EP2435555A2 - Verfahren zur herstellung eines beschichteten zellkulturträgers - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines beschichteten zellkulturträgers

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EP2435555A2
EP2435555A2 EP10721122A EP10721122A EP2435555A2 EP 2435555 A2 EP2435555 A2 EP 2435555A2 EP 10721122 A EP10721122 A EP 10721122A EP 10721122 A EP10721122 A EP 10721122A EP 2435555 A2 EP2435555 A2 EP 2435555A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
mol
cell culture
stem cells
cells
component
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10721122A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Köcher
Theresia Klose
Tilo Pompe
Philipp Seib
Carsten Werner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Covestro Deutschland AG
Original Assignee
Bayer MaterialScience AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer MaterialScience AG filed Critical Bayer MaterialScience AG
Priority to EP10721122A priority Critical patent/EP2435555A2/de
Publication of EP2435555A2 publication Critical patent/EP2435555A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/093—Polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a coated cell culture carrier in which a polyurethaneurea-containing solution is applied to a cell carrier and dried. Further objects of the invention are a cell culture carrier obtainable by the process and its use for the in vitro cultivation of stem cells, in particular for the cultivation of mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells are capable of either proliferating or differentiating into various cell types such as osteoblasts, chondrocytes or adipocytes (A. I. Caplan and J. E. Dennis, J. Cell Biochem., 98, 2006, 1076-1084).
  • the mesenchymal stem cell multipotency coupled with the ease of isolation from adult donors, makes these stem cells an ideal source of cells for tissue engineering (D.P. Lennon and A.I. Caplan, Exp. Hematol., 34, 2006, 1604-1605). Examples of such applications are the regeneration of cartilage or bone or for therapeutic measures for the treatment of stroke or myocardial infarction (A. I. Caplan and J. E. Dennis J.
  • mesenchymal stem cells During prolonged periods of cultivation, mesenchymal stem cells often show osteoblast properties and have thus already lost their differentiation potential (Banfi et al Exp Hematol 28, 2000, 707, Baxter et al., Stern Cells 22, 2004 675, Wagner et al., PLoS ONE 3, 2008, E2218).
  • polyurethanes An interesting class of polymers for medical technology applications and tissue engineering is the class of polyurethanes. These have great potential for varying the structure and thus for setting certain properties. Polyurethanes as templates for stem cells are used regularly in tissue engineering. Examples of this are described in various publications. HL Pritchard et al., Biomaterials 28 (2007), 936-946 describe colonization studies of stem cells from fat cells on various substrates, including polyurethanes. In the case of the polyurethane used Pellethan the densities of colonization on pure material are very poor ( ⁇ 10%). Only further measures such as the occupancy with fibronectin and a plasma activation lead to a sufficient colonization density. However, these measures mean additional work steps and costs.
  • the prior art does not disclose a process for the preparation of a coated cell culture carrier which can easily be colonized with a sufficiently high density of stem cells, which enables a rapid proliferation of the stem cells and which prevents their premature differentiation during the propagation of the stem cells.
  • the polyurethane urea contained in the solution is prepared by reacting at least one polycarbonate polyol component, at least one polyisocyanate component and at least one diamine component.
  • a cell culture carrier produced by the process according to the invention can be colonized quickly and simply, ie in particular without the necessity of using expensive techniques, with a sufficient density of stem cells.
  • premature, unwanted differentiation of the stem cells does not occur.
  • This effect is already achieved by polyurethane urea coating alone, ie without the additional use of proteins or other natural substances.
  • chen substances in the coating of the cell culture carrier achieved.
  • the stem cells which have been propagated on the cell culture carrier still have the necessary differentiation potential after removal from the carrier and can be used accordingly, for example for tissue engineering.
  • Polyurethane ureas in the context of the present invention are, in particular, polymeric compounds which
  • the polyurethane ureas are preferably substantially linear molecules, but may also be branched, but less preferred.
  • substantially linear molecules are readily cross-linked systems, the underlying polycarbonate polyol component in particular having an average hydroxyl functionality of from 1.7 to 2.3, preferably from 1.8 to 2.2 and particularly preferably from 1.9 to 2.1, has.
  • the polycarbonate polyol component may in particular have a molecular weight, determined by the OH number, of preferably 400 to 6000 g / mol, more preferably of 500 to 5000 g / mol, and particularly preferably of 600 to 3000 g / mol.
  • Such polycarbonate polyol components are obtainable, for example, by reaction of carbonic acid derivatives, such as diphenyl carbonate, dimethyl carbonate or phosgene, with polyols, preferably diols.
  • diols examples include ethylene glycol, 1,2- and 1,3-propanediol, 1,3- and 1,4-butanediol, 1,6-hexanediol, 1,8-octanediol, neopentyl glycol, 1,4-bishydroxymethylcyclohexane, 2 Methyl-1,3-propanediol, 2,2,4-trimethylpentane-1,3-diol, di-, tri- or tetraethylene glycol, dipropylene glycol, Polypropylene glycols, dibutylene glycol, polybutylene glycols, bisphenol A, tetrabromobisphenol A but also lactone-modified diols in question.
  • the abovementioned polycarbonate polyols preferably contain from 40 to 100% by weight hexanediol, preferably 1,6-hexanediol and / or hexanediol derivatives, preferably those which have, in addition to terminal OH groups, ether or ester groups, e.g. Products obtained by reacting 1 mole of hexanediol with at least 1 mole, preferably 1 to 2 moles of caprolactone or by etherification of hexanediol with itself to di- or Trihexylenglykol. Polyether-polycarbonate diols can also be used.
  • the hydroxyl polycarbonates should be substantially linear.
  • polyfunctional components especially low molecular weight polyols.
  • Glycerol, trimethylolpropane, hexanetriol-1,2,6, butanetriol-1,2,4, trimethylolpropane, pentaerythritol, quinitol, mannitol, sorbitol, methyl glycoside or 1,3,4,6-dianhydrohexitols are suitable for this purpose, for example.
  • butane-1,4-diol or ⁇ -caprolactone As butane-1,4-diol or ⁇ -caprolactone.
  • polycarbonate polyols based on hexanediol-1,6, butanediol-1,4 or mixtures thereof are used.
  • the polyurethaneureas also have units which are based on at least one polyisocyanate component.
  • polyisocyanate component all aromatic, araliphatic, aliphatic and cycloaliphatic isocyanates known to the person skilled in the art having an average NCO functionality> 1, preferably> 2, can be used individually or in any mixtures with one another, it being immaterial whether these compounds have a phosgene or phosgene content. free processes were produced. They may also have iminooxadiazinedione, isocyanurate, uretdione, urethane, allophanate, biuret, urea, oxadiazinetrione, oxazolidinone, acylurea and / or carbodiimide structures. The isocyanates can be used individually or in any desired mixtures with one another.
  • Isocyanates from the series of aliphatic or cycloaliphatic representatives are preferably used, these having a carbon skeleton (without the NCO groups contained) of 3 to 30, preferably 4 to 20 carbon atoms.
  • Particularly preferred compounds of the abovementioned type with aliphatically and / or cyclo-aliphatically bonded NCO groups are, for example, bis (isocyanatoalkyl) ethers, bis- and tris- (isocyanatoalkyl) benzenes, -toluenes, and -xylols, propane diisocyanates, butane diisocyanates, pentane diisocyanates , Hexandiisocyanate (eg hexamethylene diisocyanate, HDI), Heptandiisocyana- te, octane diisocyanates, nonane diisocyanates (eg trimethyl-HDI (TMDI) usually as a mixture of 2,4,4- and 2,2,4-isomers), Nonantriisocyanate (eg 4 -isocyanatomethyl-l, 8- octane diisocyanate), decane diis
  • HDI hexamethylene diisocyanate
  • TMDI trimethyl-HDI
  • MPDI 2-methylpentane-1,1-diisocyanate
  • IPDI isophorone diisocyanate
  • H 6 XDI 1,3- and 1,4-bis (isocyanatomethyl) cyclohexane
  • NBDI bis (isocyanatomethyl) norbornane
  • IMCI - isocyanatomethyl-1-methylcyclohexyl isocyanate
  • IMCI 4,4'-bis (isocyanatocyclohexyl) methane
  • the amount of polyisocyanate component in the preparation of the polyurethaneureas is preferably 1.0 to 5.0 mol, particularly preferably 1.0 to 4.5 mol, in particular 1.0 to 4.0 mol, based on 1 mol of the polycarbonate component.
  • the essential polyurethane ureas have units which are based on at least one diamine and serve as so-called chain extenders.
  • Suitable diaminocomponents are di- or polyamines and also hydrazides, eg hydrazine, ethylenediamine, 1,2- and 1,3-diaminopropane, 1,4-diaminobutane, 1,6-diaminohexane, isophoronediamine, isomer mixture of 2,2,4- and 2,4,4-trimethylhexamethylenediamine, 2-methylpentamethylenediamine, diethylenetriamine, 1,3- and 1,4-xylylenediamine, ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ '-tetramethyl-1, 3- and -1,4- xylylenediamine and 4,4'-diaminodicyclohexylmethane, dimethylethylenediamine, hydrazine, adipic acid dihydrazide, 1,4-bis (aminomethyl) cyclohexane, 4,4'-diamino-3,3'-d
  • diamino components examples include primary and secondary amines such as 3-amino-1-methylaminopropane, 3-amino-1-ethylaminopropane, 3-amino-1-cyclohexylaminopropane, 3-amino-1-methylaminobutane.
  • the diamine component has at least one hydroxyl group.
  • the diaminocomponent may contain both primary and secondary amine as well as mixtures of both amine types.
  • An example of a particularly preferred compound is 1,3-diamino-2-propanol
  • the amount of the diamine component in the preparation of the polyurethaneurea is preferably 0.1 to 3.0 mol, particularly preferably 0.2 to 2.8 mol, in particular 0.3 to 2.5 mol, based on 1 mol of the polycarbonate component.
  • a polyol component is additionally reacted with in the preparation of the polyurethaneurea.
  • the polyol component used to build up the polyurethane ureas generally cause stiffening and / or branching of the polymer chain.
  • the molecular weight of the polyol component is preferably 62 to 500 g / mol, more preferably 62 to 400 g / mol, especially 62 to 200 g / mol.
  • Suitable polyol components may contain aliphatic, alicyclic or aromatic groups. Mentioned here are, for example, low molecular weight polyol components having up to about 20 carbon atoms per molecule, such as.
  • ester diols such as e.g. ⁇ -Hydroxybutyl- ⁇ -hydroxy-caproic acid esters, ⁇ -hydroxyhexyl- ⁇ -hydroxybutyric acid esters, adipic acid ( ⁇ -hydroxyethyl) esters or terephthalic acid bis ( ⁇ -hydroxyethyl) esters can be used.
  • the amount of polyol component in the preparation of the polyurethaneureas is preferably 0.05 to 2.0 mol, more preferably 0.05 to 1.5 mol, in particular 0.1 to 1.0 mol, based on 1 mol of the polycarbonate component.
  • the reaction of the polyisocyanate component with the polycarbonate polyol and the diamine component is usually carried out while maintaining a slight excess of NCO over the reactive hydroxy or amine compounds. At the end point of the reaction by reaching a target viscosity remains of active isocyanate remain. These residues must be blocked to avoid reaction with large polymer chains. Such a reaction leads to three-dimensional crosslinking and gelling of the approach. The processing of such a solution is no longer possible. To block the remaining free NCO groups can be reacted with a block component.
