EP2929012A1 - Nouvelle souche bacterienne de lactobacillus plantarum et utilisations de cette souche - Google Patents

Nouvelle souche bacterienne de lactobacillus plantarum et utilisations de cette souche

Info

Publication number
EP2929012A1
EP2929012A1 EP13801605.0A EP13801605A EP2929012A1 EP 2929012 A1 EP2929012 A1 EP 2929012A1 EP 13801605 A EP13801605 A EP 13801605A EP 2929012 A1 EP2929012 A1 EP 2929012A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
composition
strain
virus
lactobacillus plantarum
plantarum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP13801605.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe LAGELLA
Luis G. BERMUDEZ HUMARAN
Florian CHAIN
Nora KECHAOU
Jean-Marc CHATEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP2929012A1 publication Critical patent/EP2929012A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/169—Plantarum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to the field of probiotics. More specifically, the present invention relates to a new bacterial strain of Lactobacillus plantarum (CNCM 1-4643) and its uses, which bacterial strain has a resistance to stress of the digestive tract and the ability to strengthen the immune system, particularly against influenza virus.
  • CNCM 1-4643 Lactobacillus plantarum
  • Respiratory infections are infections of the organs of the respiratory system that can be caused by bacteria or viruses.
  • Viruses are responsible for about 80% of acute respiratory infections.
  • the main families of viruses causing respiratory infections are Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae and Adenoviridae.
  • Influenza is one of the most common respiratory infections. It is caused by RNA viruses of the family Orthomyxoviridae comprising three genera: Myxovirus influenzae A, B and C. These viruses can infect certain mammals and birds. In humans, and for people in good health, the symptoms of the flu are mainly fever, muscle aches, coughs or headaches. In some cases, influenza may be accompanied by bacterial superinfection which may eventually lead to pneumonia. Sometimes, especially in immunocompromised people, the elderly, pregnant women and children, influenza can have more serious consequences, even death.
  • influenza is a very common cause of sick leave for working people and has a very important medico-economic cost evaluated between 450 and 500 million euros for France for a medium epidemic.
  • influenza In the temperate zones, influenza is an epidemic infection occurring mainly from autumn to spring, hence its name of seasonal influenza. In the tropics, flu can occur throughout the year.
  • the influenza virus is transmitted by the respiratory route, that is to say via droplets containing viruses from mouth and / or nasal projections, when a contaminated person speaks, coughs or sneezes.
  • viruses are characterized by a large genetic variability expressed by two different mechanisms.
  • the first mechanism is the antigenic shift, caused by mutations that preferentially affect the genes encoding the antigenic glycoproteins of the envelope but do not modify the overall antigenic structure of the virus, which allows the immune system to remain effective at least partially and short term.
  • the second mechanism responsible for the variability of influenza viruses is genetic reassortment resulting in the regular appearance of new viral subtypes. It is characterized by reassortments between genomic RNA segments of two different types of viruses. This variability only affects viruses of the genus influenzavirus type A. It is these new viral subtypes, against which human populations are not immune, that create pandemics. Viral subtypes causing pandemics include Myxovirus influenzae A subtype HlNl, Myxovirus influenzae A subtype H3N2, or recently Myxovirus influenzae A subtype H5 1.
  • the inventors have demonstrated, surprisingly and unexpectedly, a bacterial strain of Lactobacillus plantarum having a positive effect on the immune system, both for innate immunity and for adaptive immunity. This effect is particularly evident in the case of influenza. Even more surprisingly, this bacterial strain has bile salt resistance, which is a stress inherent in the human digestive tract and in particular the intestines.
  • a first subject of the invention relates to a bacterial strain of L. plantarum deposited with the National Collection of Culture of Microorganisms (CNCM, Institut Pasteur) under accession number CNCM 1-4643, or a mutant thereof.
  • Another subject of the invention relates to a use of the strain of the invention as a probiotic.
  • Another subject of the invention relates to a composition comprising the bacterial strain L. plantarum of the invention.
  • Figure 1 Scheme describing the experimental protocol followed for the determination of bile salt resistance of the strain Lactobacillus plantarum of the invention.
  • Figure 2 Graph showing a global view of the exponential phase entry delays of strains tested for bile salt stress.
  • FIG. 4 Graph showing the variation of IL8 measured for the strains tested for the determination of their pro-inflammatory or anti-inflammatory profile.
  • Figure 5 (A) and (B) Graphics showing the efficacy in mice of the L. plantarum strain of the invention against the influenza virus H1N1 / PR8 on weight variations.
  • Figure 6 Graph showing the efficacy in mice of the L. plantarum strain of the invention against the influenza virus H1N1 / PR8 on the physical state (visual scores).
  • Figure 7 Graph showing the efficacy in mice of the L. plantarum strain of the invention against the H1N1 / PR8 influenza virus on the viral load. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • a first subject of the invention relates to a bacterial strain of Lactobacillus plantarum deposited with the National Collection of Culture of Microorganisms (CNCM, Institut Pasteur) under accession number CNCM 1-4643, or a mutant thereof.
  • the L. plantarum strain of the invention was deposited according to the Budapest Treaty to the National Collection of Microorganisms Culture (CNCM) of the Institut Pasteur (28 rue du Dondel Roux 75024 Paris Cedex 15) with the registration number CNCM 1-4643.
  • CNCM National Collection of Microorganisms Culture
  • Lactobacillus plantarum is intended to mean a probiotic bacterial strain isolated from yak milk.
  • the strain Lactobacillus plantarum of the invention corresponds to the strain Lactobacillus plantarum VEL 12238.
  • bacterial strain is constituted by a succession of cultures derived from a pure culture of bacteria.
  • the bacterial strain is not necessarily derived from a single ancestor by cell division.
  • probiotic is intended to mean living or dead microorganisms which, administered in a sufficient quantity to a host, in particular an animal, have a beneficial effect on the health of the host. More specifically, probiotics are known to have a beneficial effect on the intestinal microbiota (formerly intestinal flora) by maintaining its balance.
  • the intestinal microbiota has four recognized functions: a physiological function, both on the anatomy and the histology of the digestive tract and on the intestinal transit; a digestive function, by the digestion of certain types of molecules such as lipids and proteins; an anti-infectious protection function, by preventing the development of potentially pathogenic germs in the intestines and finally an immune function, by the activation of the immune system.
  • the term "mutant” is intended to mean a bacterial strain of Lactobacillus plantarum having undergone one or more mutations, that is to say one or more changes in one or more nucleic acid sequences (such as as the sequence of a gene) or in one or more amino acid sequences, compared, for example, with the nucleic acid or amino acid sequence present in the typical Lactobacillus plantarum bacterial strain as described in US Pat. present invention.
  • Said mutations are for example substitutions and / or deletions and / or insertions of one or more nucleotides as well as combinations thereof. These mutations can appear spontaneously or be introduced using molecular biology techniques.
  • the mutants of the bacterial strain of the invention have the same biological activity (s) or biological activities similar to that of the bacterial strain of the invention.
  • the term “mutant” may be used interchangeably with the term “variant”.
  • the Lactobacillus plantarum strain exhibits an acid stress resistance induced by bile salts.
  • bile acids and “bile salts” means the acids that are found in mammalian bile and secreted by the liver in which they are formed from bilirubin derivatives and from acidic steroids.
  • the role of bile acids is fragmentation of lipid globules in the intestines during digestion and inhibition of bacterial growth in the upper digestive tract (duodenum).
  • Bile acids include cholic, glycocholic, taurocholic, deoxycholic, and chenodeoxycholic acids.
  • the strain Lactobacillus plantarum has pro-inflammatory properties.
  • pro-inflammatory is meant, in the sense of the present invention, the ability to activate and maintain tissue inflammation caused by infection or disease.
  • the probiotic bacterial strain of the invention Lactobacillus plantarum can be administered to humans or animals without risk to health.
  • Another subject of the invention relates to a use of the bacterial strain of Lactobacillus plantarum of the invention as a probiotic.
  • Another subject of the invention relates to a composition comprising the bacterial strain Lactobacillus plantarum of the invention.
  • the composition of the invention is a probiotic and / or pharmaceutical composition
  • probiotic composition is intended to mean a dietary supplement which has beneficial effects on the health of the host to which it is administered.
  • a probiotic composition contains probiotic microorganisms that must be ingested to induce beneficial effects in humans as defined by WHO (2001); which microorganisms can be alive or dead. Live probiotics can secrete a full range of antigens, multiply to promote interactions with the intestinal mucosa and adhere to intestinal tissue to stimulate the immune response.
  • pharmaceutical composition is intended to mean a formulation comprising an active agent, which is a probiotic bacterium in the present invention, in combination with excipients making it possible to stabilize said composition and its oral administration.
  • the strain of the invention may be used in combination with one or more other probiotic species for the preparation of probiotic compositions.
  • species belonging to the genera Bifidobacterium, Streptococcus and Lactococcus commonly used in the dairy industry, may be used (for example Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus).
  • They can be used in the form of living whole bacteria or not, and also in the form of bacterial lysate, or in the form of bacterial fractions.
  • the composition of the invention comprises at least 10 5 , preferably at least 10 6 , and at most 10 10 Lactobacillus plantarum cells of the invention per ml.
  • the probiotic composition of the invention comprises one or more acceptable excipients.
  • excipient is intended to mean any substance, other than the active principle of the probiotic composition, intended to confer on the said probiotic composition particular physical, chemical or taste characteristics that do not interact with the active principle.
  • Said excipients may be of natural origin or of synthetic origin.
