EP2114998A1 - Nouvelles molecules multimeriques, leur procede de preparation, et leur utilisation pour la preparation de medicaments - Google Patents

Nouvelles molecules multimeriques, leur procede de preparation, et leur utilisation pour la preparation de medicaments

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Publication number
EP2114998A1
EP2114998A1 EP08761833A EP08761833A EP2114998A1 EP 2114998 A1 EP2114998 A1 EP 2114998A1 EP 08761833 A EP08761833 A EP 08761833A EP 08761833 A EP08761833 A EP 08761833A EP 2114998 A1 EP2114998 A1 EP 2114998A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
acid
formula
representing
amino
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08761833A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gilles Guichard
Sylvie Fournel
Nathalie Trouche
Sébastien WIECKOWSKI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2114998A1 publication Critical patent/EP2114998A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the subject of the invention is novel multimeric molecules, process for their preparation and their use for the preparation of medicaments.
  • the subject of the invention is also molecules capable of activating or inhibiting the immune response.
  • CD40 / CD40L couple in the immune response has led many groups to use antibodies directed against these two molecules for therapeutic purposes, so as to inhibit or activate the immune system.
  • the administration of anti-CD40L antibodies has yielded encouraging results in the treatment of autoimmune diseases such as murine experimental allergic encephalomyelitis (a model of human multiple sclerosis) (Howard et al, 1999) or in the treatment rejection of renal allografts in monkeys (Kirk et al., 1999). In both cases, the antibodies inhibited a harmful activity of the immune system.
  • anti-CD40 agonist antibodies has, on the one hand, greatly improved the response to peptide anti-tumor vaccines in mice (Diehl et al., 1999) and on the other hand, increase the efficacy of CD4 + T cells in the fight against murine tumors (Sotomayor et al., 1999, Lode et al., 2000). Tumor regression in murine models has been demonstrated after injection of dendritic cells (CDs) transformed with adenovirus encoding CD40L (Kikuchi et al., 2000).
  • CDs dendritic cells
  • the object of the invention is to provide multimeric ligands designed to interfere with protein-protein interactions.
  • the present invention also aims at the preparation of molecules that can interfere with multivalent protein-protein interactions.
  • the present invention also aims at the preparation of molecules capable of modulating the activity of family members of TNF and TNF-R.
  • the present invention aims to provide a synthetic molecule acting on the CD40 / CD40L system.
  • the present invention relates to a compound corresponding to the following formula (I):
  • - k and j represent independently of one another 0 or 1
  • - Y represents a macrocycle whose ring comprises from 9 to 36 atoms, and is functionalized by three amine functions allowing the attachment of Rc by its carboxylic function C -terminal and by a chain allowing attachment of the spacer arm Z via an X link,
  • R 0 represents a receptor binding unit of the TNF 5 superfamily and preferably corresponds to a ligand-derived sequence chosen from the residues forming the interface with the ligand receptor, which sequence is capable of interacting with the receptor, said ligand being chosen from TNF superfamily receptor ligands, and especially from the following ligands: EDA, CD40L, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, CD27L, LTa , TNF, LT ⁇ , TWEAK, APRIL, BLYS, RANKL and TRAIL, X represents a chemical function making it possible to connect the group Y to the spacer arm and is chosen from the following functions:
  • Z represents a bi-, tri- or tetrafunctional spacer arm allowing the
  • n and n being as defined above, p being an integer ranging from 1 to 6, where u is an integer ranging from 1 to 4, W representing a group of formula or a group of formula / ] ⁇ 'a '
  • W represents a group of formula ⁇ vV] r being an integer ranging from 1 to 4 ⁇ W group bonding to the NH group via the bond in dotted lines a ',
  • u being an integer ranging from 1 to 4
  • n being an integer ranging from 1 to 10
  • u being an integer ranging from 1 to 4
  • n being an integer ranging from 1 to 10
  • W is a group of the formula wherein R is an integer ranging from 1 to 4, the group W binding to the NH group via the dotted bond a ',
  • R represents one of the following groups:
  • R represents one of the following groups:
  • n represents an integer varying from 1 to 10 u representing an integer ranging from 1 to 4 the group R binding to the NH group via the dotted bond a ',
  • R is one of the following groups:
  • W "W- (Pro) n- W- n representing an integer ranging from 1 to 10 W representing a group of formula the group W binding to the NH group via the dotted bond a ',
  • R represents one of the following groups:
  • W represents a group of formula V ⁇ r [] 'r being an integer ranging from 1 to 4 W group bonding to the NH group via the dotted bond a'.
  • the compounds of the invention are characterized in that R 0 represents a peptide derived from the human or murine CD40 receptor ligand (CD40L), said peptide belonging to the CD40 CD40L ligand primary sequence and from which the number of amino acids is between 3 and 10.
  • CD40L CD40 receptor ligand
  • the compounds of the invention are characterized in that R c represents a peptide derived from the ligand of the human or murine CD40 receptor (CD40L), said peptide belonging to the primary sequence of the ligand
  • CD40L and whose number of amino acids is between 3 and 10 chosen from the following sequences (LQWAEKGYYTMSNN (human sequence SEQ ID NO: 1); LQWAICKGYYTMKSN (murine sequence SEQ ID NO: 2); PGRFERILLRAANTH (human sequence SEQ ID NO: 3); SIGSERILLKAANTH (murine sequence SEQ ID NO: 4).
  • R 0 represents a group of formula HX a - (Xb) iX c - Xd - Xe - (Xf) i - or H - XVL - XVX c - X d -X e - (Xf) i-, wherein:
  • I 0 or 1
  • X a is selected from the following amino acid residues:
  • N- (4-aminobutyl) -glycine - NH 2 - (CH 2 ) n -COOH, n varying from 1 to 10;
  • Xb is selected from the following amino acid residues:
  • alkyl group being a methyl, ethyl or benzyl group
  • R representing H, Me, Et, Pr or Bu
  • k 1, 2, 3 or 4;
  • X 0 is chosen from the following amino acid residues:
  • DOPA 3,4-dihydroxy-phenylalanine
  • Xe is selected from the following amino acid residues:
  • trans-4-aminocyclohexanecarboxylic acid cis-4-aminocyclohexanecarboxylic acid
  • Xf is selected from the following amino acid residues:
  • trans-4-aminocyclohexanecarboxylic acid cis-4-aminocyclohexanecarboxylic acid
  • X ' a represents the side chain of lysine, arginine or ornithine
  • X'b represents the side chain of one of the following amino acid residues:
  • N-alkylated natural amino acids the alkyl group being a methyl, ethyl or benzyl group; acyclic dialkyl amino acids of the following formula:
  • R representing H, Me, Et, Pr or Bu
  • X is especially chosen from the following groups:
  • Xb is in particular chosen from the following groups :
  • X c and Xd are in particular chosen from the following groups:
  • X e and X f are in particular chosen from the following groups
  • the present invention also relates to compounds of formula (I) as defined above, characterized in that Y corresponds to the following formula (II):
  • - A represents an amino acid residue or an amino acid derivative chosen indifferently from:
  • B 1 is an amino acid residue or an amino acid derivative independently selected from:
  • Ra representing the chain of a proteinase amino acid, C1 -C8 alkylated; B is independently selected from the following groups: the link c represents the bond to the group X,
  • n 0, 1, 2 or 3;
  • . p is 0, 1, 2 or 3;
  • Rb represents an alkyl chain comprising from 1 to 6 carbon atoms
  • the compounds of the invention are compounds of formula (I) as defined above in which Y corresponds to one of the following formulas:
  • Ra, R c , D, D ', Xg, q, i and p being as defined above.
  • the preferred compounds according to the invention are compounds corresponding to one of the
  • R c and m being as defined above.
  • the compounds of the invention are characterized in that R c is chosen from one of the following groups:
  • the present invention also relates to a compound as defined above of
  • n 1, 2 or 6;
  • R 0 represents an H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH- (CH 2 ) 5 -CO- group.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, as active substance, a compound of formula (I) as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vector.
  • the present invention also relates to a vaccine composition characterized in that it comprises, as active substance, a compound of formula (I) as defined above, in combination with a pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • the present invention also relates to the use of compounds as defined above, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies involving the inhibition or activation of the immune response.
  • the immune response must be inhibited during inflammatory diseases (inflammatory rheumatism), autoimmune diseases, hypersensitivity reactions in general and allergies in particular, rejection of grafts, graft-versus-host reactions.
  • inflammatory diseases inflammatory rheumatism
  • autoimmune diseases hypersensitivity reactions in general and allergies in particular, rejection of grafts, graft-versus-host reactions.
  • the immune response must be activated in vaccinations in general, in cancer immunotherapy, in bacterial or viral diseases inducing immunosuppression (measles, AIDS, herpes virus, cytomegalovirus ...), in the treatment of diseases. viral bacterial or involving unconventional infectious agents (prions) in people with primary or secondary immunodeficiency.
  • the present invention also relates to the use of compounds as defined above, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies involving the inhibition of the immune response, such as graft rejection, allergies or diseases. autoimmune.
  • the present invention also relates to the use as defined above, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies involving the increase of the immune response, such as cancers or parasitic, bacterial, viral or involving infections.
  • autoimmune diseases such as diabetes, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus or rheumatoid arthritis
  • transplant rejection especially in the context of allografts, xenografts or graft-versus-host reactions, as well as hypersensitivity reactions such as allergies, including hay fever and atopic dermatitis, or granulomas.
  • the compounds according to the present invention used in the context of the inhibition of the immune response, can be administered intravenously, via the mucous (oral, aerial, nasal, vaginal), subcutaneous, intradermal or epicutaneous routes.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises a compound according to the present invention, for the treatment of pathologies involving the inhibition of the immune response, which compound is present in the pharmaceutical composition in amounts such that it can be administered at a rate of about 100 ng to about 5 mg per day per individual.
  • the present invention also relates to the use as mentioned above, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies involving the increase of the immune response, such as cancers or parasitic, bacterial, viral or involving infections.
  • Cases involving activation of the immune response include vaccinations in general, including vaccines against influenza or against childhood diseases, cancer immunotherapy, particularly in the context of melanoma or metastatic cancer, or bacterial diseases immunosuppressive diseases, especially in the context of measles, AIDS, herpes or cytomegalovirus, or vaccines for people with primary or secondary immunodeficiency.
  • the compounds according to the present invention used in the context of the activation of the immune response, can be administered intravenously, by the mucous (oral, aerial, nasal, vaginal) routes, subcutaneously, intradecnically or epicutaneously .
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises a compound according to the present invention, for the treatment of pathologies involving the activation of the immune response, which compound is present in the pharmaceutical composition in amounts such that it can be administered at a rate of about 100 ng to about 5 mg per day per individual.
  • the present invention also relates to a process for the preparation on a solid support of a compound of formula (I) as defined above, said process being characterized in that it comprises the following steps: the formation of a linear precursor of Y as defined above, which precursor consists of a chain of amino acids forming a growing peptide chain, synthesized by successive cycles of coupling between amino acid residues N-protected, three of which carry a amino group, and the amine function of the growing peptide chain, and deprotection, the first amino acid residue being attached to a solid support, said Y linear precursor comprising at least one D-Alanine residue, said residue D-Alanine being substituted with a D-Lysine residue whose ⁇ -NH amine has been acylated by a carboxylic acid carrying the desired function corresponding to group X as defined herein -above,
  • the present invention also relates to a process for the preparation as defined above of a compound of formula (III-a) or (III-b), said process being characterized in that it comprises the following steps:
  • GP representing a protecting group especially chosen from: Boc, Z or Alloc, X 'representing a group -SH or
  • Figure 1 shows the synergism between L1 (see formula below) and the anti-CD40 agonist antibody 3/23.
  • the y-axis represents the uptake of 3 H-thymidine in cpm.
  • Figure 2 shows the HPLC profile of the 1,3-dipolar reaction between macrocycle IV.23 and IV.15 diazide under the conditions of entry 6 and after treatment with TFA. (HPLC: linear gradient, 5-65% B, 20 min).
  • Figure 3 shows the HPLC profile of the 1,3-dipolar reaction between macrocycle IV.23 and IV.14 diazide under inlet conditions and after TFA treatment. (HPLC: linear gradient, 5-65% B, 20 min).
  • FIG. 4A represents the HPLC profile of the crude reaction product of the coupling reaction between the dimerized macrocycle IV.25 and protected pentapeptide P1 after treatment with TFA.
  • Figure 4B shows the HPLC profile of ligand L41 after purification by preparative HPLC. (HPLC: linear gradient, 5-65% B, 20 min).
  • Figure 4C shows the MALDI-TOF profile of ligand L41 (expected mass: 5529).
  • Figures 5A and 5B show apoptosis induction of RAJI cells of Burkitt lymphoma and proliferation of B cells by L1 and L41.
  • the white columns correspond to the ligand L41 and the black columns to the ligand L1.
  • the ordinate axis represents the percentage of specific apoptosis and the abscissa represents the ten ligand concentration in ⁇ M.
  • the results correspond to the average of three independent +/- SD experiments.
  • the ordinate axis represents the stimulation index corresponding to the cpm obtained in the cultures with CD40L analogues divided by the cpm obtained in cultures without CD40L analogues and the abscissa axis represents the concentration of each CD40L analog (L1 and L41) in ⁇ M.
  • the white squares correspond to the ligand L41 and the black squares to the ligand L1.
  • the degree of oligomerization required for signal transduction is different: some are activated by the homotrimeric ligand in soluble form while others are activated only by the homotrimeric membrane ligand.
  • TWEAK, TNF and BAFF ligands are active in soluble forms.
  • activation by FasL, TRAIL, CD40L or CD30L requires the recruitment of two or more spatially similar homotrimers (Holler, N .; Tardivel, A., Kovacsovics-Bankowski, M., Hertig, S., Gaide, O. Martinon,
  • the minimum signaling unit corresponds, not to one, but to several hexameric complexes close to each other.
  • the enhancer may be an anti-receptor monoclonal antibody (eg, anti-CD40 mAb) acting synergistically with the soluble ligand (Pound, JD, Challa, A, Holder, MJ; , RJ, Dower, SK, Fanslow, WC, Kikutani, H., Paulie, S. Gregory, CD, Gordon, J. Immunol Int 1999, 11, 11-20, Schneider, P., Holler, N.
  • an anti-receptor monoclonal antibody eg, anti-CD40 mAb acting synergistically with the soluble ligand (Pound, JD, Challa, A, Holder, MJ; , RJ, Dower, SK, Fanslow, WC, Kikutani, H., Paulie, S. Gregory, CD, Gordon, J. Immunol Int 1999, 11, 11-20, Schneider, P., Holler, N.
  • Bodmer JL, Hahne, M, Frei, K., Fontana, A., Tschopp, JJ Exp Med 1998, 187, 1205-1213
  • an anti-Flag monoclonal antibody allowing oligomerization of the recombinant ligand fused with a Flag peptide (Haswell, LE, Glennie, MJ, Al-Shamkhani, A. Ew, J. Immunol 2001, 31, 3094-3100).
  • the second strategy is to construct fusion proteins consisting of several copies of the ligand.
  • Jorg Tschopp's group at the University of Lausanne has built a molecule in which FasL or CD40L is fused to the collagen domain of the ACRP30 protein.
  • This protein a member of the superfamily of CIq, has a particular geometry and two homotrimeric heads which make it possible to associate by fusion two homotrimeric domains on the same molecule.
  • Haswell et al. has described a molecule capable of presenting four homotrimers of CD40L.
  • the inventors have sought to develop the design of molecules making it possible to present at least two copies of the homotrimeric CD40L mimicking synthetic ligand.
  • the idea is to demonstrate an amplifying effect resulting from the oligomerization of the ligand and to identify the minimal entity that makes it possible to induce proliferation of B lymphocytes. For this purpose, it has been chosen to synthesize dimers of the synthetic ligands. . DIMERIZATION OF SYNTHETIC LIGANDS. 1) General retrosynthetic approach
  • the dimerized molecules are synthesized from two trimeric architectures of cyclo-D, L- ⁇ -peptide type connected to each other by means of an n-alkyl or polyethylene glycol spacer arm.
  • two approaches have been considered: one uses thiol chemistry (Michael addition reaction of a thiol on a maleimide) and the other the "click chemistry", a cycloaddition reaction [3 +2] dipole (or Huisgen reaction) between an alkyne and an azide.
  • the introduced link is a thioether
  • the click chemistry approach generates a 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole bond.
  • the general strategy used is based on the synthesis of a D-L- ⁇ -peptide macrocycle on which a functionalized group is attached: either a true alkyne in the case of the click chemistry approach or a thiol group in the case of the second approach according to the following scheme:
  • This functionalized cycle is prepared according to the following strategy: one of the three D-Alanine residues is substituted, at the time of preparation of the peptide precursor, with a D-Lysine residue whose ⁇ NH amine has been acylated beforehand with a carboxylic acid carrying the desired functionality.
  • This spacer arm is prepared from the corresponding diamine by reaction with N- (methylcarbonyl) maleimide in a mixture of THF and saturated sodium hydrogencarbonate solution
  • the desired product is obtained by simple washing, without further purification.
  • the protection of the thiol derivative of 3-mercaptopropanoic acid by the acetamide protecting group is carried out in trifluoroacetic acid in the presence of N- (hydroxymethyl) acetamide (Phelan, JC, Skelton, NJ, Braisted, AC McDowell, RSJ Am Chem Soc 1997, 119, 455-460).
  • the IV.2 acid is then coupled to the 6 NH-amine of the suitably protected D-Lysine derivative IV.4.
  • the compound obtained, IV.5 is then deprotected from these groups Fmoc and benzyl ester. Then, the N-terminal part of the zwitterion thus formed is again protected by an Fmoc group in order to obtain the precursor IV.7 necessary for the assembly of the linear peptide for the purpose of macrocyclization.
  • This monomer containing a protected thiol group is then incorporated during the solid support synthesis of linear hexapeptide IV.8.
  • the synthesis is carried out from the 2-chlorotrityl chloride resin according to the Fmoc strategy as illustrated below:
  • Macrocycle IV.10 thus obtained is coupled to the protected pentapeptide Boc-Lys (Boc) -Gly-Tyr (OtBu) -Tyr (OfBu) -AhX-OH Pl in the presence of BOP without further purification to yield the fully protected trimeric ligand.
