EP2670423A2 - Utilisation du recepteur sigma-1 pour reguler l'expression des canaux ioniques au niveau posttranscriptionnel - Google Patents
Utilisation du recepteur sigma-1 pour reguler l'expression des canaux ioniques au niveau posttranscriptionnelInfo
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- EP2670423A2 EP2670423A2 EP12707835.0A EP12707835A EP2670423A2 EP 2670423 A2 EP2670423 A2 EP 2670423A2 EP 12707835 A EP12707835 A EP 12707835A EP 2670423 A2 EP2670423 A2 EP 2670423A2
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Description
UTILISATION DU RECEPTEUR SIGMA-1 POUR REGULER L'EXPRESSION DES CANAUX IONIQUES AU NIVEAU POST-
TRANSCRIPTIONNEL DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à l'utilisation du récepteur Sigma-1 (SigI R) pour réguler l'expression des canaux ioniques au niveau post- transcriptionnel.
Ainsi une extinction de SigI R dans les cellules induit une réduction de la densité de courant engendré par les canaux ioniques, corrélée à la baisse du taux d'expression de SigI R, ainsi qu'une diminution de l'adhésion spécifique à la fibronectine (FN). A contrario, la co-expression de hERG et SigI R provoque une potentialisation du courant et du taux de protéine exprimée.
La présente invention trouve une application dans la fabrication d'un médicament destiné au traitement de maladies impliquant les canaux ioniques. Il s'agit par exemple des maladies du système nerveux telles que par exemple l'épilepsie, des maladies neurodégénératives telles que par exemple la maladie d'Alzheimer, des maladies cardiaques, et du cancer.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique
Les canaux ioniques sont des protéines insérées dans les membranes des cellules de tous les êtres vivants. Ces canaux permettent aux ions (potassium, sodium, calcium et chlore) de traverser la membrane. Ce passage crée un courant électrique dont les fonctions sont fondamentales : message nerveux, contraction musculaire et cardiaque, sécrétion des hormones, composition des fluides corporels. Depuis peu,
ces canaux ont également été impliqués dans la prolifération tumorale et l'agressivité métastatique. En effet, l'expression aberrante de canaux de nature différente a été observée dans de nombreux cancers primaires de l'homme, et est fréquemment corrélée à l'agressivité de la tumeur. En règle générale, les canaux ioniques exercent des effets pléïotropes sur la physiologie des cellules néoplasiques. Par exemple, en régulant le potentiel de membrane, les canaux contrôlent le flux de Ca2+ intracellulaire et en conséquence le cycle cellulaire. Leurs effets sur la mitose peuvent également dépendre de la régulation du volume cellulaire, le plus souvent en coopération avec les canaux chlorure. Les canaux ioniques sont également impliqués dans les étapes néoplasiques ultimes, la stimulation de l'angiogenèse, l'interaction cellule/matrice extracellulaire ou la régulation de la motilité cellulaire. Ainsi la contribution des canaux ioniques dans le phénotype néoplasique s'étend du contrôle de la prolifération cellulaire et de l'apoptose, à la régulation de l'invasion et de la propagation métastatique. Toutefois si leur implication est de plus en plus démontrée, la régulation et les mécanismes moléculaires associés aux canaux ioniques dans un contexte tumoral restent à préciser. Les mécanismes régissant les effets des canaux ioniques sont multiples et font intervenir une cascade de voies de signalisation intracellulaire généralement déclenchée après formation de complexes protéiques avec d'autres protéines membranaires tels que les intégrines ou les récepteurs de facteur de croissance. Enfin, dans un contexte tumoral, les canaux ioniques sont généralement détournés de leur fonction première pour participer au phénotype tumoral. Ainsi, une meilleure connaissance de leur profil d'expression, de leurs partenaires, de la relation structure/fonction des complexes canalaires ouvrirait potentiellement la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées. En effet certaines molécules chimiques sont capables de bloquer directement ces canaux et de ralentir la croissance des tumeurs cancéreuses in vitro. Cependant l'utilisation de ces molécules chez des patients est dangereuse dans la mesure où les canaux
des tumeurs sont les mêmes que ceux retrouvés dans le tissu sain (les muscles ou le cerveau...)
Il existe donc un réel besoin de composés pharmacologiques palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier de composés capables de cibler les canaux ioniques dans les cancers sans altérer les fonctions des organes sains, de réduire les coûts et d'améliorer ainsi les thérapies anticancéreuses.
