EP2134859A1 - Timp-4 als biomarker zur diagnose einer herzinsuffizienz - Google Patents

Timp-4 als biomarker zur diagnose einer herzinsuffizienz

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EP2134859A1
EP2134859A1 EP08734838A EP08734838A EP2134859A1 EP 2134859 A1 EP2134859 A1 EP 2134859A1 EP 08734838 A EP08734838 A EP 08734838A EP 08734838 A EP08734838 A EP 08734838A EP 2134859 A1 EP2134859 A1 EP 2134859A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
timp
sample
heart failure
diagnosed
amount
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08734838A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hendrik Milting
Frank Kramer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Bayer Schering Pharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Schering Pharma AG filed Critical Bayer Schering Pharma AG
Publication of EP2134859A1 publication Critical patent/EP2134859A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/8146—Metalloprotease (E.C. 3.4.24) inhibitors, e.g. tissue inhibitor of metallo proteinase, TIMP
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Definitions

  • TIMP-4 as a biomarker for the diagnosis of heart failure
  • the invention relates to the use of the plasma concentration of tissue inhibitor of metalloproteinases-4 (TIMP-4) 1 as a biomarker for the diagnosis of diastolic and systolic heart failure (DHF, SHF), right heart, left heart, and global heart failure (GHF).
  • DHF diastolic and systolic heart failure
  • GHF global heart failure
  • acute or chronic, as well as underlying cardiomyopathies such as myocarditis and hypertrophic cardiomyopathy (HCM), dilated cardiomyopathy (DCM), arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVCM), restrictive cardiomyopathy (RCM).
  • HCM hypertrophic cardiomyopathy
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • ARVCM arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy
  • RCM restrictive cardiomyopathy
  • pulmonary arterial hypertension PAH
  • pulmonary hypertension in left heart disease pulmonary hypertension associated with hypoxia
  • pulmonary hypertension due to chronic thrombotic and / or embolic disorders pulmonary hypertension due to sarcoidosis
  • Histiocytosis X Lymphangioleiomyomatosis Subject of the invention.
  • biomarker for diagnosis in particular includes the following uses:
  • events such as a local ischemic insult (myocardial infarction) or viral myocarditis damage the heart muscle irreversible and thus form the basis for the development of the disease, but also creeping processes, such as persistent arterial hypertension or pulmonary arterial hypertension lead to far-reaching changes in the homeostasis of the body.
  • the increased volume load of the heart is initially compensated by a myocardial hypertrophy, but eventually leads to creeping damage to the cellular structures of the heart.
  • the most important pathological changes in these processes are neurohormonal changes 2 , local and systemic inflammation 3 , necrosis and apoptosis of cardiomyocytes 4 ' 5 and the influence of renal elimination of electrolytes and water 6 .
  • the aforementioned damaging influences lead to the activation of a gradual process of transformation of the heart tissue, which in its consequence leads to the incorporation of collagenous structures into the myocardium and thereby negatively influences the functionality of the heart in various respects 7 .
  • Interstitial fibrosis on the one hand leads to a stiffening of the myocardium and thus to a limited contractility, but on the other hand impedes the electrophysiological stimulus transmission and thus the excitation of the cardiomyocytes, which additionally reduces the pumping power of the heart.
  • a manifest heart failure is characterized by a limited pumping function of the heart, which leads to underperfusion and thus to insufficient oxygen and nutrient supply to the organs, as a result of which body performance is slightly to very severely restricted.
  • heart failure is a progressive disease that, in addition to severely limiting the patient's ability to perform and a. U. severely impaired quality of life is associated with a very poor prognosis.
  • NYHA class patients are characterized by:
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • TIMPs ⁇ 2- macroglobulins or regulated l0 endogenous inhibitors
  • the therapy of heart failure is essentially geared to this
  • the pharmacological evidence-based therapy of chronic heart failure of NYHA classes I-IV is characterized by the Use of inhibitors of the angiotensin converting enzyme (ACE inhibitor), beta-receptor antagonists (ß-blockers) and aldosterone antagonists.
  • ACE inhibitor angiotensin converting enzyme
  • ß-blockers beta-receptor antagonists
  • aldosterone antagonists aldosterone antagonists
  • Angiotensin receptor antagonists are used.
  • Ventricular Assistant Devices VAD
  • heart transplantation remains the last life-sustaining treatment option, depending on the type of disease.
  • NYHA Class III and IV heart failure patients with ⁇ 35% ejection fraction who also have ECG abnormalities such as nonsynchronized contractions of the ventricles, benefit from implantation of a biventricular pacemaker in addition to pharmacotherapy.
  • This resynchronization therapy usually leads to a significant improvement in the symptoms and, consequently, to a gain in quality of life.
  • implantation of a biventricular pacing system improves patient compliance and has been shown to reduce their rehospitalization rate and mortality 19 .
  • LVAD Left ventricular assist devices
  • LVAD cardiac output support generally improves the overall condition of patients undergoing inpatient intensive care
  • LVADs are switched between the left ventricle and the aorta.
  • Heart transplantation or the implantation of an artificial heart is the last option to preserve the life of terminal heart failure patients, who are dependent on in-patient intensive care.
  • this protein class include the atrial natriuretic peptide (ANP) and the B-type natriuretic peptide (BNP), which are the only plasma markers to date for the evaluation of cardiac insufficiency in hospitals.
  • the BNP precursor hormone pre-proBNP is secreted by cardiomyocytes when they are exposed to increased stretch, such as occurs in an increased volume load of the heart. In the circulation, there is an enzymatic cleavage of the pre-proBNP into the vasoactive BNP (C-terminus of the pre-proBNP) and the biologically inactive NT-proBNP (N-terminus of the pre-proBNP) 23 .
  • NT-proBNP both the plasma concentration of NT-proBNP and that of the biologically active BNP correlate very well with the output of the heart.
  • an automated NT-proBNP analysis has found its way into everyday clinical practice.
  • an NT-proBNP level of ⁇ 300 pg / mL is an indication that 83% chance of excluding chronic heart failure.
  • NT-proBNP levels above 900 pg / mL suggest 87% chance of CHR 24 24 .
  • the BNP plasma concentration only provides information about the volume load of the heart, but the manifestation of heart failure Significantly characterized by fibrotic remodeling processes of the heart tissue, these neurohumoral markers reflect only a partial aspect of the disease. Furthermore, the predictive value of plasma BNP or NT-proBNP levels is limited by the fact that there is an increased release of natriuretic peptides in diseases other than heart failure. Especially with a restriction of renal function to a glomerular filtration rate ⁇ 60 mL / min. Significantly increased BNP plasma concentrations occur 25 . In addition, non-alcohol-induced cirrhosis of the liver 26 , intense exercise 27 , type I diabetes mellitus 28 and infusion of larger amounts of fluid lead to an increase in BNP levels. The evaluation of the BNP plasma concentration is further complicated by the fact that there is an inverse correlation between the body mass index (BMI) and the BNP or NT-proBNP plasma levels 29 .
  • BMI body mass index
  • the invention is based on the object to overcome the disadvantages and limitations of the prior art, in particular the limitations of the diagnosis by means of the BNP and NT-proBNP levels, and to idcntifizieien a plasma marker, which can be used for the diagnosis of heart failure. Furthermore, the identified cardiac insufficiency plasma marker should complement or replace the insights that can be obtained by an imaging or other diagnostic procedure in the sense of a surrogate marker.
  • TIMP-4 plasma concentrations can be distinguished between healthy volunteers and heart failure patients. Due to the biological function of TIMP-4, TIMP-4 mimics fibrotic heart remodeling processes better than, for example, NT-ProBNP and is not affected by the volume load. This precludes, for example, influencing the diagnosis by a previous infusion or diabetes. Further, in heart failure patients, TIMP-4 plasma concentrations correlated with functional parameters of the heart, which had been collected by imaging or other diagnostic methods.