  • acceptable excipients include: sugars such as sucrose, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose and xylose; polyols such as sorbitol, xylitol, erythritol, and lactitol; emulsifiers such as sucrose esters of fatty acids, glycerol esters of fatty acids and lecithin; thickeners and stabilizers such as carrageenan, xanthan gum, guar gum, pectin and locust bean gum; acidifiers such as citric acid, acid lactic and malic acid; fruit juices such as lemon juice, orange juice and berry juice; vitamins such as vitamin A, vitamin B, vitamin C, vitamin D and vitamin E; and minerals such as calcium, iron, manganese and zinc.
  • sugars such as sucrose, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose and xylose
  • polyols such as sorbito
  • composition of the invention is in an orally administrable form.
  • compositions may take the form of capsules, tablets, powders, lozenges, granules, soft capsules, reconstitutable powders, suspensions, frozen compositions, oral liquid preparations or conventional food products.
  • the composition of the invention is in the form of a capsule.
  • Oral tablets and capsules may be single-dose and may contain one or more acceptable excipients such as binders, fillers, lubricants, wetting agents or disintegrants.
  • the tablets may be coated by methods well known in the pharmaceutical field.
  • Liquid oral preparations may, for example, be in the form of aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups or elixirs in the form of dehydrated products that can be reconstituted with water or any other acceptable vehicle.
  • Such liquid preparations may contain commonly used additives such as suspending agents, emulsifiers, non-aqueous vehicles, preservatives and optionally flavorings and / or dyes.
  • composition of the invention is in the form of a food product or a food supplement.
  • food product and “conventional food product” is meant, within the meaning of the present invention, any substance or product, having been transformed, partially converted or not converted and intended to be ingested by humans or animals.
  • Food products can be of animal origin, vegetable or mineral. Food products provide the body with the energy and nutrients it needs to function.
  • the food product according to the invention may be a liquid, therefore a drink, or solid.
  • food supplement is intended to mean any product containing nutrients that are beneficial to health and that are added to the normal diet of humans or animals.
  • Food supplements contain, but are not limited to, vitamins, minerals, amino acids, enzymes and probiotics.
  • composition of the invention may be in the form of a dairy product.
  • the dairy products according to the invention may be based on raw milk.
  • the milks used may be, for example, cow, goat, sheep, yak, buffalo or soya milk milks.
  • the dairy products according to the invention may be in liquid, solid or powder form.
  • the dairy products according to the invention may for example be milk, butter, cheese or cream.
  • the dairy products according to the invention may be based on plant milks.
  • Vegetable milks include but are not limited to soy milk, rice, oats or almonds.
  • composition of the invention may be in the form of a fermented dairy product.
  • a fermented dairy product is for example a yoghurt.
  • the strain of the invention can be used in combination with yogurt ferments, namely Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus.
  • said composition advantageously comprises at least 10 7, preferably between 2 ⁇ 10 8 to lxlO 9 S. thermophilus cells per ml, and at least 5> ⁇ 10 5 preferably between 4x10 6 and 2> ⁇ 10 7 cells of L. bulgaricus per ml.
  • composition according to the invention has an immunomodulatory function making it useful both in the treatment and / or prevention of infections and / or allergies.
  • the composition of the invention is intended to prevent and / or treat infections.
  • composition of the invention is intended to prevent and / or treat respiratory infections.
  • respiratory infection is meant, within the meaning of the present invention, a disease, a disorder or an infection affecting the group of organs composing the respiratory system and responsible for transporting oxygen from the air to the bloodstream. and the release of exhaled carbon into the air.
  • the respiratory system consists of the nose, nasal cavity, pharynx, larynx, trachea, bronchi and lungs.
  • prevention and “prevention” is intended to prevent the appearance of a disease, disorder or one or more signs and / or symptoms of a disease or disorder. .
  • treating and “treatment” is intended to improve or remedy a disease, a disorder or one or more signs and / or symptoms of a disease or disorder.
  • composition of the invention makes it possible to strengthen a specific systemic immune response with respect to a pathogenic microorganism of the respiratory tract.
  • said respiratory infections are caused by viruses.
  • said viruses are viruses of the respiratory tract.
  • said viruses are chosen from rhinoviruses, myxoviruses, coronaviruses or even adenoviruses.
  • myxovirus refers to viruses belonging to families
  • rhinovirus refers to a genus of viruses belonging to the family Picornaviridae.
  • coronavirus refers to viruses belonging to the family Coronaviridae.
  • adenovirus refers to viruses belonging to the family Adenoviridae.
  • said virus is an influenza virus.
  • Such viral respiratory infections can be, for example, influenza, bronchiolitis, bronchitis, pharyngitis, nasopharyngitis, pneumonia, rhinitis, sinusitis, Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), or colds.
  • influenza bronchiolitis
  • bronchitis pharyngitis
  • nasopharyngitis nasopharyngitis
  • pneumonia rhinitis
  • sinusitis Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), or colds.
  • SARS Severe Acute Respiratory Syndrome
  • said influenza is an influenza transmitted by the virus Myxovirus influenzae A subtype H1 1.
  • the invention also comprises a method for preventing and / or treating respiratory infections, comprising a step of administering to a patient a therapeutically effective amount of the Lactobacillus plantarum strain or a composition comprising said strain of the invention. .
  • the term "therapeutically effective amount” is intended to mean the minimum amount necessary to obtain the desired effect by the administration of such a strain or composition.
  • the term "patient” means an animal, preferably a mammal, and more preferably a human, requiring the administration of the Lactobacillus plantarum strain or a composition comprising said strain for the prevention and / or treatment of respiratory infections.
  • Lactobacillus plantarum VEL 12238 (CNCM 1-4643) to bile salts compared to 157 other strains isolated within different biotopes and including a majority of lactobacilli (90 Lactobacillus spp., 31 Lactococcus spp., 31 Bifidobacterium spp., 3 Streptococcus spp., 2 Pediococcus spp. and 1 Bacillus spp.). Strains of Lactococcus and Streptococcus were cultured at 30 ° C without agitation on M17 medium (DIFCO) supplemented with 5% lactose.
  • DIFCO M17 medium
  • Lactobacillus and Pediococcus were cultured at 37 ° C without agitation on MRS medium (DIFCO).
  • the Bifidobacterium strains were cultured at 37 ° C. under anaerobic conditions (GENBOX MICROAER, BIOMERIEUX) without stirring on MRS medium (DIFCO) supplemented with 10% cysteine (SIGMA).
  • the Bacillus strain was cultured on LURIABERTANI (DIFCO) medium at 37 ° C with shaking.
  • Figure 2 is a graph showing a global view of exponential phase entry delays of strains tested for bile salt stress.
  • Exponential phase-in delays range from approximately 0 for the most resistant bile salt strain to 19 h, the maximum growth monitoring time, for strains least resistant to bile salt stress.
  • the Lactobacillus plantarum strain according to the invention has an exponential phase entry delay of approximately 3 hours. About 75% of the strains tested have an exponential phase entry delay greater than that of the Lactobacillus plantarum strain for bile salt stress.
  • the purpose of this manipulation is to test the immunomodulatory properties of the strain Lactobacillus plantarum VEL 12238 in comparison with a collection of nearly 160 strains (The collection includes 158 strains from different biotopes and including: 90 Lactobacillus spp., 31 Lactococcus spp., 31 Bifidobacterium spp., 3 Streptococcus spp., 2 Pediococcus spp. And 1 Bacillus spp.) When screened with PBMCs all from the same donor.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • FCS Fetal calf serum
  • PBMCs are delivered on dry ice and are ideally stored in liquid nitrogen. Failing at -80 ° C. It is best not to exceed one week at -80 ° C to maintain a good viability of the cell population.
  • DNAse I has the role of preventing aggregates. To be used from a 10 mg / ml stock solution for a final concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • composition of the mix :
  • Centrifugation / resuspension cycle centrifugation for 15 minutes at 2000 g and then recovery in 15-20 ml of mix.
  • Enumeration with trypan blue - Take 90 ⁇ of RPMI medium then ⁇ of cells, then 50 ⁇ of this mixture with 50 ⁇ of blue (counting of the dilution at 20th, so)
  • This cell suspension is deposited using pipettes of 20 ml in the wells of the plates under sterile hood. So deposit about 1 ml per well.
  • the bacterial cultures are centrifuged, washed in PBS, centrifuged again and taken up in PBS (1 ml). The OD is then adjusted to 1 by diluting the samples in PBS.
  • An OD of 1 to 600 nm corresponds to approximately 5.10 8 bacterial cells.
  • the supernatants are frozen and stored at -80 ° C until the day of analysis.
  • the analysis is carried out by assaying IL-10 and IL-12p70 by the method
  • the IL-12p70 / IL-10 ratio is calculated.
  • FIG. 3 This figure represents the ratio IL-12p70 / IL-10 measured as a function of the bacterial strain tested. The calculated ratios range from 0.1 for the most anti-inflammatory strain to about 8 for the most proinflammatory strain. Strains known as neutral strains have an IL-12p70 / IL-10 ratio of between approximately 1.5 and 3. For the Lactobacillus plantarum strain, the IL-12p70 / IL-10 ratio is slightly less than 7. Only two of the strains tested had an IL-12p70 / IL-10 ratio higher than that of the Lactobacillus plantarum strain.
  • strain Lactobacillus plantarum of the invention has a proinflammatory profile.
  • the purpose of this manipulation is to test the immunomodulatory properties of the strain Lactobacillus plantarum in comparison with a collection of nearly 160 strains (The collection comprises 158 strains from different biotopes and including: 90 Lactobacillus spp., 31 Lactococcus spp., 31 Bifidobacterium spp., 3 Streptococcus spp., 2 Pediococcus spp. and 1 Bacillus spp.) when screened with HT-29.
  • J-4 Change of culture media of HT29 cells
  • J-3 Change of culture media HT29 cells
  • J-2 Change of culture media of HT29 cells
  • J-1 Change of culture media of HT29 cells
  • the volume to be added per well is also set at 50 ⁇ , so we want: 7.32 10 6 CFU / 50 I.
  • the concentration is estimated at 5 10 8 CFU / ml, so to have a concentration of 1.46 10 8 CFU / ml:
  • TNF ⁇ cytokines enabling activation of the N FKB pathway
  • the 24 hour cultures are centrifuged at 3000g for 5 minutes;
  • the pellets are taken up in 1 ml of DMEM;
  • the pellets are taken up in 1 ml of DMEM + serum FCS 5% + glutamine 1%;
  • the OD is measured for each of the strains (dilution 1/10 DMEM + serum SVF 5% + glutamine 1%, white: DMEM + serum SVF 5% + glutamine 1%);
