EP2780712A1 - Méthode de caractérisât] on de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic - Google Patents

Méthode de caractérisât] on de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic

Info

Publication number
EP2780712A1
EP2780712A1 EP12813392.3A EP12813392A EP2780712A1 EP 2780712 A1 EP2780712 A1 EP 2780712A1 EP 12813392 A EP12813392 A EP 12813392A EP 2780712 A1 EP2780712 A1 EP 2780712A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
marker
cells
protein
ctc
eml4
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP12813392.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Amélie BARTHELEMY
Françoise FARACE
Marianne OULHEN
Jean-Charles Soria
Alexander VALENT
Philippe Vielh
Benjamin Besse
Emma PAILLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Gustave Roussy (IGR)
Universite Paris Sud
Original Assignee
Institut Gustave Roussy (IGR)
Universite Paris Sud
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Gustave Roussy (IGR), Universite Paris Sud filed Critical Institut Gustave Roussy (IGR)
Publication of EP2780712A1 publication Critical patent/EP2780712A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5752—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the lungs
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57555—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/57595—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving intracellular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4742—Keratin; Cytokeratin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70589—CD45
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
    • G01N2333/91215—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases with a definite EC number (2.7.1.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention has for object a new method of characterization of circulating tumor cells (CTC) as well as the uses of this method to decide on the implementation of a treatment, to diagnose the progress of a cancer and to prognose the evolution of 1 there " disease in a patient.
  • CTC circulating tumor cells
  • Circulating tumor cells play a crucial role in the metastatic process, and their analysis can provide important information for the prognosis of a patient. They also constitute a tumor material easily accessible by non-invasive methods, representative in real time of the metastatic disease.
  • the detection of the presence in CTCs of molecular markers targeted for antitumor treatment may make it possible to select the patients likely to benefit from this treatment, or even to evaluate at the individual level the response or resistance to this same treatment. The selection of patients likely to benefit from a
  • Targeted antitumor therapy is currently based on "the search for molecular markers in metastasis biopsies.”
  • the present method allows this research to be performed on CTCs, completing or even substituting for the analysis of tumor biopsy.
  • Lecharpentier et al (2011) describes a method for detecting CTCs in a blood sample, based on the coexpression by said cells of markers specific for epithelial cells and markers specific for mesenchymal cells. This method exploits the combined use of three fluorescent markings and requires a complementary morphocytological analysis, performed by an experienced cytopathologist.
  • the method according to the present invention provides an alternative solution for the detection of CTCs not requiring the presence of a licensed cytopathologist, as it combines a true morphological analysis, phenotypic identification of the cells by fluorescent immunostaining and genomic detection of the presence of particular DNA sequences, such as characteristic rearrangements of cancer cells.
  • the subject of the present invention is a method of identifying, in a sample, in particular in a blood sample, circulating tumor cells (CTC) bearing at least one marker that is characteristic of the tumor nature of the cell, said marker being chosen from the groups consisting of:
  • said method comprising the following steps: at. Identification, on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell , b. Detection, on a support comprising the cells from the biological sample, using a FISH-type technique, of the signal associated with the presence of a gene characteristic of the tumor nature of the cell, c. Comparison of the location on the support of the signals obtained in steps a and b and identification of the CTCs.
  • the invention has the advantage of combining, on the same support, a phenotypic labeling and an analysis by a method of FISH type, which preserve the integrity of CTC.
  • the subject of the invention is a method for identifying circulating tumor cells (CTCs) carrying the EML4-ALK fusion gene in a biological sample originating from a patient, said method comprising the following steps: :
  • Identification on a support comprising the cells originating from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by the EML4-ALK fusion gene,
  • the subject of the invention is a method of identification, in a biological sample, in particular in a sample circulating tumor cells (CTCs) carrying the EML4-ALK fusion gene, said method comprising the following steps:
  • Identification on a support comprising the cells originating from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene,
  • the method detects the presence of the EML4-ALK fusion gene, by the FISH technique, and morphologically and phenotypically identifies the CTCs, and in particular the presence of the protein encoded by said fusion gene.
  • EML4-ALK reshaping exclusively affects patients with non-small cell lung cancer (also known as non-small cell lung cancer (NSCLC)).
  • the EML4-ALK fusion protein has potent oncogenic activity and a key role in carcinogenesis in a subpopulation of NSCLC patients. This activity, which can be blocked by small molecules, including tyrosine kinase inhibitors targeting ALK, is an important molecular target in the treatment of these cancers. It is well known that CTCs in these tumors have a significant mesenchymal component and that methods based on detection of epithelial CTC are ineffective for capturing lung cancer CTCs.
  • the circulating tumor cells are of epithelial and mesenchymal origin.
  • the CTC identification method is also referred to as the CTC enrichment method or the CTC characterization method.
  • the three expressions are equivalent and can be used interchangeably.
  • the enrichment method used according to the present invention is the ISET method.
  • the cells originating from the biological sample serving for identifying at least one signal that is a control signal for the presence of CTC and for detecting the signal associated with the presence of the fusion gene EML4-ALK are isolated according to their size which varies from 8 pm to at least 40 pm.
  • the subject of the invention is a method of identifying, in a sample originating from a patient, circulating tumor cells (CTC) bearing at least one marker that is characteristic of the tumor nature of the cell, said marker being selected from the groups consisting of:
  • said method comprising the steps of: a. Identification, on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell , except for a protein encoded by the EML4-ALK fusion gene, b. Detection, on a support comprising the cells from the biological sample, using a FISH-type technique, of the signal associated with the presence of a gene characteristic of the tumor nature of the cell, with the exception the EML4-ALK fusion gene, c. Comparison of focusing on the support of the signals obtained in steps a and b and identification of the CTCs.
  • the CTC detection method described in the publication by Charpentier et al. discloses a CTC detection method comprising, on the one hand, the combined use of three fluorescent labels and, on the other hand, a morphocytological analysis performed by an experienced cytopathologist.
  • This document does not disclose a CTC detection method combining fluorescent phenotypic markings and automated analysis of cell morphology; it also does not disclose a method combining the phenotypic detection of cells by fluorescent immunostaining and the chromosomal detection of the presence of particular DNA sequences.
  • this document does not disclose a detection method combining automated detection of cell morphology, phenotypic detection by fluorescent immunostaining and molecular detection by the use of FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) methods.
  • FISH Fluorescence In Situ Hybridization
  • the identification method according to the invention comprises the following steps:
  • Identification on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of the EML4-ALK fusion protein gene,
  • the identification method according to the invention comprises the following steps:
  • Identification on a support comprising the cells from the biological sample, of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of the EML4-ALK fusion protein gene, - - b.
  • Detection on a support comprising the cells coming from the biological sample, using a FISH type technique using specific reshaping or amplification probes, of the signal associated with the presence of the EML4-ALK fusion gene ,
  • the method detects, on the one hand, the presence of the EML4-ALK fusion gene and, on the other hand, the presence of a protein other than a protein encoded by said fusion gene.
  • the method according to the invention comprises a step of enriching the biological sample in CTC, preliminary or inherent to the steps of identification of the different signals, the enrichment factor of the cells in CTC being understood as about 1/100 to about 1 / 100,000.
  • the filter in particular an ISET filter (sold by the company Rarecell or Screencell)
  • the filtration of the blood sample leads, in a manner inherently to the filtration, to an enrichment of the cells in CTC.
  • the approach on filters can usually get more cells to sit the diagnosis. Filters are very delicate than any other medium (no flatness, background noise and pore problems).
  • the size of the pores, these filters determines the size of the cells that can be retained on the filter, said size of the cells may vary from 8 pm to at least 40 pm.
  • the enrichment step takes place during the immunomagnetic separation, and is prior to the slide deposit.
  • the subject of the invention is a method in which the deposition of the cells originating from the biological sample of the patient is carried out on a suitable support that can be analyzed using a fluorescence microscope-type apparatus. or scanner, said support being able to be a filter or a blade.
  • the support used for depositing the biological sample can be analyzed in a microscope, such as for example a fluorescence microscope, a scanner, or any other device for reading a support, whether the reading is manual or automated.
  • a microscope such as for example a fluorescence microscope, a scanner, or any other device for reading a support, whether the reading is manual or automated.
  • the support can be a filter, a blade, or any other support adapted to the deposit of the sample and the reading of the signals in a suitable apparatus.
  • the inventors have thus developed an automated strategy using a blade scanner (in particular the ARIOL ® system from LEICA) which consists in sorting the cells recovered after filtration (or after enrichment by negative selection) into 2 fractions, one CD45 (+) and the other CD45 (-).
  • the CD45 (-) fraction containing the different CTC populations is then extensively analyzed to identify purely epithelial CTCs, mesenchymal, hybrid (epithelial and mesenchymal) CTCs as well as other populations that do not express these markers.
  • FISH FISH signals (ALK / EML4 rearrangement) are relocated in these different populations.
  • CTCs can be characterized phenotypically and genotypically in their entirety.
  • the cells originating from the biological patient sample are collected during filtration, for filter deposition, or deposited on a slide after magnetic immuno-separation, or by any appropriate method known to the patient. skilled person.