  • These block components are derived, for example, from monofunctional compounds reactive with NCO groups, such as monoamines, in particular mono-secondary amines or monoalcohols.
  • Examples of these are ethanol, n-butanol, ethylene glycol monobutyl ether, 2-ethylhexanol, 1-octanol, 1-dodecanol, 1-hexadecanol, methylamine, ethylamine, propylamine, butylamine, octylamine, laurylamine, stearylamine, isononyloxypropylamine, Dimethylamine, diethylamine, dipropylamine, dibutylamine, N-methylaminopropylamine, diethyl (methyl) aminopropylamine, morpholine, piperidine and suitable substituted derivatives thereof.
  • the block component Since the block component is primarily used to destroy the NCO excess, the amount required depends essentially on the amount of excess NCO and can not be generally specified.
  • the polycarbonate polyol, the polyisocyanate and the diamine components are reacted together in a melt or in solution until all the hydroxyl groups have been consumed. Then solvent is added.
  • the reaction takes place at a temperature of preferably between 60 and 110 ° C., particularly preferably 75 to 110 ° C., in particular 90 to 110 ° C., temperatures of around 110 ° C. being preferred because of the rate of the reaction. Even higher temperatures are also possible, but then there is the risk in individual cases and depending on the components used that decomposition processes and discoloration occur in the resulting polymer.
  • the catalysts known in polyurethane chemistry can be used, for example dibutyltin dilaurate.
  • the synthesis is without a catalyst.
  • the reaction in melt is preferred, but there is a risk that it comes to high viscosities of the reacted mixtures. In these cases it is recommended to add solvents. However, it should preferably not contain more than about 50 wt .-% solvent, otherwise the dilution significantly reduces the reaction rate.
  • the order of addition or conversion of the individual constituents may differ from the sequence indicated above. This may be particularly advantageous if the mechanical properties of the resulting coatings to be changed. If, for example, all hydroxyl-containing components are reacted simultaneously, a mixture of hard and soft segments is formed. For example, adding the polyol after the polycarbonate polyol component gives defined blocks, which may entail other properties of the resulting coatings.
  • the present invention is thus not limited to any particular order of addition or reaction of the individual components.
  • the addition of the solvent is preferably carried out stepwise so as not to slow down the reaction unnecessarily, which would occur if the amount of solvent were added completely at the beginning of the reaction, for example. Furthermore, it is bound at a high content of solvent at the beginning of the reaction at a relatively low temperature, which is at least co-determined by the type of solvent. This also leads to a slowing of the reaction.
  • the remaining residues of NCO can be blocked by a monofunctional aliphatic amine.
  • the remaining isocyanate groups are preferably blocked by reaction with the alcohols contained in the solvent mixture.
  • Suitable solvents for the preparation of the polyurethaneurea solutions are all conceivable solvents and solvent mixtures such as dimethylformamide, N-methylacetamide, tetramethylurea, N-methylpyrrolidone, aromatic solvents such as toluene, linear and cyclic esters, ethers, ketones and alcohols in question.
  • esters and ketones are ethyl acetate, butyl acetate, acetone, ⁇ -butyrolactone, methyl ethyl ketone and methyl isobutyl ketone.
  • Preference is given to mixtures of alcohols with toluene.
  • examples of alcohols which can be used together with toluene are ethanol, n-propanol, isopropanol and 1-methoxy-2-propanol.
  • the solids content of the polyurethane urea solutions is generally in the range of 1 to 60 wt .-%, preferably from 10 to 40 wt .-%.
  • the polyurethaneurea solutions can be diluted as desired with toluene / alcohol mixtures in order to variably adjust the thickness of the coating.
  • any layer thicknesses such as some 100 nm up to several 100 microns, and in the context of the present invention also higher and lower thicknesses are possible.
  • the polyurethaneurea solutions may also contain customary constituents and additives for the respective intended purpose.
  • additives such as antioxidants or pigments may also be used.
  • further additives such as grip aids, dyes, matting agents, UV stabilizers, light stabilizers, hydrophilizing agents, water repellents and / or flow control agents may be used.
  • the polyurethaneurea solutions may additionally contain proteins. Preferably, these may be extracellular matrix proteins.
  • Coatings of the polyurethaneurea solutions can be applied to the cell culture carrier by various methods. Suitable coating techniques are, for example, doctoring, printing, transfer coating, spraying, spin coating or dipping.
  • cell culture carriers made of glass, silicon wafer, plastic or metals
  • metals which can be mentioned are: medical stainless steel and nickel-titanium alloys.
  • Many polymer materials are conceivable from which the cell culture carrier can be constructed, for example polyamide; polystyrene; polycarbonate; polyether; Polyester; polyvinyl acetate; natural and synthetic rubbers; Block copolymers of styrene and unsaturated compounds such as ethylene, butylene and isoprene; Polyethylene or copolymers Polyethylene and polypropylene; Silicone; Polyvinyl chloride (PVC) and polyurethanes.
  • PVC Polyvinyl chloride
  • further suitable coatings can be applied as substrate before the application of these coating materials.
  • Particularly preferred is the coating of glass or silicon wafers for the production of cell culture carriers.
  • the NCO content of the resins described in the Examples and Comparative Examples was determined by titration in accordance with DIN EN ISO 11909.
  • Viscosity measurements were carried out with the Physics MCR 51 Rheometer from Anton Paar GmbH, Ostf ⁇ ldern, Germany.
  • Desmophen C2200 Bayer MaterialScience AG, Leverkusen, Germany
  • Polycarbonate polyol OH number 56 mg KOH / g, number average molecular weight 2000 g / mol
  • Polytetramethylene glycol polyol OH number 56 mg KOH / g, number average molecular weight 2000 g / mol
  • Cell line C2C 12 multipotent cell line (species mouse), was obtained from the American Type Culture Collection (ATTC), Manassass, VA, USA, ATCC number CRL-1772
  • BMP-2 Bone Morphogenic Protein 2
  • rhBMP-2 human recombinant bone morphogenesis protein-2
  • CHO Chinese Horseradish
  • composition insulin 6.25 ⁇ g / ml transferin 6.25 ⁇ g / ml selenious acid 6.25 ng / ml bovine serum albumin 1.25 mg / ml linoleic acid 5.35 ⁇ g / ml
  • BME Eagle's Basal Medium
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco / Invitrogen, Düsseldorf, Germany, (D-MEM) (IX), liquid (high glucose) Catalog No. 31966
  • Glucose high glucose content (4500mg / L)
  • Glucose high glucose content (1000mg / L)
  • Glutamine GlutaMAX TM -I
  • PBS Phosphate buffered saline
  • TPS Tissue Culture Polystyrene
  • the coatings were produced on glass slides of size 25x25 mm with the aid of a spin coater (RC5 Gyrset 5, Karl Süss, Garching, Germany). For this purpose, a microscope slide was clamped on the sample plate of the spin coater and homogeneously covered with about 0.5-1 ml of organic 5% strength polyurethane solution. All organic polyurethane solutions were treated with a solvent mixture of 65% by weight of toluene and 35% by weight of isopropanol (2: 1) to a polymer content of 5% by weight diluted. By rotation of the sample tray for 120 seconds at 3000 revolutions per minute, a homogeneous coating was obtained, which was dried at 60 for 2 hours. The polyurethane coatings thus obtained were ⁇ -sterilized at room temperature at a dose of 50 kGy prior to use for cell culture experiments.
  • Multipotent cells from C2C12 mouse were (Dulbecco's Modified Eagle Medium) containing 10% fetal calf serum (FBS), 2 to 3 days at 37 0 C in a humidified atmosphere containing 5% carbon dioxide cultured in DMEM.
  • the cells were subcultured with about 85% coverage by rinsing the cells twice with PBS and then treating with trypsin-EDTA for 5 min to detach the cells from the culture surface. Subsequently, the cells were taken up in DMEM, centrifuged off and plated out at a cell density of 700 cells / cm 2 .
  • the cells were also colonized at a density of about 700 cells / ml on the native polyurethane substrates of Examples 6a-e.
  • the same cell densities were colonized on polystyrene (Tissue Culture Polystyrene, (TCP)) and on glass.
  • TCP tissue Culture Polystyrene
  • Mouse mesenchymal stem cells C3H10T0.5 were cultured in Eagle's basal medium containing Glutamax and Earle's salt supplemented with 10% fetal calf serum (FBS). The cells were kept in a humidified atmosphere with the addition of 5% carbon dioxide. The cells were plated with approximately 70% coverage, as described in Example 7 a for the multipotential cells C2C12, subcultured at a concentration of 2 ⁇ 10 3 cells / cm 2. These low plating densities were chosen to prevent contact inhibition and selection of cell variants.
  • FBS fetal calf serum
  • Example 6a, 6b and 6c allow growth comparable to growth on the previously used tissue culture polystyrene.
  • the comparative coating of Example 6e does not allow any growth of the cell lines and thus can not be used as a culture carrier.
  • Example 6a, 6b and 6c allow growth comparable to growth on the previously used tissue culture polystyrene.
  • the comparative coating of Example 6e does not allow growth of the cell lines and thus can not be used as a culture carrier.
  • Example 6d allows growth comparable to growth on the previously used tissue culture polystyrene.
  • TCP Tissue Culture Polystyrene
  • Mouse mesenchymal stem cells C3H10T0.5 were cultured in Eagle's basal medium containing Glutamax and Earle's salt supplemented with 10% fetal calf serum (FBS). The cells were kept in a humidified atmosphere with the addition of 5% carbon dioxide. The cells were subcultured with approximately 70% coverage and plated at a concentration of 2x10 3 cells / cm 2 . These low plating densities were chosen to prevent contact inhibition and the selection of cell variants.
  • FBS fetal calf serum
  • BMP-2 bone morphogenetic protein
  • the conditions are the same as described in Example 7b, except that the BMP-2 is additionally added to the cell culture medium.
  • an additional 200 ⁇ M ascorbic acid and 10 mM glycerol phosphate were added.
  • BMP-2 is a known agent for the induction of osteogenic differentiation.
  • mesenchymal stem cells C3H10T0.5 in a concentration of 1.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in complete medium with the addition of 500 ng / ml BMP-2 were plated on a native polyurethane coating of Example 6d.
  • the same cell cultures were seeded on TCP and on glass under the same experimental conditions.
  • the content of the enzyme alkaline leukocyte phosphatase (ALP) is used as a marker for the degree of differentiation.
  • ALP alkaline leukocyte phosphatase
  • the reagent for the determination of the alkaline leukocyte phosphatase was prepared by adding 5 ml of 16 mM p-nitrophenol phosphate and 20 ul of a 1 M aqueous MgCl 2 solution to 5 ml of sodium borate-sodium hydroxide buffer with a pH of 9.8.
  • Table 5 Effect of the coating of Example 6d on the prevention of differentiation of the mesenchymal stem cells C3H10T0.5 in control medium without BMP-2 as an induction agent (values are activity of the alkaline leukocyte phosphatase in nmol / min / mg protein)
  • the activity of the alkaline leukocyte phosphatase after cell culture on the polyurethane film of Example 6d is significantly lower than the activity after culture on tissue culture polystyrene or on glass. During in vitro cultivation, there is little premature differentiation of the cells on the polyurethane film, which is advantageous over the usual materials such as tissue culture polystyrene or glass.
