EP3087380A1 - Procédé de détermination du grade d'agressivite cellulaire de cellules cancereuses ou de cellules souches cancereuses - Google Patents

Procédé de détermination du grade d'agressivite cellulaire de cellules cancereuses ou de cellules souches cancereuses

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EP3087380A1
EP3087380A1 EP14831029.5A EP14831029A EP3087380A1 EP 3087380 A1 EP3087380 A1 EP 3087380A1 EP 14831029 A EP14831029 A EP 14831029A EP 3087380 A1 EP3087380 A1 EP 3087380A1
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EP
European Patent Office
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cells
cell
determination method
sensor
dissociation
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14831029.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Arnaud Pothier
Claire JEROME
Pierre Blondy
Fabrice Lalloue
Serge Battu
Marie-Odile Jauberteau
Philippe Cardot
Christophe Lautrette
Stéphanie GIRAUD
Christophe MORAND DU PUCH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oncomedics
Universite de Limoges
Original Assignee
Oncomedics
Universite de Limoges
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Filing date
Publication date
Application filed by Oncomedics, Universite de Limoges filed Critical Oncomedics
Publication of EP3087380A1 publication Critical patent/EP3087380A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N22/00—Investigating or analysing materials by the use of microwaves or radio waves, i.e. electromagnetic waves with a wavelength of one millimetre or more
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
    • G01N27/22—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating capacitance
    • G01N27/221—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating capacitance by investigating the dielectric properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the cell aggression rank of cancer cells or cancer stem cells.
  • grade will be used for the level of aggressiveness of the tumor cell and the term “stage” for the level of aggressiveness and organization at the tissue level.
  • Cancerous tumors are known to fall into several categories based on the TNM classification, from the least aggressive tumor stage to the most aggressive tumor stage. In the case of colorectal cancer, there are five (5) stages:
  • Stage 0 the tumor is superficial and does not invade the submucosa, the lymph nodes are not affected, no distant metastasis.
  • Stage I the tumor invades the submucosa or the muscular layer of the wall of the colon or rectum, the lymph nodes are not affected, no metastasis.
  • Stage II The cancer cells have crossed several layers of the wall of the colon or rectum, the lymph nodes are not affected, no distant metastasis.
  • Stage III The cancer cells have invaded the lymph nodes close to the tumor.
  • Stage IV The cancer has spread beyond the colon or rectum to distant organs.
  • the most aggressive stage is the one that corresponds to the formation of metastases.
  • the visual examination consists of analyzing abnormalities of cell morphology, which is a laborious and time-consuming method, which can not be automated in any case.
  • the resulting cost is necessarily very high. It is therefore understandable that there may be a crucial need for an alternative method.
  • This cell-scale dielectric spectroscopy analysis is based on the use of the resonant frequency difference of these micro-sensors when they are blank of any cell and when a cell or a few cells rest on said micro-sensor. -sensor. It should be noted that this analysis does not require any prior labeling of the cells.
  • the electromagnetic waves of the microwave spectrum used to interrogate the cells, lead to a discriminating result because the cancer cells studied have a high permittivity with respect to these electromagnetic waves of the microwave spectrum. Indeed, the conductivity and permittivity of a normal cell are lower than that of a cancer cell.
  • the difficulty of implementing the method lies in the fact that the measurement using electromagnetic micro-sensors operating in a resonator requires a very limited number of cells.
  • the object of the present invention to provide a method for determining the degree of cellular aggressiveness of cancer cells or of cancer stem cells which meets the needs of number analyzes.
  • the invention is directed to a method for determining in vitro the degree of cell aggression of cancer cells or of cancer stem cell detection in a cell sample originating from a solid tissue suspected of being cancerous, comprising at least the steps following:
  • the method of analysis on resonant electromagnetic biosensors requires the preparation of the cells from a sample of live tissue removed. This sample must be stored between 2 and 8 ° C in a suitable medium and is known for this purpose in particular a composition sold under the name OncoWave-Via, the company Oncomédics (France). Indeed, it is necessary to be able to dissociate the cells in order to obtain individualized cells because the biosensors aim for measurements on a single cell scale or even on the scale of a few cells, the number being less than 10 to give an order of idea.
  • the dissociation step preferably consists in producing at least one mechanical dissociation and one enzymatic dissociation.