  • the protective groups Boc and tBu as well as the mAb are eliminated in the same step
  • the acetamide group can be removed under different conditions which for some are orthogonal to the Boc / ffiu protective group removal conditions.
  • an acidic medium Hg [OAc] 2 in a pH 4 buffer solution
  • silver salts eg CF 3 SO 3 Ag in the presence of anisole in trifluoroacetic acid
  • Michael addition reaction between the thiol ligand and the bismaleimide spacer arm
  • the Michael addition reaction is carried out in a water / acetonitrile mixture.
  • a solution of bismaleimide IV.1 (1 eq.) In acetonitrile is added to a solution of L38 ligand (3 eq) in water.
  • L38 ligand 3 eq
  • the Michael addition reaction is simple to implement since it requires only to dissolve the ligand functionalized with a thiol group and the bismaleimide spacer arm in a water / acetonitrile mixture.
  • PH adjustment pH ⁇ 7
  • Purification of the crude reaction by preparative HPLC makes it possible to obtain the dimerized ligand.
  • difficulties of purification of the dimerization product were encountered when other bismaleimides were used. Indeed, this reaction was also carried out from a bismaleimide spacer arm of polyethylene glycol IV.ll type.
  • This copper-catalyzed reaction allows a wide variety of conditions, be it at the solvent, the pH or even the copper source.
  • the reaction is carried out using Cu (SO 4 ) 5H 2 O which is reduced in situ by a reducing agent such as sodium ascorbate or ascorbic acid.
  • a source of copper I CuI, CuBr, CuOTfC 6 H 6 Certainly can be directly used. In this case, the reaction is more sensitive to oxidation, and the formation of by-products is sometimes observed.
  • the reaction In order to avoid these parasitic reactions, the reaction must be protected from air and a base such as 2,6-lutidine must be added.
  • the Meîda ⁇ group describes the use of copper salts I (CuI) for the solid phase preparation of 1,4-triazole peptides from organic azides and an alkyne attached to it. end of a peptide-resin (Tornoe, CW, Christensen, C. Meldal, MJ Org Chem 2002, 67, 3057-3064). As in solution, this reaction tolerates all kinds of solvents (acetonitrile, N, N-dimethylformamide, toluene, dichloromethane) and provides easy access in excellent purities to the desired triazole peptide.
  • solvents acetonitrile, N, N-dimethylformamide, toluene, dichloromethane
  • the diazoture spacer arms are prepared in two stages from the corresponding polyethylene glycol chains as follows:
  • the diol is first converted to dimestylate and this is then substituted by the addition of sodium azide.
  • the preparation of the D, L- ⁇ -peptide macrocycle begins with the synthesis of the D-Ly sine derivative IV.21 incorporating the true and suitably protected alkyne function for use in peptide synthesis on a solid support.
  • the HPLC profile of the cyclization reaction carried out using the coupling reagent EDCHCl shows a fine peak corresponding to the deprotected macrocycle IV.24, but this is accompanied by a large mass corresponding to polymerization products. . Even if the dilution of the reaction medium has made it possible to increase the purity of the macrocycle, the reaction yield with this coupling reagent remains very low.
  • the "click chemistry" reaction was first considered from the deprotected ligand (L40) or not (L40 ') of these protective groups.
  • the reactivity tests were carried out with diazide IV.15.
  • Table 2 summarizes the experimental conditions used.
  • the progress of the reaction is monitored by analytical HPLC either by direct injection of the reaction crude in the case of experiments carried out on the deprotected ligand (L40), or after treatment with prior to trifluoroacetic acid in the case of reactions carried out from the protected ligand (L40 ').
  • L40 deprotected ligand
  • L40 ' the low solubility of ligand L40 'makes its analysis in reverse phase HPLC and direct monitoring of the dimerization reaction by "click chemistry" difficult.
  • the corresponding ligands L41 to L43 were then prepared by coupling the dimerized macrocycles and the protected pentapeptide Boc-Lys (Boc) -Gly-Tyr (OtBu) -Tyr (OtBu) -Ahx-OH (P1), deprotection of the protective groups and purification by preparative HPLC.
  • the coupling reaction is carried out in two days.
  • the reaction requires one week stirring at room temperature to arrive at completion. Stopping the reaction after only three days shows the presence of several intermediate products resulting from partial coupling of the pentapeptide on the available ⁇ NH amines.
  • Spleens were taken from BALB / c mice aged 5-12 weeks.
  • Splenic B cells were prepared by positive selection using magnetic beads coated with an anti-CD19 monoclonal antibody (MACS, Milteny Biotech, Germany). This fraction contains more than 95% of B220 + cells.
  • B cells (3 ⁇ 10 6 / ml) were then cultured on RPMI 1640 medium enriched with 10% decompleted FBS, gentamicin (10 ⁇ g / ml), 25 mM Hepes and 10 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol. in the presence of CD40L analogues.
  • the cells were pulsed with 1 ⁇ Ci / well of tritiated thymidine (ICN, Irvine, CA) during the last 20 h of culture and the [H] -thymidine uptake expressed in cpm was measured after 72 h using a direct counter.
  • Matrix 9600 beta (Packard, Meriden, CT).
  • the results (FIG. 5B) are expressed as a stimulation index corresponding to the cpm obtained in cultures with CD40L / cpm analogues obtained in cultures without CD40L analogues.
  • the mice used in this study were raised in our pet stores which are approved by the French veterinary services under number D-67-482-2.
  • Burkitt's lymphoma was cultured on RPMI 1640 medium (Cambrex Bioscience, Verviers, Belgium) enriched with 10% decomplemented fetal bovine serum (FBS) and gentamicin (10 ⁇ g / mL).
  • FBS fetal bovine serum
  • gentamicin 10 ⁇ g / mL
  • cells (1x10 / ml) were incubated at 37 ° C in 96-well plates, at the indicated concentrations of CD40L analogs, in a final volume of 200 ⁇ L. After 16 hours of incubation, the apoptosis of the cells was measured as described below.
  • Apoptosis was evaluated by measuring the decay of the mitocliondrial transmembrane potential ( ⁇ m ) associated with the reduction of cationic dye uptake, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC 6 (3)), as demonstrated by flow cytometry (Zamzami et al., J. Exp Med 1995, 191: 1661).
  • ligand L41 a dimeric ligand resulting from synthesis by "click chemistry" induces a percentage of apoptosis specific to Burkitt's lymphomas.
  • this ligand induces only the proliferation of murine splenic B cells whereas the monomeric ligand L1 did not do so without potentiation with the anti-CD40 3/23 antibody (FIG. 5B).
  • Fmoc-D-Lys (Acm) -OH (IV.7)
  • Compound IV.6 (2.21 g, 7.2 mmol) is dissolved in a solution of H 2 O (50 mL) with K 2 CO 3 ( 2 g, 14.4 mmol).
  • FmocXaaOH (5 eq.) Is coupled twice at room temperature for 30 min to the Fmoc-deprotected resin in the presence of BOP (5 eq.), HOBt (1-hydroxybenzotriazole) (5 eq.) And DIEA (15 eq.) .
  • Compound IV.7 (2.5 eq) is coupled once at room temperature for 2 h in the presence of BOP (2.5 eq.), HOBt (2.5 eq.) And DIEA (10 eq.).
  • the peptide is cleaved from the resin with a mixture of HFIP (hexafluoroisopropanol) and CH 2 Cl 2 (60/40).
  • Triethylene glycol (2 g, 13.31 mmol) is dissolved in
  • Fmoc-D-Lys (Nps) -OH (IV.21) Compound IV.20 (972 mg, 3.43 mmol) is dissolved in a mixture of water and acetone (50 mL, v / v: 1 / 1). K 2 CO 3 (948 mg, 6.86 mmol) in water (25 mL) is added. Then Fmoc-OSu (9-fluorenylmethyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimide) (1.16 g, 3.43 mmol) was added slowly in acetone.
  • the resin is reinflated in methanol with stirring for 1 h and is then washed with DMF, isopropanol, CH 2 Cl 2 , diethyl ether and dried under vacuum.
  • FmocXaaOH (5 eq) is coupled twice at room temperature for 30 min to the Fmoc-deprotected resin in the presence of BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.) And DIEA (15 eq.).
  • Compound IV.21 (2.5 eq.) Is coupled once at room temperature for 2 hours to the Fmoc-deprotected resin in the presence of BOP (2.5 eq.), HOBt (2.5 eq.) And DIEA (10 eq.).
  • the peptide is cleaved from the resin with a mixture of HFIP and CH 2 Cl 2 (60/40).
  • Peptide IV.22 (60 mg, 0.054 mmol) is dissolved in DMF (12 mL) at room temperature.
  • BOP 28.6 mg, 0.064 mmol
  • DIEA 14 ⁇ L, 0.081 mmol
  • the reaction mixture is precipitated in a large amount of saturated NaHCO 3 .
  • the precipitate is filtered and washed with saturated NaHCO 3 , then with water, 1N KHSO 4 , brine, ethyl acetate, acetonitrile and cyclohexane.
  • the heart IV.24, IV.25 or IV.26 (1 eq.) Is dissolved in DMF. At room temperature, the peptide (6.6 eq.), BOP (6.6 eq.) And DIEA (20 eq.) Are added. The reaction mixture is stirred for one week and precipitated in a large amount of saturated NaHCO 3 . The precipitate is filtered and washed with saturated NaHCO 3, then water, KHSO 4 IN, brine and cyclohexane. The solid is dried under vacuum.
  • the crude product is dissolved in trifluoroacetic acid with 5% water.

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Abstract

La présente invention concerne un composé répondant à la formule suivante (I) dans laquelle k et j représentent indépendamment l'un de l'autre 0 ou 1, Y représente un macrocycle dont le cycle comprend de 9 à 36 atomes, et est fonctionnalisé par trois fonctions aminés et par une chaîne permettant l'accrochage du bras espaceur Z via une liaison X, Rc représente un motif de liaison à un récepteur de la superfamille du TNF, X représente une fonction chimique permettant de relier le groupe Y au bras espaceur et Z représente un bras espaceur bi-, tri- ou tétrafonctionnel.

Description

NOUVELLES MOLÉCULES MULTIMÉRIQUES, LEUR PROCÉDÉ DE PRÉPARATION, ET LEUR UTILISATION POUR LA PRÉPARATION DE MÉDICAMENTS
L'invention a pour objet de nouvelles molécules multimériques, leur procédé de préparation, ainsi que leur utilisation pour la préparation de médicaments.
L'invention a également pour objet des molécules capables d'activer ou d'inhiber la réponse immunitaire.
L'importance du couple CD40/CD40L dans la réponse immunitaire a amené de nombreux groupes à utiliser des anticorps dirigés contre ces deux molécules à des fins thérapeutiques, de manière à inhiber ou activer le système immunitaire. L'administration d'anticorps anti-CD40L a donné des résultats encourageants dans le traitement de maladies auto-immunes comme l'encéphalomyélite allergique expérimentale murine (un modèle de la sclérose en plaques humaine) (Howard et al, 1999) ou dans le traitement de rejet d'allogreffes rénales chez les singes (Kirk et al., 1999). Dans ces deux cas, les anticorps ont inhibé une activité néfaste du système immunitaire. Inversement, l'utilisation d'anticorps anti~CD40 agonistes a permis d'une part, d'améliorer fortement la réponse à des vaccins anti-tumoraux peptidiques chez la souris (Diehl et al., 1999) et d'autre part, d'augmenter l'efficacité des cellules T CD4+ dans la lutte contre des tumeurs murines (Sotomayor et al., 1999 ; Lode et al., 2000). Une régression de tumeur dans des modèles murins a été mise en évidence après injection de cellules dendritiques (CDs) transformées par un adénovirus codant le CD40L (Kikuchi et al., 2000). Enfin, une activation des cellules dendritiques par l'interaction de leur molécule CD40 avec CD40L est capable de protéger des souris d'une infection par un parasite, Trypanosoma Cruzi (Chaussabel et al., 1999). Dans tous ces travaux, la valence particulière de la molécule CD40L, qui s'associe sous forme de trimère pour former avec le CD40 des complexes hexavalents, rend difficile la production d'anticorps fonctionnels capables d'interférer avec les fonctions du couple
CD40/CD40L. Le développement des adénovirus codant pour CD40L répond en partie à cet inconvénient. Cependant, leur utilisation n'est pas sans poser de problèmes chez l'homme. Enfin, la valence particulière du système rend difficile la découverte de molécules de synthèse capables d'interférer avec l'interaction CD40/CD40L. L'invention a pour but de fournir des ligands multimériques conçus pour interférer dans des interactions protéine-protéine.
La présente invention a également pour but la préparation de molécules pouvant interférer avec des interactions multivalentes protéines-protéines. La présente invention a également pour but la préparation de molécules pouvant moduler l'activité des membres des familles du TNF et du TNF-R.
La présente invention a pour but de fournir une molécule de synthèse agissant sur le système CD40/CD40L.
La présente invention concerne un composé répondant à la formule suivante (I) :
dans laquelle :
- k et j représentent indépendamment l'un de l'autre 0 ou 1, - Y représente un macrocycle dont le cycle comprend de 9 à 36 atomes, et est fonctionnalisé par trois fonctions aminés permettant l'accrochage de Rc par sa fonction carboxylique C-terminale et par une chaîne permettant l'accrochage du bras espaceur Z via une liaison X,
- R0 représente un motif de liaison à un récepteur de la superfamille du TNF5 et de préférence correspond à une séquence dérivée d'un ligand, choisie parmi les résidus formant l'interface avec le récepteur du ligand, laquelle séquence est susceptible d' interagir avec le récepteur, ledit ligand étant choisi parmi les ligands de récepteurs de la superfamille du TNF, et notamment parmi les ligands suivants : EDA, CD40L, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, CD27L, LTa, TNF, LTβ, TWEAK, APRIL, BLYS, RANKL et TRAIL, - X représente une fonction chimique permettant de relier le groupe Y au bras espaceur et est choisi parmi les fonctions suivantes :
thioether-2 thioether-3
(5') (6') (T) (8') a' S'b disulfure oxime-1 oxime-2 (9') (10') (H')
1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole
1 ,4-disubstitué- 1 1 ,4-disubstitué-2 1 ,5-disubstitué- 1 1 ,5-disubstitué-2 (12') (13') (14') (15')
a représentant la liaison avec le groupe Y et b représentant la liaison avec le groupe Z,
- Z représente un bras espaceur bi-, tri- ou tétrafonctionnel permettant la
R~Y — Rc dimérisation, trimérisation ou tétramérisation de | par la formation d'une liaison de type X, les bras espaceurs Z réponda Knt à l'une des formules suivantes : lorsque j ^ k = O :
* lorsque X représente un groupe de formule (1 '), (8'), (9'), (5'), (6'), (T), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes :
.---\^o O -(CH2)Ii- m m étant un nombre entier variant de 1 à 40, n étant un nombre entier variant de 1 à 10, * lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') , Z répond à l'une des formules suivantes :
H
O N-(CH2)n—N
H m H 2 H
* lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') , Z répond à l'une des formules suivantes :
m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6, u étant un nombre entier variant de 1 à 4, W représentant un groupe de formule ou un groupe de formule / ]τ'a'
O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
* lorsque X représente un groupe de formule (1 '), (2')» (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11 '), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes :
m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6 u étant un nombre entier variant de 1 à 4 a,-
W représentant un groupe de formule ^vV] r étant un nombre entier variant de 1 à 4 ^ le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
lorsque j = 1 ou k = 1
* lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14'), Z répond à l'une des
u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10
W représentant un groupe de formule ou un groupe de formule 1 Ji'''
O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
* lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11 '), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes :
u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10
W représentant un groupe de formule S^ Ψn'k r étant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
* Z pouvant également représenter l'une des formules suivantes
dans laquelle :
- lorsque X représente un groupe de formule (I5), (8'), (9'), (5!), (6'), (7'), (13') et (15') :
R représente l'un des groupes suivants :
à 10
le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
- lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') :
R représente l'un des groupes suivants :
n représentant un nombre entier variant de 1 à 10 u représentant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
- lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') :
R représente l' un des groupes suivants :
W-NH-(CH2-CH2-O)ITI-CH2-CH2-CO- m variant de 3 à 6 le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
W" W-(Pro)n— W- n représentant un nombre entier variant de 1 à 10 W représentant un groupe de formule le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
- lorsque X représente un groupe de formule (1'), (T), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11 '), (13') et (15') : R représente l'un des groupes suivants :
W-NH-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-CO- m variant de 3 à 6
W-- W-(Pro)n— W~
u et n étant tels que définis ci-dessus,
JJ ai. W représentant un groupe de formule ^V 'r []' r étant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a'.
Ainsi, la présente invention concerne des dimères (lorsque j = k = 0), des trimères (lorsque j = l ou k = l) et des tétramères (lorsque j = k = 1) du motif c | c.
Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont caractérisés en ce que R0 représente un peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand CD40L de CD40 et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10.
Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont caractérisés en- ce que Rc représente un peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand
CD40L et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10 choisi parmi les séquences suivantes (LQWAEKGYYTMSNN (séquence humaine SEQ ID NO : 1) ; LQWAICKGYYTMKSN (séquence murine SEQ ID NO : 2) ; PGRFERILLRAANTH (séquence humaine SEQ ID NO : 3) ; SIGSERILLKAANTH (séquence murine SEQ ID NO : 4).