  • the invention relates to methods of using TIMP-4 as a biomarker for the diagnosis of heart failure in a mammal comprising the steps of: a) obtaining a sample to be diagnosed from a mammal
  • the invention further provides methods for using TIMP-4 as a biomarker for the diagnosis of heart failure in a mammal, comprising the steps of:
  • An additional subject of the invention are methods of using TIMP-4 as a biomarker for the diagnosis of heart failure in a mammal comprising the steps of:
  • the invention further provides methods for using TIMP-4 as a biomarker for the diagnosis of heart failure in a mammal, comprising the steps of:
  • the method according to the invention describes the use of TIMP-4 as a biomarker for the diagnosis of cardiac insufficiency.
  • the use of TIMP-4 as a diagnostic biomarker is based on comparing the TIMP-4 amount in a sample to be diagnosed with the
  • TIMP-4 amount in a control sample or a TIMP-4 control value is diagnosis of a
  • Heart failure is about comparing the amount of TIMP-4 in the one being diagnosed
  • TIMP-4 from the sample to be diagnosed allows the diagnosis of heart failure.
  • Comparison of the amount of TIMP-4 can be made by relative or absolute TIMP-4 amount.
  • the absolute amount of TIMP-4 can be determined by means of a standard calibration curve using known amounts of TIMP-4. The person skilled in the art knows from the prior art how such experiments are carried out.
  • the diagnosis of heart failure is made when the TIMP-4 amount in the sample to be diagnosed is higher than in the control sample, more preferably an increase by at least a factor of 1.5; 2; 2.5; 5; 7,5 or> 10.
  • the sample to be diagnosed and the control sample are obtained from a mammal.
  • the sample to be diagnosed and the control sample consist of a body fluid, particularly preferably blood, or samples obtained therefrom, such as serum or plasma.
  • the sample to be diagnosed and the control sample are human.
  • the sample to be diagnosed and the control sample are obtained from analogous tissues or body fluids.
  • the normal or control values for TIMP-4 are obtained using the control sample derived from healthy mammals.
  • the control sample can be obtained by collecting several separate or even pooled samples from mammals. The skilled worker knows how many samples must be used to obtain a statistically relevant statement.
  • the control sample may be withdrawn at an earlier time, or the amount of TIMP-4 in one or more control samples, or the TIMP-4 control value may be determined earlier and for example in a database, internet publication, electronically recordable Or deposited in a publication.
  • the amount of TIMP-4 is determined by the amount of TIMP-4 polypeptide in the sample.
  • the person skilled in the art knows methods in the prior art to quantitatively detect polypeptides. Examples are antibody-based methods such as ELISA, RIA or Western Blot. Another method is, for example, the Planar Wave Guide technology. The person skilled in the art knows methods in the prior art to generate anti-TIMP-4 antibodies.
  • a TIMP-4 polypeptide is selected from a group consisting of a polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 1, a polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 1, a polypeptide derived by a TIMP-4 polynucleotide (SEQ ID NO: 2), and polypeptides having at least 99%, 98%, 95%, 90%, 88% or 80% identity with any of the TEVIP-4 polypeptides listed above.
  • the TIMP-4 polypeptide sequence is described in reference '.
  • the amount of TIMP-4 is determined by the amount of TIMP-4 polynucleotide in the sample.
  • the person skilled in the art knows methods in the prior art in order to quantitatively detect polynucleotides. Examples are Northern Blot, Realtime PCR or TaqMan. Another method is, for example, the Planar Wave Guide technology.
  • the method according to the invention is particularly preferred for the diagnosis of heart failure selected from the group consisting of the diastolic and systolic Cardiac insufficiency (DHF, SHF), right-heart, left-heart, and global heart failure (GHF) in acute or chronic forms, as well as underlying cardiomyopathies, such as myocarditis and hypertrophic cardiomyopathy (HCM), dilated cardiomyopathy ( DCM), arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVCM), restrictive cardiomyopathy (RCM) and right heart hypertrophy and right heart failure based on pulmonary arterial hypertension (PAH), pulmonary hypertension in left heart disease, pulmonary hypertension associated with hypoxia, pulmonary hypertension chronic thrombotic and / or embolic diseases and pulmonary hypertension due to sarcoidosis, histiocytosis X, lymphangioleiomyomatosis.
  • HCM hypertrophic cardiomyopathy
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • ARVCM ar
  • the method according to the invention is used for the diagnosis of the abovementioned diseases and pathological changes.
  • the method according to the invention is used to diagnose the severity of the abovementioned diseases and pathological changes.
  • the amount of TIMP-4 in diseased mammals classified into defined groups according to certain criteria, such as NYHA criteria may be determined as the TIMP-4 co-assay or TIMP-4 control value.
  • TIMP -4 is used as a therapy-accompanying biomarker in the method according to the invention for the diagnosis and monitoring of the effects of interventions, such as pharmacotherapy, surgical interventions, use of medical products and therapy-accompanying measures for the abovementioned disorders and pathological changes.
  • interventions such as pharmacotherapy, surgical interventions, use of medical products and therapy-accompanying measures for the abovementioned disorders and pathological changes.
  • a sample to be diagnosed can be taken and analyzed according to the method according to the invention. If the amount of TIMP-4 does not change or only marginally during therapy, the therapy can not be considered successful. If this is the case, re-therapy with a different dosage, for example an increased dose, or another dosage form may be considered. Furthermore, additional or different therapy may be considered.
  • the method according to the invention can also be used in clinical studies for diagnosis a therapeutic success can be used.
  • This invention is directed to methods of using TIMP-4 as a biomarker to diagnose the efficacy of heart failure therapy in a
  • the invention further provides methods for using TIMP-4 as a biomarker to diagnose the efficacy of a heart failure therapy in a mammal comprising the steps of:
  • TIMP-4 as a biomarker to diagnose the efficacy of a heart failure therapy in a mammal comprising the steps of:
  • the method according to the invention can be used as a surrogate marker which replaces the determination of another parameter which helps to assess the above-mentioned disease and pathological changes.
  • the method of the invention may be selected from one of blood pressure, heart rate, systemic vascular resistance, fractional shortening (FS), end-diastolic diameter (EDD), end-systolic diameter, with one or more known clinical markers and diagnostic methods (ESD), Ejection Fraction (EF), Left Ventricular Contractility (LVC), Systolic Pulmonary Arterial Pressure (PAP sys ), Diastolic Pulmonary Arterial Pressure (PAP d , a ), Left Ventricular End Diastolic Pressure (LVEDP), 6-minute walk , Spiroergometry, Metabolites, BNP, CRP, ANP, Electrocardiogram (ECG),
  • PET Positron emission tomography
  • CT computed tomography
  • Magnetic resonance imaging MRI
  • functional magnetic resonance imaging fMRI
  • diffusion tensor imaging DT-MRI
  • echocardiography ultrasound and impedance cardiography
  • the black box represents 50% of all individual values (25th-75th percentile), the white bar indicates the median, the end of the vertical line represents the lowest and highest reading.
  • A collective A; B: collective B; Y: TIMP-4 concentration [ng / mL]
  • the NT-proBNP concentration (CN ⁇ - per BNp) (Y-CNT- P ⁇ ⁇ BNP [pg / rnL]) of the two sample pools used to determine the TIMP-4 levels (Fig.l) are shown ,
  • the black box represents 50% of all individual values (25th-75th percentile), the white bar indicates the median. and the end of the vertical line represents the lowest and highest reading.
  • the black box represents 50% of all individual values (25th-75th percentile), the white bar indicates the median. and the end of the vertical line represents the lowest and highest reading.
  • C collective C; D: collective D; Y: TIMP-4 concentration [ng / mL]
  • the black box represents 50% of all individual values (25th-75th percentile), the white bar indicates the median, and the end of the vertical line represents the lowest and highest values.
  • E collective E; F: collective F; Y: TIMP-4 concentration [ng / mL]
  • Fig. 6 SEQ ID NO: 2 Human TIMP-4 polynucleotide sequence
  • TIMP-4 polypeptides of different mammals Pairwise sequence comparison of the TIMP-4 polypeptides of different mammals.