  • Example 6d Effect of the coating of Example 6d on the prevention of the differentiation of the mesenchymal stem cells C3H1OTO.5 in control medium with the addition of BMP-2 as an induction of osteogenic differentiation (values are alkaline phosphatase activity in nmol / min / mg protein)
  • Example 9 The activity of the ALP after cell culture on the polyurethane film of Example 6d is significantly lower than the activity after culture on tissue culture polystyrene or on glass.
  • the addition of the inducer BMP-2 significantly increases the differentiation of the mesenchymal cell culture on the usual cell culture carriers polystyrene or glass (compare values of Tables 5 and 6).
  • On the polyurethane film according to the invention there is no increased premature differentiation of the cells during in vitro cultivation despite the presence of the induction agent.
  • Human mesenchymal stem cells were isolated from bone marrow from healthy donors according to the protocol of Oswald et al., Star Cells 2004, 22, 377-384. The cells were removed from a donor by puncture from the iliac crest. Mononuclear cells were isolated from the cell mixture of the puncture by removing the erythrocytes by density gradient centrifugation. The mononuclear cells are placed in a cell culture flask so that the mesenchymal stem cells adhere to the substrate.
  • the cell culture consists of DMEM with a proportion of 1 g / l glucose and 10% by volume fetal calf serum. The cells were cultivated at 37 ° C. in a steam-saturated atmosphere containing 5% of carbon dioxide. The time of the culture is donor dependent, lasted in the described case 2 weeks.
  • the remaining erythrocytes are washed down after 72 h.
  • the remaining mesenchymal stem cells multiply in the cell culture. After harvesting, phenotypic characterization and differentiation behavior are determined.
  • the cells were subcultured at a coverage of about 80% for a maximum of five passages.
  • the cells thus obtained were plated at a cell density of 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 onto the polyurethane coating of Example 6d.
  • As a control the same cell cultures were plated out on TCP and on glass.
  • the cultivation of the human mesenchymal stem cells is carried out as in Example 7 a.
  • Example 6d The investigation of osteogenic differentiation was carried out in DMEM with addition of 10% by volume of FBS and human recombinant BMP-2 (200 ng / ml) with further addition of 200 ⁇ M ascorbic acid and 10 mM glycerol phosphate by sowing on polyurethane membranes of Example 6d.
  • the procedure is the same as in Example 8 except that in the case of human mesenchymal stem cells, the cell culture is continued on the fourth day without the addition of fetal calf serum.
  • the cells were seeded on TCP and on glass.
  • DMEM containing ITS + medium supplement of: insulin 6.25 mg / ml, transferrin 6.25 mg / ml, selenious acid 6.25 ⁇ g / ml, bovine serum albumin 0.125 g / ml and linoleic acid 5 , 35 mg / ml
  • the activity of the alkaline leukocyte phosphatase for evaluation of osteogenic differentiation was carried out according to the procedure of Example 8
  • the matrix mineralization of the cells was determined by staining with alizarin S according to J. Jadlowiec et al., J. Biol. Chem.
  • the cells were harvested at specific time points, washed with 0.5 ml PBS and fixed at -20 0 C for 1 h with 0.5 ml of ethanol (70 wt% in water). The cells were then washed with 0.5 ml of double-distilled water and stained with 0.5 ml of aqueous, 40 nM alizarin solution adjusted to pH 4.2 with ammonia. Excess alizarin was removed by washing with water.
  • the dye bound in the matrix of the osteoblasts formed was dissolved by incubation of the stained cells at RT in 300 ⁇ l of a 10% by weight aqueous hexadecylpyridinium chloride solution for 2 hours and the optical density of this solution was determined at 570 nm.
  • Table 7 Effect of the coating of Example 6d on the prevention of the differentiation of human mesenchymal stem cells in control medium without BMP-2 as an induction agent (values are activity of the alkaline leukocyte phosphatase in nmol / min / mg protein)
  • Example 6d The activity of the alkaline leukocyte phosphatase after cell culture on the Polyurethanf ⁇ lm of Example 6d is significantly lower than the activity after culture of the same cells on tissue culture polystyrene or on glass. During in vitro cultivation, there is little early differentiation of the cells on the polyurethane film, which is advantageous over the usual materials such as tissue culture polystyrene or glass.
  • Table 8 Effect of the coating of Example 6d on the prevention of the differentiation of human mesenchymal stem cells in control medium with the addition of BMP-2 as an induction agent (values are alkaline phosphatase activity in nmol / min / mg protein)
  • Table 9 Effect of the coating of Example 6d on the prevention of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in control medium with the addition of BMP-2 as an induction agent (values are optical densities of alizarin determination)
  • the staining with alizarin, as well as the detection of the activity of the alkaline leukocyte phosphatase, show that in the presence of the inducible agent BMP-2 the polyurethane film according to the invention as cell culture medium has significantly less spontaneous, premature and undesired differentiation.
  • tion of human mesenchymal stem cells causes polystyrene and glass as the conventional cell culture carriers.
  • the stem cells which have been propagated on the cell culture carrier according to the invention still have the necessary differentiation potential after removal from the carrier and can be used correspondingly, for example for tissue engineering.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines beschichteten Zellkulturträgers, bei dem eine Polyurethanharnstoff enthaltende Lösung auf einen Zellträger aufgebracht und getrocknet wird. Der Polyurethanharnstoff wird zuvor durch Umsetzung mindestens einer Polycarbonatpolyolkomponente, mindestens einer Polyisocyanatkomponente und mindestens einer Diaminokomponente hergestellt. Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein nach dem Verfahren erhältlicher Zellkulturträger und dessen Verwendung zur in-vitro Kultivierung von Stammzellen, insbesondere zur Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen.

Description

Verfahren zur Herstellung eines beschichteten Zellkulturträgers
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines beschichteten Zellkulturträgers, bei dem eine Polyurethanharnstoff enthaltende Lösung auf einen Zellträger aufgebracht und getrocknet wird. Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein nach dem Verfahren erhältlicher Zellkulturträger und dessen Verwendung zur in-vitro Kultivierung von Stammzellen, insbesondere zur Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen.
Mesenchymale Stammzellen sind befähigt, sich entweder zu vermehren oder sich in verschiedene Zelltypen wie Osteoblasten, Chondrozyten oder Adipozyten zu differenzieren (A. I. Caplan und J. E. Dennis, J. Cell Biochem. 98, 2006, 1076-1084). Die Multipotenz der mesenchymalen Stammzellen, gepaart mit der leichten Isolierbarkeit aus erwachsenen Spendern, macht aus diesen Stammzellen eine ideale Quelle für Zellen für das Tissue Engineering (D. P. Lennon und A. I. Caplan, Exp. Hematol. 34, 2006, 1604-1605). Beispiele solcher Anwendungen sind die Regeneration von Knorpel oder Knochen oder für therapeutischer Maßnahmen zur Behandlung von Schlag- anfall oder Herzinfarkt (A. I. Caplan und J. E. Dennis J. Cell Biochem. 98, 2006, 1076-1084). Aufgrund der niedrigen Konzentration dieser mesenchymalen Stammzellen im menschlichen Knochenmark ist es notwendig, diese Stammzellen vor der klinischen Anwendung in-vitro zu kultivieren und zu vermehren (A. I. Caplan und J. E. Dennis J. Cell Biochem. 98, 2006, 1076-1084; D. L. Jones und A. J. Wagers, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 2008, 11-21). Hierbei kommt es bisher aber sehr häufig zu einem Verlust des Differenzierungspotentials und somit reduziertem therapeutischen Nutzen (S. J. Morrison and A. C. Spradling, Cell 132, 2008, 598-611). Während längerer Perioden der Kultivierung zeigen mesenchymale Stammzellen oftmals Eigenschaften von Osteoblasten und haben somit schon an Differenzierungspotential verloren (Banfi et al Exp Hematol 28, 2000, 707; Baxter et al Stern Cells 22, 2004 675; Wagner et al PLoS ONE 3, 2008, e2218).
Ganz allgemein sind Strategien wünschenswert, um mesenchymale Stammzellen in-vitro kultivieren zu können. Die Kultivierung soll dabei ohne vorzeitige Differenzierung der Zellen und somit ohne Verlust des Potentials der Stammzellen erfolgen.
Eine etablierte Methode zur Erreichung dieses Ziels besteht in der Verwendung von Proteinen der extrazellulären Matrix. Diese Vorgehensweise ist beispielsweise in den Publikationen X.-D. Chen et al., Journal of Bone and Mineral Research 22 (12), 2007, 1943-1956, und T. Matsubara et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 313 (2004), 503-508 beschrieben. Die hier verwendeten Proteinmischungen werden auf Zellkulturträgern aus Kunststoff aufgebracht. Auf den beschichteten Zellkulturträger können mesenchymale Stammzellen mit im Vergleich zu unbeschichteten Zellkulturträgern geringerem Verlust an Differnzierungspotential vermehrt werden.
Die Vermehrung von Stammzellen unter gleichzeitiger Verhinderung der verfrühten Differenzierung dieser Stammzellen wird im Stand der Technik auch durch die gezielte Zugabe von biologi- sehen Faktoren erreicht. So beschreibt Ansellem et al, Nature Medicine 9 (11), 2003, 1423 die Verwendung von Modulatoren wie „sonic hedgehog"- oder Wnt-Proteinen zur Verhinderung der Differenzierung der Stammzellen in einer in-vitro-Kultur. Die Patentanmeldungen WO 2006/006171 und WO 2006/030442 sowie die Veröffentlichung PNAS 103 (2006), 11707 beschreiben ähnliche Konzepte.
Die vorstehend beschriebenen Konzepte benötigen zusätzliche Materialien als Modulatoren oder als Oberflächenschicht. Diese Materialien sind jedoch schwer zu isolieren, da es sich um natürliche Proteine handelt. Daher sind alternative Strategien wünschenswert, die ebenfalls eine Vermehrung unter gleichzeitiger Verhinderung der Differenzierung ermöglichen.
Ein relativ neuer Ansatz für das Arbeitsgebiet des Tissue Engineering ist das spezielle Design der Zellkulturträger selbst zur Differenzierung von Stammzellen in situ (S. Neuss et al., Biomaterials 29, 2008, 302-313). Neuss et al. untersuchen eine Bibliothek verschiedener natürlicher oder künstlicher Polymere zu diesem Zweck, wobei hier keine Proteine zur Unterstützung der Stammzellkultivierung eingesetzt werden.
In J. M. Curran et al., Biomaterials 27, 2006, 4783-4793 ist das Prinzip, dass die Oberflächenbe- schaffenheit eines Substrates die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen beeinflussen kann, angesprochen. Es konnte an modifizierten Glasoberflächen gezeigt werden, dass verschiedene Oberflächenmodifizierungen die Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen unterschiedlich beeinflussen. Amino- und Thiolgruppen-haltige Glasoberflächen förderten die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen, während das Kontrollglas und ein methylmodifiziertes Glas den Phenotyp erhielten. Allerdings ist der Prozess der Modifikation einer Glasoberfläche durch chemische Reagenzien aufwendig. Im Übrigen tritt trotz allem bei der Zugabe eines Induktionsmittels eine vorzeitige Differenzierung der Zellen auf der modifizierten Oberfläche auf.