  • step a is, the identification of at least one signal indicating the presence of CTC, in particular the signal characterizing the presence of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal that is a witness of the presence of CTC is carried out by means of fluorescence immunolabeling using at least one marker chosen in one of the groups consisting of:
  • a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene i. a nuclear membrane marker or a nuclear marker
  • a protein marker selected from. group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells. More particularly, the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal which is a control signal for the presence of CTC is carried out by means of a fluorescence immunolabeling using, in combination, at least two markers. each being selected from one of the groups consisting of:
  • a marker of the protein encoded by the E L4-ALK fusion gene i. a nuclear membrane marker or a nuclear marker
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC implements, in a combined manner, at least three markers, each being chosen from one of groups consisting of:
  • a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene i. a nuclear membrane marker or a nuclear marker
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC implements, in a combined manner, four markers, each being chosen from the one of the groups consisting of:
  • a marker of the protein encoded by the E L4-ALK fusion gene i. a nuclear membrane marker or a nuclear marker
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC is carried out by means of fluorescence immunomarquacy using at least one marker selected from one of the groups consisting of:
  • a marker of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene, ii. a nuclear membrane marker or a nuclear marker,
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal which is a control signal for the presence of CTC is carried out by means of fluorescence immunolabeling using, in combination, at least two markers, each selected from one of the groups consisting of:
  • a marker of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene,
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC implements, in a combined manner, at least three markers, each being chosen from one of groups consisting of:
  • a marker of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene,
  • the subject of the invention is a method in which the step of identifying at least one signal indicating the presence of CTC implements, in a combined manner, four markers, each being chosen from the one of the groups consisting of:
  • a marker of a protein encoded by a gene characteristic of the tumor nature of the cell with the exception of a marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene,
  • a protein marker selected from the group consisting of: protein markers characteristic of epithelial cells and protein markers characteristic of mesenchymal cells.
  • the invention relates to a method wherein the specific marker of the EML4-ALK fusion gene encoded protein clones are 5A4 or D5F3, marketed by companies AbCam ®, Cell Signaling Technology ®
  • the subject of the invention is a method in which the nuclear membrane marker used is the Emerin marker.
  • the morphological characterization step is based either on the introduction of a nuclear membrane marker (such as emerin) into the quadruple fluorescent labeling, or on the completion of a staining step of the nuclei (such as hematoxylin / eosin) after labeling * 1 F which must also be removed in the intermediate washing step between IF and FISH.
  • the subject of the invention is a method in which the nuclear marker used is chosen from the group consisting of: the DAPI marker, the Syto59, Sytox Orange, TOPRO 3 and Hoescht 33342 markers.
  • the subject of the invention is a method in which the hemafipoetic cell marker is chosen from the group consisting of: CD45 and CD31.
  • the marker used is preferably CD45.
  • CTCs are known to be heterogeneous and composed of different subpopulations.
  • the approach according to the invention makes it possible to identify and characterize the different subpopulations of CTC, purely epithelial, purely mesenchymal, hybrid (epithelial and mesenchymal) as well as other populations that do not express these markers. Only the approaches of filtration or negative selection of CTCs by elimination of hematopoietic cells can give access to these cells.
  • the subject of the invention is a method in which the protein marker characteristic of epithelial cells is selected from the group consisting of: EpCAM markers, pan-cytokeratin markers and epithelial cadherin markers .
  • the subject of the invention is a method in which the protein marker characteristic of mesenchymal cells is chosen from the group consisting of: vimentin markers and markers of neural cadherin.
  • a particular embodiment of the invention which is the subject of the invention comprises a step of identifying at least one signal which is a control signal for the presence of CTC carried out by means of a fluorescence immunolabeling using: i. the marker of the protein encoded by the EML4-ALK fusion gene, i. the DAPI nuclear marker,
  • iii a marker of pan-cytokeratin.
  • Another particular aspect of the invention relates to a method of the FISH type comprising the following successive steps:
  • the method according to the invention comprises a FISH test carried out according to a particular and advantageous protocol, developed by the inventors, and using specific reshaping or amplification spndes, and not centromeric probes.
  • This method therefore makes it possible to specifically detect the presence of reshaped or amplified genes in the cells.
  • the cells which are very fragile, are not resistant to testing, the results of these tests are therefore not usable.
  • the immunofluorescence (IF) and FlSH coupling is in fact very delicate for the following reasons:
  • CTCs are inherently very fragile because of the detachment of the tumor and it is generally accepted that a very large part of the entrances are in apoptosis
  • the IF plus FISH sequence requires very mild methods for both IF and FISH and has an intermediate stage of fluorescence elimination before FISH. If the fluorescence is poorly eliminated, it follows a significant background noise that makes the FISH uninterpretable. Moreover, it is well known that FISH is already very delicate. The inventors have developed successive gentle washes that respect the fragility of CTC and avoid cell losses,
  • the method according to the invention is carried out on a blood sample of a patient.
  • the biological samples necessary to diagnose the presence of an ALK gene rearrangement and to decide on a targeted anti-ALK treatment in the tests according to the prior art are necessarily tumor biopsies, invasive and often of poor quality, in particular in patients certain cancers such as NSCLC.
  • Another aspect relates to the use of a method according to the invention for analyzing a biological sample from a cancer patient presenting the translocated ALK gene for monitoring tumor progression, for the prediction of a tumor event. metastatic type or for measuring the effectiveness of an anti-cancer treatment.
  • Another aspect relates to the use of a method according to the invention for analyzing a biological sample from a cancer patient having the translocated ALK gene for the diagnosis of the indication of tumor treatment against ALK protein.
  • the invention relates to the use of the method described in the context of cancer patients likely to lead to the presence of metastases, including non-small cell lung cancer, and any other cancer presenting with reshaping the ALK gene.
  • a method according to the invention therefore falls within the scope of personalized medicine with targeted antitumor therapy.
  • FIG. 1 Fluorescence microscopy image on ISET filter showing the labeling obtained on line H2228 (carrying the EML4-ALK translocation) with the monoclonal antibody (5A4 or D5F3) specific for the translocated ALK protein.
  • 1A Marking obtained with the nuclear dye DAPI;
  • B Labeling obtained with the specific antibody of the ALK protein;
  • C Labeling obtained with the specific antibody of the ALK protein and DAPI.
  • FIG. 2 Fluorescence microscopy image showing a FISH experiment on ISET filter performed on CTC of a patient with non-small cell lung cancer.
  • 2A Example of a hematopoietic cell retained on the filter having no translocation;
  • 2B and 2C Example of two CTCs with translocation. 2p23 break point specific probes were used.
  • Figure 3 Fluorescence microscopy images in three representative patients (P2, P6, P11) showing FISH detection of ALK rearrangement in CTC and tumor of the same patient.
  • Various CTC examples are presented: individual CTCs carrying only ALK (P2) shuffling, individual CTCs carrying both a native ALK gain and ALK (P6) shuffling, CLC in ALK shuffling (P11) clusters .
  • Figure 4 Microscopy images illustrating the method combining 4-color immunofluorescence labeling
  • Figure 5 Fluorescence microscopy images illustrating the possibility of following by FISH the presence of CTCs carrying ALK rearrangement in patients with ALK positive NKLC treated with an inhibitor of ALK.
  • Figure 6 Fluorescence microscopy image showing detection of amplification of HER2 on ISET filter.
  • 6A Example PSU ⁇ e experi- for FISH on SKBR3 cell line;
  • 6B Example of a FISH experiment on CTCs of a patient carrying HER2 amplification;
  • 6C Example of immunofluorescence staining with the monoclonal antibody directed against the HER2 protein on the CTCs of a patient carrying the HER2 amplification.
  • Figure 7 Fluorescence microscopy image showing in cell lines and prostate and breast cancer patients collected on ISET filter, the detection by FISH of various molecular abnormalities.
  • FIG. 8 Microscopy images illustrating in cell lines (FIG. 8A) and CTCs of patients suffering from prostate cancer (FIG. 8B) the automated method combining on ISET filter the 4-color immunofluorescence labeling (vimentin / cytokeratines / CD45 / DAPI) and FISH for the detection of CTCs carrying amplification of ERG or cMYC or AR genes.
  • FIG. 9 Microscopy images illustrating in the H 975 bronchial cancer cell line the method combining on ISET filter the immunofluorescence labeling (cMet / CD45 / DAPI) and FISH; 9A: 3-Color Immunofluorescence Detection of cMET Protein; 9B: Detection of cMET amplification; 9CT Method combining immunofluorescence labeling and FISH.
  • Example 1 Preparing the Analysis Medium
  • the blood sample is enriched in CTC by filtration based on the ISET technique (isolation by size of epithelial tumors).
  • the filters are subjected to very low pressure filtration on the ISET machine (7mBar), then dried on a hot plate at 45 ° C for 2 min.
  • the filters are wrapped in aluminum foil and then frozen.
  • Example 2 Morphological and Phenotypic Identification of CTCs
  • the cells are identified by immunofluorescent staining, on ISET filter, nuclei, cytokeratin, CD45 and ALK protein.
  • 1X EDTA buffer pH9 is prepared from 10X EDTA and then warmed to 98 ° C.
  • the antibodies are diluted in 0.4% TBS-Triton and at a total volume of 10 ⁇ .
  • the different antibody solutions are prepared independently and then mixed.
  • the anti-cytokeratin antibodies (CK A1 / A3 - DAKO) are coupled to the AF546 fluorochrome according to the Zenon IGAF546 kit coupling protocol (Invitrogen). 30 ⁇ l of anti-CD45 APC antibodies (BD Biosciences) are taken and will be added to the mixture of different antibodies.
  • Anti-ALK (Novo-Castra) antibodies are coupled to AF488 fluorochrome according to the Zenon IGAF488 kit coupling protocol (Invitrogen).
  • the filters are taken out of the freezer and placed at room temperature for about 15 minutes.
  • the filters are attached to the blade using high temperature resistant tape, which also identifies the filters.
  • the filters are then rehydrated in TBS for 5 minutes and then drained.
  • the slides are immersed for 5 min in EDTA buffer 1X pH 9 heated in a water bath at 98 ° C, they are then rinsed for 2 min in TBS and for 1 min in distilled water and then drained.
  • spots (8 mm in diameter) are surrounded using DakoPen (hydrophobic).