  • the table lists the results of a TIMP-4 polypeptide sequence comparison of various mammals (A: Homo sapiens; B: Pan troglodytes; C: Macaca mulatta; D: Bos taurus; E: Canis familiaris; F: Felis catus; G: Mus musculus; H : Rattus norvegicus; I: Oryctolagus cuniculus).
  • the comparison is expressed in% identity.
  • the human sequence shows an identity of 88.8% to the mouse sequence (G: Mus musculus).
  • Fig. 11 Table of the measurements of the group D (serum samples of terminal heart failure patients before the LVAD implantation), the measurements shown in FIG. 3 and example 2. Designations A: patient number; B: Concentration TIMP-4 [ng / mL].
  • FIG. 12 Table of the measured values of the collective E (serum samples from non-right heart failure subjects), the measurements shown in FIG. 4 and Example 3. Designations A: patient number; B: Concentration TIMP -4 [ng / mL].
  • FIG. 13 Table of the measured values of the collective F (serum samples of right heart insufficiency pulmonary hypertensive (PAP> 25 mmHg)), the measurements shown in FIG. 4 and Example 3. Designations A: patient number; B: Concentration TIMP -4 [ng / mL].
  • Terminally cardio-insufficated patients (NYHA IV), whose clinical situation does not improve to a sufficient extent under pharmacotherapy, can be renounced to intensive care and for whom no donor heart is available in the short term, are dependent on the implantation of a ventricular assist device (" Ventricular Assistant Device ", VAD) (see above).
  • VAD Ventricular Assistant Device
  • the TIMP-4 concentration in serum samples from patients enrolled for implantation of a left ventricular assist device (LVAD) was compared to the TIMP-4 concentration in serum samples from healthy blood donors ( Figure 3).
  • the TIMP-4 serum concentration of the pre-LVAD patients was significantly increased compared to the healthy control group (control: median: 1.20 ng / mL, 25-75% percentile: 0.96-1.54 ng / mL, min : 0.62 ng / mL, max .: 3.69 ng / mL; pre-LVAD: median: 2.52 ng / mL, 25-75% percentile: 1, 70-3.45 ng / mL, min .: 0.40 ng / mL, max .: 6.07 ng / mL; /? ⁇ 0.001).
  • a major cause of right heart hypertrophy (cor pulmonale) and the resulting insufficiency of the right ventricle is pulmonary hypertension, which is characterized by an increase in pulmonary arterial blood pressure (PAP) at rest to levels of> 25 mmHg (see above).
  • PAP pulmonary arterial blood pressure
  • the TIMP-4 serum concentration of rHI / PH patients was significantly increased compared to the healthy control group (control: median: 1, 14 ng / mL, 25-75% percentile: 0.90-1, 28 ng / mL, min : 0.59 ng / mL, max .: 1.43 ng / mL; rHI / PH: median: 2.30 ng / mL, 25-75% percentile: 1.90-2.90 ng / mL, min .: 1, 0 ng / mL, max .: 5.60 ng / mL; /? ⁇ 0.001). Materials and methods
  • the TIMP-4 concentration was determined in human serum samples.
  • TIMP-4 concentration in serum samples from patients whose NT-proBNP was below a limit of 1000 pg / mL was compared with the TIMP-4 concentrations of patients with elevated NT-pro-BNP levels (> 1000 pg / mL). compared.
  • the NT-proBNP serum concentration was determined using the Elecsys® proBNP Chemieluminescence Immunoassay (Roche Diagnostics).
  • TIMP-4 concentration in serum samples from healthy volunteers was compared with the TIMP-4 concentrations of terminal heart failure patients who were to receive LVAD.
  • TIMP-4 Quantikine® ELISA from R & D Systems (Wiesbaden Nordenstadt, Germany, catalog no .: DTM400) was used.
  • the serum samples stored at -80 ° C. were thawed on ice, centrifuged at 4 ° C. and 800 g for five minutes and then added undiluted according to the manufacturer's recommendations for concentration determination by ELISA.
  • the ELISA protocol was characterized by the following steps:
  • BNP B-type natriuretic peptide
  • ECG electrocardiogram
  • HRP Horse radish peroxidase
  • LVAD Left ventricular assistant device
  • MMP matrix metalloproteinase
  • nm nanometer
  • PAP pulmonary arterial pressure
  • pg picogram
  • TIMP tissue inhibitor of metalloproteinases

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung der Plasmakonzentration des Polypeptides "Tissue inhibitor of metalloproteinases-4" (TIMP-4) als Biomarker zur Diagnose einer Herzinsuffizienz.

Description

TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose einer Herzinsuffizienz
Die Erfindung betrifft die Verwendung der Plasmakonzentration des "Tissue inhibitor of metalloproteinases-4" (TIMP-4)1 als Biomarker zur Diagnose der diastolischen und systolischen Herzinsuffizienz (DHF, SHF), der Rechtsherz-, Linksherz-, und globalen Herzinsuffizienz (GHF) in akuter oder chronischer Ausprägung, sowie der ihr zu Grunde liegenden Kardiomyopathien, wie die Myokarditis und hypertrophische Kardiomyopathie (HCM), die dilatative Kardiomyopathie (DCM), die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVCM), die restriktive Kardiomyopathie (RCM). Ferner ist die Diagnose der Rechtsherzhypertrophie und Rechtsherzinsuffizienz auf der Basis einer pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH), der pulmonalen Hypertonie bei Linksherzerkrankung, der pulmonalen Hypertonie assoziiert mit Hypoxie, der pulmonalen Hypertonie aufgrund chronisch thrombotischer und/oder embolischer Erkrankungen sowie der pulmonalen Hypertonie aufgrund von Sarkoidose, Histiozytosis X, Lymphangioleiomyomatose Gegenstand der Erfindung.
Unter dem Begriff "Biomarker zur Diagnose" sind in diesem Zusammenhang insbesondere folgende Nutzungen zusammengefasst:
die Diagnose der oben genannten Erkrankungen und pathologischen Veränderungen
die Bestimmung des Schweregrades oben genannter Erkrankungen und pathologischen Veränderungen
- Überwachung der Effekte von Interventionen, wie Pharmakotherapie, chirurgische
Eingriffe, Einsatz medizinischer Produkte und therapiebegleitender Maßnahmen auf oben genannten Erkrankungen und pathologischen Veränderungen
Verwendung als Surrogat-Marker, der die Bestimmung eines anderen Parameters ersetzt, der die oben genannten Erkrankungen und pathologischen Veränderungen zu beurteilen hilft.
Herzinsuffizienz
Eine Reihe von Faktoren kann zur Entwicklung der verschiedenen Formen der Herzinsuffizienz und deren Fortschreiten führen. Häufig schädigen Ereignisse wie ein lokaler ischämischer Insult (Myokardinfarkt) oder eine virale Myokarditis den Herzmuskel irreversible und bilden damit die Basis fiir die Entwicklung der Erkrankung, aber auch schleichende Prozesse, wie eine persistierende arterielle Hypertonie oder eine pulmonale arterielle Hypertonie fuhren zu weitreichenden Veränderungen in der Homöostase des Körpers. Die gesteigerte Volumenbelastung des Herzens wird anfänglich durch eine Myokard-Hypertrophie kompensiert, fuhrt aber schließlich zur schleichenden Schädigung der zellulären Strukturen des Herzens. Als wichtigste pathologische Veränderungen im Rahmen dieser Prozesse sind neurohormonelle Veränderungen2, lokale und systemische Entzündungen3, Nekrose und Apoptose von Kardiomyozyten4' 5 und die Beeinflussung der renalen Elektrolyt- und Wasser-Ausscheidung6 zu nennen. Die zuvor genannten schädigenden Einflüsse führen zur Aktivierung eines allmählichen Umbauprozesses des Herzgewebes, der in seiner Konsequenz zur Einlagerung von kollagenenösen Strukturen in das Myokard führt und dadurch in verschiedener Hinsicht die Funktionalität des Herzens negative beeinflusst7. Eine interstitielle Fibrose führt einerseits zu einer Versteifung des Myokards und damit zu einer eingeschränkten Kontraktilität, behindert aber andererseits auch die elektrophysiologische Reizweiterleitung und damit die Erregung der Kardiomyozyten, was die Pumpleistung des Herzens zusätzlich herabsetzt. In letzter Konsequenz ist eine manifestierte Herzinsuffizienz durch eine eingeschränkte Pumpfunktion des Herzen gekennzeichnet, die zur Minderperfüsion und somit zur unzureichenden Sauerstoff- und Nährstoffversorgung der Organe führt und in deren Folge die körperlichen Leistungsfähigkeit leicht bis sehr stark eingeschränkt ist. Insgesamt betrachtet stellt die Herzinsuffizienz eine progrediente Erkrankung dar, die neben einer starken Einschränkung der Leistungsfähigkeit des Patienten und einer u. U. stark beeinträchtigten Lebensqualität mit einer sehr schlechten Prognose verbunden ist .
