EP1951287A2 - Medicament for treating problems relating to fertility and pregnancy, and auto-immune diseases, and for inducing an immunological tolerance in transplant patients, and method for producing said medicament - Google Patents

Medicament for treating problems relating to fertility and pregnancy, and auto-immune diseases, and for inducing an immunological tolerance in transplant patients, and method for producing said medicament

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EP1951287A2
EP1951287A2 EP06805531A EP06805531A EP1951287A2 EP 1951287 A2 EP1951287 A2 EP 1951287A2 EP 06805531 A EP06805531 A EP 06805531A EP 06805531 A EP06805531 A EP 06805531A EP 1951287 A2 EP1951287 A2 EP 1951287A2
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EP
European Patent Office
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hcg
seq
subunit
mature
precursor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06805531A
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German (de)
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Inventor
Henry Alexander
Gerolf Zimmermann
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VivoSensMedical GmbH
Original Assignee
Universitaet Leipzig
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22Hormones
    • A61K38/24Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders

Abstract

The invention relates to a medicament, especially for treating problems relating to pregnancy or for inducing an immunological tolerance in patients with auto-immune diseases or having undergone a transplant. Said medicament contains at least one beta6 or beta7 precursor or mature sub-unit of the endometrial or decidual human choriongonadotropin (hCG), and an alpha precursor or mature sub-unit of the human choriongonadotropin or the glycolysed fragments of said sub-units. Unlike the trophoblast hCG with the sub-units beta3, beta5 and beta8, the function of the non-trophoblast hCG beta6 oder beta7 expressed in the endometrium and the decidua has hardly been examined.

Description

Arzneimittel zur Behandlung von Fertilitäts- und Schwangerschaftsstörungen, Autoimmunerkrankungen und zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Transplantationspatienten und Verfahren zur HerstellungMedicines for the treatment of fertility and pregnancy disorders, autoimmune diseases and induction of immunological tolerance in transplant patients and methods of preparation
Die Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung von Fertilitäts- und Schwangerschaftsstörungen, Autoimmunerkrankungen und zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Transplantationspatienten zur Anwendung in der Medizin, insbesondere in der Gynäkologie bzw. Transplantationsmedizin, sowie ein Verfahren zur Herstellung.The invention relates to agents for the treatment of fertility and pregnancy disorders, autoimmune diseases and induction of immunological tolerance in transplant patients for use in medicine, in particular in gynecology and transplantation medicine, and a method for producing.
In der Frauenheilkunde stellt die Frühgeburtlichkeit ein großes medizinisches Problem dar. Bei einer Frühgeburt endet die Schwangerschaft vor der 37. Schwangerschaftswoche (normale Schwangerschaftsdauer: 40 Wochen). In Deutschland liegt die Frühgeburtsrate bei ca. 6 bis 7%. Trotz großer Bemühungen ist es in den vergangenen Jahrzehnten nicht gelungen, die Frühgeburtsrate zu senken. Circa zwei Drittel der perinatalen Todesfälle von Neugeborenen sind auf eine Frühgeburt zurückzuführen. „Frühgeborene" haben ein Gewicht von 500 bis 2500 g. Die neonatologische Versorgung der Frühgeburten zieht sich oftmals über mehrere Monate hin und ist ein sehr kostenintensives Gebiet der Kinderheilkunde. Trotz intensivmedizinischer Versorgung tragen von den überlebenden Frühgeburten ca. 7 % Spätschäden (neurologische Schäden, körperliche und geistige Entwicklungsstörung bzw. Retardierung, Seh- bzw. Hörstörungen) davon.In gynecology, prematurity is a major medical problem. For premature birth, the pregnancy ends before the 37th week of pregnancy (normal duration of pregnancy: 40 weeks). In Germany, the premature birth rate is around 6 to 7%. Despite great efforts, it has not been possible in recent decades to lower the premature birth rate. About two thirds of neonatal perinatal deaths are due to premature birth. "Premature babies" have a weight of 500 to 2500 g., The neonatal care of premature births often extends over several months and is a very cost-intensive field of paediatrics Despite intensive medical care of the surviving premature births carry about 7% late damage (neurological damage, physical and mental developmental disorder or retardation, visual or hearing disorders) thereof.
Bisher gibt es keine kausale Therapie für späte Schwangerschaftsstörungen bzw. eine Frühgeburt. Bei frühen Schwangerschaftsstörungen (Fertilitätsstörungen, Implantationsstörungen, frühe Schwangerschaftsverluste, imminenter und habitueller Abort) wird zur Stützung des Gelbkörpers Progesteron verordnet. Teilweise erfolgt auch die Gabe von hCG bis zur 10. Schwangerschaftswoche. Bei dem bisher verabreichten hCG handelt es sich um trophoblastäres hCG.So far, there is no causal therapy for late pregnancy disorders or premature birth. In early pregnancy disorders (fertility disorders, implantation disorders, early pregnancy loss, imminent and habitual abortion) progesterone is prescribed to support the corpus luteum. In some cases the administration of hCG takes place until the 10th week of pregnancy. The previously administered hCG is trophoblastic hCG.
Späte Schwangerschaftsstörungen (Frühgeburt, Präeklampsie, Wachstumsretardierung) behandelt man zur Zeit symptomatisch mit Progesteron, Magnesium, ß-Sympathikomimetika bzw. Antihypertonika.Late pregnancy disorders (premature birth, preeclampsia, growth retardation) are currently being treated symptomatically with progesterone, magnesium, ß-sympathomimetics or antihypertensives.
Seit Jahren werden Immunsuppressiva bei Patienten mit Organtransplantation und Autoimmunerkrankungen angewendet. Dabei müssen diese Medikamente dauerhaft eingenommen werden. Diese weisen aber nicht unbeträchtliche Nebenwirkungen auf, die für eine erhöhte Morbidität und Mortalität verantwortlich sind. Deshalb ist man seit Jahren bemüht, neue Methoden und Medikamente für die Behandlung von Patienten mit Organ- transplantation und Autoimmunerkrankungen zu erarbeiten. Für eine Immuntoleranz ist außerdem der Fas-Ligand bedeutungsvoll (Fandrich F., Lin X., Klöppel G. und Kremer B., 1998; Fandrich F., Lin X, Zhu X., Parwaresch R., Kremer B. und Henne-Bruns D., 1998).For years immunosuppressants have been used in patients with organ transplantation and autoimmune diseases. These drugs must be taken permanently. However, these have not inconsiderable side effects, which are responsible for increased morbidity and mortality. Therefore, efforts have been made for years to develop new methods and drugs for the treatment of patients with organ transplantation and autoimmune diseases. The Fas ligand is also important for immune tolerance (Fandrich F., Lin X., Klöppel G. and Kremer B., 1998, Fandrich F., Lin X, Zhu X, Parwaresch R., Kremer B. and Henne- Bruns D., 1998).
Die Hormone humanes Choriongonadotropin (hCG), LH (luteinisierendes Hormon), FSH (Follikel-stimulierendes Hormon) und TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon) bilden eine Famile von Glycoproteinhormonen. Sie bestehen aus einem nicht-kovalent verknüpften Heterodimer aus einer α-Untereinheit und einer ß-Untereinheit. Die α-Untereinheit ist bei allen vier Hormonen identisch, die ß-Untereinheiten sind unterschiedlich und definieren die endokrinen Funktionen der Heterodimere (Pierce et al. 1981 ). Die ß-Untereinheit des Chorongonadotropins unterscheidet sich von den anderen ß-Untereinheiten der Glykoproteinhormone hauptsächlich dadurch, dass sie am C-Terminus um 23 Aminosäuren - das sog. C-terminale Peptid (CTP) - verlängert ist. Die ß-Untereinheit des hCG besitzt zwei Asparagin-N-glykosidischen Seitenketten, der C-terminale Peptid(CTP)-Anteil (Aminosäuren 122 bis 145) weist vier zusätzliche Serin-O-glykosidische Oligosaccharid-Seitenketten auf.The hormones human chorionic gonadotropin (hCG), LH (luteinizing hormone), FSH (follicle stimulating hormone) and TSH (thyroid stimulating hormone) make up a family of glycoprotein hormones. They consist of a non-covalently linked heterodimer of an α-subunit and a β-subunit. The α subunit is identical in all four hormones, the β subunits are different and define the endocrine functions of the heterodimers (Pierce et al 1981). The β-subunit of chorongonadotropin differs from the other β-subunits of glycoprotein hormones mainly in that it is extended at the C-terminus by 23 amino acids - the so-called C-terminal peptide (CTP). The β-subunit of hCG has two asparagine-N-glycosidic side chains, and the C-terminal peptide (CTP) portion (amino acids 122 to 145) has four additional serine-O-glycosidic oligosaccharide side chains.
Die α-Untereinheit des LH, FSH, TSH und des humanen Choriongonadotropins (αCG) wird von einem Gen kodiert, das auf Chromosom 6 lokalisiert ist (Chromosom 6q21.1-q 23), während die ß-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins (ßhCG) von den sechs homologen Genen hCG ß1 , ß2, ß3, ß5, ß7 und ß8 kodiert wird, die in einem Gencluster auf Chromosom 19 (Chromosom 19q13.3) neben LH ß4 lokalisiert sind (Jameson et al. 1993). Das ßhCG-Gen ß6 ist wahrscheinlich ein Allel von ß7 mit Differenzen in der nichttranslatierenden Nukleotidsequenz des Promotorgens (Exon 1) und der translatierenden Sequenz (Exon 2) der ßhCG-Untereinheit.The α-subunit of LH, FSH, TSH and human chorionic gonadotropin (αCG) is encoded by a gene located on chromosome 6 (chromosome 6q21.1-q23), while the β-subunit of human chorionic gonadotropin (βhCG) of the six homologous genes hCG β1, β2, β3, β5, β7 and β8, which are located in a gene cluster on chromosome 19 (chromosome 19q13.3) next to LH β4 (Jameson et al., 1993). The βhCG gene β6 is probably an allele of β7 with differences in the non-translating nucleotide sequence of the promoter gene (exon 1) and the translational sequence (exon 2) of the βhCG subunit.
Während der Schwangerschaft werden im Trophoblast des frühen Embryos (ab dem 6. bis 12. Tag nach der Konzeption) und später im Syncytiotrophoblast der Plazenta größere Mengen hCG-Heterodimer und freie αCG - und ßhCG-Untereinheiten gebildet und in das Blut sezerniert. Dieses trophoblastäre Gewebe exprimiert ausschließlich die ßhCG-Untereinheiten hCG ß5, ß8 und ß3. Diese ßhCG-Untereinheiten werden daher trophoblastäres ßhCG (tßhCG) oder Typ Il - ßhCG genannt. Dieses trophoblastäre hCG bindet am Gelbkörper, der so zur Produktion und weiteren Sekretion von Progesteron angeregt wird, die zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft erforderlich ist.During pregnancy, larger amounts of hCG heterodimer and free αCG and βhCG subunits are formed in the trophoblast of the early embryo (from days 6 to 12 after conception) and later in the syncytiotrophoblast of the placenta and secreted into the blood. This trophoblastic tissue expresses exclusively the βhCG subunits hCG β5, β8 and β3. These βhCG subunits are therefore called trophoblastic βhCG (tβhCG) or type Il - βhCG. This trophoblastic hCG binds to the corpus luteum, which is thus stimulated to produce and further secrete progesterone needed to maintain pregnancy.
Das trophoblastäre hCG wirkt wie LH an einem gemeinsamen membrangebundenen G-Protein- gekoppelten Rezeptor. Dieser wird im Epithel, Endothel und den Stromazellen des Endometriums und anderer Organe, in Lymphozyten und Makrophagen nachgewiesen (Reshef et al. 1990; Licht et al. 1993; Lin et al. 1995; Zhang et al. 2003; Licht et al. 2003). Daneben wirkt eventuell trophoblastäres ßhCG auch über Signalwege, die nicht rezeptor-vermittelt sind (Cruz et al. 1987).The trophoblastic hCG, like LH, acts on a common membrane-bound G protein-coupled receptor. This is demonstrated in the epithelium, endothelium and stromal cells of the endometrium and other organs, in lymphocytes and macrophages (Reshef et al 1990, Licht et al 1993, Lin et al 1995, Zhang et al 2003, Licht et al ). Next to it works possibly trophoblastic βhCG also via signaling pathways that are not receptor-mediated (Cruz et al., 1987).
Aber auch in einigen nicht-trophoblastären Geweben wird hCG-Heterodimer bzw. freie αCG - und ßhCG-Untereinheiten in geringen Mengen exprimiert (Rothman et al. 1992; Dirnhofer et al. 1996; Lei et al. 1993; Yokotani et al. 1997; Berger et al. 1994). Nicht-trophoblastäre Gewebe, wie z. B. Mamma, Lunge, Prostata, Blase und Colon, exprimieren auschließlich die ßhCG- Untereinheiten hCG ß7 / ß6. Auch im endometrialen und dezidualen Epithelium der Gebärmutter wird nicht-trophoblastäres hCG gebildet (Alexander et al. 1998b; Wolkersdorfer et al. 1998; Zimmermann et al. 2003). Die ßhCG-Untereinheiten ß7 bzw. das ß7-Allel ß6 werden daher auch als nicht-trophoblastäres oder epitheliales ßhCG oder Typ I- ßhCG bezeichnet (Bellet et al. 1997). Die Funktion des nicht-trophoblastären hCG ist aber noch kaum untersucht.However, hCG heterodimer or free αCG and βhCG subunits are also expressed in small amounts in some non-trophoblastic tissues (Rothman et al., 1992; Dirnhofer et al., 1996; Lei et al., 1993; Yokotani et al., 1997; Berger et al., 1994). Non-trophoblastic tissues, such as As mamma, lung, prostate, bladder and colon express exclusively the ßhCG subunits hCG ß7 / ß6. Non-trophoblastic hCG is also produced in the endometrial and decidual epithelium of the uterus (Alexander et al 1998b, Wolkersdorfer et al 1998, Zimmermann et al., 2003). The βhCG subunits β7 and the β7 allele β6 are therefore also designated as non-trophoblastic or epithelial βhCG or type ββCG (Bellet et al., 1997). However, the function of the non-trophoblastic hCG has barely been studied.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Mittel zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen, insbesondere zur Behandlung von Fertilitätsstörungen, Implantationsstörungen, frühen Schwangerschaftsverlusten, imminentem und habituellen Abort sowie von Frühgeburt, Wachstumsretardierung und Präeklampsie bereitzustellen.The object of the invention is therefore to provide an agent for the treatment of pregnancy disorders, in particular for the treatment of fertility disorders, implantation disorders, early pregnancy loss, imminent and habitual abortion and premature birth, growth retardation and preeclampsia.
