EP2991643A1 - Prenylflavonoide zur behandlung eines melanoms - Google Patents

Prenylflavonoide zur behandlung eines melanoms

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EP2991643A1
EP2991643A1 EP14713859.8A EP14713859A EP2991643A1 EP 2991643 A1 EP2991643 A1 EP 2991643A1 EP 14713859 A EP14713859 A EP 14713859A EP 2991643 A1 EP2991643 A1 EP 2991643A1
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EP
European Patent Office
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melanoma
cells
pharmaceutical composition
skin
treatment
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14713859.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christian Busch
Sascha Venturelli
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Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Original Assignee
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
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Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard Karls Universitaet Tuebingen filed Critical Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Publication of EP2991643A1 publication Critical patent/EP2991643A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Definitions

  • the malignant melanoma is a highly malignant tumor of the pigment cells, the so-called. Melanocytes. It tends to spread early metastases on lymphoid and bloodstreams and is the most frequently fatal skin disease with a rapidly increasing number of new cases worldwide.
  • the melanoma usually develops from a precursor. This cell structure already contains melanoma cells, which are locally limited to the uppermost tissue layer. There is also talk of melanoma in situ.
  • One of the precursors of malignant melanoma is called lentigo maligna.
  • malignant melanoma In the literature at least five different subtypes of malignant melanoma are distinguished. The most common form is superficial spreading melanoma (SSM). The most aggressive form of malignant melanoma with the most unfavorable prognosis is nodular malignant melanoma (NMM). Other subtypes include lentigo- maligna melanoma (LMM), acrolentiginous melanoma (ALM) and amenalotic melanoma (AMM). Melanomas can metastasize into various organs, but there are no preferred target organs as in other tumors. Often, metastases are found in the liver, skin, lung, skeleton, and brain.
  • SSM superficial spreading melanoma
  • NMM nodular malignant melanoma
  • Other subtypes include lentigo- maligna melanoma (LMM), acrolentiginous melanoma (ALM) and amenalotic
  • a skin metastasis which is also referred to as secondary skin cancer or metastatic skin cancer, is understood to mean a lymphogenic or hematogenous sealing of primary skin malignancies or tumors of other organs in the skin.
  • Malignant melanoma, breast carcinoma, gastric carcinoma, uterine carcinoma, bronchial carcinoma, rectal carcinoma or renal carcinoma are considered as causative primary tumors after decreasing frequency especially. They can occur anywhere on the body surface, preferably on the abdominal wall, trunk and capillaries.
  • melanoma therapy is still the surgical removal of the primary tumor and excision of the metastases. Only premature and complete removal of the primary tumor can lead to healing. In later stages, when the tumor has already metastasized to the skin, lymph nodes and internal organs, the chance of a cure is low.
  • alternative therapies are used and tested, which usually provide only a temporary improvement, but usually have no chance of recovery.
  • chemotherapy with DTIC or Fotemustin
  • vaccine therapy with antigen-presenting cells surgical procedures to reduce tumor mass or radiotherapy.
  • Newer therapeutic approaches are based on the blockade of molecular processes in the signal transduction of the cell. For example, combinations of a classical chemotherapeutic agent with b-RAF kinase inhibitors such as sorafenib are used.
  • IL-2 interleukin-2
  • the surgical removal of the melanoma, its precursors or metastases is not always feasible.
  • the procedure is also stressful for the patient, postoperatively painful and time-consuming and logistically complex, especially at long journeys to the clinic or critical general condition of the patient.
  • the procedure is associated with scarring and generally carries the risk of wound infections.
  • IL-2 intralesional injection of IL-2 also has serious disadvantages. It must be performed experimentally under study conditions for a long period of time three times a week in a skin center. In addition to the high cost and associated costs, this treatment option is often associated with severe, partial systemic side effects. The application itself is painful and carries the risk of skin infections. In addition, IL-2 hypersensitivity is only suitable for skin metastases ⁇ 5mm in diameter and shows only moderate response rates.
  • PN prenylnarogenin
  • the pharmaceutical composition of the invention may have a pharmaceutically acceptable formulation.
  • Pharmaceutically acceptable formulations are well known in the art. For example, reference is made to the paper by Kibbe A. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
  • the pharmaceutical composition of the invention may further contain additives. These include any compound or composition which is advantageous for use in the invention, including salts, binders, solvents, dispersants and other substances commonly used in the formulation of pharmaceuticals.
  • the pharmaceutical composition comprises 6-prenylnaringenin (6-PN) and / or 8-prenylnaringenin (8-PN).
  • 6-PN and 8-PN are so-called prenylflavonoids. These are found in low concentrations, for example in hops and in beer.
  • Flavonoids are derived from 2-phenylchrom-4-one. 6-PN and 8-PN are isomers. The difference lies in the position of the five carbonyl group. 6-PN and 8-PN are products of a cyclization reaction of a common precursor molecule, desmethylxanthohumol, a polyphenol based on the structure of 1, 3-diphenyl-2-propene-1-one. Both molecules exist as enantiomers (R, S).
  • 8-PN has a strong binding affinity for estrogen receptors of rat uterus and has been identified as a potent phytoestrogen due to a characteristic spacing of the hydroxyl groups that mimic beta-estradiol; see. Milligan et al. (1999), Identification of potent phytoestrogens in hops (Humulus lupulus L.) and beer, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 2249-2252.
  • flavonoids In addition to the antioxidant properties, some flavonoids also show anticancer properties; see. Hodek et al. (2002) Flavonoids-potent and versatile biologically active compounds interacting with cytochromes p. 450, Chem. Biol. Interact. 139, 1 - 21; Son et al. (2007) Pomiferin, histone deacetylase inhibitor isolated from fruits of Maculea pomifera, Bioorg. Med. Chem. Lett, Vol. 17 (17), 4753-4755; Cariae et al. (2001) Artelastocarpine and carpelastofuran, two new flavones, and cytotoxicities of prenyl flavonoids from Artocarpus elasticus against three cancer cell lines, Planta. Med.
  • 8-PN inhibits angiogenesis induced by basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor in a three-dimensional collagen gel in vitro and in chorioallantoic membrane assays in vivo; see. Pepper et al. (2004), 8-prenylnaringenin, A novel phytoestogen, inhibits angiogenesis in vitro and in vivo, J. Cell Physiol. 199, 98-107.
  • 8-PN mimics the effects of 17 ⁇ -estradiol on breast cancer cells MCF-7; see. Rong et al. (2001), 8-prenylnaringenin, the phytoestrogen in hops and beer, upregulates the function of the e-cadherin / catenin complex in human mammary carcinoma cells, Eur. J. Cell Biol. 80, 5, 580-585.
  • 8-PN also induces apoptosis in MCF7 cells and in a leukemia burden resistant to a variety of drugs; see. Brunei et al. (2007), 8-prenylnaringenin, inhibits estrogen receptor-mediated cell growth and induce apoptosis in MCF-7 breast cancer cells, J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 107, 140-148, and Diller et al. (2007), Ability of prenylflavanones present in hops to induce apoptosis in a human Burkitt lymphoma cell line, Planta Med. 73, 755-761.
  • 6-PN and 8-PN show antiproliferative effects on the human prostate cancer cell lines PC-3 and DU 145 in vitro; Delmulle et al. (2006), Antiproliferative properties of prenylated flavonoids from hops (Humulus lupulus L.) in human prostate cancer cell lines, Phytomedicine 13, 732-734. This occurs in the absence of caspase-3 activation and typical apoptotic morphological features; Delmulle et al. (2008), Treatment of PC-3 and DU 145 prostate cancer cells by prenylflavonoids from hop (Humulus lupulus L.) induces a caspase-independent form of cell death, Phytother. Res. 22, 197-203.
  • 6-PN and 8-PN are potent inhibitors of histone deacetylases (HDACs) of classes I, II and IV and induce hyperacetylation of the histone protein H3.
  • HDACs histone deacetylases
  • the inventors were able to demonstrate this using the example of various tumor cell lines, in particular using the two melanoma cell lines SK-MEL-28 and BLM. Further, the inventors have been able to show on a variety of tumor cell lines that 6-PN and 8-PN show strong apoptosis-independent antiproliferative properties in vitro and low toxicity in vivo. In human epidermal skin reconstructs, both PNs show greatly inhibited cell proliferation and tumor cell invasion.
  • HDACs histone deacetylases
  • the inventors were able to observe the induction of autophagy in tumor cells after treatment with 6-PN and 8-PN.
  • 6-PN and 8-PN are potent phytotherapeutic epigenetic agents for melanoma prevention, melanoma therapy, treatment and prophylaxis of cutaneous and mucosal metastases of any primary tumor.
  • the pharmaceutical composition for topical application further preferably for topical application to the skin is formed.
  • Recurrence can thus be counteracted, which is only partially or not the case in surgical removal as well as IL2 injection.
  • the topical application also enables effective melanoma prophylaxis, the treatment of melanoma precursors or after excision of a primary melanoma the reduction of the risk of primary melanoma formation or a melanoma recurrence.
  • the active compounds 6-PN and / or 8-PN may also be encapsulated, for example in liposomes.
  • the composition according to the invention may be in the form of a single preparation in which 6-PN and / or 8-PN is / are provided as sole active agent (s). According to a development, however, the pharmaceutical composition has another against melanoma and / or melanoma precursors and / or skin and / or
  • This measure can make synergistic effects available that arise through the interaction of 6-PN and / or 8-PN and the other active ingredient. Also, this can simplify the application by the patient, who may need to apply only the pharmaceutical composition of the invention instead of two preparations.
  • the further active ingredient is preferably a necrosin inhibitor.
  • necrosis inhibitor is IM-54.
  • Another object of the present invention relates to the use of prenylnaringenin, preferably 6- and / or 8-prenylnaringenin, as an epigenetically active drug substance, more preferably for the prophylaxis and / or treatment of a melanoma and / or a melanoma precursor and / or a Skin and / or mucosal metastasis of any primary tumor.
  • Another object of the present invention relates to the use of prenylnaringenin, preferably 6- and / or 8-prenylnaringenin, as histone deacetylase inhibitor (HDACi).
  • HDACi histone deacetylase inhibitor
  • Another object of the present invention relates to a method for the prophylaxis and / or treatment of a melanoma and / or a melanoma precursor and / or a skin and / or mucosal metastasis of any primary tumor in a living being, preferably a human having the following steps (1) providing the pharmaceutical composition according to the invention, and (2) applying the pharmaceutical composition to the skin of the animal, preferably the melanoma and / or the melanoma precursor and / or the skin and / or mucosal metastasis.
  • FIG. 2 A docking analysis in silico with 6-PN and 8-PN illustrates the inhibitory potential for human-derived class I and II HDACs.
  • A Results of docking analysis in silico of 6-PN and 8-PN with crystal structures of HDAC2 (Class I) and HDAC4 (class II). The analysis shows the predicted binding mode of 6-PN and 8-PN in the HDAC binding pocket. Both molecules are predicted to interact with the zinc ion as well as the other residues of the catalytic center. Docking analyzes of 6-PN and 8-PN in the individual HDAC binding pockets were performed using GOLD (version 4.1 .2) and MOE (version 2009.10).