  • ROCHE anti-protease pellet
  • the plates are centrifuged for 10 minutes at 13000 g and then the supernatants are recovered in DEEPWELL in the presence of anti-protease.
  • the "DEEPWELI" plates are stored at -80 ° C while waiting for the ELISA assay;
  • the 24-well plates are washed with PBS (500 ⁇ l) and then the PBS is removed using a pasteur pipette connected to a vacuum pump system;
  • Interleukin 8 is assayed by the ELISA method. Total proteins are assayed by the BRADFORD method. The results obtained are shown in FIG. 4. This figure represents the percentage variation of IL-8 measured as a function of the bacterial strain tested. The amounts measured range from about -45% for the most anti-inflammatory strain to about 75% for the most proinflammatory strain. For the strain Lactobacillus plantarum, the variation of IL-8 is about + 45%. Only four of the strains tested had an IL-8 variation greater than that of the strain Lactobacillus plantarum.
  • strain Lactobacillus plantarum of the invention has a proinflammatory profile.
  • Example 4 Testing the effectiveness of the probiotic bacterial strain Lactobacillus plantarum of the invention against an influenza virus in mice
  • mice were tested the immunomodulatory properties of the bacterial strain L. plantarum in the case of winter infections. a) Viral inoculation in mice
  • mice BALB / c female mice (January, France) were used for this test. They were divided into batches of 8 mice (4 mice per cage). Experiments started after two weeks of acclimation of the mice in the Rodent Animal Experimentation Unit in a confined-atmosphere cell, due to the use of the influenza virus. For the duration of the experiment, the mice had unlimited access to food and water.
  • Influenza Virus The H1N1 / PR8 / 34 influenza virus (influenza virus adapted to the murine model) was produced by culturing in 11-day-old eggs of fertile hens for 2 days at 35 ° C. The viral titer was quantified by a plaque assay using Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells and the viral stock is stored at -80 ° C for subsequent uses.
  • MDCK Madin-Darby Canine Kidney
  • Intra-nasal infections with the virus The mice, aged seven weeks, were initially anesthetized by intraperitoneal injection of IMALGENE 1000 / ketamine (MERIAL) and Rompum / xylazine (ALCYON) (0.1% ketamine + 0.06% xylazine, qs physiological water). They were then infected by the deposit of 25 ⁇ of viral suspension in each nostril. Several concentrations of viral inocula were tested: 2000, 200 and 100 PFU to identify the concentration that does not induce mortality, apart from the visible symptoms of the disease.
  • the stationary phase cultures of the candidate strains of probiotic bacteria (Lactobacillus plantarum VEL 12238 and Lactobacillus paracasei VEL 12195) were centrifuged at 3000 g for 10 minutes. The pellets were washed in sterile PBS. The pellets were then resuspended in sterile PBS to have a final concentration of 1.10 9 CFU / mouse.
  • mice received 200 ⁇ of this bacterial dose daily by oral administrations (intragastric gavages), or simply PBS for the control groups, for 10 days as a preventive and 9 days as a cure after the viral infection. Mice were sacrificed on day 10 (D10).
  • Macroscopic markers informing about the physical state of the mice were used throughout the test:
  • mice The weight of the mice was monitored daily from the viral infection as well as
  • mice taking into account their external appearance using a rating scale (Kawase, He et al., 2009):
  • mice On the day of slaughter, the mice were euthanized by cervical dislocation. Bronchoalveolar lavages (BALF) have been collected with a cone attached to a syringe, inserted into the upper part of the trachea of the mouse. Back and forth were then performed with a total volume of 1mL of PBS to wash the lungs. BALFs were frozen at -80 ° C until use. Antibody assays (total IgA, total IgM, total IgE, virus specific IgG1, virus specific IgG2a and virus specific IgA) were performed. Total antibody assays (IgA, IgM and IgE) were performed using ELISA kits (MABTECH).
  • BALF Bronchoalveolar lavages
  • virus-specific antibody assays were made with a suitable ELISA protocol, including a step of fixing the plates with viral proteins and the use of conjugated anti-IgG1, IgG2a or IgGA (BD-PHARMINGEN, France) antibodies. to a peroxidase.
  • RNAs were then removed and frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. A piece of a few milligrams of lung was milled in the presence of lysis buffer (RLT + ⁇ -mercaptoethanol) and ceramic beads of diameter 1 mm. Extraction of the total RNA from the lungs of the mice was then performed with the QIAGEN RNEASY MINI KIT (QIAGEN). The RNAs were then treated with DNase I. The total RNA concentration was assayed with NANODROP (THERMO FISHER SCIENTIFIC). A reverse transcriptase was performed with SUPERSCIPT II reverse transcriptase (INVITROGEN) and a specific primer from 2.5 ⁇ g of total RNA according to the supplier's indications.
  • a quantitative PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction was finally performed with the QUANTI TECT SYBR GREEN PCR (APPLIED BIOSYSTEMS) PCR kit, the H1N1 PR8 / 34 specific primers and the MASTERCYCLER REALPLEX (EPPENDORF).
  • the amplification conditions were as follows: 10 minutes at 95 ° C., 40 cycles (15 seconds at 95 ° C., 20 seconds at 64 ° C. and 30 seconds at 72 ° C.), 15 seconds at 95 ° C. seconds at 60 ° C, 20 minutes for the hybridization curve and 15 seconds at 95 ° C.
  • Quantification was performed by comparison to a standard viral range established from a plasmid containing the target gene sequence (capsid) of the primers used. f) Statistical analysis
  • mice infected with the H1N1 PR8 / 34 virus are presented in FIG. 5A and B.
  • FIG. 5A is a graph showing the 4 curves representing the weight variations of the batches of mice:
  • mice infected with the virus without receiving a dose of probiotic bacteria lost 25% of their weight on D10.
  • Mice infected with the virus and given doses of L. paracasei VEL 12195 lost between 20 and 25% of their weight on D10.
  • Mice infected with the virus and dosed with L. plantarum VEL 12238 lost 10% of their body weight on D10. Control mice did not lose weight.
  • the L. plantarum strain VEL 12238 has a marked effect on the maintenance of the weight of mice infected with the H1N1 PR8 / 34 virus. It allows the mice to preserve 90% of their weight on day 10, whereas the mice infected with the virus that received PBS and the mice infected with the virus that received doses of L. paracasei VEL 12195 preserved, on D10, 75 respectively. % and between 75 and 80% of their weight.
  • the bacterial probiotic strain L plantarum VEL 12238 therefore has a protective effect against the influenza virus, and particularly the H1N1 influenza virus.
  • Figure 5B shows the air under the curve for each of the three batches of mice infected with the virus.
  • the area under the curve representing the virus-infected lot that received PBS is less than the area under the curve representing the virus-infected lot and received doses of L paracasei VEL 12195.
  • Area under the curve representing the lot of virus-infected mice that received doses of L. plantarum VEL 12238 is greater than the areas of the other two batches of mice infected with the virus.
  • Figure 6 shows the visual scores defining the external appearance of the mice for the three batches infected with the H1N1 PR8 / 34 virus and having received doses of PBS or L. paracasei VEL 12195 or L. plantarum VEL 12238, to OJ and J10.
  • mice infected with H1N1 PR8 / 34 virus and receiving doses of PBS or L. paracasei VEL 12195 had an approximately identical visual score of 3, corresponding to a moderately spindly and lethargic fur (Moderate) .
  • mice infected with H1N1 PR8 / 34 virus and receiving doses of L plantarum VEL 12238 have a visual score close to 4, corresponding to a slightly bristly fur (light).
  • mice infected with H1N1 PR8 / 34 virus and receiving doses of L. plantarum are in better physical state than mice infected with H1N1 PR8 / 34 virus and given doses of PBS or L. paracasei VEL 12195.
  • the bacterial probiotic strain L. plantarum VEL 12238 therefore has a protective effect against the influenza virus, and particularly the H1N1 virus.
  • FIG. 7 represents the viral load (logarithmic copy number of viral genome in 2.5 ⁇ g of total RNA) at day 10 and day 14 in the lungs of mice infected with H1N1 PR8 / 34 virus and having received doses of PBS. or L. paracasei VEL 12195 or L plantarum VEL 12238.
  • the lungs of the mice infected with the H1N1 PR8 / 34 virus and having received PBS doses had a viral load of approximately 3.5; the lungs of mice infected with H1N1 PR8 / 34 virus and having received doses of L. paracasei VEL 12195 have a viral load of about 4; the lungs of the mice infected with the H1N1 PR8 / 34 virus and receiving doses of L plantarum VEL 12238 have a viral load of between 2 and 2.5.
  • the lungs of the mice infected with the H1N1 PR8 / 34 virus and having received doses of PBS have a viral load of approximately 1.5; the lungs of mice infected with H1N1 PR8 / 34 virus and given doses of L. paracasei VEL 12195 have a viral load of about 2; the lungs of mice infected with H1N1 PR8 / 34 virus and receiving doses of L. plantarum VEL 12238 have a viral load of about 0.5.
  • the L. plantarum probiotic bacterial strain of the invention therefore has a protective effect against the influenza virus, and particularly the H1N1 virus.
  • Example 5 Clinical trial evaluating the efficacy of the strain Lactobacillus plantarum against episodes of colds in humans.
  • the purpose of this study is to evaluate the effect of the Lactobacillus plantarum probiotic strain of the invention on cold episodes in a healthy adult population (placebo-controlled, double-blind, randomized trial).
  • the selection criteria for the patients participating in the study are: healthy subjects, aged 18 to 65, subjects with colds (at least one in the year preceding this trial) and who gave their written informed consent to their participation in this study. Patients meeting the selection criteria are randomized into two groups of 200 subjects receiving the double-blind study product, that is, the placebo or true Lactobacillus piantarum of the invention.
  • the purpose of these experiments is to test the ability of this strain to stimulate in the mouse an immune response both local (mucosal) and systemic.
  • the strain is administered to mice orally for 7 days.
  • mice At the end of this period, the small intestine of mice is recovered and the levels of secretory IgA antibodies (S-IgA) are determined.
  • S-IgA secretory IgA antibodies
  • IgA + cells, macrophages, dendritic cells (DC) and goblet cells are also determined on the same samples.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention est relative au domaine des probiotiques. Plus particulièrement, la présente invention s'intéresse à une souche bactérienne probiotique Lactobacillus plantarum présentant un effet positif sur le système immunitaire, à la fois pour l'immunité inné et l'immunité adaptative. Cet effet se manifeste notamment dans le cas de la grippe. De manière plus surprenante encore, cette souche bactérienne présente une résistance aux sels biliaires, qui sont un stress inhérent au tube digestif humain et en particulier aux intestins. La présente invention concerne également des utilisations de ladite souche bactérienne. Par ailleurs, la présente invention s'intéresse à une composition contenant ladite souche.