Aufgabe der Erfindung ist es ebenfalls, Mittel zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen bzw. zur Induktion einer Immuntoleranz bei Transplantationspatienten anzugeben.The object of the invention is also to specify agents for the treatment of autoimmune diseases or for the induction of immune tolerance in transplant patients.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen, das eine Präkursor-hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 1 oder alternativ SEQ ID NO 2, aus hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 5 oder eine mature hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 3 oder alternativ SEQ ID NO 4, aus hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder Fragmente daraus enthält.According to the invention, the object is achieved by a medicament, in particular for the treatment of pregnancy disorders, comprising a precursor hCG β subunit selected from hCG β6 according to SEQ ID NO 1 or alternatively SEQ ID NO 2, hCG β7 according to SEQ ID NO 5 or a mature hCG β subunit selected from hCG β6 according to SEQ ID NO 3 or alternatively SEQ ID NO 4, from hCG β7 according to SEQ ID NO 6 or fragments thereof.
Bestandteil der Erfindung ist auch die Verwendung einer Präkursor-hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2 und hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 5 oder einer maturen hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4, hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder glycan-behaftete Oligopeptid- Fragmenten daraus zur Behandlung von Schwanger-schaftsstörungen.Also part of the invention is the use of a precursor hCG β subunit selected from hCG β6 according to SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2 and hCG β7 according to SEQ ID NO 5 or a mature hCG β subunit selected from hCG β6 according to SEQ ID NO 3 or SEQ ID NO 4, hCG β7 according to SEQ ID NO 6 or glycan-afflicted oligopeptide fragments thereof for the treatment of pregnancy disorders.
Bei den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 2 handelt es sich um die beiden möglichen Formen der Aminosäuresequenzen des Präkursors der endometrialen oder dezidualen hCG ß6-Untereinheit. Der Präkursor der hCG ß6-Untereinheit besteht aus 165 Aminosäuren (in SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 2 nummeriert von 1 bis 165). Die Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 20 ist das Signalpeptid, das im Golgiapparat abgespalten wird. Die spezifische, mature Form der dezidualen hCG ß6-Untereinheit entspricht der Aminosäuresequenz von Aminosäure 21 bis Aminosäure 165, d.h. einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 3 bzw. SEQ ID NO 4.The amino acid sequences according to SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2 are the two possible forms of the amino acid sequences of the precursor of the endometrial or decidual hCG β6 subunit. The precursor of the hCG β6 subunit consists of 165 Amino acids (numbered 1 to 165 in SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2, respectively). The amino acid sequence of amino acid 1 to 20 is the signal peptide that is cleaved in the Golgi apparatus. The specific, mature form of the decidual hCG β6 subunit corresponds to the amino acid sequence from amino acid 21 to amino acid 165, ie an amino acid sequence according to SEQ ID NO 3 or SEQ ID NO 4.
Die spezifische, mature Form der endometrialen oder dezidualen hCG ß6-Untereinheit besteht aus 145 Aminosäuren (in SEQ ID NO 3 bzw. SEQ ID NO 4 von 1 bis 145 nummeriert). Die Aminosäuresequenz der hCG ß6-Untereinheit enthält im Unterschied zu der Aminosäuresequenz der trophoblastären hCG ß-Untereinheiten ß3, ß5 und ß8 an Aminosäureposition 117 ein Alanin statt eines Aspartates. An Position 2 der hCG ß6- Untereinheit ist ein Lysin (SEQ ID NO 3) oder ein Arginin (SEQ ID NO 4). Bevorzugt ist die mature Form der endometriaien oder dezidualen hCG ß6-Untereinheit gemäß SEQ ID NO 3 bzw. SEQ ID NO 4 und/oder der Präkursor der dezidualen hCG ß6-Untereinheit gemäß SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 2 im Arzneimittel enthalten.The specific, mature form of the endometrial or decidual hCG β6 subunit consists of 145 amino acids (numbered 1 to 145 in SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 4, respectively). In contrast to the amino acid sequence of the trophoblastic hCG β subunits β3, β5 and β8 at amino acid position 117, the amino acid sequence of the hCG β6 subunit contains an alanine instead of an aspartate. At position 2 of the hCG β6 subunit is a lysine (SEQ ID NO 3) or an arginine (SEQ ID NO 4). The mature form of the endometria or deciduous hCG β6 subunit according to SEQ ID NO 3 or SEQ ID NO 4 and / or the precursor of the decident hCG β6 subunit according to SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2 are preferably contained in the medicament.
Bei SEQ ID NO 5 handelt es sich um den Präkursor der Aminosäuresequenz der endometrialen oder dezidualen hCG ß7-Untereinheit. Der Präkursor der hCG ß7-Untereinheit besteht aus 165 Aminosäuren (in SEQ ID NO 5 nummeriert von 1 bis 165). Die Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 20 entspricht dem Signalpeptid, das im Golgiapparat abgespalten wird. Die spezifische, biologisch mature Form der endometrialen oder dezidualen hCG ß7-Untereinheit entspricht der Aminosäuresequenz von Aminosäure 21 bis Aminosäure 165, d.h. einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 6.SEQ ID NO 5 is the precursor of the amino acid sequence of the endometrial or decidual hCG β7 subunit. The precursor of the hCG β7 subunit consists of 165 amino acids (numbered 1 to 165 in SEQ ID NO 5). The amino acid sequence of amino acid 1 to 20 corresponds to the signal peptide that is cleaved in the Golgi apparatus. The specific, biologically mature form of the endometrial or decidual hCG β7 subunit corresponds to the amino acid sequence from amino acid 21 to amino acid 165, i. an amino acid sequence according to SEQ ID NO 6.
Die mature Form der endometrialen oder dezidualen hCG ß7-Untereinheit besteht aus 145 Aminosäuren (in SEQ ID NO 6 von 1 bis 145 nummeriert). Die Aminosäuresequenz der hCG ß7-Untereinheit enthält im Unterschied zu der Aminosäuresequenz der trophoblastären hCG ß- Untereinheiten ß3, ß5 und ß8 an Aminosäureposition 117 ein Alanin statt eines Aspartates. An Aminosäureposition 2 enthält sie ein Arginin statt eines Lysins, an Aminosäureposition 4 enthält sie ein Methionin statt eines Prolins.The mature form of the endometrial or decidual hCG β7 subunit consists of 145 amino acids (numbered 1 to 145 in SEQ ID NO 6). In contrast to the amino acid sequence of the trophoblastic hCG β subunits β3, β5 and β8 at amino acid position 117, the amino acid sequence of the hCG β7 subunit contains an alanine instead of an aspartate. At amino acid position 2 it contains an arginine instead of a lysine, at amino acid position 4 it contains a methionine instead of a proline.
Bevorzugt ist die mature Form der endometrialen oder dezidualen hCG ß7-Untereinheit gemäß SEQ ID NO 6 und/oder der Präkursor der dezidualen hCG ß7-Untereinheit gemäß SEQ ID NO 5 im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten. In einer besonderen Ausführungsform des Arzneimittel enthält dieses zusätzlich zu der endometrialen ß6- und/oder ß7-Einheit die trophoblastäre Untereinheit hCG ß5, hCG ß3 und hCG ß8 gemäß SEQ ID NO 7 und/oder SEQ ID NO 8The mature form of the endometrial or decidual hCG β7 subunit according to SEQ ID NO 6 and / or the precursor of the decidual hCG β7 subunit according to SEQ ID NO 5 are preferably contained in the medicament according to the invention. In a particular embodiment of the medicament, this contains, in addition to the endometrial β6 and / or β7 unit, the trophoblastic subunit hCGβ5, hCGβ3 and hCGβ8 according to SEQ ID NO 7 and / or SEQ ID NO 8
Bei SEQ ID NO 7 handelt es sich um den Präkursor der Aminosäuresequenz der tropho- blastären ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ß8. Der Präkursor der trophoblastären ßhCG- Untereinheiten ß5, ß3 und ß8 bestehen aus je 165 Aminosäuren (in SEQ ID NO 7 nummeriert von 1 bis 165). Die Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 20 entspricht dem Signaipeptid, das im Golgiapparat abgespalten wird. Die spezifischen, maturen Formen der trophoblastären ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ß8 entsprechen der Aminosäuresequenz von Aminosäure 21 bis Aminosäure 165, d.h. einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 8.SEQ ID NO 7 is the precursor of the amino acid sequence of the trophoblastic βhCG subunits β5, β3 and β8. The precursors of the trophoblastic βhCG subunits β5, β3 and β8 each consist of 165 amino acids (numbered 1 to 165 in SEQ ID NO 7). The amino acid sequence of amino acid 1 to 20 corresponds to the signal peptide that is cleaved in the Golgi apparatus. The specific mature forms of trophoblastic βhCG subunits β5, β3 and β8 correspond to the amino acid sequence from amino acid 21 to amino acid 165, i. an amino acid sequence according to SEQ ID NO 8.
Die spezifischen, maturen Formen der trophoblastären ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ß8 bestehen aus 145 Aminosäuren (in SEQ ID NO 8 von 1 bis 145 nummeriert). Die Aminosäuresequenz der ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ß8 enthält im Unterschied zu der Aminosäuresequenz der dezidualen ßhCG-Untereinheiten ß6 und ß7 an Aminosäureposition 117 ein Aspartat statt eines Alanins. An Aminosäureposition 2 enthält sie ein Lysin, an Aminosäureposition 4 enthält sie ein Prolin.The specific mature forms of the trophoblastic βhCG subunits β5, β3 and β8 consist of 145 amino acids (numbered 1 to 145 in SEQ ID NO 8). The amino acid sequence of the βhCG subunits β5, β3 and β8, in contrast to the amino acid sequence of the βcG βcβ subunits β6 and β7 at amino acid position 117, contains an aspartate instead of an alanine. At amino acid position 2 it contains a lysine, at amino acid position 4 it contains a proline.
Mit dem erfindungsgemäßen Mittel wird erstmals die Durchführung einer kausalen Therapie von Schwangerschaftsstörungen ermöglicht. Der für die Schwangerschafts-störungen ursächliche Verlust an dezidualem hCG wird durch die erfindungsgemäßen Mittel substituiert. Gleichzeitig stimuliert das zugeführte hCG die Bildung von hCG in der Dezidua, was wiederum die Gebärmuttermuskulatur ruhig stellt und die Durchblutung für die Plazenta verbessert. Somit ist die ursächliche Behandlung von Schwangerschaftsstörungen und der vorzeitige Geburtsbeginn im Sinne einer Frühgeburt möglich.With the agent according to the invention, the implementation of a causal therapy of pregnancy disorders is made possible for the first time. The loss of decidual hCG, which causes the pregnancy disorders, is substituted by the agents according to the invention. At the same time, the hCG delivered stimulates the formation of hCG in the decidua, which in turn calms the uterine muscles and improves the blood circulation to the placenta. Thus, the causal treatment of pregnancy disorders and premature birth is possible in terms of premature birth.
Bei den bisher in der Gynäkologie verwendeten hCG-Präparationen wird gereinigtes urinäres hCG bzw. ein gentechnisch hergestelltes rekombinantes humanes Choriogonadotropin eingesetzt. Dieses hCG besteht aus der ßhCG-Untereinheit ß5, ß8, ß3 sowie der αCG- Untereinheit und hat seinen Hauptwirkungsort am Gelbkörper (Corpus luteum) des Eierstockes. Da das Corpus luteum beim Menschen nur bis zur 10. Schwangerschaftswoche essentiell ist, wird dementsprechend nach dem Stand der Technik eine hCG-Therapie auch nur bis zur 10. Schwangerschaftswoche vorgenommen.The hCG preparations hitherto used in gynecology use purified urinary hCG or a genetically engineered recombinant human choriogonadotropin. This hCG consists of the ßhCG subunit ß5, ß8, ß3 and the αCG subunit and has its main site of action on the yellow body (corpus luteum) of the ovary. Since the corpus luteum in humans is only essential until the 10th week of pregnancy, according to the state of the art, hCG therapy is also carried out only up to the 10th week of pregnancy.
Humanes deziduales Choriongonadotropin, das aus der hCG ß-Untereinheit ß6 bzw. ß7 und der αCG-Untereinheit besteht, stützt zwar auch das Corpus luteum, ist aber darüber hinaus hauptsächlich für die Aufrechterhaltung der Immuntoleranz der Schwangerschaft notwendig. Die Induktion, Expression und Proteinbildung des ßhCG-Gens ß7 und/oder ß6 im endometrialen und dezidualen Drüsenepithel unterstützt die Fertilität und Schwangerschaft. Dabei erfolgt die Wirkung über verschiedene Mechanismen.Although human decidual chorionic gonadotropin, which consists of the hCG β subunit β6 or β7 and the αCG subunit, also supports the corpus luteum, it is beyond that mainly necessary for maintaining the immune tolerance of pregnancy. The induction, expression and protein formation of the βhCG gene β7 and / or β6 in the endometrial and decidual gland epithelium promotes fertility and pregnancy. The effect takes place via various mechanisms.