Zur Klassifizierung der Schweregrade der Herzinsuffizienz hat sich der Vorschlag der New York Heart Assoziation (NYHA) zur Einteilung der Patienten in vier Klassen durchgesetzt. Patienten der NYHA-Klassen sind charakterisiert durch:
• NYHA I -^ Symptomfreies Anfangsstadium der Herzinsuffizienz, das nur durch spezielle diagnostische Verfahren zu erfassen ist.
• NYHA II -> Die körperliche Leistungsfähigkeit ist bei stärkerer physischer Belastung eingeschränkt • NYHA III -> Die Patienten sind in Ruhe symptomfrei, ihre Leistungsfähigkeit ist bei normaler körperlicher Belastung jedoch eingeschränkt.
• NYHA IV -> Die Patienten sind nicht belastbar, da bereits unter Ruhebedingungen schwere Symptome vorliegen, so dass in der Regel Bettruhe angezeigt ist.
Bei der strukturellen Re-Organisation des Herzgewebes spielen die Matrix- Metalloproteinasen (MMPs) und deren endogene Inhibitoren die "Tissue inhibitor of metalloproteinases" (TIMPs) eine wichtige Rolle. Matrix-Metalloproteinasen, die auch als Matrixine bezeichnet werden repräsentieren eine Familie von Ca2+- und Zn 2+-abhängigen Endopeptidasen, die eine Vielzahl von Proteinen, insbesondere Bestandteile der Extrazellulärmatrix, spalten 9. Die lokale Degradation von Extrazellulärmatrix wird durch die Expression der MMPs, durch die proteolytische Aktivierung der MMP-Pro-Enzyme und durch die Deaktivierung der MMPs aufgrund der Bindung endogener Inhibitoren, wie α2- Makroglobuline oder TIMPs, reguliert l0 ". TIMPs binden nicht-kovalent in einem stöchiometri sehen Verhältnis von 1 :1 an MMPs und blockieren dadurch potentiellen Substraten den Zugang zur katalytischen Domäne.
In den Herzen insufπzienter Patienten wurde eine signifikant erhöhte mRNA- und Protein- Expression der MMP-2 und deren Inhibitor TEVIP-I beobachtet 12' 13. Desweiteren konnte in verschiedenen klinischen Studien gezeigt werden, dass eine Korrelation zwischen dem Schweregrad der Herzinsuffizienz und den Plasma MMP-2 und TIMP-I -Konzentrationen des Patienten besteht l4'17.
Therapie der Herzinsuffizienz
Die Therapie der Herzinsuffizienz ist im Wesentlichen darauf ausgerichtet
1. die Volumenbelastung des Herzens zu reduzieren
2. die Energiebilanz des Herzens zu verbessern
3. die Kontraktilität der Herzens zu verbessern
Diese Ziele können durch medikamentöse Therapien, chirurgische Intervention und therapiebegleitende Maßnahmen erreicht werden. Die pharmakologische evidenzbasierte Therapie der chronischen Herzinsuffizienz der NYHA-Klassen I-IV ist geprägt durch den Einsatz von Inhibitoren des Angiotensin-konvertierenden Enzyms (ACE-Hemmer), Beta- Rezeptor- Antagonisten (ß-Blocker) und Aldosteronantagonisten. Zusätzlich kommen in Abhängigkeit von Symptomen und Begleiterkrankungen Diuretika, Herzglykoside,
Angiotensin-Rezeptor-Antagonisten, Vasodilatatoren und Antikoagulantien zum Einsatz .
Führen die Möglichkeiten der Pharmakotherapie bei terminal insuffizienten Patienten nicht zu einer Stabilisierung der Symptomatik, bleibt je nach Art der Erkrankung die Implantation von Schrittmachersysteme, unterstützender Pumpsysteme, sogenannter "Ventricular Assistant Devices" (VAD) oder die Herztransplantation die letzte lebenserhaltende Therapieoption .
Biventrikuläre Schrittmacher
Herzinsuffizienz-Patienten der NYHA-Klassen III und IV mit einer Ejektionsfraktion von <35%, die außerdem EKG-Anomalien, wie nichtsynchronisierte Kontraktionen der Ventrikel, aufweisen, profitieren neben eine Pharmakotherapie von der Implantation eines biventrikulären Schrittmachers. Diese Resynchronisation-Therapie führt in der Regel zu einer deutlichen Verbesserung der Symptomatik und damit verbunden zu einem Zugewinn an Lebensqualität. Ferner verbessert die Implantation eines biventrikulären Schrittmacher- Systerns die Piυgnose der Patienten und verringert nachweislich deren Rehospitalisierungsrate und Mortalität 19.
Linksventrikuläre Unterstützungssysteme (LVAD)
In den Fällen in denen das Herz auch unter Pharmakotherapie und unter Anwendung anderen Therapiemaßnahmen keine ausreichende Auswurfleistung erbringt und dadurch die
Koronarien des Herzens und die Organe des Körpers minderperfundiert werden, besteht die
Möglichkeit Batteriebetriebene intra- oder extrakorporale Pumpsysteme zu implantieren, die mechanisch die Herzfunktion unterstützen oder ersetzen 20. Im idealen Fall führt die
Entlastung durch das LVAD zu einer sich normalisierenden Genexpression in den Geweben des Herzens, zu einem Abklingen lokaler Endzündungsprozesse, zur Inhibition aktiver
Umbauprozesse der Arbeitsmyokards und ermöglicht dadurch dem Herzen, sich zu regenerieren. Die Unterstützung der Herzleistung durch das LVAD verbessert in der Regel den Gesamtzustand der Patienten dermaßen, das eine stationäre intensivmedizinische
Versorgung nicht mehr nötig ist . Insbesondere für Patienten, die zur Herztransplantation angemeldet sind und auf ein geeignetes Spenderherz warten, stellt die LVAD-Implantation eine wichtige lebenserhaltende Maßnahme dar 22. LVADs werden zwischen den linken Ventrikel und die Aorta geschaltet.
Transplantation
Die Herztransplantation bzw. die Implantation eines Kunstherzes stellt die letzte Option dar, um das Leben von terminal herzinsuffizienten Patienten, die auf eine stationäre intensivmedizinische Versorgung angewiesen sind, zu erhalten.