Description

NOUVELLE SOUCHE BACTERIENNE DE LACTOBACILLUS PLANTARUM ET UTILISATIONS DE CETTE SOUCHE
La présente demande de brevet internationale revendique la priorité de la demande de brevet français FR 12/03017 déposée en date du 9 novembre 2013, laquelle est incorporée dans son entièreté par référence.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention est relative au domaine des probiotiques. Plus précisément, la présente invention est relative à une nouvelle souche bactérienne de Lactobacillus plantarum (CNCM 1-4643) et à ses utilisations, laquelle souche bactérienne présente une résistance aux stress du tractus digestif et la capacité à renforcer le système immunitaire, notamment contre le virus de la grippe.
ART ANTERIEUR
Les infections respiratoires sont des infections des organes du système respiratoire qui peuvent être causées par des bactéries ou des virus.
Les virus sont responsables d'environ 80% des infections respiratoires aiguës. Les principales familles de virus causant des infections respiratoires sont les suivantes : Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae et Adenoviridae.
La grippe compte parmi les infections respiratoires les plus fréquentes. Elle est causée par des virus à ARN de la famille des Orthomyxoviridae comprenant trois genres : Myxovirus influenzae A, B et C. Ces virus peuvent infecter certains mammifères et les oiseaux. Chez les humains, et pour les personnes en bonne santé, les symptômes de la grippe sont principalement la fièvre, les douleurs musculaires, la toux ou encore les maux de tête. Dans certains cas, la grippe peut s'accompagner d'une surinfection bactérienne pouvant éventuellement conduire à des pneumopathies. Parfois, notamment chez les personnes immunodéprimées, les personnes âgées, les femmes enceintes et les enfants, la grippe peut avoir des conséquences plus graves, allant jusqu'à la mort.
Chaque année, la grippe cause entre 250 000 et 500 000 décès dans le monde et entre 1 500 et 5 000 décès en France.
De plus, la grippe est une cause très fréquente d'arrêt maladie pour les personnes actives et a un coût médico-économique très important évalué entre 450 et 500 millions d'euros pour la France pour une épidémie moyenne.
Dans les zones tempérées, la grippe est une infection épidémique survenant principalement de l'automne au printemps, d'où son appellation de grippe saisonnière. Dans les zones tropicales, la grippe peut survenir tout au long de l'année.
Le virus de la grippe se transmet par voie respiratoire, c'est-à-dire par l'intermédiaire de gouttelettes contenant des virus provenant de projections buccales et/ou nasales, lorsqu'une personne contaminée parle, tousse ou éternue.
Le moyen le plus utilisé jusque-là pour lutter contre la grippe est la vaccination, qui a permis de limiter l'expansion du virus.
Cependant, ces virus sont caractérisés par une grande variabilité génétique s'exprimant selon deux mécanismes différents. Le premier mécanisme est le glissement antigénique, causé par des mutations touchant préférentiellement les gènes codant pour les glycoprotéines antigéniques de l'enveloppe mais ne modifiant pas la structure antigénique globale du virus, ce qui permet au système immunitaire de rester efficace au moins partiellement et à court terme.
Le second mécanisme responsable de la variabilité des virus de la grippe est le réassortiment génétique entraînant l'apparition régulière de nouveaux sous-types viraux. Elle se caractérise par des réassortiments entre les segments d'ARN génomique de deux types de virus différents. Cette variabilité ne touche que les virus du genre influenzavirus type A. Ce sont ces nouveaux sous-types viraux, contre lesquels les populations humaines ne sont pas immunisées, qui créent des pandémies. Parmi les sous-types viraux ayant été à l'origine de pandémies, on retrouve Myxovirus influenzae A sous-type HlNl, Myxovirus influenzae A sous-type H3N2, ou encore dernièrement Myxovirus influenzae A sous-type H5 1.
Il existe donc un besoin pour un moyen de prévenir et/ou traiter les infections, notamment les infections respiratoires comme la grippe, en renforçant le système immunitaire, plus particulièrement durant les périodes propices aux épidémies de grippe. Plus généralement, il existe un besoin pour un moyen de moduler le système immunitaire pour lutter contre les infections et pour limiter les réactions allergiques.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis en évidence, de manière surprenante et inattendue, une souche bactérienne de Lactobacillus plantarum présentant un effet positif sur le système immunitaire, à la fois pour l'immunité innée et pour l'immunité adaptative. Cet effet se manifeste notamment dans le cas de la grippe. De manière plus surprenante encore, cette souche bactérienne présente une résistance aux sels biliaires, qui est un stress inhérent au tube digestif humain et en particulier aux intestins.
Un premier objet de l'invention concerne une souche bactérienne de L. plantarum déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur) sous le numéro d'accession CNCM 1-4643, ou un mutant de celle-ci.
Un autre objet de l'invention concerne une utilisation de la souche de l'invention comme probiotique.
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant la souche bactérienne L. plantarum de l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Schéma décrivant le protocole expérimental suivi pour la détermination de la résistance aux sels biliaires de la souche Lactobacillus plantarum de l'invention. Figure 2 : Graphique présentant une vue globale des retards d'entrée en phase exponentielle des souches testées pour le stress aux sels biliaires.
Figure 3 : Graphique présentant le ratio IL 12p70/IL 10 mesuré pour les souches testées pour la détermination de leur profil pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire.
Figure 4 : Graphique présentant la variation d'IL8 mesurée pour les souches testées pour la détermination de leur profil pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire.
Figure 5 : (A) et (B) Graphiques présentant l'efficacité chez la souris de la souche L. plantarum de l'invention contre le virus de la grippe H1N1/PR8 sur les variations pondérales.
Figure 6 : Graphique présentant l'efficacité chez la souris de la souche L. plantarum de l'invention contre le virus de la grippe H1N1/PR8 sur l'état physique (scores visuels).
Figure 7 : Graphique présentant l'efficacité chez la souris de la souche L. plantarum de l'invention contre le virus de la grippe H1N1/PR8 sur la charge virale. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne une souche bactérienne de Lactobacillus plantarum déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur) sous le numéro d'accession CNCM 1-4643, ou un mutant de celle-ci.
La souche L. plantarum de l'invention a été déposée selon le traité de Budapest à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) de L'Institut Pasteur (28 rue du Docteur Roux 75024 Paris Cedex 15) avec le numéro d'enregistrement CNCM 1-4643.
Par Lactobacillus plantarum on entend au sens de la présente invention une souche bactérienne probiotique isolée du lait de yack.
La souche Lactobacillus plantarum de l'invention correspond à la souche Lactobacillus plantarum VEL 12238.
Les termes « Lactobacillus plantarum », « L. plantarum » et « VEL 12238 » peuvent être utilisés indifféremment. Aux termes de la présente invention, une "souche bactérienne" est constituée par une succession de cultures dérivées d'une culture pure de bactéries. La souche bactérienne n'est pas nécessairement issue d'un ancêtre unique par division cellulaire.
Par "probiotique", on entend, au sens de la présente invention, des microorganismes vivants ou morts qui, administrés en quantité suffisante à un hôte, animal notamment, ont un effet bénéfique sur la santé de l'hôte. Plus particulièrement, les probiotiques sont connus pour avoir un effet bénéfique sur le microbiote intestinal (anciennement flore intestinale) en maintenant son équilibre. Le microbiote intestinal a quatre fonctions reconnues : une fonction physiologique, à la fois sur l'anatomie et l'histologie du tube digestif et sur le transit intestinal ; une fonction digestive, par la digestion de certains types de molécules telles que les lipides et les protéines ; une fonction de protection anti-infectieuse, en empêchant le développement de germes potentiellement pathogènes dans les intestins et enfin une fonction immunitaire, par l'activation du système immunitaire.
Par « mutant », on entend, au sens de la présente invention, une souche bactérienne de Lactobacillus plantarum ayant subi une ou plusieurs mutations, c'est-à- dire un ou plusieurs changements dans une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques (telle que la séquence d'un gène) ou dans une ou plusieurs séquences d'acides aminés, comparé, par exemple, à la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés présente dans la souche bactérienne de Lactobacillus plantarum typique telle que décrite dans la présente invention. Lesdites mutations sont par exemple des substitutions et/ou délétions et/ou insertions de un ou plusieurs nucléotides ainsi que des combinaisons de celles-ci. Ces mutations peuvent apparaître spontanément ou bien être introduites en utilisant notamment des techniques de biologie moléculaire. Dans certains modes de réalisation, les mutants de la souche bactérienne de l'invention ont la ou les mêmes activités biologiques ou des activités biologiques similaires à celle de la souche bactérienne de l'invention. Le terme « mutant » peut être utilisé de manière interchangeable avec le terme « variant ».
De manière préférée, la souche Lactobacillus plantarum présente une résistance au stress acide induit par les sels biliaires. Par « acides biliaires » et « sels biliaires » on entend, au sens de la présente invention, les acides se trouvant dans la bile des mammifères et sécrétés par le foie dans lequel ils sont formés à partir de dérivés de la bilirubine et de stéroïdes acides. Les acides biliaires ont pour rôle la fragmentation des globules lipidiques dans les intestins lors de la digestion et l'inhibition de la prolifération bactérienne dans la partie haute du tube digestif (duodénum). Parmi les acides biliaires, on compte les acides cholique, glycocholique, taurocholique, désoxycholique ou encore chénodésoxycholique.
De manière préférée, la souche Lactobacillus plantarum présente des propriétés pro-inflammatoires.
Par « pro-inflammatoire », on entend, au sens de la présente invention, la capacité à activer et maintenir une inflammation des tissus causée par une infection ou une maladie.
De manière préférée, la souche bactérienne probiotique de l'invention, Lactobacillus plantarum peut être administrée à l'homme ou à l'animal sans risque pour sa santé.
Un autre objet de l'invention concerne une utilisation de la souche bactérienne de Lactobacillus plantarum de l'invention comme probiotique.
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant la souche bactérienne Lactobacillus plantarum de l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention est une composition probiotique et/ou pharmaceutique
Par « composition probiotique » on entend, au sens de la présente invention un complément alimentaire qui a des effets bénéfiques pour la santé de l'hôte auquel il est administré. Une composition probiotique contient des microorganismes probiotiques qui doivent être ingérés pour induire des effets bénéfiques chez l'Homme selon la définition de l'OMS (2001) ; lesquels microorganismes peuvent être vivants ou morts . Les probiotiques vivants peuvent sécréter une gamme complète d'antigènes, se multiplient pour promouvoir les interactions avec la muqueuse intestinale et adhèrent aux tissus intestinaux pour stimuler la réponse immunitaire. Par « composition pharmaceutique », on entend, au sens de la présente invention, une formulation comprenant un agent actif, qui est une bactérie probiotique dans la présente invention, en combinaison avec des excipients permettant de stabiliser ladite composition et son administration par voie orale.
De manière préférée, la souche de l'invention peut être utilisée en association avec une ou plusieurs autres espèces probiotiques pour la préparation des compositions probiotiques.
A titre d'exemple, des espèces appartenant aux genres Bifidobacterium, Streptococcus et Lactococcus, couramment utilisés dans l'industrie laitière, peuvent être utilisées (par exemple Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus).
Elles peuvent être utilisées sous forme de bactéries entières vivantes ou non, et aussi sous forme de lysat bactérien, ou sous forme de fractions bactériennes.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention comprend au moins 105, de préférence au moins 106, et au plus 1010 cellules de Lactobacillus plantarum de l'invention par mL.