  • Wet chambers are prepared using an absorbent paper previously passed under tap water. On each spot, 100 ⁇ of the prepared solution of antibodies are deposited, then each spot is covered with a round slat 12mm in diameter. All incubated overnight in a humid chamber at 4 ° C and in the dark.
  • the chambers are placed at room temperature for 15 min and then rinsed in 0.05% TBS-Tween for 2 min and drained, rinsed in distilled water and then drained.
  • DAPI mounting solution 100 ⁇ l of diluted DAPI mounting solution are deposited on each slide, all incubated for 15 min at room temperature and in the dark. The slides are then rinsed in 0.05% TBS-Tween for 2 min and then drained, then rinsed in distilled water and drained.
  • the slides and coverslips are then mounted fluoromount, after 1 hour at room temperature and in the dark, they are sealed, before being stored at 4 ° C.
  • This test is performed after immunofluorescence staining.
  • a solution of 80 ml of 0.01 N HCl (8 ml 0.1N HCl + 72 ml H 2 O) is preheated in a 37 ° C water bath.
  • the slides kept at + 4 ° C. are incubated for 5 min in a bath of 4xSSCT.
  • Peptide afiquote is added to 0.01N HCl at 37 ° C.
  • the filter is incubated for a few minutes in the pepsin solution, shaking it every two minutes.
  • a fixing solution, formaldehyde of final concentration 1%, is prepared extemporaneously.
  • the resulting solution is stable for a day.
  • the slides are washed in a tray of PBS1x for 5 minutes without moistening the adhesive tape and without agitation.
  • the slides are then fixed by soaking for 2 minutes in the fixing solution, without moistening the adhesive tape.
  • the slides are then dehydrated successively for two minutes at 70%, 85% and 100% ethanol, without letting the lamés dry between the alcohols.
  • the back of the blade is wiped gently, the filter then dries for a few minutes, and for a maximum of one hour, on a plate at 37 ° C, or dry at room temperature.
  • an airtight box is placed on the lit plate at 37 ° C, this box will allow the possible transport of the blade.
  • the hybridization apparatus, or hybridizer is turned on and programmed to obtain a temperature of 37 ° C.
  • the blades are inserted in their respective places in the "hybridizer”.
  • the two strips on the cover are moistened with water, and then replaced on the cover of the hybridizer to minimize evaporation of the probe.
  • the blade is placed on the platen at 37 ° C.
  • On each spot (8 mm in diameter) are deposited 10 ⁇ of hybridization mixture probe ALK (Vysis) (for each spot are deposited 7 ⁇ of buffer, 2 ⁇ of water, 1 ⁇ of probe).
  • a small round blade (12 mm in diameter) is placed gently on the spots.
  • the area of interest is sealed with glue placed around it to completely isolate this area.
  • the glue is dried by depositing the slide on the platen at 37 ° C. for about 5 minutes.
  • the slide is then immediately placed in the hybridizer in order not to modify the temperature of the probe.
  • the denaturation program is started at 85 ° C for 0 min, then hybridization typically takes place at 44 ° C overnight (12 hours) at 44 ° C.
  • This hybridization can be carried out in the hybridizer or in an oven placed at 44 ° C. In the latter case, after the step at 85 ° C, the blade is very quickly placed in the box already at 37 ° C on the plate, then transferred to the special wet black box set in the oven at 44 ° C.
  • Dako Wash Buffer IX buffer is prepared extemporaneously.
  • the buffer is then preheated, placing half of the buffer in a porcelain tray which is placed in the water bath at 65 ° C without the temperature being reached (to avoid thermal shock), the temperature is reached at the end about 30 min.
  • the other half of the buffer is placed in a slide tray at room temperature.
  • the blade is extracted from the hybridizer or oven and transported if necessary into a special black box to protect the blade from light.
  • the slide is washed for about 7 minutes in the Stringent Wash Buffer at room temperature without agitation.
  • the slide is washed for 5 min in the preheated buffer at 65 ° C. and then for 5 min in Wash Buffer 1X DAKO wash buffer at room temperature.
  • the slide is dehydrated for 2 min with successively 70%, 85%
  • the back of the blade is gently wiped with absorbent paper and allowed to dry for a few minutes on the plate at 37 ° C, checking that no alcohol remains between the blade and the filter.
  • the slides can be rewashed at 70 ° C for 1-5 min.
  • the blades are covered by a slat of 22x22 or 24x40, the whole is sealed on one side of the slat, on the opposite side to the spot.
  • the slide is dried on the hot plate at 37 ° C for about a few minutes.
  • the slide is transported in a black box to the microscope, and observed using successively x20 magnifications, to spot the spot, then x100, with immersion oil.
  • the slide can be stored in the dark for 1 week at room temperature or for 1 year at -20 ° C.
  • the reading is carried out under a fluorescence microscope or scanner. CTCs are relocated from the positions already identified during immunostaining.
  • EXAMPLE 4 Test for Detection of the HER-2 Gene Using the FISH Technique This test is carried out after the immunofluorescence labeling.
  • the blade and coverslip system is disassembled and the filter is washed in a 1X PBS solution before being fixed with a solution of methanol / acetic acid (9: 1) for 2 hours at room temperature. room.
  • a solution of 80 ml of 0.01 N HCl (8 ml 0.1N HCl + 72 ml H 2 O) is preheated in a water bath at 37 ° C for at least 30 minutes.
  • the slides kept at + 4 ° C are incubated successively for 5 min in a bath of 4xSSCT to take off the coverslip, if necessary the slide can be peeled off using a clamp, the mounting medium is removed and the filter is rinsed off in a 1X PBS bath.
  • pepsin is added to the 0.01N HCl, at 37 ° C, the whole is thoroughly mixed. The filter is incubated for 6 min in the pepsin solution, shaking it every two minutes.
  • a fixing solution containing 1% formaldehyde is prepared extemporaneously.
  • the slides are washed in a tray of PBS1X for 5 minutes without moistening the adhesive tape and without agitation.
  • the slides are then fixed by soaking for 2 minutes in the fixing solution, without moistening the adhesive tape.
  • the slides are then dehydrated successively for two minutes at 70%, 85% and 100% ethanol, without allowing the slides to dry between the alcohols.
  • the back of the blade is wiped gently, the filter then dries for a few minutes, and for a maximum of one hour, on a plate at 37 ° C, or it dries at room temperature.
  • Hybridizer is turned on and programmed to obtain a temperature of 37 ° C.
  • the slides are inserted, in their respective places, in "hybridizer".
  • the two strips on the cover are moistened with water, and then replaced on the cover of the hybridizer to minimize evaporation of the probe.
  • the blade is placed on the platen at 37 ° C. On each spot (8 mm in diameter) are deposited 6 ⁇ of probe HER-2 (Dako)
  • a small round blade (12 mm in diameter) is placed gently on the spots. Any bubbles are pushed gently outside the surface of the slat, for example with a cone.
  • the area of interest is sealed with glue placed around, to completely desolate this area.
  • the glue is dried by depositing the slide on the platen at 37 ° C. for about 6 minutes. The slide is then immediately placed in the hybridizer so as not to change the temperature of the probe.
  • the denaturation program is started at 85 ° C for 10 minutes, followed by hybridization at 44 ° C overnight (12 hours) at 44 ° C.
  • This hybridization can be carried out in a hybridizer or in an oven placed at 44.degree. In the latter case, after the step at 85 ° C, the blade is very quickly placed in the box already at 37 ° C on the plate, then transferred to the special wet black box put in advance in the oven at 44 ° C.
  • the hybridizer when cooled to 37 ° C, is stopped.
  • the water bath is connected at 65 ° C and the plate at 37 ° C, Dako Wash Buffer 1X buffer is prepared extemporaneously.
  • the pad is then preheated, placing half of the pad in a porcelain dish which is placed in the water bath at 65 ° C. without the temperature being reached (to avoid thermal shock), the temperature is reached at after about 30 minutes.
  • the other half of the buffer is placed in a slide tray at room temperature.
  • the blade is extracted from the hybridizer or oven and transported if necessary into a special black box to protect the blade from light.
  • the slide is dehydrated for 2 min with successively 70%, 85% 00% ethanol, without allowing to dry between the alcohols.
  • the back of the blade is wiped gently with absorbent paper, then allowed to dry for a few minutes on the plate at 37 ° C, checking that no alcohol remains between the blade and the filter.
  • the labels can be rewashed at 70 ° C for 1 -5 min.
  • the blades are covered by a slat of 22x22 or 24x40, the whole is sealed on one side of the slat.
  • the blade is dried on. the hot plate at 37 ° C for about 5 min.
  • the slide is transported in a black box to the microscope, and observed using successively x20 magnifications, to spot the spot, then x100, with immersion oil.
  • the slide can be kept in the dark for 1 week at room temperature or for 1 year at -20 ° C.
  • the reading is carried out under a fluorescence microscope or scanner. CTCs are relocated from the positions already identified during immunostaining.
  • the FISH technique is carried out in the same way as described in Example 4, using a probe specific for c-MET.
  • the FISH technique is implemented in the same manner as described in Example 4, using a specific Erg probe.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention a pour objet une méthode de caractérisation, dans un échantillon biologique de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses d'au moins un marqueur caractéristique de la nature tumorale de la cellule, ledit marqueur étant choisi dans les groupes constitués par : - les protéines oncogéniques caractéristiques des CTC, et - les marqueurs tumoraux. L'invention concerne également l'utilisation de cette méthode pour décider de la mise en oeuvre d'un traitement chez un patient atteint d'un cancer.

Description

Méthode de caractérisation de cellules tumorales circulantes
et application au diagnostic
La présente invention a pour oBjet une nouvelle méthode dé caractérisation de cellules tumorales circulantes (CTC) ainsi que les utilisations de cette méthode pour décider de la mise en œuvre d'un traitement, diagnostiquer l'état d'avancement d'un cancer et prognostiquer l'évolution dé1 là" maladie chez un patient.
