EP2176660A2 - Utilisation de la proteine em6 comme marqueur de la performance germinative de lots de semences et ses applications - Google Patents

Utilisation de la proteine em6 comme marqueur de la performance germinative de lots de semences et ses applications

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Publication number
EP2176660A2
EP2176660A2 EP08831425A EP08831425A EP2176660A2 EP 2176660 A2 EP2176660 A2 EP 2176660A2 EP 08831425 A EP08831425 A EP 08831425A EP 08831425 A EP08831425 A EP 08831425A EP 2176660 A2 EP2176660 A2 EP 2176660A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
antibody
seeds
seq
directed against
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08831425A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Julia Buitink
Olivier Leprince
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agrocampus Ouest - Centre d'Angers
Institut National de la Recherche Agronomique
Original Assignee
Agrocampus Ouest - Centre d'Angers
Institut National de la Recherche Agronomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agrocampus Ouest - Centre d'Angers, Institut National de la Recherche Agronomique filed Critical Agrocampus Ouest - Centre d'Angers
Publication of EP2176660A2 publication Critical patent/EP2176660A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants

Definitions

  • the present invention relates to the use of the EM6 protein as a marker of the germination performance of seed lots.
  • One of the challenges of the seed industry is to obtain seed lot with high germination vigor, that is to say a good germination ability in a fast and uniform way but also a good quality of growth of the seeds. plants, regardless of the environmental and sowing conditions.
  • phase I of imbibition is characterized by a passive influx of water which is made rapidly in the dry seed in latent life. Then a phase II reduction of the imbibition rate is followed by a last phase where again the seed absorbs water. It is during this last stage that there is an elongation of the radicle resulting in the germination, that is to say the protrusion of this one out of the seeds of the seed. During these three phases, the metabolism is gradually reactivated. On the other hand, during phases I and II of imbibition, the seed remains able to survive drying which brings its water content to values similar to those observed in an ungerminated seed.
  • desiccation tolerance This property is referred to as desiccation tolerance.
  • desiccation tolerance During drying, the cellular and metabolic events that lead to germination are stopped and the seed returns to a latent state of life. Tolerance to desiccation is lost progressively during the imbibition, first in the radicle when it has pierced the integuments and then in the other parts of the embryo.
  • LEA Late Embryonic Abundant
  • the EM6 protein belongs to the group 1 of the LEA proteins. Boudet et al (Plant Physiology, 2006, 140: 1418-1436) identified this protein in Medicago truncatula. The polypeptide sequence of this protein is accessible on Genbank under the number ABB13462 (Boudet et al Plant Physiology, 2006, 140: 1418-1436).
  • EM6 homologues have been identified in many other higher plants: by way of non-limiting examples, mention may in particular be made of Arabidopsis thaliana (Genbank AAD25932, NP181546, Swissprot Q02973, Q07187), Glycine max (Swissprot P93165), Vigna radiata ( Genbank AAB07225), Oryza sativa (Swissprot P46520), Triticum aestivum (Swissprot Q9ZR71), Hordeum vulgare (Swissprot P46532), Dry cereal (Swissprot Q9M4P1), Zea mays (Swissprot P46517), Raphanus sativus (Swissprot P11573), Brassica napus (Swissprot 065 725),
  • pregermination priming
  • the seeds thus treated are more vigorous, germinate and / or raise faster or better in penalizing conditions. It is essentially to produce pregerminated seeds, ie seeds in which the radicle has not yet emerged, by means of a controlled treatment of imbibition by hydration, followed by drying.
  • the imbibition can take place with an osmoticum such as PEG or salts (KNO3) or without osmoticum.
  • the seeds are then dried which reduces their water content to values similar to those observed for ungerminated seeds.
  • Some pregermination methods are based on the treatment of seeds at more advanced stages, after the emergence of the radicle (EP 0 202 879). However, at this stage the seed is much more fragile.
  • post-harvest packaging methods may be applied to the seeds including imbibition steps. These are coating processes, film coating or treatment with chemicals. These conditioning methods can also be applied independently of the pregerminative treatment.
  • the pregerminative treatment must be carried out under conditions that allow the germination to be initiated in a homogeneous manner and that it is stopped early enough for the seed to be able to reinitiate the germination effectively. There is therefore a need to accurately determine the conditions of the imbibition treatment, including the duration of the treatment, to meet the seed quality criteria. If it is too short, no beneficial effects on germinative performance are observed. At worst, there is no initiation of germination. Overly long duration of the seed imbibition treatment has the effect of reducing the longevity and germinative performance of the dried treated seeds, which makes their conservation and management of seed stocks more problematic, if not impossible.
  • the physiological quality of the seed lot can be defined in particular in terms of germination performance and / or storage ability as well as level of heterogeneity of the batch.
  • the germination performance (or T (50)) of a seed lot is estimated for example by the germination rate expressed in hours to reach 50% germination after sowing under specific conditions defined for each species or variety according to the standards.
  • ISTA International Seed Testing
  • the storage ability is defined by the aging time to obtain 50% germination for a batch of seeds at a precise and controlled relative humidity and temperature, for example 75% relative humidity and
  • the time required to carry out the tests indicated above is from several days to several weeks and is often longer than the pregermination treatment itself which is 3 to 7 days.
  • the inventors have found, during the imbibition of seeds of Medicago truncatula, a significant linear correlation between, on the one hand, the content of EM6, measured using an antibody directed against said EM6 protein, in a soluble protein extract. non-emerged radicle and, secondly, the ability to preserve the seeds concerned. They further observed that the coefficient of linearity between the amount of EM6 and the storage ability remains stable even when different imbibition conditions are applied to the seeds.
  • the inventors have furthermore found that the antibody directed against EM6 of Medicago truncatula recognizes the homologous proteins in seeds or embryos of other dicotyledonous and monocotyledonous species, and that the linear correlation between the amount of protein recognized by this antibody in the non-emergent radicle, and the ability to conserve is also observed in these other species.
  • the EM6 protein is a robust marker and perfectly correlated with the ability to preserve, and thus allowing to follow the evolution of it during the imbibition treatments of a batch of seeds.
  • the inventors have furthermore identified, from the Medicago truncatula EM6 protein, two peptides making it possible to obtain antibodies capable of recognizing homologues of EM ⁇ in other plant species, and that can be used as the antibody directed against the protein.
  • the present invention relates to a method for determining the storage ability of a seed lot undergoing an imbibition treatment, characterized in that it comprises the quantification in a seed sample taken from said batch of proteins recognized by an antibody chosen from: a) an antibody recognizing a protein, hereinafter referred to as EM6 protein, and having at least 70%, preferably at least 75% and most preferably at least 80% identity, or at least 80%, preferably at least 85% and most preferably at least 90% similarity with the EM6 protein of Medicago truncatula identified by accession number GenBank ABB13462 (and also represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO: 1), and containing a region defined by the general sequence (I) GX I SX 2 GGX 3 TRX 2 X 4 QX S G (SEQ ID NO: 2) wherein X is H or R, X2 is K or R, X 3 is Q or N, X 4 is E or D, X 5 is L or M, or by the general
  • an antibody directed against a portion of said EM6 protein comprising at least one of the sequences GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO: 4) or EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5).
  • the percentages of identity and similarity referred to herein are calculated using BLAST software (Altschul et al,
  • the process according to the invention can be carried out during an imbibition stage which can take place during a post-harvest conditioning and / or a pre-germinating treatment or any other treatment resulting in a modification of the water content of the seed or part of the seed either in time or in its distribution within the tissues of the seed.
  • imbibition treatment any treatment containing at least one step of hydration of the seeds, which can be carried out either in the presence of an inert osmoticum such as PEG or a salt (for example KNO3) or without osmoticum (for example , hydroconditioning, soaking).
  • an inert osmoticum such as PEG or a salt (for example KNO3) or without osmoticum (for example , hydroconditioning, soaking).
  • imbibition treatments there may be mentioned pregermination treatment, and various post-harvest packaging methods of the seed such as coating or film coating. Hydration methods can be varied and include, for example, the use of water vapor, contacting the seeds with a liquid film or soaking the seeds.
  • the graphical representation of the correlation between the quantity of EM6 detected by the process according to the invention and the storage ability and / or the germinative performance can be obtained from at least 3 points, each corresponding to one batch of seeds having undergone imbibition treatments of different durations.
  • the coefficient of linearity can be directly deduced, which makes it possible to determine quantitatively the storage ability, irrespective of the imbibition treatment subsequently applied.
  • Those skilled in the art may, by quantifying the content of EM6 protein of the sample, for example compare the effects of different operating conditions of a given treatment on the ability to preserve or performance germinative. He may also compare the effects of an imbibition treatment over time.