Die Schwangerschaft selbst ist ein immunologisches Paradox. Der Embryo bzw. Fetus ist ein sogenanntes „Semi-Allotransplantat", das zur Hälfte aus mütterlichen und zur Hälfte aus väterlichen Genen besteht und somit zur Hälfte „fremd" ist. Die Frucht muss bis zur Reife für 38 Wochen immunologisch toleriert werden. Dies ist ein komplexer und multifaktorieller Prozess, über dessen Mechanismen bisher nur wenig bekannt ist.The pregnancy itself is an immunological paradox. The embryo or fetus is a so-called "semi-allograft", half of which consists of maternal and half of paternal genes and is therefore half "alien". The fruit must be tolerated immunologically until maturity for 38 weeks. This is a complex and multifactorial process whose mechanisms are still poorly understood.
Die Gebärmutter ist ein immunprivilegierter Ort. Dabei stellt das endometriale hCG (ß6/ß7hCG und αCG) den Hauptfaktor für diese biologische Besonderheit dar, die erst eine erfolgreiche Schwangerschaft möglich macht.The uterus is an immune-privileged place. Here, the endometrial hCG (ß6 / ß7hCG and αCG) is the main factor for this biological peculiarity that makes a successful pregnancy possible.
hCG wirkt immunsuppressiv am Uterus. Auf diese Weise wirkt die Dezidua, die die Frucht umgibt und über die Eihäute auch das hCG in das Fruchtwasser abgibt, wie ein Schutzschild. Das hCG der Dezidua (ß6/ß7hCG und αCG) ist gleichzeitig verantwortlich für chemotaktische Attraktion von mononukleären Immunzellen, die ihrerseits eine Abstoßungsreaktion verhindern. Außerdem verbessert das deziduale hCG die Durchblutung der Gebärmutter und Plazenta.hCG has an immunosuppressive effect on the uterus. In this way, the decidua that surrounds the fruit and also releases the hCG into the amniotic fluid via the membranes, acts as a shield. The hCG of the decidua (ß6 / ß7hCG and αCG) is also responsible for the chemotactic attraction of mononuclear immune cells, which in turn prevent a rejection reaction. In addition, decidual hCG improves blood flow to the uterus and placenta.
Erst wenn die Fähigkeit zur hCG-Produktion und Sekretion durch die Dezidua am Ende der Schwangerschaft vor allem durch den abfallenden Progesteronspiegel nachlässt, wird auch die Immuntoleranz der Schwangerschaft beendet, der lokale Immunschutz wird aufgehoben, die protektiven mononukleären Zellen werden apoptotisch und die hCG-induzierte optimale Durchblutung der Dezidua und Plazenta wird vermindert. Es kommt zur Hypoxie und Nekrose der Dezidua und damit zur Bildung von Prostaglandinen sowie Oxytocin und zur Geburt. Bei Patientinnen mit Frühgeburt wird dieser Prozess durch eine Vielzahl von Störungen vorfristig ausgelöst.Only when the ability to hCG production and secretion by the decidua at the end of pregnancy, especially by the declining progesterone levels, also the immune tolerance of pregnancy is terminated, the local immune protection is reversed, the protective mononuclear cells are apoptotic and the hCG-induced optimal blood flow to the decidua and placenta is reduced. It leads to hypoxia and necrosis of the decidua and thus to the formation of prostaglandins and oxytocin and birth. In premature birth, this process is prematurely triggered by a variety of disorders.
Somit ist bei einem Mangel an dezidualem Choriongonadotropin dessen Substitution während der gesamten Schwangerschaft bis zur 37. Schwangerschaftswoche notwendig.Thus, in the absence of decidual chorionic gonadotropin its substitution during the entire pregnancy up to the 37th week of pregnancy is necessary.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel dient der Behandlung von Schwangerschaftsstörungen. Unter Schwangerschaftsstörungen sind dabei Fertilitätsstörungen, Implantations-störungen, frühe Schwangerschaftsverluste, imminenter und habitueller Abort sowie Frühgeburt, Wachstumsretardierung und Präeklampsie zu verstehen. Insbesondere sind darunter solche Schwangerschaftsstörungen zu verstehen, die durch einen Mangel an dezidualem hCG verursacht sind.The medicament according to the invention is used for the treatment of pregnancy disorders. Pregnancy disorders include fertility disorders, implantation disorders, early pregnancy loss, imminent and habitual abortion as well as premature birth, growth retardation and preeclampsia. In particular, such are among them To understand pregnancy disorders caused by a lack of deciduous hCG.
Bei einer Fertilitätsstörung handelt es sich um eine Störung, die dadurch gekennzeichnet ist, das trotz regelmäßigen ungeschützten Geschlechtsverkehrs keine Schwangerschaft eintritt.A fertility disorder is a disorder characterized by no pregnancy despite regular unprotected intercourse.
Eine Implantationsstörung liegt vor, wenn zwar eine Befruchtung der Eizelle erfolgt, diese sich jedoch in die Gebärmutterschleimhaut einnisten kann.There is an implantation disorder, although fertilization of the egg cell occurs, but this can nest in the uterine lining.
Frühe Schwangerschaftsverluste sind dadurch gekennzeichnet, dass sich ein Embryo zwar in die Gebärmutterschleimhaut einnistet, der Embryo jedoch kurz nach der Implantation abstirbt.Early pregnancy losses are characterized by the fact that an embryo, although implanted in the uterine lining, the embryo dies shortly after implantation.
Ein imminenter Abort ist eine sogenannte drohende Fehlgeburt, die meist gekennzeichnet ist durch Blutungen und Unterbauchschmerzen. Während hingegen eine habituelle Abortneigung dann vorliegt, wenn eine Patientin drei- und mehrfach hintereinander eine Fehlgeburt hatte.An imminent abortion is a so-called impending miscarriage, which is usually characterized by bleeding and pelvic pain. Whereas, on the other hand, a habitual tendency to abortion occurs when a patient has had a miscarriage three or more times in succession.
Eine Frühgeburt liegt vor, wenn es zwischen der 24. und 37. Schwangerschaftswoche zur Geburt kommt, bzw. wenn auch vor der 24. Schwangerschaftswoche ein Lebendes Kind geboren wird.A premature birth occurs when it comes to birth between the 24th and 37th week of pregnancy, or if a living child is born before the 24th week of pregnancy.
Bei einer intrauterinen Wachstumsretardierung ist der Fetus für sein Alter entsprechend der Schwangerschaftswoche zu klein. Dabei liegt die Abweichung des geschätzten Gewichtes um zwei Standardabweichungen unter dem Normalwert. Diese Abweichung des Größenwachstums wird nach Abmessen des Fetus mit dem Ultraschall und dem anschließenden Vergleich mit Wachstumskurven festgestellt.In case of an intrauterine growth retardation, the fetus is too small for its age corresponding to the week of pregnancy. The deviation of the estimated weight by two standard deviations is below the normal value. This variation in size growth is determined by measuring the fetus with ultrasound and then comparing it to growth curves.
Die Präeklampsie ist eine hypertensive Erkrankung in der Schwangerschaft (Schwangerschaftshypertonie). Sie beschreibt gleichzeitig das Auftreten von Ödemen und Eiweißausscheidung im Urin. In 20 Prozent der Falle kommt es zu einer Beteiligung der Leber mit Erhöhung der Transaminasen und des Bilirubins.Pre-eclampsia is a hypertensive disease in pregnancy (pregnancy hypertension). It also describes the occurrence of edema and protein excretion in the urine. In 20 percent of the cases liver involvement occurs, with increases in transaminases and bilirubin.
Mit den erfindungsgemäßen Mitteln wird auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen ermöglicht. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Mittel auch zur Induktion einer Immuntoleranz bei Transplantationspatienten geeignet.The agents according to the invention also make it possible to treat autoimmune diseases. Furthermore, the agents according to the invention are also suitable for inducing immune tolerance in transplant patients.
Unter der Immuntoleranz wird das Ausbleiben einer Immunreaktion nach Gabe eines bestimmten Antigens verstanden. Die Autoimmunerkrankung ist ein Überbegriff für Krankheiten, deren Ursache in einer überschießenden Reaktion des Immunsystems gegen körpereigene Gewebe besteht. Dabei wird vom Immunsystem körpereigenes Gewebe irrtümlicherweise als zu bekämpfender Fremdkörper wahrgenommen. Dadurch kommt es zu schweren systemischen oder lokalen Entzündungsreaktionen, die zu Schäden an den betroffenen Organen führen.Immune tolerance refers to the absence of an immune response after administration of a particular antigen. The autoimmune disease is an umbrella term for diseases whose cause is an overreaction of the immune system against the body's own tissues. The body's own immune system is mistakenly considered to be too Fighting foreign body perceived. This leads to severe systemic or local inflammatory reactions, which lead to damage to the affected organs.
hCG ist eine immunsuppressive Substanz. Deshalb kann eine hCG-Therapie in obengenannter Weise sowohl eine Immunreaktion des Körpers gegen ein Allotransplantat, d.h. gegen eine Organtransplantation von einem anderen Individuum, unterdrücken als auch eine fehlgeleitete Immunantwort gegen körpereigenes Gewebe im Rahmen einer Autoimmunerkrankung unterbinden.hCG is an immunosuppressive substance. Therefore, hCG therapy in the above manner can cause both an immune response of the body to an allograft, i. suppress an organ transplant from another individual, as well as suppress an aberrant immune response against the body's own tissue in the context of an autoimmune disease.
Bevorzugt enthält das Arzneimittel zusätzlich den Präkursor der αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 oder die mature αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 10 oder glycan-behaftete Oligopeptid- Fragmente als Teile dieser Sequenzen.Preferably, the drug additionally contains the precursor of the human chorionic gonadotropin αCG subunit according to SEQ ID NO 9 or the mature αCG subunit of the human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 10 or glycan-linked oligopeptide fragments as parts of these sequences.
Bei SEQ ID NO 9 handelt es sich um die Aminosäuresequenz des Präkursors der hCG α- Untereinheit (J.C.Fiddes and H. M. Goodman 1973). Der Präkursor der hCG α-Untereinheit besteht aus 116 Aminosäuren (hier nummeriert von 1 bis 116). Die Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 24 entspricht dem Signalpeptid, das im Golgiapparat abgespalten wird. Die spezifische, mature Form der hCG α-Untereinheit entspricht der Aminosäuresequenz von Aminosäure 25 bis Aminosäure 116, d.h. der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 10.SEQ ID NO 9 is the amino acid sequence of the hCG α subunit precursor (J.C. Fiddes and H.M. Goodman 1973). The precursor of the hCG α subunit consists of 116 amino acids (numbered 1 to 116 here). The amino acid sequence of amino acid 1 to 24 corresponds to the signal peptide that is cleaved in the Golgi apparatus. The specific, mature form of the hCG α subunit corresponds to the amino acid sequence from amino acid 25 to amino acid 116, i. the amino acid sequence according to SEQ ID NO 10.
Die spezifische, mature Form der hCG α-Untereinheit besteht aus 92 Aminosäuren (in SEQ ID NO 10 von 1 bis 94 durchnummeriert). Bevorzugt ist die mature hCG α-Untereinheit gemäß der SEQ ID NO 10 im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten.The specific, mature form of the hCG α subunit consists of 92 amino acids (numbered 1 to 94 in SEQ ID NO 10). The mature hCG α subunit according to SEQ ID NO 10 is preferably contained in the medicament according to the invention.