  • C Specific Fluometric Profiling Assay Using Class I, II and IV Recombinant Human HDACs. Specific inhibition values were generated for treatment with 100 ⁇ M 6-PN and 8-PN. TSA was used as a reference inhibitor (HDAC1, 2, 3, 6, 10, 1 1: 10 nM, HDAC4, 8, 9: 1 ⁇ , HDAC5, 7:10 ⁇ ). The inhibition values for each HDAC were obtained by a double-set experiment. Shown are the mean ⁇ S.A.
  • Fig. 3 Docking analysis in silico with 6-PN and 8-PN for HDAC2, HDAC4,
  • HDAC7 and HDAC8 Results of docking analysis in silico of 6-PN and 8-PN with crystal structures of HDAC8 (class I) and HDAC 7 (class II). The analysis shows the predicted binding mode of 6-PN and 8-PN in the different HDAC binding pockets. Both molecules are predicted to interact with the zinc ion and other catalytic site residues.
  • B Representation of a 2D Ligand plots of 6-PN and 8-PN together with interacting amino acids (circles) of the corresponding binding pocket. Shown are hydrophobic, polar, acidic and basic radicals. Halo-like slices around the amino acids are calculated based on the reduction in solvent exposure by the ligand.
  • the same protein loading was confirmed by staining with vinculin (bottom rows).
  • Fig. 5 Real-time cell monitoring of melanoma cells BLM and SK-MEL-28 treated with 6-PN and 8-PN.
  • BML and SK-MEL-28 cells were treated 24 hours after plating with varying concentrations of 6-PN and 8-PN (20 ⁇ , 50 ⁇ and 100 ⁇ ) over a period of 104 hours.
  • Cellular impedance was measured over the entire observation period using the xCELLIGENCE TM SP system and displayed by cell index (Cl). All Cl values were normalized just prior to treatment. Normalized Cl values are shown every four hours.
  • 0.1% Triton X-100 was used to induce cell death. Shown are the mean ⁇ SD of three independent experiments, each performed in triplicate (B, C).
  • the MUH proliferation assay with BLM and SK-MEL-28 melanoma cells treated with 6-PN and 8-PN (0.1 ⁇ to 100 ⁇ ), TSA and SAHA (both at 100 ⁇ ), with and without addition of the necrosis inhibitor IM-54 (5 ⁇ ) showed a concentration-dependent reduction in cell proliferation> 90% in both cell lines by the PNs, which is partially inhibited by IM-54. Shown are the mean ⁇ SD; the experiments were performed in quadruplicate.
  • D The MUH proliferation assay was repeated under the same conditions on human fibroblasts (FF868) and melanocytes (HEM1).
  • FIG. 7 100 ⁇ 6-PN and 100 ⁇ 8-PN do not induce cleaved caspase-3 in the melanoma cells SK-MEL-28.
  • a band for caspase-3 25 kDa
  • no additional band for cleaved caspase-3 expected size 17 kDa
  • FIG. 8 6-PN and 8-PN lowers the expression of pS6p via the downregulation of pERK / pP90.
  • Western blot analysis of the melanoma SK-MEL-28 cells 1 hour, 2 hours, 4 hours, 12 hours and 24 hours after treatment with 100 ⁇ M 6-PN or 8-PN.
  • 6-PN and 8-PN indu- characterized down-regulation of pS6p accompanied by a decrease of pERK and pP90, respectively.
  • 6-PN and 8-PN induced a time-dependent decrease in p70s6 kinase.
  • Figure 10 100 ⁇ 6-PN and 100 ⁇ 8-PN do not induce apoptosis in SK-MEL-28 melanoma cells.
  • A Cell cycle FACS analyzes of Pl-stained melanoma cells BLM and SK-MEL-28. 100 ⁇ 8-PN induced a G2 arrest in both cells.
  • B FACS analyzes of BLM and SK-MEL-28 melanoma cells treated with 100 ⁇ 6-PN or 8-PN and stained for annexin V / PI; Staurosporine was used as a control for apoptosis induction and DMSO as a vehicle control. Treatment with PN did not increase the number of annexin V-positive (apoptotic) cells.
  • FIG. 1 6-PN and 8-PN reduce the proliferation and invasion of BLM and LOXIMVI melanoma cells in human epidermal skin constructs and induce low embryotoxicity.
  • BLM melanoma cells and keratocytes were plated on the surface of a collagen matrix which was provided with fibroblasts. After 16 days, a keratinizing stratified epithelium with a rudimentary corium forms. Untreated MIB1-positive (proliferating) control BLM cells form an a large tumor in the epidermal part of the reconstruct and invade the corium (upper row). For the untreated BLM cells, 103 ⁇ 15 MI B-positive and 39 ⁇ 13 invasive cells were counted per high power field (40X magnification).
  • the inventors have tested a total of 19 different tumor cell lines including five melanoma cell lines, two liver cancer cell lines, three breast cancer cell lines, three colon cancer cell lines, two prostate cancer cell lines, two lung cancer cell lines and two renal cancer cell lines:
  • the metastatic melanoma cell lines SK-MEL-28, LOXIMVI and BLM, the colon cancer cells HT29 and the breast cancer cells MCF7 are described below. These were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin and 1% streptomycin. All cell cultures were maintained at 37 ° C in an atmosphere of 95% air and 5% C0 2 at 100% humidity. Docking analyzes in silico
  • HDACi activity was performed by the HDAC assay kit as described by the manufacturer (Active Motif, La Hulpe, Belgium) using 6-PN and 8-PN at increasing concentrations (5 ⁇ , 10 ⁇ , 20 ⁇ , 50 ⁇ and 100 ⁇ ).
  • the human HDAC profiling assay was performed on the basis of the Fluor de Z.ys TM technology from Scottish Biomedical, Glasgow, United Kingdom. The percent inhibition values of 100 ⁇ 6-PN and 100 ⁇ 8-PN against the human HDAC enzymes HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10 and HDAC1 1 were determined. All assays were performed in 1% DMSO (final concentration). immunoblotting
  • the cells were plated out in triplicate in 96-well plates at a density of 2500 cells per well in 50 ⁇ M medium (5 x 10 4 cells per milliliter). After 24 hours, the medium was replaced with one containing 6-PN, 8-PN (dissolved in DMSO), TSA (dissolved in EtOH) or SAHA (dissolved in DMSO) at the concentrations to be tested with or without addition of the necrosis inhibitor. tor IM-54 at 5 ⁇ (Calbiochem, Darmstadt, Germany). Cells treated with culture medium, with or without DMSO, served as controls. The assay was started after a 24 hour incubation.
  • the human melanoma cell lines BLM and SK-MEL-28 (2.5 x 10 3 cell well) were plated in 96-well plates. The cells were treated after 24 hours with various concentrations of 6-PN or 8-PN (20 ⁇ , 50 ⁇ and 100 ⁇ ) and by electrical impedance measurements at 15-minute intervals for a total of 104 hours and using the xCELLigencer® SP Systems (Roche Applied Science) monitors. The cell index values were determined using the RTCA software
  • the apoptosis induction test was carried out with the human proteomic profiler apoptosis antibody array kit (R & D Systems, Wiesbaden, Germany) as described by the manufacturer after treatment of the melanoma cells SK-MEL-28 with 100 ⁇ 6-PN or 100 ⁇ 8-PN for 4 hours.
  • Organ-specific epidermal skin reconstructions were carried out with the human proteomic profiler apoptosis antibody array kit (R & D Systems, Wiesbaden, Germany) as described by the manufacturer after treatment of the melanoma cells SK-MEL-28 with 100 ⁇ 6-PN or 100 ⁇ 8-PN for 4 hours.
  • Fertilized eggs from Leghorn chickens (Gallus gallus domesticus) were incubated at 38 ° C in a temperature-controlled, humidified breeder.
  • the eggs were prepared after approximately 48 to 52 hours of incubation (corresponding to stages 12 to 13), which corresponds to approximately 6 human gestational weeks.
  • a small hole was made in the lateral side of the eggs and 2 ml of egg whites were removed from the lower blastoderm with a cannula.
  • the egg was prepared for fenestration using a hacksaw to generate a rectangular breaking point on the shell around the previously marked point (about 15 x 25 mm in size).
  • the previously defined "window” was opened by removing the egg shell with curved tweezers.
  • the embryo is already visible on top of the blastoderm.
  • HDAC2 and HDAC8 members were initially screened in s / 7 / co docking analyzes with human HDAC class I HDAC4 and HDAC7 (Figs. 2, 3).
  • Important features for a HDACi are the structural ability to fit into the binding pocket of the HDAC enzymes and the capacity to interact with key residues such as the zinc ion in the catalytic site. According to the predicted docking analysis interactions, both 6-PN and 8-PN theoretically both requirements regarding HDAC2, HDAC4 (Fig. 2A) or HDAC7 and HDAC8, respectively (Fig. 3).
  • 6-PN and 8-PN yielded higher gold scores than TSA or SAHA for HDAC4, HDAC7, and HDAC8, and gold scores comparable to (6-PN) or lower (8-PN) than TSA or SAHA for HDAC2 with those mentioned above restrictions.
  • Table 2 Gold scores for 6-PN and 8-PN. Calculated GoldScores for 6-PN and 8-PN based on the corresponding docking analysis with HDAC2, 4, 7 and 8. The docking and following analyzes were performed using GOLD (version 4.1.2).
  • 6-PN and 8-PN appear to have inhibitory activity against class I and II HDAC enzymes compared to standard HDACi such as TSA and SAHA.
  • standard HDACi such as TSA and SAHA.
  • v / ' iro-screening confirms the suspected pan-HDACi activity of 6-PN and 8-PN.
  • 6-PN and 8-PN were screened in a HDACi assay.
  • 6-PN and 8-PN showed dose-dependent HDAC inhibitory activity (Fig. 2B).
  • Even low concentrations of 6-PN (5 ⁇ ) and 8-PN (10 ⁇ ) showed inhibitory effects, and 100 ⁇ resulted in an inhibition rate> 50% (FIG. 2B).
  • the human me- palpation melanoma cell lines BLM and SK-MEL-28 were treated once with increasing concentrations of 6-PN or 8-PN (20 ⁇ , 50 ⁇ and 100 ⁇ ) and monitored continuously for a total of 104 hours using a real-time cell monitor assay ( Fig. 5A).
  • the cell impedance, represented as the cell index (Ci) was measured, reflecting changes in cellular status.
  • Ci the cell index
  • the normalized CI of BLM and SK-MEL-28 cells treated with 6-PN and 8-PN decreased over time compared to the control for each concentration tested.
  • an incubation with 60 ⁇ and 100 ⁇ 6-PN and 8-PN showed an increased and rapid change in the measured Ci.
  • hyperacetylation of histone H3 after treatment with the PNs corresponded to a delayed decrease in Ci.
  • PNs also affect the proliferation of benign cells.
  • human fibroblasts (FF) and foreskineal melanocytes (HEM1) were treated with the same concentrations of 6-PN and 8-PN, and proliferation was assayed using the proliferation assay described above.
  • Fibroblast proliferation was scarcely affected by PN treatment ( Figure 5D), whereas proliferation of melanocytes decreased significantly at higher concentrations of PNs ( Figure 5E).
  • TSA and SAHA no reduced proliferation of fibroblasts or melanocytes could be detected.
  • 6-PN and 8-PN effectively reduce cell proliferation in all cancer cells tested (see Table 1); in particular, melanoma cells were highly accessible for treatment with the two prenylflavonoids.
  • IM-54 was able to partially block PN-induced cell death in BLM and SK-MEL-28 cells, suggesting that the antiproliferative and cytotoxic cascade initiated by PN may necrosis in some of the melanoma cells induced.