De manière préférée, la composition probiotique de l'invention comprend un ou plusieurs excipients acceptables.
Par « excipient » on entend, au sens de la présente invention toute substance, autre que le principe actif de la composition probiotique, destinée à conférer à ladite composition probiotique des caractéristiques physiques, chimiques ou gustatives particulières et n'interagissant pas avec le principe actif. Lesdits excipients peuvent être d'origine naturelle ou d'origine synthétique.
Un homme du métier sera à même, au regard de ses connaissances, d'identifier un excipient acceptable pour une composition probiotique. Des exemples d'excipients acceptables incluent : des sucres tels que le saccharose, le glucose, le fructose, le palatinose, le tréhalose, le lactose et le xylose ; des polyols tels que le sorbitol, le xylitol, l'érythritol, et le lactitol ; des émulsifiants tels que les esters de saccharose d'acides gras, les esters de glycérol d'acides gras et la lécithine ; des épaississants et stabilisants tels que le carraghénane, la gomme de xanthane, la gomme de guar, la pectine et la gomme de caroube ; des acidifiants tels que l'acide citrique, l'acide lactique et l'acide malique ; des jus de fruits tels que le jus de citron, le jus d'orange et des jus de baies ; des vitamines telles que la vitamine A, la vitamine B, la vitamine C, la vitamine D et la vitamine E ; et des minéraux tels que le calcium, le fer le manganèse et le zinc.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la composition de l'invention se présente sous une forme administrable par voie orale.
De telles compositions peuvent prendre la forme de gélules, de comprimés, de poudres, de pastilles, de granules, de capsules molles, de poudres reconstituables, de suspensions, de compositions surgelées, de préparations liquides orales ou encore de produits alimentaires conventionnels.
De préférence, la composition de l'invention se présente sous la forme d'une gélule.
Les comprimés et les gélules à administration orale peuvent être unidoses et peuvent contenir un ou plusieurs excipients acceptables tels que des liants, des agents de remplissage, des lubrifiants, des agents mouillant ou encore des agents désintégrant. Les comprimés peuvent être enrobés par des méthodes bien connues dans le domaine pharmaceutique.
Les préparations orales liquides peuvent par exemple être sous la forme de suspensions aqueuses ou huileuses, de solutions, d'émulsions, de sirops ou encore d'élixirs sous la forme de produits déshydratés reconstituables avec de l'eau ou tout autre véhicule acceptable. De telles préparations liquides peuvent contenir des additifs communément utilisés tels que des agents de suspension, des émulsifiants, des véhicules non aqueux, des conservateurs et éventuellement des arômes et/ou des colorants.
Alternativement, la composition de l'invention se présente sous la forme d'un produit alimentaire ou un complément alimentaire.
Par « produit alimentaire » et « produit alimentaire conventionnel », on entend, au sens de la présente invention, toute substance ou produit, ayant été transformé, partiellement transformé ou non transformé et destiné à être ingéré par l'homme ou l'animal. Les produits alimentaires peuvent être d'origine animale, végétale ou minérale. Les produits alimentaires apportent à l'organisme l'énergie et les nutriments nécessaires à son fonctionnement. Le produit alimentaire selon l'invention peut être un liquide, donc une boisson, ou solide.
Par « complément alimentaire », on entend, au sens de la présente invention, tout produit contenant des nutriments bénéfiques pour la santé et qui sont ajoutés au régime alimentaire normal des être humains ou des animaux. Les compléments alimentaires contiennent, mais sans s'y limiter, des vitamines, des minéraux, des acides aminés, des enzymes et des probiotiques.
La composition de l'invention peut se présenter sous la forme d'un produit laitier.
Les produits laitiers selon l'invention peuvent être à base de lait cru. Les laits utilisés peuvent être par exemple des laits de vache, de chèvre, de brebis, de yack, de bufflone ou encore du lait de soja. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être sous forme liquide, solide ou de poudre. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être par exemple du lait, du beurre, du fromage ou encore de la crème.
Les produits laitiers selon l'invention peuvent être à base de laits végétaux. Les laits végétaux comprennent mais ne sont pas limités au lait de soja, de riz, d'avoine ou encore d'amande.
La composition de l'invention peut se présenter sous la forme d'un produit laitier fermenté.
Un produit laitier fermenté est par exemple un yaourt.
La souche de l'invention peut être utilisée en association avec des ferments du yaourt, à savoir Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus.
Lorsque L. plantarum est utilisé en association avec des ferments du yogourt, ladite composition comprend avantageusement au moins 107, de préférence entre 2χ108 et lxlO9 cellules de S. thermophilus par mL, et au moins 5>< 105 et de préférence entre 4x l06 et 2><107 cellules de L. bulgaricus par mL.
La composition selon l'invention présente une fonction immunomodulatrice la rendant utile tout à la fois dans le traitement et/ou la prévention des infections et/ou des allergies. Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention est destinée à prévenir et/ou traiter des infections.
De manière préférée, la composition de l'invention est destinée à prévenir et/ou traiter des infections respiratoires.
Par « infection respiratoire » on entend, au sens de la présente invention une maladie, un trouble ou une infection affectant le groupe d'organes composant le système respiratoire et responsable du transport de l'oxygène depuis l'air jusqu'à la circulation sanguine et du rejet du carbone expiré dans l'air. Le système respiratoire est constitué du nez, des fosses nasales, du pharynx, du larynx, de la trachée, des bronches et des poumons.
Par « prévenir » et « prévention » on entend, au sens de la présente invention éviter l'apparition d'une maladie, d'un trouble ou d'un ou plusieurs signes et/ou symptômes d'une maladie ou d'un trouble.
Par « traiter » et « traitement » on entend, au sens de la présente invention, améliorer ou remédier à une maladie, un trouble ou à un ou plusieurs signes et/ou symptômes d'une maladie ou d'un trouble.
La composition de l'invention permet de renforcer une réponse immunitaire systémique spécifique vis-à-vis d'un micro-organisme pathogène des voies respiratoires.
Selon un mode de réalisation préféré, lesdites infections respiratoires sont causées par des virus.
De manière préférée, lesdits virus sont des virus des voies respiratoires.
Selon un mode de réalisation préféré, lesdits virus sont choisis parmi les rhinovirus, les myxovirus, les coronavirus ou encore les adénovirus.
Le terme « myxovirus » désigne les virus appartenant aux familles
Orthomyxoviridae et Paramyxoviridae.
Le terme « rhinovirus » désigne un genre de virus appartenant à la famille des Picornaviridae.
Le terme « coronavirus » désigne les virus appartenant à la famille des Coronaviridae. Le terme « adenovirus » désigne les virus appartenant à la famille des Adenoviridae.
De manière encore préférée, ledit virus est un virus de la grippe.
Lesdites infections respiratoires virales peuvent être par exemple la grippe, la bronchiolite, la bronchite, la pharyngite, la rhinopharyngite, la pneumonie, la rhinite, la sinusite, le Syndrome Respiratoire Aigu Sévère (SRAS), ou encore le rhume.
De manière encore préférée, ladite grippe est une grippe transmise par le virus Myxovirus influenzae A sous-type H1 1.
L'invention comprend également une méthode de prévention et/ou de traitement des infections respiratoires, comprenant une étape d'administration à un patient d'une quantité thérapeutiquement efficace de la souche Lactobacillus plantarum ou d'une composition comprenant ladite souche de l'invention.
Par « quantité thérapeutiquement efficace », on entend, au sens de la présente invention, la quantité minimale nécessaire à l'obtention de l'effet attendu par l'administration d'une telle souche ou d'une telle composition.
Par « patient », on entend, au sens de la présente invention, un animal, de manière préférée un mammifère, et de manière encore préférée un humain, nécessitant l'administration de la souche Lactobacillus plantarum ou d'une composition comprenant ladite souche pour la prévention et/ou le traitement d'infections respiratoires.
Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Méthode multifactorielle et à haut débit pour l'étude de la résistance des souches au stress aux sels biliaires
Le but de cette manipulation a été de tester la résistance d'une souche de Lactobacillus plantarum VEL 12238 (CNCM 1-4643) aux sels biliaires par rapport à 157 autres souches isolées au sein de différents biotopes et incluant une majorité de lactobacilles (90 Lactobacillus spp., 31 Lactococcus spp., 31 Bifidobacterium spp., 3 Streptococcus spp., 2 Pediococcus spp. et 1 Bacillus spp.). Les souches de Lactococcus et de Streptococcus ont été cultivées à 30°C sans agitation sur milieu M17 (DIFCO) supplémenté avec 5% de lactose. Les souches de Lactobacillus et de Pediococcus ont été cultivées à 37°C sans agitation sur milieu MRS (DIFCO). Les souches de Bifidobacterium ont été cultivées à 37°C en conditions anaérobies (GENBOX MICROAER; BIOMERIEUX) sans agitation sur milieu MRS (DIFCO) supplémenté avec 10% de cystéine (SIGMA). La souche de Bacillus a été cultivées sur milieu LURIA- BERTANI (DIFCO) à 37°C sous agitation.
Le protocole expérimental suivi est le suivant. Il est également exposé en figure 1.
1 mL de culture en phase stationnaire est transvasé dans un tube EPPENDORF. Centrifugation à 5000g pendant 5 minutes
Remise en suspension du culot dans 1 mL d'eau peptonnée.
Ajustement de la Densité Optique à 1 pour faire le blanc optique.
Division de la précédente solution de lmL en deux solutions de 500 μΐ dans deux tubes EPPENDORF différents.
- Le premier est appelé (S) pour Stressé
- Le second est appelé (IMS) pour Non Stressé
Ajout de 10 μί de solution stressante stérile (solution de sodium cholate et sodium déoxycholate, 50 mg de chaque sel dilué dans 1 ml d'eau stérile, filtrée à 0,2 μιη) dans le tube S.
Ajout 10 μί d'eau stérile dans le tube NS.
Incubation des tubes stressés et non stressés lh à 37°C.
Arrêt de la réaction dans les tubes S et NS par centrifugation à 5 000 g pendant 5 minutes puis reprise dans 1 ml l'eau peptonnée stérile.
Cent microlitres de cette suspension sont ensuite ajoutés à 900 μΙ de milieu
MRS.
Dans une plaque de 384 puits :
Dépôt de 60 μί par puit de S et NS dilués au l/40ème
Puis 5 dilutions en cascade au ½ à partir du premier dépôt. Suivi de la croissance pendant 19h à la DO de 600 nm.
Les résultats obtenus sont exposés en figure 2 pour la résistance aux sels biliaires. Ces résultats expriment le retard d'entrée en phase exponentielle en heures pour chaque souche testée.
La figure 2 est un graphique présentant une vue globale des retards d'entrée en phase exponentielle des souches testées pour le stress aux sels biliaires. Les retards d'entrée en phase exponentielle vont d'environ Oh pour la souche la plus résistante aux sels biliaires jusqu'à 19h, soit le temps maximal de suivi de la croissance, pour les souches les moins résistantes au stress aux sels biliaires. La souche Lactobacillus plantarum selon l'invention présente un retard d'entrée en phase exponentielle d'environ 3h. Environ 75% des souches testées présentent un retard d'entrée en phase exponentielle supérieur à celui de la souche Lactobacillus plantarum pour le stress aux sels biliaires.
Exemple 2 : criblage des souches bactériennes avec les cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC)
Le but de cette manipulation est de tester les propriétés immuno-modulatrices de la souche Lactobacillus plantarum VEL 12238 en comparaison d'une collection de près de 160 souches ((La collection comprend 158 souches provenant de différents biotopes et incluant : 90 Lactobacillus spp., 31 Lactococcus spp., 31 Bifidobacterium spp., 3 Streptococcus spp., 2 Pediococcus spp et 1 Bacillus spp.)lors d'un criblage avec des PBMC provenant tous d'un même donneur.
Préparatifs :
- Chauffer le bain marie à 37°C
- Nettoyer les hottes
- Ramener un flacon de Phosphate Buffer Saline (PBS) de la chambre froide
- L-glutamine 200mM (=100x pour utilisation dans cet essai) : 2 mM final
- Sérum de Veau Foetal (SVF) : 10% final
- Bleu trypan pour l'énumération des PBMC en cellule de Malassez
- Milieu RPMI-1640
- Pipettes jetables/stériles 5, 10 et 25 ml - Un mélange pénicilline + streptomycine à lOOOx
- Prévoir un flacon poubelle stérile (= bouteille verre)
- Nettoyer à l'alcool tout ce qui rentre sous la hotte
Les PBMC sont livrées sur carboglace et se conservent dans l'idéal dans l'azote liquide. A défaut à -80°C. Il vaut mieux ne pas dépasser une semaine à -80°C pour garder une bonne viabilité de la population cellulaire.