Enthält das Arzneimittel zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen, Fertilitäts- Störungen bzw. Autoimmunerkrankungen und zur Induktion einer immunologischen Toleranz neben einer hCG ß-Untereinheit zusätzlich die αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 bzw. SEQ ID NO 10 oder glycan-behaftete Oligopeptid-Fragmente davon, liegen bevorzugt äquimolare Mengen von ßhCG-Untereinheiten und αCG-Untereinheiten vor. Besteht das Arzneimittel beispielsweise aus der hCG ß-Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID NO 1 und der α-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9, so enthält das erfindungsgemäße Arzneimittel bevorzugt äquimolare Mengen der hCG ß-Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID NO 1 und der α-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9. Enthält das Arzneimittel zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen verschiedene Formen der ßhCG-Untereinheit, wie ßhCG ß6 und/oder ß7, so enthält das Arzneimittel bevorzugt eine αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 bzw. SEQ ID NO 10 bzw. Fragmente davon pro im Arzneimittel vorliegender ßhCG-Untereinheit bzw. pro im Arzneimittel vorliegender Fragmente von hCGß-Untereinheiten. Enthält das Arzneimittel z. B. die hCG ß-Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID No 1 und ein Fragment der hCG ß- Untereinheit ß5 als hCGß-Untereinheiten, so enthält das Arzneimittel zusätzlich so viele αCG- Untereinheiten gemäß SEQ ID NO 9 bzw. SEQ ID NO 10 bzw. glycan-behaftete Oligopeptid- Fragmenten von αCG-Unterheiten, dass jede ßhCG-Untereinheit bzw. jedes Fragment einer ßhCG-Untereinheit mit einer αCG-Untereinheit bzw. mit dem Fragment einer α-Untereinheit ein Heterodimer ausbilden kann.Contains the drug for the treatment of pregnancy disorders, fertility disorders or autoimmune diseases and induction of immunological tolerance in addition to a hCG β subunit additionally the αCG subunit of human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 9 or SEQ ID NO 10 or glycan-linked oligopeptide Fragments thereof are preferably equimolar amounts of βhCG subunits and αCG subunits. If the medicament consists, for example, of the hCG β subunit β6 according to SEQ ID NO 1 and the α subunit of the human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 9, the medicament according to the invention preferably contains equimolar amounts of the hCG β subunit β6 according to SEQ ID NO 1 and the α subunit of human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 9. If the medicament for the treatment of pregnancy disorders contains various forms of the βhCG subunit, such as βhCG β6 and / or β7, the medicament preferably contains an αCG subunit of the human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 9 or SEQ ID NO 10 or fragments thereof per in the drug present βhCG subunit or pro-drug fragments of hCGβ subunits. Contains the drug z. B. the hCG ß subunit ß6 according to SEQ ID No 1 and a fragment of the hCG ß subunit ß5 as hCGß subunits, the drug also contains as many αCG subunits according to SEQ ID NO 9 and SEQ ID NO 10 and Glycated oligopeptide fragments of αCG subunits, that each ßhCG subunit or each fragment of a βhCG subunit with an αCG subunit or with the fragment of an α subunit can form a heterodimer.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Untereinheiten des humanen Choriongonadotropins umfassen dabei beispielsweise aus natürlichen Quellen isolierte Choriongonadotropine, rekombinant hergestellte Formen sowie degiykosyliert, nicht-glykosylierte, modifiziert glykosylierte und andere Formen. Die im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthaltene ßhCG- Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID 1 , SEQ ID NO 2 bzw. SEQ ID NO 3 bzw. SEQ ID NO 4 oder die ßhCG-Untereinheit ß7 gemäß SEQ ID NO 5 bzw. SEQ ID NO 6 sowie die ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ßδ gemäß SEQ ID NO 7 bzw. SEQ ID NO 8 des humanen Choriongonadotropins bzw. die glycan-behaftete Oligopeptid-Fragmente davon sind bevorzugt rekombinant hergestellt. Sind zusätzlich die αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 bzw. SEQ ID NO 10 oder Fragmente davon im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten, so sind diese bevorzugt ebenfalls rekombinant hergestellt.The subunits of human chorionic gonadotropin used according to the invention include, for example, chorionic gonadotropins isolated from natural sources, recombinantly produced forms, as well as deglycosylated, non-glycosylated, modified glycosylated and other forms. The ßhCG subunit ß6 contained in the medicament of the invention according to SEQ ID 1, SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 3 or SEQ ID NO 4 or the ßhCG subunit ß7 according to SEQ ID NO 5 or SEQ ID NO 6 and the ßhCG Subunits β5, β3 and βδ according to SEQ ID NO 7 or SEQ ID NO 8 of the human chorionic gonadotropin or the glycan-linked oligopeptide fragments thereof are preferably prepared recombinantly. If, in addition, the αCG subunit of the human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 9 or SEQ ID NO 10 or fragments thereof are present in the medicament according to the invention, then these are preferably also prepared recombinantly.
Die gentechnische Herstellung von humanen Gonadotropinen ist als Standardmethode für das rekombinante FSH und das trophoblastäre hCG beschrieben. Dabei werden geeignete Zellen (wie z. B. Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters - CHO-Zellen) mit geklonten ßhCG- und αhCG-DNA-Sequenzen transfiziert und das von diesen Zellen hergestellte Protein isoliert. Für die gentechnische Herstellung werden bisher eukaryontische Zelllinien, wie z. B. Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters - CHO-Zellen, Insektenzelllinien, für die Expression des Proteins bevorzugt.Genetic engineering of human gonadotropins is described as the standard method for recombinant FSH and trophoblastic hCG. Here, suitable cells (such as, for example, Chinese hamster ovary cells - CHO cells) are transfected with cloned βhCG and αhCG DNA sequences, and the protein produced by these cells is isolated. For genetic engineering so far eukaryotic cell lines such. For example, Chinese hamster ovary cells - CHO cells, insect cell lines, are preferred for expression of the protein.
Vorzugsweise werden für die Expression Säugetier-Epithelzelllinien, bevorzugt menschliche Epithelzelllinien, besonders bevorzugt des Endometriums oder der Dezidua, verwendet. Wegen seiner komplexen Struktur sollte die Integrität des hCG-Moleküls in der Isolation der αCG- und ß-hCG-DNA-Fragmente gewährleistet sein. Serin-O- und Asparagin-N-gebundene Glykosaccharid-Seitenketten (Glycane), und gegebenfalls auch Disulfidbrückenbindungen, garantieren die biologische Aktivität des hCG.Preferably, mammalian epithelial cell lines, preferably human epithelial cell lines, more preferably endometrial or decidual, are used for expression. Because of its complex structure, the integrity of the hCG molecule should be ensured in the isolation of the αCG and β-hCG DNA fragments. Serine-O- and asparagine-N-linked glycoside side chains (glycans), and optionally also disulfide bonds, guarantee the biological activity of the hCG.
In bisher unveröffentlichten Western Blot-Untersuchungen zum endometrialen hCG (Fig. 9) können wir mehrere glykosylierte und partiell deglykosylierte ßhCG-Molekülformen analog dem trophoblastären resp. plazentaren hCG der Schwangerschaft nachweisen. Vergleichbar zu dem plazentaren hCG-Pattern von 56, 44, 38 und 35 kDa für das glykosylierte und partiell deglykosylierte αß-dimere hCG und von 32, 29, 24, 21 und 17 kDa für das glykosylierte und partiell deglykosylierte ßhCG konnten wir im Western Blot erstmals auch die identischen molekulare hCG-Formen endometrialer Herkunft nachweisen. Differente molekulare Formen des glykosylierten αCG von 24 und 21 kDa wurden ebenso für das Endometrium gefunden.In hitherto unpublished Western Blot investigations on the endometrial hCG (FIG. 9), we can identify several glycosylated and partially deglycosylated βhCG molecular forms analogous to the trophoblastic resp. evidence of placental hCG pregnancy. Similar to the placental hCG pattern of 56, 44, 38 and 35 kDa for the glycosylated and partially deglycosylated αβ-dimeric hCG and of 32, 29, 24, 21 and 17 kDa for the glycosylated and partially deglycosylated βhCG we were able to detect in Western blot For the first time, the identical molecular hCG forms of endometrial origin can be detected. Differentiated molecular forms of the glycosylated αCG of 24 and 21 kDa were also found for the endometrium.
Die alpha-Untereinheit (α-hCG, αCG) ist bevorzugt an den Aminosäuren Asn-52 und/oder Asn- 78 der reifen, maturen Aminosäuresequenz (SEQ ID NO 10) bzw. Asn-76 und/oder Asn-102 des Präkursors (SEQ ID NO 9) N-glykosyliert und bildet N-Glycanketten mit spezifischen Zuckerrest-Anteilen aus.The alpha subunit (α-hCG, αCG) is preferably present on the amino acids Asn-52 and / or Asn-78 of the mature, mature amino acid sequence (SEQ ID NO 10) or Asn-76 and / or Asn-102 of the precursor ( SEQ ID NO 9) N-glycosylated and forms N-glycan chains with specific sugar residue portions.
Die maturen (reifen) endometrialen oder dezidualen beta-Untereinheiten hCG ß6 (SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4) und hCG ß7 (SEQ ID NO 6) sind bevorzugt an den Aminosäuren Asn-13 und/oder Asn-30 N-glykosyliert und bevorzugt an mindestens einer der CTP-Positionen Ser- 121 , Ser-127, Ser-132 und SeM 38 O-glykosyliert.The mature (mature) endometrial or decidual beta subunits hCG β6 (SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4) and hCG β7 (SEQ ID NO 6) are preferably N-glycosylated on the amino acids Asn-13 and / or Asn-30 and preferably at least one of the CTP positions Ser-121, Ser-127, Ser-132 and SeM 38 O-glycosylated.
Die Präkursor-hCG ß-Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2 oder ß7 gemäß SEQ ID NO 5 ist bevorzugt an mindestens einer der folgenden Aminosäuren Asn-33, Asn-50 n- glykosidisch und/oder Ser-141 , SeM 47, SeM 52, SeM 58 o-glykosidisch glykolisidiert.The precursor hCG β subunit β6 according to SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2 or β7 according to SEQ ID NO 5 is preferably on at least one of the following amino acids Asn-33, Asn-50 n-glycosidic and / or Ser-141, SeM 47, SeM 52, SeM 58 glycosidically glycosidated.
Die (bis zu) zwei Asn-N-Glycanketten der αhCG- und ß6- oder ß7-hCG-Untereinheit sind bevorzugt drei- bis zweiantennig und tri-, di-, mono- oder non-sialinysiert. Die Asn-N- Glycanketten enthalten jeweils bevorzugt 2 bis 15, besonders bevorzugt 4 bis 10 Zuckerreste, bevorzugt mit absteigenden Anteil NAc-Glucosamin, Sialinsäure, Galactose, Mannose.The (up to) two Asn-N-glycan chains of the αhCG and β6 or β7-hCG subunits are preferably three- to two-membered and tri-, di-, mono- or non-sialylated. The Asn-N-glycan chains each contain preferably 2 to 15, more preferably 4 to 10, sugar residues, preferably with a descending fraction of NAc-glucosamine, sialic acid, galactose, mannose.
Die (bis zu) vier Ser-O-Glycanketten der CTP-Region in der ß6- oder ß7-hCG-Untereinheit enthalten bevorzugt vier- bis zweiantennige und stärker sialinysierte 2 bis 10 Zuckerreste, besonders bevorzugt 4 bis 8 Zuckerreste, bevorzugt mit absteigendem Anteil Sialinsäure, NAc- Galactosamin, Galactose, Mannose, Fucose.The (up to) four Ser-O-glycan chains of the CTP region in the β6 or β7 hCG subunit preferably contain four to two-branched and more strongly sialylated 2 to 10 sugar residues, particularly preferably 4 to 8 sugar residues, preferably with decreasing proportion of sialic acid, NAc-galactosamine, galactose, mannose, fucose.
Die reife, mature alpha-Untereinheit αhCG enthält besonders bevorzugt 3 Disulfidbrücken- bindungen zwischen den Cysteinpaaren AS 10-60, AS 28-82 und AS 59-87 sowie weitere 2 bevorzugte SH-Brücken zwischen AS 7-31 und AS 32-84.The mature, mature alpha subunit αhCG particularly preferably contains 3 disulfide bridge bonds between the cysteine pairs AS 10-60, AS 28-82 and AS 59-87 as well as further 2 preferred SH bridges between AS 7-31 and AS 32-84.
Die reife, mature beta-Untereinheit ß6- oder ß7-hCG- enthält besonders bevorzugt 2 Disulfid- brückenbindungen zwischen den Cysteinpaaren AS 9-57 und AS 38-90 sowie weiteren 4 bevorzugten SH- Brücken zwischen AS 23-72, AS 26-110, AS 34-88 und AS 93-100.The mature, mature beta-subunit ß6- or ß7-hCG contains particularly preferably 2 disulfide bridge bonds between the cysteine pairs AS 9-57 and AS 38-90 and further 4 preferred SH bridges between AS 23-72, AS 26-110 , AS 34-88 and AS 93-100.
Die bevorzugten Disulfidbrückenbindungen im dimeren hCG sind für die Ausbildung der typischen Cysteinknotenstruktur verantwortlich, die sich in einer Reihe von Cysteinknoten- proteinen analog wiederfindet. Andererseits zeigen geänderte Bedingungen der SH-Brücken- bildung im hCG nur geringe Änderungen der biologischen Aktivität.The preferred disulfide bonds in dimeric hCG are responsible for the formation of the typical cysteine knot structure, which is analogous to a number of cysteine knot proteins. On the other hand, altered conditions of SH bridging in hCG show only minor changes in biological activity.
In bisher unveröffentlichten Primärzelllkultur-Untersuchungen zeigte sich sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene, daß in Endometriumzellkultur die epitheliale Bildung der ßhCG- und αCG-Untereinheiten durch Mediatoren wie Oestradiol, Progesteron, hCG, LPS undTh2-Cytokine induziert und durch Inhibitoren wie Th1-Cytokine, Cycloheximid und Actinomycin D vermindert werden kann. Das bedeutet für Herstellung von dimeren epithelialem hCG mit der beta-Untereinheit hCG ß6 oder hCG ß7, daß für diesen Prozeß bevorzugt Epithelzellen des sekretorisch transformierten Endometriums verwendet oder epitheliale Endometrium-Zelllinien eingesetzt werden, die zur sekretorischen Transformation befähigt sind. Epitheliale Endometrium-Zelllinien kanzerogener Herkunft sind zumeist auszuschließen oder müssen überprüft werden, keine zusätzliche beta-Untereinheit hCG ß5, ßδ und ß3 zu exprimieren.In previously unpublished primary cell culture studies, it has been shown at both the transcriptional and translational level that in endometrial cell culture epithelial formation of the βhCG and αCG subunits is induced by mediators such as estradiol, progesterone, hCG, LPS and Th2 cytokines, and by inhibitors such as Th1 cytokines, cycloheximide and actinomycin D can be reduced. That is, for production of dimeric epithelial hCG having the beta subunit hCGβ6 or hCGβ7, epithelial cells of the secretory transformed endometrium are preferably used for this process, or epithelial endometrial cell lines capable of secretory transformation are used. Epithelial endometrial cell lines of carcinogenic origin are usually excluded or must be checked to express no additional beta-subunit hCG ß5, ß and ß3.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel wird beispielsweise durch Injektion verabreicht. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Arzneimittels ist so angepasst, dass die parenterale Verabreichung des Arzneimittel ermöglicht wird. Dazu wird bevorzugt das Präkursor- oder mature hCG mit der Subunit hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 5 oder SEQ ID NO 6 oder des Präkursor- oder maturen hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 4 oder glycan- behaftete Oligopeptid-Fragmente davon in einer Injektionslösung gelöst und in eine Fertigspritze überführt. Bevorzugt werden zusätzlich der Präkursor der αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 oder die mature αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 10 oder glycan-behaftete Oligopeptid-Fragmente davon verabreicht.The medicament of the invention is administered by injection, for example. A particularly preferred embodiment of the medicament is adapted to allow parenteral administration of the drug. For this purpose, preference is given to the precursor or mature hCG having the subunit hCG β7 according to SEQ ID NO 5 or SEQ ID NO 6 or the precursor or mature hCG β6 according to SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 4 or glycan-afflicted oligopeptide fragments thereof dissolved in an injection solution and transferred to a pre-filled syringe. In addition, the precursor of the αCG subunit of the human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 9 or the mature αCG subunit of the human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 10 or glycan-linked oligopeptide fragments thereof are preferably additionally administered.