  • S6P could be phosphorylated by another mechanism.
  • activated ERK can phosphorylate the p90 ribosomal S6 kinase (pP90).
  • pP90 also phosphorylates S6P (in addition to the P70S6 kinase). Since pP70S6 kinase was not present in the cells used (SK-MEL-28 and BLM), it was hypothesized that phosphorylation of S6P occurs via the pERK / pP90 signaling pathway, independent of P70S6 signaling.
  • FACS analysis showed induction of G2 arrest in BLM and SK-MEL-28 cells 48 hours after treatment with 100 ⁇ 8-PN compared to DMSO-treated control cells (BLM: 99.6% vs. 30.4%) %; SK-MEL-28: 49.8% vs. 20.1% of the cells in the G2 phase); the sub-G1 fraction (apoptotic cells) was unaffected by 8-PN ( Figure 10A).
  • the LOXIMVI cells (aligned along the dermal-epidermal border and in prominent tumor cell nests in the dermal part of the aggregates) were 100% MIB1 positive ( Figure 11 B).
  • the treatments with 6-PN and 8-PN each resulted in the completely inhibited cell proliferation of the LOXIMVI cells: only nests of dead LOXIMVI cells could be detected in the dermal part of the skin reconstructs (FIG. 11B).
  • PN prenylflavonoid or prenylnaringenin
  • 6- and / or 8-prenylnaringenin 6-PN, 8-PN
  • PN prenylflavonoid or prenylnaringenin
  • 6-PN, 8-PN 6- and / or 8-prenylnaringenin
  • a melanoma and / or a melanoma precursor and / or a skin and / or mucosal metastasis are suitable.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Prenylflavonoid, vorzugsweise ein Prenylnaringenin, weiter vorzugsweise 6- und/oder 8-Prenylnaringenin, zur Prophylaxe und Behandlung eines Melanoms und einer Vorstufe hiervon sowie einer Haut- und Schleimhautmetastase und damit zusammenhängende Verwendungen und Verfahren.

Description

PRENYLFLAVONOIDE ZUR BEHANDLUNG EINES MELANOMS
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und Behandlung eines Melanoms und einer Vorstufe hiervon sowie einer Haut- und Schleimhautmetastase und damit zusammenhängende Verwendungen und Verfahren.
[0002] Das maligne Melanom ist ein hochgradig bösartiger Tumor der Pigmentzellen, der sog. Melanozyten. Er neigt dazu, früh Metastasen über Lymph- und Blutbahnen zu streuen und ist die am häufigsten tödlich verlaufende Hautkrankheit mit einer weltweit stark steigenden Anzahl an Neuerkrankungen.
[0003] Das Melanom entwickelt sich meist aus einer Vorstufe. Dieser Zellverband enthält bereits Melanomzellen, die jedoch örtlich auf die oberste Gewebsschicht begrenzt sind. Man spricht auch von einem Melanoma in situ. Eine der Vorstufen des malignen Melanoms wird als Lentigo maligna bezeichnet.
[0004] In der Literatur werden zumindest fünf verschiedene Subtypen des malignen Melanoms unterschieden. Die häufigste Form ist das superfiziell spreitende Melanom (SSM). Die aggressivste Form des malignen Melanoms mit der ungünstigsten Prognose ist das noduläre maligne Melanom (NMM). Weitere Subtypen sind das Lentigo- Maligna-Melanom (LMM), das akrolentiginöse Melanom (ALM) und das amenalotische Melanom (AMM). [0005] Melanome können in unterschiedlichste Organe metastasieren, bevorzugte Zielorgane wie bei anderen Tumoren gibt es nicht. Häufig sind Metastasen in der Leber, in der Haut, in der Lunge, im Skelett und im Gehirn zu finden.
[0006] Unter einer Hautmetastase, die auch als sekundärer Hautkrebs oder metastatischer Hautkrebs bezeichnet wird, versteht man eine lymphogene oder hämato- gene Absiegelung von primären Hautmalignomen oder Tumoren anderer Organe in der Haut. Als verursachende Primärtumoren kommen nach abnehmender Häufigkeit vor allem das maligne Melanom, Mammakarzinom, Magenkarzinom, Uteruskarzinom, Bronchialkarzinom, Rektumkarzinom oder Nierenkarzinom in Frage. Sie können überall auf der Körperoberfläche auftreten, bevorzugt auf der Bauchwand, dem Rumpf und Kapillitium.
[0007] Die wichtigste Form der Therapie des Melanoms ist nach wie vor die chirurgische Entfernung des Primärtumors und Exzision der Metastasen. Nur eine frühzeitige und vollständige Entfernung des Primärtumors kann zur Heilung führen. In späteren Stadien, wenn der Tumor bereits Metastasen in der Haut, Lymphknoten und inneren Organen gebildet hat, ist die Chance auf eine Heilung gering. Hier werden eine ganze Reihe von Therapiealternativen angewendet und erprobt, die in der Regel nur eine zeitweilige Besserung bieten, jedoch meist keine Aussicht auf Heilung haben. Hierzu gehören die Chemotherapie mit DTIC oder Fotemustin, eine Impftherapie mit Antigen präsentierenden Zellen, chirurgische Eingriffe zur Verringerung der Tumormasse oder eine Strahlentherapie. Neuere Therapieansätze beruhen auf der Blockade molekularer Prozesse in der Signaltransduktion der Zelle. Dabei werden beispielsweise Kombinationen eines klassischen Chemotherapeutikums mit b-RAF-Kinase-lnhibitoren wie Sorafenib eingesetzt.
[0008] Eine häufige Behandlungsform von Hautmetastasen ist ferner die in- traläsionale Unterspritzung mit lnterleukin-2 (IL-2).
[0009] Die chirurgische Entfernung des Melanoms, dessen Vorstufen oder Metastasen ist nicht immer durchführbar. Der Eingriff ist außerdem belastend für den Patienten, postoperativ schmerzhaft sowie zeitlich und logistisch aufwändig, besonders bei langen Anfahrtswegen in die Klinik oder kritischem Allgemeinzustand des Patienten. Ferner ist der Eingriff mit Narbenbildungen verbunden und birgt allgemein das Risiko von Wundinfekten.
[0010] Die intraläsionale Unterspritzung von IL-2 weist ebenfalls gravierende Nachteile auf. Sie muss experimentell unter Studienbedingungen über einen längeren Zeitraum dreimal wöchentlich in einem Hautzentrum durchgeführt werden. Neben dem hohen Aufwand und damit verbundenen Kosten ist diese Behandlungsoption oft mit schweren, teilweise systemischen Nebenwirkungen vergesellschaftet. Die Applikation an sich ist schmerzhaft und birgt das Risiko von Hautinfektionen. Darüber hinaus ist die IL-2- Untersprizuung nur für Hautmetastasen von < 5mm Durchmesser geeignet und zeigt nur moderate Ansprechraten.
[0011] Aufgrund der stark ansteigenden Anzahl von Neuerkrankungen und der bislang nicht zufriedenstellenden Therapieansätze besteht ein großer Bedarf an neuen Behandlungsoptionen.
[0012] Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, mit der ein Melanom und eine Melanomvorstufe sowie eine Haut- und Schleimhautmetastase eines beliebigen Primärtumors behandelt bzw. diesen vorgebeugt werden kann.
[0013] Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gelöst, die als Wirkstoff ein Prenylflavonoid, vorzugsweise Prenylnar- ingenin (PN) aufweist.
[0014] Prenylflavonoide gehören zu der Gruppe der Flavonoiden, einer großen Gruppe von niedermolekulargewichtigen polyphenolischen Verbindungen. Flavonoide werden in Pflanzen gefunden und bestehen aus Flavonen, Flavonolen, Flavononen, Flavan-3-olen und Anthocyaninen. Diese sekundären Pflanzenmetabolite spielen eine Rolle in der Abwehr der Pflanze gegen Mikroorganismen oder Pilzen und dem Schutz vor oxidativem Stress. [0015] Ein wichtiger Vertreter der Prenylflavonoide ist das Prenylnaringenin
(PN).
[0016] Es versteht sich, dass die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine pharmazeutisch akzeptable Formulierung aufweisen kann. Pharmazeutisch akzeptable Formulierungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Beispielhaft wird auf die Abhandlung von Kibbe A. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Auflage, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, verwiesen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner Zusätze enthalten. Diese umfassen jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für die erfindungsgemäße Verwendung vorteilhaft sind, worunter Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel und weitere in Zusammenhang mit der Formulierung von Arzneimittel üblicherweise verwendete Stoffe fallen.
[0017] Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
[0018] Nach einer erfindungsgemäßen Weiterentwicklung weist die pharmazeutische Zusammensetzung 6-Prenylnaringenin (6-PN) und/oder 8-Prenylnaringenin (8-PN) auf.
[0019] 6-PN und 8-PN sind sog. Prenylflavonoide. Diese finden sich in niedrigen Konzentrationen bspw. im Hopfen und in Bier. Die Struktur dieser Klasse von
Flavonoiden leitet sich vom 2-Phenylchrom-4-on ab. 6-PN und 8-PN sind Isomere. Der Unterschied liegt in der Position der aus fünf Kohlenstoffatomen bestehenden Pre- nylgruppe. 6-PN und 8-PN sind Produkte einer Ringschlussreaktion eines gemeinsamen Vorläufermoleküls, Desmethylxanthohumol, einem Polyphenol, das auf der Struktur von 1 ,3-Diphenyl-2-Propen-1 -on basiert. Beide Moleküle existieren als Enantiomere (R, S).
[0020] 8-PN weist eine starke Bindeaffinität zu Östrogenrezeptoren des Rattenuterus auf und ist als potentes Phytoestrogen aufgrund einer charakteristischen Beab- standung der Hydroxylgruppen identifiziert worden, die Beta-Estradiol imitieren; vgl. Milligan et al. (1999), Identification of potent phytoestrogen in hops (Humulus lupulus L.) and beer, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 2249-2252.
[0021] Neben den antioxidativen Eigenschaften zeigen einige Flavonoide auch Antikrebseigenschaften; vgl. Hodek et al. (2002) Flavonoids-potent and versatile biologi- cally active Compounds interacting with cytochromes p. 450, Chem. Biol. Interact. 139, 1 - 21 ; Son et al. (2007) Pomiferin, histone deacetylase inhibitor isolated from fruits of Maclu- ra pomifera, Bioorg. Med. Chem. Lett, Vol. 17(17), 4753-4755; Cidade et al. (2001 ) Artelastocarpin and carpelastofuran, two new flavones, and cytotoxicities of prenyl flavo- noids from Artocarpus elasticus against three Cancer cell lines, Planta. Med. Vol. 67(9), 867-870; Kuete et al. (201 1 ), Cytotoxicity and mode of action of four naturally occuring flavonoids from the genus Dorstenia: gancaonin Q, 4-hydroxylonchocarpin, 6- prenylapigenin, and 6,8-diprenyleriodictyol, Planta. Med. Vol. 77(18), 194-1989 (abstract).
[0022] 8-PN inhibiert die Angiogenese, induziert durch den basischen Fib- roblastenwachstumsfaktor und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, in einem dreidimensionalen Collagengel in vitro und in Chorioallantoismembran assays in vivo; vgl. Pepper et al. (2004), 8-Prenylnaringenin, A novel phytoestogen, inhibits angiogenesis in vitro and in vivo, J. Cell Physiol. 199, 98-107.