La présente invention concerne des composés tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que R0 représente un groupe de formule H-Xa-(Xb)i-Xc-Xd-Xe-(Xf)i- ou H-XVL-XVXc-Xd-Xe-(Xf)i-, dans laquelle :
• 1 représente O ou 1 ,
• i représente O ou 1,
• Xa est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :
- lysine ; - arginine ;
- ornithine ;
- les β-acides aminés correspondant à la lysine, l'argmine ou l'omithine, portant la substitution en position α ou β ;
- acide tranéxamique ; - acide N-méthyl -tranéxamique ;
- acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ;
- acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ;
- acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ;
- N-(4-aminobutyl)-glycine ; - NH2-(CH2)n-COOH, n variant de 1 à 10 ;
- NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH, m variant de 3 à 6 ;
- 4-carboxyméthyl-pipérazine ;
- acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ;
- acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ; - acide 4-aminophénylacétique ;
- 4-(2aminoéthyl)-l-carboxyméthyl-pipérazine ;
- acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; - acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;
- 4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine ;
- acide 4-aminobenzoïque ;
- acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ; • Xb est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :
- glycine ;
- isoleucine ;
- leucine ; - valine ;
- asparagine ;
- D-alanine ;
- D-valine ;
- L-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ; - D-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;
- acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ;
- acides aminés dialkylés acycliques de formule suivante :
R représentant H, Me, Et, Pr ou Bu ;
- acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante :
k représentant 1, 2, 3 ou 4 ;
• X0 est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :
- tyrosine ; - isoleucine ;
- leucine ;
- valine ;
- phénylalanine ;
- 3-nitro-tyrosine ; - 4-hydroxyméthyl-phénylalanine ;
- 3,5-dihydroxy-ρhénylalanine ;
- 2,6-diméthyl-tyrosine ;
- 3,4-dihydroxy-phénylalanine (DOPA) ; • Xd est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :
- tyrosine ;
- isoleucine ;
- leucine ; - valine ;
- phénylalanine ;
- 3-nitro-tyrosine ;
- 4-hydroxyméthyl-phénylalanine ;
- 3,5-dihydroxy-phénylalanine ; - 2,6-diméthyl-tyrosine ;
- 3,4-dihydroxy-phénylalanine ;
• Xe est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :
- arginine ;
- -(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; - -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ;
- NH2-(CH2)I1-COOH, n variant de 1 à 10 ;
- NH2-(CH2-CH2-O)1n-CH2CH2COOH5 m variant de 3 à 6 ;
- acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ;
- acide tranéxamique ; - acide N-méthyl-tranéxamique ;
- acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ;
- acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ;
- N-(4-aminobutyl)-glycine ;
- 4-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ;
- acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ;
- acide 4-aminophénylacétique ;
- 4-(2aminoéthyl)-l-carboxyméthyl-pipérazine ;
- acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexane acétique ;
- acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;
- 4-amino-l-earboxyméthyl pipéridine ;
- acide 4-aminobenzoïque ; - acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ;
• Xf est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :
- -(GIy)Ii-;, n variant de 1 à 10 ; - -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ;
- NH2-(CH2)n-COOH, n variant de 1 à 10 ;
- NH2-(CH2-CH2-O)01-CH2CH2COOH, m variant de 3 à 6 ;
- acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ;
- acide tranéxamique ; - acide N-méthyl-tranéxamique ;
- acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ;
- acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ;
- N-(4-aminobutyl)-glycine ;
- 4-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ;
- acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ;
- acide 4-aminophénylacétique ;
- 4-(2aminoéthyl)-l-carboxyméthyl-pipérazme ;
- acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexane acétique ;
- acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;
- 4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine ;
- acide 4-aminobenzoïque ; - acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ;
• -L- représente une liaison de nature pseudopeptidique entre les résidus X'a et X'b, choisie notamment dans la liste ci-dessous :
-L- = -ψ(CH2CH2> ; -ψ(CH(Fk)=CH(Fk'))s -ψ(CH2NH)- ; -ψ(NHCO)- ; -ψ(NHCONH)- ; -ψ(CO-O)- ; -ψ(CS-NH)- ; -ψ(CH(OH)-CH(OH))- ; -ψ(S-CH2)- ; -ψ(CH2-S> ; -ψ(CH(CN)-CH2> ; -ψ(CH(OH)> ; -ψ(COCH2)- ; -ψ(CH(OH)CH2)- ;
-ψ(CH(OH)CH2NH)- ; -ψ(CH2)- ; -ψ(CH(Fk))- ; -ψ(CH2O)- ; -ψ(CH2-NHCONH)- ; -ψ(CH(Fk)NHCONFk')- ; -ψ(CH2-CONH)- ; -ψ(CH(Fk)CONH> ;
-ψ(CH(Fk)CH(Fk')CONH)- ; ou -ψ(CH2N> ; -ψ(NHCON)- ; -ψ(CS-N)- ; -ψ(CH(OH)CH2N)- ; -ψ(CH2-NHCON> ; -ψ(CH2-CQN> ; -ψ(CH(Fk)CON> ; -ψ(CH(Fk)CH(Fk')CON> lorsque X'b représente la chaîne latérale d'une proline,
Fk et Fk' représentant, indépendamment l'un de l'autre, un hydrogène, un halogène, un groupe alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, ou un groupe aryle dont la structure du cycle contient de 5 à 20 atomes de carbone,
• X'a représente la chaîne latérale de la lysine, de l'arginine ou de î'ornithine ; et
• X'b représente la chaîne latérale de l'un des résidus d'acides aminés suivants :
- glycine ; - isoleucine ;
- leucine ;
- valine ;
- asparagine ;
- D-alanine ; - D-valine ;
- L-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;
- D-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;
- acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ; - acides aminés dialkylés acycliques de formule suivante :
R représentant H, Me, Et, Pr ou Bu ;
- acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante
k représentant 1, 2, 3 ou 4. Ainsi, Xa est notamment choisi parmi les groupes suivants :
Xb est notamment choisi parmi les groupes suivants : Xc et Xd sont notamment choisis parmi les groupes suivants :
Xe et Xf sont notamment choisis parmi les groupes suivants
La présente invention concerne également des composés de formule (I) tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que Y répond à la formule suivante (II) :
dans laquelle :
- A représente un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi indifféremment parmi :
(1) (2) (3) (4)
(5) (6) (V) (8)
(9) (10) (H) (12)
. n représentant O, 1, 2 ou 3 ; . p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; . E représentant NH ou O ;
- B1 est un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi de manière indépendante parmi :
(13) (14) (15) (16)
(17) (18) (19) (20)
. n représentant 0, 1, 2 ou 3 ; . p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; . E représentant NH ou O ;
. Ra représentant la chaîne d'un acide aminé protéinogénique, Cl -C 8 alkylé ; - B est choisi de manière indépendante parmi les groupes suivants : la liaison c représentant la liaison au groupe X,
(15) (16) (19) (20)
. n représentant 0, 1, 2 ou 3 ;
. p représentant 0, 1 , 2 ou 3 ;
. E représentant NH ou O ;
. Rb représentant une chaîne alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone ;
. D' représentant l'un des groupes suivants :
-N-(CH2)V-N-D
O H H
H 'm D
--N-(CH 2M
----N' O H m m représentant un nombre entier variant de 1 à 40 ; v représentant un nombre entier variant de 1 à 10 ; la liaison c' représentant la liaison au groupe X, D représentant l'un des groupes suivants : - un groupe de formule , 9 9
lorsque X représente un groupe de formule (13') et (15'), u un groupe de ou de formule lorsque X représente un groupe de formule (1 '), (T), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (H '), (12') et (14'), la liaison c' représentant la liaison au groupe X, q représentant un nombre entier variant de 2 à 6 ; Xg correspondant au résidu de l'un des groupes suivants :
-(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ;
-NH2-(CH2)n-COOH, n variant de 1 à 10 ;
-NH2-(CH2-CH2-O)1n-CH2CH2COOH, m variant de 3 à 6 ; . acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; acide tranéxamique ; acide N-méthyl-tranéxamique ; acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; acide 3(pipéridin-4-yl)-propionique ;
N-(4-aminobutyl)-glycine ;
4-carboxyméthyl-pipérazine ; acide 4-(4-aminophenyl)butanoïque ; acide 3-(4-aminophenyl)propanoïque ; acide 4-aminophénylacétique ;
4-(2-aminoéthyl)- 1 -carboxyméthyl-pipérazine ; acide trans-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;
4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine ; acide 4-aminobenzoïque ; acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque. Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont des composés de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle Y répond à l'une des formules suivantes :
(III) (IV)
(III-3) (iπ-4)
Ra, Rc, D, D', Xg, q, i et p étant tels que définis ci-dessus.
Les composés préférés selon l'invention sont des composés répondant à l'une des
Rc et m étant tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont caractérisé en ce que lequel Rc est choisi parmi l'un des groupes suivants :
- H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-,
- H-Lys-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-,
- Ahx-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-,
- H-Lys-ψ(CH2N)-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, -ψ(CH2N)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène-amino,
- H-Lys~ψ(CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, -ψ(CH2)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène,
- H-Lys-ψ(CH2-CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, -ψ(CH2CH2)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type éthylène,
- H-Lys-Gly-DOPA-Tyr-NH-(CH2)5-CO- et
- H-Arg-Ile-Ile-Leu-Arg- NH-(CH2)5-CO.
La présente invention concerne également un composé tel que défini ci-dessus de
dans laquelle :
- n est égal à 1, 2 ou 6 ;
- R0 représente un groupe H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de substance active un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également une composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de substance active un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec un adjuvant pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également l'utilisation de composés tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'inhibition ou l'activation de la réponse immunitaire.
La réponse immunitaire doit être inhibée au cours des maladies inflammatoires (rhumatismes inflammatoires), des maladies auto-immunes, des réactions d'hypersensibilités en général et des allergies en particulier, des rejets de greffes, des réactions du greffon contre l'hôte.
La réponse immunitaire doit être activée dans les vaccinations en général, dans l'immunothérapie des cancers, dans les maladies bactériennes ou virales induisant une immunosuppression (rougeole, SIDA, virus de l'herpès, cytomégalovirus...), dans le traitement des maladies bactériennes virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels (prions) chez les personnes présentant un déficit immunitaire primaire ou secondaire. La présente invention concerne également l'utilisation de composés tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire, telles que les rejets de greffes, les allergies ou les maladies auto-immunes. La présente invention concerne également l'utilisation telle que défmie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'augmentation de la réponse immunitaire, telles que les cancers ou les infections parasitaires, bactériennes, virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels tels que les prions. Les maladies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire comprennent les maladies auto-immunes telles que les diabètes, la sclérose en plaques, le lupus érythémateux disséminé ou l'arthrite rhumatoïde, les rejets de greffes, notamment dans le cadre d'allogreffes, de xénogreffes ou les réactions du greffon contre l'hôte, ainsi que les réactions d'hypersensibilités telles que les allergies, notamment le rhume des foins et les dermatites atopiques, ou les granulomes.
Les composés selon la présente invention, utilisés dans le cadre de l'inhibition de la réponse immunitaire, peuvent être administrés par voie intraveineuse, par les voies muqueuses (orales, aériennes, nasales, vaginales), par voie sous-cutanée, intradermique ou épicutanée. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé selon la présente invention, pour le traitement de pathologies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire, lequel composé est présent dans la composition pharmaceutique en quantités telles qu'il peut être administré à raison d'environ 100 ng à environ 5 mg par jour et par individu. La présente invention concerne également l'utilisation telle que mentionnée ci- dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'augmentation de la réponse immunitaire, telles que les cancers ou les infections parasitaires, bactériennes, virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels tels que les prions. Les cas impliquant l'activation de la réponse immunitaire comprennent les vaccinations en général, notamment les vaccins contre la grippe ou contre les maladies infantiles, l'immunothérapie des cancers, notamment dans le cadre de mélanomes ou de cancers à métastases, ou les maladies bactériennes ou virales induisant une immunosuppression, notamment dans le cadre de la rougeole, du SIDA, du virus de l'herpès ou du cytomégalovirus, ou les vaccins destinés aux personnes présentant un déficit immunitaire primaire ou secondaire.
Les composés selon la présente invention, utilisés dans le cadre de l'activation de la réponse immunitaire, peuvent être administrés par voie intraveineuse, par les voies muqueuses (orales, aériennes, nasales, vaginales), par voie sous-cutanée, intradeπnique ou épicutanée.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé selon la présente invention, pour le traitement de pathologies impliquant l'activation de la réponse immunitaire, lequel composé est présent dans la composition pharmaceutique en quantités telles qu'il peut être administré à raison d'environ 100 ng à environ 5 mg par jour et par individu.
La présente invention concerne également un procédé de préparation sur support solide d'un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la formation d'un précurseur linéaire de Y tel que défini ci-dessus, lequel précurseur est constitué d'un enchaînement d'acides aminés formant une chaîne peptidique en croissance, synthétisée par des cycles successifs de couplage entre des résidus d'acides aminés N-protégés, dont trois portent un groupe de type aminé, et la fonction aminé de la chaîne peptidique en croissance, et de déprotection, le premier résidu d'acide aminé étant accroché sur un support solide, ledit précurseur linéaire de Y comprenant au moins un résidu D-Alanine, ledit résidu D-Alanine étant substitué par un résidu D-Lysine dont l'aminé ε-NH a été acylée par un acide carboxylique portant la fonction désirée correspondant au groupe X tel que défini ci-dessus,
- la cyclisation du précurseur linéaire de Y protégé susmentionné, afin d'obtenir un cycle fonctionnalisé protégé,
- la réaction dudit cycle fonctionnalisé protégé avec un bras espaceur dérivé de Z tel que défini ci-dessus, afin d'obtenir un cycle fonctionnalisé protégé dimérisé,
- le clivage des susdits groupes protecteurs, pour libérer les susdites fonctions aminés protégées et obtenir un cycle fonctionnalisé déprotégé dimérisé, - le couplage des fonctions aminés libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe R0 tel que défini ci-dessus, et - le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe R0, afin d'obtenir le composé tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé de préparation tel que défini ci-dessus d'un composé de formule (Ill-a) ou (III-b), ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la réaction d'un cycle fonctionnalisé protégé de formule suivante :
GP représentant un groupe protecteur notamment choisi parmi : Boc, Z ou Alloc, X' représentant un groupe -SH ou
O ,z avec un groupe espaceur de formule Z" O n représentant un nombre entier variant de 1 à 10
afin d'obtenir un composé de formule (VIII) suivante
GP étant tel que défini ci-dessus et
étant entendu que Y' répond à la formule (A) lorsque Z' représente un groupe N3
et que Y' répond à la formule (B) lorsque Z' représente un groupe
— la déprotection des susdits groupes protecteurs GP, pour libérer les fonctions aminés protégées et le couplage de ces fonctions aminés libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe Rc tel que défini ci-dessus, et
— le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe Rc, afin d'obtenir le composé de formule (Ill-a) ou (Ill-b) tel que défini ci-dessus. DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente la synergie entre Ll (voir formule plus loin) et l'anticorps anti- CD40 agoniste 3/23. L'axe des ordonnées représente l'absorption de 3H-thymidine en cpm.
La Figure 2 représente le profil HPLC de la réaction 1,3-dipolaire entre le macrocycle IV.23 et le diazoture IV.15 dans les conditions de l'entrée 6 et après traitement au TFA. (HPLC : gradient linéaire, 5-65% B, 20 min).
La Figure 3 représente le profil HPLC de la réaction 1,3-dipolaire entre le macrocycle IV.23 et le diazoture IV.14 dans les conditions de l'entrée 5 et après traitement au TFA. (HPLC : gradient linéaire, 5-65% B, 20 min).
La Figure 4 A représente le profil HPLC du brut réactionnel de la réaction de couplage entre le macrocycle dimérisé IV.25 et du pentapeptide protégé Pl après traitement au TFA. La Figure 4B représente le profil HPLC du ligand L41 après purification par HPLC préparative. (HPLC : gradient linéaire, 5-65% B, 20 min). La Figure 4C représente le profil MALDI-TOF du ligand L41 (masse attendue : 5529).
Les Figures 5 A et 5B représentent l'induction d'apoptose des cellules RAJI de lymphomes de Burkitt et la prolifération des cellules B par Ll et L41. Les colonnes blanches correspondent au ligand L41 et les colonnes noires au ligand Ll . Dans la Figure 5A, l'axe des ordonnées représente le pourcentage d'apoptose spécifique et l'axe des abscisses représente la concentration dix ligand en μM. Les résultats correspondent à la moyenne de trois expérimentations indépendante +/- SD. Dans la Figure 5B, l'axe des ordonnées représente l'index de stimulation correspondant aux cpm obtenus dans les cultures avec des analogues de CD40L divisés par les cpm obtenus dans les cultures sans analogues de CD40L et l'axe des abscisses représente la concentration de chaque analogue de CD40L (Ll et L41) en μM. Les carrés blancs correspondent au ligand L41 et les carrés noirs au ligand Ll . En interagissant avec leurs ligands respectifs, les récepteurs de la superfamille du TNF transmettent un signal qui permet la survie, la prolifération et la différentiation cellulaire et/ou l'apoptose (mort cellulaire programmée). Suivant le récepteur de la superfamille du TNF considéré et/ou le type cellulaire, le degré d'oligomérisation nécessaire à la transduction du signal est différent : certains sont activés par le ligand homotrimérique sous forme soluble alors que d'autres sont activés uniquement par le ligand homotrimérique membranaire. Ainsi les ligands TWEAK, TNF et BAFF sont actifs sous formes solubles. En revanche, l'activation par FasL, TRAIL, CD40L ou CD30L nécessite le recrutement de deux ou plusieurs homotrimères spatialement proches (Holler, N.; Tardivel, A.; Kovacsovics-Bankowski, M.; Hertig, S.; Gaide, O.; Martinon,
F.; Tinel, A.; Deperthes, D.; Calderara, S.; Schulthess, T.; Engel, J.; Schneider, P.;
Tschopp, J. Molec. CeIl Biol. 2003, 23, 1428-1440; Schneider, P.; Holler N.; Bodmer,
J.L.; Hahne, M.; Frei, M.; Fontana, A.; Tschopp, J. J. Exp. Med 1998, 187, 1205-1213).
Dans le cas de la signalisation par CD40, il a été démontré que sur certains types cellulaires et notamment sur les cellules B, la formation du seul complexe hexamérique
3:3 n'était pas suffisante pour induire la transduction du signal. Dans ce cas, l'unité minimale de signalisation correspond, non pas à un, mais à plusieurs complexes hexamériques proche les uns les autres.
Cette observation a incité les biochimistes à développer des outils pour augmenter Poligomérisation du récepteur induite par le ligand soluble. Cette approche permet, d'une part d'augmenter l'effet biologique produit par l'engagement du récepteur, et d'autre part d'étudier les mécanismes par lesquels la multimérisation permet cette augmentation.