Das Arzneimittel wird z.B. subkutan, intramuskulär, intraamnial, sublingual, intrathekal oder intravenös verabreicht. Unter Notfallbedingungen ist dabei die intravenöse Verabreichung bevorzugt. Im Fall einer Störung der frühen Schwangerschaft wie z.B. bei Implantationsstörungen, frühen Schwangerschaftsverlusten, imminentem oder habituellem Abort erfolgt die Verabreichung des Arzneimittels bevorzugt durch subkutane Injektion.The drug is e.g. administered subcutaneously, intramuscularly, intraamnically, sublingually, intrathecally or intravenously. Under emergency conditions, intravenous administration is preferred. In the case of a disorder of early pregnancy, e.g. In case of implantation disorders, early pregnancy loss, or imminent or habitual abortion, administration of the drug is preferably by subcutaneous injection.
Die zu verabreichende endometriale hCG-Dosis ist vom Krankheitszustand und dem speziellen zu behandelnden Patienten abhängt. Bevorzugt ist das Arzneimittel so angepasst, dass die Menge an verabreichtem humanem Choriongonadotropin 1 bis 10 μg, besondes bevorzugt 3 bis 6 μg, pro kg Körpergewicht pro Tag beträgt. Bevorzugte Einzeldosen sind 50 μg bis 1000 μg des beschriebenen hCG.The dose of endometrial hCG to be administered depends on the condition of the disease and the particular patient to be treated. Preferably, the drug is adapted so that the amount of human chorionic gonadotropin administered is 1 to 10 μg, more preferably 3 to 6 μg, per kg of body weight per day. Preferred unit doses are 50 μg to 1000 μg of the described hCG.
Zur parenteralen Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels werden beispielsweise 250 Mikrogramm des maturen hCG gebildet aus einer endometrialen ß-Untereinheit (ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder des maturen hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4) und einer α- Untereinheit (SEQ ID NO 9 oder SEQ ID NO 10) in 0,5 ml einer Injektionslösung gelöst und in eine Fertigspritze überführt.For parenteral administration of the medicament according to the invention, for example, 250 micrograms of the mature hCG are formed from an endometrial β subunit (β7 according to SEQ ID NO 6 or the mature hCG β6 according to SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 4) and an α subunit (SEQ ID NO 9 or SEQ ID NO 10) dissolved in 0.5 ml of an injection solution and transferred to a pre-filled syringe.
Die Erfindung betrifft weiter eine Methode zur Behandlung von Fertilitäts- und Schwangerschaftsstörungen oder zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder Transplatationsprozessen bei der eine Präkursor-hCG ß- Untereinheit des humanen Choriongonadotropins ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2, hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 5 oder eine mature hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4, hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder glycan-behaftete Oligopeptid-Fragmenten dieser Sequenzen einem Patienten verabreicht wird.The invention further relates to a method for the treatment of fertility and pregnancy disorders or for the induction of immunological tolerance in patients with autoimmune diseases or transplantation processes in which a precursor hCG β subunit of the human chorionic gonadotropin selected from hCG β6 according to SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2, hCG β7 according to SEQ ID NO 5 or a mature hCG β subunit selected from hCG β6 according to SEQ ID NO 3 or SEQ ID NO 4, hCG β7 according to SEQ ID NO 6 or glycan-afflicted oligopeptide fragments of these sequences administered to a patient becomes.
Bevorzugt werden zusätzlich der Präkursor der αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 oder die mature αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 10 oder glycanbehaftete Oligopeptid-Fragmente davon verabreicht. Bevorzugt beträgt die Menge an verabreichtem humanem Choriongonadotropin 1 bis 10 μg, besonders bevorzugt 3 bis 6 μg, jeweils pro kg Körpergewicht pro Tag. Bevorzugte Einzeldosen sind 50 μg bis 1000 μg hCG.In addition, the precursor of the αCG subunit of the human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 9 or the mature αCG subunit of the human chorionic gonadotropin according to SEQ ID NO 10 or glycan-afflicted oligopeptide fragments thereof are preferably additionally administered. Preferably, the amount of human chorionic gonadotropin administered is 1 to 10 μg, more preferably 3 to 6 μg, each per kg of body weight per day. Preferred single doses are 50 μg to 1000 μg hCG.
Die Injektionen mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel erfolgen bei einer drohenden Frühgeburt, bei Präeklampsie oder bei intrauteriner Wachstumsretardierung beispielsweise täglich, im Falle einer drohenden Frühgeburt mit Beginn regelmäßiger Wehen. Nach Abklingen der Wehen erfolgt die Injektion mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel in Abständen von 2 bis 4 Tagen.The injections with the medicament according to the invention take place in the case of imminent premature birth, in preeclampsia or in intrauterine growth retardation, for example daily, in the case of imminent premature birth with the onset of regular labor. After the contractions have subsided, the injection with the medicament according to the invention takes place at intervals of 2 to 4 days.
Im Falle eines akuten Wehenbeginns bei fortgeschrittener Eröffnung des Muttermundes ist die Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels durch intravenöse Infusion bevorzugt. Hierbei wird das Proteindimer - hCG ß7/α oder hCGß6/α (mature hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder des mature hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4 mit hCG α SEQ ID NO 9 oder 10) - in einer Infusionslösung gelöst und über einen Zeitraum von bevorzugt vier Stunden verabreicht. Bevorzugte Dosis: 500 μg bis 1500 μg, vorzugsweise 1000 μg hCG ß7/α oder hCGß6/α in 500 ml Infusionslösung.In the case of an acute onset of labor in advanced opening of the cervix, the administration of the medicament according to the invention by intravenous infusion is preferred. Here, the protein dimer - hCG ß7 / α or hCGß6 / α (mature hCG ß7 according to SEQ ID NO 6 or mature hCG ß6 according to SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 4 with hCG α SEQ ID NO 9 or 10) - in one Dissolved solution and administered over a period of preferably four hours. Preferred dose: 500 μg to 1500 μg, preferably 1000 μg hCG β7 / α or hCGβ6 / α in 500 ml infusion solution.
Alternativ erfolgt die Injektion von hCG ß7/α oder hCGß6/α intramnial. Bevorzugte Dosis: 500 μg bis 1500 μg, vorzugsweise 1000 μg hCG ß7/α oder hCGß6/αAlternatively, the injection of hCG ß7 / α or hCGß6 / α is intramnial. Preferred dose: 500 μg to 1500 μg, preferably 1000 μg hCG β7 / α or hCGβ6 / α
Zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Transplantationspatienten werden dem Patienten bevorzugt mononukleäre Zellen entnommen, mit den oben genannten hCG-Formen in vitro inkubiert und danach wieder subkutan, intravenös oder lokal an den jeweiligen Patienten zurückgegeben. Bei diesem Schritt werden die mononukleären Zellen (vor allem Monozyten, NK-Zellen und T-Zellen) in ihren Eigenschaften so verändert, daß sie eine Immuntoleranz bewirken.For the treatment of autoimmune diseases and the induction of immunological tolerance in transplant patients, the patient preferably mononuclear cells are removed, incubated with the above hCG forms in vitro and then returned subcutaneously, intravenously or locally to the respective patient. In this step, the mononuclear cells (especially monocytes, NK cells and T cells) are changed in their properties so that they cause an immune tolerance.
Dabei induziert die Inkubation von mononukleären Zellen mit hCG in vitro die Bildung und Sekretion von hCG in diesen Zellen. Dieser Effekt läßt sich hauptsächlich bei Monozyten und NK-Zellen nachweisen. Eine systemische hCG-Gabe wirkt ebenfalls über diesen Effekt.Incubation of mononuclear cells with hCG in vitro induces the formation and secretion of hCG in these cells. This effect is mainly found in monocytes and NK cells. Systemic hCG administration also has this effect.
Eine Aufrechterhaltung dieser Immunität kann durch intravenöse und lokale Applikation der oben genannten hCG-Formen oder deren Fragmente erzielt werden. Durch die lokale hCG- Applikation (Ort der Transplantation, Gelenkspalt, Blase, Darm, Haut, Liquor) in Form von Injektion, Instillation, Cremes, Sprays oder Kapseln wird der chemotaktische Effekt des hCG auf die mononukleären Zellen, die eine Immuntoleranz induzieren, ausgenutzt. Herstellungsverfahren: Nach dem Stand der Technik erfolgte die Herstellung eines rekombinanten trophoblastären hCG in einer Kultur von Ovarzellinien des chinesischen Hamsters (CHO)-Zellen wie CHO-DUKX Fibroblastzellen, COS-7 Zellen oder weitere in der Literatur beschriebene CHO-Zelllinien (Chappel et al. 1992, Matzuk et al. 1989, Garcia- Campayo et al. 2002, Birken et al. 2003). Dabei wurden das αGen wie die ßGene des Trophoblast transfiziert.Maintaining this immunity can be achieved by intravenous and local administration of the above hCG forms or fragments thereof. By local application of hCG (site of transplantation, joint space, bladder, intestine, skin, cerebrospinal fluid) in the form of injection, instillation, creams, sprays or capsules, the chemotactic effect of hCG on mononuclear cells inducing immune tolerance is exploited , Method of Preparation: The prior art has produced a recombinant trophoblastic hCG in a culture of Chinese hamster ovary (CHO) cell lines, such as CHO-DUKX fibroblast cells, COS-7 cells, or other CHO cell lines described in the literature (Chappel et al 1992, Matzuk et al., 1989, Garcia-Campayo et al., 2002, Birken et al., 2003). The αGen as the ßGene of the trophoblast were transfected.
Die Erfinder haben festgestellt, das sich die Glykolisierung des nach dem Stand des Technik produzierten rekombinanten hCG nachteilig von dem natürlicherweise im menschlichen Endometrium und Dezidua exprimierten hCG unterscheidet. Die Glykolisierung des hCG hat sich als erstaunlich epithelspezifisch erwiesen. Wobei die Glyklosierung starke Auswirkungen auf die Spezifität und die biologische Aktivität des hCG hat.The inventors have found that glycation of the recombinant hCG produced by the prior art is disadvantageously different from hCG naturally expressed in human endometrium and decidua. Glycolation of hCG has been shown to be astonishingly epithelial-specific. Glycation has strong effects on the specificity and biological activity of hCG.
Ebenso konnten die Erfinder erstmals durch Sequenzanalyse die exakte ßhCG-Nukieotidfolge des Exon 1 und Exon 2 aufführen, die im gesunden sekretorisch transformierten Endometrium und der Dezidua des Menschen als RNA hCG ß7 oder hCG ß6 oder hCG ß7+ß6 exprimiert (s. SEQ ID No. 11 bis 13).The inventors were also able for the first time by sequence analysis to list the exact βhCG nucleotide sequence of exon 1 and exon 2, which expresses in the healthy secretory transformed endometrium and the decidua of humans as RNA hCG β7 or hCG β6 or hCG β7 + β6 (see SEQ ID No 11 to 13).
Die Erfindung betrifft daher weiter ein Verfahren zur Herstellung von humanem hCG mit den Untereinheiten α-Choriongonadotropin (αCG) und ß-humanem Choriongonadotropin (ßhCG) in isolierten humanen Epithelzellen oder Epithelzelllinien endometrialen oder dezidualen Ursprungs. Vorzugsweise besteht dabei die exprimierte ß-Untereinheit aus ßhCG ß6 und/oder ßhCG p7.The invention therefore further relates to a method for the production of human hCG with the subunits α-chorionic gonadotropin (αCG) and β-human chorionic gonadotropin (βhCG) in isolated human epithelial cells or epithelial cell lines of endometrial or decidual origin. Preferably, the expressed β-subunit consists of βhCG β6 and / or βhCG p7.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren hat mit der Zielstellung des Einsatzes natürlicher oder artifizieller menschlicher Epithelzellen gegenüber bisher den Vorteil der Produktion eines epithelspezifischen hCG-Sekretionsproduktes mit epithelspezifischen Giykosylierung, die im humanen Epithel ausgeprägter ist. Sie vermeidet zudem die Nachteile, die nach dem Stand der Technik dadurch entstanden, dass das hCG bisher in einer Säugetierzellkultur ohne unmittelbaren Bezug zum natürlichen humanen, epithelspezifischen Glykolysierungsprogramm hergestellt wurde.The production process according to the invention, with the aim of using natural or artificial human epithelial cells, has hitherto had the advantage of producing an epithelium-specific hCG secretion product with epithelium-specific glycosylation, which is more pronounced in the human epithelium. It also avoids the disadvantages which have arisen in the prior art in that the hCG has hitherto been produced in a mammalian cell culture without direct reference to the natural human epithelium-specific glycosylation program.