[0023] 8-PN imitiert die Wirkungen von 17ß-Estradiol auf den Brustkrebszellen MCF-7; vgl. Rong et al. (2001 ), 8-Prenylnaringenin, the phytoestrogen in hops and beer, upregulates the function of the e-cadherin-/catenin complex in human mammary Carcinoma cells, Eur. J. Cell Biol. 80, 5 580-585.
[0024] 8-PN induziert ferner die Apoptose in MCF7-Zellen und in einer gegen eine Vielzahl von Wirkstoffen resistenten Leukämieblaste; vgl. Bruneiii et al. (2007), 8- Prenylnaringenin, inhibits estrogen receptor-α mediated cell growth and induces apoptosis in MCF-7 breast Cancer cells, J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 107, 140-148, und Diller et al. (2007), Ability of prenylflavanones present in hops to induce apoptosis in a human Burkitt lymphoma cell line, Planta Med. 73, 755-761. [0025] Vor Kurzem wurde ferner die Inhibition des P-Glycoproteins, dem mit einer Multiresistenz assoziierten Transporterprotein, und die Inhibition von MRP1 durch 8- PN beschrieben; vgl. Wesolowska et al. (2010), 8-Prenylnaringenin is an inhibitor of multidrug resistance-associated transporters, P-glycoprotein and MRP1 , Eur. J. Pharma- col. 644, 32-40.
[0026] Ferner inhibiert 8-PN direkt die Aktivierung des PI (3) K/Akt-Signalweges in MCF-7-Zellen in vitro; Bruneiii et al. (2009), 8-Prenylnaringenin inhibits epidermal growth factor-induced MCF-7 breast cancer cell proliferation by targeting phosphatidylino- sitol-3-ΟΗ kinase activity, J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 1 13, 163-170.
[0027] 6-PN und 8-PN zeigen antiproliferative Wirkungen auf die humanen Prostatakrebszelllinien PC-3 und DU 145 in vitro; Delmulle et al. (2006), Anti-proliferative properties of prenylated flavonoids from hops (Humulus lupulus L.) in human prostate Cancer cell lines, Phytomedicine 13, 732-734. Dies erfolgt in Abwesenheit einer Caspase- 3-Aktivierung und typischen apoptotischen morphologischen Merkmalen; Delmulle et al. (2008), Treatment of PC-3 and DU 145 prostate Cancer cells by prenylflavonoids from hop (Humulus lupulus L.) induces a caspase-independent form of cell death, Phytother. Res. 22, 197-203.
[0028] Die Eignung von 6-PN und 8-PN zur Prophylaxe und Behandlung eines Melanoms oder einer Vorstufe hiervon sowie einer Haut- oder Schleimhautmetastase eines beliebigen Primärtumors ist im Stand der Technik bislang nicht beschrieben oder nahegelegt. Dies liegt auch daran, dass die genauen zellulären Mechanismen von 6-PN und 8-PN bislang nicht bekannt sind.
[0029] Die Erfinder konnten nunmehr erstmals in silico und in vitro demonstrieren, dass 6-PN und 8-PN distinkte potente Inhibitoren von Histondeacetylasen (HDACs) der Klassen I, II und IV sind und eine Hyperacetylierung des Histonproteins H3 induzieren. Dies konnten die Erfinder am Beispiel verschiedener Tumorzelllinien zeigen, insbesondere anhand der beiden Melanomzelllinien SK-MEL-28 und BLM. [0030] Ferner konnten die Erfinder an einer Vielzahl von Tumorzelllinien zeigen, dass 6-PN und 8-PN starke Apoptose-unabhängige antiproliferative Eigenschaften in vitro und niedrige Toxizität in vivo zeigen. In humanen epidermalen Hautrekonstrukten zeigen beide PNs eine stark inhibierte Zellproliferation und Invasion der Tumorzellen.
[0031] Ferner konnten die Erfinder in Tumorzellen nach Behandlung mit 6-PN und 8-PN die Induktion von Autophagie beobachten.
[0032] Zusammengenommen ergeben die von den Erfindern generierten Daten, dass 6-PN und 8-PN potente phytotherapeutische epigenetische Wirkstoffe zur Melanomprävention, Melanomtherapie, Behandlung und Prophylaxe von Haut- und Schleimhautmetastasen eines beliebigen Primärtumors sind.
[0033] Nach einer bevorzugten Weiterbildung ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms oder einer Melanomvorstufe der Haut ausgebildet.
[0034] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel zur Behandlung der häufigsten Melanomform, nämlich dem kutanen Melanom und dessen Vorstufen bereitgestellt wird. Zufriedenstellende Therapieansätze gegen diese Krankheitsbilder existieren im Stand der Technik bislang nicht.
[0035] Nach einer erfindungsgemäß bevorzugten Weiterbildung ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Melanomhaut- und/oder Melanomschleimhautmetastasten ausgebildet.
[0036] Auch mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise die Behandlung solcher Metastasen adressiert, für die bislang keine ausreichenden Behandlungskonzepte vorliegen. [0037] Nach einer bevorzugten Weiterbildung ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur topischen Applikation, weiter vorzugsweise zur topischen Applikation auf die Haut ausgebildet.
[0038] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass erstmals eine wirksame topische Therapie des Melanoms, dessen Vorstufen bzw. von Metastasen eines beliebigen Primärtumors möglich ist, die vom Patienten selbst durchgeführt werden kann. Sie ist für den Patienten sowohl physisch als auch psychisch weitaus weniger belastend als die derzeitigen Therapieformen, beispielsweise eine Unterspritzung der Läsionen mit IL-2. Gegenüber operativen Eingriffen und der IL2-Unterspritzung ist auch der Kostenaufwand einer solchen topischen Therapie deutlich reduziert. Auch das Risiko von Infektionen ist stark vermindert. Die erfindungsgemäße topische Ausgestaltung der Zusammensetzung ermöglicht ferner die Behandlung eines größeren Hautareals. Nach Erkenntnissen der Erfinder ist ferner von einer besseren antitumoralen Wirkung bzw. höheren Ansprechrate auszugehen im Vergleich zu der IL2-Unterspritzung. Auch ermöglicht die topische Applikation die Behandlung von okkulten Hautmikrometastasen. Einem Rezidiv kann somit entgegengewirkt werden, was sowohl bei einer chirurgischen Entfernung als auch IL2- Unterspritzung nur bedingt bzw. gar nicht der Fall ist. Auch ermöglicht die topische Applikation eine wirksame Melanomprophylaxe, die Therapie von Melanomvorstufen oder nach Exzision eines Primärmelanoms die Verminderung des Risikos der primären Melanomentstehung bzw. eines Melanomrezidives.
[0039] Erfindungsgemäß ist es deshalb bevorzugt, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Applikationsform vorliegt, die eine topische Applikation ermöglicht und deshalb vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Salbe, Creme, Lotion, Gel, Paste, transdermales therapeutisches System, Schaum, Puder.
[0040] Die Wirkstoffe 6-PN und/oder 8-PN können auch verkapselt, beispielsweise in Liposomen, vorliegen. [0041] Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann als Monopräparat ausgebildet sein, in dem 6-PN und/oder 8-PN als einzige(r) Wirkstoff(e) vorgesehen ist/sind. Nach einer Weiterbildung weist die pharmazeutische Zusammensetzung jedoch einen weiteren gegen Melanome und/oder Melanomvorstufen und/oder Haut- und/oder
Schleimhautmetastasen eines beliebigen Primärtumors wirksamen Wirkstoff auf.
[0042] Diese Maßnahme kann sich synergistische Effekte nutzbar machen, die durch das Zusammenwirken von 6-PN und/oder 8-PN und dem weiteren Wirkstoff entstehen. Auch kann dadurch die Anwendung durch den Patienten vereinfacht werden, der ggf. anstelle von zwei Präparaten lediglich die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung aufbringen muss.
[0043] Bei dem weiteren Wirkstoff handelt es sich vorzugsweise um einen Nek- roseinhibitor.
[0044] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass nekrotische Prozesse und damit ggf. verbundene Entzündungen inhibiert und etwaige Nebenwirkungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung weiter reduziert werden.
[0045] Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, wenn es sich bei dem Nekrose- inhibitor um IM-54 handelt.
[0046] Mit dieser Maßnahme wird ein solcher Nekroseinhibitor eingesetzt, der sich nach Erkenntnissen der Erfinder besonders eignet.
[0047] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Prenylnaringenin, vorzugsweise 6- und/oder 8-Prenylnaringenin, als epigenetisch aktiver arzneilicher Wirkstoff, weiter vorzugsweise zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms und/oder einer Melanomvorstufe und/oder einer Haut- und/oder Schleimhautmetastase eines beliebigen Primärtumors. [0048] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Prenylnaringenin, vorzugsweise 6- und/oder 8-Prenylnaringenin, als Histon- deacetylaseinhibitor (HDACi).
[0049] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms und/oder einer Melanomvorstufe und/oder einer Haut- und/oder Schleimhautmetastase eines beliebigen Primärtumors bei einem Lebewesen, vorzugsweise einem Menschen, das folgende Schritte aufweist: (1 ) Bereitstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung, und (2) Applikation der pharmazeutischen Zusammensetzung auf die Haut des Lebewesens, vorzugsweise das Melanom und/oder die Melanomvorstufe und/oder die Haut- und/oder Schleimhautmetastase.
[0050] Die Eigenschaften, die Merkmale und Vorteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für die erfindungsgemäßen Verwendungen und das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen.
[0051] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
[0052] Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften, Merkmale und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung illustrieren, schränken jedoch deren Reichweite nicht ein. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 : Chemische Strukturen von 6-PN und 8-PN. Dargestellt sind die chemischen Strukturen von 6-Prenylnaringenin (5,6-Dihydroxy-2-(4-Hydroxy- Phenyl)-6-(3-Methyl-But-2-enyl)-Chroman-4-on) und 8-Prenylnaringenin (5J-Dihydroxy-2-(4-Hydroxy-Phenyl)-8-(3-Methyl-But-2-enyl)-Chroman- 4-on).
Fig. 2: Eine Dockinganalyse in silico mit 6-PN und 8-PN illustriert das inhibitorisches Potenzial für human abgeleitete HDACs der Klassen I und II. (A) Ergebnisse der Dockinganalyse in silico von 6-PN und 8-PN mit Kristallstrukturen von HDAC2 (Klasse I) und HDAC4 (Klasse II). Die Analyse zeigt den vorhergesagten Bindemodus von 6-PN und 8-PN in der HDAC-Bindetasche. Für beide Moleküle ist vorhergesagt, dass diese mit dem Zink-Ion als auch den anderen Resten des katalytischen Zentrums interagieren. Dockinganalysen von 6-PN und 8-PN in den individuellen HDAC-Bindetaschen wurden unter Verwendung von GOLD (Version 4.1 .2) und MOE (Version 2009.10) durchgeführt. (B) Gesamtinhibition von HDAC in zellulären Extrakten der humanen Zelllinie HeLa durch Erhöhung der Konzentrationen von 6-PN und 8-PN (5 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ). Als Referenzinhibitor wurden 100 μΜ SAHA verwendet. Jede Konzentration wurde dreimal in Dreifachansätzen getestet. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S.A. (C) Spezifischer fluometrischer Profiling-Assay unter Verwendung von rekombinanten humanen HDACs der Klassen I, II und IV. Spezifische Inhibitionswerte wurden generiert für eine Behandlung mit 100 μΜ 6-PN und 8-PN. TSA wurde als Referenzinhibitor verwendet (HDAC1 , 2, 3, 6, 10, 1 1 : 10 nM; HDAC4, 8, 9: 1 μΜ; HDAC5, 7: 10 μΜ). Die Inhibitionswerte für jede HDAC wurden durch ein im Doppelansatz durchgeführtes Experiment erhalten. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S.A.