Le jour de l'essai, décongeler les PBMC selon le protocole fourni. Avant la décongélation, il faut toutefois préparer du milieu pour recevoir les cellules.
DNAse I : a pour rôle d'empêcher les agrégats. A utiliser à partir d'une solution stock à 10 mg/ml pour une concentration finale de 100μg/ml.
Transvaser les PBMC décongelées dans un flacon contenant déjà un mix milieu + DNAse I : en deux fois ; pipetage du volume (environ 1,8ml) du tube de PBMC, puis ajout dans ce tube d'un peu de milieu pour rincer. Compléter le flacon à 15-20ml.
Composition du mix :
- RPMI 1640 : 150 ml
L glutamine : 1,5 ml
- FBS : 15 ml
- PS : 150 μΙ
Cycle de centrifugation/resuspension : centrifugation 15 mn à 2000 g puis reprise dans 15-20ml de mix.
Note : lorsqu'au cours des pipetages, on recrache le liquide, le faire sur les parois et à vitesse lente pour ne pas abîmer les cellules. Le protocole indique des pertes maximales possibles allant jusqu'à 30%.
Après la 2è centrifugation, remise en suspension dans 10ml, agitation douce pour séparer les cellules, puis compléter à 40ml et faire une énumération pour déterminer le nombre de cellules viables et leur concentration.
Utilisation de deux dilutions : une première au 10ème, suivie d'une 2eme au ½ (20è final).
Enumération au bleu trypan : - Prendre 90μΙ de milieu RPMI puis ΙΟμΙ de cellules, puis 50μΙ de ce mélange avec 50μΙ de bleu (comptage de la dilution au 20è, donc)
Dans chaque puits, on veut déposer 1.106 cellules
Cette suspension cellulaire est déposée à l'aide de pipettes de 20 ml dans les puits des plaques sous hotte stérile. On dépose donc environ 1 ml par puits.
Préparation des co-incubations :
Les précultures bactériennes sont centrifugées, lavée dans du PBS, centrifugées à nouveau et reprise dans du PBS (1 ml). On ajuste ensuite la DO à 1 en diluant les échantillons dans du PBS.
Une DO de 1 à 600 nm correspond à environ 5.108 cellules bactériennes.
Exemple :
Pour la souche VEL 12191 : DO (après dilution au 1/10) = 0,49 ; donc DO = 4,9. 1 uDO x 1000 / 4,9 uDO = 204 μΙ et 1000 - 204 = 796 μΙ.
Donc pour cette souche, prendre 204 μΙ de la suspension dans PBS à la DO de 4,9 et rajouter 796 μΙ de PBS pour ramener le volume à 1 ml.
Dépôt de 20 μΙ de ces suspensions dans les puits contenant les PBMC. Dépôts en triple.
Récupération des surnageants des plaques et dépôt sur DEEPWELL contenant au préalable 10 μΙ d'anti protéase.
Les surnageant sont congelés et conservés à -80°C jusqu'au jour de l'analyse.
L'analyse est effectuée par dosage de l'IL-10 et de l'IL-12p70 par la méthode
ELISA.
Le ratio IL-12p70 / IL-10 est calculé.
Les résultats obtenus par le dosage de l'IL-10 et de l'IL-12p70 par ELISA sont exposés en figure 3. Cette figure représente le ratio IL-12p70 / IL-10 mesurés en fonction de la souche bactérienne testée. Lès ratios calculés vont de 0,1 pour la souche la plus anti-inflammatoire jusqu'à environ 8 pour la souche la plus pro-inflammatoire. Les souches appelées souches neutres ont un ratio IL-12p70 / IL-10 compris environ entre 1,5 et 3. Pour la souche Lactobacillus plantarum, le ratio IL-12p70 / IL-10 est légèrement inférieur à 7. Seules deux des souches testées on un ratio IL-12p70 / IL- 10 supérieur à celui de la souche Lactobacillus plantarum.
Il apparaît que la souche Lactobacillus plantarum de l'invention a un profil proinflammatoire.
Exemple 3 : criblage de souches bactériennes avec les HT29
Le but de cette manipulation est de tester les propriétés immuno-modulatrices de la souche Lactobacillus plantarum en comparaison d'une collection de près de 160 souches ((La collection comprend 158 souches provenant de différents biotopes et incluant : 90 Lactobacillus spp., 31 Lactococcus spp., 31 Bifidobacterium spp., 3 Streptococcus spp., 2 Pediococcus spp et 1 Bacillus spp.) lors d'un criblage avec des HT- 29.
J-7 : Préparation des cellules HT 29 ;
A partir d'une préparation (labo) de HT29 repris dans du milieu « Dulbecco's Modified Eagle Médium » (DMEM) + Sérum de Veau Foetal (SVF) 10% et glutamine 1% avec une concentration de 0.1 106 cellules/ml :
Répartition des cellules en plaques 24 puits à valeur de 500μΙ de milieu par puits ;
- Mise des plaques à 37°C à l'étuve C02 10% pendant 72 heures.
J-4 : Changement des milieux de culture des cellules HT29 ;
- Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ;
Ajout de 500μΙ de milieu DMEM + sérum SVF 10% et glutamine 1% à valeur de 500μΙ/ρυΐΐ5, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ;
- Mise des plaques à 37°C à l'étuve C02 10% pendant 24 heures.
J-3 : Changement des milieux de culture des cellules HT29 ;
Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ; Ajout de 500μΙ de milieu DMEM + sérum SVF 10% et glutamine 1% à valeur de δΟΟμΙ/ρυ^, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ;
- Mise des plaques à 37°C à l'étuve C02 10% pendant 24 heures ;
Lancement des pré-cultures bactériennes.
J-2 : Changement des milieux de culture des cellules HT29 ;
Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ;
Ajout de 500μΙ de milieu DMEM + sérum SVF 10% et glutamine 1% à valeur de 500μΙ/ρυίΐ5, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ;
- Mise des plaques à 37°C à l'étuve C02 10% pendant 24 heures ;
J-l : Changement des milieux de culture des cellules HT29 ;
Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ;
Ajout de 500μΙ de milieu DMEM + sérum SVF 5% (attention changement de concentration pour le sérum, mise en stress des cellules HT29) et glutamine 1% à valeur de 500pl/puits, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ;
Mise des plaques à 37°C à l'étuve C02 10% pendant 24 heures ;
Lancement des cultures bactériennes à partir des pré-cultures de 48h.
J0 : Co-incubation HT29 / bactéries et récupération des surnageants :
a) Calcul de la concentration en HT29 et estimation de la quantité de bactéries à ajouter pour la co-incubation :
On sait que pour une surface de croissance de 200 mm2 on a une concentration en HT29, à confluence, de 2 105 cellules. Or, la surface d'un puits (plaque 24 puits) est de 182,62 mm2, donc on peut estimer la concentration de nos HT29 :
182,62 x 2 105 / 200 = 1,83 105 HT29/puits. Pour la co-incubation, le rapport HT29 / bactéries est fixé à 1/40, donc on veut : 40 x 1,83 105 = 7,32 106 CFU/puits.
Le volume à ajouter par puits est lui aussi fixé à 50μΙ, donc on veut : 7,32 106 CFU/50 I.
Si on veut 7,32 106 CFU pour 50μΙ, nous avons besoin d'une concentration :
1000 x 7,32 106 / 50 = 1,46 108 CFU/ml
Or, pour une DO de 1, on estime la concentration à 5 108 CFU/ml, donc pour avoir une concentration de 1,46 108 CFU/ml :
1,46 108 x 1 / 5 108 = DO 0,3.
b) Préparation des milieux :
- TNFa (cytokines permettant d'activer la voie N FKB), il se présente à une concentration de lOOng/μΙ dans des tubes de 2μΙ, on veut une concentration finale dans le DMEM de 5ng/ml, on le dilue donc au 1/20000, pour préparer 80 ml de DMEM on ajoute 4 μΙ de TNFa ;
- DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1%, à valeur de 160 ml pour « 50 souches ;
- DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1% + antibiotiques PS 0.1%, à valeur de 80 ml pour 144 puits à 500μΙ/ρυϊΐ5 ;
- DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1% + antibiotiques PS 0.1% + TNFa (5ng/ml) à valeur de 80 ml pour 144 puits à δΟΟμΙ/ρυ^ ;
c) Préparation des bactéries :
Les cultures de 24 heures sont centrifugées à 3000g pendant 5 minutes ;
Les culots sont repris dans 1 ml de DMEM ;
- Centrifugation à 3000g pendant 5 minutes ;
- Les culots sont repris dans 1 ml de DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1% ;
La DO est mesurée pour chacune des souches (dilution 1/10 DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1%, blanc : DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1%) ;
- Ajustement de la DO avec du DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1% pour obtenir une solution bactérienne de 1ml avec DO = 0,3 ;
d) Co-incubation HT29 / bactéries : - Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ;
Ajout de 45(^l/puits de milieu DMEM + 5% sérum SVF, glutamine 1% et 0.1% PS ou de milieu DMEM + 5% sérum SVF, glutamine 1%, 0.1% PS et TNFa, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ;
- Ajout de 50μΙ de DMEM + 5% sérum SVF, glutamine 1% et 0.1% PS (témoin) ou 50μΙ de solutions bactériennes (plan de plaques) ;
- Mise des plaques à 37°C à l'étuve C02 10% pendant 6 heures.
e) Récupération et stockage des surnageants de cultures HT29 / bactéries : Préparation pour 1 plaque « DEEP WELL » :
Dissoudre une pastille d'anti-protéase (ROCHE) dans 2 ml de PBS, solution au 50X ;
- Dépôt de 10μΙ par puits dans la plaque, la solution se retrouve à IX car ajout de
500μΙ de surnageants de cultures.
Récupération des surnageants :
Les plaques sont centrifugées 10 minutes à 13000 g puis les surnageants sont récupérés dans la DEEPWELL en présence d'anti-protéase.
Stockage des plaques :
Les plaques « DEEPWELI » sont conservées à -80°C en attendant le dosage ELISA ;
Les plaques 24 puits sont lavées avec du PBS (500 μΙ) puis le PBS est éliminé à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide ;
- Enfin, les plaques sont conservées à -20°C en attendant le dosage des protéines par la méthode BRADFORD.
f) Dosage des protéines :
L'interleukine 8 est dosée par la méthode ELISA. Les protéines totales sont dosées par la méthode de BRADFORD. Les résultats obtenus sont exposés en figure 4. Cette figure représente le pourcentage de variation d'IL-8 mesuré en fonction de la souche bactérienne testée. Les quantités mesurées vont d'environ -45% pour la souche la plus anti-inflammatoire jusqu'à environ 75% pour la souche la plus pro-inflammatoire. Pour la souche Lactobacillus plantarum, la variation d'IL-8 est d'environ + 45%. Seules quatre des souches testées on une variation d'IL-8 supérieure à celle de la souche Lactobacillus plantarum.
Il apparaît que la souche Lactobacillus plantarum de l'invention a un profil proinflammatoire.
Exemple 4' : Test de l'efficacité de la souche bactérienne probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention contre un virus de la grippe chez la souris
Le but de ces expérimentations est de tester les propriétés immuno- modulatrices de la souche bactérienne L. plantarum dans le cas d'infections hivernales. a) Inoculation virale chez la souris
Souris : Des souris BALB/c femelles (Janvier, France) ont été utilisées pour cet essai. Elles ont été réparties en lots de 8 souris (4 souris par cage). Les expérimentations ont commencé après deux semaines d'acclimatation des souris au sein de l'Unité d'Expérimentation Animale Rongeurs dans une cellule à atmosphère confinée, du fait de l'utilisation du virus de la grippe. Pendant toute la durée de l'expérience, les souris avaient un accès illimité à la nourriture et à l'eau.
Virus de la grippe : Le virus de la grippe H1N1/PR8/34 (virus grippal adapté au modèle murin) a été produit par une culture dans des œufs âgés de 11 jours de poules fertiles, pendant 2 jours à 35°C. Le titre viral a été quantifié par un essai sur plaque utilisant les cellules « Madin-Darby Canine Kidney » (MDCK) et le stock viral est gardé à -80°C pour les utilisations ultérieures.
Infections intra-nasales par le virus : Les souris, âgées de sept semaines, ont d'abord été anesthésiées par une injection intra-péritonéale de IMALGENE 1000/kétamine (MERIAL) et Rompum/xylazine (ALCYON) (0,1% kétamine + 0,06% xylazine, qsp eau physiologique). Elles ont ensuite été infectées par le dépôt de 25 ί de suspension virale dans chaque narine. Plusieurs concentrations d'inoculums viraux ont été testés : 2000, 200 et 100 PFU afin d'identifier la concentration n'induisant pas de mortalité, en dehors des symptômes visibles de la maladie.
b) Préparation des bactéries
Les cultures en phase stationnaire des souches candidates de bactéries probiotiques (Lactobacillus plantarum VEL 12238 et Lactobacillus paracasei VEL 12195) ont été centrifugées à 3000g pendant 10 minutes. Les culots ont été lavés dans du PBS stérile. Les culots ont ensuite été resuspendus dans du PBS stérile pour avoir une concentration finale de 1.109 UFC/souris.
Les souris ont reçu quotidiennement 200μί de cette dose bactérienne par des administrations orales (gavages intra-gastriques), ou simplement du PBS pour les lots témoins, pendant 10 jours en préventif et 9 jours en curatif après l'infection virale. Les souris sont sacrifiées le 10ème jour (J10).
c) Evaluation des scores visuels
Des marqueurs macroscopiques renseignant sur l'état physique des souris ont été utilisés tout au long de l'essai :
- Le poids des souris a été suivi tous les jours à partir de l'infection virale ainsi que
- L'état des souris prenant en compte leur aspect extérieur en utilisant une échelle de notation (Kawase, He et al. 2009) :
5. Saine (aucun symptôme clinique)
4. Légère (fourrure légèrement hérissée)
