EP2335049A1 - Procédé de recherche d'au moins un analyte dans un milieu susceptible de le contenir - Google Patents
Procédé de recherche d'au moins un analyte dans un milieu susceptible de le contenirInfo
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- EP2335049A1 EP2335049A1 EP09782890A EP09782890A EP2335049A1 EP 2335049 A1 EP2335049 A1 EP 2335049A1 EP 09782890 A EP09782890 A EP 09782890A EP 09782890 A EP09782890 A EP 09782890A EP 2335049 A1 EP2335049 A1 EP 2335049A1
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/4788—Diffraction
Definitions
- the hook layer is made so that the thickness e c is between 0 and 500 nm.
- the specific layer is made so that a report is less than 1, where e an aiyte is a thickness of an analyte layer
- sensitivity S means for calculating a relative signal variation, referred to as sensitivity S, by comparing, for the same diffractive system, the power measurement of the first order diffracted beam before and after an awareness step, that is, that is to say a step during which a probe is placed in temporary contact with a medium likely to contain an analyte and during which the possible analyte is attached to the probe, - means of presentation of the information characterizing the sensitivity S.
- the invention also relates to an analysis chip comprising a plurality of diffracting systems, comprising at least one probe, juxtaposed on a surface of a support.
- the analysis chip comprises at least two diffracting systems that differ in different periodic geometrical patterns and or at least one of their probe.
- FIG. 5a an illustration of the sensitivity as a function of a filling ratio according to the invention
- the analytes that can be detected include, but are not limited to, for example:
- probe By probe is meant a specific complement of the analyte, a material having an affinity with the analyte, capable of specifically binding the analyte.
- This material is for example:
- the diffraction field obtained after diffraction of the incident beam on the diffractive system is also a function of the geometric characteristics of the diffractive system, said geometrical characteristics being variable according to the presence or absence of the analyte on the probe of the diffractive system 2.
- the thickness e c of the adhesive layer constitutes a compromise between the sensitivity S and the power of the diffracted beam. As the thickness e c increases, the power of the diffracted beam increases but the sensitivity S decreases.
- the thickness e c is between 0 nm and 500 nm, preferably substantially of the order of 5 nm.
- the parallel lines 24 embossed include a second layer, of thickness e s and index n s , said specific layer 25, hooked analyte and comprises the probe A.
- Example 2 illustrates, from FIG. 4, the sensitivity S as a function of the ratio of the diffractive system, for different thicknesses e s of the
- FIG. 7a schematically illustrates the diffractive system produced for the implementation of the method.
- the diffracting system has a period of 1000 nm and is composed of 400 lines of 500 nm width.
- the first step in producing the diffractive system consists in depositing by molecular buffering the hooked layer 26.
- the second step consists in incubating the probe molecule, followed by rinsing with a phosphate buffered saline buffer, called PBS buffer.
- PBS buffer phosphate buffered saline buffer
- the last step is to incubate the analyte followed by rinsing with PBS buffer.
- the angle of the first order diffracted beam is 40 °.
- a measuring device 1 for searching for an analyte in a medium likely to contain it, as illustrated in FIG. 6, said analyte being linked to a probe forming a diffractive system 2 comprises: illumination means 3 of the system diffracting 2 by the coherent incident beam 31,
- the diffractive system (2) When the diffractive system (2) is made with the period p of the periodic geometric pattern lying between ⁇ and 2 ⁇ , so that only the first order diffraction beam is visible, there is no need to use optical separator, such as for example a prism, for separating the diffracted beams.
- optical separator such as for example a prism
- the measuring means 4, 5 comprise at least one detector 42, 51, a detector 51 intercepting the incident beam, for example by means of a semi-reflecting plate 9, and a detector 42 intercepting the first order diffracted beam.
- the detectors are for example a photosensitive element, such as a photodiode, or at least one photomultiplier or a CCD coupled matrix.
- the beams are directed through a waveguide, such as for example an optical fiber, to the detector.
- a single measurement means provides the function of the two measuring means 4, 5 by measuring the power of the incident beam and the power of the diffracted beam.
- the display means 71 are an image of the diffracting system with a color code according to the intensity of the diffracted beam, such as for example a blue color whose intensity increases with the intensity of the beam diffracted in the case where the sensitivity S is greater than Si, a red color whose intensity increases when the intensity of the diffracted beam decreases in the case where the sensitivity S is less than S2 and a black color in the case where the sensitivity is between Si and S 2 .
- a map of the support comprising all the diffracting systems is produced, each colored area of the map corresponding to a location of a diffractive system.
- the coloration corresponds to a color code according to the intensity of the diffracted beam, such as for example a blue color whose intensity increases with the intensity of the diffracted beam in the case where the sensitivity S is greater to Si, a red color whose intensity increases when the intensity of the diffracted beam decreases in the case where the sensitivity S is less than S2 and a black color in the case where the sensitivity is between S1 and S2.
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Abstract
L'invention concerne un procédé pour rechercher la présence d'un analyte lié à une sonde, dans lequel un motif géométrique périodique (24), constituant un système diffractant (2), est formé par une alternance de zones comportant une sonde A, et de zones ne comportant pas la sonde A. Le système diffractant (2) est réalisé pour être diffractant avant une étape de sensibilisation, c'est-à-dire une étape au cours de laquelle une sonde est mise en contact temporairement avec un milieu susceptible de contenir un analyte et au cours de laquelle l'éventuel analyte se fixe à la sonde. Le procédé comporte au moins les étapes de : - mesure d'une puissance P1 d'un faisceau de diffraction d'ordre 1 d'un champ de diffraction produit par le système diffractant, sonde non sensibilisée, - sensibilisation de la sonde A, - mesure d'une puissance P1a d'un faisceau de diffraction d'ordre 1 d'un champ de diffraction produit par le système diffractant, - comparaison des puissances mesurées P1 et P1a.
Description
Procédé de recherche d'au moins un analyte dans un milieu susceptible de le contenir
La présente invention appartient au domaine de la détection d'analyte. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour rechercher la présence d'au moins un analyte dans un milieu susceptible de le contenir.
La détermination de la présence de substances biologiques ou organiques dans des milieux est une étape importante, entre autre, dans le diagnostic de nombreuses maladies.
Les méthodes couramment utilisées pour cette détermination sont basées sur la formation d'une réaction spécifique de liaison entre un analyte, c'est à dire la substance à détecter, et un complémentaire spécifique de cet analyte, dit sonde, qui est une substance capable de fixer spécifiquement l'analyte.