Die isolierten endometrialen und dezidualen Epithelzellen sind bevorzugt Zelllinien humanen Ursprungs. Abgeleitete endometriale Epithelzelllinien oder Epithelzelllinien mit zusätzlicher Transfektion von ßhCG Genen ß6 und ß7 und/oder weiteren ßhCG Genen (ß5, ß3, ß8, ß1 , ß2) und/oder von Genen zur Giykosylierung des Hormones sind hierbei ausdrücklich einbezogen. Die Epithelzellen werden bevorzugt aus nativem endometrialen Gewebe gewonnen. Vorteilhaft weist das in diesen Zellen exprimierte hCG, das oben erwähnte bevorzugte Glykolisierungsmuster und die oben erwähnten Disulfidbrücken auf.The isolated endometrial and decidual epithelial cells are preferably cell lines of human origin. Derived endometrial epithelial cell lines or epithelial cell lines with additional transfection of ßhCG genes ß6 and ß7 and / or other ßhCG genes (ß5, ß3, ß8, ß1, ß2) and / or of genes for Giykosylierung of the hormone are hereby expressly included. The epithelial cells are preferably obtained from native endometrial tissue. Advantageously, the hCG expressed in these cells has the above-mentioned preferred glycation pattern and the above-mentioned disulfide bridges.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird es daher möglich ein hCG bereitzustellen, dessen Glykolisierung, Faltung und Disulfidbrücken den natürlichen Gegebenheiten entsprechen.With the method according to the invention, it is therefore possible to provide an hCG whose glycation, folding and disulfide bridges correspond to natural conditions.
Weitere Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Arzneimittels werden nachfolgend genannt:Further fields of application of the medicament according to the invention are mentioned below:
Zur Behandlung einer Sepsis werden bevorzugt täglich hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) infundiert. Bevorzugte Dosis: 500 bis 1000 μg/d hCG. Virus-bedingte Karzinome und Sarkome werden systemisch und lokal mit Dosen von bevorzugt 1000 μg/d behandelt.For the treatment of sepsis, daily hCG (composed of α-CG and β6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides) is preferably infused. Preferred dose: 500 to 1000 μg / d hCG. Virus-related carcinomas and sarcomas are treated systemically and locally with doses of preferably 1000 μg / d.
Zur Verwendung zur Kontrazeption (Schwangerschaftsverhütung) wird hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) subkutan injiziert bzw. sublingual appliziert. Bevorzugte Dosis: täglich 10 μg hCG. Alternativ wird das hCG in Stäbchen aus Polymeren subcutan oder Ringe aus Polymeren intravaginal apppliziert. Die Stäbchen oder Ringe bestehen bevorzugt aus Polyethylen-co-vinylacetat und setzen bevorzugt täglich 2, 5 bis 20, vorzugsweise 4 bis 7,5 μg hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) freiFor use in contraception (pregnancy prevention), hCG (composed of α-CG and β6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides) is subcutaneously injected or administered sublingually. Preferred dose: daily 10 μg hCG. Alternatively, the hCG is subcutaneously implanted into polymer rods or polymer rings are intravaginally appplied. The rods or rings are preferably made of polyethylene-co-vinyl acetate and preferably daily 2, 5 to 20, preferably 4 to 7.5 ug hCG (composed of α-CG and ß6 / 7-hCG) free
Zur Prophylaxe einer HIV Infektion werden hCG-haltige Gels und Cremes, die hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) in einer Konzentration von bevorzugt 1% enthalten, eingesetzt.To prevent HIV infection, hCG-containing gels and creams containing hCG (composed of α-CG and β6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides) are used in a concentration of preferably 1%.
Zur Behandlung schwerer Gewebsischämien wie bei Apoplexie, Herzinfarkt oder schweren postpartalen Hirnödeme Neugeborener wird hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt infundiert bzw. bei Verbrennungen lokal in Form von Sprays aufgebracht. Bevorzugte Dosis: täglich 500 bis 1000 μg.For the treatment of severe tissue ischemia, such as in apoplexy, myocardial infarction or severe postpartum cerebral edema of newborns, hCG (composed of α-CG and β6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides) is preferably infused or, in the case of burns, applied locally in the form of sprays. Preferred dose: daily 500 to 1000 μg.
Zur Behandlung und Prophylaxe einer allergischen-entzündlichen Reaktionen der oberen Luftwege (Heuschnupfen, Asthma bronchiale) wird hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt in Form eines Spray (alternativ einer Creme bzw. Gel) verwendet. Bevorzugte Dosis: täglich 50 bis 100 μg.For the treatment and prophylaxis of an allergic-inflammatory reactions of the upper respiratory tract (hay fever, bronchial asthma) is hCG (composed of α-CG and ß6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides) preferably in the form of a spray (alternatively a cream or gel ) used. Preferred dose: daily 50 to 100 μg.
Zur Behandlung der Benignen Prostathyperplasie (BPH) wird hCG (zusammengesetzt aus α- CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt sublingual verordnet. Bevorzugte Dosis: zweimal täglich 0,5 μg Behandlung von Autoimmunerkrankung des Auges: Bei Autoimmunuveitis werden bevorzugt im 4 bis 7-tägigen Abstand eine Lösung zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden enthält injekziert. Bevorzugte Dosis: 0,5ml mit 10μg/ml hCG. Diese Therapie kann auch bei einer therapieresistenten Glaukomtherapie bzw. bei Gefahr der Abstoßung eines Hornhauttransplantates verordnet werden.For the treatment of benign prostatic hyperplasia (BPH), hCG (composed of α-CG and β6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides) is preferably administered sublingually. Preferred dose: 0.5 μg twice daily Treatment of Autoimmune Disease of the Eye: In autoimmune uveitis, a solution composed of α-CG and β6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides is preferably injected at intervals of 4 to 7 days. Preferred dose: 0.5ml with 10μg / ml hCG. This therapy can also be prescribed for therapy-resistant glaucoma therapy or at risk of rejection of a cornea transplant.
Bei Patienten mit Multipler Sklerose werden wöchentlich hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt intrathekal instilliert. Bevorzugte Dosis: 2 ml in einer Konzentration von 10 μg / mlIn patients with multiple sclerosis weekly hCG (composed of α-CG and ß6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides) is preferably instilled intrathecally. Preferred dose: 2 ml at a concentration of 10 μg / ml
Behandlung von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa: Perorale Gabe von hCG zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden in eine Biomembrankapsel, die erst im Dünn- bzw. Dickdarm hCG freisetzen, bevorzugt in einer Konzentration von 5μg/ml.Treatment of Crohn's disease and ulcerative colitis: peroral administration of hCG composed of α-CG and β6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides into a biomembrane capsule, which release hCG in the small or large intestine, preferably at a concentration of 5 μg / ml.
Zur Transplantation von autologen und/oder xenogenen Inselzellen werden diese bevorzugt vor der Transplantation für vorzugsweise 24 bis 72 Stunden 48 Stunden in einer hCG-Emulsion mit 2μg/ml hCG stimuliert und anschließend intravenös injiziert. Alternativ werden autologe oder xenogene Inselzellen in eine hCG freisetzende Biomembranen vorzugsweise zusammengesetzt aus einem biologisch abbaubaren Polymer, wie Poly(s-caprolactone) (PCL) eingekapselt und so implantiert.For transplantation of autologous and / or xenogeneic islet cells, these are preferably stimulated for 48 to 48 hours in an hCG emulsion containing 2 μg / ml hCG prior to transplantation and then injected intravenously. Alternatively, autologous or xenogeneic islet cells are encapsulated in a hCG-releasing biomembrane, preferably composed of a biodegradable polymer, such as poly (s-caprolactone) (PCL), and so implanted.
Zur Behandlung von Behandlung der interstitiellen Cystitis und von chronischen Cystitiden erfolgt bevorzugt die Einlage eines biologisch abbaubaren Implantates, vorzugsweise aus Poly(ε-caprolactone) (PCL), in Form eines Stiftes bei chronischer Blasenentzündung bzw. einer Interstitiellen Cystitis, der kontinuierlich hCG freigibt.For the treatment of interstitial cystitis and chronic cystitis, it is preferable to incorporate a biodegradable implant, preferably poly (ε-caprolactone) (PCL), in the form of a pencil in chronic cystitis or interstitial cystitis, which continuously releases hCG.
Behandlung bei HIV Infektion: Bei ausgeprägtem T-Zellabfall im Rahmen einer HIV Infektion werden hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt intravenös injiziert. Die Verabreichung erfolgt bevorzugt täglich über 2 Wochen. Bevorzugte Dosis: 1000 μg/ml. Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert. Dabei zeigen die Abbildungen weitgehende Analogien und spezifische Unterschiede in der molekularen Organisationsstruktur der plazentaren und endometrialen hCG-Bildung. Untersuchungen zur Genexpression, Sequenzanalyse, Hormonbestimmungen im Gewebe, molekularem Nachweis mit spezifischen hCG-Antikörpern (Western Blot) und mit immunhistochemischen Methoden bestätigen die zyklusabhängige hCG-Bildung im gesunden sekretorischen Endometrium.Treatment with HIV infection: In the case of pronounced T cell degeneration in the context of HIV infection, hCG (composed of α-CG and β6 / 7-hCG or the glycosylated oligopeptides) are preferably injected intravenously. Administration is preferably daily for 2 weeks. Preferred dose: 1000 μg / ml. Reference to the following figures and embodiments, the invention will be explained in more detail. The illustrations show extensive analogies and specific differences in the molecular organization of placental and endometrial hCG formation. Studies on gene expression, sequence analysis, tissue hormonal determinations, molecular detection with specific hCG antibodies (Western Blot) and immunohistochemical methods confirm cycle-dependent hCG formation in the healthy secretory endometrium.
Fig. 1: Organisation der ßhCG Gene ß5, ßδ und ß3 sowie der ßhCG Gene ß6 und ß7FIG. 1: Organization of the βhCG genes β5, βδ and β3 as well as the βhCG genes β6 and β7
Fig. 2: Genexpression und Nukleotidsequenz der mRNA von ßhCG Gene ß5, ß6 und ß7 und von ßl_H Gen ß4 in Verbindung zur kodierten Aminosäuresequenz Fig. 3: Lokalisation unterschiedlicher Nukleotidsequenzen der ßhCG mRNA von Gen ß5, ß6 und ß7 in Exon 1 , 2 und 3FIG. 2: Gene expression and nucleotide sequence of the mRNA of βhCG genes β5, β6 and β7 and of β1_H gene β4 in conjunction with the encoded amino acid sequence FIG. 3: Localization of different nucleotide sequences of the βhCG mRNA of gene β5, β6 and β7 in exons 1, 2 and 3
Fig. 4: Genexpression von ßhCG und αCG nach RT-PCR im sekretorischen Endometrium Fig. 5: Zyklusabhängigkeit der endometrialen Genexpression von ßhCG Fig. 6: (A) Sequenzanalyse des Transkripts der endometrialem Genexpression ßhCG ß6Fig. 4: Gene expression of βhCG and αCG after RT-PCR in the secretory endometrium Fig. 5: Cycle dependence of the endometrial gene expression of βhCG Fig. 6: (A) Sequence analysis of the transcript of endometrial gene expression βhCG β6
(B) Sequenzanalyse des Transkripts der endometrialen Genexpression ßhCG ß7(B) Sequence analysis of the transcript of endometrial gene expression βhCG β7
(C) Sequenzanalyse des Transkripts der endometrialen Genexpression ßhCG ß6 und ßhCG ß7(C) Sequence analysis of the transcript of endometrial gene expression βhCGβ6 and βhCGβ7
Fig. 7: Konzentrationsbestimmung des endometrialen hCG im Endometriumhomogenat Fig. 8: Western Biot-Untersuchung zur molekularen Struktur und zur Glykolisierung des plazentaren und endometrialen hCG mitFIG. 7: Determination of the concentration of the endometrial hCG in the endometrium homogenate FIG. 8: Western biot examination for the molecular structure and for the glycolization of the placental and endometrial hCG with. FIG
(A1B) polyklonalem hCG- und CTP-hCG-Antikörper(A 1 B) polyclonal hCG and CTP hCG antibodies
(C1D) monoklonalem ßhCG-Antikörper(C 1 D) monoclonal βhCG antibody
(E1F) monoklonalem αCG-Antikörper(E 1 F) monoclonal αCG antibody
Fig. 9: Western Blot-Untersuchungen zur Unterscheidung zwischen ßhCG endometrialen (ß7, ß6) und trophoblastären (ß5) UrsprungsFig. 9: Western blot studies to distinguish between βhCG endometrial (β7, β6) and trophoblastic (β5) origin
Die Organisation der ßhCG plazentaren Gene ß5, ßδ und ß3 sowie der endometrialen Gene ß6 und ß7 ist in Fig. 1 dargestellt. Die Gene der ßhCG-Untereinheit bestehen aus jeweils drei Exons und zwei dazwischenliegenden Introns. Exon 1 beinhaltet die Promotorsequenz, die beiden Strukturgene Exon 2 und Exon 3 einschließlich des C-terminalen Peptids (CTP) kodieren die reife (mature) ßhCG-Untereinheit mit 145 Aminosäuren (aa). Das ßhCG-Gen wird von bp -366 im Exon 1 (Transkriptionsstart, ***) über bp +1 im Exon 1 (Translationsstart, Tr) bis zum bp +495 im CTP des Exon 3 exprimiert. Das Exon 1 überstreicht den bp-Bereich von -366 bis +15, das Exon 2 von +16 bis +183 und das Exon 3 von +184 bis +495. Vier intron- überspannende ßhCG-Primerpaare mit den resultierenden Amplikons von 548, 423, 378 und 300 bp bestätigen die full-length ßhCG-Genexpression.The organization of the βhCG placental genes β5, βδ and β3 as well as the endometrial genes β6 and β7 is shown in FIG. The genes of the βhCG subunit consist of three exons and two intervening introns. Exon 1 contains the promoter sequence, the both structural genes exon 2 and exon 3 including the C-terminal peptide (CTP) encode the mature (145h) βhCG subunit (aa). The βhCG gene is expressed from bp -366 in exon 1 (transcriptional start, ***) via bp +1 in exon 1 (translation start, Tr) to bp +495 in the CTP of exon 3. Exon 1 covers the bp range from -366 to +15, exon 2 from +16 to +183, and exon 3 from +184 to +545. Four intron-spanning βhCG primer pairs with the resulting amplicons of 548, 423, 378, and 300 bp confirm full-length βhCG gene expression.