Le récepteur Sigma-1 (Sig1 R) est une protéine ubiquitaire ancrée à la membrane cellulaire. Cette protéine est surexprimée dans les cellules tumorales au point d'être proposée comme marqueur biologique de tumeur en imagerie cellulaire [1 ], impliquée dans la prolifération cellulaire [2]. Son aspect le mieux décrit est la modulation des canaux ioniques bien que son mode d'action reste inconnu. L'activation du SigI R par des ligands exogènes spécifiques change les propriétés électriques de la membrane, conséquence de la modification de la cinétique d'activation/inactivation des canaux chlorures et des canaux potassiques voltage-dépendants (M, lA, Kv1 .5) [5-7]. Récemment, il a été montré que SigI R contrôle différentes familles de canaux ioniques dont les canaux potassiques voltage- dépendants (Kv1 .3) et les canaux VRCC (Volume Regulated Chloride Channel). De plus, les interactions Sig1 R-Kv1 .3 ou Sig1 R-VRCC participent à plusieurs événements cellulaires : le cycle cellulaire, la résistance à l'apoptose [8,9] mais pas à l'interaction avec la matrice extracellulaire et la formation des métastases comme c'est le cas par exemple pour le canal ERG (canal éther-à-go-go). De plus les canaux modulés par SigI R dans ces études sont exprimés à la fois dans le tissu sain et dans le tissu tumoral, alors que hERG est absent du tissu sain et se présente donc comme un marqueur de nombreuses tumeurs.
Le canal hERG est un canal cardiaque K+ voltage-dépendant dont la fonction primordiale est de réguler le temps qui sépare deux battements successifs, et dont l'expression aberrante a été caractérisée dans de nombreux cancers incluant les cancers du sein, du colon, les
neuroblastomes et les leucémies myéloïdes [10]. L'expression de hERG est corrélée au potentiel invasif des cellules, et l'étude des mécanismes mis en jeu démontre une voie de signalisation atypique : la stimulation des intégrines par la matrice extracellulaire (MEC) active hERG, étape nécessaire au recrutement de Rac1 , des FAK et de l'association avec le récepteur au VEGF FLT-1 . Le macrocomplexe canalaire ainsi formé potentialise la migration, l'invasion et l'angiogenèse [10].
Par conséquent il n'existe pas actuellement d'outil thérapeutique ciblant spécifiquement ces macrocomplexes canalaires SigI R/canal ionique permettant d'inhiber la prolifération cellulaire, en limitant les effets secondaires résultant de l'utilisation de molécules ayant une action non- ciblée.
Description de l'invention
Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence de manière tout à fait inattendue qu'il est possible de réguler au niveau post-transcriptionnel les canaux ioniques, par exemple le canal ionique hERG (human Ether-a-go- go Related Gene), par le récepteur Sigma-1 (SigI R), dans un modèle de cellules leucémiques myéloïdes chroniques : les cellules K562 qui expriment un seul type d'intégrine, Γα5β1 , récepteur de la fibronectine (FN) et le canal hERG. Un résultat analogue a été obtenu dans une autre lignée cellulaire : les cellules de cancer du sein MDA-MD-435s. Cette régulation est réalisée à travers une interaction fonctionnelle entre les deux protéines. Ainsi Sig1 R permet de moduler la maturation et la stabilité membranaire de hERG sans modifier les propriétés cinétiques dudit canal.
En outre, les Inventeurs ont mis en évidence que le récepteur sigma-1 fait partie intégrante des voies de signalisation régulant l'adhésion des cellules à la matrice extracellulaire. En effet l'extinction de SigI R dans les cellules K562 provoque la diminution de l'adhésion spécifique à la fibronectine (FN). Les conséquences de ces observations sont, qu'en ciblant SigI R, il est possible d'agir sur le programme de tumorisation en
interférant dans les voies de signalisation cellulaires assignées aux canaux ioniques.
De même, ce mécanisme de régulation peut être transposé au système nerveux ou cardiaque, où SigI R est présent, pour permettre le réexamen de certaines pathologies impliquant les canaux ioniques, en dehors de tout contexte tumoral.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un modulateur des macrocomplexes canalaires comprenant ou constitués de SigI R et de canaux ioniques pour l'obtention d'un médicament destiné à la régulation post-transcriptionnelle de l'expression membranaire des canaux ioniques pour le traitement de maladies impliquant lesdits canaux ioniques.
La présente invention a donc pour objet un ligand modulateur de l'interaction entre SigI R et un canal ionique pour son utilisation comme médicament destiné à la régulation post-transcriptionnelle de l'expression membranaire dudit canal ionique ; soit pour le traitement de maladies impliquant lesdits canaux ioniques.
L'invention a donc pour objet un ligand modulateur du nombre de canaux ioniques associés à la membrane pour son utilisation comme médicament destiné à la régulation post-transcriptionnelle de l'expression membranaire dudit canal ionique ; soit pour le traitement de maladies impliquant lesdits canaux ioniques.