Généralement, la réaction ainsi formée est mise en évidence par un marqueur associé à l'analyte, par exemple, un marqueur fluorescent.
Après mise en contact de la sonde avec le milieu susceptible de contenir l'analyte, la réaction spécifique est déterminée en réalisant une excitation des marqueurs fluorescents puis une détection de la lumière de fluorescence réémise par les marqueurs.
Cependant, la détection par fluorescence nécessite, en plus de la présence d'un marqueur, un contrôle négatif des mesures pour déterminer si une interaction spécifique, c'est à dire un accrochage de l'analyte avec son complémentaire, a bien eu lieu.
Une autre solution pour mettre en évidence la réaction formée, est l'utilisation d'un réseau de diffraction.
Il est connu que, lorsqu'un réseau est illuminé par une source lumineuse, le faisceau lumineux est diffracté par le réseau et une figure de diffraction est produite. Le champ de diffraction observé dépend entre autres des caractéristiques du réseau, comme par exemple, la période ou l'épaisseur du réseau.
Le brevet américain US 4876208 décrit un exemple de procédé de détection d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir. Suivant l'invention, le réseau comportant la sonde est réalisé de sorte à être non diffractant avant sa mise en contact temporaire avec un milieu susceptible de contenir l'analyte et à être diffractant si il y a formation de la réaction spécifique de liaison avec l'analyte. L'accroche de l'analyte à la sonde va modifier les caractéristiques du réseau, entre autre son épaisseur, créant ainsi un champ de diffraction.
La demande de brevet américain US 2002/0025534 décrit un dispositif et un procédé de détection d'analyte reposant sur le principe décrit dans le brevet US 4876208. Les technologies de lithographie utilisées pour la réalisation du réseau sont micrométriques, la période du réseau présentant une dimension supérieure au micromètre. Ceci engendre une faible séparation angulaire entre les différents ordres des faisceaux diffractés conduisant à une complexité de réalisation du dispositif de détection. Un autre inconvénient de l'invention réside dans l'utilisation d'un substrat structuré, donc non plan, ce qui complexifie la réalisation du réseau. De plus, l'invention décrit la possibilité de réaliser deux réseaux superposés permettant la détection de deux analytes différents. Les deux réseaux génèrent chacun un champ de diffraction différent, avec des ordres de diffraction spatialement différents. Ainsi, une mesure spécifique des faisceaux de diffraction de chaque champ est nécessaire afin de détecter les analytes correspondant à chaque réseau.
La présente invention propose un nouveau procédé pour rechercher la présence d'un analyte lié à une sonde, dans lequel un motif géométrique périodique, constituant un système diffractant, est formé par une alternance de zones comportant une sonde, dite sonde A, et de zones ne comportant pas la sonde A.
Suivant l'invention, le système diffractant est réalisé pour être diffractant avant une étape de sensibilisation, c'est-à-dire une étape au cours de laquelle une sonde est mise en contact temporairement avec un milieu susceptible de contenir un analyte et au cours de laquelle l'éventuel analyte se fixe à la sonde,
et le procédé comporte au moins les étapes : a) de mesure d'une puissance Pi d'un faisceau de diffraction d'ordre 1 d'un champ de diffraction produit par le système diffractant, sonde non sensibilisée, b) de sensibilisation de la sonde A, c) de mesure d'une puissance Pi3 d'un faisceau de diffraction d'ordre 1 d'un champ de diffraction produit par le système diffractant, d) de comparaison des puissances mesurées Pi et Pi3, lesdites étapes étant réalisées suivant l'ordre énuméré. Suivant l'invention, la période p du motif géométrique périodique est comprise entre λ et 2λ, λ correspondant à une longueur d'onde d'illumination du système diffractant, de manière à ce que seul le faisceau diffracté d'ordre 1 soit visible. Les technologies de lithographie utilisées pour la réalisation du motif géométrique sont des technologies à l'échelle nanométrique connues. De préférence, la comparaison est réalisée en déterminant une
P -P variation relative de signal, dite sensibilité S, à partir de la formule S = — — .
La sensibilité S est comparée à deux valeurs seuils S1 et S2, et
- la présence de l'analyte sur la sonde A est déclarée si S est supérieure à S1 , - l'absence de l'analyte sur la sonde A est déclarée si S est inférieure à
S2,
- une incertitude sur la présence ou l'absence de l'analyte sur la sonde A est déclarée si S est comprise entre S1 et S2.
Dans un mode particulier de mise en œuvre du procédé, l'étape b) de sensibilisation réalise également la sensibilisation d'une sonde B, lorsque les zones du motif géométrique périodique ne comportant pas la sonde A comportent essentiellement la sonde B, sensible à un analyte à laquelle la sonde A n'est pas sensible. La sensibilité S est comparée à deux valeurs seuils
S1 et S2, et - la présence d'analyte sur la sonde A est déclarée si S est supérieure
à S1 ,
- la présence d'analyte sur la sonde B est déclarée si S est inférieure à S2,
- une incertitude sur la présence ou l'absence d'analyte est déclarée si S est comprise entre S1 et S2.
Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, la puissance du faisceau diffracté d'ordre 1 , Pi, respectivement Pi3, est normalisée, pendant sa mesure, par une puissance d'un faisceau incident Pιnc, respectivement PιnCa, mesurée avant, respectivement après, l'étape de sensibilisation. De préférence, pour améliorer la sensibilité d'un dispositif associé au procédé, le système diffractant est réalisé de sorte que :
- une période p du motif géométrique périodique est comprise entre λ et 2 λ, λ correspondant à une longueur d'onde d'illumination du système diffractant, - un taux de remplissage r, définissant un rapport entre une largeur de la zone du motif géométrique périodique comportant la sonde A et la période p, est inférieur ou égal à 0,5,
- une zone d'un motif géométrique périodique du système diffractant (2) comportant une sonde est réalisée par une couche d'accroché de l'analyte, dite couche spécifique (25), d'épaisseur es et comportant la sonde et une couche d'ancrage de la sonde, dite couche d'accroché (26), d'épaisseur ec.
En plus d'améliorer la sensibilité du dispositif associé au procédé, le choix de la période du motif géométrique compris entre λ et 2 λ permet de n'obtenir qu'un seul faisceau diffracté d'ordre 1 , qui est, de plus, fortement séparé angulairement de l'ordre 0. Dans un exemple de réalisation, pour une période du système diffractant de sensiblement 1 μm, et pour une longueur d'onde de 633nm, l'angle βi est de sensiblement 40°.