3. Modérée (fourrure modérément hérissée et léthargique) 2. Sévère (fourrure sévèrement hérissée et maigre) 1. Très sévère (pas de réaction à la stimulation)
L'évaluation de ces scores a été réalisée en aveugle par des binômes de notateurs extérieurs à l'essai.
d) Lavages broncho-alvéolaires
Le jour de l'abattage, les souris ont été euthanasiées par dislocation cervicale. Des lavages broncho-alvéolaires (BALF, « Broncho-Alveolar Lavage Fluid ») ont été collectés à l'aide d'un cône attaché à une seringue, inséré dans la partie supérieure de la trachée de la souris. Des allers-retours ont alors été pratiqués avec un volume total de lmL de PBS afin de laver les poumons. Les BALF ont été congelés à -80°C jusqu'à leur utilisation. Des dosages d'anticorps (IgA totaux, IgM totaux, IgE totaux, IgGl spécifique au virus, lgG2a spécifique au virus et IgA spécifique au virus) ont été réalisés. Les dosages des anticorps totaux (IgA, IgM et IgE) ont été effectués à l'aide des kits ELISA (MABTECH). Les dosages des anticorps spécifiques au virus ont été faits avec un protocole ELISA adapté, comprenant notamment une étape de fixation des plaques avec des protéines virales et l'utilisation d'anticorps anti-lgGl, lgG2a ou IgGA (BD-PHARMINGEN, France) conjugués à une peroxydase.
e) Dosage de la charge virale
Les poumons ont ensuite été prélevés et congelés dans l'azote liquide et conservés à -80°C. Un morceau de quelques milligrammes de poumon a été broyé en présence de tampon de lyse (RLT + β-mercaptoéthanol) et de billes en céramique de diamètre 1 mm. L'extraction de l'ARN total à partir des poumons des souris a ensuite été effectuée avec le QIAGEN RNEASY MINI KIT (QIAGEN). Les ARN ont ensuite été traités avec la DNase I. La concentration en ARN total a été dosée avec un NANODROP (THERMO FISHER SCIENTIFIC). Une transcriptase inverse a été réalisée avec la transcriptase inverse SUPERSCIPT II (INVITROGEN) et une amorce spécifique à partir de 2,5 μg d'ARN total selon les indications du fournisseur. Une réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitative a été finalement réalisée avec le mélange du kitPCR QUANTI TECT SYBR GREEN PCR (APPLIED BIOSYSTEMS), les amorces spécifiques du virus H1N1 PR8/34 et l'appareil MASTERCYCLER REALPLEX (EPPENDORF). Les conditions d'amplification ont été les suivantes : 10 minutes à 95°C, 40 cycles (15 secondes à 95°C, 20 secondes à 64°C et 30 secondes à 72°C), 15 secondes à 95°C, 15 secondes à 60°C, 20 minutes pour la courbe d'hybridation puis 15 secondes à 95°C.
La quantification a été réalisée par comparaison à une gamme étalon virale établie à partir d'un plasmide contenant la séquence du gène cible (capside) des amorces utilisées. f) Analyse statistique
Les comparaisons entre les différents résultats obtenus ont été analysées par le logiciel GRAPHPAD PRISM5®. Les différences ont été considérées comme significatives si P < 0,05.
g) Résultats
Variation pondérale :
Les résultats obtenus en analysant la variation pondérale des souris infectées par le virus H1N 1 PR8/34 sont présentés en figure 5 A et B.
La figure 5 A est un graphique exposant les 4 courbes représentant les variations pondérales des lots de souris :
- infectés par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS,
- infectés par le virus H1N 1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. paracasei VEL 12195 par administration orale,
- infectés par le virus H1N 1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238 par administration orale,
- non infectés par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS (témoins)
Il apparaît que les souris infectées par le virus sans recevoir de dose de bactérie probiotique ont perdu 25% de leur poids à J10. Les souris infectées par le virus et ayant reçu des doses de L. paracasei VEL 12195 ont perdu entre 20 et 25% de leur poids à J10. Les souris infectées par le virus et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238 ont perdu 10% de leur poids à J10. Les souris témoins n'ont pas perdu de poids.
La souche L. plantarum VEL 12238 a un effet marqué sur le maintien du poids des souris infectées par le virus H1N 1 PR8/34. Il permet aux souris de préserver 90% de leur poids à J10 alors que les souris infectées par le virus ayant reçu du PBS et les souris infectées par le virus ayant reçu des doses de L. paracasei VEL 12195 ont préservé, à J10, respectivement 75% et entre 75 et 80% de leur poids.
La souche bactérienne probiotique L plantarum VEL 12238 a donc un effet protecteur contre le virus de la grippe, et particulièrement le virus de la grippe H1N1. La figure 5B représente l'air sous la courbe pour chacun des trois lots de souris infectés par le virus. L'aire sous la courbe représentant le lot infecté par le virus ayant reçu du PBS est inférieure à l'aire sous la courbe représentant le lot infecté par le virus et ayant reçu des doses de L paracasei VEL 12195. L'aire sous la courbe représentant le lot de souris infecté par le virus et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238 est supérieure aux aires des deux autres lots de souris infectés par le virus.
Il y a une augmentation significative de l'aire sous la courbe pour le lot de souris infecté par le virus et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238 par rapport au lot infecté par le virus et n'ayant pas reçu de doses de bactéries probiotiques.
Aspect extérieur :
La figure 6 présente les scores visuels définissant l'aspect extérieur des souris pour les trois lots infectés par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS ou de L. paracasei VEL 12195 ou encore de L. plantarum VEL 12238, à JO et à J10.
A JO, les trois lots ont le score visuel maximal de l'échelle, 5, qui signifie que les souris ne présentent aucun symptôme de la grippe (Saine).
A J10, les lots de souris infectés par le virus H1N 1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS ou de L. paracasei VEL 12195 ont un score visuel approximativement identique de 3, correspondant à une fourrure modérément hérissée et léthargique (Modérée).
A J10, le lot de souris infecté par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L plantarum VEL 12238 ont un score visuel proche de 4, correspondant à une fourrure légèrement hérissée (Légère).
Les souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. plantarum sont en meilleur état physique que les souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS ou de L. paracasei VEL 12195.
La souche bactérienne probiotique L. plantarum VEL 12238 a donc un effet protecteur contre le virus de la grippe, et particulièrement le virus H1N1.
Charge virale : La figure 7 représente la charge virale (logarithme du nombre de copies de génome viral dans 2,5 pg d'ARN total) à J10 et J14 dans les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS ou de L. paracasei VEL 12195 ou encore de L plantarum VEL 12238.
A J10, les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS présentent une charge virale d'environ 3,5 ; les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. paracasei VEL 12195 présentent une charge virale d'environ 4 ; les poumons des souris infectées par le virus H1N 1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L plantarum VEL 12238 présentent une charge virale comprise entre 2 et 2,5.
A J14, les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS présentent une charge virale d'environ 1,5 ; les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. paracasei VEL 12195 présentent une charge virale d'environ 2 ; les poumons des souris infectées par le virus H1N 1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238 présentent une charge virale d'environ 0,5.
Il apparaît donc que l'administration de doses de L. plantarum VEL 12238 à des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 permet une diminution significative de la charge virale dans les poumons des souris entre J10 et J14.
De plus, l'administration de doses de L plantarum VEL 12238 à des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 montre une différence significative de la charge virale entre les souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS et les souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238.
La souche bactérienne probiotique L. plantarum de l'invention a donc un effet protecteur contre le virus de la grippe, et particulièrement le virus H1N1.
Exemple 5 : Essai clinique d'évaluation de l'efficacité de la souche Lactobacillus plantarum contre des épisodes de rhume chez l'homme. Cette étude vise l'évaluation de l'effet de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention sur les épisodes de rhume dans une population adulte en bonne santé (essai contrôlé contre placebo, en double aveugle et aléatoire).
Objectifs de l'étude :
Evaluation contre un placebo de l'effet de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention sur la sévérité du rhume. La sévérité est quantifiée par le score total de sévérité, c'est-à-dire la somme des scores de Jackson quotidiens pour tous les jours de l'épisode de rhume.
Evaluation contre un placebo de l'effet de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention sur l'incidence du rhume, sur la qualité de vie liée à la santé mesurée avec le critère WURSS-21, les 8 symptômes du critère de Jackson, la température corporelle mesurée avec un thermomètre fiable (fourni à chaque participant de l'étude) et la durée de la maladie.
Evaluation contre un placebo de la tolérance de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention.
Evaluation contre un placebo de l'observance des patients à la prise de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention.
Evaluation de la quantité de Lactobacillus plantarum de l'invention après 14 jours d'administration orale dans un échantillon séparé de deux groupes de 20 sujets correspondant au même critère de sélection mais pas intégrés à l'étude globale et randomisés séparément selon la même procédure en double aveugle contre un placebo. Cette étude auxiliaire est conduite séparément de façon à être analysée à l'avance sans rompre le caractère aveugle de l'étude.
Conduite de l'étude :
Les critères de sélection des patients participant à l'étude sont les suivants : sujets en bonne santé, âgés de 18 à 65 ans, sujets aux rhumes (au moins un dans l'année précédent cet essai) et ayant donné leur consentement éclairé écrit à leur participation à cette étude. Les patients correspondant aux critères de sélection sont randomisés en deux groupes de 200 sujets recevant le produit de l'étude en double aveugle, c'est-à-dire le placebo ou le véritable Lactobacillus piantarum de l'invention.
Ces deux groupes de patients sont suivis pendant quatre mois.
Tous les sujets ont une visite médicale à l'apparition du rhume (DO) et après 16 semaines (D112).
Ils reçoivent un auto-questionnaire comprenant les critères de Jackson et WURSS-21 à compléter quand un épisode de rhume apparaîtra. Ils complètent l'auto- questionnaire quotidiennement pendant chaque jour de l'épisode de rhume depuis l'apparition du rhume jusqu'à sa fin, ce qui permet d'évaluer leur sévérité et leur durée.
L'observation du protocole sera vérifiée par des appels téléphoniques réguliers mensuels.
Les patients engagés dans la quantification du niveau de Lactobacillus piantarum VEL 12238 dans les matières fécales fournissent leur échantillon de selles à D14.
Exemple 6 : formules de compositions probiotiques comprenant Lactobacillus piantarum de l'invention
Capsule :
Composé Quantité
Lactobacillus piantarum CNCM 1-4643 109 UFC
Citrate de calcium 300 mg/capsule
Stéarate de magnésium 0.02 mg/capsule
Poudre :
Composé Quantité
Lactobacillus piantarum CNCM 1-4643 1010 UFC
Citrate de calcium 600 mg
Citrate de magnésium 200 mg
Gomme de xanthane 0,8 mg
Benzoate de sodium 0,2 mg Maltodextrine qsp 30g
3. Yaourt
a) Fabrication
- Mélange homogène des constituants : lait écrémé et dégazé, sucre, arômes, eau, stabilisants
- Pasteurisation de ce mélange à 93°C pendant 5 minutes
- Refroidissement à 42°C
- Ensemencement par le Lactobacillus bulgaricus et le Streptococcus thermophilus et la souche Lactobacillus plantarum de l'invention
- Fermentation 3h à 42°C
- Conditionnement
- Réfrigération rapide à +4°C
b) Composition
Exemple 7 : Test de l'efficacité de la souche bactérienne probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention dans ses propriétés immunomodulatrices chez la souris
Le but de ces expérimentations est de tester la capacité de cette souche à stimuler chez la souris une réponse immunitaire à la fois local (au niveau des muqueuses) et systémique. Pour cela, la souche est administrée à des souris par voie orale pendant 7 jours.
À la fin de cette période, l'intestin grêle de souris est récupéré et les niveaux d'anticorps IgA sécrétoires (S-lgA) sont déterminés. En outre, les cellules lgA+, les macrophages, les cellules dendritiques (DC) et les cellules caliciformes sont également déterminées sur les mêmes échantillons.