  • the process according to the invention may advantageously be carried out during the pregermination treatment in order to determine the duration of the treatment to obtain a seed lot with a desired preservation ability. Since the amounts of EM6 protein evolve linearly with the storage ability, the observed variations in amounts of EM6 protein are equal to the variations in storage ability.
  • the process according to the invention can be carried out on whole seeds, or on embryos or non-emerged radicles previously isolated from the seeds.
  • the method according to the invention can be implemented separately on individual seeds taken from the batch to be tested, this makes it possible to determine the level of heterogeneity of a seed lot for the ability to preserve.
  • the subject of the present invention is also any anti-EM6 antibody directed against a region of said EM6 protein chosen from the region defined by the sequences
  • An antibody against a region of an EM6 protein is defined as any antibody capable of detectably binding to the region concerned on the protein. Whole EM6 or a fragment thereof, but not detectably binding to another region of the same protein. In the case of monoclonal antibodies, this includes any antibody recognizing an epitope located in said region; in the case of polyclonal antibodies, this includes any antibody preparation that does not show significant cross-reactions with other regions of the EM6 protein.
  • this antibody will advantageously have cross-reactions with the homologous region of EM6 proteins of other plant species.
  • antibodies directed against the region defined by the sequence (I) or by the sequence (Ia) generally have a very broad specificity and can recognize a wide variety of EM6 proteins in monocotyledons or dicotyledons.
  • the antibodies directed against the region defined by the sequence (II) or by the sequence (II bis) generally have a more restricted specificity.
  • Antibodies according to the invention can be obtained by methods well known per se.
  • an EM-6 protein fragment (in the form of a natural, recombinant, or synthetic peptide) comprising the region against which it is desired to direct the antibody, or at least one fragment of this region of size, is used as immunogen. sufficient to constitute a B epitope (usually at least 5 to 7 amino acids). If necessary, said peptide is mixed with an adjuvant, or coupled to a carrier protein, in order to increase its immunogenicity.
  • the resulting antibodies can then be purified, also known per se. Generally, this purification comprises at least one affinity chromatography step on a column on which is grafted the peptide against which the antibody is to be directed.
  • the entire EM-6 protein can also be used as an immunogen, and affinity chromatography can be performed on a column onto which the peptide to which the antibody is to be directed is grafted.
  • affinity chromatography can be performed on a column onto which the peptide to which the antibody is to be directed is grafted.
  • anti-EM6 antibodies directed against a region defined by the general sequence (I) mention may be made of antibodies directed against the peptide defined by the sequence GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO: 4).
  • anti-EM6 antibodies directed against a region defined by the general sequence (I) mention may be made of antibodies directed against the peptide defined by the sequence GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO: 4).
  • anti-EM6 antibodies directed against a region defined by the general sequence (I) mention may be made of antibodies directed against the peptide defined by the sequence GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO: 4).
  • the present invention also relates to a
  • LO method of quantifying EM ⁇ in plant material characterized in that it comprises bringing said plant material into contact with an anti-EM6 antibody according to the invention, as defined above.
  • the present invention also relates to
  • EXAMPLE I CORRELATION BETWEEN CONSERVATION ABILITY AND THE QUANTITY OF EM6 DETERMINED IN ELISA AT MEDICAGO TRUNCATULA.
  • Treatment imbibition and priming.
  • a batch of seeds of Medicago truncatula (var Parragio) is divided into 100 seeds which are soaked in a 9 cm petri dish or on Whatman No. 1 filter paper soaked in 4 ml of distilled water or on two Whatman No. 1 filter papers soaked with 7 ml of a solution of polyethylene glycol (Sigma, Mw 6000-8000) equivalent to water potentials calculated from the formula of Michel and Kaufmann, 1973 (Plant Physiology 51: 5 914-916).
  • the petri dishes are then placed in the dark at 20 ° C. for different times.
  • the seeds are optionally rinsed quickly with running water to remove the PEG. They are quickly dried in an enclosure ventilated at 43% relative humidity at 20 0 C in the dark for 3 days. Aging treatment
  • the untreated or previously hydrated seeds then dried are placed on a grid in a hermetically sealed box containing a relative humidity of 75%. This is obtained by depositing at the bottom of the box a saturated solution of NaCl. The seeds are thus incubated at 35 ° C in the dark for increasing times. Over time, 100 seeds are removed from the can and sprouted in distilled water as described above. After 7 days, count the number of sprouts. A seed is considered sprouted when the radicle has emerged out of the seeds of the seed. The storage ability is expressed in days required to obtain 50% germination for each batch of aged P seeds (50). Protein extraction and ELISA
  • Sample preparation can be done in a standard 96-well ELISA microtiter plate (Greiner Bio-One ref 655161).
  • the soluble protein extracts obtained by the method described above are diluted in PBS buffer (15OmM NaCl, 10mM Na 2 HPO 4 ) at 100 ng / .mu.l. 2 ⁇ l of these Dilutions are added to 248 ⁇ l of PBS buffer. Then, successive half dilutions are prepared from the most concentrated extract taking care to homogenize the mixtures well. A volume of 100 ⁇ l of each concentration for each sample is transferred to an ELISA microtiter plate. The plate with the samples is incubated for 30 minutes at 35 ° C., then washed 5 times with 125 ⁇ l of
  • the rabies anti-EM6 primary antibodies directed against the entire recombinant EM6 protein of Medicago truncatula, or anti-EM6-peptide II directed against the sequence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) of the EM6 protein of Medicago truncatula are diluted to 1 / 1000 in PBS buffer. 100 ⁇ l of antibody solution are deposited per well. The plate is incubated for 30 minutes at 35 ° C. and then washed 5 times with 125 ⁇ l of buffer (PBS + 0.05% Tween-20).
  • the secondary antibodies coupled to peroxidase are diluted to 1/10 000 in PBS alone. 100 ⁇ l of antibody solution are deposited per well. The plate is then incubated for 30 minutes at 35 ° C. and then washed 5 times with 125 ⁇ l of (PBS + 0.05% Tween-20).
  • the microplate is revealed by the addition of a solution containing the aforementioned peroxidase substrates (ABTS, Sigma). 100 ⁇ l of ABTS developer are deposited per well. The reaction is monitored spectrophotometrically at 405 nm in a microplate reader, the intensity of the staining being proportional to the amount of antigen in the soluble protein extract. The absorbance is measured every 5 to 10 minutes and this during Ih. To determine the value of the relative content of EM6, the slope of the regression line of the absorbance values is calculated as a function of increasing concentrations of protein extracts.
  • ABTS peroxidase substrates
  • the control corresponds to non-soaked seeds.
  • the amount in EM6 is determined in extracts of soluble proteins by ELISA radicles with one hand an anti-EM6 rabbit antibody directed against the whole recombinant protein EM6 Medicago truncatula (A) and secondly the ⁇ antibodies -EM6-peptide II directed against the sequence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) of the Medicago truncatula EM6 protein (B)
  • the control represents ungerminated seeds.
  • Figure 1 shows that regardless of the duration of the imbibition, the percentage of germination measured after 7 days of imbibition decreases as a function of the duration of aging.
  • Figure 1 determines the storage ability (P50) for each treatment. It is found that the longer the duration of the imbibition treatment increases the lower the value of P (50), regardless of the type of imbibition treatment applied (in distilled water (A) or in an aqueous solution of PEG (B)).
  • Figure 2 shows that there is a significant linear relationship between the content of EM6, determined by an ELISA test with two different antibodies and P (50) obtained according to the modalities of the imbibition treatment. Moreover, the correlation coefficient is conserved whatever the type of imbibition treatment used (with or without osmoticum). The ELISA test put in place makes it possible to distinguish seeds of Medicago truncatula pretreated according to their aptitude for conservation.
  • EXAMPLE II CORRELATION BETWEEN GERMINATION PERFORMANCE AND THE QUANTITY OF EM6 AT MEDICAGO TRUNCATULA.
  • Protein samples extracted from radicles isolated from treated seeds are prepared according to the protocol described in Example 1. To determine the rates of imbibition (T50), the treated seeds are dried as described in Example 1. Next 100 seeds are imbibed at 20 0 C as described in Example 1. The sprouted seeds are counted every 2 hours. The germination percentages are plotted against the imbibition time to determine the time required to obtain 50% germination for each seed lot (T20).
  • the quantity of EM6 is determined in extracts of soluble radicle proteins by ELISA test with on the one hand an anti-rabbit anti-EM6 antibody directed against the whole recombinant EM6 protein of Medicago truncatula (A) and on the other hand the antibody anti-EM6-peptide II directed against the sequence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) of the Medicago truncatula EM6 protein (B)
  • a + C Antigen-antibody specific recognition by the Western blot technique using soluble protein extracts of seeds of 13 species (lane 1 to 13) using the anti-EM6-peptide II antibody directed against the sequence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) Medicago truncatula EM6 protein.