De préférence, la couche d'accroché est réalisée de sorte que l'épaisseur ec est comprise entre 0 et 500nm.
De préférence, la couche spécifique est réalisée de sorte qu'un rapport
est inférieur à 1 , où eanaiyte est une épaisseur d'une couche d'analyte
"'analyîe déposée sur la sonde, après l'étape de sensibilisation.
Dans un mode de mise en oeuvre du procédé suivant l'invention, les étapes b) et c) sont réalisées simultanément. Dans un exemple de mise en oeuvre du procédé, le système diffractant est réalisé dans un matériau apte à réfléchir un faisceau incident.
Dans un autre exemple de mise en oeuvre du procédé, le système diffractant est réalisé dans un matériau apte à transmettre un faisceau incident. De préférence, le système diffractant est illuminé par une source monochromatique collimatée, par exemple un laser, à une longueur d'onde λ sélectionnée dans le domaine du visible et de l'infra rouge.
L'invention concerne également un système diffractant pour la mise en oeuvre du procédé et comportant un motif géométrique, comportant au moins une sonde, sur un substrat. De préférence, le substrat est plan et est réalisé par exemple dans un matériau en verre, en silicium ou en plastique.
L'invention concerne également un dispositif de recherche de la présence d'un analyte lié à une sonde formant un système diffractant qui comporte des moyens d'illumination du système diffractant par un faisceau incident cohérent. Le dispositif comporte en outre :
- des moyens de mesure de la puissance du faisceau diffracté d'ordre 1 , après diffraction du faisceau incident par ledit système diffractant,
- des moyens de calcul d'une variation relative de signal, dite sensibilité S, par comparaison, pour un même système diffractant, de la mesure de puissance du faisceau diffracté d'ordre 1 avant et après une étape de sensibilisation, c'est-à-dire une étape au cours de laquelle une sonde est mise en contact temporairement avec un milieu susceptible de contenir un analyte et au cours de laquelle l'éventuel analyte se fixe à la sonde, - des moyens de présentation de l'information caractérisant la sensibilité
S.
L'invention est également relative à une puce d'analyse comportant une pluralité de systèmes diffractants, comportant au moins une sonde, juxtaposés sur une surface d'un support. Dans un mode de réalisation, la puce d'analyse comporte au moins deux systèmes diffractants qui diffèrent par des motifs géométriques périodiques différents et ou par au moins une de leur sonde.
La description détaillée de l'invention est faite en référence aux figures qui représentent : Figure 1 , une illustration du principe de diffraction sur un réseau,
Figure 2a, une coupe transversale d'un système diffractant suivant l'invention avant une étape de sensibilisation,
Figure 2b, une coupe transversale d'un système diffractant suivant l'invention après l'étape de sensibilisation, Figure 3a, une illustration d'une puissance du faisceau diffracté en fonction d'une épaisseur ec d'une couche d'accroché du système diffractant suivant l'invention, pour des indices différents d'une sonde,
Figure 3b, une illustration d'une sensibilité en fonction de l'épaisseur ec de la couche d'accroché du système diffractant suivant l'invention, pour des indices différents de la sonde,
Figure 4, une illustration de la sensibilité en fonction d'un rapport entre une épaisseur es d'une couche spécifique comportant une sonde et une épaisseur d'une couche d'analyte eanaiyte suivant l'invention,
Figure 5a, une illustration de la sensibilité en fonction d'un taux de remplissage suivant l'invention,
Figure 5b, une coupe transversale du système diffractant illustrant un premier exemple d'accroché de l'analyte sur la sonde,
Figure 6, une vue schématique d'un dispositif de mesure pour la recherche d'un analyte suivant l'invention, Figure 7a, une illustration schématique d'un système diffractant réalisé expérimentalement, après l'étape de sensibilisation,
Figure 7b, une illustration de la sensibilité en fonction de l'épaisseur de la couche d'accroché du système diffractant de la figure 7a,
Figure 8a, une illustration schématique d'un système diffractant réalisé expérimentalement, après l'étape de sensibilisation, Figure 8b, une illustration de la sensibilité en fonction de l'épaisseur de la couche d'accroché du système diffractant de la figure 8a.
Le procédé suivant l'invention consiste à rechercher la présence d'un analyte, susceptible d'être contenu dans un milieu, au moyen d'un matériau récepteur, dit sonde, formant un système diffractant. Par analyte, on entend un matériau à détecter.
Les analytes qui peuvent être détectés incluent, mais ne se limitent pas, par exemple à :
- un matériau biologique tel que des bactéries, des levures, des anticorps, de des sucres, des peptides, des composés organiques volatiles,
- un matériau chimique ou biochimique, tel que des pesticides, des sucres, de l'acide désoxyhbonucléique (ADN), des molécules pharmaceutiques.
Par sonde, on entend un complémentaire spécifique de l'analyte, un matériau présentant une affinité avec l'analyte, apte à fixer spécifiquement l'analyte. Ce matériau est par exemple :
- un matériau biologique tel que des cellules ou des microorganismes tels que des bactéries,
- un matériau chimique ou biochimique, tel que des molécules, par exemple des silanes, des biomolécules, telles que des oligonucléotides, de l'acide désoxyribonucléique (ADN), des plasmides, des protéines, des anticorps, des oligosaccharides, des polysaccharides.
- un matériau synthétique, tel que par exemple un polymère à empreinte moléculaire (MIP).
- un matériau bistable tel que par exemple les analogues du bleu de
Prusse, les polymères de coordination à base de fer, par exemple le (Fe" (pyrazine) (Pt(CN)4 )).
Suivant le procédé, comme illustré sur la figure 1 , le système diffractant 2, comportant une sonde, dite sonde A, est éclairé au moyen d'un faisceau incident cohérent 31 , de longueur d'onde λ. Le système diffractant 2 est formé par un motif géométrique périodique 24, comportant une alternance de zones, en relief, comportant la sonde A, et de zones ne comportant pas la sonde A, déposé sur un substrat 23 et susceptible de contenir un analyte lié à la sonde A. Le faisceau incident 31 forme par rapport à une normale 20 à une surface diffractante 21 du système diffractant 2, un angle α.
Le faisceau incident cohérent 31 interagit avec le système diffractant 2 qui génère des faisceaux diffractés 41 , formant des angles β, avec la normale
20, chaque angle β, correspondant à un ordre de diffraction i du champ de diffraction produit par le système diffractant 2. (sur la figure 1 , pour exemple, seul le faisceau diffracté d'ordre 1 , d'angle βi est représenté).