Die ßhCG Gene ß1 und ß2 enthalten eine Punktmutation in der Donor Splice Site des ersten Introns. Eine aus alternativem Splicing von Intron 1 resultierende mRNA kodiert Proteine von 132 Aminosäuren, deren Sequenzen jedoch keinerlei Ähnlichkeit zu den Aminosäuresequenzen der anderen ßhCGs aufweisen (Policastro et al. 1983; Talmadge et al. 1984; Bo and Boime 1992).The βhCG genes β1 and β2 contain a point mutation in the donor splice site of the first intron. An mRNA resulting from alternative splicing of intron 1 encodes proteins of 132 amino acids, but their sequences are not similar to the amino acid sequences of the other βhCGs (Policastro et al 1983, Talmadge et al 1984, Bo and Boime 1992).
In Fig. 2 sind die differierenden Nukleotidsequenzen des plazentaren ßhCG Gene ß5 (CG5) den epithelialen ßhCG Genen ß6 und ß7 (CG6, CG7) und dem ßl_H Gen ß4 (LH4) sowie den ermittelten Endometriumsequenzen (Endo) gegenübergestellt. Ebenso sind die zugehörigen unterschiedlichen Aminosäuresequenzen im Proteinmolekül aufgeführt. Die mRNA der ßhCG- Gene umfaßt den Nukleotidbereich von - 366 bis +495 bp, die Nukleotide von +1 bis +496 bp kodieren das Prähormon (ßhCG precursor) mit 165 Aminosäuren, die Nukleotide von +60 bis +495 bp kodieren die reife (mature) ß-Untereinheit mit 145 Aminosäuren. In der Tabelle steht M in der Endometrium-Sequenz für C oder A, R für G oder A und S für G oder C. Der Start des Exon 1 ist mit *** , des Exon 2 mit ** und des Exon 3 mit * markiert.2, the differing nucleotide sequences of the placental βhCG genes β5 (CG5) are compared with the epithelial βhCG genes β6 and β7 (CG6, CG7) and β1_H gene β4 (LH4) as well as the determined endometrial sequences (endo). Likewise, the associated different amino acid sequences are listed in the protein molecule. The mRNA of the βhCG genes covers the nucleotide range from - 366 to +495 bp, the nucleotides from +1 to +496 bp encode the prehormone (βhCG precursor) with 165 amino acids, the nucleotides from +60 to +46 to +5 bp encode the mature ( mature) β-subunit with 145 amino acids. In the table M in the endometrial sequence is C or A, R is G or A and S is G or C. The start of exon 1 is indicated by * ** , exon 2 by ** and exon 3 by * marked.
Fig. 3 zeigt die Unterschiede in den Nukleotidsequenzen der Exons 1 (bp -358 bis -21 , n=25), Exon 2 (bp +65 bis +71 , n=3) und Exon 3 (bp +410, n=1). Promotorgen und die Strukturgene insgesamt unterscheiden sich zwischen den Genen hCG ß5 und hCG ß7 in 27 Nukleotidpositionen, das hCG Gen ß7 unterscheidet sich von hCG ß6 in zehn Nukleotidpositionen. Die Nukleotidsequenzen der hCG-Untereinheiten ß3, ß5 und ßδ im Promotorgen zeigen mehrere Differenzen, die Aminosäuresequenzen der Prähormon- und maturen hCG-Untereinheiten ß3, ß5 und ß8 sind aber identisch. Die Zählung der bp-Nummern in Fig. 3 bezieht sich jeweils auf den Transkriptionsstart oder Translationsstart.Figure 3 shows the differences in the nucleotide sequences of exons 1 (bp -358 to -21, n = 25), exon 2 (bp +65 to +71, n = 3) and exon 3 (bp + 410, n = 1) ). Promoter genes and the structural genes as a whole differ between the genes hCG ß5 and hCG ß7 in 27 nucleotide positions, the hCG gene ß7 differs from hCG ß6 in ten nucleotide positions. The nucleotide sequences of the hCG subunits β3, β5 and βδ in the promoter gene show several differences, but the amino acid sequences of the prehormone and mature hCG subunits β3, β5 and β8 are identical. The count of the bp numbers in Fig. 3 refers to the transcription start or translation start, respectively.
Wie aus Tabelle 1 und der vorangegangenen Figur hervorgeht, unterscheidet sich die resultierende Aminosäuresequenz des plazentaren hCG trotz seiner vielfältigen ßhCG ß5, ßδ, ß3-Untereinheitenstruktur nicht. Für das endometriale hCG mit seinen ßhCG ß7 und ß6- Untereinheiten sind neben der Aminosäure +117 im C-terminalen Bereich jedoch noch weitere Aminosäuren im N-terminaien Bereich zum plazentaren hCG verändert.As can be seen from Table 1 and the previous figure, the resulting amino acid sequence of the placental hCG does not differ despite its diverse βhCGβ5, βδ, β3 subunit structure. For the endometrial hCG with its ßhCG ß7 and ß6- Subunits are in addition to the amino acid +117 in the C-terminal region, however, further amino acids in the N-terminal region to the placental hCG changed.
Diese Untereinheiten αCG und ßhCG, exprimiert von unterschiedlichen Genen, kombinieren intrazellulär bald nach Proteinsynthese im endoplasmatischen Retikulum und erfahren post- translatorische Modifikationen in die spezifische, biologisch aktive heterodimere Form (Disulfidbrückenbindungen und Glykosylierung im endoplasmatischen Retikulum, Hetero- dimerisierung, seat belt - Konfiguration und Prähormonspaltung im Golgiapparat). Die resultierenden Aminosäuresequenzen der maturen hCG ß7-Untereinheit und der hCG ß3, ß5, ß8-Untereinheit unterscheiden sich in den Aminosäurepositionen +2 (Arginin/Lysin), +4 (Methionin/Prolin) und +117 (Alanin/Aspartat), die der hCG ß6- wie der hCG ß7- mit der hCG ß5-Untereinheit ebenso in der Aminosäureposition +117 (Alanin/Aspartat) und die der hCG ß6- und der hCG ß7-Untereinheit noch in den Aminosäure-Position +2 (Lysin/Arginin) und +4 (Prolin/Methionin). Zudem kann in Position +2 für hCG ß6 ein Arginin mit der Nukleotidfolge AGG dargestellt werden (b). Die Differenzen der Aminosäuresequenz sind in Tab.1 zusammengestellt.These subunits αCG and βhCG expressed from different genes combine intracellularly soon after protein synthesis in the endoplasmic reticulum and undergo post translational modifications into the specific, biologically active heterodimeric form (disulfide bonds and glycosylation in the endoplasmic reticulum, heterodimerization, seat belt configuration and Prehormone cleavage in the Golgi apparatus). The resulting amino acid sequences of the mature hCG β7 subunit and the hCG β3, β5, β8 subunits differ in the amino acid positions +2 (arginine / lysine), +4 (methionine / proline) and +117 (alanine / aspartate), which are the hCG β6- like the hCG β7- with the hCG β5 subunit also in the amino acid position +117 (alanine / aspartate) and those of the hCG β6 and hCG β7 subunits still in the amino acid position +2 (lysine / arginine) and +4 (proline / methionine). In addition, an arginine with the nucleotide sequence AGG can be displayed in position +2 for hCG β6 (b). The differences in the amino acid sequence are summarized in Tab.1.
Tabelle 1:Table 1:
AS-Position hCG ßδ hCG ß7 hCG ß6AS position hCG βδ hCG β7 hCG β6
+ 2 Lys Arg Lys oder Arg+ 2 Lys Arg Lys or Arg
+ 4 Pro Met Pro+ 4 Pro Met Pro
+ 117 Asp AIa AIa+ 117 Asp AIa AIa
In der Fig.4 können wir mit unseren Laborergebnissen erstmals nachweisen, daß im normalen sekretorischen Endometrium gesunder Frauen epitheliales hCG exprimiert wird. Die Genexpression des sekretorischen Endometriums umfaßt sowohl die αCG-Untereinheit als auch die full-length RNA der ßhCG-Untereinheit von Exon 1 bis Exon 3 einschließlich des CTP- Anteils.In Fig. 4 we can demonstrate for the first time with our laboratory results that in the normal secretory endometrium of healthy women epithelial hCG is expressed. Gene expression of the secretory endometrium includes both the αCG subunit and the full length RNA of the βhCG subunit from exon 1 to exon 3, including the CTP moiety.
Aus Gewebeproben des Endometriums und der Plazenta als Kontrolle wurde RNA durch Trizol- Extraktion isoliert und mittels semi-quantitativer RT-PCR mit Primerpaaren, die spezifisch ßhCG (A-D in Fig. 4), αhCG (E, F in Fig. 4) und GAPDH (G in Fig. 4) erkennen, analysiert. Dafür wurden die in der Tabelle 2 aufgeführten Primerpaare in einer RT-PCR unter Standardbedingungen eingesetzt: Tabelle 2: r. Gen Primer Exon Strand Primersequenz bp Nr. location Amp- Pair- licon* edFrom tissue samples of the endometrium and placenta as controls, RNA was isolated by trizol extraction and by semi-quantitative RT-PCR with primer pairs specific to βhCG (AD in Figure 4), αhCG (E, F in Figure 4) and GAPDH (G in Fig. 4) recognize, analyzed. For this purpose, the primer pairs listed in Table 2 were used in an RT-PCR under standard conditions: Table 2: r. Gene primer exon beach primer sequence bp no. Location Amp- Pair- licon * ed
1 ßhCG -353 / -337 1 sense 5'-TCGGGTCACGGCCTCCT-3' 548 41 βhCG -353 / -337 1 sense 5'-TCGGGTCACGGCCTCCT-3 '548 4
2 ßhCG -228 / -209 1 sense 5'-TCACTTCACCGTGGTCTCCG-3' 423 42 βhCG -228 / -209 1 sense 5'-TCACTTCACCGTGGTCTCCG-3 '423 4
3 ßhCG 108 / 127 2 sense δ'-GGCTGTGGAGAAGGAGGGCT-S' 5,63 βhCG 108/127 2 sense δ'-GGCTGTGGAGAAGGAGGGCT-S '5,6
4 ßhCG 197 / 178 2,3 anti-s. 5'-CAGCACGCGGGTCATGGT-3' 1.24 βhCG 197/178 2,3 anti-s. 5'-CAGCACGCGGGTCATGGT-3 '1.2
5 ßhCG 406 / 384 3 anti-s. 5'-GAAGCGGGGGTCATCACAGGTC-3I 300 35 ßhCG 406/384 3 anti-s. 5'-GAAGCGGGGGTCATCACAGGTC-3 I 300 3
6 ßhCG 484 / 468 3 anti-s. 5'-TCGGGGTGTCCGAGGGC-3I 378 36 ßhCG 484/468 3 anti-s. 5'-TCGGGGTGTCCGAGGGC-3 I 378 3
7 αhCG 83 / 102 sense δ'-TGCAGGATTGCCCAGAATGC-S' 231 87 αhCG 83/102 sense δ'-TGCAGGATTGCCCAGAATGC-S '231 8
8 αhCG 313 / 294 anti-s. 51-CCGTGTGGTTCTCCACTTTG-3I 78 αhCG 313/294 anti-s. 5 1 -CCGTGTGGTTCTCCACTTTG-3 I 7
99
GAPDH 335 / 352 sense 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-31 196 10 0GAPDH 335/352 sense 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3 1 196 10 0
GAPDH 530 / 510 anti-s. 5'-CCAAAGTTGTCATGGATGACC-3' 9GAPDH 530/510 anti-s. 5'-CCAAAGTTGTCATGGATGACC-3 '9
Die Basenpaarlänge der durch die RT-PCR amplifizierte DNA-Produkte sind in bp an-gegeben. Die Primer sind mit den SEQ ID 15 bis 24 im beiliegenden Sequenzprotokoll enthalten. Die spezifischen ßhCG-Primer amplifizierten keine ßLH-mRNA.The base pair length of the DNA products amplified by the RT-PCR are indicated in bp. The primers are included with SEQ ID 15 to 24 in the attached Sequence Listing. The specific βhCG primers did not amplify βLH mRNA.
In Fig. 4 sind die Ergebnisse der RT-PCR für 4 Gewebeproben des Endometriums in den Bahnen 3 bis 6 („endometrium") und in Bahn 8 als Kontrolle eine Gewebeprobe einer "early gestation" Plazenta („plac") gezeigt. In Bahn 1 ist zur Größenbestimmung eine DNA-Leiter als Standard („stand.") aufgetragen. In Bahn 2 wurde eine Negativkontrolle (ohne Primer, ohne RNA) aufgetragen.In Fig. 4 the results of the RT-PCR for 4 tissue samples of the endometrium in lanes 3 to 6 ("endometrium") and in lane 8 as control a tissue sample of an "early gestation" placenta ("plac") are shown. A DNA ladder is applied as standard ("stand.") In lane 1. In lane 2, a negative control (without primer, without RNA) was applied.