On entend par « ligand modulateur » au sens de la présente invention, toute molécule capable de moduler l'activité et/ou l'expression de SigI R et/ou du canal ionique. Par exemple, il s'agit d'un ligand de SigI R capable de moduler la maturation et la stabilité membranaire dudit canal ionique sans en modifier les propriétés cinétiques.
On entend par « médicament » au sens de la présente invention, tout outil ou moyen thérapeutique connu de l'homme du métier (par exemple substance ou composition) présenté comme possédant des propriétés curatives et/ou préventives à l'égard de maladies humaines ou animales, ainsi que tout produit pouvant être administré à l'homme ou à l'animal, en
vue d'établir un diagnostic médical et/ou de restaurer, corriger et/ou modifier leurs fonctions organiques.
On entend par « maladies impliquant les canaux ioniques » au sens de la présente invention, les maladies du système nerveux telles que par exemple l'épilepsie, les maladies neurodégénératives telles que par exemple la maladie d'Alzheimer, les maladies cardiaques telles que par exemple le syndrome de QT long, et le cancer.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit médicament est destiné au traitement du cancer.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit médicament inhibe l'expression membranaire des canaux ioniques, de préférence des canaux ioniques potassiques (K+), préférentiellement des canaux appartenant à la famille « éther-à-go-go related gene » (ERG).
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
La figure 1 représente la caractérisation des courants hERG dans les cellules K562. (A), Courants de queue enregistrés à -120mV suite à une préimpulsion à +40mV (Epp) pour activer pleinement les canaux hERG, en l'absence (control) ou présence de E-4031 (1 μΜ). (B), Détail des courants de queue présenté en (A). (C), Familles de courants de queue enregistrés suite à des préimpulsions de -70 à 40mV, en l'absence (control) ou présence de E-4031 (1 μΜ). Le graphique du bas représente la soustraction graphique des deux graphiques précédents (control et (+) E- 4031 . (D), Courbes l/V (courant/voltage) correspondantes aux tracés montrés en C. Les Amplitudes de courant de queue sont tracées en fonction du potentiel de préimpulsion (Epp).
- La figure 2 représente la diminution du courant hERG par les ligands sigma dans les cellules K562. (A), Evolution temporelle du courant
hERG enregistré à -120mV après une préimpulsion de 40mV dans deux cellules distinctes. Igmésine (Igm, gauche, 10μΜ) ou (+)pentazocine ((+)Ptz, droite, 10μΜ) appliquées dans le milieu extracellulaire pendant le laps de temps représenté par la barre noire. (B), Familles de courants hERG enregistrés à -120mV après des préimpulsions de -70 à 40mV dans une seule cellule en l'absence (gauche, contrôle) ou présence d'igmésine (10μΜ, droite, Igm). (C), Courbes l/V correspondantes. Les amplitudes de courant de queue sont représentées comme une fonction du potentiel de préimpulsion (Epp) (D), Courbe de désactivation du courant hERG à -120mV en l'absence (barres blanches) ou présence d'igmésine (10μΜ, barres noires). La courbe de désactivation a été ajustée à l'aide d'une fonction double exponentielle. Les valeurs représentent la moyenne ± erreur standard. Comparaison des moyennes effectuées à l'aide du test t de Student.
- La figure 3 représente l'extinction de SigI R dans les cellules
K562 et MDA-MB-435. (A), Western blots de cellules K562 transduites avec un shRNA aléatoire (shRD) ou un shRNA dirigé contre SigI R (shSigI R), et révélés avec des anticorps anti-actine (ligne supérieure) ou anti-Sig1 R (ligne inférieure). (B), Western blots de cellules MDA-MB-435 transduites avec un shRNA aléatoire (shRD) ou un shRNA dirigé contre SigI R (shSigI R), et révélés avec des anticorps anti-actine (ligne supérieure) ou anti-Sig1 R (ligne inférieure).
La figure 4 représente la réduction de la densité du courant hERG dans les cellules K562 par l'extinction de SigI R. (A), Familles de courants hERG enregistrés en réponse au protocole décrit en 1 C. Les traces ont été obtenues à partir des cellules K562 exprimant un shRNA aléatoire (K562 shRD, supérieur) ou un shRNA dirigé contre le SigI R (K562 shSigI R, inférieur). (B), Moyenne des courbes l/V correspondantes aux tracés des cellules K562 shRD (carrés noirs) et K562 shSigl R (cercles noirs). (C), Histogramme montrant la moyenne des amplitudes de courant dans les cellules K562 shRD et K562 shSigI R. (D) Courbe d'activation
déduites de C. (E), Vitesse de désactivation du courant de hERG à -120mV dans les cellules K562 shRD (barres blanches) et K562 shSirI R (barres noires). La courbe de désactivation a été ajustée à l'aide d'une fonction double exponentielle. Les valeurs représentent la moyenne ± erreur standard, test t de Student.