Fig. 3: Dockinganalyse in silico mit 6-PN und 8-PN für HDAC2, HDAC4,
HDAC7 und HDAC8. (A) Ergebnisse der Dockinganalyse in silico von 6- PN und 8-PN mit Kristallstrukturen von HDAC8 (Klasse I) und HDAC 7 (Klasse II). Die Analyse zeigt den vorhergesagten Bindemodus von 6- PN und 8-PN in den unterschiedlichen HDAC-Bindetaschen. Für beide Moleküle ist vorhergesagt, dass sie mit dem Zink-Ion und anderen Resten des katalytischen Zentrums interagieren. (B) Darstellung eines 2D- Liganden-Plots von 6-PN und 8-PN zusammen mit interagierenden Aminosäuren (Kreisen) der korrespondierenden Bindetasche. Dargestellt sind hydrophobe, polare, saure und basische Reste. Halo-artige Scheiben um die Aminosäuren werden basierend auf der Reduzierung der Lösungsmittelexposition durch den Liganden kalkuliert. Die Pfeile repräsentieren Wasserstoffbindungsinteraktionen des Rückgrats oder Wasserstoffbindungsinteraktionen der Seitenkette. Die gestrichelten Linien repräsentieren Metallkontakte. Die Benzolringe mit einem "+" beschreiben eine Aren-Kation-Interaktion, 2-Benzolringe eine Aren-Aren-Inter- aktion. Bereiche mit einem farbigen Hintergrund korrespondieren mit Lösungsmittel-exponierten Teilen der Liganden. Die Dockinganalysen von 6-PN und 8-PN in den individuellen HDAC-Bindetaschen wurden unter Verwendung von GOLD (Version 4.1 .2) und MOE (Version 2009.10) durchgeführt.
Fig. 4: 6-PN und 8-PN induzieren eine Hyperacetylierung in den Melanomzellen
SK-MEL-28. Western-Blot-Analyse des acetylierten Histonkomplex H3 in zellulären Lysaten von BLM und SK-MEL-28-Zellen behandelt mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN für 1 , 2, 4, 12 und 24 Stunden, oder mit 100 μΜ SAHA (als Referenz-HDACi) für 24 Stunden. Die gleiche Proteinbeladung wurde durch Färbung mit Vinculin bestätigt (untere Reihen).
24 Stunden (BLM) und 2 Stunden (SK-MEL-28) nach der PN-Behand- lung ist eine prominente Hochregulation von AC-H3 detektierbar. Die Proteinexpressionsspiegel wurden mittels densitometrischer Analyse abgeschätzt.
Fig. 5: Echtzeitzellmonitoring der Melanomzellen BLM und SK-MEL-28 behandelt mit 6-PN und 8-PN. (A) BML- und SK-MEL-28-Zellen wurden 24 Stunden nach dem Ausplattieren mit unterschiedlichen Konzentrationen von 6-PN und 8-PN (20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ) über einen Zeitraum von 104 Stunden behandelt. Die zelluläre Impedanz wurde über den gesamten Beobachtungszeitraum unter Verwendung des xCELLi- gence™ SP-Systems gemessen und über den Zellindex (Cl) dargestellt. Sämtliche Cl-Werte wurden kurz vor Beginn der Behandlung normalisiert. Dargestellt sind normalisierte Cl-Werte alle vier Stunden. Als Positivkontrolle wurde 0,1 % Triton X-100 zur Induktion des Zelltods verwendet. Gezeigt sind die Mittelwerte ± S.A. von drei unabhängigen Experimenten, jeweils in Dreifachansätzen durchgeführt (B, C). Der MUH- Proliferations-Assay mit den Melanomzellen BLM und SK-MEL-28, behandelt mit 6-PN und 8-PN (0,1 μΜ bis 100 μΜ), TSA und SAHA (beide bei 100 μΜ), mit und ohne Zugabe des Nekroseinhibitors IM-54 (5 μΜ), zeigte eine konzentrationsabhängige Reduzierung der Zellproliferation > 90 % in beiden Zelllinien durch die PNs, welche teilweise durch IM-54 inhibiert wird. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD; die Experimente wurden in Vierfachansätzen durchgeführt. (D) Der MUH-Proliferations- Assay wurde unter den gleichen Bedingungen auf humanen Fibroblasten (FF868) und Melanozyten (HEM1 ) wiederholt.
Fig. 6: 6-PN und 8-PN inhibiert das Wachstum von MCF7 und HT29. (A, B)
MUH-Proliferations-Assay von HT29-Kolon-Krebszellen und MCF7- Brustkrebszellen behandelt mit ansteigenden Konzentrationen von 6-PN und 8-PN (0,1 μΜ bis 100 μΜ) ίϋΓ 48 Stunden. Dargestellt sind Mittelwerte ± S.A.; die Experimente wurden in Vierfachansätzen durchgeführt.
Fig. 7: 100 μΜ 6-PN und 100 μΜ 8-PN induziert keine gespaltene Caspase-3 in den Melanomzellen SK-MEL-28. Western-Blot-Analyse der Melanomzellen SK-MEL-28 behandelt mit 100 μΜ 6-PN, 8-PN, SAHA oder TSA. EtOH und DSO wurden als Kontrollen verwendet. Obwohl eine Bande für Caspase-3 (25 kDa) für alle Behandlungen klar erkennbar ist, kann keine zusätzliche Bande für gespaltene Caspase-3 (erwartete Größe 17 kDa) bei den Behandlungen gefunden werden.
Fig. 8: 6-PN und 8-PN erniedrigt die Expression von pS6p über die Runterregulation von pERK/pP90. Western-Blot-Analyse der Melanomzellen SK- MEL-28 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden nach der Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN. 6-PN und 8-PN indu- zierten eine Herunterregulation von pS6p begleitet von einer Abnahme von pERK bzw. pP90. 6-PN und 8-PN induzierten eine zeitabhängige Abnahme der p70s6-Kinase.
Fig. 9: 100 μΜ 6-PN und 100 μΜ 8-PN induzieren keine Apoptose in den Mela- nomzellen SK-MEL-28. Apoptose-Assay (35 Proteine) durchgeführt auf Lysaten der Melanomzellen SK-MEL-28 vier Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN. Die Proteinexpressionsspiegel wurden unter Verwendung einer densitometrischen Analyse abgeschätzt. Weder 6- PN noch 8-PN führten zu einer signifikanten Veränderung der Expression der analysierten in die Apoptose involvierten Proteine.
Fig. 10: 100 μΜ 6-PN und 100 μΜ 8-PN induzieren keine Apoptose in SK-MEL- 28-Melanomzellen. (A) Zellzyklus-FACS-Analysen von Pl-gefärbten Melanomzellen BLM und SK-MEL-28. 100 μΜ 8-PN-induzierte einen G2- Arrest in beiden Zellen. (B) FACS-Analysen der Melanomzellen BLM und SK-MEL-28 behandelt mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN und gefärbt auf Annexin V/PI; Staurosporin wurde als Kontrolle zur Apoptoseinduktion und DMSO als Vehikelkontrolle verwendet. Die Behandlung mit PN erhöhte nicht die Anzahl von Annexin V-positiven (apoptotischen) Zellen. (C) Die Melanomzellen BLM und SK-MEL-28 wurden mit 100 μΜ der PNs behandelt; TSA, SAHA und EMSO wurden als Kontrollen verwendet. Ein Western Blot wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen LC3 durchgeführt und zeigte einen Shift von LC3-I nach LC3-III (zweite, untere Bande) nach Behandlung mit den PNs nach 12 und 24 Stunden.
Fig. 1 1 : 6-PN und 8-PN reduzieren die Proliferation und Invasion der Melanomzellen BLM und LOXIMVI in humanen epidermalen Hautkonstrukten und induzieren geringe Embryotoxizität. (A) BLM-Melanomzellen und Kerato- nozyten wurden auf die Oberfläche einer Kollagenmatrix ausplattiert, die mit Fibroblasten versehen war. Nach 16 Tagen bildet sich ein keratini- sierendes stratifiziertes Epithel mit einem rudimentären Corium. Unbehandelte MIB1 -positive (proliferierenden) Kontroll-BLM-Zellen bilden ei- nen großen Tumor in dem epidermalen Teil des Rekonstruktes und in- vadieren das Corium (obere Reihe). Für die unbehandelten BLM-Zellen 103 ± 15 MI B-positive und 39 ± 13 invasive Zellen wurden pro Hochleistungsfeld (40-fache Vergrößerung) gezählt. 100 μΜ 6-PN-Behandlung führte zu einer signifikant abgenommenen Menge von MIB1 -positiven BLM-Zellen (27 ± 6) mit geringerer Invasion (9 ± 4; mittlere Reihe; p < 0,01 , Student's t-Test). 100 μΜ 8-PN-reduzierte die Proliferation (16 ± 4) und Invasion (6 ± 2) der BLM-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen noch weiter (untere Reihe; p < 0,01 , Student's t-Test). Die Experimente wurde in Dreifachansätzen durchgeführt. (B) Ähnliche Ergebnisse wurden für die Melanomzellen LOXIMVI unter den gleichen Behandlungsbedingungen erhalten. Nur Ansammlungen von toten, MIB1 - negativen LOXIMVI-Zellen wurden nach der Behandlung mit den PNs detektiert. (C) Hühnchenembryonen Stadium 13HH (entsprechend 6 humanen Schwangerschaftswochen) wurden an DMSO als Kontrolle exponiert, 100 μΜ 6-PN oder 100 μΜ 8-PN, um die LD50-Werte zu bestimmen. Die Überlebensraten nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden, sind in einem Kaplan-Meier-Plot dargestellt.