Eine interessante Polymerklasse für Medizintechnikanwendungen und für das Tissue Engineering ist die Klasse der Polyurethane. Diese besitzen ein großes Potential zur Variation der Struktur und somit zur Einstellung von bestimmten Eigenschaften. Polyurethane als Matrizes für Stammzellen werden im Tissue Engineering regelmäßig benutzt. Beispiele hierfür sind in verschiedenen Publikationen beschrieben. H. L. Pritchard et al., Biomaterials 28 (2007), 936 - 946 beschreiben Besiedlungsstudien von Stammzellen aus Fettzellen auf verschiedenen Substraten, unter anderem auch auf Polyurethanen. Im Fall des verwendeten Polyurethans Pellethan sind die Besiedlungsdichten auf reinem Material sehr schlecht (< 10 %). Nur weitere Maßnahmen wie die Belegung mit Fibronectin sowie einer Plasmaaktivierung führen zu einer ausreichenden Besiedlungsdichte. Diese Maßnahmen bedeuten jedoch zusätzliche Arbeitsschritte und Kosten.
C. Alperin et al., Biomaterials 26 (2005), 7377-7386 beschreiben die Kultivierung von Cardiomy- ocyten auf Polyurethanen durch Besiedlung mit embyronalen Stammzellen aus Maus. Die Stammzellen werden gezielt innerhalb von 9 Tagen zu Cardiomyozyten differenziert. Die Verhinderung der Differenzierung der Stammzellen ist hingegen nicht Gegenstand der Veröffentlichung.
Nieponice et al., Biomaterials 29 (2008), 825-833 beschreiben die Besiedlung von Stammzellen aus Muskeln auf bioabbaubarem Polyurethan zur Herstellung von Implantaten für kardiovaskuläre Anwendungen. Die Besiedlung erfolgt auf dem reinen Polyurethan ohne weitere Zusätze. Mit Hilfe des beschriebenen Verfahrens lassen sich die Zellen auf dem Träger 7 Tage ohne vorzeitige Diffe- renzierung kultivieren. Allerdings ist der Einsatz einer aufwendigen Vakuumbesiedlungstechnik notwendig, um eine ausreichende Besiedlungsdichte zu erhalten.
Im Stand der Technik ist kein einfach durchzuführendes Verfahren zur Herstellung eines beschichteten Zellkulturträgers bekannt, der leicht mit einer ausreichend hohen Dichte an Stammzellen besiedelt werden kann, der eine schnelle Vermehrung der Stammzellen ermöglicht und der wäh- rend der Vermehrung der Stammzellen deren vorzeitige Differenzierung verhindert.
Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren der eingangs genannten Art bereit zu stellen, mit dessen Hilfe ein Zellkulturträger erhalten werden kann, der den oben genannten Anforderungen gleichermaßen genügt.
Diese Aufgabe wird erfϊndungsgemäß dadurch gelöst, dass der in der Lösung enthaltene Polyu- rethanharnstoff durch Umsetzung mindestens einer Polycarbonatpolyolkomponente, mindestens einer Polyisocyanatkomponente und mindestens einer Diaminokomponente hergestellt wird.
Ein nach dem erfϊndungsgemäßen Verfahren hergestellter Zellkulturträger kann schnell und einfach, d.h. insbesondere ohne die Notwendigkeit des Einsatzes aufwendiger Techniken, mit einer ausreichenden Dichte an Stammzellen besiedelt werden. Während der anschließenden raschen Vermehrung der Stammzellen auf dem Zellkulturträger tritt eine vorzeitige, ungewollte Differenzierung der Stammzellen nicht auf. Dieser Effekt wird bereits allein durch die Polyurethan- harnstoffbeschichtung, d.h. ohne die zusätzliche Verwendung von Proteinen oder weiteren natürli- chen Substanzen in der Beschichtung des Zellkulturträger erreicht. Die auf den Zellkulturträger vermehrten Stammzellen weisen nach der Entfernung von dem Träger noch das notwendige Differenzierungspotential auf und können entsprechend, beispielsweise für das Tissue Engineering verwendet werden.
Polyurethanharnstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere polymere Verbindungen, die
(a) mindestens zwei Urethangruppen enthaltende Wiederholungseinheiten der folgenden allgemeinen Struktur
O
N- O- H
und
(b) mindestens eine Harnstoffgruppen enthaltende Wiederholungseinheit
O
-N- -N- H H
aufweisen.
Die Polyurethanharnstoffe sind bevorzugt im Wesentlichen lineare Moleküle, können jedoch auch verzweigt sein, was jedoch weniger bevorzugt ist. Unter im Wesentlichen linearen Molekülen versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung leicht anvernetzte Systeme, wobei die zugrundeliegende Polycarbonatpolyolkomponente insbesondere eine mittlere Hydroxylfunktionalität von 1,7 bis 2,3, bevorzugt von 1,8 bis 2,2 und besonders bevorzugt von 1,9 bis 2,1, aufweist.
Ferner kann die Polycarbonatpolyolkomponente insbesondere ein durch die OH-Zahl bestimmtes Molekulargewicht von vorzugsweise 400 bis 6000 g/mol, besonders bevorzugt von 500 bis 5000 g/mol und insbesondere bevorzugt von 600 bis 3000 g/mol auf. Derartige Polycarbonatpolyolkom- ponenten sind beispielsweise durch Reaktion von Kohlensäurederivaten, wie Diphenylcarbonat, Dimethylcarbonat oder Phosgen, mit Polyolen, vorzugsweise Diolen, erhältlich. Als Diole kommen dabei beispielsweise Ethylenglykol, 1,2- und 1,3-Propandiol, 1,3- und 1 ,4-Butandiol, 1,6- Hexandiol, 1 ,8-Octandiol, Neopentylglykol, 1,4-Bishydroxymethylcyclohexan, 2-Methyl-l,3- propandiol, 2,2,4-Trimethylpentan-l,3-diol, Di-, Tri- oder Tetraethylenglykol, Dipropylenglykol, Polypropylenglykole, Dibutylenglykol, Polybutylenglykole, Bisphenol A, Tetrabrombisphenol A aber auch Lacton-modifizierte Diole in Frage.
Die vorstehend genannten Polycarbonatpolyole enthalten vorzugsweise 40 bis 100 Gew.-% He- xandiol, bevorzugt 1 ,6-Hexandiol und/oder Hexandiol-Derivate, vorzugsweise solche, die neben endständigen OH-Gruppen Ether- oder Estergruppen aufweisen, z.B. Produkte, die durch Umsetzung von 1 Mol Hexandiol mit mindestens 1 Mol, bevorzugt 1 bis 2 Mol Caprolacton oder durch Veretherung von Hexandiol mit sich selbst zum Di- oder Trihexylenglykol erhalten wurden. Auch Polyether-Polycarbonatdiole können eingesetzt werden. Die Hydroxylpolycarbonate sollten im wesentlichen linear sein. Sie können jedoch gegebenenfalls durch den Einbau polyfunktioneller Komponenten, insbesondere niedermolekularer Polyole, leicht verzweigt werden. Hierzu eignen sich beispielsweise Glycerin, Trimethylolpropan, Hexantriol-1,2,6, Butantriol-1,2,4, Trimethy- lolpropan, Pentaerythrit, Chinit, Mannit, Sorbit, Methylglykosid oder 1,3,4,6-Dianhydrohexite. Bevorzugt sind solche Polycarbonate auf Basis von Hexandiol- 1,6, sowie modifizierend wirkenden Co-Diolen wie z. B. Butandiol-1,4 oder auch von ε-Caprolacton. In einer bevorzugten Ausftih- rungsform werden Polycarbonatpolyole auf Basis von Hexandiol-1,6, Butandiol-1,4 oder deren Mischungen verwendet.
Die Polyurethanharnstoffe weisen ferner Einheiten auf, welche auf mindestens eine Polyisocya- natkomponente zurückgehen.
Als Polyisocyanatkomponente können alle dem Fachmann bekannten aromatischen, araliphati- sehen, aliphatischen und cycloaliphatischen Isocyanate einer mittleren NCO-Funktionalität > 1, bevorzugt > 2 einzeln oder in beliebigen Mischungen miteinander eingesetzt werden, wobei es unerheblich ist, ob diese nach Phosgen- oder phosgen-freien Verfahren hergestellt wurden. Sie können auch Iminooxadiazindion-, Isocyanurat-, Uretdion-, Urethan-, Allophanat-, Biuret-, Harnstoff-, Oxadiazintrion, Oxazolidinon-, Acylharnstoff- und/oder Carbodiimid-Strukturen aufweisen. Die Isocyanate können einzeln oder in beliebigen Mischungen miteinander eingesetzt werden.
Bevorzugt werden Isocyanate aus der Reihe der aliphatischen oder cycloaliphatischen Vertreter eingesetzt, wobei diese ein Kohlenstoffgrundgerüst (ohne die enthaltenen NCO-Gruppen) von 3 bis 30, bevorzugt 4 bis 20 Kohlenstoffatomen aufweisen.
Besonders bevorzugte Verbindungen der vorstehend genannten Art mit aliphatisch und/oder cyclo- aliphatisch gebundene NCO-Gruppen sind beispielsweise Bis-(isocyanatoalkyl)ether, Bis- und Tris-(isocyanatoalkyl)benzole, -toluole, sowie -xylole, Propandiisocyanate, Butandiisocyanate, Pentandiisocyanate, Hexandiisocyanate (z.B. Hexamethylendiisocyanat, HDI), Heptandiisocyana- te, Octandiisocyanate, Nonandiisocyanate (z.B. Trimethyl-HDI (TMDI) in der Regel als Gemisch der 2,4,4- und 2,2,4-Isomeren), Nonantriisocyanate (z.B. 4-Isocyanatomethyl-l,8- octandiisocyanat), Dekandiisocyanate, Dekantriisocyanate, Undekandiisocyanate, Undekantriiso- cyanate, Dodecandiisocyanate, Dodecantriisocyanate, 1,3- sowie 1,4-Bis- (isocyanatomethyl)cyclohexane (H6XDI), 3-Isocyanatomethyl-3 ,5 ,5 -trimethylcyclohexylisocyanat (Isophorondiisocyanat, IPDI), Bis-(4-isocyanatocyclohexyl)methan (Hi2MDI) oder Bis- (isocyanatomethyl)norbornan (NBDI).
Ganz besonders bevorzugt sind Hexamethylendiisocyanat (HDI), Trimethyl-HDI (TMDI), 2- Methylpentan-l,5-diisocyanat (MPDI), Isophorondiisocyanat (IPDI), 1,3- sowie 1,4- Bis(isocyanatomethyl)cyclohexan (H6XDI), Bis(isocyanatomethyl)norbornan (NBDI), 3(4)- Isocyanatomethyl-1-methyl-cyclohexylisocyanat (IMCI) und/oder 4,4'-Bis- (isocyanatocyclohexyl)methan (H12MDI) oder Gemische dieser Isocyanate. Weitere Beispiele sind Derivate aus den vorstehenden Diisocyanaten mit Uretdion-, Isocyanurat-, Urethan-, Allophanat-, Biuret-, Iminooxadiazindion- und/oder Oxadiazintrionstruktur mit mehr als zwei NCO-Gruppen.
Die Menge an Polyisocyanatkomponente bei der Herstellung der Polyurethanharnstoffe beträgt vorzugsweise 1,0 bis 5,0 mol, besonders bevorzugt 1,0 bis 4,5 mol, insbesondere 1,0 bis 4,0 mol bezogen auf 1 mol der Polycarbonatkomponente.
Die erfϊndungswesentlichen Polyurethanharnstoffe weisen Einheiten auf, welche auf mindestens ein Diamin zurückgehen und als sogenannte Kettenverlängerer dienen.