  • the mechanical dissociation consists in particular of cutting the sample taken into tissue fragments of 1 to 3 mm 3, preferably less than 2
  • the enzymatic dissociation is preferably carried out using at least two enzymes. It may consist in immersing these fragments in a dissociation solution, such as the solution marketed under the name OncoWava-Diss, an Oncomédics company (France).
  • the enzymatic dissociation is carried out using at least:
  • collagenase type II This enzyme cleaves the peptide bonds of collagen proteins by degrading the extracellular matrix and releasing the cells in the surrounding medium, and / or
  • the solution is then preferably filtered using a 40 ⁇ cell sieve in order to eliminate the tissue fragments undigested by the enzymatic action.
  • An inhibitory solution in particular trypsin, makes it possible to stop the dissociation and preserve the cells and more particularly to avoid degrading the membrane.
  • the filtrate is then centrifuged to recover the cell pellet.
  • the heterogeneous tumor cells should be sorted according to their intrinsic physico-chemical properties, in particular size, density, shape or deformability. It is necessary that this sorting be obtained without fluorescent or magnetic immunolabeling, capable of modifying the cell activation state.
  • the sorting is therefore preferably carried out by the SdFFF method (Fractionation by coupling flux force of sedimentation).
  • This method and the device necessary for its implementation are amply described in the thesis of September 28, 2007, Ga ⁇ lle BEGAUD, whose subject is: "Splitting by flux flux coupling of sedimentation: applications to cell sorting in the field of oncology” , p 84-92 and in EP 1 679 124.
  • the method comprises a step c. calibration of at least one microwave electromagnetic sensor resonant of its own resonance frequency.
  • the dielectric permittivity sensors used are resonant electromagnetic biosensors with planar geometries and millimeter dimensions. These sensors are made using the substrates used in microelectronics, including silica plates of 500 ⁇ thick. A thin metal film of gold, of a very small thickness of 4 to 5 ⁇ in thickness to specify the range of values, defined by chemical etching makes it possible to realize the resonant circuit, associated inductance in parallel with a capacitor, provided with inter-digitized electrodes. Gold is used for its excellent electrical conductivity, for its stability against oxidation and for its biocompatibility.
  • the inter-digit spaces of the circuit receive said cells.
  • Biocompatible polymer coatings may be deposited on the sensors around their electrodes in order to define microscopically sized analysis chambers for receiving the cells to react with said sensor.
  • the resonance shift is related to the number of cells present, the volume of these cells and the dielectric properties of these cells to define a reproducible value.
  • the volume of cells can be determined by commercially available means as a BECKMAN Coulter counter.
  • sensors having a single fixed resonance frequency in a range between 1 and 40 GHz, preferably between 5 and 14 GHz.
  • the periodicity of the measurements is of the order of 500 MHz to 1 GHz.
  • Such sensors are each provided in a known manner with a tuning component, for example a diode or a variable capacitor or a bank of switchable capacitors, connected in parallel with the capacitance of the resonator, said tuning component being supplied with an external voltage.
  • a tuning component for example a diode or a variable capacitor or a bank of switchable capacitors
  • the frequency used can thus be adjusted continuously to determine the properties of the cells analyzed over a continuous spectrum of frequencies.
  • the determination of the properties of the cells is preferably carried out in the manner now described.
  • the biosensor responses do not determine whether it is cytoplasm, protein concentrations, kernel properties or organelles that are the cause but there is a determination of the average dielectric properties of the cells that have been sorted to determine a homogeneous population.
  • the determination of the cell permittivity is established from a mathematical model in which the cell is assimilated to a uniform dielectric particle disposed between two electrodes.
  • Each cell thus acts as an additional capacitive element C ceU which increases the initial capacitive value of the sensor.
  • the resonator LC sees its frequency vary from f 0 , sensor without cell, to fi, sensor with at least one cell:
  • the permittivity of the cell is thus determined by the following calculation formula:
  • the dielectric permittivity of the cells is thus determined essentially from the following parameters: number of cells analyzed, volume of the cells and frequency shift between the resonant frequency of the biosensor and the resonance frequency measured when the cells have been deposited in the electrodes .
  • fluidic micro-channels are provided which make it possible to present the cells individually to the biosensors. These cells are transported in a suitable support medium to the biosensor detection electrodes. The population is analyzed dynamically in the manner of a flow cytometer.