Ausführungsbeispiele Materialien und Methoden Synthese von 6-Prenylnaringenin und 8-Prenylnaringenin (PN)
8-Prenylnaringenin und 6-Prenylnaringenin wurden gemäß Gester et al. (2001 ), An efficient synthesis of the potent phytoestrogens 8-prenylnaringenin und 6-(1 ,1 - dimethylallyl)naringenin by europium (lll)-catalyzed Claisen rearrangement, Tetrahedron 57, 1015-1018 bzw. Tischer und Metz (2007), Selective C-6 prenylation of flavonoids via europium(lll)-catalyzed Claisen rearrangement and cross- metathesis, Advanced Synthesis & Catalysis 349, 147-151 , synthetisiert. Der Inhalt der beiden vorstehenden Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Zellkultur
Die Erfinder haben insgesamt 19 verschiedene Tumorzelllinien getestet, darunter fünf Melanomzelllinien, zwei Leberkrebszelllinien, drei Brustkrebszelllinien, drei Darmkrebszelllinien, zwei Prostatakrebszelllinien, zwei Lungenkrebszelllinien und zwei Nierenkrebszelllinien:
Tabelle 1 : Getestete Tumorzelllinien
Beispielhaft werden nachfolgend die metastatischen Melanomzelllinien SK-MEL- 28, LOXIMVI und BLM, die Kolon-Krebszellen HT29 und die Brustkrebszellen MCF7 beschrieben. Diese wurden in RPMI 1640-Medium kultiviert, supplementiert mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin und 1 % Streptomycin. Sämtliche Zellkulturen wurden bei 37 °C in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % C02 bei 100 % Feuchtigkeit gehalten. Dockinganalysen in silico
Die Dockinganalysen wurden mit humanem HDAC2, 4, 7 und 8 mit 6-PN, 8-PN und den beiden HDACi-Referenzverbindungen Suberoylanilid-Hydroxaminsäure (SAHA) und Trichostatin (A (TSA)) durchgeführt. HDAC-Inhibitor Screening Assay
Die Bestimmung der HDACi-Aktivität wurde mittels des HDAC-Assay-Kits durchgeführt, wie von dem Hersteller beschrieben (Active Motif, La Hulpe, Belgien), und zwar unter Verwendung von 6-PN und 8-PN bei steigenden Konzentrationen (5 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ). HDAC-Inhibitionsprofiling
Der humane HDAC-Profiling-Assay wurde auf Basis der Fluor de Z.ys™-Techno- logie von Scottish Biomedical, Glasgow, Vereinigtes Königreich, durchgeführt. Die prozentualen Inhibitionswerte von 100 μΜ 6-PN und 100 μΜ 8-PN gegen die humanen HDAC-Enzyme HDAC1 , HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10 und HDAC1 1 wurden bestimmt. Sämtliche Assays wurden in 1 % DMSO (Endkonzentration) durchgeführt. Immunblotting
Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Anti-Vinculin und Anti-Actin (1 :5000, Sigma-Aldrich), Anti-Acetyl-Histon H3 (1 :5000, Millipore, Billerica, USA), Anti- Caspase-3 (1 :1000), Anti-AKT, Anti-pAKT, Anti-ERK, Anti-pERK, Anti-pE90, Anti- p70S6-Kinase und Ant.i-pS6-Prot.ein (1 :1000), alle von Cell Signaling, Frankfurt, Deutschland), Anti-LC3 (1 :5000, Sigma-Aldrich). Proliferations-Assay
Die Zellen wurden als Dreifachansätze in Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Dichte von 2500 Zellen pro Vertiefung in 50 μΙ Medium (5 x 104 Zellen pro Milliliter) ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium durch ein solches ersetzt, das 6- PN, 8-PN (gelöst in DMSO), TSA (gelöst in EtOH) oder SAHA (gelöst in DMSO) bei den zu testenden Konzentrationen mit oder ohne Zugabe des Nekroseinhibi- tors IM-54 bei 5 μΜ (Calbiochem, Darmstadt, Deutschland), enthielt. Zellen behandelt mit Kulturmedium, ohne oder mit DMSO, dienten als Kontrollen. Der Assay wurde nach einer Inkubation von 24 Stunden gestartet. Das Medium wurde verworfen, jede Vertiefung wurde zweimal mit PBS (ohne Ca++ und Mg++) gewaschen und 100 μΙ einer Lösung enthaltend 100 mg 4-Methyl Umbellipherylheptanoat pro Milliliter PBS wurden hinzugegeben. Die Platten wurden bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert und in einem Fluoroskan II (Lab Systems, Helsinki, Finnland) mit einem λβΓΠ von 355 nm und λβχ von 460 nm gemessen. Die Intensität der Fluoreszenz indiziert die Anzahl von lebenden Zellen in den Vertiefungen. Echtzeitzellmonitoring-Assay
Die humanen Melanomzelllinien BLM und SK-MEL-28 (2,5 x 103 ZellenA ertiefung) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Die Zellen wurden nach 24 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen von 6-PN oder 8-PN (20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ) behandelt und durch Messungen der elektrischen Impedanz in Intervallen von 15 Minuten für eine Zeitspanne von insgesamt 104 Stunden und unter Verwendung des xCELLigencer® SP Systems (Roche Applied Science) überwacht. Die Zellindexwerte wurden unter Verwendung der RTCA-Software
(1 .0.0.0805) kalkuliert. Sämtliche Kurven wurden am Beginn des Behandlungszeitraums normalisiert. Apoptose-Assay
Der Test der Apoptose-Induktion erfolgte mit dem human Proteom-Profiler-Apop- tose-Antikörper-Array-Kit (R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland), wie vom Hersteller beschrieben, und zwar nach Behandlung der Melanomzellen SK-MEL- 28 mit 100 μΜ 6-PN oder 100 μΜ 8-PN für 4 Stunden. Organtypische epidermale Hautrekonstrukte
Organtypische Kulturen von humaner Haut und Melanoma (unter Verwendung von BLM und LOXIMVI-Melanomzellen) wurden hergestellt, wie zuvor beschrieben von Meier et al. (2000), Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF, Am. J. Pathol. 156, 193-200. Embryotoxizitätstest (Bestimmung von LD50)
Befruchtete Eier von Leghorn-Hühnern (Gallus gallus domesticus) wurden bei 38 °C in einem temperaturkontrollierten, befeuchteten Brüter inkubiert. Der oberste Punkt der Eischale und damit indirekt das Blastoderm, das stets in Richtung des oberen Teils des Eis orientiert ist, wurde mit einem Stift markiert. Für den Embryotoxizitätstest wurden die Eier nach ungefähr 48 bis 52 Stunden der Inkubation (entsprechend des Stadiums 12 bis 13) präpariert, was in etwa 6 humanen Schwangerschaftswochen entspricht. Vor der Fenestration wurde ein kleines Loch in die laterale Seite der Eier gestochen und 2 ml Eiweiß wurden mit einer Kanüle aus dem unteren Spiegel des Blastoderms entnommen. Anschließend wurde das Ei für die Fenestration unter Verwendung einer Bügelsäge präpariert, um eine rechteckige Bruchgrenze auf der Schale um den zuvor markierten Punkt zu generieren (etwa 15 x 25 mm Größe). Das zuvor festgelegte "Fenster" wurde durch Entfernung der Eischale mit einer gebogenen Pinzette geöffnet. Zu diesem Stadium ist der Embryo bereits auf der Oberseite des Blastoderms sichtbar. 100 μΜ 6- PN oder 8-PN (gelöst in 50 % Ethanol und 50 % PBS, Gesamtvolumen: 500 μΙ) wurden auf den oberen Teil des Blastoderms gegeben (2 Embryos pro Behand- lungsgruppe; das Experiment wurde in Dreifachansätzen durchgeführt; insgesamt n = 6 pro Gruppe). Als Kontrolle wurde die gleiche Anzahl von Embryonen mit den gleichen Volumina von Ethanol und PBS ohne Zugabe von 6-PN oder 8-PN behandelt, um mögliche toxische Effekte des Ethanols auszuschließen. Die Eier wurden dann mit Klebeband verschlossen und in den Inkubator zurückgestellt. Die Lebensfähigkeit der Embryos wurde verifiziert und 24, 48 und 72 Stunden nach der Verabreichung der Substanzen dokumentiert. Statistische Analysen
Statistische Analysen für die verschiedenen Assays wurden mit dem One-Way ANOVA Dunnett's Multiple Comparison Test unter Verwendung von GraphPad Prism Version 4.00 (GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA) durchgeführt. Gemäß dieser Analyse wurde ein Wert von p < 0,01 als statistisch signifikant definiert. Ergebnisse In s/7/co-Dockinganalysen sagen eine Bindung von 6-PN und 8-PN in humanen HDAC-Enzymen voraus.
Um eine potenzielle HDACi-Aktivität von 6-PN und 8-PN (Fig. 1 ) zu identifizieren, wurden zunächst in s/7/co-Dockinganalysen mit den humanen HDAC-Klasse I Mitgliedern HDAC2 und HDAC8 als auch den Klasse II Mitgliedern HDAC4 und HDAC7 (Fig. 2, 3) durchgeführt. Wichtige Merkmale für ein HDACi sind die strukturelle Eigenschaft, in die Bindetasche der HDAC-Enzyme zu passen, und die Kapazität, mit Schlüsselresten wie dem Zink-Ion im katalytischen Zentrum zu interagie- ren. Gemäß den vorhergesagten Interaktionen der Dockinganalysen erfüllen sowohl 6-PN als auch 8-PN theoretisch beide Erfordernisse betreffend HDAC2, HDAC4 (Fig. 2A) oder HDAC7 bzw. HDAC8 (Fig. 3). Es wurde jedoch beobachtet, dass kein konsistenter Bindemodus für 6-PN und 8-PN über die verschiedenen HDAC-Enzyme erhalten wurde, d.h. es interagieren unterschiedliche Teile von 6- PN und 8-PN mit dem Zink-Ion. Dies macht die Dockinganalyse von 6-PN und 8- PN schwierig zu interpretieren. Das etablierte HDACi-Tricholstatin A (TSA; nicht klinisch zugelassen aufgrund von Toxizität) und Suberoylanilid-Hydroxaminsäure (SAHA; klinisch zugelassen für die Krebstherapie) wurden ebenfalls als Referenzinhibitoren analysiert. Zum Vergleich der Dockingergebnisse wurde die Scoring- Funktion GoldScore verwendet. Interessanterweise ergaben 6-PN und 8-PN höhere GoldScores als TSA oder SAHA für HDAC4, HDAC7 und HDAC8, und Gold- Scores vergleichbar mit (6-PN) oder niedriger (8-PN) als TSA oder SAHA für HDAC2 mit den oben erwähnten Restriktionen.
HDAC2 HDAC4 HDAC7 HDAC8
6-PN 62.8 66.5 56.9 59.5
8-PN 37 57.6 56.7 64.8
Tabelle 2: GoldScores für 6-PN und 8-PN. Kalkulierte GoldScores für 6-PN und 8-PN auf der Basis der korrespondierenden Dockinganalyse mit HDAC2, 4, 7 und 8. Die Docking- und folgenden Analysen erfolgten unter Verwendung von GOLD (Version 4.1.2).
Basierend auf den in s/7/co-Daten scheinen 6-PN und 8-PN inhibitorische Aktivität gegen HDAC-Enzyme der Klassen I und II im Vergleich zu Standard HDACi wie TSA und SAHA aufzuweisen. In v/'iro-Screening bestätigt die vermutete pan-HDACi-Aktivität von 6-PN und 8-PN.
Um die vorhergesagte HDACi-Aktivität in vitro weiter zu untersuchen, wurden 6-PN und 8-PN in einem HDACi-Assay gescreent. Unter Verwendung von standardisiertem Kernextrakt von HeLa-Zellen als humane HDAC-Enzymquelle zeigten 6-PN und 8-PN eine dosisabhängige HDAC-inhibitorische Aktivität (Fig. 2B). Bereits niedrige Konzentrationen von 6-PN (5 μΜ) und 8-PN (10 μΜ) zeigten inhibitorische Wirkungen, und 100 μΜ resultierte in einer Inhibitionsrate > 50 % (Fig. 2B).