  • EQLGTEGYQEMGRK SEQ ID NO: 5
  • the assignment of the corridors to each species and the corresponding protein concentration are as follows: 1, celery (25 ⁇ g of protein); 2, carrot (25 ⁇ g); 3, cucumber (30 ⁇ g); 4, leek (15 ⁇ g); 5, chives (15 ⁇ g); 6, onion (15 ⁇ g); 7, impatience (15 ⁇ g); 8, petunia (15 ⁇ g); 9, thought (15 ⁇ g); 10, radish (2.5 ⁇ g); 11, broccoli (2.5 ⁇ g); 12, rapeseed (2.5 ⁇ g); 13 cabbages (2.5 ⁇ g).
  • B + D Antigen-antibody specific recognition by Western blot technique using soluble protein extracts of 13 species seeds (lane 1 to 13) using the anti-EM6-peptide I antibody directed against the sequence GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO: 4) Medicago truncatula EM6 protein.
  • the assignment of the corridors and protein concentrations for each species are identical to those mentioned above.
  • E + F Antigen-antibody specific recognition by Western blot technique from soluble protein extracts of radicles isolated from 7 species using anti-EM6-peptide II (E) and anti-EM6-peptide I (F)
  • E anti-EM6-peptide II
  • F anti-EM6-peptide I
  • the assignment of corridors to each species and the corresponding protein concentration are as follows: 14, Medicago truncatula (30 ⁇ g); 15, cowpea (15 ⁇ g); 16, soy (15 ⁇ g); 17, pea (15 ⁇ g); 18, beans (15 ⁇ g); 19, but (15 ⁇ g ) •
  • the protein samples extracted from dry whole seeds or radicles isolated from dry seeds are prepared according to the protocol described in Example 1.
  • PVDF Polyvinylidine difluoride
  • a batch of sunflower seeds is divided into units of 80 seeds which are imbibed in the presence of distilled water or an aqueous solution of PEG as described in Example I.
  • the seeds are then placed in the dark at 20 ° C. C for increasing periods of time (Oh, 6h and 15h in water and 48h in PEG solution at -1.5 MPa). Then, they are optionally quickly rinsed with running water to remove the PEG and then quickly dried in a ventilated enclosure at 43% relative humidity at 20 0 C in the dark for 3 days.
  • Aging treatment Untreated or previously hydrated seeds then dried are aged according to the protocol described in Example I. During storage, 80 seeds are removed successively and germinated under the conditions described in Example I. After 7 days, count the number of sprouts. Storage ability is measured by P (75), defined by the aging time required to obtain 75% germination for the seed lot.
  • Protein extraction and ELISA test The protocol for preparing protein extracts from isolated radicles and the quantification of the proteins are described in Example I.
  • the preparation of the samples for the ELISA test is described in Example I except that the dilutions successive half are made from a protein concentration of 100 ng / ⁇ l.
  • the procedure described in Example I was followed using the anti-EM6-peptide II antibody directed against the sequence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) of the EM6 protein of Medicago truncatula.
  • the longevity ability corresponds to the time required to obtain 75% germination after aging after storage at 35 ° C., 75% RH.
  • EXAMPLE V CORRELATION BETWEEN THE AMOUNT IN EM6 DETERMINED BY ELISA AND IMPROVING THE ABILITY TO PRESERVE A LOT OF AGEED OIL SEED BY SOAKING IN DISTILLED WATER.
  • One of the objectives of a pregerminative imbibition is to eliminate the effects of aging suffered by a batch of seeds too old or stored in bad conditions. Experiments have been carried out to show that EM ⁇ is correlated with longevity ability as it evolves depending on the duration of soaking in aged onion seeds.
  • Example I A lot of naturally aged onion seeds is divided into units of 80 seeds and imbibed according to the protocol described in Example I. Then, the seeds are quickly dried in a ventilated enclosure at 43% relative humidity at 20 ° C. in the dark for 3 days. The procedure described in Example I is followed for the seed aging treatment.
  • Example I The protocol for the preparation of the protein extracts and the quantification of the proteins are described in Example I.
  • the preparation of the samples and the ELISA test are described in Example I except that the successive one-half dilutions are made from a protein concentration of 1 ⁇ g / ⁇ l.
  • the anti-EM6-peptide II antibody directed against the sequence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) of the Medicago truncatula EM6 protein was used.
  • Figure 6A shows that between 10 and 17 hours of imbibition, the P50 value increases from 8 to 12.5 days.
  • FIG. 6B shows the content of EM6 as a function of the set of P50 values obtained after a period of time. croissants of imbibition. It is observed that there is a linear relationship between the relative amount of EM6 in the radicles and the longevity ability.
  • EXAMPLE VI CORRELATION BETWEEN THE QUANTITY IN EM6 DETERMINED BY WESTERN BLOT AND IMAGE ANALYSIS AND IMPROVING THE ABILITY TO PRESERVE A LOT OF BROCOLI SEEDS.
  • a batch of broccoli seeds is divided into a unit of 100 seeds and imbibed according to the protocol described in Example I.
  • the Petri dishes are then placed in the dark at 20 0 C for increasing periods of time (6h and 15h in water and 24 and 48h in the PEG solution corresponding to a water potential of -1.5 MPa, then the seeds are optionally rinsed with running water in order to remove the PEG and are rapidly dried in a chamber ventilated at 43% relative humidity at 20 ° C. in the dark for 3 days
  • the untreated or previously hydrated seeds then dried are then stored in relative humidity at 35 ° C. according to the protocol described in Example I. After 19 and 25 days of aging, 100 seeds are germinated under the conditions described in Example I. After 7 days, the number of sprouts is counted.
  • Example II The protocol for the preparation of protein extracts from isolated radicles and the quantification of proteins are described in Example I.
  • One ⁇ g of protein extracts is separated by gel electrophoresis.
  • Medicago truncatula EM6 protein is 1 / 10,000th.
  • the revelation is carried out by chemiluminescence using the kit Immun-Star Western C (Biorad) under the conditions recommended by the manufacturer.
  • the shooting and the quantification of the signal are carried out by means of an imager (Chemidoc Biorad) after optimization of the exposure according to the conditions recommended by the manufacturer. The results are shown in Figure 7.

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Abstract

La présente invention est relative à la détermination de l'aptitude à la conservation et/ou la performance germinative d'un lot de semences, par quantification de la protéine EM6 appartenant à la famille des protéines Late Embryogenesis Abundant (LEA). La présente invention concerne également des anticorps permettant la quantification de la protéine EM6.

Description

UTILISATION DE LA PROTEINE EM6 COMME MARQUEUR DE LA PERFORMANCE GERMINATIVE DE LOTS DE SEMENCES ET SES APPLICATIONS .
La présente invention est relative à l'utilisation de la protéine EM6 comme marqueur de la performance germinative de lots de semences.
L'un des défis de l'industrie semencière est l'obtention de lot de semences ayant une haute vigueur germinative, c'est-à-dire une bonne aptitude à la germination de façon rapide et uniforme mais aussi une bonne qualité de croissance des plantes qui en sont issues, et ce quelles que soient les conditions environnementales et de semis.
Plusieurs étapes de germination dans des graines non dormantes ont été identifiées. La phase I d' imbibition est caractérisée par un influx passif d'eau qui se fait rapidement dans la graine sèche en vie latente. Puis une phase II de réduction de la vitesse d' imbibition est suivie d' une dernière phase où de nouveau la graine absorbe de l'eau. C'est au cours de cette dernière étape qu' il y a élongation de la radicule résultant dans la germination, c'est-à-dire la protrusion de celle-ci hors des téguments de la graine. Pendant ces trois phases, le métabolisme est progressivement réactivé. Par ailleurs, au cours des phases I et II de l' imbibition, la graine reste capable de survivre à un séchage qui amène sa teneur en eau à des valeurs similaires à celles observées dans une graine non germée. Cette propriété est dénommée tolérance à la dessiccation. Au cours du séchage, les événements cellulaires et métaboliques qui aboutissent à la germination sont arrêtés et la graine retourne vers un état de vie latent. La tolérance à la dessiccation est perdue progressivement au cours de l' imbibition, d'abord dans la radicule lorsqu'elle a percé les téguments puis ensuite dans les autres parties de 1' embryon.
Chez les plantes, la présence de protéines LEA (Late Embryonic Abundant) est corrélée à la tolérance à la dessiccation. Notamment, ces protéines s'accumulent pendant la maturation de la graine (Cuming, 1999, Kluwer Académie Press, The Netherlands, pp753-780) et elles auraient un rôle de protection contre les effets de la dessiccation et autres stress osmotiques aussi bien dans les tissus végétatifs que dans les graines.