Les faisceaux diffractés sont mesurables par des moyens de mesure (non représentés) délivrant une valeur d'une puissance mesurée de chaque faisceau diffracté. La puissance mesurée de chaque faisceau diffracté diminue au fur et à mesure que l'ordre diffracté augmente.
Le champ de diffraction obtenu après diffraction du faisceau incident sur le système diffractant est fonction, en autre, des caractéristiques géométriques du système diffractant, lesdites caractéristiques géométriques étant variables suivant la présence ou non de l'analyte sur la sonde du système diffractant 2.
Suivant le procédé, dans une première étape, une première mesure d'une valeur d'une puissance Pi du faisceau diffracté d'ordre 1 est réalisée, lorsque le système diffractant n'a pas encore été soumis à la présence de l'analyte susceptible de se fixer à la sonde. Dans une deuxième étape, dite étape de sensibilisation, la sonde A est temporairement mise en contact avec un milieu susceptible de contenir
l'analyte. Au cours de ladite étape de sensibilisation, l'éventuel analyte se fixe à la sonde A.
L'étape de sensibilisation est réalisée de façon conventionnelle, par exemple par immersion du système diffractant dans un milieu ou par dépôt par exemple par une micropipette du milieu sur la sonde puis séchage, et non décrite ici.
Dans une troisième étape, une mesure d'une valeur d'une puissance Pia du faisceau diffracté d'ordre 1 est réalisée avec le système diffractant obtenu après l'étape de sensibilisation. Au cours de cette troisième étape, le système diffractant 2 est soumis de nouveau au même faisceau incident cohérent 31 , avec le même angle α par rapport à la normale 20.
Dans un mode particulier de mise en œuvre du procédé suivant l'invention, lorsque la deuxième étape, l'étape de sensibilisation, consiste à immerger la sonde dans un liquide, ladite deuxième et la troisième étape peuvent être réalisées simultanément sans modifier le résultat desdites étapes.
Dans une quatrième étape, les deux valeurs mesurées de puissance Pi et Pia sont comparées pour déduire la présence ou non de l'analyte sur le système diffractant, et donc par conséquent sa présence dans le milieu. Les deux valeurs de puissance sont comparées de sorte à déterminer une variation relative du signal (valeur algébrique), dite sensibilité S, telle que :
P - P S = (1 )
De la relation précédente, des valeurs seuils Si et S2 sont déterminées de sorte que :
- lorsque S > Si, l'analyte est déclaré présent sur la sonde A, - lorsque S < S2, l'analyte est déclaré absent sur la sonde A,
- lorsque S2 < S < Si, il y a une incertitude qui ne permet de conclure ni à la présence ni à l'absence de l'analyte sur la sonde A. Dans ce dernier cas, il convient d'effectuer de nouvelles mesures, si besoin en modifiant le protocole opératoire.
Dans un mode de mise en œuvre particulier de l'invention, les zones du motif géométrique périodique ne comportant pas la sonde A comporte essentiellement une sonde B.
Ladite sonde B est sensible à un analyte à laquelle la sonde A n'est pas sensible.
Le procédé suivant l'invention permet de rechercher la présence d'un des deux analytes, susceptibles d'être contenu dans le milieu.
La détection des deux analytes est réalisée à partir d'un seul et même faisceau diffracté, le faisceau diffracté d'ordre 1. La détection entre les deux analytes distincts est dite différentielle.
La sensibilité S est toujours définie par la relation (1 ).
Les valeurs seuils Si et S2 sont déterminées de sorte que :
- lorsque S > Si, la présence de l'analyte sur la sonde A est déclarée,
- lorsque S < S2, la présence de l'analyte sur la sonde B est déclarée, - lorsque S2 < S < Si, il y a une incertitude qui ne permet de conclure ni à la présence ni à l'absence d'analyte sur la sonde A ou B. Dans ce dernier cas, il convient d'effectuer de nouvelles mesures, si besoin en modifiant le protocole opératoire.
Les valeurs seuils Si et S2 peuvent être déterminées de manière expérimentales, compte tenu du nombre important de paramètres, tels que par exemple les caractéristiques géométriques du système diffractant, la longueur d'onde du faisceau incident, l'angle d'incidence, la forme du faisceau incident, l'indice du substrat, la rugosité du substrat, qui influent sur la précision de la mesure. De préférence, la valeur seuil Si est sensiblement égale à 5 % et la valeur seuil S2 est sensiblement égale à -5 %.
Les fluctuations de puissance du faisceau incident émis peuvent conduire à une incertitude supplémentaire, compte tenu des mesures décalées dans le temps des puissances du faisceau diffracté avant et après l'étape de sensibilisation.
Un moyen mis en oeuvre par le procédé pour compenser lesdites
fluctuations consiste à normaliser chaque valeur de puissance mesurée Pi, Pia des faisceaux diffractés d'ordre 1 par rapport à une valeur de puissance mesurée Pιnc, Pmca du faisceau incident au moment de chaque mesure, avant et après l'étape de sensibilisation. Pour réaliser une mesure de la puissance du faisceau incident simultanément à la mesure de la puissance du faisceau diffracté, une partie γde la puissance du faisceau incident est prélevée, par exemple 10 à 20%, pour ne pas trop diminuer la sensibilité du dispositif de mesure associé au procédé.
Ainsi, la sensibilité S est exprimée sous la forme :
Pu s - J-P1n c y i P inca
(2)
P1 y-pmc Les valeurs des angles des faisceaux diffractés, trop proches de la normale 20 ou entre eux, peuvent conduire à une mise en oeuvre délicate du procédé.
Un moyen mis en oeuvre par le procédé pour générer des angles de faisceaux diffractés plus ouverts consiste à utiliser un système diffractant présentant une période p comprise entre λ et 2λ, de préférence 1 μm, compte tenu des longueurs d'onde utilisées comprises de préférence entre 400nm et
1200 nm.
De préférence, si le faisceau incident 31 est, de plus, émis en incidence normale (α = 0) par rapport au système diffractant 2, seul le faisceau diffracté d'ordre 1 est visible. L'angle βi du faisceau diffracté d'ordre 1 est suffisamment ouvert (par exemple, pour une période du système diffractant de sensiblement
1 μm, et pour une longueur d'onde de 633nm, l'angle βi est de sensiblement
40°) pour permettre un découplage angulaire et spatial des faisceaux réfléchi et diffracté. En n'obtenant seulement que le faisceau diffracté d'ordre 1 , le maximum de la puissance diffractée est localisé sur le faisceau diffracté d'ordre
1 , ce qui améliore le rapport signal sur bruit.