La figure 5 représente l'altération de l'expression protéique de hERG dans les cellules K562 par l'extinction de SigI R. (A), Quantité d'ARNm du gène hERG exprimé dans ces cellules transduites avec un shRNA non-ciblé (shRD) et transduites avec un shRNA anti-Sig1 R (shSigI R). NS, signifie non significatif (test t de Student). (B), Western blots révélés avec des anticorps anti-hERG (pavé supérieur) ou anti- tubuline (pavé inférieur), réalisés dans les cellules K562 shRD et K562 shSigI R. (C), Histogramme de l'analyse densitométrique des isoformes matures et immatures de hERG dans les cellules K562 shSigI R (barres noires) par rapport aux cellules K562 shRD (barres blanches). Les valeurs correspondent au rapport densitométrique hERG/tubuline. (D), Efficacité du trafic intracellulaire de hERGI b dans les cellules K562 shRD et shSigl R (barres noires). L'efficacité du trafic est calculée comme le rapport densitométrique (mature)/(mature+immature). *p<0,05 (test t de Student).
- La figure 6 représente la stimulation des courants hERG dans les ovocytes de Xénope par l'expression de SigI R. (A), Famille de courants de queue dans des ovocytes non injectés (NI), injectés avec l'ARNc de hERG, et injectés avec les ARNc de hERG et SigI R. Le protocole de tension est décrit en 1 C. (B), Amplitudes relatives de courant à -120mV dans des ovocytes non injectés (NI), injectés avec l'ARN de hERG, et injectés avec les ARNc de hERG et SigI R (unités arbitraires, 1 correspondant au courant moyen enregistré dans les ovocytes injectés avec l'ARNc de hERG). Les valeurs représentent la moyenne ± erreur standard de n expériences indépendantes comme indiqué dans le graphe. (C), Courbes d'activation des canaux hERG enregistrés dans des ovocytes injectés avec l'ARNc de hERG (carrés noirs) et injectés avec les ARNc de
hERG et SigI R (cercles noirs). Les valeurs représentent la moyenne ± erreur standard de 6 expérimentations indépendantes (n=6). (D), Courbes d'inactivation des canaux hERG enregistrés dans des ovocytes injectés avec l'ARNc de hERG (carrés noirs) et injectés avec les ARNc de hERG et SigI R (cercles noirs). Les valeurs représentent la moyenne ± erreur standard de 8 expériences indépendantes (n=8).
La figure 7 représente la modulation de l'expression de hERG par SigI R via une interaction directe. (A), Western blots révélés avec un anticorps anti-Sig1 R dans : des ovocytes non injectés (NI), injectés avec l'ARNc de hERGI a, et injectés avec les ARNc de hERGI a et SigI R (pavé supérieur) et dans : des ovocytes non injectés (NI), injectés avec l'ARNc de hERGI b, et injectés avec les ARNc de hERGI b et SigI R (pavé inférieur). Les ARNc de hERGI a, hERGI b et SigI R ont été injectés aux concentrations de 25pg, 75pg et 5ng/ovocyte, respectivement. (B), Une immunoprécipitation de protéines de lysat d'ovocyte a été réalisée avec un anticorps anti-Myc dans des ovocytes non injectés (NI), injectés avec l'ARN de hERGI a, et injectés avec les ARNs de hERGI a et SigI R. Les immunocomplexes ont été révélés avec des anticorps anti-hERG (panneau supérieur) ou anti-Sig1 R (panneau inférieur). Les ARNc de hERGI a et Sig1 R ont été injectés à une concentration de 15ng/ovocyte.
La figure 8 représente l'inhibition de l'adhésion des cellules K562 à la FN par l'igmésine, le E-4031 et l'extinction de SigI R. (A), Histogramme représentant le pourcentage d'adhésion à la fibronectine (FN) des cellules K562 traitées au E-4031 (10μΜ), E4031 +igmésine (10μΜ chacun) ou d'igmésine seule (10μΜ) par rapport aux conditions
« contrôle » (ctl, 100%). Les valeurs représentent la moyenne ± erreur standard de 6 à 9 expériences indépendantes. NS : non significatif (test t de Student). (B), Pourcentage d'adhésion à la FN des cellules K562 shRD (barres blanches) et K562 shSigI R (barres noires). Les valeurs représentent la moyenne ± erreur standard de 12 expériences
indépendantes. ***p<0,001 (test t de Student). Dans une expérience, chaque valeur est la moyenne de trois puits distincts.