Les cellules tumorales circulantes jouent un rôle crucial dans le processus métastatique, et leur analyse peut fournir des informations importantes pour le pronostic d'un patient. Elles constituent en outre un matériel tumoral facilement accessible par des méthodes non invasives, représentatif en temps réel de la maladie métastatique. Dans le contexte du développement de la médecine personnalisée des cancers, la détection de la présence dans des CTC de marqueurs moléculaires cibles d'un traitement antitumoral, peut permettre de sélectionner les patients susceptibles de bénéficier de ce traitement voire d'évaluer au niveau individuel la réponse ou la résistance à ce même traitement. La sélection des patients susceptibles de bénéficier d'un
r
traitement ciblé antitumoral est actuellement basée sur "la recherche de marqueurs moléculaires dans des biopsies de métastases. La présente méthode permet de réaliser cette recherche sur des CTC, complétant voire se substituant à l'analyse de la biopsie tumorale.
Les difficultés actuelles de détection des CTC sont liées à leur présence en faible nombre dans le sang. Dans le contexte des traitements ciblés antitumoraux, le diagnostic de la présence d'un marqueur moléculaire dans des CTC doit donc être réalisé sur très peu de cellules. Pour établir dé façon certaine et fiable ce diagnostic, différentes analyses doivent donc être réalisées en parallèle sur les cellules afin de montrer d'une part la nature tumorale des CTC sur la base du phénotype (marqueurs tumoraux), de la morphologie et d'une anomalie moléculaire impliquée dans l'oncogénèse (exemple : remaniement du gène ALK, amplification du gène HER2). Lecharpentier et al (2011) décrit une méthode de détection des CTC dans un échantillon sanguin, basée sur la co-expression par lesdites cellules de marqueurs spécifiques de cellules épithéliales et de marqueurs spécifiques de cellules mésenchymateuses. Cette méthode met en œuvré l'utilisation combinée de trois marquages fluorescents et requiert une analyse morphocytologique complémentaire, pratiquée par un cytopathologiste expérimenté.
La méthode selon la présente invention offre une solution alternative pour la détection des CTC ne requérant pas la présence d'un cytopathologiste patenté, car elle combine une véritable analyse morphologique, une identification phénotypique des cellules par immunomarquage fluorescent et la détection au niveau génomique de la présence de séquences particulières d'ADN, telles que des réarrangements caractéristiques de cellules cancéreuses.
La combinaison, selon la méthode de l'invention, de deux techniques différentes de détection et de deux niveaux d'analyse différents, appliquées sur un même échantillon biologique et de préférence un échantillon sanguin, confère à ce diagnostic une sensibilité et une fiabilité élevée. Plus particulièrement, la méthode selon la présente invention constitue un test diagnostic permettant de poser l'indication d'un traitement antitumoral ciblé contre la protéine oncogénique ALK chez les patients atteints de cancer.
La méthode de détection selon l'invention est maintenant décrite de façon détaillée.
La présente invention a pour objet une méthode d'identification, dans un échantillon, notamment dans échantillon sanguin, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses d'au moins un marqueur caractéristique de la nature tumorale de la cellule, ledit marqueur étant choisi dans les groupes constitués par :
- les protéines oncogéniques caractéristiques des CTC, et
- les marqueurs tumoraux,
ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH, du signal associé à la présence d'un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC. L'invention a pour avantage de combiner, sur le même support, un marquage phénotypique et une analyse par une méthode de type FISH, qui préservent l'intégrité des CTC.
Selon un premier aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode d'identification, dans un échantillon biologique provenant d'un patient, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses du gène de fusion EML4-ALK, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH, du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK,
c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
Selon toujours ce premier aspect, l'invention a pour objet une méthode d'identification, dans un échantillon biologique, notamment dans un échantillon sanguin, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses du gène de fusion EML4-ALK, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK,
c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
Selon ce premier aspect de l'invention, la méthode détecte la présence du gène de fusion EML4-ALK, par la technique de FISH, et identifie morphologiquement et phénotypiquement les CTC, et notamment la présence de la protéine codée par ledit gène de fusion.
La détection du remaniement EML4-ALK concerne exclusivement des patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules (également appelé cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC)). La protéine de fusion EML4-ALK a une puissante activité oncogénique et un rôle clé dans la cancérogénèse chez une sous population de patients atteints de CBNPC. Cette activité, qui peut être bloquée par des petites molécules, notamment des inhibiteurs de tyrosine kinase ciblant ALK, est une cible moléculaire importante dans le traitement de ces cancers. Il est notoire que les CTCs dans ces tumeurs présentent une composante mésenchymateuse importante et que les méthodes basées sur la détection de CTC épithéliales sont inefficaces pour capturer des CTC de cancer du poumon. Compte tenu du rendement très faible en nombre de CTCs dans ces approches, il n'est pas possible de se servir dans un contexte clinique des approches ne capturant que des CTCs épithéliales pour diagnostiquer la présence du remaniement, suivre la réponse aux inhibiteurs de ALK ou encore pour détecter précocement des résistances. L'échantillon biologique, et notamment l'échantillon sanguin, provient d'un patient atteint d'un cancer.
Selon un mode particulier de la méthode d'identification, les cellules tumorales circulantes (CTC) sont d'origine épithéliale et mésenchymateuse.
Au sens de la présente invention, la méthode d'identification des CTC est également appelée méthode d'enrichissement des CTC ou méthode de caractérisation des CTC. Les trois expressions sont équivalentes et peuvent être employées indifféremment. La méthode d'enrichissement utilisée selon la présente invention est la méthode ISET.
Selon un mode particulier de la méthode d'identification, les cellules provenant de l'échantillon biologique servant à l'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC et à la détection du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK, sont isolées selon leur taille qui varie de 8 pm à au moins 40 pm.
Selon un deuxième aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode d'identification, dans un échantillon provenant d'un patient, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses d'au moins un marqueur caractéristique de la nature tumorale de la cellule, ledit marqueur étant choisi dans les groupes constitués par :
- les protéines oncogéniques caractéristiques des CTC, à l'exception du gène de fusion EML4-ALK, et
- les marqueurs tumoraux,
ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'une protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH, du signal associé à la présence d'un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception du gène de fusion EML4-ALK, c. Comparaison de tâ focalisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
La méthode de détection des CTC décrite dans la publication de Charpentier et al. (201 1) décrit une méthode de détection de CTC comprenant, d'une part, l'utilisation combinée de trois marquages fluorescents et, d'autre part, une analyse morphocytologique pratiquée par un cytopathologiste expérimenté. Ce document ne divulgue pas une méthode de détection de CTC combinant des marquages phénotypiques fluorescents et une analyse automatisée de la morphologie des cellules ; il ne divulgue pas non plus une méthode combinant la détection phénotypique des cellules par immunomarquage fluorescent et la détection au niveau chromosomique de la présence de séquences particulières d'ADN. Enfin, ce document ne divulgue pas une méthode de détection combinant une détection automatisée de la morphologie des cellules, une détection phénotypique par immunomarquage fluorescent et une détection moléculaire par l'utilisation de procédés de type FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation).
Selon un autre aspect, la méthode d'identification selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de ta nature tumorale de la cellule à l'exception du gène de la protéine de fusion EML4-ALK,
b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH, du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
Toujours selon cet autre aspect, la méthode d'identification selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule à l'exception du gène de la protéine de fusion EML4-ALK, - - b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK,
c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
Selon cet aspect, la méthode détecte, d'une part, la présence du gène de fusion EML4-ALK et, d'autre part, la présence d'une protéine autre qu'une protéine codée par ledit gène de fusion.
La combinaison de marqueurs de nature différente dans les étapes a et b de la méthode présente l'avantage particulier d'offrir une meilleure caractérisation des cellules, d'où la plus grande fiabilité du diagnostic.
.
Selon un aspect particulier, la méthode selon l'invention comporte une étape d'enrichissement de l'échantillon biologique en CTC, préalable ou inhérente aux étapes d'identification des différents signaux, le facteur d'enrichissement des cellules en CTC étant compris d'environ 1/100 à environ 1/100.000.
Lorsque le support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique est un filtre, notamment un filtre ISET (commercialisé par la société Rarecell ou Screencell), la filtration de l'échantillon sanguin conduit, de façon inhérente à la filtration, à un enrichissement des cellules en CTC. L'approche sur filtres permet d'obtenir généralement plus de cellules pour asseoir le diagnostic. Les filtres sont beaucoup délicats que tout autre support (pas de planéité, problèmes de bruit de fond et de pores). La taille des pores, de ces filtres détermine la taille des cellules qui vont pouvoir être retenues sur le filtre, ladite taille des cellules pouvant varier de 8pm à au moins 40 pm.
Lorsque le support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique est une lame, l'étape d'enrichissement a lieu lors de la séparation immunomagnétique, et est préalable au dépôt sur lame.
Cet enrichissement est de l'ordre d'un facteur environ 1/100 à un facteur environ 1/100.000, selon la méthode d'enrichissement utilisée et varie d'un patient à l'autre. Selon un aspect plus particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le dépôt des cellules provenant de l'échantillon biologique du patient est réalisé sur un support approprié pouvant être analysé à l'aide d'un appareil de type microscope à fluorescence ou scanner, ledit support pouvant être un filtre ou une lame.
Le support utilisé pour le dépôt de l'échantillon biologique peut être analysé dans un microscope, comme par exemple un microscope à fluorescence, un scanner, ou tout autre appareil permettant la lecture d'un support, que la lecture soit manuelle ou automatisée. Comme indiqué précédemment, le support peut être un filtre, une lame, ou tout autre support adapté au dépôt de l'échantillon et à la lecture des signaux dans un appareil approprié.