Stand der Technik: Rolle von Biomarkern bei der Diagnose der Herzinsuffizienz
Zur Diagnose der Herzinsuffizienz stehen eine Reihe von unterschiedlichen Verfahren zur Verfügung, die jede für sich bestimmte funktionelle Parameter des Herzens zu beurteilen vermag. Neben bereits durch den Allgemeinmediziner durchführbaren Verfahren wie Ruhe- Echokardiogramm (EKG) und Belastungs-EKG spielen aufwendigere differential- diagnostische bildgebende Verfahren, wie die Magnetresonanztomographie (MRT) und die Herzkatheterisierung gepaart mit der Angiographie eine wichtige Rolle. In jedem Fall leistet eine biochemische Beurteilung verschiedener Plasmaparameter einen wichtigen Beitrag zur Diagnose. Neben der Konzentrationsbestimmung von Elektrolyten sowie proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen kommt der Detektion neurohumoraler Proteine eine wichtige Bedeutung zu. Als Vertreter dieser Proteinklasse sind das atriale natriuretische Peptid (ANP) und das B-Typ natriuretische Peptid (BNP) zu nennen, die als bisher einzige Plasmamarker zur Beurteilung der Herzinsuffizienz in der Klinik anerkannt sind. Das BNP- Vorläuferhormon Prä-proBNP wird von Kardiomyozyten sezerniert, wenn diese einem erhöhten Dehnungsreiz ausgesetzt sind, wie er z.B. bei einer vergrößerten Volumenbelastung des Herzens auftritt. In der Zirkulation kommt es zur enzymatischen Spaltung des Prä- proBNPs in das vasoaktive BNP (C-Terminus des Prä-proBNPs) und das biologisch inaktive NT-proBNP (N-Terminus des Prä-proBNPs) 23. Sowohl die Plasmakonzentration von NT- proBNP als auch die des biologisch aktiven BNPs korrelieren sehr gut mit der Auswurfleistung des Herzens. Da die Halbwertszeit des NT-proBNPs aber deutlich über der des BNPs liegt, hat eine automatisierte NT-proBNP-Analytik Einzug in den Klinikalltag gefunden. Für Patienten aller Altersklassen gilt ein NT-proBNP-Spiegel von < 300 pg/mL als Indiz dafür, dass eine Chronische Herzinsuffizienz mit 83%iger Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden kann. NT-proBNP-Konzentrationen oberhalb einer Grenze von 900 pg/mL deuten mit einer 87%igen Wahrscheinlichkeit auf das Vorliegen eine Chronischen Herzinsuffizienz hin 24. Da die BNP-Plasmakonzentration allerdings lediglich Aufschluss über die Volumenbelastung des Herzen gibt, die Manifestation der Herzinsuffizienz aber maßgeblich durch fibrotische Umbauprozesse des Herzgewebes gekennzeichnet ist, spiegeln diese neurohumoralen Marker nur einen Teilaspekt der Erkrankung wider. Ferner wird der prädiktive Wert der Plasma BNP oder NT-proBNP-Spiegel durch die Tatsache limitiert, dass es auch bei anderen Erkrankungen als der Herzinsuffizienz zu einer vermehrten Ausschüttung der natriuretischen Peptide kommt. Insbesondere bei einer Einschränkung der Nierenfunktion auf eine glomeruläre Filtrationsrate < 60 mL/min. treten signifikant erhöhte BNP- Plasmakonzentrationen auf 25. Des Weiteren führen eine nicht-Alkohol-induzierte Leberzirrhose 26, intensive körperliche Belastungen27, ein Typ I Diabetes mellitus 28 und die Infusion größerer Mengen Flüssigkeit zu einem Anstieg der BNP-Spiegel. Die Bewertung der BNP-Plasmakonzentration wird zusätzlich durch die Tatsache erschwert, dass zwischen dem „Body-Mass-Index" (BMI) und den BNP- bzw. NT-proBNP-Plasmaspiegeln eine inverse Korrelation besteht29.
Aufgabenstellung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, die aufgeführten Nachteile und Limitationen des Standes der Technik zu überwinden, insbesondere der Limitationen der Diagnose mittels der BNP und NT-proBNP Spiegel, und einen Plasmamarker zu idcntifizieien, der zur Diagnose der Herzinsuffizienz herangezogen werden kann. Ferner sollte der identifizierte Herzinsuffizienz-Plasmamarker die Erkenntnisse, die durch ein bildgebendes oder ein andersartiges diagnostisches Verfahren gewonnen werden können, ergänzen oder im Sinne eines Surrogatmarkers ersetzen.
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst, indem gezeigt wurde, dass anhand der TIMP-4 Plasmakonzentrationen zwischen gesunden Probanden und herzinsuffizienten Patienten unterschieden werden kann. Auf Grund der biologischen Funktion von TIMP-4 bildet TIMP- 4 fibrotische Umbauprozesse des Herzen besser ab, als zum Beispiel NT-ProBNP und wird nicht durch die Volumenbelastung beeinflusst. Dies schließt zum Beispiel eine Beeinflussung der Diagnose durch eine vorangegangene Infusion oder Diabetes aus. Ferner korrelierten bei herzinsuffizienten Patienten die TIMP-4 Plasmakonzentrationen mit funktionellen Parametern des Herzens, die durch bildgebende oder andersartige diagnostische Verfahren erhoben worden waren.
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Verwendung von TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose einer Herzinsuffizienz in einem Säuger, welche folgende Stufen umfassen: a) Beschaffung einer zu diagnostizierenden Probe aus einem Säuger
b) Bestimmung der TIMP -4 Menge der zu diagnostizierenden Probe
c) Beschaffung einer Kontrollprobe
d) Bestimmung der TIMP-4 Menge der Kontrollprobe
e) Vergleich der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Probe mit der Kontrollprobe
f) Diagnose einer Herzinsuffizienz basierend auf dem Vergleich der Menge an TIMP-4 in der zu diagnostizierenden Probe im Vergleich zur Kontrollprobe.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Verwendung von TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose einer Herzinsuffizienz in einem Säuger, welche folgende Stufen umfassen:
a) Beschaffung einer zu diagnostizierenden Probe aus einem Säuger
b) Bestimmung der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Probe
c) Vergleich der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Probe mit der Kontrollprobe
d) Diagnose einer Herzinsuffizienz basierend auf dem Vergleich der Menge an TIMP-4 in der zu diagnostizierenden Probe im Vergleich zur Kontrollprobe.
Ein zusätzlicher Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Verwendung von TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose einer Herzinsuffizienz in einem Säuger, welche folgende Stufen umfassen:
a) Bestimmung der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Probe erhalten aus einem Säuger
b) Bestimmung der TIMP-4 Menge der Kontrollprobe erhalten aus einem Säuger
c) Vergleich der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Probe mit der Kontrollprobe
d) Diagnose einer Herzinsuffizienz basierend auf dem Vergleich der Menge an TIMP-4 in der zu diagnostizierenden Probe im Vergleich zur Kontrollprobe. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Verwendung von TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose einer Herzinsuffizienz in einem Säuger, welche folgende Stufen umfassen:
a) Bestimmung der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Probe erhalten aus einem Säuger
b) Vergleich der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Probe mit der Kontrollprobe
c) Diagnose einer Herzinsuffizienz basierend auf dem Vergleich der Menge an TIMP-4 in der zu diagnostizierenden Probe im Vergleich zur Kontrollprobe.
Das erfindungsgemäße Verfahren beschreibt die Verwendung von TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose einer Herzinsuffizienz. Die Verwendung von TIMP-4 als diagnostischer Biomarker basiert auf dem Vergleich der TIMP-4 Menge in einer zu diagnostizierenden Probe mit der
TIMP-4 Menge in einer Kontrollprobe bzw. einem TIMP-4 Kontrollwert. Die Diagnose einer
Herzinsuffizienz wird über den Vergleich der Menge an TIMP-4 in der zu diagnostizierenden
Probe und der Menge an TIMP-4 in der Kontrollprobe durchgeführt. Ein Unterschied im Vergleich des TEVIP -4 Kontrollwerts (erhalten aus der Konü'öllprυbe) und der Menge an
TIMP-4 aus der zu diagnostizierenden Probe erlaubt die Diagnose einer Herzinsuffizienz. Der
Vergleich der Menge an TIMP-4 kann mittels relativer oder absoluter TIMP-4 Menge durchgeführt werden. Die absolute Menge an TIMP-4 kann mittels einer Standarteichkurve ermittelt werden, bei der bekannte Mengen an TIMP-4 verwendet werden. Der Fachmann weiß aus dem Stand der Technik, wie solche Experimente durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Diagnose einer Herzinsuffizienz erstellt, wenn die TIMP-4 Menge in der zu diagnostizierenden Probe höher ist als in der Kontrollprobe, besonders bevorzugt ist eine Erhöhung um mindestens den Faktor 1,5; 2; 2,5; 5; 7,5 oder >10.