100 μΜ SAHA wurde als Kontroll-HDACi verwendet. Schließlich zeigten 6-PN und 8-PN eine substanzielle HDACi-Aktivität auf humanen HDAC-Enzymen in vitro. Um die in silico- und in v/'iro-Ergebnisse zu überprüfen und um die Inhibitoraktivität von 6-PN und 8-PN aufzuschlüsseln, wurde eine Profilinganalyse mit allen bekannten humanen HDAC-Enzymen der Klassen I, II und IV durchgeführt (Fig. 2C). Auf der Basis des HDACi-Screening-Assays und der resultierenden Inhibitionswerte wurden 100 μΜ 6-PN, 8-PN und TSA (als Referenz-HDACi; in den optimierten Konzentrationen 0,01 μΜ, 1 μΜ und 10 μΜ) verwendet, um alle konservierten elf HDAC-Enzyme zu testen und um adäquate Inhibitorkonzentrationen sicherzustellen. In Übereinstimmung mit den Dockingergebnissen und dem Screening-Assay inhibierten 6-PN als auch 8-PN stark die HDAC-Aktivität aller getesteter HDACs (Fig. 2C). Gemäß den spezifischen HDAC-Inhibitionswerten für HDAC1 -HDAC1 1 können beide Prenylflavonoide als pan-HDACi betrachtet werden. Hyperacetylierung von H3 nach einer Behandlung mit 6-PN und 8-PN in BLM und SK-MEL-8-Melanomzellen
Eine Inkubation von Zellen mit HDACi induziert im Allgemeinen eine Hyperacetylierung von Histonproteinen. Deshalb wurde der Acetylierungsstatus des Histon- proteins H3 nach Behandlung mit 6-PN oder 8-PN untersucht. Entsprechend den HDAC-Screening-Ergebnissen wurde ein direkter Effekt beobachtet. Western Blot- Analysen zeigten im Vergleich zu DMSO-behandelten Kontrollzellen einen massiven Anstieg der Acetylierung des Histonkomplexes H3 in BLM-Melanomzellen 24 Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN, und in SK-MEL-28 Melanomzellen bereits 2 Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN (Fig. 4). SAHA wurde als Kontroll-HDACi verwendet (bei 100 μΜ, 24 Stunden Behandlung). Apoptose-unabhängige antiproliferative Effekte von 6-PN und 8-PN auf humanen Melanom-, Kolon- und Brustkrebszellen
Aufgrund der neu gefundenen HDACi-Aktivität von 6-PN als auch 8-PN und der beobachteten Hyperacetylierung von Histonprotein H3 in humanen Melanomzellen wurden die antiproliferativen Effekte auf Krebszellen getestet. Die humanen me- tastasierenden Melanomzelllinien BLM und SK-MEL-28 wurden einmal mit steigenden Konzentrationen von 6-PN oder 8-PN (20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ) behandelt und kontinuierlich für eine gesamte Zeitspanne von 104 Stunden unter Verwendung eines Echtzeitzellmonitor-Assays beobachtet (Fig. 5A). Die Zellimpedanz, dargestellt als Zellindex (Ci), wurde gemessen, was Veränderungen im zellulären Status reflektiert. Demnach zeigt ein Anstieg des Ci im Allgemeinen zelluläres Wachstum an, während eine Abnahme Störungen des Zellwachstums oder der Lebensfähigkeit indiziert. Der normalisierte Ci von BLM- und SK-MEL-28-Zellen behandelt mit 6-PN und 8-PN nahm über die Zeit im Vergleich zur Kontrolle für jede getestete Konzentration ab. Insbesondere eine Inkubation mit 60 μΜ und 100 μΜ 6-PN als auch 8-PN zeigte eine verstärkte und schnelle Veränderung des gemessenen Ci. Die frühe HDACi-vermittelte Hyperacetylierung von Histon H3, die in der Western Blot-Analyse bei 100 μΜ für beide PNS in SK-MEL-28-Zellen de- tektiert wurde, stand im Einklang mit der raschen Abnahme des normalisierten Ci bereits 4 Stunden nach Behandlung im Vergleich zur Kontrolle. Gleichermaßen korrespondierte in den BLM-Zellen die Hyperacetylierung von Histon H3 nach einer Behandlung mit den PNs mit einer verzögerten Abnahme des Ci.
Um die antiproliferativen Effekte von 6-PN und 8-PN auf BLM und SK-MEL-28- Melanomzellen zu konkretisieren, wurden Proliferations-Assays durchgeführt (Fig. 5B, C). Gemäß dem Echtzeitzellmonitoring-Assay induzieren bereits 20 μΜ 6- PN oder 8-PN eine distinkte Abnahme innerhalb von 48 Stunden (Fig. 5A). Deshalb wurden auf der einen Seite auch niedrige Konzentrationen in diesen Assay eingeschlossen, und auf der anderen Seite wurden die Zelllinien für 48 Stunden behandelt. In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen zeigten Konzentrationen von 50 μΜ und 100 μΜ 6-PN als auch 8-PN einen starken antiproliferativen Effekt. In BLM- und SK-MEL-28-Zellen reduzierte 6-PN die Zellproliferation bis zu 95 % und 8-PN bis zu 90 % (Fig. 5B, C). Ferner induzierten auch Behandlungen von anderen Tumorentitäten, wie HT-20-Kolon-Krebs- und MCF-7-Brustkrebszellen, mit steigenden Konzentrationen von 6-PN oder 8-PN eine starke Reduzierung der Zellproliferation (Fig. 6). Um die Antikrebseigenschaften von 6-PN und 8-PN auf metastatische Melanom- zellen weiter zu evaluieren, wurden die Proliferations-Assays unter Zugabe des Nekroseinhibitors IM-54 wiederholt, um die Rolle der Nekroseinduktion nach Behandlung mit PN zu analysieren. Die Zugabe von 5 μΜ IM-54 reduzierte die Zelltodraten bei höheren PN-Konzentrationen sowohl in BLM als auch SK-MEL-28- Zelllinien um bis zu 35 % (Fig. 5B, C). Höhere Dosen von IM-54 (10 μΜ) zeigten keinen zusätzlichen Effekt (nicht gezeigt).
Als Nächstes wurde getestet, ob PNs auch die Proliferation von gutartigen Zellen beeinflusst. Dazu wurden humane Fibroblasten (FF) und Vorhautmelanozyten (HEM1 ) mit den gleichen Konzentrationen von 6-PN und 8-PN behandelt, und die Proliferation wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Proliferations- Assays getestet. Die Fibroblastenproliferation wurde durch die PN-Behandlung kaum beeinflusst (Fig. 5D), wohingegen die Proliferation der Melanozyten bei höheren Konzentrationen der PNs deutlich abnahm (Fig. 5E). Für TSA und SAHA konnte keine reduzierte Proliferation der Fibroblasten oder Melanozyten detektiert werden.
Zusammengenommen reduzieren 6-PN und 8-PN effektiv die Zellproliferation in allen getesteten Krebszellen (vgl. Tab. 1 ); insbesondere Melanomzellen waren höchst zugänglich für eine Behandlung mit den beiden Prenylflavonoiden. IM-54 war in der Lage, PN-induzierten Zelltod in BLM und SK-MEL-28-Zellen teilweise zu blockieren, was darauf hinweist, dass die antiproliferative und zytotoxische Kaskade, die durch PN initiiert wird, eventuell in einem Teil der Melanomzellen Nekrose induziert.
Um den Typus des Zelltods weiter zu analysieren, der durch 6-PN und 8-PN induziert wird, wurden Western Blot-Analysen von SK-MEL-28 Melanomzellen 1 , 2, 4, 12 und 24 Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN und 8-PN durchgeführt. Für beide PNs wurden reduzierte Proteinspiegel von Caspase-3 (pro-apop- totisch) und Bcl-xl (anti-apoptotisch) detektiert (nicht gezeigt). Allerdings wurde für 6-PN, 8-PN oder jeden anderen verwendeten Referenz-HDACi (TSA, SAHA) oder Vehikelkontrolle (DMSO) keine zusätzliche Bande für gespaltene Caspase-3 in SK-MEL-28-Zellen detektiert (Fig. 7). Nach PN-Behandlung wurde eine inkonsistente Expression von onkogenem AKT und Phospho-AKT (pAKT) detektiert. Auf der anderen Seite wurde Phospho-S6-Protein (pS6P, ein stromabwärts gelegenes Target von mTOR) stark durch 6-PN oder 8-PN nach 4, 12 und 24 Stunden herunterreguliert (Fig. 8). Es gab deshalb eine offensichtliche Diskrepanz zwischen der Expression von pAKT und pS6P. Deshalb wurde zuerst nach der Expression der P70S6-Kinase und dessen phosphorylierter Form geschaut. 6-PN und 8-PN regulierten die Banden für die P70S6-Kinase in einer zeitabhängigen Art und Weise herunter (Fig. 8). Interessanterweise war dessen phosphorylierte Form (pP70S6- Kinase) nicht detektierbar, selbst nicht in der Kontrollgruppe (nicht gezeigt). Deshalb wurde als Nächstes gefragt, ob S6P durch einen anderen Mechanismus phosphoryliert werden könnte. In dieser Hinsicht kann aktiviertes ERK die p90 ri- bosomale S6-Kinase (pP90) phosphorylieren. pP90 phosphoryliert ebenfalls S6P (zusätzlich zu der P70S6-Kinase). Da die pP70S6-Kinase in den verwendeten Zellen nicht vorhanden war (SK-MEL-28 und BLM), wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Phosphorylierung von S6P über den pERK/pP90-Signalweg erfolgt, unabhängig von der P70S6-Signalgebung. Diese Hypothese wurde gestützt durch die parallele Herunterregulation der Banden für pP90 (Thr359/Ser363) und pS6P 12 Stunden nach Behandlung mit 6-PN, und die Wiedererscheinung von beiden Banden nach 24 Stunden (Fig. 8). In der 8-PN-Behandlungsgruppe wurde nach 12 Stunden und 24 Stunden eine starke Herunterregulation von pERK und ein zusätzlicher Anstieg des pP80-Proteins detektiert, die begleitet wurde von der parallelen Herunterregulation von pS6P. Die Western-Blot-Experimente wurden mit BLM- Zellen unter den gleichen Behandlungsbedingungen wiederholt und erzielten vergleichbare Ergebnisse (nicht gezeigt). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die Phosphorylierung von S6P über die Herunterregulation des pERK/pP90- Signalwegs durch die PNs erfolgt, unabhängig von der PI3K/AKT/P70S6- Signalgebung.