Les inventeurs ont ainsi mis au point une stratégie automatisée grâce à un scanner de lames (notamment le système ARIOL® de LEICA) qui consiste à trier les cellules récupérées après filtration (ou après enrichissement par sélection négative) en 2 fractions, l'une CD45(+) et l'autre CD45(-). La fraction CD45(-) contenant les différentes populations de CTC est ensuite extensivement analysées pour identifier les CTCs purement épithéliales, les CTCs mésenchymateuses, hybrides (épithéliales et mésenchymateuses) ainsi que d'autres populations qui n'exprimerait pas ces marqueurs. Après FISH, les signaux de FISH (réarrangement ALK/EML4) sont relocalisés dans ces différentes populations. C'est ainsi que les CTCs peuvent être caractérisées phénotypiquement et génotypiquement dans leur globalité.
Dans la méthode selon l'invention, les cellules issues de l'échantillon biologique d patient sont recueillies lors de la filtration, pour le dépôt sur filtre, ou déposées sur lame après immuno-séparation magnétique, ou par toute méthode appropriée connue de l'homme du métier.
La méthode selon l'invention est maintenant plus particulièrement détaillée pour ce qui concerne l'étape a; etest à dire l'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale.
Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre au moins un marqueur choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le . groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses. Plus particulièrement, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen cTun immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre de façon combinée au moins deux marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion E L4-ALK, ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques, iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses. Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée au moins trois marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée quatre marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion E L4-ALK, ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Dans un autre aspect de l'invention en ce qui concerne l'étape a, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de- CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquacie en fluorescence mettant en œuvre au moins un marqueur choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins Un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre de façon combinée au moins deux marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée au moins trois marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques, '
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée quatre marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur d'une protéine codée par un gène caractéristique de la nature tumorale de la cellule, à l'exception d'un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi parmi le groupe constitué par : des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et des marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur spécifique de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK sont les clones 5A4 ou D5F3, commercialisés par les sociétés AbCam®, Cell Signaling Technology®
Dans un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur de membrane nucléaire utilisé est le marqueur Emerin. L'étape de caractérisation morphologique repose soit sur l'introduction d'un marqueur de la membrane nucléaire (comme l'émerine) dans le quadruple marquage fluorescent, soit sur la réalisation d'une étape de coloration des noyaux (comme l'hématoxyline/éosine) après le marquage* 1 F qui doit aussi être éliminée dans l'étape intermédiaire de lavage entre IF et FISH.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur nucléaire utilisé est choisi dans le groupe constitué par : le marqueur DAPI, les marqueurs Syto59, Sytox Orange, TOPRO 3, Hoescht 33342. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur de cellules hémafbpoiétiques est choisi dans le groupe constitué par : CD45 et CD31. Le marqueur utilisé est de préférence CD45. Bien que très rares, les CTCs sont connues pour être hétérogènes et composées de différentes sous populations. L'approche selon l'invention permet d'identifier et de caractériser les différentes sous populations de CTC, purement épithéliales, purement mésenchymateuses, hybrides (épithéliales et mésenchymateuses) ainsi que d'autres populations qui n'exprimerait pas ces marqueurs. Seules les approches de filtration ou de sélection négative des CTCs par élimination des cellules hématopoiétiques peuvent donner accès à ces cellules.
Ceci est important du point de vue de l'application clinique à deux niveaux : - plus de CTCs (en nombre) sont identifiées et il devient donc possible de les utiliser pour diagnostiquer la présence du réarrangement ALK et ainsi décider de l'administration d'un traitement avec des inhibiteurs de ALK, puis rechercher la présence de CTCs présentant le remaniement de ALK sous ce traitement pour évaluer son efficacité ; les méthodes décrites dans l'art antérieur ne permettent de récupérer qu'une petite fraction des CTC (CTC épithéliales) et cette fraction trop rare n'est pas utilisable dans ce contexte clinique. Par ailleurs des travaux montrent que les CTC porteuses d'un réarrangement ALK sont principalement mésenchymateuses et donc ne peuvent pas être ou sont très mal caractérisées à partir des méthodes de l'art antérieur,
- l'émergence des sous populations très minoritaires porteuses d'autres anomalies moléculaires, qui vont être la manifestation d'un mécanisme de résistance aux traitements, ciblant ALK, devient détectable ; il est important de détecter précocement ces résistances pour pouvoir changer plus tôt de traitement et permettre au patient de bénéficier d'un traitement plus adapté, l'identification de la nature de la résistance est une application importante des CTCs, parce il n'y a pas d'autre moyen (impossible de réaliser des biopsies répétées) de repérer précocement et d'identifier la nature de ces résistances qui peuvent être d'autres anomalies moléculaires (amplification de gènes ou mutations...). Les méthodes selon la présente invention peuvent donc contribuer véritablement à une meilleure prise en charge thérapeutique des patients.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur de protéines caractéristiques des cellules épithéliales est choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de EpCAM, les marqueurs de pan-cytokératines et les marqueurs de la cadhérine épithéliale.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode dans laquelle le marqueur de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses est choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de la vimentine et les marqueurs de la cadhérine neurale.
Une réalisation particulière de l'invention objet de l'invention comprend une étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre : i. le marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, i. le marqueur nucléaire DAPI,
ii. le marqueur de cellules hématopoïétiques CD45,
iii. un marqueur de pan-cytokératines.
Un autre aspect particulier de l'invention a pour objet une méthode de type FISH comprenant les étapes successives suivantes :
- traitement enzymatique du support après fixation,
- hybridation sur le suppprt en présence d'au moins une sonde,
- localisation de la sonde hybridée sur le support.
La méthode selon l'invention comprend un test de FISH réalisé selon un protocole particulier et avantageux, mis au point par les inventeurs, et utilisant des spndes spécifiques de remaniement ou d'amplification, et non des sondes centromériques. Cette méthode permet donc de détecter spécifiquement la présence de gènes remaniés ou amplifiés dans les cellules. Lors de la mise en œuvre sur des CTC de tests de FISH réalisés selon des protocoles standards de l'art antérieur, les cellules, qui sont très fragiles, ne résistent pas aux tests, les résultats de ces tests ne sont donc pas utilisables. Le couplage de immunofluorescence (IF) et de la FlSH est en fait très délicat pour les raisons suivantes :
- les CTC sont par nature très fragiles du fait du détachement de la tumeur et il est communément admis qu'une très grande partie d'entrés elles sont en apoptose,
- l'enchaînement IF plus FISH nécessite d'avoir des méthodes très douces à la fois pour l'IF et la FISH et d'avoir une étape intermédiaire d'élimination de la fluorescence avant la FISH. Si la fluorescence est mal éliminée, il s'en suit un bruit de fond important qui rend la FISH ininterprétable. Par ailleurs, il est notoire que la FISH est déjà par elle- même très délicate. Les inventeurs ont mis au point des lavages doux successifs qui respectent la fragilité des CTC et évitent les pertes cellulaires,
- compte tenu de la rareté des CTCs, il est important d'en conserver le plus grand nombre. Lors du travail sur filtre, il est indispensable de chauffer les filtres 5min à 98°C pour ancrer les cellules dans le filtre sinon les cellules sont perdues.
Selon un aspect particulier, la méthode selon l'invention est réalisée sur un échantillon sanguin d'un patient. Les échantillons biologiques nécessaires pour diagnostiquer la présence d'un remaniement des gènes ALK et décider d'un traitement ciblé anti-ALK dans les tests selon l'art antérieur sont nécessairement des biopsies tumorales, invasives et souvent de mauvaise qualité, notamment chez les patients atteints de certains cancers tels le CBNPC. Un autre aspect concerne l'utilisation d'une méthode selon l'invention pour analyser un échantillon biologique provenant d'un patient atteint de cancer présentant le gène ALK transloqué pour le suivi de l'évolution tumorale, pour la prédiction d'un événement de type métastatique ou pour la mesure de l'efficacité d'un traitement anti-cancéreux. Un autre aspect concerne l'utilisation d'une méthode selon l'invention pour analyser un échantillon biologique provenant d'un patient atteint de cancer présentant le gène ALK transloqué pour le diagnostic de l'indication d'un traitement tumoral contrë a protéine ALK.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation de la méthode décrite dans le cadre de patients atteints d'un cancer susceptible de conduire à la présence de métastases, notamment le cancer bronchique non à petites cellules, et tout autre cancer présentant un remaniement du gène ALK.
Une méthode selon l'invention entre donc dans le cadre de la médecine personnalisée avec thérapie antitumorale ciblée.
L'invention est maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples et des figures qui les accompagnent.
Légende des Figures
Figure 1 : Image de microscopie en fluorescence sur filtre ISET montrant le marquage obtenu sur la lignée H2228 (porteuse de la translocation EML4-ALK) avec l'anticorps monoclonal (5A4 ou D5F3) spécifique de la protéine ALK transloquée. 1A. Marquage obtenu avec le colorant nucléaire DAPI ; 1 B. Marquage obtenu avec l'anticorps spécifique de la protéine ALK ; 1C. Marquage obtenu avec l'anticorps spécifique de la protéine ALK et le DAPI.
Figure 2 : Image de microscopie en fluorescence montrant une expérience de FISH sur filtre ISET réalisée sur les CTC d'un patient atteint de carcinome bronchique non à petites cellules. 2A. Exemple d'une cellule hématopoïétique retenue sur le filtre ne présentant pas de translocation; 2B et 2C. Exemple de deux CTCs présentant une translocation. Des sondes spécifiques du point de cassure 2p23 ont été utilisées. Figure 3: Images de microscopie en fluorescence chez trois patients (P2, P6, P11) représentatifs montrant la détection par FISH du réarrangement ALK dans les CTC et la tumeur du même patient. Différents exemples de CTC sont présentés: CTCs individuelles porteuses uniquement du remaniement ALK (P2), CTCs individuelles porteuses à la fois d'un gain du gène ALK natif et du remaniement ALK (P6), CTC en clusters porteuses du remaniement ALK (P11).
