la même solution supplémentée avec 0,05 g de bleu de Coomassie G250 (48 h, 20°C, sous agitation).
Décoloration des gels et digestion trypsique
Les spots d'intérêt sont excisés, rincés avec de l'eau ultra-pure et décolorés par bains successifs d'une solution d'acétonitrile (ACN)/NH4HC03 à 50 mM (50/50, v/v, 20°C, sous agitation). Après décoloration totale, les spots sont déshydratés (ACN 100%, 3x 10 min, 20°C) puis réhydratés (NH4HC03 100 mM, 10 min, 20°C). Ils sont ensuite réduits (45 min, 56°C avec 10 mM DTT dans 100 mM NH4HC03) et alkylés (30 min, 20°C, à l'obscurité avec 55 mM iodoacétamide dans 100 mM NH4HC03). Après séchage au Speed-Vac (30 min, 20°C), les spots sont réhydratés et incubés avec la trypsine (NH4HC03 25 mM, 12,5 μg/ml de trypsine (Promega ; Charbonnières les bains, France), 1 h, 4°C). Cette solution est ensuite renouvelée, sans trypsine et les tubes incubés (12 h, 37°C). Après récupération du surnageant, les morceaux de gel sont lavés successivement dans une solution d'ACN/acide formique (45/10, v/v) (deux lavages) puis dans une solution d'ACN/acide formique (95/5, v/v). Les surnageants sont collectés, regroupés avec le précédent et l'ensemble évaporé au Speed-Vac.
Analyse par spectrométrie de masse MS/MS
Les analyses nanoLC-nanoESI-MS/MS sont effectuées sur une trappe ionique (LCQ
Deca XP+, Thermo Electron ; Brebières, France) équipée avec une source nano-électrospray couplée à une nano-chromatographie liquide haute pression (LC Packings Dionex ; Voisins le Bretonneux, France). Les digestats trypsiques sont repris dans 4 μΐ d'une solution à 0,1% d'acide formique et 1,4 μΐ sont injectés en utilisant un passeur d'échantillon Famos (LC Packings Dionex). Les échantillons sont, dans un premier temps, dessalés puis concentrés sur une pré-colonne en phase inverse Cl 8 (d'une longueur de 5 mm et d'un 0 interne de 0,3 mm, LC Packings Dionex) par un solvant A (H20/ACN, 95/5, v/v ; 0,1% d'acide formique), délivré par le système de pompage Switchos® (LC Packings Dionex) à un débit de 10 μΐ/min pendant 3 min. Les peptides sont séparés sur une colonne Cl 8 Pepmap (15 cm x 75 μιη de 0 interne, LC Packings Dionex). Un débit constant est appliqué (200 nL/min). Les peptides sont élués en 45 min en utilisant un gradient linéaire de 5 à 70% d'un solvant B (H20/ACN, 20/80, v/v ; 0,08%) d'acide formique). Une tension de 1,5 kV est appliquée au niveau de l'aiguille nano-électrospray (0 externe : 360 μιη, 0 interne : 20 μιη, 0 interne de la pointe de l'aiguille : 10 μιη, recouverte d'un alliage conducteur, New Objective, Wil, Suisse). Les analyses sont effectuées en mode positif. L'acquisition des données est réalisée en mode automatique de séquençage peptidique qui consiste en une alternance d'un spectre MS entre m/z 500 - 2000 et un spectre MS/MS de l'ion le plus intense du spectre MS précédent. Les spectres MS/MS sont acquis avec une fenêtre d'isolation de l'ion parent de 2 uma et avec une énergie de collision de 35%. Les fichiers MS/MS.raw sont transformés en fichiers .dta à l'aide du logiciel Bioworks 3.1 (Thermo Electron). Les fichiers .dta sont ensuite compilés en utilisant le logiciel merge.bat téléchargeable via le logiciel Mascot Daemon version 2.1.6 (www.matrixscience.com) pour l'interrogation des banques de données sur SwissProt 51.4 (252616 séquences). Les paramètres de recherche sont les suivants : Homo sapiens (taxonomie), un site autorisé « missed cleavage » par la trypsine, carbamidométhylation, oxydation des méthionines et phosphorylation des résidus Ser, Thr et Tyr (modifications variables), 2 Da (tolérance de masse des peptides) et 0,8 Da (tolérance de masse des MS/MS).