Elles sont classées en 5 groupes selon leur homologie de séquences. Plus spécifiquement, il existe une corrélation entre la diminution des quantités de certaines LEAs de groupe 1, 2, 3 et 5 et la perte de tolérance à la dessiccation pendant la germination (Boudet et al, 2006, Plant Physiology, 140: 1418-1436) . La protéine EM6 appartient au groupe 1 des protéines LEA. Boudet et al (Plant Physiology, 2006, 140:1418- 1436) ont identifié cette protéine chez Medicago truncatula . La séquence polypeptidique de cette protéine est accessible sur Genbank sous le numéro ABB13462 (Boudet et al Plant Physiology, 2006, 140:1418-1436). Ils ont montré qu'elle est particulièrement exprimée dans les radicules tolérantes à la dessiccation, avant leur émergence. De plus, après germination, au stade 2,8 mm de protusion, l'expression de cette protéine dans les radicules devenues sensibles est augmentée par un traitement osmotique au polyéthylène glycol (PEG) qui rétablit la tolérance à la dessiccation.
Des homologues d'EM6 ont été identifiés chez de nombreuses autres plantes supérieures: à titre d'exemples non limitatifs, on citera notamment Arabidopsis thaliana (Genbank AAD25932, NP181546, Swissprot Q02973, Q07187), Glycine max (Swissprot P93165), Vigna radiata (Genbank AAB07225) , Oryza sativa (Swissprot P46520) , Triticum aestivum (Swissprot Q9ZR71), Hordeum vulgare (Swissprot P46532), Secale céréale (Swissprot Q9M4P1), Zea mays (Swissprot P46517), Raphanus sativus (Swissprot P11573), Brassica napus (Swissprot 065725),
Lycopersicum esculentum (TAIR Gène Indice TC178231 ) ,
Phaseolus aureus (Swissprot Q41685) , Vitis vinifera (TrEMBL
A5BF16 ) , Daucus carota (Swissprot Q5KTS6) , Helianthus annuus
(Swissprot P46514) . De nombreux procédés de traitement de semences
(prégermination, priming) , visant à activer la germination des semences en vue d'améliorer la performance germinative avant commercialisation sont bien connus. Les graines ainsi traitées sont plus vigoureuses, germent et/ou lèvent plus vite ou mieux en conditions pénalisantes. Il s'agit essentiellement de produire des semences prégermées, c'est à dire des semences dans lesquelles la radicule n'a pas encore émergé, à l'aide d'un traitement contrôlé d' imbibition par hydratation, suivi d'un séchage. L' imbibition peut avoir lieu avec un osmoticum comme le PEG ou des sels (KNO3) ou sans osmoticum. Les graines sont ensuite séchées ce qui réduit leur teneur en eau à des valeurs similaires à celles observées pour des graines non germées.
Certains procédés de prégermination sont basés sur le traitement de semences à des stades plus avancés, après l'émergence de la radicule (EP 0 202 879). Toutefois, à ce stade la semence est beaucoup plus fragile. II existe des procédés mettant en œuvre une étape d'hydratation puis l'addition d'un gel (Agrigel) dans l'eau ou d'un polymère encapsulant (US 4 780 987).
En plus des traitements prégerminatifs, on peut appliquer aux semences des procédés de conditionnement post- récolte comprenant des étapes d' imbibition. Il s'agit de procédés d'enrobage, de pelliculage ou de traitement avec des substances chimiques. Ces procédés de conditionnement peuvent aussi être appliqués indépendamment du traitement prégerminatif . Le traitement prégerminatif doit être mis en œuvre dans des conditions permettant d'une part d'initier la germination de façon homogène, et d'autre part de l'arrêter suffisamment tôt pour que la graine puisse être capable de réinitialiser efficacement la germination. Il y a donc un besoin de déterminer précisément les conditions du traitement d' imbibition, notamment la durée du traitement, afin de satisfaire les critères de qualité de semences. S'il est trop court, on n'observe pas d'effets bénéfiques sur la performance germinative. Au pire, il n'y a pas initiation de la germination. Une durée trop longue du traitement d' imbibition des graines a pour effet de réduire la longévité et la performance germinative des semences traitées séchées, ce qui rend leur conservation et la gestion des stocks de graines plus problématique, voire impossible.
De plus, si le traitement est mal conduit et échoue (de par la nature très hétérogène des lots de semences ou suite à une erreur de manipulation), le lot est perdu. Il est donc important de pouvoir effectuer un suivi du traitement d' imbibition afin de pouvoir si nécessaire l'adapter en cours de processus.
La qualité physiologique du lot de semences peut être notamment définie en termes de performance germinative et/ou d'aptitude à la conservation ainsi que de niveau d'hétérogénéité du lot.
La performance germinative (ou T (50)) d'un lot de semences est estimée par exemple par la vitesse de germination exprimée en heure pour atteindre 50% de germination après le semis dans des conditions précises définies pour chaque espèce ou variété selon les normes ISTA (International Seed Testing
Association). Il existe d'autres méthodes publiées dans la littérature telle que les mesures de la faculté germinative sous stress hydriques (Bettey and Finch-Savage, 1996, Seed
Science Research, 6 : 165-173)
L'aptitude à la conservation (ou P50) est définie par le temps de vieillissement pour obtenir 50% de germination pour un lot de semences à une humidité relative et température précises et contrôlées, par exemple 75% d'humidité relative et
35°C. Ce test d'aptitude à la conservation est connu des semenciers pour être un indicateur de la performance germinative (Ibrahim et al, 1993, Journal of seed technology,
17 : 29-37 et Ellis and Roberts, 1981, Seed Science and Technology, 9: 373-409) .
Toutefois, la durée nécessaire à la mise en œuvre des tests indiqués ci-dessus est de plusieurs jours à plusieurs semaines et est souvent plus longue que la durée traitement de prégermination en lui-même qui est de 3 à 7 jours.
Afin de contourner ce problème, des marqueurs moléculaires permettant le suivi de la prégermination ont été caractérisés. Toutefois, soit le procédé d'utilisation du marqueur reste lourd à mettre en oeuvre (par des mesures d'activité enzymatique ou de teneur en sucres solubles,
(Bettey and Finch-Savage, 1996, Seed Science Research, 6 :165-
173; EP 0 202 879) soit le marqueur en lui-même n'est pas spécifique de la semence.
Les Inventeurs ont constaté lors de l'imbibition de semences de Medicago truncatula , une corrélation linéaire significative entre d'une part la teneur en EM6, mesurée à l'aide d'un anticorps dirigé contre ladite protéine EM6, dans un extrait de protéines solubles de radicule non émergée et, d'autre part l'aptitude à la conservation des semences concernées. Ils ont en outre observé que le coefficient de linéarité entre la quantité d' EM6 et l'aptitude à la conservation reste stable même lorsque différentes conditions d' imbibition sont appliquées aux semences.
Les Inventeurs ont de plus constaté que l'anticorps dirigé contre EM6 de Medicago truncatula reconnaît les protéines homologues chez les semences ou embryons d' autres espèces de dicotylédones et de monocotylédones, et que la corrélation linéaire entre la quantité de protéine reconnue par cet anticorps dans la radicule non-émergée, et l'aptitude à la conservation est également observée chez ces autres espèces .
Il apparaît donc que la protéine EM6 est un marqueur robuste et parfaitement corrélé à l'aptitude à la conservation, et permettant donc de suivre l'évolution de celle-ci pendant les traitements d' imbibition d'un lot de semences .
Les Inventeurs ont en outre identifié, à partir de la protéine EM6 de Medicago truncatula, deux peptides permettant d'obtenir des anticorps capables de reconnaître des homologues d'EMβ chez d'autres espèces végétales, et utilisables comme l'anticorps dirigé contre la protéine EM6 entière, pour quantifier cette protéine, et suivre son évolution pendant un traitement d' imbibition.
La présente invention a pour objet un procédé de détermination de l'aptitude à la conservation d'un lot de semences subissant un traitement d' imbibition, caractérisé en ce qu' il comprend la quantification dans un échantillon de semences prélevé sur ledit lot, des protéines reconnues par un anticorps choisi parmi : a) un anticorps reconnaissant une protéine, dénommée ci-après protéine EM6, et présentant au moins 70%, de préférence au moins 75% et de manière tout à fait préférée au moins 80% d'identité, ou au moins 80%, de préférence au moins 85% et de manière tout à fait préférée, au moins 90% de similarité avec la protéine EM6 de Medicago truncatula identifiée par le numéro d'accès GenBank ABB13462 (et également représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1) , et contenant une région définie par la séquence générale (I) GXISX2GGX3TRX2X4QXSG (SEQ ID NO: 2) où Xi représente H ou R, X2 représente K ou R, X3 représente Q ou N, X4 représente E ou D, X5 représente L ou M, ou par la séquence générale (I bis) GXiSX2GX3X4TRX2XsQXeG (SEQ ID NO: 6) où Xi représente H ou R, X2 représente H, K ou R, X3 représente G ou A, X4 représente Q, H, E ou N, X5 représente E, Q ou D, X^ représente L, I ou M, et une région définie par la séquence générale (II) XIQX2X3X4XSGYX6X5MGX7X8 (SEQ ID NO: 3) où X1 représente D ou E, X2 représente L, ou M, X3 représente G ou S, X4 représente T, E ou Q, X5 représente E ou Q, Xe représente K, H, Q, S ou R, X7 représente R ou K et Xa représente K ou Q, ou par la séquence générale (II bis) X1QX2X3X4XsGYX6X5MX7X8X9 (SEQ ID NO: 7) où Xx représente D, Q ou E, X2 représente L, I ou M, X3 représente G ou A, X4 représente S, T, G, E, H, K ou Q, X5 représente E ou Q, X6 représente K, H, Q, S ou R, X7 représente G ou A, X8 représente R, K, P ou H et Xg représente K ou Q ; b) un anticorps dirigé contre une portion de ladite protéine EM6 comprenant au moins l'une des séquences (I), (I bis) , (II) ou (II bis) .