Geeignete Diaminokomponenten sind Di- oder Polyamine sowie Hydrazide, z.B. Hydrazin, Ethy- lendiamin, 1,2- und 1,3-Diaminopropan, 1 ,4-Diaminobutan, 1 ,6-Diaminohexan, Isophorondiamin, Isomerengemisch von 2,2,4- und 2,4,4-Trimethylhexamethylendiamin, 2-Methylpentamethy- lendiamin, Diethylentriamin, 1,3- und 1,4-Xylylendiamin, α,α,α',α'-Tetramethyl-l,3- und -1,4- xylylendiamin und 4,4'-Diaminodicyclohexylmethan, Dimethylethylendiamin, Hydrazin, Adipin- säuredihydrazid, 1 ,4-Bis(aminomethyl)cyclohexan, 4,4' -Diamino-3 ,3 ' -dimethyldicyclo- hexylmethan und andere (C1 - Gt)-Di- und Tetraalkyldicyclo-hexylmethane, z. B. 4,4'-Diamino- 3,5-diethyl-3',5'-diisopropyldicyclohexylmethan.
Bei der Herstellung des Polyurethanharnstoffs kommen als Diaminokomponente auch niedermolekulare Diamine in Betracht, die aktiven Wasserstoff mit gegenüber NCO-Gruppen unterschiedlicher Reaktivität aufweisen. Dies sind z.B. Verbindungen, die neben einer primären Aminogruppe auch sekundäre Aminogruppen aufweisen.
Beispiele für solche Diaminokomponenten sind primäre und sekundäre Amine, wie 3-Amino-l- Methylaminopropan, 3-Amino-l-Ethylaminopropan, 3-Amino-l-cyclohexylaminopropan, 3- Amino-1- Methylaminobutan. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform weist die Diaminokomponente mindestens noch eine Hydroxygruppe auf. Dabei kann die Diaminokomponente sowohl primäre als auch sekundäre A- mine sowie Mischungen beider Amintypen enthalten. Ein Beispiel einer besonders bevorzugten Verbindung ist l,3-Diamino-2-propanol
Die Menge der Diaminokomponente bei der Herstellung des Polyurethanharnstoffs beträgt vorzugsweise 0,1 bis 3,0 mol, besonders bevorzugt 0,2 bis 2,8 mol, insbesondere 0,3 bis 2,5 mol bezogen auf 1 mol der Polycarbonatkomponente.
In einer weiteren Ausführungsform wird bei der Herstellung des Polyurethanharnstoffs zusätzlich eine Polyolkomponente mit umgesetzt. Die zum Aufbau der Polyurethanharnstoffe eingesetzte Polyolkomponente bewirken in der Regel eine Versteifung und/oder eine Verzweigung der Polymerkette. Das Molekulargewicht der Polyolkomponente beträgt vorzugsweise 62 bis 500 g/mol, besonders bevorzugt 62 bis 400 g/mol, insbesondere 62 bis 200 g/mol.
Geeignete Polyolkomponenten können aliphatische, alicyclische oder aromatische Gruppen enthal- ten. Genannt seien hier beispielsweise niedermolekulare Polyolkomponenten mit bis zu etwa 20 Kohlenstoffatomen je Molekül, wie z. B. Ethyenglykol, Diethylenglykol, Triethylenglykol, 1,2- Propandiol, 1,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, 1,3-Butylenglykol, Cyclohexandiol, 1 ,4-Cyclohexandi- methanol, 1 ,6-Hexandiol, Neopentylglykol, Hydrochinondihydroxyethylether, Bisphenol A (2,2- Bis(4-hydroxyphenyl)propan), hydriertes Bisphenol A (2,2-Bis(4-hydroxycyclohexyl)propan), so- wie Trimethylolpropan, Glycerin oder Pentaerythrit und Mischungen dieser und gegebenenfalls auch weiterer niedermolekularer Polyole. Auch Esterdiole wie z.B. α-Hydroxybutyl-ε-hydroxy- capronsäureester, ω-Hydroxyhexyl-γ-hydroxybuttersäure-ester, Adipinsäure-(ß-hydroxyethyl)ester oder Terephthalsäure-bis(ß-hydroxyethyl)-ester können verwendet werden.
Die Menge an Polyolkomponente bei der Herstellung der Polyurethanharnstoffe beträgt vorzugs- weise 0,05 bis 2,0 mol, besonders bevorzugt 0,05 bis 1,5 mol, insbesondere 0,1 bis 1,0 mol bezogen auf 1 mol der Polycarbonatkomponente.
Die Umsetzung der Polyisocycantkomponente mit der Polycarbonatpolyol- und der Diaminokomponente erfolgt üblicherweise unter Einhaltung eines leichten NCO-Überschusses gegenüber den reaktiven Hydroxy- oder Aminverbindungen. Am Endpunkt der Reaktion durch Erreichen einer Zielviskosität verbleiben immer noch Reste an aktivem Isocyanat. Diese Reste müssen blockiert werden, damit nicht eine Reaktion mit großen Polymerketten stattfindet. Eine solche Reaktion führt zur dreidimensionalen Vernetzung und Vergelung des Ansatzes. Die Verarbeitung einer solchen Lösung ist nicht mehr möglich. Um die verbliebenen freien NCO-Gruppen zu blockieren, kann mit einer Blockkomponente umgesetzt werden. Diese Blockkomponenten leiten sich beispielsweise von monofunktionellen, mit NCO-Gruppen reaktiven Verbindungen ab, wie Monoaminen, insbesondere mono-sekundären Aminen oder Monoalkoholen. Genannt seien hier beispielsweise Ethanol, n-Butanol, Ethylengly- kol-monobutylether, 2-Ethylhexanol, 1-Octanol, 1-Dodecanol, 1-Hexadecanol, Methylamin, Ethy- lamin, Propylamin, Butylamin, Octylamin, Laurylamin, Stearylamin, Isononyloxypropylamin, Di- methylamin, Diethylamin, Dipropylamin, Dibutylamin, N-Methylaminopropylamin, Diethyl(me- thyl)aminopropylamin, Morpholin, Piperidin und geeignete substituierte Derivate davon.
Da die Blockkomponente vor allem dazu verwendet wird, den NCO-Überschuss zu vernichten, hängt die erforderliche Menge im Wesentlichen von der Menge des NCO-Überschusses ab und kann nicht allgemein spezifiziert werden.
Wurde bei der Herstellung der Polyurethanharnstoffe der Restisocyanatgehalt blockiert, weisen diese auch Monomere als Aufbaukomponenten auf, die sich jeweils an den Kettenenden befinden und diese abschließen.
Bevorzugt wird jedoch bei der Synthese auf eine zusätzlich hinzugefügte Blockkomponente verzichtet. Statt dessen werden die verbliebenen freien Isocyanatgruppen mit in sehr hoher Konzentration im Ansatz enthaltenem Lösungsmittelalkohol zu terminalen Urethanen umgesetzt. So blockiert der Alkohol innerhalb von mehreren Stunden Stehen oder Rühren des Ansatzes bei Raumtemperatur die noch verbliebenen Isocyanatgruppen.
Zur Herstellung der Polyurethanharnstofflösungen werden die Polycarbonatpolyol-, die Polyisocy- anat- und die Diaminokomponente in einer Schmelze oder in Lösung miteinander umgesetzt, bis alle Hydroxylgruppen verbraucht sind. Dann wird Lösemittel zugesetzt.
Die Stöchiometrie zwischen den einzelnen an der Umsetzung beteiligten Komponenten ergibt sich aus den zuvor erwähnten Mengenverhältnissen.
Die Umsetzung erfolgt bei einer Temperatur von vorzugsweise zwischen 60 und 110 0C, besonders bevorzugt 75 bis 110 0C, insbesondere 90 bis 110 0C, wobei Temperaturen um 110 0C aufgrund der Geschwindigkeit der Umsetzung bevorzugt sind. Noch höhere Temperaturen sind ebenfalls möglich, allerdings besteht dann im Einzelfall und in Abhängigkeit der verwendeten Bestandteile das Risiko, dass Zersetzungsprozesse und Verfärbungen in dem entstehenden Polymer auftreten.
Zur Beschleunigung der Isocyanatadditionsreaktion können die in der Polyurethan-Chemie bekannten Katalysatoren eingesetzt werden, zum Beispiel Dibutyzinndilaurat. Bevorzugt ist aber die Synthese ohne Katalysator. Bei dem Prepolymer aus Isocyanat und allen Hydroxylgruppen aufweisenden Komponenten ist die Umsetzung in Schmelze bevorzugt, allerdings besteht die Gefahr, dass es zu hohen Viskositäten der ausreagierten Gemische kommt. In diesen Fällen empfiehlt es sich, Lösemittel hinzugegeben. Es sollte aber möglichst nicht mehr als ungefähr 50 Gew.-% Lösemittel enthalten sein, da andern- falls die Verdünnung die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich verringert.
Bei der Umsetzung von Isocyanat und den Hydroxylgruppen aufweisenden Komponenten kann die Reaktion in der Schmelze in einem Zeitraum von 1 Stunde bis 24 Stunden erfolgen. Geringe Zugabe von Lösungsmittelmengen fuhren zu einer Verlangsamung, wobei die Gesamtumsetzungszeit jedoch in den genannten Zeiträumen liegt.
Die Reihenfolge der Zugabe bzw. Umsetzung der einzelnen Bestandteile kann von der zuvor angegebenen Reihenfolge abweichen. Dieses kann insbesondere dann von Vorteil sein, wenn die mechanischen Eigenschaften der resultierenden Beschichtungen verändert werden sollen. Wenn man beispielsweise alle Hydroxylgruppen aufweisenden Komponenten gleichzeitig umsetzt, entsteht ein Gemisch aus Hart- und Weichsegmenten. Wenn man beispielsweise das Polyol nach der PoIy- carbonatpolyolkomponente zugibt, erhält man definierte Blöcke, was andere Eigenschaften der resultierenden Beschichtungen mit sich bringen kann. Die vorliegende Erfindung ist somit nicht auf eine bestimmte Reihenfolge der Zugabe bzw. Umsetzung der einzelnen Bestandteile beschränkt.
Die Zugabe des Lösemittels erfolgt vorzugsweise schrittweise, um die Reaktion nicht unnötig zu verlangsamen, was bei einer vollständigen Zugabe der Lösemittelmenge beispielsweise am Anfang der Umsetzung passieren würde. Ferner ist man bei einem hohen Gehalt an Lösemittel zu Beginn der Reaktion an eine im Verhältnis niedrige Temperatur gebunden, welche von der Art des Lösemittels zumindest mitbestimmt wird. Auch dieses führt zu einer Verlangsamung der Reaktion.
Nach Erreichen der Zielviskosität können die noch verbleibenden Reste an NCO durch ein mono- funktionelles aliphatisches Amin blockiert werden. Bevorzugt blockiert man die noch verbliebenen Isocyanatgruppen durch Umsetzung mit den im Lösungsmittelgemisch enthaltenen Alkoholen.
Als Lösemittel für die Herstellung der Polyurethanharnstoff-Lösungen kommen alle denkbaren Lösemittel und Lösemittelgemische wie Dimethylformamid, N-Methylacetamid, Tetramethylharnstoff, N-Methylpyrrolidon, aromatische Lösemittel wie Toluol, lineare und cyclische Ester, Ether, Ketone und Alkohole in Frage. Beispiele für Ester und Ketone sind Ethylacetat, Butylacetat, Aceton, γ-Butyrolacton, Methylethylketon und Methylisobutylketon. Bevorzugt sind Mischungen aus Alkoholen mit Toluol. Beispiele für Alkohole, die gemeinsam mit Toluol verwendet werden können, sind Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol und l-Methoxy-2- propanol.