Analyse de l'expression des gènes dans les échantillons tumoraux de sein. Les expressions de la sortiline (SORTI), EphA2 et TrkA (NTPv l) ont été analysées sur des échantillons tumoraux et sains. L'analyse est effectuée sur la base du recueil de données de 35 cohortes publiées sur le site du National Center for Biotechnology Information (NCBI)/Genbank GEO database, de l'European Bioinformatics Institute (EBI) ArrayExpress database et de l'institut Paoli Calmettes (Marseille). 6183 cas de cancer du sein non invasif sont ainsi analysés pour l'expression de NTR 1 et corrélés avec les données clinico- pathologiques. Un traitement pré-analytique des données est ensuite appliqué. Pour les sets de données issus des puces à ADN Agilent, une normalisation par les quantiles a été appliquée afin d'obtenir les données processées. Concernant les données générées par les puces à ADN Affîmetrix, la méthode de normalisation RMA (Robust Multichip Average) (48) a été utilisée avec l'algorithme de calcul non-paramétrique des quantiles. Afin de rendre l'ensemble des données comparables et pour exclure tout biais provenant de l'hétérogénéité des populations, les niveaux d'expression de NTRK1 ont été standardisés à l'intérieur de chaque set de données en prenant pour référence la population luminale A, le sous-type moléculaire des tumeurs étant défini par le PAM50 « Predictor » (49). Lorsque plusieurs sondes sont étudiées avec NTRK1, celle avec la variance la plus élevée dans un ensemble de données particulier a été sélectionnée. La sur-régulation de NTR 1 est définie par l'augmentation d'expression au- dessus du niveau médian. Les corrélations entre l'expression de NRTK1 et les variables histo- cliniques incluant l'âge des patients au moment du diagnostic (<50 ans vs > 50), l'état pathologique du ganglion lymphatique axillaire (pN : négatif vs positif), la taille de la tumeur (pT : pTl vs pT2-3), le stade (I vs 2-3), immunocyto chimie (IHC) du récepteur aux œstrogène alpha (ER), du récepteur à la progestérone (PR), du statut du récepteur ERBB2 (positif vs négatif) pour chaque patients, et la durée de vie sans métastase (MFS) pour les patients ne présentant pas de métastase au moment du diagnostic, ont été recherchées. La survie sans métastase est calculée de la date du diagnostic à la date de la première métastase découverte. Le suivi des patients est mesuré à la date de diagnostique à la date de la première récidive (follow-up). La survie est calculée par la méthode de Kaplan Meier et les courbes sont analyses par un test lok rank. Les distributions sont analysées par test de Fisher. La signifîcativité est considérée avec un seuil de 5%. Toutes les analyses sont effectuées en suivant les "REcommendations for tumor MARKer prognostic studies » (REMARK criteria) (50).
Résultats Tests d'invasion cellulaire
Après 24h de traitement, on observe que le NGF et le proNGF augmentent l'invasion cellulaire des lignées cancéreuses CAL33, DU145, PC3 et MDA-MB-231. En revanche, les cellules tumorales FaDu et CAL27 ne répondent à aucun des facteurs de croissance, tandis que l'invasion cellulaire de SQ20B est uniquement induite lors du traitement avec le NGF (figure 1).
Des analyses par Western Blot ont donc ensuite été réalisées pour évaluer les niveaux d'EphA2, sortilme et TrkA dans les cellules répondant au proNGF (CAL33, DU145, PC3 et MDA-MB-231) (figure 2). Ces trois récepteurs sont exprimés dans chacune des lignées cellulaires testées mais CAL33 n'exprime que très faiblement EphA2.