Selon un mode de mise en œuvre préféré du procédé de la présente invention, on utilise un anticorps dirigé contre une portion de ladite protéine EM6 comprenant au moins l'une des séquences GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO: 4) ou EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) . Sauf spécification contraire, les pourcentages d'identité et de similarité auxquels il est fait référence ici sont calculés en utilisant le logiciel BLAST (Altschul et al,
1997, Nucleic Acids Res., 25 : 3389-402), avec les paramètres par défaut.
Le procédé conforme à l'invention peut être mis en œuvre au cours d'une étape d' imbibition qui peut avoir lieu lors d'un conditionnement post-récolte et/ou un traitement prégerminatif ou de tout autre traitement aboutissant à une modification de la teneur en eau de la graine ou d'une partie de la graine soit dans le temps, soit dans sa répartition au sein des tissus de la graine.
On entend par traitement d' imbibition tout traitement contenant au moins une étape d'hydratation des semences, qui peut être réalisée soit en présence d'un osmoticum inerte comme le PEG ou un sel (par exemple KNO3) ou bien sans osmoticum (par exemple, hydroconditionnement, trempage). Parmi les traitements d' imbibition on peut notamment citer le traitement de prégermination, et divers procédés de conditionnement post-récolte de la semence comme par exemple l'enrobage ou le pelliculage. Les méthodes d'hydratation peuvent être variées et comprennent par exemple l'utilisation de vapeur d'eau, la mise en contact des graines avec un film liquide ou le trempage des graines. La représentation graphique de la corrélation entre la quantité d' EM6 détectée par le procédé conforme à l'invention et l'aptitude à la conservation et/ou la performance germinative peut être obtenue à partir d' au moins 3 points, correspondant chacun à un lot de semences ayant subi des traitements d' imbibition de durées différentes. On pourra en déduire directement le coefficient de linéarité, ce qui permet ensuite de déterminer quantitativement l'aptitude à la conservation, et ce quel que soit le traitement d' imbibition appliqué par la suite. L'homme du métier pourra, en quantifiant la teneur en protéine EM6 de l'échantillon, par exemple comparer les effets de différentes conditions opératoires d'un traitement donné sur l'aptitude à la conservation ou la performance germinative . Il pourra aussi comparer les effets d'un traitement d' imbibition au cours du temps.
Le procédé conforme à l'invention peut avantageusement être mis en œuvre pendant le traitement de prégermination afin de déterminer la durée du traitement pour obtenir un lot de semences avec une aptitude à la conservation désirée. Les quantités de protéine EM6 évoluant de façon linéaire avec l'aptitude à la conservation, les variations de quantités de protéine EM6 observées sont égales aux variations d'aptitude à la conservation.
Tout au long du traitement des échantillons de semences sont prélevés pour déterminer la teneur en EM6. Le traitement est arrêté pour une teneur d' EM6 correspondant à la valeur d'aptitude à la conservation désirée. Par exemple, pour les lots de semences âgées, une imbibition courte conduit à une augmentation de la teneur en EM6.
Si l'homme du métier ne connaît pas la valeur du coefficient de linéarité de l'espèce ou de la variété ou du lot de semences, il pourra préalablement au traitement en lui- même déterminer sur un échantillon de semences à traiter la valeur du coefficient de linéarité comme défini ci-dessus.
Le procédé conforme à l'invention peut être mis en œuvre sur des graines entières, ou sur des embryons ou des radicules non-émergées préalablement isolées des graines.
Avantageusement, le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre séparément sur des semences individuelles prélevées dans le lot à tester, ceci permet de déterminer le niveau d'hétérogénéité d'un lot de semences pour l'aptitude à la conservation.
La présente invention a également pour objet tout anticorps anti-EM6, dirigé contre une région de ladite protéine EM6 choisie parmi la région définie par les séquences
(I) ou (I bis) et la région définie par les séquences (II) ou (II bis) ci-dessus.
On définit ici comme anticorps dirigé contre une région d'une protéine EM6 tout anticorps capable de se lier de manière détectable avec la région concernée, sur la protéine EM6 entière ou sur un fragment de celle-ci, mais ne se liant pas de manière détectable avec une autre région de la même protéine. Dans le cas d'anticorps monoclonaux, ceci inclut tout anticorps reconnaissant un épitope situé dans ladite région ; dans le cas d'anticorps polyclonaux, ceci inclut toute préparation d' anticorps ne présentant pas de réactions croisées significatives avec d'autres régions de la protéine EM6.
En revanche, cet anticorps présentera avantageusement des réactions croisées avec la région homologue de protéines EM6 d'autres espèces végétales. Notamment, comme indiqué ci-dessus, des anticorps dirigés contre la région définie par la séquence (I) ou par la séquence (I bis) présentent généralement une spécificité très large et peuvent reconnaître une grande variété de protéines EM6 chez les monocotylédones ou les dicotylédones, alors que les anticorps dirigés contre la région définie par la séquence (II) ou par la séquence (II bis) présentent généralement une spécificité plus restreinte. Des anticorps conformes à l'invention peuvent être obtenus par des méthodes bien connues en elles-mêmes. Classiquement, on utilise comme immunogène un fragment de protéine EM-6 (sous forme d'un peptide naturel, recombinant, ou de synthèse) comprenant la région contre laquelle on souhaite diriger l'anticorps, ou au moins un fragment de cette région de taille suffisante pour constituer un épitope B (généralement au moins 5 à 7 acides aminés) . Si nécessaire, ledit peptide est mélangé à un adjuvant, ou couplé à une protéine porteuse, afin d'augmenter son immunogénicité . Les anticorps obtenus peuvent ensuite être purifiés, de manière également connue en elle-même. Généralement, cette purification comprend au moins une étape de chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est greffée le peptide contre lequel doit être dirigé l'anticorps. On peut également utiliser comme immunogène la protéine EM-6 entière, et effectuer une chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est greffée le peptide contre lequel doit être dirigé 1' anticorps. A titre d'exemples non-limitatifs d'anticorps anti- EM6 dirigés contre une région définie par la séquence générale (I), on peut citer des anticorps dirigés contre le peptide défini par la séquence GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO: 4) . 5 A titre d'exemples non-limitatifs d'anticorps anti-
EM6 dirigés contre une région définie par la séquence générale (II), on peut citer des anticorps dirigés contre le peptide défini par la séquence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) .
La présente invention a également pour objet un
LO procédé de quantification d'EMβ dans du matériel végétal, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact dudit matériel végétal avec un anticorps anti-EM6 conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet
L5 l'utilisation d'un anticorps anti-EM6 conforme à l'invention pour déterminer l'aptitude à la conservation d'un lot de semences .
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à
2.0 des exemples illustrant la mise en évidence de la corrélation linéaire entre la quantité d'EMβ et l'aptitude à la conservation .
EXEMPLE I : CORRELATION ENTRE L'APTITUDE A LA CONSERVATION ET LA QUANTITE DE EM6 DETERMINE EN ELISA CHEZ MEDICAGO 25 TRUNCATULA.
Traitement: d' imbibition et priming.