A ce jour, seules des approches biochimiques ont été décrites pour amplifier Poligomérisation de CD40. Essentiellement, deux stratégies ont été décrites. La première est basée sur l'utilisation de deux partenaires : le ligand et un agent amplificateur d'oligomérisation. La deuxième stratégie est basée sur la construction de protéines de fusion multimériques. Ces deux approches ont été utilisées pour amplifier l'effet biologique de CD40L et de FasL.
Dans le cas de la première stratégie, l'agent amplificateur peut être un anticorps monoclonal anti-récepteur (ex : mÀb anti-CD40) agissant en synergie avec le ligand soluble (Pound, J.D.; Challa, A.; Holder, M.J.; Armitage, RJ.; Dower, S.K.; Fanslow, W.C.; Kikutani, H.; Paulie, S.; Gregory, CD.; Gordon, J. Int. Immunol 1999, 11, 11-20 ; Schneider, P.; Holler, N.; Bodmer, J.L.; Hahne, M.; Frei, K.; Fontana, A.; Tschopp, J. J. Exp. Med. 1998, 187, 1205-1213) ou bien un anticorps monoclonal anti-Flag permettant l'oligomérisation du ligand recombinant fusionné avec un peptide Flag (Haswell, L.E.; Glennie, MJ.; Al-Shamkhani, A. Ew. J. ïmmunol. 2001, 31, 3094-3100).
La deuxième stratégie consiste à construire des protéines de fusion constituées de plusieurs copies du ligand. A cette fin, le groupe de Jôrg Tschopp à l'université de Lausanne a construit une molécule dans laquelle FasL ou CD40L est fusionnée au domaine collagène de la protéine ACRP30. Cette protéine, membre de Ia superfamille du CIq, possède une géométrie particulière et deux têtes homotrimériques qui permettent d'associer par fusion deux domaines homotrimériques sur la même molécule. Dans une démarche similaire, Haswell et al. a décrit une molécule capable de présenter quatre homotrimères de CD40L. Ils ont pour cela remplacé le domaine lectine de la « lung surfactant protein-D » (SP-D : membre de la superfamille des lectines) par le domaine extracellulaire C-terminal de CD40L (Haswell, L.E.; Glennie, M.J.; Al- Shamkhani, A. Ew. J. ïmmunol 2001, 31, 3094-3100).
L'utilisation de ces protéines multimériques ACRP30 et SP-D fusionnées à CD40L homotrimérique a permis de démontrer que la plus petite unité active capable d'induire une prolifération robuste des lymphocytes B spléniques de souris est un dimère de CD40L homotrimérique. La combinaison des deux stratégies à savoir le « crosslinking » de la protéine de fusion CD40L:ACRP30 contenant un Flag avec un anticorps anti-Flag permet d'augmenter de manière significative l'effet de la protéine CD40L:ACRP30 sur les cellules B démontrant ainsi la nécessité d'amplifier le degré d'oligomérisation du récepteur pour une signalisation efficace.
PARTIE EXPÉRIMENTALE A) CHIMIE
Comme la molécule CD40L soluble, les mimes synthétiques (ex : Ll tel que décrit dans la demande WO03/102207) n'induisent pas la prolifération des cellules B spléniques murines. Les résultats de la littérature discutés précédemment suggèrent l'intérêt que pourraient avoir des stratégies visant à augmenter encore davantage le pouvoir d'oligomérisation de nos ligands synthétiques. Ceci est conforté par les résultats obtenus au laboratoire avec l'anticorps monoclonal 3/23. En effet, nous avons pu montrer que l'action de Ll sur des cellules B spléniques, comme celle de CD40L homotrimérique soluble, est potentialisée par cet anticorps anti-CD40 agoniste. L'association de ces 2 molécules permet d'induire la prolifération des cellules B (Figure 1).
Parallèlement les Inventeurs ont cherché à développer la conception de molécules permettant de présenter au moins deux copies du ligand synthétique mimant CD40L homotrimérique. L'idée étant de mettre en évidence un effet amplificateur résultant de l'oligomérisation du ligand et d'identifier l'entité minimale permettant d'induire une prolifération des lymphocytes B. Pour cela, il a été choisi de synthétiser des dimères des ligands synthétiques. DIMÉRISATION DES LIGANDS SYNTHÉTIQUES. 1) Approche rétrosynthétique générale
Les molécules dimérisées sont synthétisées à partir de deux architectures trimériques de type cyclo-D,L-α-peptide reliées l'une à l'autre par l'intermédiaire d'un bras espaceur de type n-alkyle ou polyéthylène glycol. Afin de créer ce lien, deux approches ont été envisagées : l'une utilise la chimie des thiols (réaction d'addition de Michael d'un thiol sur un maléimide) et l'autre la « click chemistry », réaction de cycloaddition [3+2] dipolaire (ou réaction de Huisgen) entre un alcyne et un azoture. Alors que dans la première approche, le lien introduit est un thioéther, l'approche par « click chemistry » génère un lien de type 1,2,3-triazole 1,4-disubstitué.
La stratégie générale utilisée repose sur la synthèse d'un macrocycle D,L-α-peptide sur lequel est accroché un groupement fonctionnalisé : soit un alcyne vrai dans le cas de l'approche par « click chemistry », soit un groupement thiol dans le cas de la seconde approche selon le schéma suivant :
dans le cas de la "click chemistry" as de la chimie des thiols
Ce cycle fonctionnalisé est préparé suivant la stratégie suivante : un des trois résidus D-Alanine est substitué, au moment de la préparation du précurseur peptidique, par un résidu D-Lysine dont l'aminé εNH a été acylée au préalable par un acide carboxylique portant la fonctionnalité désirée.
2) Dimérisation par la réaction d'addition de Michael entre un thiol et un maléimide
II a d'abord été envisagé de dimériser les mimes fonctionnels de CD40L par la réaction d'addition de Michael entre un ligand fonctionnalisé de manière exocyclique par un groupement thiol et un bras espaceur bismaléimide à 6 carbones (IV.l).
Ce bras espaceur est préparé à partir de la diamine correspondante, par réaction avec le iV-(Méthylcarbonyl)maléimide dans un mélange de THF et d'une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium ((a) Bodanszky, M.; Bodanszky, A. In the Practice ofPeptide Synthesis; Springer-Verlag: New York, 1984, 29-31. (b) Cheronis, J.C.; Whalley, E.T.; Nguyen, K.T.; Eubanks, S.R.; Allen, L.G.; Duggan, MJ.; Loy, S.D.; Bonham, K.A.; Blodgett, K. J. Med. Chem. 1992, 35, 1563-1572). Le produit désiré est obtenu par simple lavage, sans purification supplémentaire.
(a) N-(Méthylcarbonyl) maléimide, NaHCO3/THF, 100%.
a. Synthèse du macrocycle fonctionnalisé
Une des étapes clé de cette synthèse est la préparation du macrocycle fonctionnalisé par un groupement thiol. Il a fallu dans un premier temps trouver un groupement protecteur approprié pour cette fonctionnalité, orthogonal au groupement Boc mais stable dans les conditions classiques de synthèse peptidique. Pour cela, le groupement acétamide
(Acm) a été utilisé. Ce groupement protecteur est, en effet, stable dans les conditions de déprotection du groupement Fmoc (20% pipéridine dans le DMF) mais également en présence d'acide trifmoroacétique.
La synthèse de l'intermédiaire acide 3-(Acétylamino-méthylsulfanyl) propionique (IV.2) nécessaire à la fonctionnalisation du macrocycle est présentée sur le schéma suivant : H
IV.2 (a) TFA, 100%.
La protection du dérivé thiol, de l'acide 3-mercaptopropanoïque, par le groupement protecteur acétamide, s'effectue dans l'acide trifluoroacétique en présence de N-(hydroxyméthyl)acétamide (Phelan, J.C.; Skelton, NJ.; Braisted, A.C.; McDowell, R.S. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 455-460).
L'acide IV.2 est alors couplé sur l'aminé 6NH du dérivé D-Lysine convenablement protégé IV.4. Le composé obtenu, IV.5, est ensuite déprotégé de ces groupements Fmoc et ester de benzyle. Puis, la partie N-terminale du zwitterion ainsi formé est à nouveau protégée par un groupement Fmoc afin d'obtenir le précurseur IV.7 nécessaire à l'assemblage du peptide linéaire en vue de la macrocyclisation.
1V.3 : R = Boc IV.5 IV.6 IV.7 b) \
1V.4 : R = NH3 +, TFA
(a) BnBr (3 eq.), KHCO3 (1.6 eq.), Bu4NI (0.1 eq.), DMSO, 100% ; (b) TFA, 100% ; (c) IV.1, BOP, DIEA, DMF, 90% ; (d) LiOH IN (1 eq.), DMF, 91% ; (e) FmocOSu (1 eq.), K2CO3 (2 eq.), acétone/H2O, 66%.
Ce monomère contenant un groupement thiol protégé est alors incorporé lors de la synthèse sur support solide de l'hexapeptide linéaire IV.8. La synthèse s'effectue à partir de la résine chlorure de 2-chlorotrityle selon la stratégie Fmoc comme illustré ci-après :
I — IV.9 : R ≈ Boc
•— "- IV1I O I R = NH3 +, TFA"
(a) Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 eq.), DIEA (6 eq.), CH2Cl2; (b) 25% pipéridine/DMF; (c) SPPS : Fmoc-Xaa-OH (5 eq.), BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (d) HFIP/CH2C12 (60/40 v/v) ; (e) EDCHCl (1.2 eq.), HOBt (1.2 eq.), DIEA (1.5 eq) , DMF, 77% ; (f) TFA, 85%. La cyclisation du précurseur linéaire IV.8 s'est avérée problématique. En effet, les premiers essais effectués dans les conditions standards utilisées lors de la synthèse du macrocycle 11.2 ont abouti à des profils HPLC du produit macrocyclisé brut, après déprotection, accompagné de quantités importantes de produits de polymérisation. Une étude plus détaillée des conditions de macrocyclisation a donc été nécessaire. Pour cela, nous avons fait varier la nature des réactifs de couplage, la concentration du milieu réactionnel ainsi que le temps de réaction. Les résultats de cette étude sont résumés dans le tableau 1. Dans ce tableau, le pourcentage de pureté correspond à la pureté estimée à partir du profil HPLC du composé IV.10 brut obtenu après de traitement de IV.9 au TFA. En effet, l'analyse HPLC du cycle complètement protégé IV.9 est impossible car ce composé est très peu soluble dans les solvants utilisés classiquement en HPLC.
Tableau 1 : Différentes conditions utilisés pour la réaction de macrocyclisation
II apparaît que cette réaction est très sensible aux conditions expérimentales employées. Dans un premier temps, nous avons pu remarquer que la concentration à laquelle s'effectue la réaction est très importante. En effet, suivant la dilution du milieu réactionnel, la pureté du macrocycle IV.10 varie fortement (entrées 1, 2 et 4 du tableaul). Une concentration de 4.10"3 M semble être adaptée pour former le macrocycle IV.10 avec une pureté satisfaisante. De même, l'issue de la réaction est fortement influencée par le réactif de couplage utilisé ainsi que par le pH auquel est réalisée la réaction (pH ~ 7 pour le couplage à 1ΕDC.HC1, pH ~ 8-9 pour le couplage au BOP). En effet, le réactif BOP donne un résultat très nettement inférieur à l'EDC.HCl (entrées 4 et 5). Enfin, le temps de réaction a été évalué. Dans le cas du couplage à l'EDC.HCl, 72 heures sont nécessaires pour une macrocyclisation totale (entrées 3 et 4).
Une différence de réactivité a également été observée en fonction de la température à laquelle s'effectue la réaction. A une température de 40°C, les produits de polymérisation sont très largement majoritaires.
Le macrocycle IV.10 ainsi obtenu est couplé au pentapeptide protégé Boc- Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)-Tyr (OfBu)-AhX-OH Pl en présence de BOP sans purification supplémentaire pour conduire au ligand trimérique entièrement protégé. Les groupements protecteurs Boc et tBu ainsi que l'Acm sont éliminés dans une même étape
IV.10 L38
(a) Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(Ofl3u)-Tyr(0?Bu)-Ahx-OH Pl (3.3 eq.), BOP (3.3 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (b) CF3COOAg (100 eq/Acm), TFA/Anisole puis DTT, AcOH
En principe, le groupement acétamide peut être éliminé dans différentes conditions qui pour certaines sont orthogonales aux conditions d'élimination des groupements protecteurs Boc/ffiu. On citera notamment le traitement du peptide par des sels de mercure dans un milieu acide (Hg[OAc]2 dans une solution tampon à pH 4) (Veber, D.; Milkowski, J.D.; Varga, Varga, S.L.; Denkewalter, R.G.; Hirschmann, R. J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 5456-5461), l'utilisation de sels d'argent (ex : CF3SO3Ag en présence d'anisole dans l'acide trifluoroacétique)(Fujii, N.; Otaka, A.; Watanabe, T.; Okamachi, A.; Tamamura, H.; Yajima, H.; Inagaki, Y.; Nomizu, M.; Asano, K. J. Chem. Soc, Chem. Comm. 1989, 283-284), le traitement par des sels de thalium (Tl(CF3CO2)2)(Fujii, N. et al. Chem. Pharm. Bull. 1987, 36, 2339) ou par de l'iode (Kamber, B. et al. HeIv. Chim. Acta 1980, 63, 899) (dans ces deux derniers cas un pont disulfure est formé). II a été choisi d'utiliser du trifluoroacétate d'argent CF3CO2Ag dans l'acide trifluoroacétique en présence d'anisole. Ces conditions de déprotection permettent d'éliminer à la fois le groupement protecteur acétamide et les groupements tert- Butyloxycarbonyle (Boc) et éthers /ert-butyliques (YBu) présents sur le peptide ((a) Albericio, F. et al. in "Fmoc solid phase peptide synthesis : a practical approach", W. C.
Chan & P.D. White (Eds.), Oxford University Press, Oxford, 2000, pp.104 ; (b) catalogue Novabiochem 2004/5 pp 3.21). Le ligand est ensuite traité par une solution de 1,4-dithiothréitol (DTT) dans l'acide acétique afin de réduire d'éventuels ponts disulfure formés. Après purification par HPLC préparative sur colonne C18, le ligand L38 est rapidement engagé dans la réaction de dimérisation.
b. Réaction d'addition de Michael entre le ligand thiol et le bras espaceur bismaléimide La réaction d'addition de Michael s'effectue dans un mélange eau/acétonitrile. Une solution du bismaléimide IV.l (1 eq.) dans l'acétonitrile est ajoutée à une solution du ligand L38 (3 eq) dans l'eau. Bien que la réaction d'addition de Michael soit rapide, il a été préféré effectuer la réaction dans des conditions relativement diluées (2,5.10'3 M) afin de prévenir la formation éventuelle de ponts disulfure entre deux ligands L38. Réaction de dimérisation par réaction d'addition de Michael de L38 sur IV.l
(a) H2O/CH3CN La réaction a été suivie par HPLC analytique et il a été observé qu'après 15 minutes de réaction, une nette proportion de ligand monoadduit L39' est déjà formé. Il reste cependant du bismaléimide IV.l et du ligand thiol L38 qui est mis en excès. Au bout de 24 heures, on voit apparaître la formation du produit de dimérisation L39.
Cependant, ce n'est qu'après dix jours que la réaction arrive à complétion. On remarque que la totalité du composé monoadduit a réagit avec le ligand L38 mis en excès pour former le dimère attendu L39.
c. Conclusions
L'étape clé de cette stratégie de synthèse est la préparation du macrocycle fonctionnalisé. L'issu de cette réaction de macrocyclisation s'est révélée très sensible aux choix des conditions expérimentales. Leur optimisation a néanmoins permis d'obtenir le macrocycle avec une pureté satisfaisante et suffisante pour l'engager dans la suite de la synthèse sans purification préalable.
La réaction d'addition de Michael est simple à mettre en œuvre puisqu'elle ne nécessite que de mettre en solution le ligand fonctionnalisé par un groupement thiol et le bras espaceur bismaléimide dans un mélange eau/acétonitrile. Un ajustement du pH (pH~7) peut permettre d'accélérer la réaction et de diminuer le temps de formation du dimère. La purification du brut réactionnel par HPLC préparative permet d'obtenir le ligand dimérisé. Cependant, des difficultés de purification du produit de dimérisation ont été rencontrées lorsque d'autres bismaléimides ont été utilisés. En effet, cette réaction a également été effectuée à partir d'un bras espaceur bismaléimide de type polyéthylène glycol IV.ll.
IV.11
3) Dimérisation des ligands par Ia voie « click chemistry »
Parallèlement à l'approche utilisant la réaction de Michael, la dimérisation de nos ligands synthétiques par une stratégie de « click chemistry » a été envisagée. a) La réaction de « click chemistry »
La réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire entre un alcyne et un azoture a été découverte dans les années 1960 par Huisgen et al. (Huisgen, R.; Szeimies, G.; Moebius, L. Chem. Ber. 1967, 100, 2494-2507 ; Huisgen, R. Pure Appl. Chern. 1989, 61, 613-628). Cette réaction permet de former des motifs triazoles selon le schéma
1 : 1 Récemment, le groupe de Sharpïess et al. a découvert que l'utilisation de Cuivre I en quantité catalytique permet d'adoucir les conditions de la réaction (réaction à température ambiante) et d'améliorer les rendements ainsi que la sélectivité de la réaction (formation préférentielle du régioisomère 1,4) (KoIb, H.C.; Finn, M.G.; Sharpïess, K.B. Àngew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021 ; Rostovtsev, V.V.; Green, L.G.; Fokin, V.V.; Sharpïess, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599). Cette réaction catalysée au cuivre permet une grande variété de conditions, que ce soit au niveau du solvant, du pH ou bien encore de la source de cuivre. Habituellement, la réaction s'effectue à l'aide de Cu(SO4).5H2O qui est réduit in situ par un réducteur tel que l'ascorbate de sodium ou l'acide ascorbique. Cependant, dans le cas où ces conditions ne donnent pas de résultats, une source de cuivre I (CuI, CuBr, CuOTfC6H6...) peut être directement utilisée. Dans ce cas, la réaction est plus sensible à l'oxydation, et la formation de produits secondaires est parfois observée. Afin d'éviter ces réactions parasites, la réaction doit être protégée de l'air et une base tel que la 2,6-lutidine doit être ajoutée.