L'implication d'EphA2 sur les effets pro-invasifs du proNGF a été évaluée en utilisant une chambre de Boyden sur les cellules surexprimant EphA2 (DU145, PC3 et MDA-MB- 231). Comme montré dans la figure 3, les siEphA2 abolissent l'invasion induite par le proNGF dans les cellules DU145, PC3 et MDA-MB-231. Ces résultats indiquent qu'EphA2 est impliqué dans l'invasion induite par le proNGF des cellules surexprimant EphA2.
Analyse de l'expression des gènes dans les échantillons tumoraux de sein
De plus, une analyse rétrospective réalisée sur une cohorte de 588 patients en DNA micro-arrays (puces à ADN) permet de corréler l'expression des récepteurs sortiline, TrkA et EphA2 à un mauvais pronostic dans le cancer du sein (Figure 4 A). En effet, l'expression des trois récepteurs induit une diminution significative de la survie sans métastase chez les patients.
La détection des complexes TrkA/EphA2 dans les tumeurs de sein a également été effectuée en utilisant deux tissus microarrays (ref CBA4 (superbiochips) et ref Hbre-Duc 150Sur-01 (US Biomax)) soit un total de 182 échantillons tumoraux (n=182). L'intensité du marquage PLA a été scorée comme absence de signal, très faible/faible et moyen/fort. Les résultats sont présentés sous forme d'un graphique de Kaplan Meier. Les résultats montrent que l'association des récepteurs TrkA et EphA2 révélées par la technique Duolink® est corrélée avec une diminution significative (Log Rank Test, p<0.0001) de la survie globale des patientes. La détection du complexe TrkA/EphA2 est donc corrélée à un mauvais pronostic dans le cancer du sein. Tests d'immunoprécipitation
La formation d'un complexe entre TrkA, EphA2 et la sortiline a été analysée par immunoprécipitation dans les cellules MD A-MB-231 HA-TrkA ainsi que des essais de PLA (Proximity Ligation Assay).
L'association des 3 récepteurs dans le complexe a tout d'abord été mise en évidence en spectrométrie de masse, les protéines immunoprécipitées par un anticorps dirigé contre HA-TrkA ont été identifiées (figure 5). L'analyse en spectrométrie de masse permet de manière irréfutable de démontrer la présence, dans le complexe formé par l'action du proNGF, de TrkA, de la sortiline et d'EphA2.
Les tests d'immunoprécipitation ont été effectués en utilisant des anticorps dirigés contre HA, contre la sortiline et contre EphA2 dans les cellules MD A-MB-231 HA-TrkA (Figure 6).
En l'absence de proNGF, aucun complexe n'a été observé entre ces trois récepteurs. En revanche, avec le traitement au proNGF, la sortiline et EphA2 sont co-immunoprécipités avec TrkA.
En comparaison, en présence de NGF, la liaison sortiline/TrkA n'a été détectée qu'après 30 min de traitement mais la liaison avec EphA2 n'a pas été observée, ni après 5 min de traitement ni après 30 min. Ces résultats ont été confirmés par immunoprécipitation inverse de la sortiline et EphA2. Ainsi, le traitement NGF semble induire une association tardive de TrkA et sortiline mais n'induit pas de liaison avec EphA2. Ces données confirment les résultats trouvés dans la littérature, en ce qu'en présence de NGF, la sortiline agit comme un récepteur d'endocytose dans des modèles de cellules neuronales.
Tests de PLA (Proximity Ligation Assay)
Les essais de PLA effectués sur les cellules MD A-MB-231 ont été réalisés pour confirmer l'interaction entre la sortiline et HA-TrkA et entre HA-TrkA et EphA2 dans les cellules MD A-MB-231 HA-TrkA (résultats non montrés). En l'absence de proNGF, aucun signal PLA n'a été visualisé ce qui suggère que ces récepteurs ne forment pas un complexe préexistant.
En revanche, sous traitement au proNGF, les tests PLA montrent une interaction entre la sortiline et TrkA et entre EphA2 et TrkA ce qui indique que TrkA interagit directement avec la sortiline et EphA2, et ce à une distance inférieure à 40nm (résultats non montrés).
Aucun signal de PLA n'a été détecté dans les essais entre la sortiline et EphA2, ce qui suggère que le proNGF n'induit pas d'interaction directe entre ces deux récepteurs (résultats non montrés).