De plus, les variations des caractéristiques géométriques du système diffractant suite à l'étape de sensibilisation, caractéristiques de la présence de l'analyte sur la sonde, se répercutent uniquement au niveau de la puissance du faisceau d'ordre 1 , et ne sont pas dispersées sur plusieurs faisceaux d'ordre supérieur.
Un système diffractant 2 pour la mise en oeuvre du procédé comporte, comme illustré sur la figure 2a, le motif géométrique périodique 24, formé par une alternance de zones comportant la sonde A, en relief, et de zones ne comportant pas la sonde A, déposé sur une face 231 du substrat 23, d'indice nsub.
Le système diffractant est décrit de manière détaillée dans le cas d'un réseau de lignes parallèles 24, en relief, comportant la sonde A. Ce choix n'est pas limitatif et d'autres systèmes diffractants comportant des motifs géométriques périodiques tel qu'un réseau 2D, par exemple une grille, ou une figure géométrique complexe apte à diffracter la lumière, peuvent aussi être utilisés.
De préférence, afin d'augmenter la sensibilité du procédé, les lignes du réseau présentent une dimension nanométrique.
Dans un mode préféré de réalisation, comme illustré sur les figures 1 à 2b, le substrat 23 présente une face 231 plane.
Le substrat 23 est, par exemple, réalisé dans un matériau en verre, en silicium ou en or.
De préférence, les lignes, comportant la sonde A, ont une section droite en forme de créneau. Mais d'autres sections droites sont également possibles, telles que par exemple des sections droites de forme sinusoïdale ou triangulaire.
Le réseau présente la période p telle que précédemment définie, une largeur de ligne I, un taux de remplissage r, défini comme un rapport entre la largeur de ligne I et la période p, r = — .
P Le taux de remplissage r constitue un compromis entre la sensibilité S
et la puissance du faisceau diffracté. Si le taux de remplissage r diminue, la sensibilité S augmente mais la puissance du faisceau diffracté diminue rendant la mesure de puissance plus délicate à réaliser.
De préférence, pour améliorer la sensibilité S du procédé tout en conservant une valeur suffisante de la puissance du faisceau diffracté, le réseau est dimensionné de sorte que le taux de remplissage r soit inférieur à 0,5.
Les lignes parallèles en relief 24 comportent une première couche, dite couche d'accroché 26, d'épaisseur ec et d'indice nc. La couche adhésive comporte un matériau apte à permettre l'ancrage de la sonde A.
Pour améliorer la sensibilité S du dispositif, le matériau de la couche d'accroché 26 est choisi de sorte à permettre une accroche surfacique de la sonde A sur la couche d'accroché. Par accroche surfacique, on entend une accroche sur une face supérieure 261 , opposée au substrat 23, de la couche d'accroché, ainsi que sur des faces latérales 262 de ladite couche d'accroché.
Ce matériau est par exemple :
- un silane, si le substrat est en silicium,
- un thiol, si le substrat est en or, - un sucre,
- un dendrimère,
- un nano îlot métallique,
- une nanoparticule,
- un MIP, - un matériau bistable.
L'épaisseur ec de la couche adhésive constitue un compromis entre la sensibilité S et la puissance du faisceau diffracté. Plus l'épaisseur ec augmente, plus la puissance du faisceau diffracté augmente mais plus la sensibilité S diminue. Avantageusement, l'épaisseur ec est comprise entre 0 nm et 500 nm, de préférence sensiblement de l'ordre de 5 nm.
Les lignes parallèles en relief 24 comportent une deuxième couche, d'épaisseur es et d'indice ns, dite couche spécifique 25, d'accroché de l'analyte et comprend la sonde A.
L'épaisseur es est dimensionnée par rapport à une épaisseur eanaiyte d'une couche d'analyte 28 (figure 2b), susceptible d'avoir été déposée sur la couche spécifique 25, après l'étape de sensibilisation. Un rapport
— - — constitue un compromis entre la sensibilité S et la puissance du faisceau analyîe
diffracté. Si le rapport — - — diminue, la sensibilité S augmente mais la analyîe puissance du faisceau diffracté diminue. De préférence, pour améliorer la sensibilité S du dispositif tout en conservant une valeur suffisante de la puissance du faisceau diffracté, l'épaisseur es de la couche spécifique est dimensionnée de sorte que le rapport soit inférieur e 1.
" analyîe
Avantageusement, l'épaisseur es de la couche spécifique 25 est comprise entre 0,5nm et 150nm, de préférence sensiblement de l'ordre de 10nm.
Dans un premier mode de réalisation, comme illustré sur la figure 2a et 2b, le réseau 2 comporte, entre les lignes parallèles 24, une couche, recouvrant le substrat 23, dite couche de passivation 27, d'épaisseur ep. Ladite couche de passivation comporte un matériau apte à augmenter la sélectivité de l'adhésion de la sonde avec l'analyte. En augmentant la sélectivité de l'adhésion de la sonde avec l'analyte, la sensibilité du dispositif est améliorée.
Dans un exemple de réalisation, la couche de passivation est un polyéthylène glycol (PEG), une albumine de sérum bovin (BSA), un octadecyltrichlorosilane (OTS), une éthanolamine.
L'épaisseur ep de la couche de passivation est de dimension petite devant l'épaisseur ec de la couche d'accroché, par exemple de l'ordre de quelques angstrόms, afin de ne pas diminuer la surface d'accroché de la
couche d'accroché.
Dans un mode de réalisation plus complexe et non illustré, le réseau 2 comporte, entre les lignes parallèles 24, et recouvrant le substrat, une couche, dite seconde couche spécifique, d'accroché d'un analyte pour lequel la sonde A n'est pas sensible, et comportant la sonde B et une couche d'ancrage de la sonde B.
De préférence, afin d'exploiter efficacement la détection différentielle entre les deux analytes, l'épaisseur eanaiyte de la couche d'analyte 28 déposée sur la sonde A présente une épaisseur au moins inférieure d'un nanomètre ou au moins supérieure d'un nanomètre à une épaisseur d'une couche d'analyte déposée sur la sonde B.
Avantageusement, dans ce mode de réalisation, le taux de remplissage r est sensiblement égal à 0,5.
Dans un mode de réalisation, le réseau de lignes est un réseau de lignes par réflexion et le substrat est de préférence, optiquement transparent, à la longueur d'onde λ utilisée.