De manière concomitante à Sharpïess, le groupe de Meîdaï décrit l'utilisation de sels de cuivre I (CuI) pour la préparation en phase solide de peptides 1 ,4-triazole à partir d'azotures organiques et d'un alcyne accroché à l'extrémité d'un peptide-résine (Tornoe, C.W.; Christensen, C; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057-3064). Comme en solution, cette réaction tolère toutes sortes de solvants (acétonitrile, N,N- diméthylformamide, toluène, dichlorométhane) et permet d'accéder facilement et dans d'excellentes puretés au peptide triazole désiré.
Depuis cette découverte, la réaction de Huisgen 1,3-dipolaire est aujourd'hui utilisée dans de nombreux champs d'applications : que ce soit en chimie combinatoire (Lober, S.; Rodriguez-Loaiza, P.; Gmeiner, P. Org. Lett. 2003, 5, 1753-1755 ; KoIb, H.C. et al. Préparation of 1,2,3 -triazole carboxylic acids from azides and β-ketoesters in the présence of base. US2003135050), en chimie organique ((a) Fazio, F.; Bryan, M.C.;
Blixt, O.; Paulson, J.C.; Wong, C-H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14397-14402; (b) Bodine, K.D.; Gin, D. Y.; Gin, M.S. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1638-1639; (c) Seo, T.S.; Li, Z.; Ruparel, H.; Ju, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 609-612; (d) Zhou, Z.; Fahrni, CJ. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 8862-8863; (e) Jin, T.; Kamijo, S.; Yamamoto, Y. Ew. J. Org. Chem. 2004, 3789-3791) ou encore dans la synthèse de bioconjugués ((a) Wang, Q.; Chan, T.R.; Hilgraf, R.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Finn , M.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193. (b) Link, AJ.; Tirell, D. A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11164-11165. (c) Speers, A.E.; Adam, G.C.; Cravatt, B.F. J. Am. Chem. Soc. 2003, 5 125, 4686-4687. (d) Seo, T.S.; Li, Z.; Ruparel, H.; Ju, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 609-
612. (e) Speers, A.E.; Cravatt, B.F. Chem. Biol. 2004, 11, 535-546. (f) Lee, L.V.; Mitchell, MX.; Huang, S.-J.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Wong, C-H. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 9588-8589).
10 h. Préparation des deux réactifs nécessaires à la réaction de « click chemistry » : le diazoture et le macrocycle fonctionnalisé par un alcyne yrai
Les bras espaceurs diazotures sont préparés en deux étapes à partir des chaînes polyéthylène glycol correspondantes comme suit :
IV.13 : n = 2 IV.16 : n = 2
IV.14 : n = 6 IV.17 : n = 6
] 5 (a) MsCl (2.5 eq.), NEt3 (3 eq.) ou DEEA (2.5 eq.), CH2Cl2, 74-96%; (b) NaN3 (2.5 eq.), DMF, 70-96%.
Le diol est tout d'abord transformé en dimésylate et celui-ci est ensuite substitué par addition d'azoture de sodium. Afin de pouvoir évaluer l'importance de la longueur du bras espaceur, trois diazotures de taille différente (IV.15-IV.17) ont ainsi été 0 préparés (n = 1, 2, 6).
La préparation du macrocycle D,L-α-peptide débute par la synthèse du dérivé D- Ly sine IV.21 incorporant la fonction alcyne vrai et convenablement protégé en vue de son utilisation en synthèse peptidique sur support solide.
Le dérivé alcyne vrai (IV.18) servant à construire IV.21 et donnant lieu à la 5 fonctionnalité du macrocycle, provient de la réaction entre l'anhydride succinique et la mono-propargylamine comme suit :
IV.18
(a) DIEA, ACN, 71% 0 L'acide JV-Prop-2-ynyl-succmamique (IV.18) ainsi obtenu est alors couplé à l'acide aminé D-Lysine ÏV-Fmoc protégé afin de former le dérivé IV.19. Une série de déprotection et de protection permet d'obtenir le précurseur IV.21 en 5 étapes avec un rendement global de 23% :
Synthèse de l'intermédiaire couplé à un alcyne vrai.
IV.19 IV.20 IV.21
(a) BnBr (3 eq.), KHCO3 (1.6 eq.), Bu4NI (0.1 eq.)5 DMSO, 100% ; (b) TFA, 100% ; (c) IV.17, BOP3 DIEA, ACN, 64% ; (d) LiOH IN (1 eq.), DMF, 54% ; (e) FmocOSu (1 eq.), K2CO3 (2 eq.), Acetone/H2O, 66%.
Ce précurseur fonctionnalisé ainsi préparé est alors incorporé lors de la synthèse de
Phexapeptide linéaire IV.22 en phase solide. Le peptide est ensuite cyclisé afin de former
I — IV.23 : R = Boc
• IV.24 : R = NH3 +, TFA'
(a) Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 eq.), DIEA (6 eq.), CH2Cl2; (b) 25% pipéridine/DMF; (c) SPPS : Fmoc-Xaa-OH (5 eq.), BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (d) HFIP/CH2C12 (60/40 v/v) ; (e) BOP (1.2 eq.), DIEA (1.5 eq.) DMF, 83% ; (f) TFA, 87%. A nouveau, la réaction de macrocyclisation a dû être optimisée. En effet, le profil HPLC de la réaction de cyclisation effectuée à l'aide du réactif de couplage EDCHCl montre un pic fin correspondant au macrocycle déprotégé IV.24, mais celui-ci est accompagné d'un massif important correspondant à des produits de polymérisation. Même si la dilution du milieu réactionnel a permis d'augmenter la pureté du macrocycle, le rendement de la réaction avec ce réactif de couplage reste très faible.
Il a alors été envisagé d'utiliser le réactif BOP. Celui-ci a permis d'augmenter largement le rendement (83%) et la pureté du macrocycle après déprotection (67%) des groupements Boc.
L'optimisation des conditions de cyclisation a permis d'envisager la réaction de couplage peptidique afin de former le ligand L40 correspondant, sans purification préalable du macrocycle IV.24 par HPLC préparative.
(a) Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(O/Bu)-Tyr(Offlu)-Ahx-OH Pl (3.3 eq.), BOP (3.3 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (b) TFA ; (c) RP-HPLC C18.
c. Réaction de « click chemistry » i.Mise au point de la réaction de « click chemistry »
La réaction de « click chemistry » a tout d'abord été envisagée à partir du ligand déprotégé (L40) ou non (L40') de ces groupements protecteurs. Les essais de réactivité ont été réalisés avec le diazoture IV.15.
Le tableau 2 résume les conditions expérimentales utilisées. L'avancement de la réaction est suivie par HPLC analytique soit par injection directe du brut réactionnel dans le cas des expériences effectués sur le ligand déprotégé (L40), soit après traitement au préalable à l'acide trifluoroacétique dans le cas des réactions effectuées à partir du ligand protégé (L40'). En effet, la faible solubilité du ligand L40' rend son analyse en HPLC en phase inverse et le suivi direct de la réaction de dimérisation par « click chemistry » difficile.
On a tout d'abord utilisé les conditions standards décrites par Sharpless à savoir une source de cuivre II, Cu(SO4).5H2O, introduite en quantité catalytique et réduite in situ par un réducteur, l'ascorbate de sodium. Le ligand L40, qui est très hydrophile, a été solubilisé dans le mélange tBuOH/H2O (1:1, v/v), utilisé classiquement par Sharpless. Les réactions effectuées avec le ligand protégé L40' ont été réalisées dans le N3N'- diméthylformamide, seul solvant qui permet sa solubilisation.
Après quatre jours de réaction aucune évolution n'a été observée en HPLC, quelque soit le ligand de départ (L40 ou L40') et malgré l'ajout de quantités supplémentaires de Cuivre II et de réducteur. La réaction a également été effectuée à 80°C ainsi que sous micro-ondes. Cependant aucun résultat n'a été obtenu : au contraire, on observe une dégradation du produit de départ.
Tableau 2 : Conditions expérimentales utilisées pour la réaction 1,3-dipolaire à partir des ligands L40 ou L40'
On a donc envisagé l'utilisation directe d'une source de cuivre I, en s'appuyant sur les travaux réalisés par les groupes de Kirschenbaum (Jang, H.; Fafarman, A.; Holub, J.M.; Kirschenbaum, K. Or g Lett. 2005, 7, 1951-1954) et Ghadiri (Van Maarseveen, J.H.; Home, W.S., Ghadiri M.R. Org. Lett. 2005, 1, 4503-4506), qui effectuent des réactions 1,3-dipolaires à partir de peptides soit en solution soit en phase solide, à l'aide d'iodure de cuivre (CuI). L'utilisation d'une source de cviivre I nécessite de travailler sous atmosphère inerte et de dégazer le solvant à l'argon après solubilisation du produit. Malgré ces précautions, aucune évolution n'a été observée lorsque la réaction est effectuée à partir des ligands L40 et L40'.
Une explication possible de ce manque de réactivité est la forte proportion d'aminés libres présentes sur le ligand L40. Il est en effet, possible que le cuivre se chélate autour de ces fonctionnalités, l'empêchant de chélater la fonction alcyne présente sur le macrocycle. Cette explication a déjà été évoquée par Nolte et al. dans le cas de réactions réalisées sur des peptides contenant des résidus arginines (Dirks, A.J.; Van Berkel, S. S.; Hatzakis, N.S.; Opsteen, J.A.; Van Delft, F.L.; Cornelissen, J.J.L.M.; Rowan, A.E.; Van Hest, J.C.M.; Rutjes, F.P.J.T. ; Nolte, RJ.M. Chem. Commun. 2005, 4172-4174). Alternativement, le fort encombrement lié à la présence du pentapeptide sur les bras du macrocycle peut empêcher ou du moins gêner la chélation du cuivre.
Suite à ces difficultés, il a été décidé de réaliser la réaction de « click chemistry » à partir du macrocycle protégé (IV.23) ou non protégé (IV.24). Le tableau 3 indique les conditions expérimentales utilisées lors de la réaction des macrocycles et du diazoture IV.15. Comme précédemment, l'avancement de la réaction est suivi par HPLC analytique soit par injection directe du mélange réactionnel dans le cas des expériences effectuées sur le macrocycle déprotégé (IV.24), soit après traitement au préalable à l'acide trifluroroacétique dans le cas des réactions effectuées à partir du macrocycle protégé (IV.23). Dans les conditions de Kirschenbaum, aucune évolution n'a été observée par
HPLC analytique (entrée 1). Par contre, dans les conditions de Ghadiri (entrées 2, 3 et 4), on a pu observer une diminution significative du produit de départ accompagnée de l'apparition d'un nouveau produit. Ce produit n'a cependant pas pu être caractérisé à ce stade. Ces réactions ont été réalisées dans l'acétonitrile (entrées 2 et 4) ou dans un mélange eau/acétonitrile (entrée 3). Ce solvant a été choisi car il est préconisé par
Sharpless lors de l'utilisation d'une source de Cuivre I (Rostovtsev, V.V.; Green, L. G.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599). Tableau 3 : Conditions expérimentales utilisés pour la réaction 1,3-dipolaire à partir du macrocycle protégé ou non.
A partir de ces résultats, il a été décidé d'effectuer la réaction à partir du macrocycle protégé IV.24 dans le ΛζiV'-diméthylformamide pour une meilleure solubilisation. En synthèse pseudopeptidique, Meldal utilise 2 équivalents de CuI et 50 équivalents de DDEA (Tomoe, C.W.; Christensen, C; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057-3064). Dans notre cas, la proportion de base a été augmentée à 25 équivalents de DIEA et 25 équivalents de 2,6-lutidine (entrée 6). Après trois jours d'agitation et traitement au TFA, l'analyse HPLC révèle la disparition quasi complète du cycle de départ (transformé en IV.24 après TFA, environ 2% restant) et l'apparition d'un produit majoritaire. La purification du brut réactionnel par HPLC préparative a permis d'identifier le produit majoritaire comme étant la molécule dimérique attendue IV.25 issue de la réaction par « click chemistry ». D'après l'analyse HPLC, le rapport IV.24:IV.25 est de 3:97 (Figure 2).
L'utilisation de CuBr (entrée 5) a également été explorée. La réaction a été arrêtée après trois jours d'agitation à 8O0C. Comme précédemment, l'analyse HPLC montre une conversion quasi complète du produit de départ (12% de IV.24 restant) mais cette fois ci deux produits sont formés majoritairement dans un rapport 41:59 (IV.25:IV45'). Il s'agit du composé dimérisé attendu IV.25 et du dérivé IV.25' résultant de la formation d'un seul motif triazole (Figure 3).
Même si ces conditions permettent d'accéder au produit de dimérisation, elles sont cependant moins efficaces que celles mettant enjeu l'iodure de cuivre car elles conduisent après 3 jours à un mélange de trois produits. Par conséquent, les conditions décrites dans l'entrée 6 du tableau 2 ont été conservées afin de généraliser la réaction de dimérisation 1,3-dipolaire aux autres bras espaceurs TV.16 et IV.17. Réaction de dimérisation du macrocycle fonctionnalisé à partir de différents bras espaceurs.
1V.26 : n = 2 IV.27 : n = 6
(a) CuI (2 eq.), DIEA (25 eq.), 2,6-lutidine (25 eq.), DMF ; (b) TFA ; (c) Ci8RP-HPLC.
Les composés IV.25 à IV.27 ont été isolés dans des rendements allant de 12 à 20% après purification par HPLC préparative.
Les ligands correspondants L41 à L43 ont alors été préparés par couplage des macrocycles dimérisés et du pentapeptide protégé Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)- Tyr(OtBu)-Ahx-OH (Pl), déprotection des groupements protecteurs et purification par HPLC préparative.
Habituellement, la réaction de couplage est effectuée en deux jours. Ici, la réaction nécessite une semaine d'agitation à température ambiante pour arriver à complétion. L'arrêt de la réaction après seulement trois jours montre la présence de plusieurs produits intermédiaires résultant d'un couplage partiel du pentapeptide sur les aminés εNH disponibles.
TFA-
IV.26 : n = 2 IV.27 : n = 6
L41 : n = 1 L42 : n = 2 L43 : n = 6
(a) Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(Offiu)-Tyr(Offiu)-Ahx-OH Pl (6.6 eq.)5 BOP (6.6 eq.), DIEA (20 eq.), DMF, 1 semaine ; (b) TFA5 5% H2O ; (c) C18 RP-HPLC.
Chacun de ces ligands ont été caractérisés par HPLC, masse (MALDI-TOF) (Figures 4A, 4B et 4C). Tableau 4 : Analyse par RMN du ligand L41. Expérience RMN réalisée dans H2O/tert-Butanol-d9 à 300K sur un spectromètre 500MHz.
ii. Remarques sur la réaction de « click chemistry »
L'ordre d'addition des réactifs semble être important dans la réaction mise au point précédemment. En effet, les deux bases doivent être ajoutées avant l'addition de l'iodure de cuivre. Si le métal est ajouté en premier, on observe une diminution de la pureté du macrocyle dimérisé en fin de réaction.
De plus, il est intéressant de noter que l'utilisation de deux équivalents de cycle fonctionnalisé par rapport au diazoture n'est pas nécessaire à la formation du dimère. En effet en réalisant un mélange équimoléculaire, la réaction de dimérisation arrive également à complétion. Il semble donc, comme l'a déjà mentionné Sharless, que l'utilisation d'un diazoture facilite la formation du ditriazole, et que la formation du premier triazole favorise la formation du deuxième (Rodionov, V.O.; Fokin, V. V.; Finn, M.G. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2210-2215).
Enfin, l'utilisation d'un additif comme le tris~(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) pourrait être la solution pour réaliser la réaction de « click chemistry » directement à partir du ligand L40 ou L40' ((a) Wang, Q.; Chan, T.R.; Hilgraf, R.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Finn , M.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193. (b) Chan, T.R.; Hilgraf R.; Sharpless K.B.; Fokin, V.V. Org. Lett. 2004, 6, 2853-2855). Identifié par Sharpless, le TBTA enveloppe le cuivre I et évite les interactions déstabilisantes provenant des sites de liaison libres comme les aminés. De plus, il permet d'accélérer la réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire. B) BIOLOGIE
1) Purification et culture des cellules B spléniques.
Les rates ont été prélevées sur des souris BALB/c âgées de 5-12 semaines. Les cellules B spléniques ont été préparées par sélection positive en utilisant des billes magnétiques recouvertes avec un anticorps monoclonal anti-CD19 (MACS, Milteny biotech, Allemagne). Cette fraction contient plus de 95% de cellules B220+. Les cellules B (3 x 106/mL) ont été ensuite cultivées sur un milieu RPMI 1640 enrichi avec 10% de FBS décomplémenté, de la gentamicine (10 μg/mL), 25 mM d'Hepes et 10 μM de β- mercaptoéthanol en présence d'analogues de CD40L. Les cellules ont été puisées avec 1 μCi/puit de thymidine tritiée (ICN, Irvine, CA) durant les dernières 20 h de culture et la capture de [ H] -thymidine exprimée en cpm a été mesurée après 72 h en utilisant un compteur direct beta Matrix 9600 (Packard, Meriden, CT). Les résultats (Fig 5B) sont exprimés en index de stimulation correspondant aux cpm obtenus dans les cultures avec des analogues de CD40L/cpm obtenus dans les cultures sans analogues de CD40L. Les souris utilisées dans cette étude ont été élevées dans nos animaleries qui sont approuvées par les services vétérinaires français sous le numéro D-67-482-2.
2) Culture de cellules et induction de l'apoptose.
Le lymphome de Burkitt (RAJI) a été cultivé sur un milieu RPMI 1640 (Cambrex Bioscience, Verviers, Belgique) enrichi avec 10% de sérum bovin foetal décomplémenté (FBS) et de la gentamicine (10 μg/mL). Pour les dosages d'apoptose, les cellules (1 xlO /mL) ont été incubées à 37°C dans des plaques 96-puits, aux concentrations indiquées d'analogues de CD40L, dans un volume final de 200μL. Après 16h d'incubation, l'apoptose des cellules a été mesurée comme décrit ci-dessous.