  • kits for the in vitro determination of the cell aggression grade of cancer cells or the detection of cancer stem cells in a cell sample from a solid tissue suspected of being cancerous comprising at least:
  • compositions of the enzymatic dissociation medium of the biological sample consisting in particular of organic and inorganic nutrients in the form of salts, amino acids, fatty acids, peptides, proteins and lipoproteins, carbohydrates of buffer systems for maintaining pH and trace metals and enzymes
  • composition for accommodating the cells and presenting them to the at least one biosensor.
  • the method according to the present invention thus makes it possible to determine the degree of cellular aggressiveness of cancer cells or of cancer stem cell detection in a cell sample originating from a solid tissue, without modification of the cells by a labeling, in particular without fluorescent or fluorescent immunoblotting. magnetic, capable of modifying the cell activation state.

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Abstract

L'objet de l'invention est un procédé de détermination in vitro du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide soupçonné d'être cancéreux, comprenant au moins les étapes suivantes: a. Dissociation de l'amas cellulaire constituant l'échantillon en une suspension de cellules isolées intègres et viables, b. Tri macroscopique des cellules pour obtenir des sous‐populations homogènes, c. Calibration d'au moins un capteur électromagnétique micro‐ondes résonnant à sa fréquence de résonnance propre, d. Présentation des cellules dissociées et triées selon les étapes a. et b. sur le au moins un capteur préalablement calibré, e. Interrogation du au moins un capteur et détermination de la nouvelle fréquence de résonnance dudit au moins un capteur ayant reçu les cellules, f. Calcul de la variation de permittivité diélectrique globale des cellules en fonction de la variation de la fréquence de travail, qui constitue leur signature électromagnétique. Le tri macroscopique est sans marquage préalable et basé sur les propriétés intrinsèques des cellules. L'invention couvre aussi un kit adapté pour la mise en œuvre du procédé.

Description

PROCEDE DE DETERMINATION DU GRADE D'AGRESSIVITE CELLULAIRE DE CELLULES CANCEREUSES OU DE CELLULES SOUCHES CANCEREUSES
La présente invention concerne un procédé de détermination du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de cellules souches cancéreuses.
En dehors de l'examen visuel des cellules, les praticiens sont relativement démunis pour déterminer le grade d'agressivité de cellules cancéreuses.
II n'existe pas actuellement de marqueurs liés à l'agressivité de cellules cancéreuses, du moins pas de marqueurs de certitude permettant de déterminer l'agressivité de cellules cancéreuses.
Pour la suite de la description, on utilisera le terme "grade" pour le niveau d'agressivité de la cellule tumorale et le terme "stade" pour le niveau d'agressivité et d'organisation au niveau tissulaire.
On sait que les tumeurs cancéreuses sont classées suivant plusieurs catégories reposant sur la classification TNM, du stade tumoral le moins agressif au stade tumoral le plus agressif. Dans le cas du cancer colorectal, il existe cinq (5) stades :
- Stade 0 : la tumeur est superficielle et n'envahit pas la sous-muqueuse, les ganglions lymphatiques ne sont pas atteints, pas de métastase à distance.
- Stade I : la tumeur envahit la sous-muqueuse ou la couche musculaire de la paroi du côlon ou du rectum, les ganglions lymphatiques ne sont pas atteints, pas de métastase.
- Stade II : les cellules cancéreuses ont traversé plusieurs couches de la paroi du côlon ou du rectum, les ganglions lymphatiques ne sont pas atteints, pas de métastase à distance.
- Stade III : les cellules cancéreuses ont envahi les ganglions lymphatiques proches de la tumeur.
- Stade IV : le cancer s'est propagé au-delà du côlon ou du rectum vers des organes éloignés.
Le stade le plus agressif est celui qui correspond à la formation de métastases. De ce fait, l'examen visuel consiste à analyser les anomalies de morphologie des cellules, ce qui est une méthode pour le moins laborieuse, très chronophage qui ne peut en aucun cas être automatisée. Le coût résultant est nécessairement très élevé. On comprend donc qu'il puisse y avoir un besoin crucial d'un procédé alternatif.