■ a
Figure 4: Images de microscopie illustrant la méthode combinant marquage en immunofluorescence 4 couleurs
(vimentine/cytokeratines/CD45/DAPI et N-cadherine/E- cadherine/CD45/DAPI) et FISH pour la détection de CTCs porteuses du remaniement ALK. 4A: Exemple de deux patients montrant le phénotype mésenchymateux des CTC porteuses du réarrangement ALK; 4B: Contrôle positif des marquages en immunofluorescence sur la lignée de cancer bronchique A549.
Figure 5: Images de microscopie en fluorescence illustrant la possibilité de suivre par FISH la présence de CTC porteuses d'un remaniement ALK chez des patients atteints de CBNPC ALK positif et traités par un inhibiteur de ALK. Exemple de CTCs détectées chez un patient avant et à jour 30 d'un traitement par le crizotinib. L'utilisation de la méthode permet de mettre en évidence chez ce patient la diminution importante de la taille et du nombre de clusters de CTCs dont certaines portent le réarrangement ALK.
Figure 6 : Image de microscopie en fluorescence montrant la détection de l'amplification de HER2 sur filtre ISET. 6A. Exemple d'upe^e périence de FISH sur la lignée cellulaire SKBR3; 6B. Exemple d'une expérience de FISH sur les CTC d'une patiente porteuse de l'amplification HER2 ; 6C : Exemple de marquage en immunofluorescence avec l'anticorps monoclonal dirigé contre la protéine HER2 sur les CTC d'une patiente porteuse de l'amplification HER2. Figure 7: Image de microscopie en fluorescence montrant dans des lignées cellulaires et des patients atteints de cancer de la prostate ou du sein recueillies sur filtre ISET, la détection par FISH de diverses anomalies moléculaires. A: Détection de l'amplification du gène ERG dans la lignée cellulaire LnCAP; B: Détection du réarrangement du gène ERG dans la lignée cellulaire VCAP; C: Détection de l'amplification du gène AR dans la lignée cellulaire LnCAP; D: Détection de l'amplification du gène HER2 dans la lignée cellulaire SKBR3; E: Détection dé l'amplification du gène ERG chez un patient atteint de cancer de la prostate; F: Détection de l'amplification du gène cMYC chez un patient atteint de cancer de la prostate; G: Détection de l'amplification du gène AR chez un patient atteint de cancer de la prostate; H: Détection de l'amplification du gène HER2 chez une patient atteinte de cancer du sein. Figure 8: Images de microscopie illustrant dans des lignées cellulaires (figure 8A) et des CTCs de patients atteint de cancer de la prostate (figure 8B) la méthode automatisée combinant sur filtre ISET le marquage en immunofluorescence 4 couleurs (vimentine/cytokeratines/CD45/DAPI) et FISH pour la détection de CTCs porteuses d'amplification des gènes ERG ou cMYC ou AR.
Figure 9: Images de microscopie illustrant dans la lignée cellulaire de cancer bronchique H 975 la méthode combinant sur filtre ISET le marquage en immunofluorescence (cMet/CD45/DAPI) et FISH; 9A: Détection en immunofluorescence 3 couleurs de la protéine cMET; 9B: Détection de l'amplification cMET; 9CT Méthode combinant marquage immunofluorescence et FISH.
Exemples
Exemple 1 : Préparation du support d'analyse L'échantillon sanguin est enrichi en CTC par filtration basée sur la technique ISET (isolation by size of epithelial tumour cells). Les filtres sont soumis à filtration à très basse pression sur la machine ISET (7mBar), puis séchés sur platine chauffante à 45°C pendant 2 min.
Les filtres sont emballés dans du papier aluminium et ensuite congelés.
Exemple 2 : Identification morphologique et phénotypique des CTC. Les cellules sont identifiées par marquage immunofluorescent, sur filtre ISET, des noyaux, de la cytokératine, de CD45 et de la protéine ALK.
Le tampon EDTA 1X pH9 est préparé à partir d'EDTA 10X, puis réchauffé à 98°C.
Préparation des anticorps :
Les anticorps sont dilués dans du TBS-Triton à 0,4% et à un volume total de 10ΟμΙ. Les différentes solutions d'anticorps sont préparées indépendamment puis mélangées.
Les anticorps anti-cytokératine (CK A1/A3 - DAKO) sont couplés au fluorochrome AF546 selon le protocole de couplage du kit Zenon IGAF546 (Invitrogen). 30μΙ d'anticorps anti-CD45 APC (BD Biosciences) sont prélevés et seront ajoutés au mélange des différents anticorps.
Les anticorps anti-ALK (Novo-Castra) sont couplés au fluorochrome AF488 selon le protocole de couplage du kit Zenon IGAF488 (Invitrogen).
préparés de la façon suivante : 4μΙ d'anticorps à coupler avec le kit de couplage Zenon lgAF488 « mouse » sont ajoutés à 5μΙ d'lgAF488 et incubés 5min à température ambiante.5μΙ de bloquant AF488 sont ajoutés et incubés 5min à température ambiante. La solution d'anticorps est stable 30min. Les différentes solutions d'anticorps sont rassemblées et leur volume complété à 100μΙ dans du TBS-Triton 0,4%.
Préparation des filtres
Les filtres sont sortis du congélateur et placés à température ambiante pendant environ 15 min. Les filtres sont fixés sur la lame en utilisant du ruban adhésif résistant aux hautes températures, celui-ci permet également d'identifier les filtres. Les filtres sont ensuite réhydratés dans du TBS pendant 5 mn puis égouttés.
Démasquage et immunomarquage :
Les lames sont immergées 5min dans le tampon EDTA 1X pH 9 chauffé au bain-marie à 98°C, elles sont ensuite rincées pendant 2 min dans du TBS et pendant 1 min à l'eau distillée puis égoutées. Sur le filtre, les spots (8 mm de diamètre) sont entourés en utilisant le DakoPen (hydrophobe). Des chambres humides sont préparées à l'aide d'un papier absorbant préalablement passé sous l'eau du robinet. Sur chaque spot, 100μΙ de la solution préparée d'anticorps sont déposés, puis chaque spot est recouvert avec une lamelle ronde 12mm de diamètre. Le tout incube pendant une nuit en chambre humide à 4°C et à l'obscurité.
Après incubation, les chambres sont placées à température ambiante pendant 15 min puis rincées dans du TBS-Tween à 0,05% pendant 2 min et égouttées, rincées dans de l'eau distillée puis égouttées.
100 μΙ de solution de montage DAPI préalablement diluée sont déposés sur chaque lame, le tout incube pendant 15 min à température ambiante et à l'obscurité. Les lames sont ensuite rincées dans du TBS-Tween à 0,05% pendant 2 min puis égouttées, puis rincées dans de l'eau distillée et égouttées.
Les lames et lamelles, sont ensuite montées au fluoromount, après 1 h à température ambiante et à l'obscurité, elles sont scellées, avant d'être stockées à 4°C.
La lecture est effectuée au microscope le lendemain, les CTC sont identifiées, et leurs positions sont mémorisées. Exemple 3 : Test de détection du gène de fusion EML4-ALK par la technique de FISH
Ce test est réalisé après le marquage en immunofluorescence.
A. Fixation du matériel Après l'analyse des résultats en immunofluorescence, le système lame et lamelle est démonté et le filtre est lavé dans une solution de PBS 1X avant d'être fixé avec une solution de méthanol/ acide acétique (9 :1) pendant 2 heures à température ambiante. B. Traitement du filtre immobilisé sur la lame
Préparation de la pepsine 10% :
Peser 1g à dissoudre dans 0 ml H2O, sous agitation magnétique, dans un Erlen. Une fois bien dissous, placer l'Erlen dans de la glace. Aliquoter par 100μΙ puis les conserver à -20°C).
Une solution de 80 ml de Hcl à 0,01 N (8 ml HCI 0.1 N + 72 ml H20)est préchauffée dans un bain-marie à 37°C. Les lames conservées à +4°C sont incubées 5 min dans un bain de 4xSSCT.
Une afiquote de pepsine est ajoutée au HCI 0,01 N, à 37°C. Le filtre est incubé pendant quelques min dans la solution de pepsine, en l'agitant toutes les deux minutes.
Une solution de fixation, formaldéhyde de concentration finale 1 %, est préparée de façon extemporanée.
La solution obtenue est stable pendant une journée. Les lames sont lavées dans un bac de PBS1x pendant 5 min sans humidifier le ruban adhésif et sans agitation. Les lames sont ensuite fixées par trempage pendant 2 mn dans la solution de fixation, sans humidifier le ruban adhésif. Les lames sont ensuite déshydratées successivement pendant deux minutes à 70%, 85% et 100% éthanol, sans laisser sécher les lamés entre les alcools. L'envers de la lame est essuyé délicatement, le filtre sèche ensuite quelques minutes, et au maximum pendant une heure, sur une plaque à 37°C, ou bien sèche à température ambiante. C. Dénaturation des lames et hybridation (J1)
Dans l'obscurité, une boîte hermétique est placée sur la platine allumée à 37°C, cette boîte permettra le transport éventuel de la lame. L'appareil permettant l'hybridation, ou « hybridizer », est mis en marche et programmé afin d'obtenir une température à 37°C. Les lames sont insérées, dans leurs places respectives, dans Γ « hybridizer ». Les deux barrettes se trouvant sur le capot sont humidifiées avec de l'eau, puis replacées sur le couvercle de l'hybridizer afin de minimiser l'évaporation de la sonde. La lame est placée sur la platine à 37°C. Sur chaque spot (8 mm de diamètre) sont déposés 10μΙ de mélange d'hybridation sonde ALK (Vysis) (pour chaque spot sont déposés 7μΙ de tampon, 2 μΙ d'eau, 1 μΙ de sonde). Une petite lamelle ronde (12 mm de diamètre) est posée délicatement sur les spots. La zone d'intérêt est scellée avec de la colle placée autour, afin d'isoler entièrement cette zone. Le séchage de la colle est assuré par dépôt de la lame sur la platine à 37°C pendant environ5 min.. La lame est ensuite immédiatement placée dans l'hybridizer afin de ne pas modifier la température de la sonde.