De plus, les essais PLA dans les cellules MDA-MB-231 , DU145, PC3 natives confirment que TrkA et EphA2 sont engagés dans un complexe sous traitement proNGF de la même façon que dans les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA (résultats non montrés).
En comparaison au proNGF, le NGF n'induit aucun signal de PLA dans les cellules MDA-MB-231, révélant l'absence de complexe récepteur (résultats non montrés).
Tests d'invalidation séquentielle
L'impact d'une invalidation séquentielle de chacun des récepteurs dans la formation de ce complexe a ensuite été analysé.
L'expression de TrkA a été inhibée par des ARN interférents (siTrkA) (Figure 7A). TrkA et EphA2 sont normalement co-immunoprécipités avec la sortiline après 5 min de traitement proNGF. En revanche, les cellules traitées avec un ARN interfèrent anti-TrkA (siTrkA) ne montrent pas d'association entre EphA2 et TrkA avec la sortiline, ce qui indique que la sortiline ne forme pas de complexe avec EphA2 en l'absence de TrkA.
De manière intéressante, dans les cellules exprimant de manière stable les kinase-dead TrkA et dans lesquelles la phosphorylation de TrkA a été abolie (Figure 7B), proNGF continue d'induire l'association TrkA avec la sortiline et EphA2. Ces résultats indiquent que la phosphorylation de TrkA n' est pas nécessaire pour la formation du complexe TrkA/sortiline/EphA2. L'implication de la sortiline dans le complexe sortiline/TrkA/EphA2 a ensuite été évaluée par l'utilisation de la neurotensine qui inhibe par compétition, la liaison du proNGF à la sortiline (figure 7C). En présence de neurotensine, TrkA ne précipite ni la sortiline ni EphA2. Ainsi, la liaison proNGF/sortiline apparaît comme indispensable pour la formation du complexe TrkA/sortiline/EphA2.
Enfin, l'implication d'EphA2 dans l'association du complexe de récepteurs a été étudiée en utilisant un ARN interférant anti-EphA2 (figure 7D).
L'inhibition transitoire d'EphA2 abolit complètement l'expression de cette protéine et par conséquence aucune liaison entre EphA2 et TrkA n'a été observée. Néanmoins, en l'absence d'EphA2, le proNGF induit toujours l'association entre TrkA et la sortiline. Par conséquent, TrkA s'associe à la sortiline après traitement au proNGF de manière indépendante d'EphA2.
Ces résultats démontrent donc les points suivants :
1. TrkA, sortiline et EphA2 ne forment pas un complexe préexistant ;
2. Le complexe TrkA/EphA2 a besoin, comme prérequis, de l' association proNGF/sortiline ;
3. TrkA est nécessaire à la formation de ce complexe de récepteurs, indépendamment de son état de phosphorylation ;
4. L'inhibition d'EphA2 n'altère pas le complexe TrkA/sortiline.
Ces résultats suggèrent que le proNGF induit l'association entre la sortiline et TrkA, provoquant ensuite le recrutement d'EphA2 sur le complexe sortiline/TrkA. Exemple 2 - TrkA et EphA2 sont impliqués différemment dans l'activation des protéines Akt et Src induites par le proNGF.
Sauf indication contraire, les produits, réactifs et cultures cellulaires, sont les mêmes que ceux de l'exemple 1. Les protéines Akt et Src sont impliquées toutes les deux dans l'effet pro-invasif de proNGF. Afin d'identifier le rôle de TrkA et d'EphA2 dans l'activation des protéines Akt et Src, les cellules MDA-MB-231 ont été traitées respectivement avec un inhibiteur de TrkA (K252a), un siR A anti-EphA2 (siEphA2) dont la séquence est présentée dans le tableau 1, un inhibiteur de PI3-K (LY294002) (l'activation d'Akt est en effet sous-jacente à celle de la PI3-K) et un inhibiteur de Src (SKI-1).
Les transfections des siRNA ont été réalisées au moyen de INTERFERin™ selon les instructions du fabricant (POL409-10, Polyplus transfection, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France).