Die zu diagnostizierende Probe und die Kontrollprobe werden aus einem Säuger erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bestehen die zu diagnostizierende Probe und die Kontrollprobe aus einer Körperflüssigkeit, besonders bevorzugt dabei ist Blut, oder daraus gewonnene Proben, wie Serum oder Plasma. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die zu diagnostizierende Probe und die Kontrollprobe aus einem Mensch. Die zu diagnostizierende Probe und die Kontrollprobe werden aus analogen Geweben, bzw. Körperflüssigkeiten erhalten.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform werden die Normal- oder Kontrollwerte für TIMP -4 unter Verwendung der Kontrollprobe erhalten, die von gesunden Säugern stammt. Die Kontrollprobe kann durch Sammeln mehrerer separater oder auch vereinigter Proben aus Säugern erhalten werden. Der Fachmann weiß wie viele Proben zur Erzielung einer statistisch relevanten Aussage herangezogen werden müssen. In einer weiteren Ausfuhrungsform kann die Kontrollprobe zu einem früheren Zeitpunkt entnommen oder die Menge an TIMP -4 in einer oder mehreren Kontrollproben oder der TIMP -4 Kontrollwert zu einem früheren Zeitpunkt bestimmt werden und zum Beispiel in einer Datenbank, einer Internetpublikation, in einer elektronisch erfassbaren Weise oder in einer Publikation hinterlegt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Menge an TIMP -4 über die Menge an TIMP -4 Polypeptid in der Probe bestimmt. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, um Polypeptide quantitativ nachzuweisen. Beispiele sind Antikörperbasierte Methoden wie ELISA, RIA oder Western Blot. Eine weitere Methode ist zum Beispiel die Planar Wave Guide Technologie. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, um anti-TIMP-4 Antikörper zu erzeugen. Wobei ein TIMP-4 Polypeptid ausgewählt wird aus einer Gruppe bestehend aus einem Polypeptid mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 , einem Polypeptid welches die Sequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst, ein Polypeptid welches durch ein TIMP-4 Polynukleotid (SEQ ID NO:2) kodiert wird, und Polypeptide, die wenigstens 99%, 98%, 95%, 90%, 88% oder 80% Identität mit einem der oben aufgeführten TEVIP-4 Polypeptide haben. Die TIMP-4 Polypeptidesequenz ist in Literaturstelle ' beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Menge an TIMP -4 über die Menge an TIMP -4 Polynukleotid in der Probe bestimmt. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, um Polynukleotide quantitativ nachzuweisen. Beispiele sind Northern-Blot, Realtime PCR oder TaqMan. Eine weitere Methode ist zum Beispiel die Planar Wave Guide Technologie.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird besonders bevorzugt zur Diagnose der Herzinsuffizienz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der diastolischen und systolischen Herzinsuffizienz (DHF, SHF), der Rechtsherz-, Linksherz-, und globalen Herz-Insuffizienz (GHF) in akuter oder chronischer Ausprägung, sowie der ihr zu Grunde liegenden Kardiomyopathien, wie die Myokarditis und hypertrophische Kardiomyopathie (HCM), die dilatative Kardiomyopathie (DCM), die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVCM), die restriktive Kardiomyopathie (RCM) und der Rechtsherzhypertrophie und Rechtsherzinsuffizienz auf der Basis einer pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH), der pulmonalen Hypertonie bei Linksherzerkrankung, der pulmonalen Hypertonie assoziiert mit Hypoxie, der pulmonalen Hypertonie aufgrund chronisch thrombotischer und/oder embolischer Erkrankungen sowie der pulmonalen Hypertonie aufgrund von Sarkoidose, Histiozytosis X, Lymphangioleiomyomatose.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose der oben genannten Erkrankungen und pathologischen Veränderungen eingesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose des Schweregrades der oben genannten Erkrankungen und pathologischen Veränderungen eingesetzt. In dieser Ausführungsform kann als TIMP-4 Koπtrollprobc oder als TIMP-4 Kontrollwert die Menge an TIMP-4 in erkrankten Säugern bestimmt werden, die nach bestimmten Kriterien, wie zum Beispiel die Kriterien der NYHA, in definierte Gruppen eingeteilt werden.
hi einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird TIMP -4 als therapiebegleitender Biomarker im erfindungsgemäßen Verfahren zur Diagnose und Überwachung der Effekte von Interventionen, wie Pharmakotherapie, chirurgische Eingriffe, Einsatz medizinischer Produkte und therapiebegleitender Maßnahmen auf oben genannten Erkrankungen und pathologischen Veränderungen verwendet. In dieser Ausführungsform kann mehrmals, das heißt im Laufe einer Therapie, eine zu diagnostizierende Probe entnommen und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden. Verändert sich die Menge an TIMP -4 während einer Therapie nicht oder nur unwesentlich, kann die Therapie als nicht erfolgreich angesehen werden. Ist dies der Fall kann eine erneute Therapie mit einer anderen Dosierung, zum Beispiel einer erhöhten Dosis, oder einer anderen Darreichungsform in Betracht gezogen werden. Des Weiteren kann eine zusätzlich oder eine andere Therapie in Betracht gezogen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in klinischen Studien zur Diagnose eines Therapieerfolges eingesetzt werden. Dieser Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Verwendung von TIMP -4 als Biomarker zur Diagnose der Wirksamkeit einer Herzinsuffizienztherapie in einem Säuger, welche folgende Stufen umfassen:
a) Verabreichung einer Herzinsuffizienztherapie
b) Beschaffung einer oder mehrerer weiterer zu diagnostizierenden Proben aus dem therapierten Säuger
c) Bestimmung der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Proben
d) Beschaffung einer Kontrollprobe
e) Bestimmung der TIMP -4 Menge der Kontrollprobe
f) Vergleich der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Proben mit der Kontrollprobe
g) Diagnose des Therapieerfolges basierend auf dem Vergleich der Menge an TIMP -4 in den zu diagnostizierenden Proben im Vergleich zur Kontrollprobe.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Verwendung von TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose der Wirksamkeit einer Herzinsuffizienztherapie in einem Säuger, welche folgende Stufen umfassen:
a) Verabreichung einer Herzinsuffizienztherapie
b) Beschaffung einer oder mehrerer weiterer zu diagnostizierenden Proben aus dem therapierten Säuger
c) Bestimmung der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Proben
d) Vergleich der TIMP -4 Menge der zu diagnostizierenden Proben mit der Kontrollprobe
e) Diagnose des Therapieerfolges basierend auf dem Vergleich der Menge an TIMP -4 in den zu diagnostizierenden Proben im Vergleich zur Kontrollprobe. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Verwendung von TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose der Wirksamkeit einer Herzinsuffizienztherapie in einem Säuger, welche folgende Stufen umfassen:
a) Bestimmung der TIMP-4 Menge einer oder weiterer zu diagnostizierenden Proben erhalten aus einem Säuger, welcher eine Herzinsuffizienztherapie erhalten hat
b) Vergleich der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Proben mit der Kontrollprobe
c) Diagnose des Therapieerfolges basierend auf dem Vergleich der Menge an TIMP-4 in den zu diagnostizierenden Proben im Vergleich zur Kontrollprobe.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren als Surrogat-Marker verwendet werden, der die Bestimmung eines anderen Parameters ersetzt, der die oben genannten Erkrankung und pathologischen Veränderungen zu beurteilen hilft.
In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren mit einem oder weiteren bekannten klinischen Markern und Diagnoseverfahren ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Blutdruck, Herzfrequenz, systemischer vaskulärer Widerstand, „Fractional Shortening (FS), end-diastolischer Durchmesser (EDD), end-systolischer Durchmesser (ESD), Ejektionsfraktion (EF), links-ventrikulärer Kontraktilität (LVC), systolischem pulmonaren Arteriendruck (PAPsys), diastolischem pulmonaren Arteriendruck (PAPd,a), links- ventrikulärer end-diastolischer Druck (LVEDP), 6-Minuten Gehstrecke, Spiroergometrie, Metaboliten, BNP, CRP, ANP, Elektrokardiogramm (EKG),
Positronenemissionstomographie (PET), Computertomographie (CT),
Magnetresonanztomographie (MRT), funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT), Diffusions-Tensor Bildgebung (DT-MRT), Echokardiographie, Ultraschall und Impedanzkardiographie kombiniert werden.