3) Mesure de l'apoptose des cellules.
L'apoptose a été évaluée par mesure de la décroissance du potentiel transmembranaire mitocliondrial (Δψm) associé à la réduction de la capture du colorant cationique, l'iodure de 3,3'-dihéxyloxacarbocyanine (DiOC6(3)), tel que démontré par cytométrie de flux (Zamzami et al., J. Exp. Med. 1995, 191 : 1661).
Pour cela, les cellules ont été puisées with DiOC6(3) (Interchim, Montluçon, France)) à une concentration finale de 4OnM pendant les dernières 45 minutes de culture. Les cellules ont été ensuite lavées, resuspendues dans 300 μL de PBS et analysées par cytométrie de flux. Les résultats (Fig 5A) sont exprimés en pourcentage d'apoptose spécifique selon la formule suivante: % d'apoptose spécifique = [(% de cellules traitées mortes - % de cellules contrôle mortes) x 100]/(100 - % de cellules contrôle mortes).
Les cellules ont été analysées avec un FACSCalibur®. Au moins 25,000 événements ont été acquis pour chaque expérience en utilisant le logiciel CellQuest 3.3
(Becton Dickinson, Pont de Claix, France) et les données ont été analysées par le logiciel WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, http ://facs. scripps . edu/software .html) .
4) Résultats
II a été observé que le ligand L41, ligand dimérique issu de la synthèse par « click chemistry », induit un pourcentage d'apoptose spécifique des lymphomes de Burkitt
(RAJI) à des doses où Ll n'est pas actif (Figure 5A).
De plus ce ligand induit seul la prolifération des cellules B spléniques murines alors que le ligand monomérique Ll ne le faisait pas sans potentialisation avec l'anticorps anti-CD40 3/23 (Figure 5B).
PARTIE EXPÉRIMENTALE DÉTAILLÉE
Bismaléimidohexane (IV.l) On ajoute du iV-(rnéthoxy-carbonyl)maléimide (320 mg ; 2> 06 mmol) à 0°C à une solution agitée de N1N'- diaminohexane (100 mg ; 0,86 mmol) dans NaHCO3 saturé
/ THF (tétrahydrofurane) (V, = 8 ml, 1 :1 v/v). Le mélange réactionnel est agité à 0°C pendant 10 min et est ensuite agité pendant 4 h à température ambiante. Le produit a ensuite été isolé par extraction avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques combinées ont été lavées avec de l'eau et de la saumure, séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous vide pour obtenir le composé IV.l (230 mg ; rendement = 100%) : CLHP tR 15,78 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN 1H (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 6,67 (s ; CH maléimide ; 4H) ; 3,48 (t ; NCH2 ; J = 7,2 Hz ; 4H) ; 1,62-1,54 (m, NCH2CH2, 4Η) ; 1,31-1,26 (m, NCH2CH2CH2, 4Η) ; RMN 13C (300
MHz, CDCl3, 298 K) 170,84 (4 CO) ; 134,03 (4 CH) ; 37,67 (2 CH2) ; 28,32 (2 CH2) ; 26,15 (2 CH2) ; HRMS (ESI) : m/z : calculé pour C14HnN2O4 : 277,11 ; trouvé : 277,1183 ; calculé pour C14H16N2O4Na : 299,1 1 ; trouvé : 299,1002.
Acide 3-((acétamidométhyI)sulfanyl)propanoïque (Acm) (IV.2) De l'acide 3-mercaptopropanoïque (1,64 mL ; 19 mmol) est dissous dans de l'acide trifluoroacétique (30 mL). On ajoute du
N-(hydroxyméthyl)acétamide (1,6 g ; 19 mmol). Après agitation pendant 30 minutes à température ambiante, le TFA (acide trifluoroacétique) est retiré par évaporation pour obtenir IV.2 : HPLC tκ 7,1 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; RMN 1H (300
MHz, CDCl3, 298 K) δ 12,4 (s, COOH, 1Η) ; 7,74 (d, NH, J = 5,8 Hz, IH) ; 4,34 (d, SCH2NH, J= 6 Hz5 2H) ; 2,81 (t, CH2SCH2NH, J= 6,4 Hz, 2H) ; 2,67 (t, CH2COOH, J = 6,4 Hz, 2H) ; 2,1 (s, NHCOCH3, 3Η) ; RMN 13C (300 MHz, CDCl3, 298 K) 177,45 (CO) ; 174,63 (CO) ; 41,60 (CH2) ; 34,37 (CH2) ; 25,67 (CH2) ; 21,46 (CH3). Fmoc-D-Lys(Boc)-OBn (IV.3) Du Fmoc-D-Lys(Boc)-OH (5 g ; 10 mmol) est dissous dans du
DMSO (diméthylsulfoxyde) (22 mL). On ajoute séquentiellement KHCO3 (1,6 g ; 16 mmol) et Bu4NI (390 mg ; 1 mmol). Après 30 min d'agitation, on ajoute du bromure de benzyle (3,8 mL ; 30 mmol). Le mélange est ensuite agité pendant une nuit. On ajoute ensuite de l'eau à la solution et la couche aqueuse est extraite avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques combinées sont lavées avec du NaHCO3 saturé, une solution saturée de Na2S2O3 et de la saumure. L'évaporation du solvant et la précipitation dans du cyclohexane à -780C donne le composé IV.3 (5,80 g ; rendement = 98%) : HPLC /R
16,94 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN 1H (300 MHz, CDCl3, 298 K) £7,76 (d, CHAiom Fmoc, J= 7,4 Hz, 2H) ; 7,60 (d, CHAiom Fmoc, J= 7,4 Hz, 2H) ; 7,42-7,25 (m, CHArom Fmoc et Ph, 9H) ; 5,18 (s, CJf2Ph, 2H) ; 4,47-4,23 (m, CH2 Fmoc et CH Fmoc, 3H) ; 4,21 (t, FmocNHCH, J = 6,9 Hz, IH) ; 3,09-3,01 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 1,95-1,64 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 1,51-1,22 (m, CH2 Lysine et C(CH^)3, 13H) ;
RMN 13C (300 MHz, CDCl3, 298 K) 172,33 (CO) ; 156,08 (CO) ; 156,00 (CO) ; 143,93 (2 C) ; 141,3 (C) ; 135,27 (2 C) ; 128,65 (2 CH) ; 128,54 (2 CH) ; 128,37 (CH) ; 127,71 (2 CH) ; 127,08 (2 CH) ; 125,12 (2 CH) ; 1 19,98 (2 CH) ; 79,20 (C) ; 67,19 (CH2) ; 67,03 (CH2) ; 53,80 (CH) ; 47,16 (CH) ; 40,04 (CH2) ; 32,11 (CH2) ; 29,58 (CH2) ; 28,43 (CH3) ; 22,30 (CH2).
Sel Fmoc-D-Lys-OBn, TFA (IV.4)
NH3 + TFA" Le composés IV.3 (5,80 g ; 10,34 mmol) est dissous dans du TFA (16 mL). Après agitation pendant 30 minutes à température ? f |] ambiante, le TFA est éliminé par évaporation avec de l'éther et o du cyclohexane. Le composé IV.4 a été obtenu : HPLC /R 10,91 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN 1H (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 7,71 (d, CH Arom Fmoc, J= 7,5 Hz, 2H) ; 7,53 (d, CHAiom Fmoc, J= 7,5 Hz, 2H) ; 7,37- 7,21 (m, CH Arom Fmoc et Ph, 9H) ; 5,6 (d, Ni/, J = 8,06 Hz, IH) ; 5,12 (s, CH2Ph, 2H) ; 4,33 (m, CH Fmoc et CH2 Fmoc, 3Η) ; 4,14 (t, FmocNHCH, J = 6,94 Hz, IH) ;
2,91-2,83 (m, CH2 Lysine, 2Η) ; 1,65-1,52 (m, CH2 Lysine, 4Η) ; 1,39-1,26 (m, CH2 Lysine, 2Η) ; RMN 13C (300 MHz, CDCl3, 298 K) 172,12 (CO) ; 156,30 (CO) ; 143,66 2 (C) ; 141,26 (C) ; 135,08 (2 C) ; 128,63 (2 CH) ; 128,57 (2 CH) ; 128,33 (CH) ; 127,77 (CH) ; 127,10 (CH) ; 125,10 (CH) ; 120,01 (CH) ; 67,38 (CH2) ; 67,21 (CH2) ; 53,61 (CH) ; 47,01 (CH) ; 39,55 (CH2) ; 31,76 (CH2) ; 26,69 (CH2) ; 21,98 (CH2).
(9H-fluorén-9-yl)raéthyll-((benzyloxy)carbonyl)-5-(3-((acétamidométhyl)sulfanyl) propanamido)pentylcarbamate (IV.5) Le composé IV.2 (2,2 g ; 12,41 mnαol) est dissous dans du DMF (diméthylformamide) (40 mL). On ajoute du DIEA (N,N- diisopropyléthylèneamine) (2 mL ; 12,41 mmol) au TFA neutralisé. Ensuite on ajoute séquentiellement le composé IV.4 (10,34 mmol) dans du DMF (2O mL) avec de la DIEA (2 mL ; 12,41 mmol), du BOP (benzotriazol-1-yloxy- tris(diméthylamino)phosphonium hexafluorophosphate) (2,2 g ; 12,41 mmol). Le mélange réactionnel est ajusté à pH = 8/9 avec de la DIEA. Après
6h d'agitation, le DMF est évaporé sous pression réduite et replacé dans du CH2Cl2 qui a été lavée avec du NaHCO3 saturé, de l'eau et du KHSO4 IN plusieurs fois. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du filtrat a permis d'obtenir une huile qui a été précipatée dans CH2Cl2 / IPE (diisopropyléther) pour obtenir le composé IV.5 pur (5,74 g ; rendement = 90 %) : HPLC tR 13,29 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN 1H (300 MHz, OMSO-d6, 298 K) £ 8,46 (t, Ni/, J = 6,11 Hz, IH) ; 7,9 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,4 Hz, 2H) ; 7,87-7,81 (m, NH, 2H) ; 7,71 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,2 Hz,
2H) ; 7,45-7,26 (m, CH Arom Fmoc et Ph, 9Η) ; 5,12 (s, CH2Ph, 2Η) ; 4,31 (d, CHFmoc, J= 6,3 Hz, IH) ; 4,20 (d, CH2 Fmoc, J= 6,3 Hz, 2H) ; 4,06-4,01 (m, FmocNHCH, 1Η) ; 3,0 (m, CH2 Lysine, 2Η) ; 2,72 (t, CH2CONH, J = 7,2 Hz, 2H) ; 2,53 (s, NHCOCH5, 3Η) ; 2,35 (t, CH2SCH2NHCOCH3, J = 7,2 Hz, 2H) ; 1,83 (s, SCH2NH, 2H) ; 1,71-1,60 (m, CH2 Lysine, 2Η) ; 1,30-1,39 (m, CH2 Lysine, 4Η) ; 13C RMN (300 MHz, OMSO-d6,
298 K) 172,78 (CO) ; 170,70 (CO) ; 169,68 (CO) ; 156,63 (CO) ; 144,25 (2 C) ; 141,17 (C) ; 136,40 (2 C) ; 128,66 (2 CH) ; 128,54 (2 CH) ; 128,33 (CH) ; 127,76 (2 CH) ; 127,11 (2 CH) ; 125,12 (2 CH) ; 120,11 (2 CH) ; 66,31 (CH2) ; 66,12 (CH2) ; 54,41 (CH) ; 47,07 (CH) ; 40,18 (CH2) ; 38,66 (CH2) ; 36,07 (CH2) ; 30,72 (CH2) ; 29,06 (CH2) ; 26,62 (CH2) ; 23,35 (CH2) ; 23,01 (CH3).
Fmoc-D-Lys(Acm)-OH (IV.7) Le composé IV.6 (2,21 g ; 7,2 mmol) est dissous dans une solution de H2O (50 mL) avec K2CO3 (2 g ; 14,4 mmol). Ensuite on ajoute doucement du Fmoc-OSu (9- fluorénylméthyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimide) (2,4 g ; 7,2 mmol) dans de l'acétone (50 mL). Après 7 heures d'agitation, on ajoute de l'eau. La phase aqueuse est lavée rapidement avec de l'éther et est ajustée à pH = 3 avec du HCl IN et est ensuite extraite avec CH2Cl2. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du filtrat permet d'obtenir une huile qui est précipitée dans CH2CVlPE (diisopropyiéther) pour donner le composé pur IV.7 (2,24 g ; rendement == 60%) : HPLC /R 8,9 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; 1H RMN (300 MHz, DMSO-4, 298 K) £ 8,47 (t, NH, J= 6,07 Hz, IH) ; 7,9 (d, CH Arom Fmoc, J= 7,46 Hz, 2H) ; 7,85 (t, NH, J= 5,92 Hz, IH) ; 7,73 (d, CHArom Fmoc, J= 7,4 Hz, 2H) ; 7,58 (d, NH, J= 8 Hz, IH) ; 7,44-7,30 (m, CH Arom Fmoc, 4Η) ; 4,26 (t, CH Fmoc, J= 7,5 Hz, IH) ; 4,20 (d, CH2 Fmoc, J= 6,3 Hz, 2H) ; 3,90 (m, FmocNHCH, 1Η) ; 3,05-2,99 (m, CH2 Lysine, 2Η) ; 2,72 (t, CH2CONH, J
= 7,3 Hz, 2H) ; 2,5 (s, NHCOCH5, 3Η) ; 2,36 (t, CH2SCH2NHCOCH3, J= 7,23 Hz, 2H) ; 1,67- 1,57 (m, CH2 Lysine, 2Η) ; 1,42-1,33 (m, CH2 Lysine, 4Η) ; 13C RMN (300 MHz, DMSO-ύfe, 298 K) 174,48 (CO) ; 170,70 (CO) ; 169,68 (CO) ; 156,58 (CO) ; 144,25 (2 C) ; 141,15 (2 C) ; 128,85 (CH) ; 128,08 (2 CH) ; 127,51 (2 CH) ; 125,73 (2 CH) ; 66,03 (CH2) ; 54,26 (CH) ; 47,10 (CH) ; 40,21 (CH2) ; 38,73 (CH2) ; 36,09(CH2) ; 30,91 (CH2) ;
29,12 (CH2) ; 26,64 (CH2) ; 23,50 (CH2) ; 23,24 (CH3) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C27H33N3O6S : 527,21. Trouvé [M+Na4] ≈ 550,11; [M+K+] = 566,20. H-(D)AIa-LyS(BOC)-(D)LyS(ACm)-LyS(BoC)-(D)AIa-LyS(BoC)-OH (IV-S)
lavée avec du DMF, de Pisopropanol, du CH2Cl2, de Péther diéthylique, et séchée sous vide. La charge de la résine est déterminée par UV du dérivé fmoc après traitement avec 20% de pipéridine dans du DMF (charge = 0,3 mmol/g).
FmocXaaOH (5 eq.) est couplé deux fois à température ambiante pendant 30 min à la résine Fmoc-déprotégée en présence de BOP (5 eq.), HOBt (1- hydroxybenzotriazole) (5 eq.) et DIEA (15 eq.). Le composé IV.7 (2,5 eq.) est couplé une fois à température ambiante pendant 2 h en présence de BOP (2,5 eq.), HOBt (2,5 eq.) et DIEA (10 eq.). Après répétition de ces étapes de déprotection et couplage, le peptide est clivé de la résine avec un mélange de HFIP (hexafluoroisopropanol) et CH2Cl2 (60/40). Après agitation pendant 2 h, la résine est filtrée et lavée plusieurs fois avec CH2Cl2. L'évaporation du solvant permet d'obtenir le composé IV.8 (rendement : 100%) : HPLC tR 7.62 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100 % B, 20 min) : 73% ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C5IH93NnO15S : 1131,66. Trouvé : [M+Na+] =1154,27, [M+K+] = 1170.21 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C51H94NnO15S : 1132.66, trouvé : 1132.6646 ; calculé pour C51H93NnO15SNa : 1154,66, trouvé : 1154,6466.
Cyclo [(D)AIa-LyS(BoC)-(D)LyS(ACm)-LyS(BoC)-(D)AIa-LyS(BoC)] (IV.9)
NaHCO3 saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé puis de l'eau, du KHSO4 IN, de la saumure, de l'acétate d'éthyle, de Facétonitrile et du cyclohexane. Le solide blanc IV.9 est séché sous vide (222 mg, rendement : 77%) ; HPLC tκ 10,09 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100 % B, 20 min) : 87 % ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C51H91NnO14S : 1113,65. Trouvé : [M+Na+] = 1136,44 ; [M+K+] = 1152,42.
cyclo [D)Ala-Lys-(D)Lys(Acm)-Lys-(D)AIa-Lys] (IV.10) Le composé IV.9 (100 mg ; 0,089 mmol) es* dissous dans de l'acide trifluoroacétique
(5 mL) avec 5% d'eau. Après 20 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité avec de l'éther. Le sel de TFA attendu est filtré, lavé avec de l'éther. Le solide blanc IV.10 est séché sous vide (84 mg, rendement : 85%) : HPLC tκ 6.56 min (gradient linéaire,
5-65% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 5-65 % B, 20 min) : 86% ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C36H67N11O8S : 813,05. Trouvé : [M+Na+] = 836,44 ; [M+K+] = 852,41 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C36H68N11O8S : 814,05 ; trouvé : 814,497. Bismaléimidodiéthylèneglycol (IV.ll) OOnn aajjoouute à une solution agitée de N1N'- diaminodiéthylèneglycol (100 mg ; 0,67 mmol) dans NaHCO3 saturé / THF (V, = 6mL, 1:1 v/v) à 0°C du JV- (méthoxy-carbonyl)maléimide (251 mg ; 1,62 mmol). Le mélange réactionnel est agité à
0°C pendant 10 minutes et est ensuite laissée agiter pendant 4 heures à température ambiante. Le produit est ensuite isolé par extraction avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques combinées sont lavées avec de l'eau et de la saumure, séchées sur Na2SO4, filtrées et concentréess sous vide pour obtenir le composé IV.ll (150 mg, rendement = 72%) : HPLC fe 10.40 min (gradient linéaire, 30-100% B5 20 min) ; 1H
RMN (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 6,67 (s, CH maléimide, 4H) ; 3,68-3,63 (m, NCH2CH2O, 4H) ; 3,58-3,54 (m, NCH2CH2O, 4Η) ; 3,51 (s, OCH2CH2O, 4H) ; 13C RMN (300 MHz, CDCl3, 298 K) 170,66 (4 CO) ; 134,13 (4 CH) ; 69,97 (2 CH2) ; 67,77 (2 CH2) ; 37,09 (2 CH2) ; HRMS (ESI) : m/z : calculé pour Ci4H17N2O6 : 309,10 ; trouvé : 309,1081 ; calculé pour Ci4Hi6N2O6Na : 331,10 ; trouvé : 331,0901.