Résultats Comme démontré dans la figure 8 A, le proNGF active à la fois Akt et Src.
L'inhibition de la phosphorylation de TrkA par l'utilisation de K252a abolit l'activation d'Akt mais pas celle de Src. Des résultats similaires ont été obtenus par l'utilisation d'un mutant Kinase-dead de TrkA (figure 8B). Ceci indique que seule l'activation d'Akt, et non celle de Src, est dépendante de la phosphorylation de TrkA.
L'inhibition de l'activation d'Akt avec LY294002 ne modifie pas la phosphorylation de Src. De façon similaire, l'inhibition de Src avec SKI-1 n'affecte pas la phosphorylation d'Akt. Par conséquent, l'activation d'Akt et Src par le proNGF sont deux voies de signalisation différentes.
L'implication d'EphA2 dans l'activation d'Akt et Src a été déterminée par transfection transitoire des cellules avec un ARN interfèrent anti-EphA2 (figure 8C). L'inhibition d'EphA2 diminue la phosphorylation de Src induite par le proNGF mais pas celle de Akt.
Il a donc été démontré que la protéine Akt est activée par le proNGF via la phosphorylation de TrkA tandis que la protéine Src est activée par EphA2 indépendamment de la phosphorylation de TrkA Pour comparaison, les effets du NGF ont été déterminés (figures 8D, E et F).
Le NGF augmente les phosphorylations d'Akt et Src tandis que l'inhibiteur de TrkA, K252a, inhibe cette activation (figure 8D). Ce résultat a été confirmé par l'utilisation d'un mutant Kinase-Dead de TrkA (figure 8E). Les activations de Src et Akt par le NGF ne sont pas interconnectées comme pour le proNGF (figure 8D). Contrairement au proNGF, les effets du NGF sur Src et Akt sont indépendants de EphA2 (figure 8F). L'inhibition d'EphA2 réduit uniquement l'activation basale de phospho-Akt et phospho-Src mais pas la phosphorylation induite par le NGF. En effet, le NGF est capable d'augmenter la phosphorylation d'Akt et Src même dans les cellules où l'expression d'EphA2 est inhibée. Ces résultats montrent que l'activation d'Akt et Src sont en aval de TrkA en présence de NGF.
Ces résultats montrent que l'activation de Src induite par le proNGF requiert à la fois TrkA et EphA2 mais qu'elle est indépendante de la phosphorylation de TrkA. En revanche, l'activation d'Akt induite par le proNGF est dépendante de la phosphorylation de TrkA mais pas d'EphA2. Contrairement au proNGF, la signalisation du NGF requiert uniquement TrkA pour activer Akt et Src sans aucune implication d'EphA2.
Exemple 3 - Le complexe TrkA/EphA2 est impliqué dans le développement et l'agressivité des tumeurs in vivo
Sauf indication contraire, les produits, réactifs et cultures cellulaires, sont les mêmes que ceux de l'exemple 1. Des essais de xénogreffes de lignées tumorales sur des souris immuno déficientes ont été réalisés en utilisant des cellules MDA-MB-231.
Xénogreffes des lignées tumorales en souris immunodéfïcientes.
Expérience 1 :Les souris utilisées sont des femelles SCID de six semaines. Les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA (3x 106) sont injectées en sous cutanée dans le flanc des souris. Les souris sont alors réparties aléatoirement dans les groupes expérimentaux (7 souris dans le groupe témoin et 6 dans les autres). 14 jours après inoculation des cellules, les animaux sont traités à trois reprises avec un intervalle de 3 jours entre chaque injection. Le CEP-701 (Calbiochem) est dissous dans un mélange (40% polyethylene glycol 1000, 10% povidone C30 et 2% alcool benzylique dans l'eau distillée) et injecté en intra péritonéal (10 mg/kg). Les siR A EphA2 (7.5 micro g/souris) sont injectés à proximité de la masse tumorale en utilisant du in vivo jetPEI® (Polyplus transfection) selon les recommandations du fabricant. Le volume tumoral est mesuré selon la formule suivante π/6 x longueur x largeur x (largeur+longueur)/2. Les analyses statistiques sont réalisées en utilisant le test de Mann and Whitney et le logiciel GraphPad Prism 5.01.