In Fig. 4 A kamen die ßhCG spezifischen Primer 1 und 4 der Tabelle 2 zum Einsatz. Der Vergleich mit der DNA-Leiter zeigt, dass die amplifizierte DNA die erwartete Länge von 548 bp aufweist. In Fig. 4 B kamen die ßhCG spezifischen Primer 2 und 4 der Tabelle 2 zum Einsatz. Der Vergleich mit der DNA-Leiter zeigt, dass die amplifizierte DNA die erwartete Länge von 423 bp aufweist. In Fig. 4 C kamen die ßhCG spezifischen Primer 3 und 6 der Tabelle 2 zum Einsatz. Die amplifizierte DNA weist die erwartete Länge von 378 bp. In Fig. 4 D kamen die ßhCG spezifischen Primer 3 und 5 der Tabelle 2 zum Einsatz. Die amplifizierte DNA weist die erwartete Länge von 300 bp auf. In Fig. 4E und Fig. 4F kamen die αCG spezifischen Primer 7 und 8 zum Einsatz. Das DNA-Produkt weist in Fig. E die erwartete Länge von 231 bp auf. Ohne Revertase im cDNA-Ansatz (- RTase) bleibt die Reaktion aus, d.h. ist RNA und nicht etwa endogene DNA.In Fig. 4 A, the βhCG specific primers 1 and 4 of Table 2 were used. The comparison with the DNA ladder shows that the amplified DNA has the expected length of 548 bp. In Fig. 4B, the βhCG specific primers 2 and 4 of Table 2 were used. The comparison with the DNA ladder shows that the amplified DNA has the expected length of 423 bp. In Fig. 4C, the βhCG specific primers 3 and 6 of Table 2 were used. The amplified DNA has the expected length of 378 bp. In Fig. 4 D, the βhCG specific primers 3 and 5 of Table 2 were used. The amplified DNA has the expected length of 300 bp. The αCG-specific primers 7 were obtained in FIGS. 4E and 4F and 8 are used. The DNA product in Fig. E has the expected length of 231 bp. Without revertase in the cDNA approach (- RTase), the reaction remains, ie, is RNA and not about endogenous DNA.
In Fig. 4 E kamen als Kontrolle und für eine semiquantitative Bestimmung weiterhin die GAPDH- spezifische Primer 9 und 10 der Tabelle 2 zum Einsatz. Der Vergleich mit der DNA- Leiter zeigt, dass die amplifizierte DNA die erwartete Länge von 196 bp aufweist. Die Ergebnisse zeigen, dass ßhCG and αhCG mRNA in der sekretorischen Phase von gesundem Endometrium in etwa gleicher Konzentration wie die Plazenta exprimiert werden.In FIG. 4E, the GAPDH-specific primers 9 and 10 of Table 2 were used as a control and for a semiquantitative determination. The comparison with the DNA ladder shows that the amplified DNA has the expected length of 196 bp. The results show that βhCG and αhCG mRNA are expressed in the secretory phase of healthy endometrium at approximately the same concentration as the placenta.
Die Fig. 5 zeigt, daß die ßhCG mRNA Expression abhängig vom Differenzierungsgrad der sekretorischen Transformation des Endometriums ist. Die Endometriumbiopsien wurden stets nach diagnostischer Curettage von erfahrenen Pathologen als ein zyklusgerecht und als ein normales Gewebe der proliferativen Phase bis zur späten sekretorischen Phase bewertet. Die endometriale RNA wurde extrahiert und durch RT-PCR halbquantitativ zur korrespondierenden GAPDH-Amplifikation bestimmt. Für die Messungen wurden Patientinnen der proliferativen (P, n=22), frühen sekretorischen (ES, n=28), mittleren sekretorischen (MS, n=26) und späten sekretorischen (LS, n=15) Phase des menstruellen Zyklus ausgewählt. Es erfolgte ein optische densitometrische Auswertung (± SEM).FIG. 5 shows that the βhCG mRNA expression is dependent on the degree of differentiation of the secretory transformation of the endometrium. The endometrial biopsies have always been evaluated by diagnostic pathologists as a cycle fit and normal proliferative phase tissue to the late secretory phase after diagnostic curettage. The endometrial RNA was extracted and semi-quantitatively determined by RT-PCR for the corresponding GAPDH amplification. For the measurements, patients were selected from the proliferative (P, n = 22), early secretory (ES, n = 28), middle secretory (MS, n = 26) and late secretory (LS, n = 15) phase of the menstrual cycle. An optical densitometric evaluation (± SEM) was carried out.
In Fig. 6 sind die Ergebnisse der Sequenzanalyse zur Bestätigung der Genexpression von ßhCG mRNA im sekretorischen Endometrium dargestellt. Die verwendeten cDNA-Amplifikate wurden nach RNA-Extraktion des endometrialen Gewebes und nach RT-PCR unter Standardbedingungen für die Sequenzierung eingesetzt. In Fig. 6 A ist nach Sequenzierung des ßhCG-Amplifikates eine Nukleotidsequenz für ßhCG ß6, in Fig. 6 B eine Nukleotid-sequenz für ßhCG ß7 und in Fig. 6 C eine Nukleotidsequenz für ßhCG ß7 mit ßhCG ß6 dargestellt. Die Sequenzfolgen bestätigen in hoher Genauigkeit die in Tab. 2 zusammen-gestellten Nukleotidsequenzen für die Expression der endometrialen ßhCG ß7- und ßhCG ß6-Untereinheit. Die ermittelte Nukleotidsequenz basiert auf der Kenntnis des für die Untersuchungen eingesetzte cDNA-Amplifikates mit 548 bp über das Exon 1 und Exon 3. Mit diesen Ergebnissen wird zum ersten Mal eine mRNA-Sequenz für die Expression einer endometrialen ßhCG-Untereinheit vorgestellt.FIG. 6 shows the results of the sequence analysis for confirming the gene expression of βhCG mRNA in the secretory endometrium. The cDNA amplicons used were used after RNA extraction of the endometrial tissue and after RT-PCR under standard conditions for sequencing. In FIG. 6A, after sequencing of the βhCG amplificate, a nucleotide sequence for βhCGβ6, in FIG. 6B a nucleotide sequence for βhCGβ7, and in FIG. 6C a nucleotide sequence for βhCGβ7 with βhCββ6 are shown. The sequence sequences confirm in high accuracy the nucleotide sequences assembled in Table 2 for the expression of the endometrial βhCGβ7 and βhCGβ6 subunits. The determined nucleotide sequence is based on the knowledge of the cDNA amplificate used for the studies with 548 bp on the exon 1 and exon 3. With these results, an mRNA sequence for the expression of an endometrial βhCG subunit is presented for the first time.
Neben der endometrialen Transkription der beiden ßhCG-Untereiheiten können wir hier auch die Translation die Translation des endometrialen hCG bestätigen. Die Konzentrationen des endometrialen hCG werden in Endometriumhomogenaten zyklusabhängug erfaßt. In Fig. 7 sind die Hormonkonzentrationen von Total-hCG/ßhCG, freier ßhCG-Untereinheit und von LH in Endometriumhomogenaten dargestellt worden. Die Hormonkonzentrationen wurden im Überstand von etwa 100 mg Gewebe pro ml Puffer gemessen. Die Gewebeproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten des menstruellen Zyklus erhalten und für den die Untersuchungen eingesetzt (proliferate, n=19; early secretory, n=24; mid secretory, n=23; late secretory, n=10; ± SEM). Das endometriale hCG steigt mit der sekretorischen Transformation auf Werte um 60 mU/ml, während LH bei basalen Werten verbleibt und die freie ßhCG- Untereinheit nur in geringem Maß ansteigt,In addition to the endometrial transcription of the two βhCG subunits, we can also confirm the translation of the endometrial hCG here. The concentrations of the endometrial hCG are detected cycle-dependent in endometrial homogenates. Figure 7 shows the hormone concentrations of total hCG / βhCG, free βhCG subunit and LH in endometrial homogenates. The hormone concentrations were measured in the supernatant of about 100 mg of tissue per ml of buffer. Tissue samples were obtained at various times in the menstrual cycle and the studies used for them (proliferate, n = 19, early secretory, n = 24, mid secretory, n = 23, late secretory, n = 10, ± SEM). The endometrial hCG increases with the secretory transformation to values around 60 mU / ml, while LH remains at basal levels and the free βhCG subunit increases only slightly,
Unter dem Gesichtspunkt der endometrialen Translation eines epithelialen hCG stellen wir hier in Fig. 8 erstmals Ergebnisse zur SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese und zu Western Blot- Untersuchungen in Homogenaten des normalen sekretorischen Endometriums vor. Die jeweils vier Bahnen der Endometriumproben (lane 4-8) werden verglichen mit kommerziellen gereinigten hCG Präparationen oder αCG- und ßhCG-Untereinheiten (lane 1-3) und einen Schwangerschaftsserum des ersten Schwangerschaftstrimesters.From the point of view of the endometrial translation of an epithelial hCG we present here for the first time in FIG. 8 results for SDS-polyacrylamide electrophoresis and for Western blot investigations in homogenates of the normal secretory endometrium. The four lanes of endometrial samples (lanes 4-8) are compared to commercial purified hCG preparations or αCG and βhCG subunits (lane 1-3) and a gestational serum of the first trimester of pregnancy.
In der Fig. 8 AB werden die Blots mit einem polyklonalen hCG-Antikörper (Dako) und einem polyklonalen CTP-h CG-Antikörper (Biotrend) als Primärantikörper behandelt. In der Fig. 8 CD werden die Blots mit einem monoklonalen ßhCG-Antikörper (INN22) unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen behandelt. In der Fig. 8 EF werden die Blots mit einem monoklonalen αCG-Antikörper (INN 132) unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen behandelt.In FIG. 8 AB, the blots are treated with a polyclonal hCG antibody (Dako) and a polyclonal CTP-h CG antibody (Biotrend) as the primary antibody. In Fig. 8 CD, the blots are treated with a monoclonal βhCG antibody (INN22) under reducing or non-reducing conditions. In Fig. 8 EF, the blots are treated with an αCG monoclonal antibody (INN 132) under reducing or non-reducing conditions.
Die endometrialen Gewebeproben zeigen prädominante ßhCG-Untereinheitenbanden von etwa 31 kDa oder 29 kDa und αCG-Untereinheitenbanden von 24 kDa oder 21 kDa wie auch αßhCG Dimer-Banden von 44 kDa, 38 kDa und 35 kDa oder weitere ßhCG Monomer-Banden von 24 kDa, 21 kDa, 17 kDa und 15 kDa, abhängig vom Desialysierungs- oder De- glxkolysierungsfrad,The endometrial tissue samples display predominantly βhCG subunit bands of about 31 kDa or 29 kDa and αGK subunit bands of 24 kDa or 21 kDa as well as αβhCG dimer bands of 44 kDa, 38 kDa and 35 kDa or other 24 kDa βhCG monomer bands. 21 kDa, 17 kDa and 15 kDa, depending on the degree of desialylation or dex- glolyzation,
Zusätzlich werden hier bisher unveröffentlichte Laborergebnisse des Western Blots in Gewebehomogenaten mehrerer sekretorisch transformierter Endometriumproben zyklusgesunder Frauen vorgestellt, die mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen unterschiedlich glykosylierte und partiell deglykosylierte molekulare Formen des dimeren αßhCG und der αCG- und ßhCG-Untereinheit im Vergleich zum plazentaren hCG beweisen (Fig. 8). Eigens entwickelte genspezifische ßhCG-Antikö rper für den alternativen Nachweis des hCG ß7- und ß5-Dimers belegen im Western Blot den genauen Nachweis über den endometrialen oder plazentaren (trophoblastären) Ursprung (Fig. 9).In addition, hitherto unpublished laboratory results of the Western blot are presented in tissue homogenates of several secretory transformed endometrial samples of healthy women with polyclonal and monoclonal antibodies under reducing and non-reducing conditions differently glycosylated and partially deglycosylated molecular forms of the dimeric αßhCG and αCG and ßhCG subunit compared to placental hCG (Figure 8). Specially developed gene-specific βhCG antibodies for the alternative detection of the hCG β7 and β5 dimers show in the Western blot the exact detection of the endometrial or placental (trophoblastic) origin (FIG. 9).
Auch Immunhistochemisch ist mit den hCG-, ßhCG- und αCG-spezifischen Antikörpern die zyklusabhängige epitheliale hCG-Sekretion im endometrialen Drüsen- und Luminalepithelium der gesunden Frau an Gewebeschnitten vor allem der mittleren und späten Sekretions-phase besonders eindeutig zu belegen.Immunohistochemically, the hCG-, ßhCG- and αCG-specific antibodies also show the cycle-dependent epithelial hCG secretion in the endometrial glandular and luminal epithelium of the healthy woman on tissue sections, especially the middle and late secretory phase.
Ausführungsbeispiel 1 : Gentechnische Herstellung von rekombinantem hCGExemplary Embodiment 1: Genetic Engineering of Recombinant hCG
(angelehnt an Loumaye et al. 1995 ; Howles 1996 ; Matzuk et al. 1989 ; Garcia-Campayo et al. 2003 ; Birken et . 2003 )(based on Loumaye et al 1995, Howles 1996, Matzuk et al 1989, Garcia-Campayo et al 2003, Birken et al 2003)
A. Präparation von humaner DNA:A. Preparation of Human DNA:
Isolation und Charakterisierung des gesamten ßhCG-Gens (Promotorgen Exon 1 , Struktur-gene Exon 2 und Exon 3 einschließlich der Introns) für die ßhCG-Gene ß6 und ß7, die für das Präkursor- und mature Reifetranskript codieren. Isolation und Charakterisierung des gesamten αCG (hCG α)-Gens, das für das Präkursor- und mature Reifetranskript codiert.Isolation and characterization of the entire βhCG gene (promoter gene exon 1, structural gene exon 2 and exon 3 including the introns) for the βhCG genes β6 and β7, which encode the precursor and mature mature transcript. Isolation and characterization of the entire αCG (hCG α) gene coding for the precursor and mature maturity transcript.
B. Insertion der ßhCG- und αCG-DNA in einen Vektor (Plasmidkonstruktion)B. Insertion of the βhCG and αCG DNA into a Vector (Plasmid Construction)
Verwendung eines TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen oder alternativ des pGEM-T Vektorsystem Promega) unter Hersteller-Anweisung je für hCG ß6, hCG ß7 und hCG α (SEQ ID NO 11 bis SEQ ID NO 13 und SEQ ID NO 15) und Insertion in den Expressionsvektor. Die eingeschleusten DNA werden mit der DNA-Sequenz von Dehydrofolsäurereduktase (DHFR) kombiniert, die für die Synthese