Un lot de graines de Medicago truncatula (var Parragio) est divisé par unité de 100 graines qui sont mises à imbiber dans une boîte de Pétri de 9 cm soit sur un papier 0 filtre Whatman n°l imbibé avec 4 ml d'eau distillée soit sur deux papiers filtres Whatman n°l imbibés avec 7 ml d'une solution de polyéthylène glycol (Sigma, Mw 6000-8000) équivalent à des potentiels hydriques calculés à partir de la formule de Michel and Kaufmann, 1973 (Plant Physiology 51: 5 914-916) . Les boîtes de Pétri sont ensuite placées à l'obscurité à 200C pendant différents temps. Ensuite, les graines sont éventuellement rincées rapidement à l'eau courante pour éliminer le PEG. Elles sont rapidement séchées dans une enceinte ventilée à 43% humidité relative à 200C à l'obscurité pendant 3 jours. Traitement de vieillissement
Les graines non traitées ou préalablement hydratées puis séchées sont déposées sur une grille dans une boite hermétiquement fermée contenant une humidité relative de 75%. Celle-ci est obtenue en déposant au fond de la boîte une solution saturée de NaCl. Les graines sont ainsi incubées à 35°C à l'obscurité pendant des temps croissants. Au cours du temps, 100 graines sont retirées de la boîte et mises à germer dans de l'eau distillée comme décrit ci-dessus. Au bout de 7 jours, on compte le nombre de graines germées. Une graine est considérée comme germée lorsque la radicule a émergé hors des téguments de la graine. L'aptitude à la conservation est exprimée en jours nécessaires pour obtenir 50% de germination pour chaque lot de semences vieillies P (50). Extraction des protéines et ELISA
Le protocole de préparation des extraits protéiques à partir des radicules de Medicago truncatula et celui des tests ELISA sont décrits dans Job et al, Seed Science Research, 1997 -.225-243. Les protéines présentes dans les extraits solubles sont alors dosées selon la méthode de Bradford (au moyen du kit Biorad Protein Assay, Biorad) . Les échantillons biologiques suivants ont été préparés selon cette méthode :
- radicules isolées de graines entières imbibées sans osmoticum respectivement pendant 3, 7, 11 et 15 heures à 200C à l'obscurité. - radicules isolées de graines entières imbibées pendant 1 jour et 3 jours dans une solution aqueuse de PEG à un potentiel hydrique de -IMPa et à -1.5MPa à 200C à 1' obscurité .
La préparation des échantillons peut se faire dans une plaque de microtitration ELISA de 96 puits standard (Greiner Bio-One ref 655161) . Les extraits protéiques solubles obtenus par la méthode décrite ci-dessus sont dilués dans du tampon PBS (15OmM NaCl, 1OmM Na2HPO4) à lOOng/μl. 2μl de ces dilutions sont additionnés à 248μl de tampon PBS. Ensuite, des dilutions successives au demi sont préparées à partir de l'extrait le plus concentré en prenant soin de bien homogénéiser les mélanges. Un volume de lOOμl de chaque concentration pour chaque échantillon est transféré dans une plaque de microtitration ELISA. La plaque avec les échantillons est incubée 30 minutes à 35°C, puis lavée 5 fois avec 125μl de
(PBS, 0.05% Tween-20) . Les anticorps primaires anti-EM6 de lapin dirigés contre la protéine EM6 recombinante entière de Medicago truncatula, ou anti-EM6-peptide II dirigé contre la séquence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) de la protéine EM6 de Medicago truncatula sont dilués au 1/1000 dans du tampon PBS. lOOμl de solution d'anticorps sont déposés par puit. La plaque est incubée 30 minutes à 35°C, puis lavée 5 fois avec 125μl de tampon (PBS + 0.05% Tween-20). Les anticorps secondaires couplés à la peroxydase (Anti Rabbit IGG Alkaline Phosphatase, Sigma) sont dilués au 1/10 000 dans du PBS seul. lOOμl de solution d'anticorps sont déposés par puit. La plaque est ensuite incubée 30 minutes à 35°C, puis lavée 5 fois avec 125μl de (PBS + 0.05% Tween-20) .
La microplaque est révélée par l'addition d'une solution contenant les substrats de la peroxydase susmentionnés (ABTS, Sigma) . lOOμl de révélateur ABTS sont déposés par puits. La réaction est suivie au spectrophotomètre à 405 nm dans un lecteur de microplaque, l'intensité de la coloration étant proportionnelle à la quantité d'antigène dans l'extrait de protéines solubles. L' absorbance est mesurée toutes les 5 à 10 minutes et ceci pendant Ih. Pour déterminer la valeur de la teneur relative en EM6, on calcule la pente de la droite de régression des valeurs d' absorbance en fonction de concentrations croissantes en extraits protéiques.
Les résultats sont illustrés par les Figures 1 et 2.
Légende de la Figure 1 :
A : % de germination à 20 °C en fonction du temps de vieillissement au cours du stockage à 35°C, 75%HR faisant suite à un traitement d' imbibition dans de l'eau distillée du durée croissante. Le témoin correspond à des graines non imbibées .
B : % de germination à 200C en fonction du temps de vieillissement au cours du stockage à 35°C, 75%HR faisant suite à un traitement d' imbibition en présence d' un osmoticum
(polyéthylène glycol) correspondant à deux potentiels hydriques (- 1 MPa et -1.5 MPa) pendant 1 ou 3 jours. Le témoin correspond à des graines non imbibées. Légende de la Figure 2 :
Corrélation entre la quantité de EM6 et l'aptitude à la longévité P (50) sur des lots de graines de Medicago truncatula imbibées dans de l'eau distillée en présence d'osmoticum (PEG) (cercles) et sans osmoticum (triangles). Les modalités des traitements d' imbibition sont (3, 7, 11 et 15 heures d' imbibition dans l'eau; 1 ou 3 jours dans une solution de PEG correspondant à un potentiel hydrique de -1,5 ou -1,0 MPa) . La quantité en EM6 est déterminée dans des extraits de protéines solubles de radicules par ELISA avec d'une part un anticorps anti-EM6 de lapin dirigé contre la protéine EM6 recombinante entière de Medicago truncatula (A) et d'autre part lλanticorps anti-EM6-peptide II dirigé contre la séquence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) de la protéine EM6 de Medicago truncatula (B) Le témoin représente des graines non germées. La
Figure 1 montre que indépendamment de la durée de 1' imbibition, le pourcentage de germination mesuré après 7 jours d' imbibition diminue en fonction de la durée du vieillissement. La Figure 1 permet de déterminer l'aptitude à la conservation (P50) pour chaque traitement. On constate que plus la durée du traitement d' imbibition augmente plus la valeur de P (50) diminue, quel que soit le type de traitement d' imbibition appliqué (dans de l'eau distillée (A) ou dans une solution aqueuse de PEG (B) ) . La Figure 2 montre qu' il existe une relation linéaire significative entre le teneur en EM6, déterminée par un test ELISA avec deux anticorps différents et P (50) obtenus en fonction des modalités du traitement d' imbibition. De plus, le coefficient de corrélation est conservé quelque soit le type de traitement d' imbibition utilisé (avec ou sans osmoticum) . Le test ELISA mis en place permet donc de distinguer des graines de Medicago truncatula prétraitées selon leur aptitude à la conservation.
EXEMPLE II : CORRELATION ENTRE LA PERFORMANCE GERMINATIVE ET LA QUANTITE D'EM6 CHEZ MEDICAGO TRUNCATULA.
Les échantillons protéiques extraits de radicules isolées de graines traitées sont préparés selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Pour déterminer les vitesses d' imbibition (T50), les graines traitées sont séchées comme décrit dans l'exemple 1. Ensuite 100 graines sont mises à imbiber à 200C comme décrit dans l'exemple 1. Les graines ayant germé sont comptées toutes les 2 heures. Les pourcentages de germination sont portés dans un graphique en fonction du temps d' imbibition afin de déterminer le temps nécessaire pour obtenir 50% de germination pour chaque lot de graines (T20) .
Les résultats sont synthétisés dans la Figure 3. Légende de la Figure 3 :
Corrélation entre la quantité d'EMβ et la performance germinative, mesurée par la vitesse de la germination T (50) sur des lots de graines de Medicago truncatula imbibées dans de l'eau distillée en présence d'osmoticum (PEG) (triangles) et sans osmoticum (cercles). Les modalités des traitements d' imbibition sont : 3, 7, 11 et 15h heures d' imbibition dans l'eau; 1 ou 3 jours dans une solution de PEG correspondant à un potentiel hydrique de -1,5 ou -1,0 MPa) . La quantité en EM6 est déterminée dans des extraits de protéines solubles de radicules par test ELISA avec d'une part un anticorps anti-EM6 de lapin dirigé contre la protéine EM6 recombinante entière de Medicago truncatula (A) et d'autre part l'anticorps anti-EM6-peptide II dirigé contre la séquence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) de la protéine EM6 de Medicago truncatula (B)
Au préalable, on a pu vérifier que plus la durée du traitement d' imbibition augmente, plus le T (50) diminue. Les résultats de la Figure 3A et B montrent qu' il y a bien corrélation linéaire significative entre la T50 et le teneur en EM6 déterminé par test ELISA en présence de deux anticorps différents. Ainsi la teneur en Em6 est étroitement corrélée à la vigueur germinative des lots. EXEMPLE III : REACTIVITE DES ANTICORPS ANTI-EM6 SUR DES EXTRAITS PROTEIQUES DE GRAINES DICOTYLEDONES ET MONOCOTYLEDONES
D'autres expérimentations ont été réalisées sur des lots de semences d'autres espèces afin de déterminer si les anticorps anti anti-EM6-peptide I et anti-EM6-peptide II reconnaissaient des homologues d'EMβ chez ces autres espèces.