Le programme de dénaturation est démarré à 85°C pendant 0 min, puis l'hybridation a lieu classiquement à 44°C pendant toute une nuit (12 heures) à 44°C. Cette hybridation peut être effectuée dans l'hybridizer ou dans une étuve placée à 44°C. Dans ce dernier cas, après l'étape à 85°C, la lame est très rapidement placée dans la boite déjà à 37°C sur la platine, puis transférée dans la boite noire spéciale humide mise à l'avance dans l'étuve à 44°C.
L'hybridizer, lorsqu'il est refroidi à 37°C, est arrêté. D. Lavage et montage (JZJ
Le bain marie est branché à 65°C et la plaque à 37°C, le tampon Wash Buffer IX Dako est préparé extemporanément. Le tampon est ensuite préchauffé, en plaçant la moitié du tampon dans un bac en porcelaine qui est placé dans le bain-marie à 65°C sans que la température ne soit atteinte (pour éviter les chocs thermiques), la température est atteinte au bout d'environ 30 min.
L'autre moitié du tampon est placé dans un bac à lames, à température ambiante. La lame est extraite de l'hybridizer ou de l'étuve et transportée si nécessaire dans une boite noire spéciale pour protéger la lame de la lumière.
Sans lumière, la colle est enlevée très délicatement avec une pince, sans détériorer le filtre. La lame est lavée pendant environ 7 min dans le tampon Stringent Wash Buffer à température ambiante sans agitation. La lame est lavée 5 min dans le tampon préchauffé à 65°C, puis 5 min dans un tampon de lavage Wash Buffer 1X DAKO à température ambiante.
La lame est déshydratée pendant 2 min avec successivement 70%, 85%
100% éthanol, sans laisser sécher entre les alcools.
Le dos de la lame est essuyé délicatement avéc du papier absorbant, puis laissée sécher pendant quelques minutes sur la plaque à 37°C, en vérifiant qu'il ne reste pas d'alcool entre la lame et le filtre.
En cas de bruit de fond, les lames peuvent être re-lavées à 70°C pendant 1-5 min.
De 15 à 20 μΙ d'une solution « antifFad+DAPI » sont déposés sur le filtre et répartis en plusieurs gouttes sur la surface du filtre.
Les lames sont couvertes par une lamelle de 22x22 ou 24x40, le tout est scellé d'un côté de la lamelle, du côté opposé au spot. La lame est séchée sur la platine chauffante à 37°C pendant environ quelques min.
La lame est transportée dans une boite noire jusqu'au microscope, et observée en utilisant successivement les grossissements x20, pour repérer le spot, puis x100, avec de l'huile à immersion.
La lame peut être conservée dans l'obscurité pendant 1 semaine à température ambiante ou pendant T an à -20°C.
La lecture s'effectue au microscope à fluorescence ou scanner. Les CTC sont relocalisées à partir des positions déjà identifiées lors de l'immunomarquage.
Exemple 4 : Test de détection du gène HER-2par la technique de FISH Ce test est réalisé après le marquage en immunofluorescence.
A. Fixation du matériel
Après l'analyse des résultats en immunofluorescence, le système lame et lamelle est démonté et le filtre est lavé dans une solution de PBS 1X avant d'être fixé avec une solution de méthanol/ acide acétique (9 :1) pendant 2 heures à température ambiante.
B. Traitement du filtre immobilisé sur la lame
Préparation de la pepsine 10% :
Peser ig à dissoudre dans 10 ml H20, sous agitation magnétique, dans un Erlen.Une fois bien dissous, placer l'Erlen dans de la glace.Aliquoter par 100μΙ puis les conserver à -20°C).
Une solution de 80 ml de HCI à 0,01 N (8 ml HCI 0.1 N + 72 ml H2O)est préchauffée dans un bain-marie à 37°C pendant au moins 30 min. Les lames conservées à +4°C sont incubées successivement 5 min dans un bain de 4xSSCT pour décoller la lamelle, si nécessaire la lamelle peut être décollée à l'aide d'une pince, le milieu de montage est éliminé puis le filtre est rincé dans un bain de PBS 1X.
Une aliquote de pepsine est ajoutée au HCI 0,01 N, à 37°C, le tout est soigneusement mélangé. Le filtre est incubé pendant 6 min dans la solution de pepsine, en l'agitant toutes les deux minutes.
Une solution de fixation contenant 1% de formaldéhyde est préparée de façon extemporanée.
Les lames sont lavées dans un bac de PBS1X pendant 5 min sans humidifier le ruban adhésif et sans agitation. Les lames sont ensuite fixées par trempage pendant 2 mn dans la solution de fixation, sans humidifier le ruban adhésif. Les lames sont ensuite déshydratées successivement pendant deux minutes à 70%, 85% et 100% éthanol, sans laisser sécher les lames entre les alcools. L'envers de la lame est essuyé délicatement, le filtre sèche ensuite quelques minutes, et au maximum pendant une heure, sur une plaque à 37°C, ou bien il sèche à température ambiante.
C. Dénaturation des lames et hybridation (J1 )
Dans l'obscurité, une boîte hermétique est placée sur la platine allumée à 37°C, cette boîte permettra le transport éventuel de la lame.
L'appareil permettant l'hybridation, ou « hybridizer » est mis en marche et programmé afin d'obtenir une température à 37°C. Les lames sont insérées, dans leurs places respectives, dans « hybridizer ». Les deux barrettes se trouvant sur le capot sont humidifiées avec de l'eau, puis replacées sur le couvercle de l'hybridizer afin de minimiser l'évaporation de la sonde. La lame est placée sur la platine à 37°C. Sur chaque spot (8 mm de diamètre) sont déposés 6 μΙ de sonde HER-2 (Dako)
Une petite lamelle ronde (12 mm de diamètre) est posée délicatement sur les spots. Les bulles éventuelles sont poussées délicatement en dehors de la surface de la lamelle, par exemple avec un cône. La zone d'intérêt est scellée avec de la colle placée autour, afin désoler entièrement cette zone. Le séchage de la colle est assuré par dépôt de la lame sur la platine à 37°C pendant environô min. La lame est ensuite immédiatement placée dans l'hybridizer afin de né pas modifier la température de la sonde.
- 5
Le programme de dénaturation est démarré à 85°C pendant 10 min, puis l'hybridation a lieu à 44°C pendant toute une nuit (12 heures) à 44°C. Cette hybridation peut être effectuée danS hybridizer ou dans une étuve placée à 44°C. Dans ce dernier cas, après l'étape à 85°C, la lame est très 0 rapidement placée dans la boite déjà à 37°C sur la platine, puis transférée dans la boite noire spéciale humide mise à l'avance dans l'étuve à 44°C. L'hybridizer, lorsqu'il est refroidi à 37°C, est arrêté.
D. Layage et montage (J2)
5
Le bain marie est branché à 65°C et la plaque à 37°C, le tampon Wash Buffer 1X Dako est préparé extemporanément.
Le tampon est ensuite préchauffé, en plaçant la moitié du tampon dans un 0 bac en porcelaine qui est placé dans le bain-marie à 65°C sans que la température ne soit atteinte (pour éviter les chocs thermiques), la température est atteinte au bout d'environ 30 min.
L'autre moitié du tampon est placé dans un bac à lames, à température ambiante. La lame est extraite de l'hybridizer ou de l'étuve et transportée 5 si nécessaire dans une boite noire spéciale pour protéger la lame de la lumière.
Sans lumière, la colle est enlevée très délicatement avec une pince, sans détériorer le filtre. La lame est lavée pendant environ 7 min dans le tampon Stringent Wash Buffer à température ambiante sans agitation. La lame est 0 lavée 5 min la lame dans le- tampon préchauffé à 65°C, puis 5 min dans un tampon de lavage Wash Buffer 1X DAKO à température ambiante.
La lame est déshydratée pendant 2 min avec successivement 70%, 85% 00% éthanol, sans laisser sécher entre les alcools. Le dos de la lame est essuyé délicatement avec du papier absorbant, puis laissée sécher pendant quelques minutes sur la plaque à 37°C, en vérifiant qu'il ne reste pas d'alcool entre la lame et le filtre.
En cas de bruit de fond, lés -lamés peuvent être ré-lavées à 70°C pendant 1 -5 min.
Selon la surface de la lamelle, 10 à 15 iL de la solution « antifFad+DAPI » sont déposés sur le filtre et répartis en . plusieurs gouttes sur la surface du filtre.
Les lames sont couvertes par une lamelle de 22x22 ou 24x40, le tout est scellé d'un côté de la lamelle. La lame est séchée sur. la platine chauffante à 37°C pendant environ 5 min.
La lame est transportée dans une boite noire jusqu'au microscope, et observée en utilisant successivement les grossissements x20, pour repérer le spot, puis x100, avec de l'huile à immersion.
La lame peut être conservée dans l'obscurité pendant 1 semaine à température ambiante ou pendant 1 an à -20°C.
La lecture s'effectue au microscope â fluorescence ou scanner. Les CTC sont relocalisées à partir des positions déjà identifiées lors de l'immunomarquage.