Dimésylate (IV.12)
Du triéthylène glycol (2 g ; 13,31 mmol) est dissous dans du
MsO ^^ ^^ O ^^
CH2Cl2 (20 mL). On ajoute séquentiellement de la DIEA (5,6 mL ; 33,3 mmol) et du méthanesulfonylchlorure (2,6 mL ; 33,3 mmol). Le mélange est agité pendant 3 h et ensuite le CH2Cl2 est évaporé. Le résidu est replacé dans de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec du NaHCO3 saturé, de l'eau, du KHSO4 IN et de la saumure. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du solvant permet d'obtenir IV.12 (3,93 g ; rendement = 96%) : 1H RMN (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 4,25-4,22 (m, CH2OMs, 4Η) ; 3,64 (m, CH2CH2OMs, 4H) ; 3,55 (s, OCH2CH2O, 4H) ;
2,96 (s, SO2CH3, 6Η) ; 13C RMN (300 MHz5 CDCl3, 298 K) 70,33 (CH2) ; 69,43 (CH2) ; 68,82 (CH2) ; 37,42 (CH3).
Dimésylate (IV.14) De Poctaéthylène glycol (540 mg ; 1,46 mmol) est dissous dans CH2Cl2 (2 mL). A 00C, on ajoute successivement dans le mélange de la triéthylamine (606 μL ; 4,37 mmol) et du méthanesulfonylchlorure (288 μL ; 3,6 mmol). Après 4h d'agitation, le solvant est évaporé. Le résidu est replacé avec de l'acétate d'éthyle et la couche organique est lavée avec du NaHCO3 saturé et du KHSO4 IN. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du solvant permet d'obtenir IV.14 (560 mg ; rendement = 73%) : 1H RMN (300 MHz, CDCl3, 298 K) 4,26-4,22 (m, CH2OMs, 4H) ; 3,65-3,62 (m, CH2CH2OMs, 4H) ; 3,53-3,50 (m, OCH2CH2O, 24H) ; 2,96 (s, OSO2CH3, 6Η) ; 13C RMN (300 MHz, CDCl3, 298 K) 70,43 (CH2) ; 69,47 (CH2) ; 68,88 (CH2) ; 37,57 (CH).
l,2-Bis(2-azidoéthoxy)éthane (IV.15)
On ajoute de l'azoture de sodium (1,33 g ; 20,57 mmol) à une solution de IV.12 (1,05 g ; 3,4 mmol) dans du DMF (10 mL). Le mélange réactionnel est chauffé pendant une nuit à 6O0C. Après refroidissement, on ajoute de l'eau et la phase aqueuse est extraire avec de l'éther. La phase organique est ensuite lavée avec de l'eau et séchée sur Na2SO4. L'évaporation du solvant donne IV.15 (670 mg, rendement = 96%) : HPLC tR 8,29 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; 1H RMN (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 2,98-2,94 (m, CH2CH2N3, 4H) ; 2,94 (s, OCH2CH2O, 4H) ; 2,67-2,63 (m, CH2N3, 4Η) ; 13C RMN (300 MHz, CDCl3, 298 K) 70,44 (CH2) ; 69,88
(CH2) ; 50,45 (CH2).
Diazide (IV.17)
On ajoute de l'azoture de sodium (170 mg ; 2,6 mmol) à une
N3" ^~γ- "Oi 6 solution agitée de IV.14 (550 mg, 1.044 mmol) dans du DMF (8 mL). Le mélange réactionnel est chauffé pendant une nuit à 600C. Après refroidissement, on ajoute de l'eau et la phase aqueuse est extraite avec de l'éther. La phase organique est ensuite lavée avec de l'eau et séchée sur Na2SO4. L'évaporation du solvant permet d'obtenir IV.17 (300 mg, rendement = 70%) : HPLC tR 6,59 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; 1H RMN (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 3,66-
3,60 (m, OCH2CH2O and CH2CH2N3, 28H) ; 3,38-3,33 (m, CH2N3, 4Η) ; 13C RMN (300 MHz, CDCl3, 298 K) 70,68 (CH2) ; 70,66(CH2) ; 70,62 (CH2) ; 70,57 (CH2) ; 50,67 (CH2).
Acide iV-PropyI-2-ynyl-succinamique (Nps) (IV.18) On dissout de la dihydrofuran-2,5-dione (3,9 g ; 40 mmol) dans de l'acétonitrile (40 mL). On ajoute de la prop-2-yn-l -aminé (1,5 mL ; 51 mmol). Après 2 h d'agitation, la précipitation se produit. Le précipité est filtré et lavé avec de l'acétonitrile. Le composé IV.18 est obtenu (4,12 g ; rendement = 71%) : 1H RMN (300 MHz, DMSO-J5, 298 K) £3,83 (dd, WLCH2CCU, J= 5,4 and 2,5 Hz, 2H) ; 3,33 (d, CCH, J = 2,5 Hz, IH) ; 2,42-2,36 (m, CH2CO2H, 2H) ; 2,33-2,27 (m, CH2CONH, 2H) ; 13C RMN (300 MHz, OMSO-(I6, 298 K) 174,33 (CO) ; 172,29 (CO) ; 81,69 (CH) ; 73,45 (C) ; 30,35 (CH2) ; 29,66 (CH2) ; 28,24 (CH2).
(9H-Fluorén-9-yl)méthyl l-((benzyloxy)carbonyI)-5-(succinamido)pentyIcarbamate (Fmoc-Lys(Nps)-OBn) (IV.19) Le composé IV.4 (9,7 mmol) est dissous dans de Pacétonitrile (30 mL) avec de la DIEA (1,9 mL ; 11.6 mmol). On ajoute séquentiellement de l'acide 3-(prop-2- ynylcarbamoyl)propanoïque (1,8 g ; 11,6 mmol), de la BOP (5,13 g ; 11,6 mmol) et de la DIEA (1,9 mL ; 11.6 mmol). Après 3 heures d'agitation, la précipitation se produit. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé, de l'eau et du KHSO4 IN et ensuite de Pacétonitrile et du diisopropyléther. Le composé IV.19 est obtenu (3,7 g ; rendement = 64%) : 1H RMN (300 MHz, DMSO-<4, 298 K) δ 8,32 (t, NH, J= 5,27 Hz, IH) ; 7,90-7,85 (m, 2 NH et CH Arom Fmoc, 4Η) ; 7,71 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,33 Hz) ; 7,42 (t, CH Arom Fmoc, J = 7,32 Hz, 2H) ; 7,34-7,28 (m, CH Arom Fmoc et CH Arom Bn, 7Η) ; 5,13 (s, CH2Ph, 2Η) ; 4,32-4,10 (m, CH2 Fmoc et CH Fmoc, 3Η) ; 4,09-4,02 (dd, NHCHCH2,1H) ; 3,84 (dd, NHCH2CCH, J = 5,25 et
2,32 Hz, 2H) ; 3,085 (t, CCH, J = 2,35 Hz, IH) ; 2,35-2,30 (m, COCH2CH2CO, 4Η) ; 1,78-1,59 (m, CH2 Lysine, 2Η) ; 1,41-1,22 (m, CH2 Lysine, 4Η) ; 13C RMN (300 MHz, DMSO-J6, 298 K) 172,8 (CO) ; 171,62 (CO) ; 171,46 (CO) ; 155,66 (CO) ; 144,27 (2 C) ; 141,18 (C) ; 136,42 (2 C) ; 128,86 (2 CH) ; 128,47 (2 CH) ; 128,21 (2 CH) ; 128,11 (CH) ; 127,53 (2 CH) ; 125,7 (2 CH) ; 120,57 (2 CH) ; 81,73 (CH) ; 73,32 (C) ; 66,34
(CH2) ; 66,16 (CH2) ; 54,44 (CH) ; 47,10 (CH) ; 38,67 (CH2) ; 31,03 (CH2) ; 30,76 (CH2) ; 30,98 (CH2) ; 29,10 (CH2) ; 28,26 (CH2) ; 23,38 (CH2) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C35H37N3O6 : 595,27. Trouvé [M+H+] = 595,78 ; [M+Na+] = 618,26 ; [M+K+] = 634,35. mL).
Fmoc-D-Lys(Nps)-OH (IV.21) Le composé IV.20 (972 mg ; 3,43 mmol) est dissous dans un mélange d'eau et d'acétone (50 mL, v/v : 1/1). On ajoute du K2CO3 (948 mg ; 6,86 mmol) dans de l'eau (25 mL). Ensuite on ajoute doucement du Fmoc-OSu (9-fluorénylmethyloxycarbonyl- N-hydroxysuccinimide) (1,16 g ; 3,43 mmol) dans de l'acétone
(25 mL). Après une nuit d'agitation, on ajoute de l'eau. La phase aqueuse est lavée rapidement avec de l'éther et est ajustée à pH = 3 avec du HCl IN et est ensuite extraite avec CH2Cl2. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du filtrat donne une huile qui est précipitée dans CH2C12/IPE pour donner le composé pur IV.21 (1,7 g ; rendement = 62%) : HPLC tu 8.61 min (gradient linéaire,
30-100% B3 20 min) ; 1H RMN (300 MHz, DMSO-J5, 298 K) δ 8,26 (t, NH, J= 5,36 Hz, IH) ; 7,89 (d, CHArom Fmoc, J= 7,42 Hz, 2H) ; 7,81 (t, NH, J= 5,25 Hz, IH) ; 7,73 (d, CHArom Fmoc, J- 7,38 Hz, 2H) ; 7,62 (d, FmocNH, J= 7,98 Hz, IH) ; 7,42 (t, CH Arom Fmoc, J = 7,41 et 1,06 Hz, 2H) ; 7,33 (dt, CH Arom Fmoc, J = 7,47 et 0,88 Hz, 2H) ; 4,29-4,19 (m, CH2 Fmoc et CH Fmoc, 3H) ; 3,94-3,87 (m, FmocNHCH,
1Η) ; 3,83 (dd, NHCH2CCH, J= 5,45 et 2,51 Hz, 2H) ; 3,07 (t, CCH, J= 2,51 Hz, IH) ; 3,04-2,96 (m, CH2 Lysine, 2Η) ; 2,33-2,26 (m, CH2CONH et CH2CONH, 4H) ; 1,72- 1,54 (m, CH2 Lysine, 4Η) ; 1,41-1,24 (m, CH2 Lysine, 4Η) ; 13C RMN (300 MHz, DMSO-J15, 298 K) 173,89 (CO) ; 171,04 (CO) ; 170,88 (CO) ; 156,08 (CO) ; 143,72 (2 C) ; 140,62 (2 C) ; 127,56 (CH) ; 126,98 (CH) ; 125,19 (CH) ; 120,03 (CH) ; 81,54
(CH) ; 72,80 (CH) ; 65,52 (CH2) ; 53,68 (CH) ; 46,57 (CH) ; 38,73 (CH2) ; 30,46 (CH2) ; 30,41 (CH2) ; 30,34 (CH2) ; 28,60 (CH2) ; 27,71 (CH2) ; 22,99 (CH2) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C28H31N3O6 : 505,22. Trouvé [M+Na+] = 528,79 ; [M+K+] = 545,57. H-(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Nps)-Lys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)-OH (IV.22) Boc On lave 2 fois 1,3 g de résine 2- chlorotritylchloiτire (charge = 1,8 mmol/g) avec du CH2Cl2 distillé. On ajoute à la résine un mélange de Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 eq.) et de DIEA (6 eq.) dans du CH2Cl2. Après 3 h d'agitation, la résine est filtrée et lavée avec du CH2Cl2. La résine est regonflée dans du méthanol sous agitation pendant Ih et est ensuite lavée avec du DMF, de l'isopropanol, du CH2Cl2, de l'éther diéthylique et séchée sous vide. La charge de la résine est déterminée par analyse UV du dérivé fmoc après traitement avec 20% de pipéridine dans du DMF (charge = 0,5 mmol/g).
FmocXaaOH (5 eq.) est couplé deux fois à température ambiante pendant 30 min à la résinie Fmoc-déprotégée en présence de BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.) et DIEA (15 eq.). Le composé IV.21 (2.5 eq.) est couplé une fois à température ambiante pendant 2 h à la résine Fmoc-déprotégée en présence de BOP (2.5 eq.), HOBt (2.5 eq.) et DIEA (10 eq.). Après répétition de ces étapes de déprotection et de couplage, le peptide est clivé de la résine avec un mélange de HFIP et de CH2Cl2 (60/40). Après 2 h d'agitation, la résine est filtrée et lavée plusieurs fois avec CH2Cl2. L'évaporation du solvant donne le peptide IV.22 (rendement : 100 %) : HPLC tR 8.54 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100 % B, 20 min) : 60% ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C52H91N11O15 : 1109,67. Trouvé : [M+Na+] 1132,45 ; [M+K+] = 1148,43 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C52H92N11O15 : 1110,67 ; trouvé : 1110,6769 ; calculé pour C52H91N11Oi5Na : 1132,67 ; trouvé : 1132,6588. Cyclo [(D)AIa-LyS(BOC)-(D)LyS(NPS)-LyS(BoC)-(D)AIa-LyS(BoC)] (IV^S)
Le peptide IV.22 (60 mg ; 0,054 mmol) est dissous dans du DMF (12 mL) à température ambiante. On ajoute séquentiellement du BOP (28,6 mg ; 0,064 mmol) et de la DIEA (14 μL ; 0,081 mmol). Après agitation pendant 3 jours à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans une grande quantité de NaHCO3 saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé, puis par de l'eau, du KHSO4 IN, de la saumure, de l'acétate d'éthyle, de l'acétonitrile et du cyclohexane. Le solide blanc IV.23 est séché sous vide (49 mg, rendement : 83%) : HPLC fa 12.92 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) : 60 % ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C52HS9N11O14 : 1091,66. Trouvé : [M+Na+] ≈ 1114,58 ; [M+K+] = 1130,56.
cyclo [(D)AIa-Lys-(D)Lys(Nps)-Lys-(D)AIa-Lys] (IV.24) Le composé IV.23 (38 mg ; 0,035 mmol) est dissous dans de l'acide trifluoroacétique (3,5 mL) avec de l'eau à 5%. Après 15 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans de l'éther. Le sel de TFA attendu est filtré, lavé avec de l'éther. Le solide blanc IV.23 est séché sous vide (34 mg, rendement : 87%) : HPLC fa 6.28 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 5-65 % B, 20 min) : 66 % ; MS (MALDI-TOF) calculé for C37H65N11O8 : 791,5. Trouvé : [M+H+] ≈ 792,57 ; [M+Na+] = 814,54 ; [M+K+] = 830,52. Procédure générale pour Ia "click chemistry" (IV.25-IV.27)
Le composé IV.23 (1 eq) est dissous dans du DMF (c = 6.10"3 M). On ajoute une solution de diazoture IN dans du DMF (1 eq). Ce mélange est dégazé d'oxygène avec de l'argon pendant 30 min. On ajoute successivement de la DIEA (25 eq), de la 2,6-lutidine (25 eq) et du CuI (2 eq). Après agitation pendant 3 jours à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans une grande quantité de NaHCO3 saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé, puis de l'eau, du KHSO4 IN et de la saumure. Le solide blanc est séché sous vide, ce composé est dissous dans de l'acide trifluoroacétique avec 5% d'eau. Après 30 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans de l'éther. Le sel de TFA attendu est filtré et lavé avec de l'éther et sécher sous vide. La purification par C18 RP-HPLC semi-preparative (5-65% B, 20 min) suivie d'une lyophilisation permet d'obtenir le composé attendu.
IV.25 : En utilisant la procédure générale, on obtient le composé IV.25. La pureté du produit brut est de 47% (déterminée par C18 RP-HPLC). La purification par Ci8 RP-
HPLC semi-préparative domie le composé pur IV.25 (rendement 40% et pureté >99%) : HPLC tR 6,63 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C80Hi42N28O18 : 1783,11. Trouvé : [M+Na+] = 1806,48 ; [M+K+] = 1823,39 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C80Hi42N28Oi8Na : 1806,11 ; trouvé : 1806,095.
IV.26 : En utilisant la procédure générale, on obtient le composé IV.26. La pureté du produit brut est de 30% (déterminée par Ci8 RP-HPLC). La purification par Ci8 RP- HPLC semi-préparative donne le composé pur IV.26 (rendement 13% et pureté >99 %) : HPLC tκ 6,95 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C82H146N28Oi9 : 1827,13. Trouvé : [M+H+] = 1828,14 ; [M+Na+] =
1850,14 ; [M+K+] = 1866,14.
IV.27 : En utilisant la procédure générale, on obtient le composé IV.27. La pureté du produit brut est de 54% (déterminée par Ci8 RP-HPLC). La purification par C18 RP- HPLC semi-préparative donne le composé pur IV.27 (rendement 20% et pureté >99
%) : HPLC tR 7,8 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C90H162N28O23 : 2003,24. Trouvé : [MH-H+] = 2004,34 ; [M+Na+] = 2026,34 ; [M+K+] = 2042,31. Procédure générale pour le couplage
Le cœur IV.24, IV.25 ou IV.26 (1 eq.) est dissous dans du DMF. A température ambiante, on ajoute le peptide (6,6 eq.), du BOP (6,6 eq.) et de la DIEA (20 eq.). Le mélange réactionnel est agité pendant une semaine et précipité dans une grande quantité de NaHCO3 saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé, puis de l'eau, du KHSO4 IN, de la saumure et du cyclohexane. Le solide est séché sous vide.