Les résultats sont synthétisés dans la Figure 4.
Légende de la Figure 4 :
A+C : Reconnaissance spécifique antigène-anticorps par la technique de Western blot à partir d'extraits protéiques solubles de graines de 13 espèces (couloir 1 à 13) au moyen de l'anticorps anti-EM6-peptide II dirigé contre la séquence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) de la protéine EM6 de Medicago truncatula . Au préalable, 2,5-30 μg de protéines selon les espèces ont été séparées par gel d' électrophorèse selon leur poids moléculaire (marqueur moléculaire indiqué sur le couloir gauche, ) et transférées sur membrane de nitrocellulose . L'assignation des couloirs à chaque espèce et la concentration protéiques correspondantes sont les suivantes : 1, céleri (25μg de protéine); 2, carotte ( 25μg) ; 3, concombre (30 μg) ; 4, poireau (15 μg) ; 5, ciboulette (15 μg) ; 6, oignon ( 15μg) ; 7, impatience (15 μg) ; 8, pétunia (15 μg) ; 9, pensée (15 μg) ; 10, radis (2,5 μg) ; 11, brocoli (2,5 μg) ; 12, colza (2,5 μg) ; 13 choux (2,5 μg) . B+D : Reconnaissance spécifique antigène-anticorps par la technique de Western blot à partir d'extraits protéiques solubles de graines de 13 espèces (couloir 1 à 13) au moyen de l'anticorps anti-EM6-peptide I dirigé contre la séquence GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO: 4) de la protéine EM6 de Medicago truncatula. L'assignation des couloirs et concentrations protéiques pour chaque espèce sont identiques à celles susmentionnées. E+F : Reconnaissance spécifique antigène-anticorps par la technique de Western blot à partir d'extraits protéiques solubles de radicules isolées de 7 espèces au moyen de l'anticorps anti-EM6-peptide II (E) et anti-EM6-peptide I (F) L'assignation des couloirs à chaque espèce et la concentration protéiques correspondantes sont les suivantes : 14, Medicago truncatula (30 μg) ; 15, niébé ( 15 μg) ; 16, soja (15 μg) ; 17, pois (15 μg) ; 18, haricot (15 μg) ; 19, mais (15 μg) • Les échantillons protéiques extraits de graines entières sèches ou de radicules isolées de graines sèches sont préparés selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12 % (m/v) , les gels sont équilibrés deux fois 10 min dans un tampon de transfert (Tris HCl 8 mM [pH 6,8], glycine 61 mM, méthanol 20 % (v/v) ) .
Les membranes en polyvinylidine difluoride (PVDF) ou Immobilon
(Millipore) sont incubées 10 secondes dans du méthanol pur puis équilibrées dans le tampon de transfert. Le transfert semi-sec (Biorad) est effectué sous un courant de 15V pendant 15 minutes. La détection est effectué selon Boudet et al, 2006, Plant Physiology, 140 : 1418-1436. La dilution de l'anticorps primaire anti-EM6-peptide I et peptide II est l/10000ème. La révélation est effectuée par chemiluminescence en utilisant le kit Immun-Star Western C (Biorad) , dans les conditions préconisées par le fabricant. La prise de vue est réalisée avec l'imageur Chemidoc (Biorad) après optimisation de l'exposition du signal selon les conditions préconisées par le fabricant.
Ces résultats montrent qu' il y a une réaction croisée entre les anticorps dirigés contre les séquences peptidiques de la protéine EM6 de Medicago truncatula et les homologues de EM6 de dicotylédones ou de monocotylédones . Pour la plupart des espèces, une ou deux bandes majeures sont détectés par les deux anticorps. Ces résultats démontrent la spécificité de l'anticorps et l'existence de plusieurs épitopes communs en quantité significative. EXEMPLE IV : CORRELATION ENTRE L'APTITUDE A LA CONSERVATION DE SEMENCES DE TOURNESOL ET LA QUANTITE EN EM6 DETERMINE PAR ELISA
Des expérimentations ont été effectuées afin de valider sur le tournesol la corrélation entre l'abondance en EM6 et la performance germinative après des traitements d' imbibition avec ou sans osmoticum (PEG).
Traitement d' imbibition et priming
Un lot de graines de tournesol est divisé en unités de 80 graines qui sont mises à imbiber en présence d'eau distillée ou une solution aqueuse de PEG comme décrit dans l'exemple I. Les graines sont ensuite placées à l'obscurité à 200C pendant des durées croissantes (Oh, 6h et 15h dans l'eau et 48h dans la solution de PEG à -1,5 MPa). Ensuite, elles sont éventuellement rapidement rincées à l'eau courante pour éliminer le PEG puis rapidement séchées dans une enceinte ventilée à 43% humidité relative à 200C à l'obscurité pendant 3 jours. Traitement de vieillissement Les graines non traitées ou préalablement hydratées puis séchées sont mises à vieillir selon le protocole décrit dans l'exemple I. Au cours du stockage, 80 graines sont retirées successivement et mises à germer dans des conditions décrites dans l'exemple I. Au bout de 7 jours, on compte le nombre de graines germées. L'aptitude à la conservation est mesurée par le P(75), définie par le temps de vieillissement nécessaire pour obtenir 75% de germination pour le lot de semences .
Extraction des protéines et test ELISA Le protocole de préparation des extraits protéiques à partir de radicules isolées et la quantification des protéines sont décrits dans l'exemple I. La préparation des échantillons pour le test ELISA est décrite dans exemple I mise à part que les dilutions successives au demi sont faites à partir d'une concentration protéique de lOOng/μl. La procédure décrite dans l'exemple I a été suivie en utilisant l'anticorps anti-EM6-peptide II dirigé contre la séquence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) de la protéine EM6 de Medicago truncatula .
Les résultats sont illustrés par la Figure 5.
Légende de la Figure 5 : Relation entre la quantité relative de EM6
(déterminée par test ELISA à partir d'extraits protéiques solubles de radicules isolées au moyen de l'anticorps anti- EM6-peptide II) et l'aptitude à la longévité de graines de tournesol ayant subi différents traitements d' imbibition. Les graines ont été imbibées pendant des temps croissants (indiqués sur la Figure) dans de l'eau distillée (cercles) ou 48 h en présence d'une solution aqueuse de PEG correspondant à un potentiel hydrique de -1.5 MPa ) (cercles). L'aptitude à la longévité correspond ici au temps nécessaire pour obtenir 75% de germination après vieillissement après stockage à 350C, 75 % HR
Utilisé dans les tests ELISA tels que décrits pour Medicago truncatula, l'anticorps anti-EM6-peptide II donne chez le tournesol, le même résultat que dans les exemples décrits ci-dessus. En particulier, la Figure 5 montre qu'il existe une relation corrélation linéaire (coefficient de corrélation = 0.971) entre la quantité relative de EM6 et l'aptitude à la longévité P (75) obtenue pour les différents traitements d' imbibition. Plus la longévité diminue et plus la teneur relative en EM6 diminue de manière proportionnée quelque soit le type de traitement d' imbibition utilisé. Par ailleurs, ces résultats indiquent également qu'il n'est pas impératif de réaliser une expérience de vieillissement suffisamment longue pour atteindre la valeur de P50. EXEMPLE V : CORRELATION ENTRE LA QUANTITE EN EM6 DETERMINE PAR ELISA ET L'AMELIORATION DE L'APTITUDE A LA CONSERVATION D'UN LOT DE SEMENCES D'OIGNON AGEES PAR TREMPAGE DANS DE L'EAU DISTILLEE.
Un des objectifs d'une imbibition prégerminative est d'éliminer les effets d'un vieillissement subis par un lot de semences trop âgées ou stocké dans de mauvaises conditions. Des expériences ont été effectuées pour montrer qu'EMβ est corrélée à l'aptitude à la longévité lorsque celle-ci évolue en fonction de la durée du trempage dans des semences d' oignon âgées .
Traitement: d/ imbibition et de vieillissement
Un lot de graines d'oignon naturellement vieilli est divisé en unités de 80 graines et mis à imbiber selon le protocole décrit dans l'exemple I. Ensuite, les graines sont rapidement séchées dans une enceinte ventilée à 43% humidité relative à 200C à l'obscurité pendant 3 jours. La procédure décrite dans l'exemple I est suivie pour le traitement de vieillissement des graines.
Extraction des protéines et test ELISA
Le protocole de préparation des extraits protéiques et la quantification des protéines sont décrits dans l'exemple I. La préparation des échantillons et le test ELISA sont décrits dans l'exemple I mise à part que les dilutions successives au demi sont réalisées à partir d'une concentration protéique de lμg/μl. Dans cette expérience, l'anticorps anti-EM6-peptide II dirigé contre la séquence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) de la protéine EM6 de Medicago truncatula a été utilisé.