La figure 9 représente l'expression de hERG à la surface de la membrane plasmique révélée par cytométrie de flux dans les cellules ShRD et ShSigI R (anticorps anti-hERG dirigé contre une boucle extracellulaire du canal). Panneau de droite : histogramme correspondant.
*p<0,02, Mann-Whitney.
La figure 10 représente l'amélioration de la maturation et de la stabilité de hERG par SigI R (A), cellules transduites avec hERG + cmyc- GFP (groupe témoin) ou hERG + cmycSigI R incubées 10 min avec de la méthionine 35S, et lavées en milieu sans radioactivité. A différents temps, des lysats cellulaires de HEK 2963 ont été préparés et la protéine hERG a été immunoprécipitée. Son profil de maturation a été analysé par Western blot. (B), cellules incubées pendant 1 heure et analysées sur une période de 8 heures. hERG a été immunoprécipitée et la forme mature a été révélée par Western blot.
La figure 1 1 représente le pouvoir invasif de cellules K562
ShRD « contrôle » (panneau gauche) et invalidées pour SigI R
« shSigI R » (panneau droite) à partir d'injections dans la vésicule vitelline d'embryons de poissons zèbres. Les cellules ont été marquées en rouge avec un marqueur fluorescent (CM-DIL, cf. flèches et têtes de flèche).
L'histogramme représente le pourcentage d'embryons avec plus de 3 cellules à l'extérieur de la vésicule vitelline après 48 heures.
EXEMPLES
Exemple 1 : Les ligands Sigma inhibent le courant h ERG dans les cellules K562
Des expériences d'électrophysiologie dites de patch-clamp ont été réalisées dans la configuration cellule entière (whole cell). La solution saline extracellulaire baignant les cellules contient une concentration élevée en potassium pour améliorer l'amplitude du courant entrant de potassium à -120mV. Les courants hERG ont été analysés en tant que courants de queue à -120mV suscités suite à des préimpulsions de -70 à 40mV. Ce protocole permet l'enregistrement de courants entrants transitoires dont l'amplitude est corrélée à la dépolarisation impliquée lors des préimpulsions. Ces courants ont été totalement supprimés par la perfusion de l'inhibiteur E-4031 spécifique de hERG (1 μΜ) [1 1] (figure 1 A,B). En outre, la soustraction graphique a révélé que E-4031 inhibe une conductance voltage dépendant (figure 1 C, D). En conclusion, ces données ont confirmé la présence de canaux hERG fonctionnels dans la lignée cellulaire K562 [12].
Afin de vérifier une potentielle interaction entre SigI R et hERG, les effets de ligands sélectifs de SigI R, i.e. igmésine et (+)pentazocine [7, 9, 13, 14] ont été analysés sur le courant. Les applications extracellulaires de l'igmésine ou de la (+)pentazocine ont inhibé de manière réversible les courants. Le courant a été réduit par 40,85±2,83% (n=10) et 21 ,19±1 ,77% (n=3) pour l'igmésine et la (+)pentazocine, respectivement (10μΜ chacun). L'inhibition maximale s'est produite dans les 3 minutes qui ont suivi le début des applications des drogues (figure 2A). Les effets de l'igmésine (10μΜ) ont ensuite été étudiés sur des courbes l/V enregistrées de -70 à 40mV. L'igmésine (10μΜ) a entraîné une réduction spectaculaire de l'amplitude du courant maximal (figure 2 B, C) suggérant que la drogue a principalement affecté la densité de courant. Néanmoins, le traitement des courbes selon une fonction de Boltzmann a révélé un déplacement
apparent de 10mV vers la gauche de la valeur du voltage de demi- activation (figure 2B, tableau 1 ).
Tableau 1
Cependant, l'igmésine n'a changé ni les composants de désactivation rapide ou lente du courant de queue hERG enregistré à -120mV (figure 2D). Ces résultats ont indiqué pour la première fois que SigI R module les canaux hERG. Cette inhibition des courants hERG par les agonistes des récepteurs sigma n'est pas due à une modification des caractéristiques électriques des canaux mais est le résultat d'une baisse du nombre de canaux actifs à la membrane cellulaire.
Exemple 2 : L'extinction de SigI R diminue la densité de courant hERG dans les cellules K562
Les effets de l'extinction de SigI R ont été étudiés sur l'activité hERG des cellules K562. Les cellules K562 ont été transduites avec un rétrovirus contenant soit un shRNA (ARN court en épingle à cheveux) aléatoire ou un shRNA dirigé contre SigI R, donnant lieu à deux populations cellulaires nommées respectivement shRD et shSigI R. Les expériences de Western blot ont révélé une diminution spectaculaire de l'expression de SigI R dans la lignée cellulaire shSigI R (figure 3, gauche). Le même résultat a été
obtenu dans les cellules MDA-MB-435s exprimant le même shRD et shSigI R (figure 3, droite) démontrant l'efficacité et la spécificité du shRNA dirigé par Sig1 R utilisé ici.