Le produit brut est dissous dans de l'acide trifluoroacétique avec 5% d'eau. Après
30 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans de l'éther. Le sel attendu de TFA est filtré, lavé avec de l'éther et séché sous vide. La purification par Ci8 RP-HPLC semi-préparative (5-65% B, 20 min) suivie d'une lyophilisation permet d'obtenir le ligand attendu.
L41 : En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, on obtient le ligand L41.
La pureté du ligand brut est de 51% (déterminée par Ci8 RP-HPLC). La purification par C18 RP-HPLC semi-préparative permet d'obtenir le ligand L41 pur (rendement 12% et pureté >99 %) : HPLC tκ 10,65 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-
TOF) calculé pour C272H406N64O60 : 5529,07. Trouvé : [MH-H+] = 5529,78.
L42 : En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, on obtient le ligand L42. La pureté du ligand brut est de 58% (déterminée par Ci8 RP-HPLC). La purification par
C1S RP-HPLC semi-préparative permet d'obtenir le ligand L42 pur (rendement 15% et pureté >99 %) : HPLC tR 10,89 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-
TOF) calculé pour C275H411N65O61 : 5600,11. Trouvé : [MHhH+] = 5580.
L43 : En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, on obtient le ligand L43.
La pureté du ligand brut est de 54% (déterminée par Cj8 RP-HPLC). La purification par Ci8 RP-HPLC semi-préparative permet d'obtenir le ligand L43 pur (rendement 15% et pureté >99 %) : HPLC tR 11,04 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI- TOF) calculé pour C282H426N64O65 : 5749,2. Trouvé : [M+H+] = 5751.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé répondant à la formule suivante (I) :
dans laquelle :
- k et j représentent indépendamment l'un de l'autre 0 ou 1,
- Y représente un macrocycle dont le cycle comprend de 9 à 36 atomes, et est fonctionnalisé par trois fonctions aminés et par une chaîne permettant l'accrochage du bras espaceur Z via une liaison X,
- R0 représente un motif de liaison à un récepteur de la superfamille du TNF, et de préférence correspond à une séquence dérivée d'un ligand, choisie parmi les résidus formant l'interface avec le récepteur du ligand, laquelle séquence est susceptible d' interagir avec le récepteur, ledit ligand étant choisi parmi les ligands de récepteurs de la superfamille du TNF, et notamment parmi les ligands suivants : EDA, CD40L, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4- IBBL, CD27L, LTa, TNF, LTβ, TWEAK5 APRIL, BLYS, RANKL et TRAIL,
- X représente une fonction chimique permettant de relier le groupe Y au bras espaceur et est choisi parmi les fonctions suivantes :
N-acyl-glycyl (4')
th thioether-2 thioether-3
(5: ') (6') (7') (8') a"N'b disulfure oxime-1 oxime-2 (9') (10') (H')
1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole
1,4-disubstitué-l l,4-disubstitué-2 1,5-disubstitué-l l,5-disubstitué-2
(12') (13') (14') (15')
a représentant la liaison avec le groupe Y et b représentant la liaison avec le groupe Z,
- Z représente un bras espaceur bi-, tri- ou tétrafonctionnel répondant à l'une des formules suivantes : • lorsque j = k = 0
* lorsque X représente un groupe de formule (1'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes :
"O-] ^-'' — (CH2)n— - m étant un nombre entier variant de 1 à 40 n étant un nombre entier variant de 1 à 10
* lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') , Z répond à l'une des formules suivantes :
* lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') , Z répond à l'une des
m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6 u étant un nombre entier variant de 1 à 4
W représentant un groupe de formule ou un groupe de formule le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a'
* lorsque X représente un groupe de formule (1'), (T), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (H'), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes :
m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6 u étant un nombre entier variant de 1 à 4
W représentant un groupe de formule r étant un nombre entier variant de 1 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a'
• lorsque j = 1 ou k = 1
* lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14'), Z répond à l'une des formules suivantes :
u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10
W représentant un groupe de formule ou un groupe de formule " Tf''
O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
* lorsque X représente un groupe de formule (1 '), (T), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11 '), (13') et (15')» z répond à l'une des formules suivantes :
u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10
W représentant un groupe de formule r étant un nombre entier variant de 1 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
* Z pouvant également représenter l'une des formules suivantes :
dans laquelle :
- lorsque X représente un groupe de formule (1'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (13') et (15') : R représente l'un des groupes suivants :
^-(CH2-CH?-O)m-CH2-CH2-CO-J *— J— (CH2)n ^1 m variant de 3 à 6 n variant de 1 à 10
m variant de 1 à 40 ° le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', - lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') : R représente l'un des groupes suivants : f-NH-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-CO-a'- m variant de 3 à 6
HProKr
n représentant un nombre entier variant de 1 à 10 u représentant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
- lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') : R représente l'un des groupes suivants :
W-NH-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-CO- m variant de 3 à 6 le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
W" W-(Pro)n-- W- n représentant un nombre entier variant de 1 à 10
W représentant un groupe de formule ou un groupe de formule '' j-T'a'
O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',
- lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (H '), (13') et (15') : R représente l'un des groupes suivants :
W-NH-(CH2-CH2-O)HI-CH2-CH2-CO- m variant de 3 à 6 W-- W-(Pro)n— W-N-(CH2)n u et n étant tels que définis ci-dessus, W représentant un groupe de formule X> '7]]' r étant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a'.
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R0 représente un peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand CD40L de CD40 et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10.
3. Composé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que R0 représente un peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand CD40L et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10 choisi parmi les séquences suivantes : LQWAEKGYYTMSNN (SEQ ID NO : 1) ; LQWAKKGYYTMKSN (SEQ ID NO : 2) ; PGRFERILLRAANTH (SEQ ID NO : 3) ; SIGSERILLKAANTH (SEQ ID NO : 4).
4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R0 représente un groupe de formule H-Xa-(Xb)i-Xc-Xd-Xe-(Xf)i- ou H-XVL-XVXc-Xd-Xe-(Xf)i-, dans laquelle :
• I représente 0 ou 1 , • i représente 0 ou 1 ,
• Xa est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :
- lysine ;
- arginine ;
- ornithine ; - les β-acides aminés correspondant à la lysine, l'arginine ou Pornithine, portant la substitution en position α ou β ;
- acide tranéxamique ;
- acide N-méthyl-tranéxamique ; - acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ;
- acide 4(pipéridin-4-yI)butanoïque ;
- acide 3(pipéridin-4-yl)proρionique ;
- N-(4-aminobutyl)-glycine ; - NH2-(CH2)n-COOH, n variant de 1 à 10 ;
- NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH, m variant de 3 à 6 ;
- 4-carboxyméthyl-pipérazine ;
- acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ;
- acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ; - acide 4-aminophénylacétique ;
- 4-(2aminoéthyl)-l~carboxyméthyl-pipérazine ;
- acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; - acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;
- 4-amino-ï-carboxyméthyl pipéridine ;
- acide 4-aminobenzoïque ;
- acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ; Xb est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants : - glycine ;
- isoleucine ;
- leucine ;
- valine ;
- asparagine ; - D-alanine ;
- D-valine ;
- L-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;
- D-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;
- acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ; - acides aminés dialkylés acycliques de formule suivante :
R représentant H, Me, Et, Pr ou Bu ;
- acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante :
k représentant 1, 2, 3 ou 4 ;
• Xc est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants
- tyrosine ;
- isoleucine ;
- leucine ; - valine ;
- phénylalanine ;
- 3-nitro-tyrosine ;
- 4-hydroxyméthyl-phénylalanine ;
- 3,5-dihydroxy-phénylalanine ; - 2,6-diméthyl-tyrosine ;
- 3,4-dihydroxy-phénylalanine (DOPA) ;
• Xd est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants
- tyrosine ;
- isoleucine ; - leucine ;
- valine ;
- phénylalanine ;
- 3-nitro-tyrosine ;
- 4-hydroxyméthyl-phénylalanine ; - 3,5-dihydroxy-phénylalanine ;
- 2,6-diméthyl-tyrosine ;
- 3,4-dihydroxy-phénylalanine ;
• Xe est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants : - arginine ;
- -(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ;
- -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ;
- NH2-(CH2VCOOH, n variant de 1 à 10 ; - NH2-(CH2-CH2-O)1n-CH2CH2COOH, m variant de 3 à 6 ;
- acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ;
- acide tranéxamique ;
- acide N-méthyl-tranéxamique ;
- acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; - acide 3(pipéridin-4~yl)propionique ;
- N-(4-aminobutyl)-glycine ;
- 4-carboxyméthyl-pipérazine ;
- acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ;
- acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ; - acide 4-aminophénylacétique ;
- 4-(2aminoéthyl)-l-carboxyméthyl-pipérazine ;
- acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; - acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;
- 4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine ;
- acide 4-aminobenzoïque ;
- acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ;
» Xf est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants : - -(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ;
- -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ;
- NH2-(CH2VCOOH, n variant de 1 à 10 ;
- NH2-(CH2-CH2-OV-CH2CH2COOH, m variant de 3 à 6 ;
- acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; - acide tranéxamique ;
- acide N-méthyl-tranéxamique ;
- acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ;
- acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ;
- N-(4-aminobutyl)-glycme ; - 4-carboxyméthyl-pipérazine ;
- acide 4~(4~aminophényl)butanoïque ;
- acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ;
- acide 4-aminophénylacétique ; - 4-(2aminoéthyl)-l-carboxyméthyl-pipérazine ;
- acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ;
- acide cis-4-aminocyclohexane acétique ;
- acide trans-4-aminocyclohexane acétique ; - 4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine ;
- acide 4-aminobenzoïque ;
- acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ;
• -L- représente une liaison de nature pseudopeptidique entre les résidus X'a et X'b, choisie notamment dans la liste ci-dessous : -L- = -ψ(CH2CH2)- ; -ψ(CH(Fk)=CH(Fk'))- ; -ψ(CH2NH)- ; -ψ(NHCO> ;
-ψ(NHCONH)- ; -ψ(CO-O)- ; -ψ(CS-NH)- ; -ψ(CH(OH)-CH(OH))- ; -ψ(S-CH2> ;
-ψ(CH2-S)- ; -ψ(CH(CN)-CH2)- ; -ψ(CH(OH))- ; -ψ(COCH2)- ; -ψ(CH(OH)CH2)- ;
^(CH(OH)CH2NH)- ; -ψ(CH2> ; -ψ(CH(Fk)> ; -ψ(CH2O)- ; -ψ(CH2-NHCONH> ;
-ψ(CH(Fk)NHCONFk')- ; -ψ(CH2-CONH)- ; -ψ(CH(Fk)CONH)- ; -ψ(CH(Fk)CH(Fk')CONH)- ; ou -ψ(CH2N)- ; -ψ(NHCON)- ; -ψ(CS-N)- ; -ψ(CH(OH)CH2N> ;
-ψ(CH2-NHCON)- ; -ψ(CH2-CON> ; -ψ(CH(Fk)CON)- ; -ψ(CH(Fk)CH(Fk')CON)- lorsque X'b représente la chaîne latérale d'une proline,
Fk et Fk' représentant, indépendamment l'un de l'autre, un hydrogène, un halogène, un groupe alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, ou un groupe aryle dont la structure du cycle contient de 5 à 20 atomes de carbone,
• X'a représente la chaîne latérale de la lysine, de l'arginine ou de l'ornithine ; et
• X'b représente la chaîne, latérale de l'un des résidus d'acides aminés suivants :
- glycine ; - isoleucine ;
- leucine ;
- valine ;
- asparagine ; - D-alanine ;
- D-valine ;
- L-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;
- D-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;
- acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ;
- acides aminés dialkylés acycliques de formule suivante :
R représentant H :, Me, Et5 Pr ou Bu ;
- acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante :
k représentant 1, 2, 3 ou 4
5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que Y répond à la formule suivante (II) :
dans laquelle :
- A représente un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi indifféremment parmi :
(1) (2) (3) (4)
(5) (6) (7) (8)
(9) (10) (H) (12)
. n représentant 0, 1, 2 ou 3 ; . p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; . E représentant NH ou O ;
- B1 est un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi de manière indépendante parmi :
(13) (14) (15) (16)
(17) (18) (19) (20)
. n représentant 0, 1, 2 ou 3 ; . p représentant 0, 1, 2 ou 3 ;
. E représentant NH ou O ;
. Ra représentant la chaîne d'un acide aminé protéinogénique, C1-C8 alkylé ; - B2 est choisi de manière indépendante parmi les groupes suivants : la liaison c représentant la liaison au groupe X,
(15) (16) (19) (20)
(21) (22) (23) (24)
n représentant 0, 1 , 2 ou 3 ; p représentant 0, 1 , 2 ou 3 ;
E représentant NH ou O ;
Rb représentant une chaîne alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone ;
D' représentant l'un des groupes suivants : D
m représentant un nombre entier variant de 1 à 40 ; v représentant un nombre entier variant de 1 à 10 ; la liaison c' représentant la liaison au groupe X,
. D représentant l'un des groupes suivants : - un groupe de formule , 9 9
lorsque X représente un groupe de formule (13') et (15')
- ou un groupe de formule ou de formule lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (l l'), (12') et (14'), la liaison c' représentant la liaison au groupe X, q représentant un nombre entier variant de 2 à 6 ;
Xg correspondant au résidu de l'un des groupes suivants :
-(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ;
-NH2~(CH2)n~COOH, n variant de 1 à 10 ;
-NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH, m variant de 3 à 6 ; acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; acide tranéxamique ; acide N-méthyl-tranéxamique ; acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; acide 3(pipéridin-4-yl)-propionique ;
N-(4-aminobutyl)-glycine ;
4-carboxyméthyl-pipérazine ; acide 4-(4-aminophenyl)butanoïque ; acide 3-(4-aminophenyl)propanoïque ; acide 4-aminophénylacétique ;
4-(2-aminoéthyl)-l -carboxyméthyl-pipérazine ; acide trans-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;
4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine ; acide 4-aminobenzoïque ; acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque.
6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que Y répond à l'une des formules suivantes :
(HI) (IV)
(iπ-3) (iπ-4)
Ra, Rc, D5 D', Xg, q, i et p étant tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5.
7. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, répondant à l'une
Rc et m étant tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5.
8. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel Rc est : - H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO- ou - H-Lys-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO- ou
- Ahx-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO- ou
- H-Lys-ψ(CH2l^)-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, -ψ(CH2N)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène-amino, ou
- H-Lys-ψ(CH2)-Gly-Tyr-Tyr-MÎ-(CH2)5-CO-, -ψ(CH2)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène, ou
- H-Lys-ψ(CH2-CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, -ψ(CH2CH2)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type éthylène, ou
- H-Lys-Gly-DOPA-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, ou
- H-Arg-Ile-Ile-Leu-Arg- NH-(CH2)5-CO-.
9. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, répondant à la
dans laquelle :
- n est égal à 1, 2 ou 6 ;
- R0 représente un groupe H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-.
10. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de substance active un composé selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable.
11. Composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de substance active un composé selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec un adjuvant pharmaceutiquement acceptable.
12. Utilisation de composés selon l'une des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'inhibition ou l'activation de la réponse immunitaire.
13. Utilisation selon la revendication 12, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire, telles que les rejets de greffes, les allergies ou les maladies auto-immunes.
14. Utilisation selon la revendication 13, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'augmentation de la réponse immunitaire, telles que les cancers ou les infections parasitaires, bactériennes, virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels tels que les prions.
15. Procédé de préparation sur support solide d'un composé, selon l'une des revendications 1 à 9, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
— la formation d'un précurseur linéaire de Y tel que défini dans la revendication 1, lequel précurseur est constitué d'un enchaînement d'acides aminés formant une chaîne peptidique en croissance, synthétisée par des cycles successifs de couplage entre des résidus d'acides aminés N-protégés, dont trois portent un groupe de type aminé, et la fonction aminé de la chaîne peptidique en croissance, et de déprotection, le premier résidu d'acide aminé étant accroché sur un support solide, ledit précurseur linéaire de Y comprenant au moins un résidu D-Alanine, ledit résidu D-Alanine étant substitué par un résidu D-Lysine dont l'aminé ε-NH a été acylée par un acide carboxylique portant la fonction désirée correspondant au groupe X tel que défini dans la revendication 1,
- la cyclisation du précurseur linéaire de Y protégé susmentionné, afin d'obtenir un cycle fonctionnalisé protégé,
- la réaction dudit cycle fonctionnalisé protégé avec un bras espaceur dérivé de Z tel que défini dans la revendication 1, afin d'obtenir un cycle fonctionnalisé protégé dimérisé,
- le clivage des susdits groupes protecteurs, pour libérer les susdites fonctions aminés protégées et obtenir un cycle fonctionnalisé déprotégé dimérisé,
- le couplage des fonctions aminés libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe Rc tel que défini dans la revendication 1, et
- le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe
Rc, afin d'obtenir le composé selon l'une des revendications 1 à 9.
16. Procédé de préparation selon la revendication 15 d'un composé de formule (Ill-a) ou (III-b) selon la revendication 7, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la réaction d'un cycle fonctionnalisé protégé de formule suivante :
GP représentant un groupe protecteur notamment choisi parmi : Boc, Z ou Alloc,
X' représentant un groupe -SH ou O Z' avec un groupe espaceur de formule Z" ;o n représentant un nombre entier variant de 1 à 10
et Z' représentant un groupe N3 ou un groupe
étant entendu que lorsque X' représente un groupe Z' représente un groupe N3,
et lorsque X' représente un groupe -SH, Z' représente un groupe afin d'obtenir un composé de formule (VIII) suivante :
GP étant tel que défini ci-dessus et
étant entendu que Y' répond à la formule (A) lorsque Z' représente un groupe N3
et que Y' répond à la formule (B) lorsque Z' représente un groupe — la déprotection des susdits groupes protecteurs GP, pour libérer les fonctions aminés protégées et le couplage de ces fonctions aminés libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe Rc tel que défini dans la revendication 1, et
- le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe Rc, afin d'obtenir le composé de formule (Ill-a) ou (III-b) selon la revendication 7.
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