Expérience 2 : Les souris utilisées sont des femelles SCID de six semaines. Les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA (3x 106) sont injectées en sous cutanée dans le flanc des souris. Les souris sont alors réparties aléatoirement dans les groupes expérimentaux (10 souris / groupe). 14 jours après inoculation des cellules, les animaux sont traités à cinq reprises avec un intervalle de 3 jours entre chaque injection. Les siRNA EphA2 et TrkA (7.5 micro g/souris) sont injectés à proximité de la masse tumorale en utilisant du in vivo jetPEI® (Polyplus transfection) selon les recommandations du fabricant. Le volume tumoral est mesuré selon la formule suivante π/6 x longueur x largeur x (largeur+longueur)/2. La survie est représentée sous forme d'un graphique de Kaplan Meier.
Résultats
Il avait antérieurement été démontré que le K252a (inhibiteur de TrkA) diminue la croissance des tumeurs xénogreffées avec des cellules MDA-MB-231 surexprimant TrkA (34).
Ici, une dose inférieure d'analogue de K252a (CEP-701 à 10mg/kg) a été utilisée afin de garantir une diminution modérée de la croissance tumorale.
Comme montré sur les figures 9 A et B, le volume tumoral est légèrement mais signifîcativement réduit par le traitement au CEP-701 comparé au contrôle. Le ciblage d'EpbA2 diminue également fortement la croissance des tumeurs xénogreffées. De manière particulièrement intéressante, le traitement combiné CEP-701 /siEphA2 induit une diminution significative de la charge tumorale en comparaison de CEP-701 seul ou de siEphA2 seul. Ces résultats indiquent que TrkA et EphA2 coopèrent in vivo pour augmenter la croissance tumorale. Pour valider l'implication de TrkA dans le développement tumoral, une seconde expérimentation animale a été menée en remplaçant le CEP-701 par un siRNA dirigé contre TrkA qui invalide spécifiquement son expression. Les résultats sont montrés en terme de survie. Les survies médianes sont respectivement de 40 jours dans le contrôle, 53 jours en présence de siTrkA, 49 jours en présence de si EphA2 et 57,5 en présence de siTrkA et si EphA2. Ces résultats sont signifîcativement différents comme l'indique le test Log Rank (P= 0,0022). Ces résultats indiquent que le CEP-701 et un siRNA dirigé contre TrkA ont les mêmes effets sur la croissance tumorale et confirment les observations réalisées en western blot sur les cellules tumorales. L'ensemble des données montre ainsi que l'inhibition de croissance observée par le traitement au CEP-701 est dépendante de ses effets sur le récepteur TrkA.
Exemple 4 - Un traitement combinant un inhibiteur de TrkA (lestaurtinib) et un inhibiteur de EphA2 (EphrinAl-Fc) diminue l'invasion des cellules cancéreuse de sein
Sauf indication contraire, les produits, réactifs et cultures cellulaires, sont les mêmes que ceux de l'exemple 1.
Le test d'invasion est réalisé sur des cellules MDA-MB-231. Les cellules non stimulées de proNGF servent de contrôle et déterminent une invasion basale de 100% (barre blanche à la figure 10). Pour les traitements, les concentrations suivantes sont appliquées : 0.5 nM proNGF N.C., 10 nM lestaurtinib, Ephrine Al-Fc (1 microg/ml), DMSO l/1000ième vol/vol pour les conditions non stimulées (Non stim). Pour les statistiques, les barres d'erreurs représentent l'écart type. * p<0.001 pour la combinaison de traitement lestaurtinib+ Ephrine Al-Fc vs les traitements seuls (lestaurtinib ou Ephrine Al-Fc) non stimulées. ** p<0.0065 pour la combinaison de traitement lestaurtinib + Ephrine Al-Fc vs les traitements au lestaurtinib en présence de proNGF ; p<0.002 pour la combinaison de traitement lestaurtinib+ Ephrine Al-Fc vs les traitements au Ephrine Al-Fc en présence de proNGF. Résultats
Comme visible à la figure 10, la combinaison lestaurtinib-Ephrine Al Fc diminue de manière significative l'invasion cellulaire, et est plus efficace que les traitements dans lesquels un unique inhibiteur est utilisé (lestaurtinib seul ou Ephrine Al Fc seul). Exemple 5 - Le complexe TrkA/EphA2 est également retrouvé dans plusieurs types de tumeurs Sauf indication contraire, les produits, réactifs et cultures cellulaires, sont les mêmes que ceux de l'exemple 1.