Um die Möglichkeit der Apoptoseinduktion weiter zu analysieren, wurde 4 Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN ein umfangreicher Apoptose-Assay auf SK-MEL-28-Melanomzellen durchgeführt (Fig. 9). Die Proteinexpressionsspiegel wurden abgeschätzt, indem eine densitometrische Analyse durchgeführt wurde und bestätigte, dass die Abnahme der Proliferation der Melanomtumorzellen, die durch 6-PN oder 8-PN induziert wurde, nicht Apoptose-assoziiert erfolgte (Fig. 9). Dies wurde durch FACS-Zellzyklusanalysen bestätigt, um auf eine mögliche Zunahme der Sub-G1 -Fraktion der Zellen (Apoptosezellen) oder nach der Induktion eines G2-Arrest (Inhibition der Proliferation) zu screenen. Tatsächlich zeigte die FACS-Analyse eine Induktion des G2-Arrests in BLM und SK-MEL-28-Zellen 48 Stunden nach Behandlung mit 100μΜ 8-PN im Vergleich zu DMSO-behandelten Kontrollzellen (BLM: 99,6% vs.30,4%; SK-MEL-28: 49,8% vs. 20,1 % der Zellen in der G2-Phase); die Sub-G1 -Fraktion (apoptotische Zellen) blieb unbeeinflusst von 8-PN (Fig. 10A). Um weiter zwischen der Induktion der Apoptose und/oder Nekrose zu differenzieren, wurde 4 Stunden und 24 Stunden nach Behandlung mit 6-PN oder 8-PN eine Pl/Annexin-V-Färbung von SK-MEL-28- und BLM-Zellen durchgeführt; 10μΜ Staurosporin (6 Stunden Behandlung) wurde als Positivkontrolle für die Induktion der Apoptose verwendet; eine DMSO-Behandlung wurde als Vehikelkontrolle verwendet. Die Zellen wurden dann durch FACS analysiert. In Übereinstimmung mit den obigen Ergebnissen, erhöhte 4 oder 24 Stunden nach Behandlung weder 6-PN noch 8-PN die Anzahl der Annexin-V-positiven (apoptoti- schen) Zellen; Staurosporin erhöhte die Anzahl der Annexin-V-positiven Zellen (BLM: DMSO-Kontrolle: 4,1 %; Staurosporin: 17,4%; 6-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 0,2% und 0,2%; 8-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 1 ,2% und 5,9%; SK-MEL- 28: DMSO-Kontrolle: 2,5%; Staurosporin: 13,9%; 6-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 0,5% und 0,6%; 8-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 0,2% und 0,5%; (Fig. 10B). Im Gegensatz hierzu nahm die Anzahl von Pl-positiven (nekrotischen) Zellen nur nach Behandlung mit den PNs stark ab (BLM: DMSO-Kontrolle: 9,1 %; Staurosporin: 16,6%; 6-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 30,8% und 92,1 %; 8-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 27% und 22,4%; SK-MEL-28: DMSO-Kontrolle: 7,9%; Staurosporin: 9,3%; 6-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 31 ,1 % und 65%; 8-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 29,9% und 58,2% (Fig. 10B). Zusammen genommen, der Western- Blot und die FACS-Ergebnisse demonstrieren eindeutig, dass die 6-PN- und 8-PN- induzierte Zytotoxizität auf Melanomzellen nicht durch Apoptose-Induktion erfolgt, sondern eher durch Nekrose. 6-PN und 8-PN induziert Autophagie in BLM und SK-MEL-28-Melanomzellen
Da spekuliert wurde, dass die Bildung von intrazytoplasmatischen Vakuolen in pankreatischen oder Brustkrebszellen durch 6-PN und 8-PN, die in früheren Studien beobachtet wurde, eine Induktion der Autophagie darstellen könnte, wurde dieser Aspekt auf einer molekularen Ebene weiter untersucht. BLM und SK-MEL- 28-Melanomzellen wurden mit "Ι ΟΟμΜ 6-PN, 8-PN, SAHA oder TSA (und mit DMSO als Kontrolle) behandelt, und die behandelten Zellen wurden lysiert, um die Proteine 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden zu extrahieren. Als Indikator für die Induktion von Autophagie wurde der Shift von LC3-I nach LC3-II (Konversion der löslichen Form von LC3 (LC3-I) zur autophagisch- vesikel-assoziierten Form (LC3-II), verwendet. In beiden Melanomzellen induzierten nach 12-24 Stunden nur 6-PN und 8-PN einen klaren Shift von LC3-I nach LC3-II (Fig. 10C). 6-PN und 8-PN inhibieren die Proliferation und Invasion von BLM und LOXIMVI- Melanomzellen in organotypischen humanen epidermalen Hautrekonstrukten
Da 6-PN und 8-PN nachweislich antiproliferative Effekte auf Melanomzellen in vitro ausüben, wurde gefragt, ob solche Effekte auch in einem komplexeren humanen epidermalen Hautrekonstrukt visualisiert werden können. In diesem Assay werden Keratinozyten und Melanomzellen auf die Oberfläche einer Kollagenmatrix ausplattiert, die mit Fibroblasten besiedelt war. Nach 16 Tagen bildete sich ein kerati- nisierendes stratifiziertes Epithel mit einem rudimentären Corium. Unbehandelte Kontroll-BLM-Zellen (die 70-80% Proliferation zeigten, bestimmte durch MIB1 - Immunhistochemie) haben einen großen Tumor im epidermalen Teil des Rekon- struktes gebildet und das Corium invadiert (Fig. 1 1A, obere Reihe). Um die Menge von proliferierenden Zellen zu bestimmen, wurde die Anzahl von MIB1 -positiven Melanomzellen pro Hochleistungsfeld im epidermalen Teil des Rekonstruktes an der epidermalen-dermalen Grenze gezählt (40-fache Vergrößerung, n=5 angrenzende Felder untersucht). Ferner wurde die Anzahl von Melanomzellen in den gleichen Hochleistungsfeldern gezählt, die den dermalen Teil des Rekonstruktes invadiert haben. In den Rekonstrukten mit unbehandelten BLM-Zellen wurden 103±15 MI B1 -positive Zellen und 39±13 invasive Zellen gezählt (Fig. 1 1A, obere Reihe). Eine Behandlung mit 100μΜ 6-PN reduzierte signifikant die Anzahl von proliferierenden BLM-Zellen und verringerte die Invasion: 27±6 MI B1 -positive Zellen und 9±4 invasive Zellen (p<0,01 , Student's t-test; Fig. 1 1A, mittlere Reihe). Fü 8-PN waren die Effekte im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen sogar noch deutlicher: 16±4 MIB1 -positive Zellen und 6±2 invasive Zellen (p<0,01 , Student's t Test; Fig. 1 1A, untere Reihe). Das Experiment mit den epidermalen Hautrekon- strukten wurde mit einer zweiten metastatischen humanen Melanomzelllinie (LOXIMVI) wiederholt, um die Zelllinien-Phänomenologie in der besonderen Hautrekonstruktumgebung auszuschließen. In der unbehandelten Gruppe waren die LOXIMVI-Zellen (ausgerichtet entlang der dermalen-epidermalen Grenze und in prominenten Tumorzellnestern im dermalen Teil der Aggregate) 100% MIB1 - positiv (Fig. 1 1 B). Die Behandlungen mit 6-PN und 8-PN führten jeweils zur vollständig inhibierten Zellproliferation der LOXIMVI-Zellen: Es konnten lediglich Nester von toten LOXIMVI-Zellen im dermalen Teil der Hautrekonstrukte detektiert werden (Fig. 1 1 B).
Zusammenfassend konnten die antiproliferativen Effekte, die in vitro beobachtet wurden, reproduziert werden und auf eine zusätzliche Inhibition der BLM- und LOXIMVI-Melanomzellinvasion in epidermalen Hautrekonstrukten erweitert werden.
In vivo Toxizitätsstudien mit 6-PN und 8-PN
Aufgrund der detektierten zytotoxischen Effekte auf Krebszellen und Melanozyten in vitro war die Bestimmung der Embryotoxizität in vivo von großem Interesse. Da zu wurden 2 Tage alte Hühnchenembryos für 24, 48 und 72 Stunden mit 10ΟμΜ 6 PN oder 100μΜ 8-PN behandelt, um das Überleben als Messgröße für letale Emb ryotoxizität zu beobachten (Fig. 1 1 C). Da das PN-Lösungsmittel, das für die Experimente in vitro verwendet wurde (DMSO), den Embryotoxizitätsassay und damit die Bestimmung der LD50-Werte negativ beeinflusst (7/7 Embryos waren 24 Stunden nach der Zugabe der entsprechenden Menge von DMSO tot; Fig. 1 1 C), wur- den die PNs nun in einer Mischung aus weniger toxischem Ethanol und PBS anstelle von DMSO gelöst, um artifizielle Nebenwirkungen des Lösungsmittels für dieses Experiment in vivo zu minimieren. Ferner wurde ein Vortest des neuen Lösungsmittels allein durchgeführt. Bei einer Konzentration von 500μΜ von Ethanol- lösungsmittel starben 6/7 Embryos innerhalb der ersten 24 Stunden und das verbliebene Embryo nach 48 Stunden. Es stellte sich heraus, dass 200μΜ Ethanol und PBS als Lösungsmittelmischung die LD50-Konzentration darstellt, wohingegen niedrigere Konzentrationen des Lösungsmittels (100μΜ und darunter) gut vertragen werden. 6-PN und 8-PN wurden deshalb bei 100μΜ getestet, die Konzentration, für die in den früheren Assays eine zytotoxische Wirksamkeit gezeigt werden konnte. 72 Stunden nach der Behandlung mit den PNs zeigten sich geringe embryotoxische Effekte: 6/10 Embryos überlebten nach 72 Stunden nach Behandlung mit 6-PN, und 8/10 Embryos nach Behandlung mit 8-PN (Fig. 1 1 C). Gemäß dem sehr sensitiven Embryotoxizitatsassay in vivo werden Konzentrationen von 100 μΜ 6-PN und 100μΜ 8-PN sehr gut toleriert. Schlussfolgerung
Die Erfinder konnten anhand von 19 verschiedenen Tumorzelllinien auf eindrucksvolle Art und Weise zeigen, dass ein Prenylflavonoid bzw. Prenylnaringenin (PN), insbesondere 6- und/oder 8-Prenylnaringenin (6-PN, 8-PN), zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms und/oder einer Melanomvorstufe und/oder einer Haut- und/oder Schleimhautmetastase geeignet sind.

Claims

Patentansprüche
1 . Pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms und/oder einer Melanomvorstufe und/oder einer Haut- und/oder Schleimhautmetastase, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff ein Pre- nylflavonoid aufweist.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Prenylflavonoid ein Prenylnaringenin ist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Prenylnaringenin 6- und/oder 8-Prenylnaringenin aufweist.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Melanom und/oder der Melanomvorstufe um solche der Haut handelt.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Melanom um Melanomhaut- und/oder Melanomschleimhaut- metastasen handelt.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur topischen Applikation ausgebildet ist.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur topischen Applikation auf die Haut ausgebildet ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer Applikationsform vorliegt, die ausgewählt ist aus der Gruppe be- stehend aus: Salbe, Creme, Lotion, Gel, Paste, transdermales therapeutisches System, Schaum, Puder.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen weiteren gegen Melanome und/oder Melanomvorstufen und/oder Haut- und/oder Schleimhautmetastasen wirksamen Wirkstoff aufweist.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff ein Nekroseinhibitor ist.
1 1 . Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Nekroseinhibitor IM-54 ist.
12. Verwendung eines Prenylflavonoids, vorzugsweise von Prenylnaringenin, weiter vorzugsweise von 6- und/oder 8-Prenylnaringenin, als epigenetisch aktiver arzneilicher Wirkstoff.
13. Verwendung eines Prenylflavonoids, vorzugsweise von Prenylnaringenin, weiter vorzugsweise von 6- und/oder 8-Prenylnaringenin, zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms und/oder einer Melanomvorstufe und/oder einer Haut- und/oder Schleimhautmetastase.
14. Verwendung eines Prenylflavonoids, vorzugsweise von Prenylnaringenin, weiter vorzugsweise von 6- und/oder 8-Prenylnaringenin, als Histondeacetylaseinhibitor (HDACi).
15. Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms und/oder einer Melanomvorstufe und/oder einer Haut- und/oder Schleimhautmetastase bei einem Lebewesen, vorzugsweise einem Menschen, das folgende Schritte aufweist: Bereitstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , und
Applikation der pharmazeutischen Zusammensetzung auf die Haut des Lebewesens, vorzugsweise das Melanom und/oder die Melanomvorstufe und/oder die Haut- und/oder Schleimhautmetastase.
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