Im Allgemeinen wird bei der Umsetzung so viel Lösemittel eingesetzt, dass man ungefähr 10 bis 50 gew.-%ige Lösungen, bevorzugt ungefähr 15 bis 45 gew.-%ige Lösungen und besonders bevorzugt ungefähr 20 bis 40 gew.-%ige Lösungen, erhält.
Der Feststoffgehalt der Polyurethanharnstofflösungen liegt im Allgemeinen im Bereich von 1 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise von 10 bis 40 Gew.-%. Für Beschichtungsversuche können die Polyurethanharnstofflösungen beliebig mit Toluol/ Alkohol-Gemischen verdünnt werden, um die Dicke der Beschichtung variabel einzustellen.
Es können beliebige Schichtdicken erreicht werden wie beispielsweise einige 100 nm bis hinauf zu einigen 100 μm, wobei im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch höhere und geringere Dicken möglich sind.
Die Polyurethanharnstofflösungen können ferner für den jeweils angestrebten Einsatzzweck übli- che Bestandteile und Additive enthalten.
Weitere Zusätze wie beispielsweise Antioxidantien oder Pigmente können ebenfalls verwendet werden. Darüber hinaus können gegebenenfalls noch weitere Zusätze wie Griffhilfsmittel, Farbstoffe, Mattierungsmittel, UV-Stabilisatoren, Lichtstabilisatoren, Hydrophilierungsmittel, Hydrophobierungsmittel und/oder Verlaufshilfsmittel verwendet werden.
Die Polyurethanharnstofflösungen können zusätzlich Proteine enthalten. Vorzugsweise kann es sich dabei um Proteine der extrazellulären Matrix handeln.
Beschichtungen aus den Polyurethanharnstofflösungen können mittels verschiedener Verfahren auf den Zellkulturträger aufgebracht werden. Geeignete Beschichtungstechniken sind beispielswei- se Rakeln, Drucken, Transferbeschichten, Sprühen, Spincoating oder Tauchen.
Beschichtet werden können vielerlei Substrate wie Glas, Siliciumwafer, Metalle, Keramiken und Kunststoffe. Bevorzugt ist die Beschichtung von Zellkulturträgern aus Glas, Siliciumwafer, Kunststoff oder Metallen. Als Metalle können beispielsweise genannt werden: Medizinischer Edelstahl und Nickel-Titan-Legierungen. Es sind viele Polymermaterialien denkbar, aus denen der Zellkul- turträger aufgebaut sein kann, beispielsweise Polyamid; Polystyrol; Polycarbonat; Polyether; Polyester; Polyvinylacetat; natürliche und synthetische Kautschuke; Blockcopolymere aus Styrol und ungesättigten Verbindungen wie Ethylen, Butylen und Isopren; Polyethylen oder Copolymeren aus Polyethylen und Polypropylen; Silikon; Polyvinylchlorid (PVC) und Polyurethanen. Zur besseren Haftung des erfindungsgemäßen Polyurethane auf dem Zellkulturträger können als Untergrund vor dem Auftragen dieser Beschichtungsmaterialien noch weitere geeignete Beschichtungen aufgetragen werden. Besonders bevorzugt ist die Beschichtung von Glas oder Siliciumwafern zur Herstel- lung von Zellkulturträgern.
Die Vorteile der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Zellkulturträgern insbesondere für die Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen werden durch die nachfolgend aufgeführten Bespiele belegt.
Beispiele
Die Ermittlung des NCO-Gehaltes der in den Beispielen und Vergleichsbeispielen beschriebenen Harze erfolgte durch Titration gemäß DIN EN ISO 11909.
Die Bestimmung der Festkörpergehalte erfolgte nach DIN-EN ISO 3251. Es wurden 1 g Polyu- rethandispersion bei 115 0C bis zur Gewichtskonstanz (15-20 min) mittels eines Infrarottrockners getrocknet.
Die in % angegebenen Mengenangaben verstehen sich, wenn nicht anders vermerkt, als Gew.-% und beziehen sich auf die erhaltene wässrige Dispersion.
Viskositätsmessungen wurden mit dem Physics MCR 51 Rheometer der Firma Anton Paar GmbH, Ostfϊldern, Deutschland, durchgeführt.
Verwendete Substanzen und Abkürzungen:
Desmophen C2200: Bayer MaterialScience AG, Leverkusen, Deutsch- land
Polycarbonatpolyol, OH-Zahl 56 mg KOH/g, zahlenmittleres Molekulargewicht 2000 g/mol
PoIyTHF 2000 BASF AG, Ludwigshafen, Deutschland
Polytetramethylenglykolpolyol, OH-Zahl 56 mg KOH/g, zahlenmittleres Molekulargewicht 2000 g/mol
Zelllinie C3H10T0.5 Mesenchymale Zelllinie (Spezies Maus), Clone 8, wurde von American Type Culture Collection (ATTC), Manassass, VA, USA bezogen, ATCC Nummer CCL-226
Zelllinie C2C 12 Multipotente Zelllinie (Spezies Maus), wurde von der American Type Culture Collection (ATTC), Manassass, VA, USA bezogen, ATCC Nummer CRL-1772
Fötales Kälberserum (FBS) Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Bone Morphogenic Protein 2 (BMP-2) Wyeth Pharma GmbH, Münster, Deutschland
Es handelt sich um ein menschliches rekombinan- tes Knochen-Morphogeneseprotein-2 (rhBMP-2), dass in einer rekombinanten Ovarialzelllinie der chinesischen Hasters (CHO) produziert wurde; (Dibotermin alfa)
IST+ BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland
Zusammensetzung: Insulin 6,25 μg/ml Transferin 6,25 μg/ml Selenige Säure 6,25 ng/ml Rinder Serum Albumin 1,25 mg/ml Linolsäure 5,35 μg/ml
Eagle's Basal Medium (BME)(IX) Gibco/Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland, Katalog Nr. 41010
Flüssigkeit mit Earle's Salts, ohne L-Glutamin
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco/Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland, (D- MEM) (IX), liquid (High Glucose) Katalog Nr. 31966
Produkt relevante Spezifikationen:
Glucose: hoher Glucosegehalt (4500mg/L)
Glutamine: GlutaMAX™-! HEPES Puffer: kein HEPES
Natriumpyruvat Zusatz: Natriumpyruvat 110 mg/L
Dulbecco's Modifϊed Eagle Medium Gibco/Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland, (D- MEM) ( 1 X), liquid (low Glucose) Katalog Nr. 21885
Produkt relevante Spezifikationen:
Glucose: hoher Glucosegehalt (1000mg/L)
Glutamine: GlutaMAX™-I
HEPES Puffer: kein HEPES
Natriumpyruvat Zusatz: Natriumpyruvat 110 mg/L
Glutamax™ 200 mM Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland, Katalog Nr. 35050038
Wird dem Eagle 's Basal Medium zugesetzt, um eine 2mM Endkonzentration zu erhalten.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Alamar Blue Gibco/Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
Die weiteren Bestandteile für DMEM (gilt für beide oben aufgeführten Medien) und BME können bei Invitrogen eingesehen werden und sind nicht herstellerspezifisch. Es wurden Mikrotiterplatten aus Tissue Culture Polystyrene (TPS) der Techno Plastic Products (TPP), Trasadingen, Schweiz verwendet.
Beispiel 1:
500,0 g Desmophen C 2200, 104,6 g Isophorondiisocyanat und 126,6 g Toluol wurden bei 110 0C bis zu einem konstanten NCO-Gehalt von 2,5 % umgesetzt. Man ließ abkühlen und verdünnte mit 500,0 g Toluol und 377,8 g iso-Propanol. Bei Raumtemperatur wurden eine Lösung von 34,7 g 4,4'-Diaminodicyclohexylmethan in 308,4 g l-Methoxypropanol-2 gelöst zugegeben. Nach beendetem Aufbau des Molgewichtes und Erreichen des gewünschten Viskositätsbereiches ließ man über Nacht bei Raumtemperatur stehen, um den restlichen Isocyanatgehalt mit iso-Propanol oder l-Methoxypropanol-2 zu blockieren. Man erhielt 1952 g einer 33,4%igen Polyurethanharnstofflösung in Toluol/iso-Propanol/l-Methoxypropanol-2 mit einer Viskosität von 21200 mPas bei 22 0C.
Beispiel 2;
300,0 g Desmophen C 2200, 11,2 g 1,2-Dodekandiol (90%ig), 104,6 g Isophorondiisocyanat und 80,0 g Toluol wurden bei 110 0C bis zu einem konstanten NCO-Gehalt von 4,5 % umgesetzt. Man ließ abkühlen und verdünnte mit 350,0 g Toluol und 350,0 g iso-Propanol. Bei Raumtemperatur wurden eine Lösung von 52,5 g 4,4'-Diaminodicyclohexylmethan in 353,9 g l-Methoxypropanol-2 gelöst zugegeben. Nach beendetem Aufbau des Molgewichtes und Erreichen des gewünschten Viskositätsbereiches ließ man über Nacht bei Raumtemperatur stehen, um den restlichen Isocyanatgehalt mit iso-Propanol oder l-Methoxypropanol-2 zu blockieren. Man erhielt 1602 g einer 35,8%igen Polyurethanharnstofflösung in Toluol/iso-Propanol/ l-Methoxypropanol-2 mit einer Viskosität von 25000 mPas bei 22 0C.
Beispiel 3:
400,0 g Desmophen C 2200, 104,6 g Isophorondiisocyanat und 126,6 g Toluol wurden bei 110 0C bis zu einem konstanten NCO-Gehalt von 3,6 % umgesetzt. Man ließ abkühlen und verdünnte mit 422,4 g Toluol und 377,8 g iso-Propanol. Bei Raumtemperatur wurden eine Lösung von 22,9 g l,3-Diamino-2-propanol in 357,7 g l-Methoxypropanol-2 gelöst zugegeben. Nach beendetem Auf- bau des Molgewichtes und Erreichen des gewünschten Viskositätsbereiches ließ man über Nacht bei Raumtemperatur stehen, um den restlichen Isocyanatgehalt mit iso-Propanol oder 1- Methoxypropanol-2 zu blockieren. Man erhielt 1812 g einer 30,5%igen Polyurethanharnstofflö- sung in Toluol/iso-Propanol/l-Methoxypropanol-2 mit einer Viskosität von 37000 mPas bei 22 °C.
Beispiel 4:
320,0 g Desmophen C 2200, 104,6 g Isophorondiisocyanat und 126,6 g Toluol wurden bei 110 0C bis zu einem konstanten NCO-Gehalt von 4,7 % umgesetzt. Man ließ abkühlen und verdünnte mit 360 g Toluol und 377,8 g iso-Propanol. Bei Raumtemperatur wurden eine Lösung von 26,4 g 1,3- Diamino-2-propanol in 369,6 g l-Methoxypropanol-2 gelöst zugegeben. Nach beendetem Aufbau des Molgewichtes und Erreichen des gewünschten Viskositätsbereiches rührte man 4 h nach, um den restlichen Isocyanatgehalt mit iso-Propanol oder l-Methoxypropanol-2 zu blockieren. Man erhielt 1685 g einer 27,2%igen Polyurethanharnstofflösung in Toluol/iso-Propanol/1- Methoxypropanol-2 mit einer Viskosität von 41000 mPas bei 22 0C.