Les expériences de patch-clamp ont alors été réalisées dans les lignées cellulaires K562 shRD et shSigI R afin d'analyser les éventuelles conséquences de l'extinction de SigI R sur les propriétés de hERG. De manière intéressante, les familles de courant de queue enregistrées à -120mV dans shSigI R ont été clairement plus petites en amplitude que celles dans les cellules shRD (figure 4A). Cette diminution de l'amplitude du courant a été observée pour des potentiels d'activation compris entre -20 et +60mV (figure 4B). A +40mV, la densité de courant a été réduite de 44% (figure 4C). Il est à noter que l'extinction de SigI R n'a pas déplacé la courbe d'activation (figure 4D, tableau 1 ). De la même manière, aucune différence significative n'a pu être observée pour des constantes de temps de désactivation rapides et lentes dans les deux populations cellulaires (figure 4E). En conclusion ces données ont suggéré que l'extinction de SigI R réduit la densité de courant sans altérer les paramètres cinétiques de hERG dans les cellules K562. Là encore, la baisse est le reflet d'une diminution du nombre de canaux actifs à la membrane cellulaire.
Exemple 3 : L'extinction de SigI R module l'expression de hERG dans les cellules K562
Afin de mieux comprendre le lien entre l'expression de SigI R et les courants hERG, l'expression de hERG a été analysée dans les deux lignées cellulaires, en utilisant la PCR en temps réel et l'analyse par
Western blot. Les niveaux en ARNm de hERG n'ont pas été significativement différents dans les lignes cellulaires shRD et shSigI R, excluant toute modulation Sig1 R-dépendante de la transcription de hERG qui pourrait expliquer la diminution observée de la densité de courant (figure 5A). Au niveau protéique, les Western blots utilisant un anticorps anti-pan-hERG ont révélé que les cellules K562 expriment deux isoformes
différentes de hERG, i.e. hERGI a, correspondant à la protéine complète, et le variant d'épissage hERGI b présentant une extrémité N-terminale tronquée [15]. La bande à 155kDa représentant la forme pleinement glycosylée (hERGI a mature), a été régulièrement détectée alors que la forme immature, (partiellement glycosylée), de 135kDa, de hERGI a a été rarement visible (figure 5B, gauche). Cependant, dans certaines expériences, la forme immature de 135kDa a pu être clairement observée (non représenté). En revanche, l'isoforme épissée hERGI b est constamment apparue sous la forme de deux bandes distinctes, la forme mature, pleinement glycosylée de 95kDa et la forme immature, à 80kDa (figure 5B, gauche). Les deux glycoformes matures de hERG sont connues pour représenter la fraction de sous-unité de canal qui est localisée à la membrane plasmique après avoir quitté le réticulum endoplasmique (ER) pour être maturée à travers l'appareil de Golgi et atteindre la surface cellulaire. De manière intéressante, l'extinction de SigI R a altéré le profil d'expression de hERG : dans les cellules shSigI R, une diminution de la quantité des deux formes matures hERGI a et hERGI b a pu être observée. Cela a été accompagné par une augmentation dans la forme immature hERGI b (figure 5 B,C). Dans les expériences pour lesquelles la forme immature hERGI a de 135kDa a été clairement détectée, son niveau d'expression a également été augmenté dans les cellules shSigI R par rapport aux cellules shRD (non représenté). La quantification du rapport hERGI b mature/h ERG 1 b total a démontré que l'extinction de SigI R a significativement réduit la maturation de hERGI b, [16] (figure 5A). En conclusion, ces résultats ont démontré pour la première fois que SigI R altère la régulation post-transcriptionnelle du canal hERG. L'extinction de SigI R induit une diminution de la forme mature de hERGI a (150 kDa) ainsi qu'une accumulation de la forme immature du variant d'épissage hERGI b (80 kDa) indiquant une baisse d'efficacité du trafic de la protéine. Ces profils d'expression sont parfaitement en accord avec la diminution du courant observée.
Exemple 4 : L'expression de SigI R potentialise la densité de courant de hERG dans les ovocytes de Xénope
Afin de confirmer la fonction atypique de SigI R sur l'expression de hERG révélé ici en utilisant les cellules K562, les expériences ont été menées dans les ovocytes de xénope. L'injection d'ARNc de hERG (25pg/ovocyte) dans les ovocytes a induit l'apparition de courants absents des ovocytes injectés avec de l'eau (figure 6A, gauche et milieu). La co- injection d'ARNc de SigI R (5ng/ovocyte) avec la même faible concentration d'ARNc de hERG a multiplié par cinq l'amplitude du courant par rapport aux œufs exprimant hERG seul (figure 6 A,B). La potentialisation du courant dépend des concentrations d'ARNc de SigI R injecté mais disparait pour des concentrations élevées d'ARNc de hERG (> 15ng/ovocyte, non représenté). L'expression de SigI R n'a pas affecté les paramètres d'activation (figure 6C, tableau 2). On peut remarquer un déplacement vers la droite de la valeur du potentiel de demi-inactivation mais cette différence est non significative (figure 6D et tableau 2).