Dans un autre mode de réalisation, le réseau de lignes est un réseau de lignes par réflexion et le substrat est de préférence, non optiquement transparent, à la longueur d'onde λ utilisée. Exemple 1 : simulation de l'épaisseur ecde la couche d'accroché
L'exemple 1 illustre, à partir des figures 3a et 3b, le compromis entre la p sensibilité S et la puissance normalisée du faisceau diffracté d'ordre 1 -J- avant
l'étape de sensibilisation, pour différentes épaisseurs ec de la couche d'accroché 26 et pour les paramètres suivants :
Quelque soit l'indice ns de la sonde A, lorsque l'épaisseur ec de la
couche d'accroché augmente, la puissance normalisée du faisceau diffracté p d'ordre 1 -J- avant l'étape de sensibilisation augmente (figure 3a) au contraire inc de la sensibilité S qui décroît rapidement (figure 3b).
Exemple 2 : simulation de la sensibilité S en fonction du rapport
" analvte
L'exemple 2 illustre, à partir de la figure 4, la sensibilité S en fonction du rapport du système diffractant, pour différentes épaisseurs es de la
' analyîe couche spécifique et pour les paramètres suivants :
Les différentes courbes présentent le même profil et on constate que la sensibilité S est améliorée si le rapport est inférieur e 1.
"'analyîe
Exemple 3 : simulation du taux de remplissage r et sensibilité S L'exemple 3 illustre, à partir de la figure 5a, la sensibilité S en fonction du taux de remplissage du système diffractant pour différentes périodes p et, pour les paramètres suivants :
La courbe 1 illustre le cas où l'accroche de la sonde A sur la couche d'accroché est réalisée uniquement sur la partie supérieure de ladite couche d'accroché (cas illustré sur la figure 5b). On constate que quelque soit le taux de remplissage et la période du système diffractant, la sensibilité S reste constante.
La courbe 2 illustre le cas où l'accroche de la sonde A sur la couche d'accroché est réalisée sur toute la surface (la partie supérieure et les faces latérales) de ladite couche d'accroché (cas illustré sur la figure 2b). On constate que la sensibilité S est améliorée si le taux de remplissage r est inférieur à 0,5, quelque soit la période p du système diffractant.
Exemple 4 : mesure expérimentale de la sensibilité S L'exemple 4 illustre, à partir des figures 7a et 7b, la sensibilité S obtenue expérimentalement pour plusieurs épaisseurs de la couche d'accroché et, pour les paramètres suivants :
Pour cet exemple 4, le substrat est un verre silanisé. La couche d'accroché est une couche de streptavidine. La sonde A est une protéine A biotinylée. L'analyte est un anticorps anti-protéine A.
L'angle du faisceau diffracté d'ordre 1 est de 40°.
La figure 7a illustre schématiquement le système diffractant réalisé pour la mise en œuvre du procédé. Le système diffractant a une période de 1000nm et est composé de 400 lignes de 500 nm de largeur. La première étape pour réaliser le système diffractant consiste à déposer par tamponnage moléculaire la couche d'accroché 26. La deuxième étape consiste à incuber la molécule sonde, suivi d'un rinçage par un tampon phosphate salin, dit tampon PBS. La
dernière étape consiste à incuber l'analyte suivi d'un rinçage avec un tampon PBS.
Deux interactions sont observées :
- une première interaction entre l'analyte et la sonde A (interaction spécifique),
- une deuxième interaction entre l'analyte et le substrat.
La figure 7b illustre la sensibilité obtenue pour quatre réseaux présentant des épaisseurs ec différentes de la couche d'accroché (l'épaisseur varie de 1.5 nm à 2.5nm).
On constate que, comme dans les simulations (figure 3b), que lorsque l'épaisseur ec de la couche d'accroché diminue, la sensibilité S augmente. De plus, la sensibilité S est positive.
Exemple 5 : mesure expérimentale de la sensibilité S L'exemple 5 illustre, à partir des figures 8a et 8b, la sensibilité S obtenue expérimentalement pour plusieurs épaisseurs de la couche d'accroché et, pour les paramètres suivants :
Pour cet exemple 5, le substrat est un verre silanisé. La couche d'accroché est une couche de streptavidine. L'analyte est un anticorps antiprotéine A.
L'angle du faisceau diffracté d'ordre 1 est de 40°.
La figure 8a illustre schématiquement le système diffractant réalisé pour la mise en œuvre du procédé. Le système diffractant a une période de 1000nm et est composé de 400 lignes de 500 nm de largeur. La première étape pour réaliser le système diffractant consiste à déposer par tamponnage moléculaire
la couche d'accroché 26. La deuxième étape consiste à incuber l'analyte suivi d'un rinçage avec un tampon PBS. Il n'y a pas eu d'étape d'incubation de la molécule sonde.
Deux interactions sont observées : - une première interaction entre l'analyte et la couche d'accroché,
- une deuxième interaction entre l'analyte et le substrat.
La figure 8b illustre la sensibilité obtenue pour six réseaux présentant des épaisseurs ec différentes de la couche d'accroché (l'épaisseur varie de 1.5 nm à 2.5nm). On constate que la sensibilité S est négative. En effet, l'interaction entre l'analyte et la couche d'accroché est sensiblement inexistante. L'interaction entre l'analyte et le substrat est alors majoritairement observée. Ainsi, lorsqu'il n'y a pas d'interaction entre les lignes et l'analyte, la sensibilité S est négative.
Par cet exemple, on montre qu'il est possible de mesurer deux interactions en une mesure.
Un dispositif de mesure 1 pour la recherche d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir, comme illustré sur la figure 6, ledit analyte étant lié à une sonde formant un système diffractant 2 comporte : - des moyens d'illumination 3 du système diffractant 2 par le faisceau incident cohérent 31 ,
- des moyens de mesure 5 de la puissance du faisceau incident 31 d'ordre 1 ,
- des moyens de mesure 4 de la puissance du faisceau diffracté 41 d'ordre 1 , après diffraction du faisceau incident 31 par le système diffractant 2,
- des moyens de calcul 6 de la sensibilité S,
- des moyens 7 de présentation de l'information.
Lorsque le système diffractant (2) est réalisé avec la période p du motif géométrique périodique comprise entre λ et 2λ, de manière à ce que seul le faisceau de diffraction d'ordre 1 est visible, il n'y a pas lieu d'utiliser d'optique
séparatrice, tel que par exemple un prisme, pour séparer les faisceaux diffractés. Le dispositif de mesure gagne ainsi en coût et en simplicité de réalisation.