Proximity Ligation Assay sur échantillons tumoraux de cavité buccale paraffinées. Les échantillons tumoraux de cavité buccale de stade T4 (NO, MO) avec infiltration osseuse (obtenus auprès du service anatomopatho logique du CHRU de Lille) sont déparaffïnées par des bains de ClaRal (dérivé du xylène) (1 x 12 h et 1 x 5 h). Les coupes sont ensuite réhydratées par des bains successifs: ClaRal/éthanol 100%(1 : 1) (1 x 5 min), éthanol 100% (2 x 5 min), éthanol 96% (2 x 5 min), éthanol 70% (2 x 5 min), H20 distillée (1 x 5 min). Le blocage des péroxydases endogènes est réalisé par une solution de péroxyde d'hydrogène fournie dans le kit Duolink In Situ® Détection Reagents Brightfield (DUO92012 ; Sigma-Aldrich) 10min à 20°C. Les coupes ont ensuite été lavées au TBS (20 mM Tris base, 137 mM NaCl) (2 x 5 min) puis incubées avec une solution de blocage fournit dans le kit Duolink® (Blocking solution ; lh ; 20°C) Les échantillons sont ensuite incubés les anticorps primaires anti-TrkA dilué au 1/25 ème (ANT-018 ; Alomone Labs) et anti-EphA2 dilué au l/50ème (AF3035 ; RD Systems) dans la solution de blocage à 4°C sur la nuit. Les coupes ont ensuite été lavées trois fois avec la solution A (0.01 M Tris, 0.15 M NaCl , 0.05%) Tween 20) pendant 5 min puis incubées pendant 1 h à 37 °C avec les sondes PLA oligo -marquées anti-lapin « plus » (DUO92006 ; Sigma-Aldrich) et anti-chèvre « moins » (DUO92002 ; Sigma-Aldrich) diluées au 1/5 ème dans une solution de PB S IX 1%SVF (Phosphate Buffered Saline : 2,7 mM KC1, 8 mM Na2HP04, 1,8 mM KH2P04, 137 mM NaCl, pH 7,4 ; 1% Sérum de Veau Fœtal). L'étape de ligation est réalisée selon les recommandations du fournisseur. Après deux lavages de 5 min avec la solution A, l'amplification des sondes est effectuée par une polymérase (l/80ème dans tampon d'amplification IX ; 2h 37°C). La détection du signal et la contre coloration sont opérées selon le protocole établi par le fournisseur. Les coupes sont ensuite lavées trois fois pendant 5 min dans l'eau distillée puis déshydratées par des bains successifs d'éthanol 70%> (2 x 5 min), d'éthanol 96% (2 x 5 min), d'éthanol 100% (2 x 5 min), de ClaRal/éthanol 100% (1 : 1) (1 x 5 min) et de ClaRal (2 x 10 min). Les lames sont séchées puis le montage entre lame et lamelle est effectué avec le milieu de montage Duolink® (DUO92012 ; Sigma-Aldrich). Les images du PLA (points marron) sont obtenues grâce à un microscope couplé à une caméra (objectif 40X, microscope Eclipse Ti ; Nikon, France) puis analysées avec le logiciel NIS-Elements BR de Nikon. Un point marron reflète une interaction entre les deux protéines (distantes de moins de 40 nm ; méthode quantitative).