Beispiel 5: (Vergleich)
400,0 g PoIyTHF 2000, 104,6 g Isophorondiisocyanat und 126,6 g Toluol wurden bei 110 0C bis zu einem konstanten NCO-Gehalt von 3,6 % umgesetzt. Man ließ abkühlen und verdünnte mit 422,4 g Toluol und 377,8 g iso-Propanol. Bei Raumtemperatur wurden eine Lösung von 48,4 g 4,4'-Diaminodicyclohexlmethan in 327,5 g l-Methoxypropanol-2 gelöst zugegeben. Nach beendetem Aufbau des Molgewichtes und Erreichen des gewünschten Viskositätsbereiches ließ man über Nacht bei Raumtemperatur stehen, um den restlichen Isocyanatgehalt mit iso-Propanol oder 1- Methoxypropanol-2 zu blockieren. Man erhielt 1807 g einer 30,9%igen Polyurethanharnstofflösung in Toluol/iso-Propanol/l-Methoxypropanol-2 mit einer Viskosität von 27800 mPas bei 22 0C.
Beispiele 6a-e;
Herstellung der Zellkulturträger durch Beschichtung mit Polyurethanlösungen
Die Beschichtungen wurden auf Glasobjektträgern der Größe 25x25 mm mit Hilfe eines Spincoa- ters (RC5 Gyrset 5, Karl Süss, Garching, Deutschland) hergestellt. Ein Objektträger wurde hierzu auf dem Probenteller des Spincoaters eingespannt und mit ca. 0,5 - 1 ml organischer 5%iger Polyurethanlösung homogen bedeckt. Alle organischen Polyurethanlösungen wurden mit einem Löse- mittelgemisch aus 65 Gew% Toluol und 35 Gew% iso-Propanol (2: 1) auf einen Polymergehalt von 5 Gew% verdünnt. Durch Rotation des Probentellers für 120 sec bei 3000 Umdrehungen pro Minute erhielt man eine homogene Beschichtung, die 2 h bei 60 getrocknet wurde. Die so erhaltenen Polyurethanbeschichtungen wurden vor dem Einsatz für Zellkulrurexperimente bei Raumtemperatur mit einer Dosis von 50 kGy γ-sterilisiert.
Tabelle 1 : Aus den Rohmaterialien der Beispiele 1-5 hergestellte Beschichtungen
Beispiel 7:
Untersuchung des Zellwachstums auf nativen PU-Oberflächen
a) allgemeine Vorschrift für die Zellkultur der multipotenten Zelllinie C2C12
Multipotente Zellen C2C12 aus Maus wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), welches 10 % fötales Kälberserum (FBS) enthält, 2 bis 3 Tage bei 37 0C in einer befeuchteten, 5 % Kohlendioxid enthaltenen Atmosphäre kultiviert. Die Zellen wurden mit etwa 85%iger Bedeckung subkultiviert, in dem die Zellen zweimal mit PBS gespült wurden und anschließend 5 min mit Trypsin-EDTA behandelt wurden, um die Zellen von der Kulturoberfläche abzulösen. Anschließend wurden die Zellen in DMEM aufgenommen, abzentrifugiert und in einer Zelldichte von 700 Zellen/cm2 ausplatiert.
Für die Proliferationsstudie wurden die Zellen ebenfalls mit einer Dichte von etwa 700 Zellen/ml auf die nativen Polyurethansubstrate der Beispiele 6a-e besiedelt. Zur Kontrolle wurden die glei- chen Zelldichten auf Polystyrol (Tissue Culture Polystyrene, (TCP)) und auf Glas besiedelt. Nach
24 h bei 37°C in einer befeuchteten, 5 % Kohlendioxid enthaltenden Atmosphäre wurde die mito- chondriale Respiration durch Alamar Blue gemäß des Herstellerprotokolls (zur Methode siehe J. Immunol. Methods 1997, 204, 205) bestimmt. Hierzu wurde zu bestimmten Zeitpunkten der Zellkultur 15 % Alamar Blue zugesetzt und 4 h bei 37 0C inkubiert. Das Zellkulturmedium wurde abpipettiert und die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 570 und 630 nm unverdünnt gemes- sen (Tecan Genios Miroplate Reader). Um die Umsetzung von Alamar Blue durch Zellrespiration nachzuweisen, wird das Absorptionsverhältnis von metabolisiertem Alamar Blue und unverbrauchtem Alamar Blue gebildet. Die gemessenen optischen Dichten wurden als relative Einheiten ausgewertet.
Der Zellkultur wurde für weitere Untersuchungen frisches Zellkulturmedium zugefügt. Die Unter- suchung der Zellkonzentration wurde jeden weiteren Tag auf die oben beschriebene Weise wiederholt.
b) allgemeine Vorschrift für die Zellkultur von mesenchymaler Zelllinie C3H10T0.5
Mesenchymale Stammzellen C3H10T0.5 aus Maus wurden in Eagle's Basal Medium kultiviert, welches Glutamax und Earle's Salz, angereichert mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), enthielt. Die Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre unter Zusatz von 5 % Kohlendioxid gehalten. Die Zellen wurden mit etwa 70%iger Bedeckung, wie im Beispiel 7 a für die multipotenten Zellen C2C12 beschrieben, subkultiviert mit einer Konzentration von 2x103 Zellen/cm2 ausplattiert. Diese niedrigen Ausplattierdichten wurden gewählt, um eine Kontaktinhibierung und die Selektion von Zellvarianten zu verhindern.
Für die Proliferationsstudie wurden die Zellen mit einer Dichte von etwa 700 Zellen/cm2 auf die nativen Polyurethansubstrate der Beispiele 6a-e besiedelt. Zur Kontrolle wurden die gleichen Zelldichten auf Polystyrol (Tissue Culture Polystyrene) und auf Glas besiedelt. Nach 24 h bei 37°C wurde die mitochondriale Respiration durch Alamar Blue gemäß des Herstellerprotokolls wie im Beispiel 7 a beschrieben bestimmt. c) Ergebnisse mit C2C12
Tabelle 2: Wachstum der C2C12-Zellen auf den hergestellten Beschichtungen (Relative Einheiten)
Die erfϊndungsgemäßen Beschichtungen der Beispiele 6a, 6b und 6c erlauben ein Wachstum, welches dem Wachstum auf dem bisher gebräuchlichen Tissue Culture Polystyrene vergleichbar ist. Die Vergleichsbeschichtung des Beispiels 6e ermöglicht dagegen kein Wachstum der Zelllinien und ist somit als Kulturträger nicht verwendbar.
d) Ergebnisse mit C3H10T0.5
Tabelle 3: Wachstum der C3H10T0.5-Zellen auf den hergestellten Beschichtungen (Relative Einheiten)
Die Beschichtungen der Beispiele 6a, 6b und 6c erlauben ein Wachstum, welches dem Wachstum auf dem bisher gebräuchlichen Tissue Culture Polystyrene vergleichbar ist. Die Vergleichsbe- schichtung des Beispiels 6e ermöglicht dagegen kein Wachstum der Zelllinien und ist somit als Kulturträger nicht verwendbar.
In einer weiteren Versuchsserie wurde das Wachstum der C3H10T0.5-Zellen auf der Beschichtung 6d gegenüber dem Zellwachstum auf Tissue Culture Polystyrene verglichen.
Tabelle 4: Wachstum der C3H10T0.5-Zellen auf der erfϊndungsgemäßen Beschichtung des Beispiels 6d (Relative Einheiten)
Die erfindungsgemäße Beschichtung des Beispiels 6d erlaubt ein Wachstum, welches dem Wachstum auf dem bisher gebräuchlichen Tissue Culture Polystyrene vergleichbar ist.
Die Wachstumsversuche der Tabellen 3 und 4 sind an verschiedenen Tagen durchgeführt worden. Aufgrund der signifikanten Schwankungsbreite zellbiologischer Versuchsreihen benötigt jedes dieser Experimente einen internen Standard, hier das Tissue Culture Polystyrene (TCP). Die absoluten Werte der Wachstumskurven zwischen verschiedenen Experimenten können nicht direkt miteinander verglichen werden. Der Bezug beider Experimente auf den internen Standard zeigt aber ganz deutlich, dass das Wachstum sowohl auf den Beschichtungen der Beispiele 6 a, 6 b und 6c als auch auf der Beschichtung des Beispiels 6d dem Standard TCP vergleichbare Ergebnisse ergibt.
Beispiel 8:
Zellwachstum der Zelllinie C3H10T0.5 ohne Differenzierung
a) allgemeine Vorschrift:
Mesenchymale Stammzellen C3H10T0.5 aus Maus wurden in Eagle's Basalmedium kultiviert, welches Glutamax und Earle's Salz, angereichert mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), enthielt. Die Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre unter Zusatz von 5 % Kohlendioxid gehalten. Die Zellen wurden mit etwa 70%iger Bedeckung subkultiviert und mit einer Konzentration von 2x103 Zellen/cm2 ausplattiert. Diese niedrigen Ausplattierdichten wurden gewählt, um eine Kontaktinhi- bierung und die Selektion von Zellvarianten zu verhindern.
Zur Untersuchung des Vermögens der Polyurethanbeschichtungen zur Inhibierung der osteogenen Differenzierung wurden die Zellen in Gegenwart von BMP-2 (Bone morphogenetic protein) kultiviert. Die Bedingungen sind dieselben wie in Beispiel 7 b beschrieben, nur dass das BMP-2 zusätzlich in das Zellkulturmedium gegeben wird. Zur Förderung der Mineralisierung wurde zusätzlich noch 200 μM Ascorbinsäure und 10 mM Glycerolphosphat zugegeben. BMP-2 ist ein bekanntes Mittel zur Induktion der osteogenen Differenzierung. Hierzu wurde auf eine native Polyurethanbe- schichrung des Beispiels 6d mesenchymale Stammzellen C3H10T0.5 in einer Konzentration von 1,25x104 Zellen/cm2 in Vollmedium unter Zusatz von 500 ng/ml BMP-2 ausplattiert. Als Kontrolle wurden bei gleichen Versuchsbedingungen dieselben Zellkulturen auf TCP und auf Glas ausgesät. Während der Differenzierung der Stammzellen zu Osteoblasten wird der Gehalt des Enzyms Alka- lische Leukozyten Phosphatase (ALP) als Marker für das Maß der Differenzierung verwendet. Zur Bestimmung der ALP wurden Zellen aus der Kultur entnommen, mit PBS gewaschen und unter Zusatz von 1 Vol% Triton X-100 durch Einfrieren lysiert.
Das Reagenz zur Bestimmung der Alkalischen Leukozyten Phosphatase wurde hergestellt durch Zugabe von 5 ml 16 mM p-Nitrophenolphosphat und 20 μl einer 1 M wässrigen MgCl2-Lösung zu 5 ml Natriumborat - Natriumhydroxid-Puffer mit einem pH von 9,8.
50 μl Zelllylsate wurden mit 200 μl Reagenz der oben genannten Zusammensetzung bei 37 0C inkubiert und die Reaktion der Farbbildung bei 410 nm kontinuierlich verfolgt. Die Aktivität der ALP wurde mit einem BCA Assay der Firma Pierce auf einen Gesamtproteingehalt standardisiert, um spezifische ALP-Aktivitäten mit der Einheit mmol/min/mg Protein zu erhalten. Zur Kontrolle wurden undifferenzierte Zellen bei einer Dichte von 1,25x104 Zellen/cm2 wie beschrieben auf die Aktivität der ALP untersucht.
b) Ergebnisse
Tabelle 5: Effekt der Beschichtung des Beispiels 6d auf die Verhinderung der Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen C3H10T0.5 in Kontrollmedium ohne BMP-2 als Induktionsmittel (Werte sind Aktivität der Alkalischen Leukozyten Phosphatase in nmol/min/mg Protein)
Die Aktivität der Alkalischen Leukozyten Phosphatase ist nach Zellkultur auf dem Polyurethanfilm des Beispiels 6d deutlich geringer als die Aktivität nach Kultur auf Tissue Culture Polystyrene oder auf Glass. Bei der in-vitro-Kultivierung kommt es auf dem Polyurethanfilm zu wenig vorzei- tiger Differenzierung der Zellen, was gegenüber den bisher üblichen Materialien wir Tissue Culture Polystyrene oder Glas von Vorteil ist.