Une publication "Label-free colorectal cancer line bio-sensing using RF resonator" XLIM UMR 7252 CNRS/ Université de Limoges, Homéostasie Cellulaire et Pathologies EA3842, Université de Limoges, ONCOMEDICS Juin 2013, mentionne l'utilisation de micro-capteurs électromagnétiques micro-ondes, résonnants, permettant de déterminer l'agressivité de cellules cancéreuses à partir de valeurs de mesure des propriétés diélectriques des cellules grâce à ces micro-capteurs.
Cette analyse par spectroscopie diélectrique à l'échelle de la cellule est basée sur l'utilisation de la différence de fréquence de résonnance de ces micro-capteurs lorsqu'ils sont vierges de toute cellule et lorsqu'une cellule ou quelques cellules reposent sur ledit micro-capteur. On note que cette analyse ne requiert aucun marquage préalable des cellules.
II faut indiquer que les ondes électromagnétiques du spectre micro-ondes, utilisées pour interroger les cellules, conduisent à un résultat discriminant du fait que les cellules cancéreuses étudiées présentent une forte permittivité vis-à-vis de ces ondes électromagnétiques du spectre micro-ondes. En effet, la conductivité et la permittivité d'une cellule normale sont inférieures à celle d'une cellule cancéreuse.
Ces variations de la fréquence de résonnance et donc des réponses des micro-capteurs sont notamment liées à la taille des cellules, au volume et à la permittivité du contenu intracellulaire, à la concentration en ions significatifs comme les ions potassium, sodium, calcium, et à la quantité de chromatine dans le noyau par rapport au volume cellulaire.
Néanmoins, la difficulté de mise en œuvre du procédé réside dans le fait que la mesure à l'aide de micro-capteurs électromagnétiques fonctionnant en résonateur nécessite un nombre de cellules très limité.
Or, tout procédé de détermination du grade d'agressivité d'une cellule avec une visée industrielle et commerciale nécessite une reproductibilité, une qualité et des mises en œuvre simples et rapides en comparaison avec un procédé de laboratoire de recherche. C'est le but de la présente invention qui propose un procédé de détermination du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de cellules souches cancéreuses qui répond aux besoins d'analyses en nombre. A cet effet l'invention vise un procédé de détermination in vitro du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide soupçonné d'être cancéreux, comprenant au moins les étapes suivantes :
a. Dissociation de l'amas cellulaire constituant l'échantillon en une suspension de cellules isolées, intègres et viables, b. Tri macroscopique des cellules pour obtenir des sous-populations homogènes,
c. Calibration d'au moins un capteur électromagnétique micro-ondes résonnant à sa fréquence de résonnance propre, d. Présentation des cellules dissociées et triées selon les étapes a. et b. sur le au moins un capteur préalablement calibré, e. Interrogation du au moins un capteur et détermination de la nouvelle fréquence de résonnance dudit au moins un capteur ayant reçu les cellules,
f. Calcul de la variation de permittivité diélectrique globale des cellules en fonction de la variation de la fréquence de travail, qui constitue leur signature électromagnétique.
L'invention est maintenant décrite en détail.
Le procédé d'analyse sur des biocapteurs électromagnétiques résonnants nécessite la préparation des cellules à partir d'un échantillon de tissu vivant prélevé. Cet échantillon doit être conservé entre 2 et 8°C, dans un milieu adapté et on connaît à cet effet notamment une composition commercialisée sous la dénomination OncoWave-Via, de la société Oncomédics (France). En effet, il faut pouvoir dissocier les cellules afin d'obtenir des cellules individualisées car les biocapteurs visent des mesures à l'échelle monocellulaire voire à l'échelle de quelques cellules, le nombre étant inférieur à 10 pour donner un ordre d'idée. L'étape de dissociation consiste préférentiellement à réaliser au moins une dissociation mécanique et une dissociation enzymatique.
La dissociation mécanique consiste en particulier à couper l'échantillon prélevé en des fragments tissulaires de 1 à 3 mm3 environ préférentiellement d'une taille inférieure à 2 La dissociation enzymatique est préférentiellement réalisée à l'aide d'au moins deux enzymes. Elle peut consister à plonger ces fragments dans une solution de dissociation, telle que la solution commercialisée sous la dénomination OncoWava-Diss, société Oncomédics (France). Préférentiellement la dissociation enzymatique est réalisée à l'aide d'au moins :
- la collagénase de type II : Cette enzyme assure un clivage des liaisons peptidiques des protéines de collagène en dégradant la matrice extracellulaire et en libérant les cellules dans le milieu environnant, et/ou
- la trypsine qui est une endoprotéase aspécifique qui dégrade indifféremment les protéines qu'elle rencontre et renforce l'action de la collagénase. Cette endoprotéase assure aussi l'individualisation des cellules à partir des éventuels amas de cellules non individualisées, générés par la collagénase, ceci en coupant les liaisons directes cellule-cellule.