Les moyens d'illumination 3 comportent une source lumineuse 32. Avantageusement la source lumineuse a une longueur d'onde λ comprise dans le domaine du visible et de l'infrarouge.
Dans un exemple de réalisation, la longueur d'onde λ de la source lumineuse est sensiblement de l'ordre de 633nm.
Dans un exemple de réalisation, la source lumineuse 32 est une source monochromatique continue ou puisée.
De préférence, la source lumineuse 32 est un laser, tel que par exemple une diode laser ou un laser Hélium-Néon.
Dans un autre exemple de réalisation, la source lumineuse 32 est une lumière blanche. Les moyens d'illumination 3 comportent en outre au moins un filtre de sélection (non représenté) de la longueur d'onde désirée et des optiques de collimation (non représentées) pour générer le faisceau incident collimaté.
Les moyens de mesure 4, 5 comportent au moins un détecteur 42, 51 , un détecteur 51 interceptant le faisceau incident, par exemple au moyen d'une lame semi-réfléchissante 9, et un détecteur 42 interceptant le faisceau diffracté d'ordre 1.
Chaque détecteur 42, 51 est relié à des moyens de traitement 43, 53 apte à traiter un signal de mesure transmis par le détecteur. Les moyens de traitement 53 délivrent la valeur de la puissance du faisceau incident et les moyens de traitement 43 délivrent une valeur d'une puissance du faisceau diffracté d'ordre 1.
Les détecteurs sont par exemple un élément photosensible, tel que une photodiode, ou au moins un photomultiplicateur ou une matrice à couplage de charges CCD. Dans un exemple de réalisation, les faisceaux sont dirigés à travers un guide d'onde, tel que par exemple une fibre optique, vers le détecteur.
Dans un mode de réalisation, un moyen de mesure unique assure la fonction des deux moyens de mesure 4, 5 en mesurant la puissance du faisceau incident et la puissance du faisceau diffracté.
Les moyens de calculs 6 sont reliés aux moyens de mesure 4 et 5 et déterminent la valeur de la sensibilité S.
Par exemple, les moyens de calculs comportent au moins un calculateur, apte à calculer la sensibilité S.
Les moyens 7 de présentation de l'information sont reliés aux moyens de calculs 6 et caractérisent entre autre la sensibilité S. Les moyens 7 de présentation de l'information comportent par exemple des moyens d'affichage 71 , qui signalent la présence, l'absence ou l'incertitude sur la présence de l'analyte.
Dans un exemple de réalisation, lorsque le système diffractant comporte la sonde A, les moyens d'affichage 71 sont un jeu de trois diodes, clignotantes ou non, qui s'illuminent suivant la valeur de la sensibilité S :
- la diode verte s'illumine pour signaler la présence de l'analyte sur la sonde A,
- la diode rouge s'illumine pour signaler l'absence de l'analyte sur la sonde A, - la diode jaune s'illumine pour signaler l'incertitude sur la présence ou l'absence de l'analyte.
Lorsque le système diffractant comporte la sonde A et la sonde B, les moyens d'affichage 71 sont un jeu de trois diodes, clignotantes ou non, qui s'illuminent suivant la valeur de la sensibilité S : - la diode verte s'illumine pour signaler la présence d'analyte sur la sonde A,
- la diode rouge s'illumine pour signaler la présence d'analyte sur la sonde B,
- la diode jaune s'illumine pour signaler l'incertitude sur la présence ou l'absence d'analyte sur la sonde A ou B.
De préférence, les moyens 7 de présentation de l'information
comportent en outre un indicateur de la qualité de la diffraction indiquant un rapport signal sur bruit avant l'étape de sensibilisation.
Dans un autre exemple de réalisation, les moyens d'affichage 71 sont une image du système diffractant avec un code de couleur selon l'intensité du faisceau diffracté, tel que par exemple une couleur bleue dont l'intensité augmente avec l'intensité du faisceau diffracté dans le cas où la sensibilité S est supérieure à Si, une couleur rouge dont l'intensité augmente lorsque l'intensité du faisceau diffracté diminue dans le cas où la sensibilité S est inférieure à S2 et une couleur noire dans le cas où la sensibilité est comprise entre Si et S2.
Dans une forme de réalisation de l'invention, afin de permettre la réalisation d'analyses (recherche de la présence d'au moins un analyte lié à une sonde) sur un grand nombre de systèmes diffractants en un minimum de temps, une puce d'analyse comporte une pluralité de systèmes diffractants juxtaposés sur une surface d'un support, suivant des agencements particuliers, en général réguliers, tels que par exemple sous la forme de matrices de lignes et de colonnes. Lesdits systèmes diffractants sont analysés individuellement suivant le procédé de l'invention, par exemple au moyen du dispositif de mesure précédemment décrit qui balaie successivement à la surface du support la pluralité de systèmes diffractants, soit par un mouvement du dispositif de mesure, soit par un mouvement du support, soit par une combinaison des deux mouvements. Chaque système diffractant comporte au moins une sonde et présente des caractères propres. Dans un premier exemple, pour obtenir des mesures de redondance, les systèmes diffractants sont identiques entre eux.
Dans un deuxième exemple, au moins deux systèmes diffractants diffèrent par leurs motifs géométriques périodiques.
Dans un troisième exemple, pour permettre de rechercher la présence de différents analytes, au moins deux systèmes diffractants diffèrent au moins par l'une de leur sonde. Par exemple, un premier système diffractant est réalisé
avec une sonde liée à un premier analyte et un deuxième système diffractant est réalisé avec une sonde liée à un analyte différent et non sensible au premier analyte. Ce troisième exemple permet, par un choix approprié des sondes, de multiplier le nombre d'analytes qu'il est possible de rechercher sur une même puce.
Dans un quatrième exemple, au moins deux systèmes diffractants diffèrent d'une part par leurs motifs géométriques périodiques et d'autre part par au moins par l'une de leur sonde.
De préférence, une cartographie du support comportant l'ensemble des systèmes diffractants est réalisée, chaque zone colorée de la cartographie correspondant à un emplacement d'un système diffractant. Dans un exemple de réalisation, la coloration correspond à un code de couleur selon l'intensité du faisceau diffracté, tel que par exemple une couleur bleu dont l'intensité augmente avec l'intensité du faisceau diffracté dans le cas où la sensibilité S est supérieure à Si, une couleur rouge dont l'intensité augmente lorsque l'intensité du faisceau diffracté diminue dans le cas où la sensibilité S est inférieure à S2 et une couleur noire dans le cas où la sensibilité est comprise entre Si et S2.