Exemple 5 : Test de détection du gène c-MET par la technique de FISH
La technique de FISH est mise en œuvre de la même façon que décrit dans l'exemple 4, en utilisant une sonde spécifique de c-MET.
Exemple 6 : Test de détection du gène de fusion Erg par la technique de FISH
.
La technique de FISH est mise en œuvre de la même façon que décrit dans l'exemple 4, en utilisant une sonde spécifique de Erg.
Références A Lecharpentier et al., "Détection of circulating tumour cells with a hybrid (epithelial/mesenchymal) phenotype in patients with metastatic non-small cell lung cancer » British Journal of Cancer, 2011 , 1-4.

Claims

Revendications
1. Méthode d'identification, dans un échantillon biologique, notamment dans un échantillon sanguin, de cellules tumorales circulantes (CTC) porteuses du gène de fusion EML4-ALK, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
2. Méthode d'identification, selon la revendication 1 , dans laquelle les cellules tumorales circulantes (CTC) sont d'origine épithéliale et mésenchymateuse.
3. Méthode d'identification, selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle les cellules provenant de l'échantillon biologique servant à l'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC et à la détection du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK, sont isolées selon leur taille qui varie de 8 pm à au moins 40 pm.
4. Méthode d'identification, selon l'une des revendications 1 à 3, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. Identification, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, d'au moins un signal témoin de la présence de CTC, notamment du signal caractérisant la présence d'un marqueur tumoral à l'exception de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, b. Détection, sur un support comprenant les cellules provenant de l'échantillon biologique, à l'aide d'une technique de type FISH utilisant des sondes spécifiques de remaniement ou d'amplification, du signal associé à la présence du gène de fusion EML4-ALK, c. Comparaison de la localisation sur le support des signaux obtenus dans les étapes a et b et identification des CTC.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, comportant une étape d'enrichissement de l'échantillon biologique en CTC, préalable ou inhérente aux étapes d'identification des différents signaux, le facteur d'enrichissement des cellules en CTC étant compris d'environ 1/100 à environ 1/100.000.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle le dépôt des cellules provenant de l'échantillon biologique du patient est réalisé sur un support approprié pouvant être analysé à l'aide d'un appareil de type microscope à fluorescence ou scanner, ledit support pouvant être un filtre ou une lame.
7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle les cellules sont recueillies sur le support par filtration ou déposées sur le support après immuno-séparation magnétique.
8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3 et 5 à 7, dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvré au moins un marqueur choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire, iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
9. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre de façon combinée au moins deux marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
10. Méthode selon l'une des revendications 8 ou 9, dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée au moins trois marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK,
11. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire,
iii. un marqueur de cellules hématopoïétiques,
iv. un marqueur de protéines choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
11 , Méthode selon l'une des revendications 8 à 10, dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC met en œuvre de façon combinée quatre marqueurs, chacun étant choisi dans l'un des groupes constitué par :
i. un marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, ii. un marqueur de membrane nucléaire ou un marqueur nucléaire, iii. un marqueur de cellules hématopo'iëtiques,
iv. un marqueur de protéines choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules épithéliales et les marqueurs de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses.
12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3 et 5 à 11 , dans laquelle le marqueur spécifique de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK sont les clones 5A4 ou D5F3.
13. Méthode selon l'une des revendications 8 à 12, dans laquelle le marqueur de membrane nucléaire utilisé est le marqueur Emerin.
14. Méthode selon l'une des revendications 8 à 13, dans laquelle le marqueur nucléaire utilisé est choisi dans le groupe constitué par : le marqueur DAPI, les marqueurs Syto59, Sytox Orange, TOPRO 3, Hoescht 33342.
15. Méthode selon l'une des revendications 8 à 14, dans laquelle le marqueur de cellules hématopoiétiques est choisi dans le groupe constitué par : CD45 et CD31.
16. Méthode selon l'une des revendications 8 à 15, dans laquelle le marqueur de protéines caractéristiques des cellules épithéliales est choisi dans le groupe constitué par : les marqueurs de EpCAM, les marqueurs de pan-cytokératines, les marqueurs de la cadhérine épithéliale.
17. Méthode selon l'une des revendications 8 à 16, dans laquelle le marqueur de protéines caractéristiques des cellules mésenchymateuses est choisi dans le group constitué par : les marqueurs de la vimentine et les marqueurs de la cadhérine neurale.
18. Méthode selon l'une des revendications 8 à 17, dans laquelle l'étape d'identification d'au moins un signal témoin de la présence de CTC est réalisée au moyen d'un immunomarquage en fluorescence mettant en œuvre : i. le marqueur de la protéine codée par le gène de fusion EML4-ALK, ii. le marqueur nucléaire DAPI,
iii. le marqueur de cellules hématopoïétiques CD45,
iv. un marqueur de pan-cytokératines.
'
19. Méthode selon l'une des revendications 1 à 18, dans laquelle la méthode de type FISH comprend les étapes successives suivantes :
- traitement enzymatique du support après fixation,
- hybridation sur le support en présence d'au moins une sonde,
- localisation de la sonde hybridée sur le support.
20. Méthode selon l'une des revendications 1 à 19, dans laquelle l'échantillon biologique provenant d'un patient est du sang.
21. Utilisation d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 20, pour analyser un échantillon biologique, et notamment un échantillon sanguin, provenant d'un patient atteint de cancer présentant le gène ALK transloqué, pour la prédiction d'un événement de type métastatique.
22. Utilisation selon la revendication 21 , dans laquelle le patient est atteint d'un cancer susceptible de conduire à la présence de métastases, notamment le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer de la prostate, le cancer du sein.
EP12813392.3A 2011-11-17 2012-11-19 Méthode de caractérisât] on de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic Withdrawn EP2780712A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/FR2011/052689 WO2013072572A1 (fr) 2011-11-17 2011-11-17 Méthode de caractérisation de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic
PCT/FR2012/000471 WO2013072585A1 (fr) 2011-11-17 2012-11-19 Méthode de caractérisât! on de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2780712A1 true EP2780712A1 (fr) 2014-09-24

Family

ID=47553234

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP12813392.3A Withdrawn EP2780712A1 (fr) 2011-11-17 2012-11-19 Méthode de caractérisât] on de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20150133323A1 (fr)
EP (1) EP2780712A1 (fr)
WO (2) WO2013072572A1 (fr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031993B (zh) * 2014-05-27 2016-06-29 益善生物技术股份有限公司 循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法
CN108918398A (zh) * 2018-05-18 2018-11-30 宁波永新光学股份有限公司 一种循环肿瘤细胞检测方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090004661A1 (en) * 2003-05-26 2009-01-01 Reliance Life Sciences Pvt Ltd. Method of growing mesenchymal stem cells from bone marrow
US8168383B2 (en) * 2006-04-14 2012-05-01 Cell Signaling Technology, Inc. Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors
US20080113350A1 (en) * 2006-11-09 2008-05-15 Terstappen Leon W M M Blood test to monitor the genetic changes of progressive cancer using immunomagnetic enrichment and fluorescence in situ hybridization (FISH)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2013072585A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20150133323A1 (en) 2015-05-14
WO2013072572A1 (fr) 2013-05-23
WO2013072585A1 (fr) 2013-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2780713A2 (fr) Méthode de caractérisation de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic
Jansen et al. SARS-CoV-2 infects the human kidney and drives fibrosis in kidney organoids
He et al. Single-cell RNA sequencing reveals the mesangial identity and species diversity of glomerular cell transcriptomes
Gerrits et al. Neurovascular dysfunction in GRN-associated frontotemporal dementia identified by single-nucleus RNA sequencing of human cerebral cortex
Shinde et al. Transglutaminase-2 facilitates extracellular vesicle-mediated establishment of the metastatic niche
Carolan et al. Up-regulation of expression of the ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 gene in human airway epithelium of cigarette smokers
Torlakovic et al. Sessile serrated adenoma (SSA) vs. traditional serrated adenoma (TSA)
Peuhu et al. SHARPIN regulates collagen architecture and ductal outgrowth in the developing mouse mammary gland
CA2810959A1 (fr) Test pronostic de l'evolution d'une tumeur solide par analyse d'images
Broughton et al. Cardiac interstitial tetraploid cells can escape replicative senescence in rodents but not large mammals
EP2780712A1 (fr) Méthode de caractérisât] on de cellules tumorales circulantes et application au diagnostic
JP2015190922A (ja) 細胞分析方法
Djordjevic et al. Expression of c-kit in fibroepithelial lesions of the breast is a mast cell phenomenon
Godin et al. A fraction of neurofibromin interacts with PML bodies in the nucleus of the CCF astrocytoma cell line
Gromova et al. ENDOGLIN/CD105 is expressed in KIT positive cells in the gut and in gastrointestinal stromal tumours
Cai et al. Single‐cell transcriptome analysis reveals tumoral microenvironment heterogenicity and hypervascularization in human carotid body tumor
EP3873204A1 (fr) Modele animal pour amplifier des cellules tumorales circulantes humaines ou animales
EP3384290B1 (fr) Methode de detection de cellules souches cancereuses
WO2003004700A1 (fr) Procede et systeme de detection de desequilibre inter-chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (fish) sur des noyaux cellulaires en interphase
Gyarmati et al. Physiological activation of the nephron central command drives endogenous kidney tissue regeneration
FR3016638A1 (fr) Nouvelle methode de depistage du cancer de la prostate
Yamazaki et al. Development of collagen fibres and lysyl oxidase expression in the presumptive dermis of chick limb bud
EP3877545A1 (fr) Methode de diagnostic d'un cancer et kit associe
EP2449377B1 (fr) Méthode de détection de cellules tumorales par signal de fluorescence
Morimura et al. Characterization of p16-positive stromal cells in age-related cardiac disorders

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20140517

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN

18W Application withdrawn

Effective date: 20151130