Une telle dissociation est obtenue en 1 à 2 heures pour donner un ordre d'idée.
La solution est ensuite préférentiellement filtrée à l'aide d'un tamis cellulaire de 40μιη afin d'éliminer les fragments tissulaires non digérés par l'action enzymatique.
Une solution inhibitrice, notamment de la trypsine, permet de stopper la dissociation et de préserver les cellules et plus particulièrement d'éviter de dégrader la membrane.
Le filtrat est ensuite centrifugé afin de récupérer le culot cellulaire.
On note que 80% des cellules environ sont ainsi conservées vivantes.
Une fois les cellules isolées, après l'étape de dissociation, il convient de trier les cellules tumorales hétérogènes en fonction de leurs propriétés physico-chimiques intrinsèques, en particulier la taille, la densité, la forme ou la déformabilité. Il est nécessaire que ce tri soit obtenu sans marquage immunologique fluorescent ou magnétique, susceptible de modifier l'état d'activation cellulaire.
Le tri est donc préférentiellement réalisé par la méthode SdFFF (Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation). Cette méthode et le dispositif nécessaire pour sa mise en œuvre sont amplement décrits dans la thèse du 28 septembre 2007, Gaëlle BEGAUD, ayant pour sujet : "Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation : applications au tri cellulaire dans le domaine de l'oncologie", p 84-92 et dans le brevet EP 1 679 124.
Les populations de cellules conservent leur viabilité et leur intégrité.
Les fractions cellulaires obtenues sont homogénéisées. Après cette étape b. de tri macroscopique des cellules, le procédé comprend une étape c. de calibration d'au moins un capteur électromagnétique micro-ondes résonnant de sa fréquence de résonnance propre.
Les capteurs de permittivité diélectrique utilisés sont des biocapteurs électromagnétiques résonnants de géométries planaires et de dimensions millimétriques. Ces capteurs sont réalisés en recourant aux substrats utilisés en microélectronique, notamment des plaques de silice de 500 μιη d'épaisseur. Un mince film métallique d'or, d'une épaisseur très faible de 4 à 5 μιη d'épaisseur pour préciser la plage de valeurs, défini par gravure chimique permet de réaliser le circuit résonnant, inductance associée en parallèle avec une capacité, muni d'électrodes inter-digitées. L'or est utilisé pour son excellente conductivité électrique, pour sa stabilité face à l'oxydation et pour sa biocompatibilité.
Les espaces inter-digités du circuit reçoivent lesdites cellules.
Des revêtements polymères biocompatibles peuvent être déposés sur les capteurs, autour de leurs électrodes afin de délimiter des chambres d'analyse, de taille microscopique destinées à recevoir les cellules afin qu'elles réagissent avec ledit capteur.
En fonction de la géométrie du capteur, il convient de déterminer la fréquence de résonnance pour laquelle le biocapteur présente un maximum d'absorption de puissance des ondes électromagnétiques du spectre micro-ondes utilisées qui l'interroge.
On constate que lorsque des cellules sont présentes sur le biocapteur, la valeur de cette fréquence de résonnance est modifiée.
Le décalage de la résonnance est rapporté au nombre de cellules en présence, au volume de ces cellules et aux propriétés diélectriques de ces cellules pour définir une valeur reproductible.
Le volume des cellules peut être déterminé par des moyens disponibles dans le commerce comme un compteur de la marque BECKMAN Coulter.
En utilisant plusieurs capteurs opérant à différentes fréquences, on peut alors reconstituer une signature électromagnétique, du type cellulaire, analysé par les capteurs.
Ainsi, il est possible de recourir à des capteurs ayant une fréquence de résonnance fixe, unique, dans une plage comprise entre 1 et 40 GHz, de préférence entre 5 et 14 GHz. La périodicité des mesures est de l'ordre de 500 MHz à 1 GHz.