Claims
R E V E N D I C A T I O N S
1 - Procédé pour rechercher la présence d'un analyte lié à une sonde, dans lequel un motif géométrique périodique (24), constituant un système diffractant (2), est formé par une alternance de zones comportant une sonde, dite sonde A, et de zones ne comportant pas la sonde A, ledit système diffractant (2) étant réalisé pour être diffractant avant une étape de sensibilisation, c'est-à-dire une étape au cours de laquelle une sonde est mise en contact temporairement avec un milieu susceptible de contenir un analyte et au cours de laquelle l'éventuel analyte se fixe à la sonde, le procédé comportant au moins les étapes de : a) mesure d'une puissance Pi d'un faisceau diffracté d'ordre 1 d'un champ de diffraction produit par le système diffractant, sonde non sensibilisée, b) sensibilisation de la sonde A, c) mesure d'une puissance Pia d'un faisceau diffracté d'ordre 1 d'un champ de diffraction produit par le système diffractant, d) comparaison des puissances mesurées Pi et Pi3, lesdites étapes étant réalisées suivant l'ordre énuméré, caractérisé en ce que le système diffractant (2) est réalisé de sorte qu'une période p du motif géométrique périodique est comprise entre λ et 2λ, λ correspondant à une longueur d'onde d'illumination du système diffractant, de manière à ce que seul le faisceau diffracté d'ordre 1 est visible.
2- Procédé suivant la revendication 1 dans lequel la comparaison est réalisée en déterminant une variation relative de signal, dite sensibilité S, à partir de la relation S = la
3- Procédé suivant la revendication 2 dans lequel la sensibilité S est comparée à deux valeurs seuils S1 et S2, et dans lequel i) la présence de l'analyte sur la sonde A est déclarée si S est supérieure
à S1 , ii) l'absence de l'analyte sur la sonde A est déclarée si S est inférieure à
S2, iii) une incertitude sur la présence ou l'absence de l'analyte sur la sonde A est déclarée si S est comprise entre S1 et S2. - Procédé suivant la revendication 2 dans lequel les zones du motif géométrique périodique ne comportant pas la sonde A comportent essentiellement une sonde B sensible à un analyte à laquelle la sonde A n'est pas sensible, et dans lequel l'étape b) de sensibilisation réalise également la sensibilisation de la sonde B. - Procédé suivant la revendication 4 dans lequel la sensibilité S est comparée à deux valeurs seuils S1 et S2, et dans lequel i) la présence d'analyte sur la sonde A est déclarée si S est supérieure à
S1 , ii) la présence d'analyte sur la sonde B est déclarée si S est inférieure à
S2, iii) une incertitude sur la présence ou l'absence d'analyte est déclarée si S est comprise entre S1 et S2. - Procédé suivant l'une des revendications précédentes dans lequel la puissance du faisceau diffracté d'ordre 1 , Pi, respectivement Pi3, est normalisée, pendant sa mesure, par une puissance d'un faisceau incident P,nc, respectivement PιnCa, mesurée avant, respectivement après, l'étape de sensibilisation. - Procédé suivant l'une des revendications précédentes dans lequel le système diffractant (2) est réalisé de sorte qu'un taux de remplissage r, définissant un rapport entre une largeur de la zone du motif géométrique périodique comportant la sonde A et la période p, est inférieur ou égal à 0,5.- Procédé suivant l'une des revendications précédentes dans lequel une zone d'un motif géométrique périodique du système diffractant (2), comportant une sonde, est réalisée par une couche d'accroché de l'analyte, dite couche spécifique (25), d'épaisseur es et comportant la sonde et une couche
d'ancrage de la sonde, dite couche d'accroché (26), d'épaisseur ec. 9- Procédé suivant la revendication 8 dans lequel dans lequel la couche d'accroché (26) est réalisée de sorte que l'épaisseur ec est comprise entre 0 et δOOnm. 10- Procédé suivant l'une des revendications 8 ou 9 dans lequel la couche spécifique (25) est réalisée de sorte qu'un rapport — - — est inférieur à 1 , où analyîe βanaiyte est une épaisseur d'une couche d'analyte déposée sur la sonde, après l'étape de sensibilisation.
11 - Procédé suivant l'une des revendications précédentes dans lequel les étapes b) et c) sont réalisées simultanément.
12- Procédé suivant l'une des revendications précédentes dans lequel le système diffractant (2) est réalisé dans un matériau apte à réfléchir un faisceau incident.
13- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 11 dans lequel le système diffractant (2) est réalisé dans un matériau apte à transmettre un faisceau incident.
14- Procédé suivant l'une des revendications précédentes dans lequel le système diffractant (2) est illuminé par une source monochromatique collimatée. 15- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 13 dans lequel le système diffractant (2) est illuminé par un laser. 16- Procédé suivant l'une des revendications précédentes dans lequel le système diffractant (2) est illuminé à une longueur d'onde λ sélectionnée dans le domaine du visible et de l'infra rouge. 17- Système diffractant (2) pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'une des revendications 1 à 16, comportant un motif géométrique (24), comportant au moins une sonde, sur un substrat (23). 18- Dispositif de recherche de la présence d'un analyte lié à une sonde formant un système diffractant (2) conforme à la revendication 17 comportant des moyens d'illumination (3) du système diffractant (2) par un
faisceau incident cohérent (31 ), caractérisé en ce que le dispositif comporte :
- des moyens de mesure (4, 5) de la puissance du faisceau diffracté (41 ) d'ordre 1 , après diffraction du faisceau incident par ledit système diffractant (2), - des moyens de calcul (6) d'une variation relative de signal, dite sensibilité S, par comparaison, pour un même système diffractant, de la mesure de puissance du faisceau diffracté d'ordre 1 avant et après une étape de sensibilisation, c'est-à-dire une étape au cours de laquelle une sonde est mise en contact temporairement avec un milieu susceptible de contenir un analyte et au cours de laquelle l'éventuel analyte se fixe à la sonde,
- des moyens (7) de présentation de l'information caractérisant la sensibilité S. - Puce d'analyse comportant une pluralité de systèmes diffractants (2) conformes à la revendication 17 juxtaposés sur une surface d'un support.- Puce d'analyse suivant la revendication 19 comportant au moins deux systèmes diffractants (2) qui diffèrent par des motifs géométriques périodiques différents et ou par au moins une de leur sonde.
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