Tableau 2
Ces données indiquent que l'expression de SigI R régule principalement la densité de courant hERG.
Afin de confirmer ces données, des analyses par Western blot des protéines membranaires d'ovocytes injectés et contrôle ont été réalisées. Les résultats ont montré que pour de faibles concentrations d'ARNc de hERGI a injecté seul, de légères bandes correspondant aux protéines
immature et mature hERGI a ont été détectées ; la co-injection d'ARNc de SigI R et hERGI a a résulté en une nette augmentation dans les deux protéines hERGI a (figure 7A, supérieur). Dans les expériences de Western blot réalisées avec l'ARNm de hERGI b, seule la bande immature de 80kDa a pu être clairement détectée, ce qui est en accord avec les précédents résultats démontrant que l'efficacité du trafic de hERGI b est modulée à la baisse en l'absence de sous-unités hERGI a [17]. De nouveau, la co-injection de hERGI b avec l'ARNc de SigI R a provoqué une claire augmentation dans l'intensité de la bande de 80kDa (figure 7A, inférieur). En revanche, l'expression de SigI R n'a pas augmenté le niveau protéique de hERG lorsque des concentrations élevées d'ARNc de SigI R (> 15ng/ovocyte) ont été injectées (non représenté). Ces résultats ont montré que l'expression de SigI R stimule le courant hERG via l'augmentation de la quantité de canal hERG. Ainsi ces expériences concluent que Sig1 R stabilise les canaux à la membrane plasmique.
L'existence d'une interaction directe entre hERG et SigI R a été explorée dans des ovocytes de xénope via l'injection d'ARNc de hERGI a ou de hERG1 a+cMyc-Sig1 R. Il est à noter qu'il a été démontré que SigI R étiqueté cMyc en partie NH2-terminale est fonctionnellement exprimé dans les cellules HEK293 [9] et augmente le courant hERG dans les ovocytes de Xénope de la même manière que le fait l'ARNc de SigI R natif (non représenté). Les récepteurs SigI R ont été immunoprécipités en utilisant un anticorps dirigé contre l'étiquette cMyc et le résultat de l'immunoprécipitation a été résolu sur un gel SDS PAGE. Le western blot a été révélé en utilisant l'anticorps anti-pan-hERG et l'anti SigI R. Comme montré dans la figure 7B, dans les ovocytes co-injectés (Sigl R- cMyc+hERG1 a) les deux protéines co-immunoprécipitent démontrant ainsi une interaction fonctionnelle directe entre SigI R et hERG.
Exemple 5 : Sigl R augmente la maturation et la stabilisation de hERG à la surface de la cellule [Crottés et al., J. Biol. Chem., 286(32) : 27947- 27958, 2011] [19]
La cytométrie de flux a permis de confirmer que Sigl R augmente bien la quantité de canaux hERG à la surface des cellules shRD par rapport aux shSigI R. Le marquage a été réalisé à l'aide d'un anticorps anti-hERG dirigé contre une boucle extracellulaire du canal. Les résultats ont montré que l'extinction de Sigl R (shSigI R) a réduit de 35% l'expression de hERG à la surface cellulaire (figure 9).
L'étude de la vitesse de maturation de hERG a également été effectuée en menant des études de « pulsechase » sur des cellules HEK exprimant cmyc-Sig1 R. Les résultats ont montré que la surexpression de Sigl R a augmenté la vitesse de maturation de hERG (figure 10A) et aussi sa stabilité à la membrane plasmique (figure 10B).