Les résultats sont illustrés par la Figure 6.
Légende de la Figure 6 :
A. Effet de la durée de l' imbibition dans de l'eau distillée à 200C à l'obscurité de graines d'oignon naturellement vieillies sur l'aptitude à la longévité (P(50).
B. Relation entre la quantité relative de EM6, déterminée par test ELISA au moyen de l'anticorps anti-EM6- peptide II dirigé contre la séquence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) de la protéine EM6 de Medicago truncatula et l'aptitude à la longévité P (50) selon des temps croissants d' imbibition
(indiqués sur la Figure) .
La Figure 6A montre qu'entre 10 et 17 heures d' imbibition, la valeur de P50 augmente de 8 à 12,5 jours.
Ensuite, elle diminue après 24h d' imbibition et stabilise autour d'une valeur de P50 équivalente à 9-10 jours. Dans la
Figure 6B, on a porté la teneur en EM6 en fonction de l'ensemble des valeurs de P50 obtenues après des temps croissants d' imbibition. On observe bien qu'il existe une relation linéaire entre la quantité relative d' EM6 dans les radicules et l'aptitude à la longévité.
EXEMPLE VI : CORRELATION ENTRE LA QUANTITE EN EM6 DETERMINEE PAR WESTERN BLOT ET ANALYSE D'IMAGE ET L'AMELIORATION DE L'APTITUDE A LA CONSERVATION D'UN LOT DE GRAINES DE BROCOLI.
Il n'est toujours possible (faute de temps ou d'une quantité de graines suffisante) d'effectuer une étude exhaustive de la perte de la faculté germinative au cours de vieillissement, telle que décrite dans l'exemple 1. L'expérience ci-dessous montre que la teneur en EM6 prédit l'aptitude à la longévité de graines de brocoli lorsqu'un seul point de vieillissement est réalisé. Elle montre également que la détermination d' EM6 peut être réalisée par western blot combiné à une quantification du signal par analyse d'image. Traitement: d' imbibition et vieillissement
Un lot de graines de brocoli est divisé en unité de 100 graines et mis à imbiber selon le protocole décrit dans l'exemple I. Les boîtes de Pétri sont ensuite placées à l'obscurité à 200C pendant des durées croissantes ( 6h et 15h dans l'eau et 24 et 48h dans la solution de PEG correspondant à un potentiel hydrique de -1,5 MPa. Ensuite, les graines sont éventuellement rapidement rincées à l'eau courante pour éliminer le PEG. Elles sont rapidement séchées dans une enceinte ventilée à 43% humidité relative à 200C à l'obscurité pendant 3 jours. Les graines non traitées ou préalablement hydratées puis séchées sont ensuite stockée dans une humidité relative à 35°C selon le protocole décrit dans l'exemple I. Après 19 et 25 jours de vieillissement, 100 graines sont mises à germer dans des conditions décrites dans l'exemple I. Au bout de 7 jours, on compte le nombre de graines germées.
Extraction des protéines , Western blot et quantification du signal
Le protocole de la préparation des extraits protéiques à partir de radicules isolées et la quantification des protéines sont décrits dans l'exemple I. Un μg d'extraits protéiques est séparé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12 % (m/v) comme décrit dans l'exemple II et transféré sur membrane en polyvinylidine difluoride immobilon
(Mill-ipore) . Le transfert semi-sec (Biorad) est effectué sous un courant de 15V pendant 15 minutes. La détection de EM6 est effectuée selon Boudet et al, 2006, Plant Physiology, 140 :
1418-1436. La dilution de l'anticorps primaire anti-EM6- peptide I dirigé contre la séquence GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO:
4) de la protéine EM6 de Medicago truncatula est de l/10000ème. La révélation est effectuée par chemiluminescence en utilisant le kit Immun-Star Western C (Biorad) dans les conditions préconisées par le fabricant. La prise de vue et la quantification du signal sont réalisées au moyen d'un imageur (Chemidoc Biorad) après optimisation de l'exposition selon les conditions préconisées par le fabricant. Les résultats sont illustrés par la Figure 7.
Légende de la Figure 7 :
Relation entre la quantité relative en EM6 dans des radicules isolées de graines de brocoli ayant subi différents traitements d' imbibition et les pourcentages de germination obtenus après 19 (triangle) et 25 (cercle) jours de vieillissement à 35°C, 75% HR. Chaque symbole représente différentes modalités d' imbibition qui sont indiquées sur la Figure. EM6 a été quantifiée par analyse d'image après western blot au moyen de l'anticorps anti-EM6-peptide I. L'aptitude à la longévité de graines ayant subi différents traitements d' imbibition a été mesurée après 19 (triangles) et 25 (cercles) jours de vieillissement à 75% HR et 35°C. La Figure 7 montre qu'il existe une relation linéaire (coefficient de corrélation = 0.92 et 0.97) entre l'aptitude à la longévité et la quantité relative en EM6 dans les radicules de brocoli : plus la performance germinative mesurée par un seul point de vieillissement diminue et plus la teneur relative en EM6 diminue de manière proportionnée quelque soit le type de traitement d' imbibition utilisé. Les résultats montrent également que la technique de western blot et analyse d' image peut se substituer avantageusement au test ELISA.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de détermination de l'aptitude à la conservation d'un lot de semences subissant un traitement d' imbibition, caractérisé en ce qu'il comprend la quantification dans un échantillon de semences prélevé sur ledit lot, des protéines reconnues par un anticorps choisi parmi : a) un anticorps reconnaissant une protéine, dénommée ci-après protéine EM6, et présentant au moins 70%, de préférence au moins 75% et de manière tout à fait préférée au moins 80% d'identité, ou au moins 80%, de préférence au moins 85% et de manière tout à fait préférée, au moins 90% de similarité avec la protéine EM6 de Medicago truncatula GenBank ABB13462 (SEQ ID NO: 1), et contenant une région définie par la séquence générale (I) GX1SX2GGX3TRX2X4QX5G (SEQ ID NO: 2) où Xi représente H ou R, X2 représente K ou R, X3 représente Q ou N, X4 représente E ou D, X5 représente L ou M, ou par la séquence générale (I bis) GXiSX2GX3X4TRX2X5QXeG (SEQ ID NO: 6) où Xx représente H ou R, X2 représente H, K ou R, X3 représente G ou A, X4 représente Q, H, E ou N, X5 représente E, Q ou D, X6 représente L, I ou M, et une région définie par la séquence générale (II) XIQX2X3X4X5GYX6X5MGX7X8 (SEQ ID NO: 3) où Xi représente D ou E, X2 représente L, ou M, X3 représente G ou S, X4 représente T, E ou Q, X5 représente E ou Q, X6 représente K, H, Q, S ou R, X7 représente R ou K et Xa représente K ou Q, ou par la séquence générale (II bis) XiQX2X3X4X5GYX6X5MX7X8X9 (SEQ ID NO: 7) où Xi représente D, Q ou E, X2 représente L, I ou M, X3 représente G ou A, X4 représente S, T, G, E, H, K ou Q, X5 représente E ou Q, X6 représente K, H, Q, S ou R, X7 représente G ou A, X8 représente R, K, P ou H et Xg représente K ou Q ; b) un anticorps dirigé contre une portion de ladite protéine EM6 comprenant au moins l'une des séquences (I), (I bis) , (II) ou (II bis) . 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met en œuvre un anticorps anti-EM6 choisi parmi : - un anticorps dirigé contre un peptide de séquence GRSKGGQTRKEQLG (SEQ ID NO: 4)
- un anticorps dirigé contre un peptide de séquence EQLGTEGYQEMGRK (SEQ ID NO: 5) .
5 3) Anticorps anti-EM6 choisi parmi :
- un anticorps dirigé contre un peptide défini par la séquence générale SEQ ID NO: 2 ;
- un anticorps dirigé contre un peptide défini par la séquence générale SEQ ID NO: 6 ;
LO - un anticorps dirigé conte un peptide défini par la séquence générale SEQ ID NO: 3 ;
- un anticorps dirigé contre un peptide défini par la séquence générale SEQ ID NO: 7.
4) Anticorps anti-EM6 selon la revendication 3, L5 choisi parmi :
-un anticorps dirigé contre le peptide de séquence SEQ ID NO: 4 ;
- un anticorps dirigé conte le peptide de séquence générale SEQ ID NO: 5.
20 5) Procédé de quantification de EM6 dans du matériel végétal, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact dudit matériel végétal avec un anticorps anti-EM6 selon une quelconque des revendications 3 ou 4.
6) Utilisation d'un anticorps anti-EM6 selon une 5 quelconque des revendications 3 ou 4 pour évaluer l'aptitude à la conservation d'un lot de semences.
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