Figuren:
Fig. l:
Die TIMP-4-Konzentration (CT1MP-4) (Y = cχiMp^ [ng/mL] ) in Serumproben von Patienten deren NT-pro-BNP unterhalb einer Grenze von 1000 pg/mL (Kollektiv A) wurde mit den TIMP-4-Konzentrationen von Patienten mit erhöhten NT-pro-BNP-Spiegeln (> 1000 pg/mL) (Kollektiv B) verglichen. Der schwarze Kasten repräsentiert 50% aller Einzelwerte (25.-75. Perzentile), der weiße Balken zeigt den Median an, das Ende der senkrechten Linie bildet den niedrigsten und höchsten Meßwert ab. (A: Kollektiv A; B: Kollektiv B; Y: TIMP-4 Konzentration [ng/mL])
Fig. 2:
Die NT-proBNP-Konzentration (CNτ-proBNp) (Y - CNT-PΓΌBNP [pg/rnL] ) der beiden Probenkollektive, die zur Bestimmung der TIMP-4-Spiegel herangezogen wurden (Fig.l), sind dargestellt. Der schwarze Kasten repräsentiert 50% aller Einzelwerte (25.-75. Perzentile), der weiße Balken zeigt den Median an. und das Ende der senkrechten Linie bildet den niedrigsten und höchsten Meßwert ab. . (A: Kollektiv A; B: Kollektiv B; Y: NT-proBNP Konzentration [pg/mL] )
Fig. 3:
Die TIMP-4-Konzentration (C-ΠMP-4) (Y = CJIMP-4 [ng/mL] ) in Serumproben von nicht herzinsuffizienten Probanden (Kollektiv C) und von terminal herzinsuffϊzienten Patienten vor der LVAD-Implantation (Kollektiv D) ist dargestellt. Der schwarze Kasten repräsentiert 50% aller Einzelwerte (25.-75. Perzentile), der weiße Balken zeigt den Median an. und das Ende der senkrechten Linie bildet den niedrigsten und höchsten Meßwert ab. (C: Kollektiv C; D: Kollektiv D; Y: TIMP-4 Konzentration [ng/mL])
Fig.4: Die TIMP-4 (C-ΠMP^) (Y = CTIMP^ [ng/mL] ) in Serumproben von nicht herzinsuffizienten Probanden (Kollektiv E) und von Patienten, die unter Pulmonaler Hypertonie-induzierter Rechtsherzinsuffizienz leiden (Kollektiv F) ist dargestellt. Der schwarze Kasten repräsentiert 50% aller Einzelwerte (25.-75. Perzentile), der weiße Balken zeigt den Median an und das Ende der senkrechten Linie bildet den niedrigsten und höchsten Meßwert ab. (E: Kollektiv E; F: Kollektiv F; Y: TIMP-4 Konzentration [ng/mL])
Fig. 5:
SEQ ID NO: 1 Humane TIMP-4 Polypeptidesequenz
Fig. 6: SEQ ID NO:2 Humane TIMP-4 Polynukleotidsequenz
Fig. 7:
Paarweiser Sequenzvergleich der TIMP-4 Polypeptide verschiedener Säuger. Die Tabelle listet die Ergebnisse eines TIMP-4 Polypeptidsequenzvergleiches verschiedenen Säuger auf (A: Homo Sapiens; B: Pan troglodytes; C: Macaca mulatta; D: Bos taurus; E: Canis familiaris; F: Felis catus; G: Mus musculus; H: Rattus norvegicus; I: Oryctolagus cuniculus). Der Vergleich ist in % Identität ausgedrückt. Zum Beispiel zeigt die menschliche Sequenz (A: Homo Sapiens) eine Identität von 88,8% zur Maussequenz (G: Mus musculus).
Fig. 8:
Tabelle der Messwerte des Kollektiv A (Serumproben von Patienten deren NT-pro-BNP unterhalb einer Grenze von 1000 pg/mL), der in Fig.l u 2 gezeigten und Beispiel 1 durchgeführten Messungen Bezeichnungen A: Probcnnummer; B: Konzentration NT- proBNP [pg/mL] ; C: Konzentration TIMP-4 [ng/mL] .
Fig. 9:
Tabelle der Messwerte des Kollektiv B (Serumproben von Patienten deren NT-pro-BNP von >1000 pg/mL), der in Fig.l u 2 gezeigten und Beispiel 1 durchgeführten Messungen. Bezeichnungen A: Probennummer; B: Konzentration NT-proBNP [pg/mL]; C: Konzentration TIMP-4 [ng/mL].
Fig. 10:
Tabelle der Messwerte des Kollektiv C (Serumproben von nicht herzinsuffizienten Probanden), der in Fig.3 gezeigten und Beispiel 2 durchgeführten Messungen. Bezeichnungen A: Patientennummer; B: Konzentration TIMP-4 [ng/mL].
Fig. 11: Tabelle der Messwerte des Kollektiv D (Serumproben von terminal herzinsuffizienten Patienten vor der LVAD-Implantation), der in Fig.3 gezeigten und Beispiel 2 durchgeführten Messungen. Bezeichnungen A: Patientennummer; B: Konzentration TIMP-4 [ng/mL].
Fig.12: Tabelle der Messwerte des Kollektiv E (Serumproben von nicht rechtsherzinsuffizienten Probanden), der in Fig.4 gezeigten und Beispiel 3 durchgeführten Messungen. Bezeichnungen A: Patientennummer; B: Konzentration TIMP -4 [ng/mL].
Fig.13: Tabelle der Messwerte des Kollektiv F (Serumproben von rechtsherzinsuffizienten pulmonalen Hypertonikern (PAP > 25 mmHg)), der in Fig.4 gezeigten und Beispiel 3 durchgeführten Messungen. Bezeichnungen A: Patientennummer; B: Konzentration TIMP -4 [ng/mL].
Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele näher erläutert:
Beispiele
Beispiel 1
Aufgrund der starken Volumenbelastung des Herzens sind Patienten, die unter einer Herzinsuffizienz leiden durch erhöhte NT-proBNP-Plasmakonzentrationen charakterisiert (s.o.). Überschreitet die NT-proBNP-Konzentration den Wert von 900 pg/mL, so liegt unabhängig von Alter und Geschlecht des Patienten mit 87%iger Wahrscheinlichkeit eine Herzinsuffizienz vor (s.o.). Bei NT-proBNP-Spiegeln < 300 pg/mL ist eine Herzinsuffizienz mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen. Basierend auf diesen Zusammenhängen wurde die TIMP-4-Konzentration in Serumproben von zwei Patientenkollektiven bestimmt: 1) Spender deren NT-proBNP-Spiegel zwischen 15 und 795 pg/mL lag (Median = 81 pg/mL (keine Herzinsuffizienz)). 2) Spender deren NT- proBNP-Spiegel zwischen 1016 und 58171 pg/mL lag (Median = 2976 pg/mL (hohe Wahrscheinlichkeit einer Herzinsuffizienz)) (Fig. 2). Die TIMP-4 Serumkonzentration des hoch-NT-proBNP-Kollektivs war im Vergleich zum niedrig-NT-proBNP-Kollektiv hoch signifikant erhöht (Fig. 1) (niedrig-NT-proBNP: Median: 1 ,37 ng/mL, 25-75 % Perzentil: 1,09-1 ,73 ng/mL, min.: 0,51 ng/mL, max.: 3,66 ng/mL; hoch-NT-proBNP: Median: 2,62 ng/mL, 25-75 % Perzentil: 2,04-3,70 ng/mL, min.:0,70 ng/mL, max.: 7,20 ng/mL; p < 0,001).
Beispiel 2
Terminal herzinsuffizienten Patienten (NYHA IV), deren klinische Situation sich unter Pharmakotherapie nicht in dem Maße verbessert, dass auf eine intensiv-medizinische Versorgung verzichtet werden kann, und für die kurzfristig kein Spenderherz zur Verfügung steht, sind auf die Implantation eines ventrikulären Unterstützungssystems ("Ventricular Assistant Device",VAD) angewiesen (s.o.).