Résultats
L'expression de TrkA et EphA2 a été détectée par coloration immunohistochimique et l'association TrkA/Epha2 a été détectée par PLA (Duolink®) dans une tumeur de la cavité buccale. Alors que l'épithélium adjacent et les masses tumorales présentent un marquage de TrkA et EphA2, seule la masse tumorale est positive (marquage punctiforme) pour le PLA (résultats non montrés). Ceci met en évidence un mécanisme d'action de TrkA et EphA2 similaire dans les tumeurs de la cavité buccale que dans les tumeurs du sein.
Il a donc été ici mis en évidence par les expériences in vitro et in vivo que TrkA et EphA2 agissent sur l'invasion et la croissance des cellules cancéreuses, justifiant de l'intérêt d'une combinaison entre un inhibiteur de TrkA, et un inhibiteur de EphA2 pour lutter contre ces formes de cancer solide.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Inhibiteur de EphA2 pour son utilisation dans le traitement de cancer solide traité par un inhibiteur de TrkA, dans lequel ledit inhibiteur de TrkA est un antagoniste de TrkA, un inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation et dans lequel ledit inhibiteur de EpbA2 est un antagoniste de EphA2, un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2, ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation.
2. Inhibiteur de TrkA pour son utilisation dans le traitement de cancer solide traité par un inhibiteur de EpbA2, dans lequel ledit inhibiteur de TrkA est un antagoniste de TrkA, un inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation et dans lequel ledit inhibiteur de EpbA2 est un antagoniste de EphA2, un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2, ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation.
3. Composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de TrkA, un inhibiteur de EpbA2 et au moins un support pharmaceutiquement acceptable, dans lequel ledit inhibiteur de TrkA est un antagoniste de TrkA, un inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation et dans lequel ledit inhibiteur de EpbA2 est un antagoniste de EphA2, un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2, ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation.
4. Composition pharmaceutique selon la revendication 3 pour son utilisation dans le traitement de cancer solide.
5. Produit de combinaison comprenant :
- un inhibiteur de TrkA, et
- un inhibiteur de EpbA2, dans lequel ledit inhibiteur de TrkA est un antagoniste de TrkA, un inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation et dans lequel ledit inhibiteur de EphA2 est un antagoniste de EphA2, un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2, ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation.
6. Produit de combinaison selon la revendication 5 pour son utilisation dans le traitement de cancer solide.
7. Méthode de pronostic de la survie d'un patient souffrant d'un cancer solide comprenant une étape de détection de l'expression de TrkA et de EphA2 au sein d'un échantillon biologique du patient, la co-expression de TrkA et de EphA2 étant associée à un mauvais pronostic de survie du patient.
8. Méthode selon la revendication 7, dans laquelle l'étape de détection de l'expression de TrkA et de EphA2 est réalisée par la détection d'un complexe TrkA/EphA2.
9. Méthode selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle l'échantillon biologique provient d'une biopsie d'une tumeur du patient.
10. Inhibiteur de EpbA2 pour son utilisation selon la revendication 1, inhibiteur de TrkA pour son utilisation selon la revendication 2, composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 4 produit de combinaison pour son utilisation selon la revendication 6, ou méthode selon l'une des revendications 7 à 9, dans lequel ledit cancer solide est choisi parmi le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer du colon, le cancer de la langue, le cancer de la sphère oro-pharyngée, le cancer de la thyroïde, le cancer du pancréas, le neuroblastome, le gliome, et le cancer de la peau.
11. Inhibiteur de EpbA2 pour son utilisation selon la revendication 1 , inhibiteur de TrkA pour son utilisation selon la revendication 2, composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 4, produit de combinaison pour son utilisation selon la revendication 6, ou méthode selon l'une des revendications 7 à 9, dans lequel ledit cancer solide est le cancer du sein, le cancer de la prostate ou le cancer de la sphère oro -pharyngée.
12. Inhibiteur de EpbA2 pour son utilisation selon la revendication 1, inhibiteur de TrkA pour son utilisation selon la revendication 2, composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 4, produit de combinaison pour son utilisation selon la revendication 6, ou méthode selon l'une des revendications 7 à 9, dans lequel ledit cancer solide est le cancer du sein.
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