Néanmoins, pour obtenir une signature plus précise, plus complète, il est possible de recourir à des capteurs électromagnétiques ayant des moyens de réglages de leur fréquence de résonance dans une plage donnée. De tels capteurs sont munis chacun de façon connue d'un composant d'accord, par exemple une diode ou une capacité variable ou encore une banque de capacités commutables, montée en parallèle avec la capacité du résonateur, ledit composant d'accord étant alimenté avec une tension externe.
La fréquence utilisée peut ainsi être ajustée en continu pour déterminer les propriétés des cellules analysées sur un spectre continu de fréquences.
La détermination des propriétés des cellules est préférentiellement réalisée de la façon maintenant décrite.
Au moins une cellule étant déposée dans les espaces inter-digités du circuit, il y a modification de la réponse du capteur résonnant.
Les réponses du biocapteur ne permettent pas de déterminer si ce sont le cytoplasme, les concentrations en protéines, les propriétés propres du noyau ou les organelles qui en sont la cause mais il y a détermination des propriétés diélectriques moyennes des cellules qui ont été triées pour déterminer une population homogène.
La détermination de la permittivité cellulaire est établie à partir d'un modèle mathématique dans lequel la cellule est assimilée à une particule diélectrique uniforme disposée entre deux électrodes.
Chaque cellule agit ainsi comme un élément capacitif supplémentaire CceU qui augmente la valeur capacitive initiale du capteur.
Dans le cas de plusieurs cellules, il y a cumul.
Le résonateur LC voit sa fréquence varier de f0, capteur sans cellule, à fi, capteur avec au moins une cellule :
1
Avec C = C0 + ∑ Ccell et C0 et C qui représentent les capacités équivalentes d'un capteur sans cellule et avec cellule, on peut déterminer la capacité totale par la formule :
∑ Cceii = NceU . CceU = C0 (f0 - fi ){ f0 + j) I fi
Nceu représente le nombre de cellules sur le biocapteur. Pour tenir compte du volume des cellules VceU et si l'on poursuit avec le modèle qui prévoit que chaque cellule complète l'espace Wwc entre deux électrodes alors la permittivité est donnée par la formule suivante, ε0 étant la permittivité effective du vide :
£cell = {Ccell■ WIDC) I {ε0 . Vcell . Ncell )
La permittivité de la cellule est ainsi déterminée par la formule de calcul suivante :
eceii = Co■ Wtlc (( o - fi)( f0 + fi) I ifi - ε0 . Vcell . Ncell )
Cette formule requiert une puissance de calcul très limitée comparée à celle recourant à des simulations avec des calculs par éléments finis. Les caractérisations sont donc obtenues plus rapidement et plus facilement qu'avec un calcul basé sur une modélisation par éléments finis.
On peut donc ainsi déterminer la permittivité des cellules d'un même type et obtenir une signature spécifique correspondant aux différents grades d'agressivité cellulaire en analysant un échantillon prélevé, conservé vivant.
On détermine ainsi la permittivité diélectrique des cellules essentiellement à partir des paramètres suivants : nombre de cellules analysées, volume des cellules et décalage de fréquence entre la fréquence de résonnance propre du biocapteur et la fréquence de résonnance mesurée lorsque les cellules ont été déposées dans les électrodes.
Il est aussi possible de prévoir des analyses avec des capteurs de types différents, non plus de façon statique (cellules déposées ou maintenues figées sur le biocapteur) mais de façon dynamique (cellules se déplaçant dans un flux).
Dans ce cas, il est prévu des micro-canaux fluidiques qui permettent de présenter les cellules individuellement aux biocapteurs. Ces cellules sont transportées dans un milieu support approprié jusqu'aux électrodes de détection des biocapteurs. La population est analysée de façon dynamique à la manière d'un cytomètre en flux.
Il est aussi prévu un kit associé pour la détermination in vitro du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide soupçonné d'être cancéreux, comprenant au moins :
- Solutions de conservation et de transport de l'échantillon biologique après prélèvement constituées notamment de nutriments organiques et inorganiques sous forme de sels, d'acides aminés, d'acides gras, de peptides, de protéines et lipoprotéines, de carbohydrates de systèmes tampon pour le maintien du pH et d'éléments trace métalliques.