Die TIMP-4-Konzentration in Serumproben von Patienten, die zur Implantation eines links-ventrikulären Unterstützungssystems (LVAD) angemeldet waren, wurde mit der TIMP-4-Konzentration in Serumproben von gesunden Blutspendern verglichen (Fig. 3). Die TIMP-4 Serumkonzentration der prä-LVAD-Patienten war im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe hoch signifikant erhöht (Kontrolle: Median: 1,20 ng/mL, 25-75 % Perzentil: 0,96-1,54 ng/mL, min.: 0,62 ng/mL, max.: 3,69 ng/mL; prä-LVAD: Median: 2,52 ng/mL, 25-75 % Perzentil: 1 ,70-3,45 ng/mL, min.: 0,40 ng/mL, max.: 6,07 ng/mL; /? < 0,001).
Beipiel 3:
Eine bedeutende Ursache der Rechtsherzhypertrophie (Cor pulmonale) und der daraus resultierende Insuffizienz des rechten Ventrikels stellt die Pulmonale Hypertonie dar, die durch einen Anstieg des pulmonal-arteriellen Blutdruckes (PAP) in Ruhe auf Werte von > 25 mmHg charakterisiert ist (s.o.).
Die TIMP-4 Serumkonzentration von rechtsherzinsuffizienten pulmonalen Hypertonikern (rHI/PH) (n = 25) wurde mit der TIMP-4 Serumkonzentration von gesunden Probanden (n = 25) verglichen (Fig. 4). Die TIMP-4 Serumkonzentration der rHI/PH-Patienten war im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe hoch signifikant erhöht (Kontrolle: Median: 1 ,14 ng/mL, 25-75 % Perzentil: 0,90-1 ,28 ng/mL, min.: 0,59 ng/mL, max.: 1 ,43 ng/mL; rHI/PH: Median: 2,30 ng/mL, 25-75 % Perzentil: 1,90-2,90 ng/mL, min.: 1 ,0 ng/mL, max.: 5,60 ng/mL; /? < 0,001). Materialien und Methoden
Probenmaterial
In zwei unterschiedlichen Studien wurde die TIMP-4-Konzentration in humanen Serumproben ermittelt.
1) Die TIMP-4-Konzentration in Serumproben von Patienten deren NT-proBNP unterhalb einer Grenze von 1000 pg/mL wurde mit den TIMP-4-Konzentrationen von Patienten mit erhöhten NT-pro-BNP- Spiegeln (> 1000 pg/mL) verglichen. Die NT- proBNP Serumkonzentration wurde unter Zuhilfenahme des Elecsys® proBNP Chemieluminescence Immuno-Assays (Roche Diagnostics) ermittelt.
2) Die TIMP-4-Konzentration in Serumproben von gesunden Probanden wurde mit den TIMP-4-Konzentrationen von terminal herzinsuffizienten Patienten, die ein LVAD erhalten sollten, verglichen.
Reagenzien
Zur Bestimmung der TIMP-4-Konzentratiύn in den Proben wurde der human TIMP-4 Quantikine® ELISA der Firma R&D Systems (Wiesbaden Nordenstadt, Deutschland; Katalog-Nr.: DTM400) eingesetzt.
Protokoll
Die bei -80°C gelagerten Serumproben wurden auf Eis aufgetaut, bei 4°C und 800 g für fünf Minuten zentrifugiert und anschließend unverdünnt entsprechend den Empfehlungen des Herstellers der Konzentrationsbestimmung mittels ELISA zugefügt.
Kurz zusammengefasst war das ELISA-Protokoll durch folgend Arbeitsschritte charakterisiert:
Inkubation der Proben in der mit einem monoklonalen anti-human-TIMP-4-
Antikörper beschichteten 96-Kavitäten Mikrotiterplatte
• Entfernen ungebundener Probenbestandteile durch Waschung der Mikrotiterplatte • Inkubation der Mikrotiterplatte mit einem HRP -konjugierten sekundären anti-human- TIMP-4-Antiköφer
• Entfernen des überschüssigen HRP -konjugierten sekundären anti-human-TIMP-4- Antikörper durch Waschung der Mikrotiterplatte
• Inkubation der Mikrotiterplatte mit TMB-Enzymsubstrat
• Abstoppen der Enzymkinetik durch Zugabe von verdünnter H2SO4-Lösung
• Bestimmung der Optischen Dichte (OD) der Kavitäten der Mikrotiterplatte bei einer Wellenlänge von λ=450 nm (Referenz-Wellenlänge: λ=570 nm).
• Errechnung der TIMP-4-Kalibrationskurve unter Verwendung der OD der Standardverdünnungsreihe
• Errechnung der Proben-TIMP-4-Konzentrationen durch Auftragen der Proben-OD gegen die OD der Standardproben
• Statistische Auswertung und graphische Darstellung der Meßsergebnisse (Gruppenmittelwerte, Standardabweichung, "Standard Error of the MEAN", Students-t-Test)
Abkürzungen
ANP atriales natriuretisches Peptid
BNP = B-Typ natriuretisches Peptid
Ca2+ = Calciumion
EKG = Elektrokardiogramm
ELISA = Enzyme linked immunosorbent assay
g = Erdbeschleunigung
HRP = Horse radish peroxidase
H2SO4 = Schwefelsäure
LVAD = Left ventricular assistant device
λ = Lambda (griech.) = Wellenlänge
mL = Milliliter
MMP = Matrix Metalloproteinase
MRT = Magnetresonanztomographie
nm = Nanometer
NYHA = New York Heart Assoziation
OD = Optische Dichte
PAP = Pulmonary arterial pressure pg = Picogramm
TIMP= Tissue inhibitor of metalloproteinases
TMB = Tetramethylbenzidine
Zn 2+ = Zinkion Literatur:
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Verwendung von TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose einer Herzinsuffizienz in einem Säuger, welches folgende Schritte umfasst:
a) Bestimmung der TMP -4 Menge der zu diagnostizierende Probe erhalten aus einem Säuger,
b) Vergleich der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Probe mit einer Kontrollprobe
c) Diagnose einer Herzinsuffizienz basierend auf dem Vergleich der Menge an TIMP-4 in der zu diagnostizierenden Probe im Vergleich zur Kontrollprobe.
2. Verfahren zur Verwendung von TIMP-4 als Biomarker zur Diagnose einer Herzinsuffizienz in einem Säuger, welches folgende Schritte umfasst:
a) Gewinnung einer zu diagnostizierenden Probe aus einem Säuger,
b) Bestimmung der TIMP-4 Menge der zu diagnostizierenden Probe
c) Vergleich der TEvIP -4 Menge der zu diagnostizierenden Probe mit einer Kontrollprobe
d) Diagnose einer Herzinsuffizienz basierend auf dem Vergleich der Menge an TIMP-4 in der zu diagnostizierenden Probe im Vergleich zur Kontrollprobe.
3. Verfahren nach Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Blut, Serum und Plasma.
4. Verfahren nach Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass der Säuger ein Mensch ist.
5. Verfahren nach Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass die TIMP-4 Menge anhand der TIMP-4 Polypeptid Menge bestimmt wird.
6. Verfahren nach Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass bei Diagnose einer Herzinsuffizienz die TIMP-4 Menge in der zu diagnostizierenden Probe erhöht ist im Vergleich zur Kontrollprobe.
7. Verfahren nach Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Verwendung von TIMP-4 als Biomarker mit einem oder mehreren weiteren Biomarkern und Diagnoseverfahren kombiniert wird.
8. Verfahren nach Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass TIMP-4 als therapiebegleitender Biomarker verwendet wird.
9. Verfahren nach Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass TIMP-4 als Biomarker zur Bestimmung des Schweregrades einer Herzinsuffizienz verwendet wird.
10. Testkit zur Durchführung eines der Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 umfassend wenigstens einen oder mehrere Antikörper, welche spezifisch TIMP-4 erkennen, ein
Detektionsmittel, ein oder mehrere Behälter zum Sammeln und Aufbewahren der zu diagnostizierenden Probe.
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