Claims

REVENDICATIONS
1. Une souche bactérienne de Ldctobacillus plantarum déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur) sous le numéro d'accession CNCM 1-4643, ou un mutant de celle-ci.
2. Utilisation de la souche telle que définie à la revendication 1 comme probiotique.
3. Une composition comprenant la souche bactérienne Lactobacillus plantarum telle que définie à la revendication 1.
4. La composition selon la revendication 3, ladite composition étant une composition probiotique et/ou pharmaceutique.
5. La composition selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, ladite composition comprenant au moins 105, de préférence au moins 106, et au plus 1010 cellules de Lactobacillus plantarum par mL.
6. La composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, ladite composition se présentant sous une forme administrabie par voie orale, de préférence sous la forme d'une gélule.
7. La composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 3 à 6, ladite composition étant destinée à prévenir et/ou à traiter des infections et/ou des réactions allergiques par son action immunomodulatrice.
8. La composition selon la revendication 7, laquelle composition étant destinée à prévenir et/ou traiter chez un patient des infections, de préférence des infections respiratoires.
9. La composition selon la revendication 8, laquelle composition étant destinée à prévenir et/ou à traiter des infections respiratoires causées par un virus, de préférence un virus des voies respiratoires.
10. La composition selon la revendication 9, lesdits virus des voies respiratoires étant choisis parmi les rhinovirus, les myxovirus, les coronavirus ou encore les adénovirus, de préférence ledit virus étant un virus de la grippe.
EP13801605.0A 2012-11-09 2013-11-08 Nouvelle souche bacterienne de lactobacillus plantarum et utilisations de cette souche Withdrawn EP2929012A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1203017A FR2997960B1 (fr) 2012-11-09 2012-11-09 Nouvelle souche bacterienne de lactobacillus plantarum et utilisation de cette souche
PCT/FR2013/000288 WO2014072594A1 (fr) 2012-11-09 2013-11-08 Nouvelle souche bacterienne de lactobacillus plantarum et utilisations de cette souche

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2929012A1 true EP2929012A1 (fr) 2015-10-14

Family

ID=48050797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP13801605.0A Withdrawn EP2929012A1 (fr) 2012-11-09 2013-11-08 Nouvelle souche bacterienne de lactobacillus plantarum et utilisations de cette souche

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2929012A1 (fr)
FR (1) FR2997960B1 (fr)
WO (1) WO2014072594A1 (fr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR115757A1 (es) * 2018-07-13 2021-02-24 Cj Cheiljedang Corp Composición que comprende la cepa cjlp475 de lactobacillus plantarum y la cepa cjlp17 de lactobacillus plantarum y el uso de la misma
AR115758A1 (es) * 2018-07-13 2021-02-24 Cj Cheildang Corp Composición que comprende la cepa de lactobacillus plantarum cjlp475 y la cepa de lactobacillus plantarum cjlp243 y uso de la misma

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007040446A1 (fr) * 2005-10-06 2007-04-12 Probi Ab Utilisation de lactobacillus pour le traitement des maladies autoimmunes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYME: "Document Properties JOURNÉES des MICROBIOLOGISTES de l'INRA 2012", 31 October 2012 (2012-10-31), Retrieved from the Internet <URL:https://colloque.inra.fr/jmicrobiologistes_inra/content/download/921/13981/version/1/file/JMI2012+-+Brochure+compl%C3%A8te+VF.pdf> *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014072594A1 (fr) 2014-05-15
FR2997960A1 (fr) 2014-05-16
FR2997960B1 (fr) 2016-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7097838B2 (ja) 制御性ｔ細胞の増殖または集積を誘導するヒト由来細菌
JP7168558B2 (ja) Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の処置
RU2758387C2 (ru) Использование микробных сообществ для лечения человека и животных
US9636366B2 (en) Bacteroides CECT 7771 and the use thereof in the prevention and treatment of excess weight, obesity and metabolic and immunological alterations
US9999641B2 (en) Treatment of clostridium difficile infection
EP0768375B1 (fr) Bactérie lactique
US20140369965A1 (en) Bifidobacterium cect 7765 and use thereof in the prevention and/or treatment of overweight, obesity and associated pathologies
JP2020503862A (ja) Ｃｄ８＋ ｔ細胞の誘導のための組成物および方法
US20240293483A1 (en) Probiotic composition for the treatment of increased intestinal permeability
CN106659747A (zh) 鼠李糖乳杆菌促进生态失调后肠道菌群多样性恢复的应用
EP4294413A1 (fr) Compositions et méthodes se suppression d&#39;organismes pathogènes
EP2120590B1 (fr) Utilisation de lactobacillus casei pour renforcer la protection induite par la vaccination anti-grippale
EP2929012A1 (fr) Nouvelle souche bacterienne de lactobacillus plantarum et utilisations de cette souche
CN103987839B (zh) 能够抑制幽门螺杆菌菌株粘附至上皮细胞的新德式乳杆菌保加利亚亚种菌株
JP5426850B2 (ja) インフルエンザワクチンのアジュバント
WO2023036957A1 (fr) Utilisation de faecalibacterium pour traiter une infection par un virus respiratoire
EA052600B1 (ru) Пробиотическая композиция для лечения повышенной кишечной проницаемости
RU2823233C2 (ru) Использование микробных сообществ для лечения человека и животных
HK1261280B (en) Human-derived bacteria that induce proliferation or accumulation of regulatory t cells
Family Dedicated To My Lovely Family and Guide

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20150609

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20160708

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN

18W Application withdrawn

Effective date: 20161028