- Compositions du milieu de dissociation enzymatique de l'échantillon biologique constituées notamment de nutriments organiques et inorganiques sous forme de sels, d'acides aminés, d'acides gras, de peptides, de protéines et lipoprotéines, de carbohydrates de systèmes tampon pour le maintien du pH et d'éléments trace métalliques et d'enzymes
- Consommables pour le tri cellulaire macroscopique de l'échantillon biologique par
Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation, SdFFF,
- Au moins un biocapteur,
- Composition pour accueillir les cellules et les présenter au au moins un biocapteur.
Le procédé selon la présente invention permet ainsi de déterminer le grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide, sans modification des cellules par un marquage notamment sans marquage immunologique fluorescent ou magnétique, susceptible de modifier l'état d'activation cellulaire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination in vitro du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide soupçonné d'être cancéreux, comprenant au moins les étapes suivantes :
a. Dissociation de l'amas cellulaire constituant l'échantillon en une suspension de cellules isolées intègres et viables, b. Tri macroscopique des cellules pour obtenir des sous-populations homogènes,
c. Calibration d'au moins un capteur électromagnétique micro-ondes résonnant à sa fréquence de résonnance propre, d. Présentation des cellules dissociées et triées selon les étapes a. et b. sur le au moins un capteur préalablement calibré, e. Interrogation du au moins un capteur et détermination de la nouvelle fréquence de résonnance dudit au moins un capteur ayant reçu les cellules,
f. Calcul de la variation de permittivité diélectrique globale des cellules en fonction de la variation de la fréquence de travail, qui constitue leur signature électromagnétique.
2. Procédé de détermination selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape a. de dissociation comprend au moins une dissociation mécanique et une dissociation enzymatique.
3. Procédé de détermination selon la revendication 2, caractérisé en ce que la dissociation mécanique consiste à réaliser des fragments tissulaires d'une taille inférieure à 2 mm3.
4. Procédé de détermination selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la dissociation enzymatique est réalisée avec au moins deux enzymes.
5. Procédé de détermination selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la dissociation enzymatique est réalisée avec la collagénase et/ou la trypsine.
6. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le tri macroscopique de l'étape b. est réalisé par Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation.
7. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise plusieurs capteurs travaillant à différentes fréquences.
8. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise des capteurs à fréquence de résonnance ajustable de façon à limiter le nombre de capteurs à utiliser.
9. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on travaille dans une bande passante de fréquences comprises entre 1 et 40 GHz.
10. Procédé de détermination selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on travaille dans un spectre de fréquences comprises entre 5 et 14 GHz.
11. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on détermine la permittivité diélectrique des cellules à partir des paramètres suivants : nombre de cellules analysées, volume des cellules et décalage de fréquence entre la fréquence de résonnance propre et la fréquence de résonnance mesurée à l'étape e.
12. Procédé de détermination selon la revendication 11, caractérisé en ce que la permittivité d'un type de cellule est obtenue par la formule suivante :
eCeii = C0■ W^c (f0 - A)( f0 + A) / (A2. ε0 . Vcell . Ncell )
1
Cx = CQ + ∑ Ccen
∑ QeZZ = Nceu . CceU = C0 ( o " A)( fo + fi) f fl
Nœii représente le nombre de cellules sur le biocapteur
CQ et C capacités d'un capteur sans et avec au moins une cellule
. ε0 la permittivité du vide
13. Kit pour la détermination in vitro du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide soupçonné d'être cancéreux, comprenant au moins :
- Solutions de conservation et de transport de l'échantillon biologique après prélèvement constituées notamment de nutriments organiques et inorganiques sous forme de sels, d'acides aminés, d'acides gras, de peptides, de protéines et lipoprotéines, de carbohydrates de systèmes tampon pour le maintien du pH et d'éléments trace métalliques.
- Compositions du milieu de dissociation enzymatique de l'échantillon biologique constituées de notamment de nutriments organiques et inorganiques sous forme de sels, d'acides aminés, d'acides gras, de peptides, de protéines et lipoprotéines, de carbohydrates de systèmes tampon pour le maintien du pH et d'éléments trace métalliques et d'enzymes
- Consommables pour le tri cellulaire macroscopique de l'échantillon biologique par Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation, SdFFF,
- Au moins un biocapteur,
- Composition pour accueillir les cellules et les présenter au au moins un biocapteur.
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