Exemple 6 : Sigl R module l'adhésion des cellules K562 à la FN
Il a récemment été démontré l'association fonctionnelle entre les canaux hERG et les intégrines [18,10]. Le rôle de l'interaction Sig1 R/hERG sur l'adhésion cellulaire dépendant de l'intégrine à la matrice extracellulaire (MEC) a été testé in vitro. L'expression d'un seul sous-type d'intégrine, i.e. l'intégrine α5βι, a été rapportée dans les cellules K562 [18]. Cette intégrine présente une affinité élevée pour la la fibronectine (FN) un composant de la matrice extracellulaire (MEC). L'adhésion cellulaire à des puits recouverts de MEC a été significativement inhibée dans les cellules shSigI R par rapport aux cellules shRD (= 40%, figure 8A). Dans les cellules sauvages, le bloqueur de canal hERG (E-4031 ) et l'igmésine ont inhibé l'adhésion cellulaire spécifique dépendant de la FN. De manière intéressante, l'igmésine n'a pas produit d'effet additif par rapport aux cellules K562 traitées avec E-4031 (figure 8B). De même, les ligands sigma n'ont plus d'effet sur l'adhésion des cellules shSigI R (non représenté). Ces résultats indiquent que Sigl R inhibe l'adhésion cellulaire
spécifique à la FN via l'interaction avec le complexe hERG/intégrine α5βι comme précédemment décrit dans les cellules myéloïdes leucémiques [10]. Exemple 7 : Rôle de SigI R dans le potentiel invasif in vivo
Le poisson zèbre est un modèle de plus en plus utilisé en cancérologie. Il s'agit d'une espèce de poisson tropical d'aquarium très populaire (Danio rerio). Le poisson zèbre est un vertébré dont le génome est assez proche de celui de l'Homme [Barbazuk et al., Génome Res., 10(9) : 1351 -1358, 2000] [20], d'où son intérêt comme modèle animal appliqué à des pathologies humaines. Son temps de développement très rapide, avec un organisme qui atteint le stade adulte en 3 jours, constitue un second avantage. Les œufs et l'embryon sont transparents facilitant son examen microscopique. Les femelles pondent 100 à 200 oeufs par semaine, ce qui facilite les analyses statistiques. De plus, l'élevage du poisson zèbre est très facile et peu coûteux [Spence et al., Biol. Rev. Camb. Philos. Soc, 83(1 ) : 13-34, 2008] [21]. Ce poisson développe des pathologies proches de celles décrites chez l'Homme et notamment : des tumeurs spontanées [Spitsbergen et al., Toxicol. Pathol., 28(5) : 705-715, 2000 ; Spitsbergen et al., Toxicol. Pathol., 28(5) : 716-725, 2000 ; Beckwith et al., Lab. Invest., 80(3) : 379-385, 2000] [22, 23, 24] ; des cancers dus à une mutation d'un gène suppresseur de tumeur [Maclnnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(30) : 10408-10413, 2008] [25]. Ce modèle offre de plus la possibilité de réaliser des xénogreffes tumorales [White et al., Cell Stem Cell, 2(2) : 183-189, 2008 ; Mizgireuv et al., Cancer Res., 66(6) : 3120-3125, 2006] [26, 27] et de développer des modèles transgéniques, par exemple, pour le mélanome [Patton et al., Current Biol., 15(3) : 249- 254, 2005] [28].
Un modèle de xénogreffe dans l'embryon de poisson zèbre a été utilisé pour étudier le rôle de SigI R dans le potentiel invasif des cellules K562. Brièvement, les cellules tumorales ont d'abord été incubées avec un
marqueur cellulaire vital fluorescent (CM-Dil) puis injectées dans le sac vitellin des embryons.
Le pouvoir invasif des cellules a été quantifié en comptant le nombre de cellules ayant migré hors du sac vitellin et colonisé le corps de l'animal 48h après l'injection [Spitsbergen et al., 2000 ; Patton et al., 2005, précités] [22, 28]. Ces expériences ont été réalisées en collaboration avec le Dr. ML Cayuela (Murcia, Espagne).
Les résultats ont montré que l'extinction de sigI R a diminué de près de 60% le pouvoir invasif in vivo (Figure 1 1 ). Ceci permet d'affirmer, pour la première fois, que sigl R est directement impliqué dans les processus de migration et d'invasion des cellules cancéreuses.
Les résultats permettent de proposer sigI R comme cible thérapeutique anticancéreuse.
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28. Patton et al., Current Biol., 15(3) : 249-254, 2005
Claims
REVENDICATIONS
1 . Ligand modulateur d'un macrocomplexe canalaire comprenant un récepteur sigma-1 et un canal ionique pour utilisation comme médicament destiné à la régulation post-transcriptionnelle de l'expression membranaire dudit canal ionique.
2. Ligand modulateur d'un macrocomplexe canalaire comprenant un récepteur sigma-1 et un canal ionique pour le traitement de maladies impliquant lesdits canaux ioniques choisies dans le groupe comprenant les maladies du système nerveux, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiaques, le cancer.
3. Ligand modulateur selon la revendication 2, pour le traitement du cancer.
4. Ligand modulateur selon la revendication 1 , où l'expression membranaire dudit canal ionique est inhibée. 5. Ligand modulateur selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, où le canal ionique est un canal potassique.
6. Ligand modulateur selon la revendication 5, où le canal potassique est un canal ERG.
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