Tabelle 6: Effekt der Beschichtung des Beispiels 6d auf die Verhinderung der Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen C3H1OTO.5 in Kontrollmedium unter Zusatz von BMP-2 als Induktionsmittel der osteogenen Differenzierung (Werte sind Aktivität der Alkalischen Phosphatase in nmol/min/mg Protein)
Die Aktivität der ALP ist nach Zellkultur auf dem Polyurethanfilm des Beispiels 6d deutlich geringer als die Aktivität nach Kultur auf Tissue Culture Polystyrene oder auf Glas. Durch den Zusatz des Induktionsmittels BMP-2 steigt die Differenzierung der mesenchymalen Zellkultur auf den bisher üblichen Zellkulturträgern Polystyrol oder Glas deutlich an (Vergleiche Werte der Tabellen 5 und 6). Auf dem erfindungsgemäßen Polyurethanfilm kommt es während der in-vitro- Kultivierung trotz Gegenwart des Induktionsmittels zu keiner erhöhten vorzeitigen Differenzierung der Zellen. Beispiel 9:
Zellwachstum von humanen mesenchymalen Stammzellen ohne Differenzierung auf nativer PU- Beschichtung Beispiel 6d
a) Allgemeine Präparation der Stammzellen aus Menschen
Menschliche mesenchymale Stammzellen wurden aus Knochenmark von gesunden Spendern gemäß der Vorschrift von Oswald et al., Stern Cells 2004, 22, 377-384 isoliert. Die Zellen wurden einem Spender durch Punktion aus dem Beckenkamm entnommen. Aus dem Zellgemisch der Punktion wurden mononukleäre Zellen isoliert, indem durch Dichtegradientenzentrifugation die Erythrozyten entfernt werden. Die mononuklären Zellen werden in eine Zellkulturflasche gegeben, so dass die mesenchymalen Stammzellen auf dem Substrat adhärieren. Die Zellkultur besteht aus DMEM mit einem Anteil von 1 g/l Glucose und 10 Vol% fötalem Kälberserum. Kultiviert wurden die Zellen bei 37 0C in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 5 % Anteil an Kohlendioxid. Die Zeit der Kultur ist spenderabhängig, dauerte im beschriebenen Fall 2 Wochen.
Die restlichen Erythrozyten werden nach 72 h heruntergewaschen. Die verbleibenden mesenchy- malen Stammzellen vermehren sich in der Zellkultur. Nach Ernten wird phenotypisch charakterisiert und das Differenzierungsverhalten bestimmt.
Subkultiviert wurden die Zellen bei einem Bedeckungsgrad von etwa 80 % für maximal fünf Passagen. Die so erhaltenen Zellen wurden mit einer Zelldichte von 1 x 104 Zellen/cm2 auf die Polyu- rethanbeschichtung des Beispiels 6d ausplattiert. Zur Kontrolle wurden dieselben Zellkulturen auf TCP und auf Glas ausplattiert.
Die Kultivierung der humanen mesenchymalen Stammzellen erfolgt wie im Beispiel 7 a.
Die Untersuchung der osteogenen Differenzierung erfolgte in DMEM unter Zusatz von 10 Vol% FBS sowie humanem rekombinantem BMP-2 (200 ng/ml) unter weiterem Zusatz von 200 μM As- corbinsäure und 10 mM Glycerolphosphat durch Aussäen auf Polyurethanfϊlmen des Beispiels 6d. Das Verfahren ist dasselbe wie in Beispiel 8 nur dass hier im Fall der menschlichen mesenchymalen Stammzellen die Zellkultur am vierten Tag ohne Zugabe von fötalem Kälberserum weitergearbeitet wird. Als Kontrollen wurden die Zellen auf TCP und auf Glas ausgesät. Am Tag 4 wurde das Medium zu DMEM gewechselt, welches ITS+ (Mediumzusatz aus: Insulin 6.25 mg/ml; Trans- ferrin 6,25 mg/ml; Selenige Säure 6,25 μg/ml; Rinderserumalbumin 0,125 g/ml und Linolsäure 5,35 mg/ml) enthielt und welchem frisches BMP-2 zugesetzt wurde. Die Aktivität der Alkalischen Leukozyten Phosphatase zur Bewertung der osteogenen Differenzierung erfolgte nach der Vorschrift des Beispiels 8 Weiterhin wurde als zweiter Marker für die Differenzierung der Zellen die Matrixmineralisation der Zellen durch Färben mit Alizarin S gemäß J. Jadlowiec et al., J. Biol. Chem. 2004, 279, 53323- 53330, bestimmt. Hierzu wurden die Zellen zu bestimmten Zeitpunkten entnommen, mit 0.5 ml PBS gewaschen und bei -20 0C für 1 h mit 0,5 ml Ethanol (70 Gew% in Wasser) fixiert. Die Zellen wurden dann mit 0,5 ml doppelt-destiliertem Wasser gewaschen und mit 0,5 ml einer wässrigen, mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 4,2 eingestellten, 40 nM Alizarinlösung gefärbt. Überschüssiges Alizarin wurde durch Waschen mit Wasser entfernt. Der in der Matrix der gebildeten Osteoblasten gebundene Farbstoff wurde durch zweistündiges Inkubieren der gefärbten Zellen bei RT in 300μl einer 10Gew%igen wässrigen Hexadecylpyridiniumchloridlösung gelöst und die optische Dichte dieser Lösung bei 570 nm bestimmt.
b) Ergebnisse für humane mesenchymale Stammzellen
Tabelle 7: Effekt der Beschichtung des Beispiels 6d auf die Verhinderung der Differenzierung von menschlichen mesenchymalen Stammzellen in Kontrollmedium ohne BMP-2 als Induktionsmittel (Werte sind Aktivität der Alkalischen Leukozyten Phosphatase in nmol/min/mg Protein)
Die Aktivität der Alkalischen Leukozyten Phosphatase ist nach Zellkultur auf dem Polyurethanfϊlm des Beispiels 6d deutlich geringer als die Aktivität nach Kultur derselben Zellen auf Tissue Cultu- re Polystyrene oder auf Glas. Bei der in-vitro-Kultivierung kommt es auf dem Polyurethanfϊlm zu wenig vorzeitiger Differenzierung der Zellen, was gegenüber den bisher üblichen Materialien wir Tissue Culture Polystyrene oder Glas von Vorteil ist. Tabelle 8: Effekt der Beschichtung des Beispiels 6d auf die Verhinderung der Differenzierung von menschlichen mesenchymalen Stammzellen in Kontrollmedium unter Zusatz von BMP-2 als Induktionsmittel (Werte sind Aktivität der Alkalischen Phosphatase in nmol/min/mg Protein)
Bei Zusatz von BMP-2 als Induktionsmittel beobachtet man bei den konventionellen Zellkulturträgern Polystyrol und Glas eine deutliche vorzeitige osteogene Differenzierung der Stammzellen. Der erfindungsgemäße Polyurethanfilm zeigt dagegen nur eine sehr geringe unerwünschte vorzeitige Differenzierung. Der absolute Wert der Aktivität der alkalischen Phosphatase ist nicht höher als derjenige ohne den Zusatz von BMP-s (siehe Tabelle 7).
Tabelle 9: Effekt der Beschichtung des Beispiels 6d auf die Verhinderung der osteogenen Differenzierung von menschlichen mesenchymalen Stammzellen in Kontrollmedium unter Zusatz von BMP-2 als Induktionsmittel (Werte sind optische Dichten der Alizarinbestimmung)
Die Färbung mit Alizarin zeigt ebenso wie der Nachweis der Aktivität der Alkalischen Leukozyten Phosphatase, dass in Gegenwart des Induktionsmittels BMP-2 der erfindungsgemäße Polyurethanfilm als Zellkulturmedium wesentlich weniger spontane, vorzeitige und unerwünschte Differenzie- rung der menschlichen mesenchymalen Stammzellen hervorruft als die konventionellen Zellkulturträger Polystyrol und Glas.
Die auf den erfindungsgemäßen Zellkulturträger vermehrten Stammzellen weisen nach der Entfernung von dem Träger noch das notwendige Differenzierungspotential auf und können entspre- chend, beispielsweise für das Tissue Engineering verwendet werden.

Claims

Patentansprflche
1. Verfahren zur Herstellung eines beschichteten Zellkulturträgers, bei dem eine Polyurethanharnstoff enthaltende Lösung auf einen Zellträger aufgebracht und getrocknet wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Polyurethanharnstoff durch Umsetzung min- destens einer Polycarbonatpolyolkomponente, mindestens einer Polyisocyanatkompo- nente und mindestens einer Diaminokomponente hergestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Diaminokomponente wenigstens eine Hydroxygruppe aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Polycarbonatpo- lyolkomponente eine zahlenmittlere Hydroxylfunktionalität von 1,7 bis 2,3, bevorzugt
1,8 bis 2,2 und besonders bevorzugt 1,9 bis 2,1 aufweist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das die Polycarbonatpolyolkomponente ein zahlenmittleres Molekulargewichte von 400 bis 6000 g/mol, bevorzugt von 500 bis 5000 g/mol, insbesondere von 600 bis 3000 g/mol aufweist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Polyurethanharnstoff ein zahlenmittleres Molekulargewicht von 1000 bis 200000 g/mol, bevorzugt von 5000 bis 100000 g/mol aufweist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Herstellung des Polyurethanharnstoffs zusätzlich eine Polyolkomponente mit umgesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass 0,05 bis 2,0 mol, bevorzugt 0,05 bis 1,5 mol und besonders bevorzugt 0,1 bis 1,0 mol der Polyolkomponente umgesetzt werden, bezogen auf 1 Mol der Polycarbonatkomponente.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyolkomponente ein zahlenmittleres Molekulargewicht von 62 bis 500 g/mol, bevorzugt von 62 bis 400 g/mol und besonders bevorzugt von 62 bis 200 g/mol aufweist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Herstellung der Polyurethanhamstoffkomponente 0,1 bis 3,0 mol, bevorzugt 0,2 bis 2,8 mol und besonders bevorzugt 0,3 bis 2,5 mol der Diaminokomponente, bezogen auf 1 mol der Polycarbonatkomponente, umgesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass bei der
Herstellung der Polyurethanharnstoffkomponente 1,0 bis 5,0 mol, bevorzugt 1,0 bis 4,5 mol und besonders bevorzugt 1,0 bis 4,0 mol der Polyisocyanatkomponente, bezogen auf 1 mol der Polycarbonatkomponente, umgesetzt werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Lö- sung zusätzlich Proteine, insbesondere Proteine der extrazellulären Matrix enthält.
12. Beschichteter Zellkulturträger, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
13. Verwendung eines Zellkulturträgers nach Anspruch 12 zur in- vitro Kultivierung von Stammzellen, insbesondere zur Kultivierung mesenchymalen Stammzellen.
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