EP1951287A2 - Arzneimittel zur behandlung von fertilitäts- und schwangerschaftsstörungen, autoimmunerkrankungen und zur induktion einer immunologischen toleranz bei transplantationspatienten und verfahren zur herstellung - Google Patents

Arzneimittel zur behandlung von fertilitäts- und schwangerschaftsstörungen, autoimmunerkrankungen und zur induktion einer immunologischen toleranz bei transplantationspatienten und verfahren zur herstellung

Info

Publication number
EP1951287A2
EP1951287A2 EP06805531A EP06805531A EP1951287A2 EP 1951287 A2 EP1951287 A2 EP 1951287A2 EP 06805531 A EP06805531 A EP 06805531A EP 06805531 A EP06805531 A EP 06805531A EP 1951287 A2 EP1951287 A2 EP 1951287A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hcg
seq
subunit
mature
precursor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06805531A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Henry Alexander
Gerolf Zimmermann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
VivoSensMedical GmbH
Original Assignee
Universitaet Leipzig
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to DE102005056832 priority Critical
Application filed by Universitaet Leipzig filed Critical Universitaet Leipzig
Priority to PCT/DE2006/002089 priority patent/WO2007059761A2/de
Publication of EP1951287A2 publication Critical patent/EP1951287A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22Hormones
    • A61K38/24Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen oder zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder Transplatationsprozessen. Dieses enthält mindestens je eine beta6 oder beta7 Präkursor- oder mature Unteinheit des endometrialen oder dezidualen Präkursor- oder mature Unteinheit humanen Choriongonadotropins (hCG), sowie eine alpha Präkursor- oder mature Unteinheit des humanen Choriongonadotropins oder oder glykolisierte Fragmente dieser Untereinheiten. Im Gegensatz zu dem trophoblastären hCG mit den Untereinheiten beta3, beta5 und beta8 ist die Funktion des im Endometrium und der Dezidua exprimierten nicht-trophoblastären hCG beta6 oder beta7 noch kaum untersucht.

Description

Arzneimittel zur Behandlung von Fertilitäts- und Schwangerschaftsstörungen, Autoimmunerkrankungen und zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Transplantationspatienten und Verfahren zur Herstellung
Die Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung von Fertilitäts- und Schwangerschaftsstörungen, Autoimmunerkrankungen und zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Transplantationspatienten zur Anwendung in der Medizin, insbesondere in der Gynäkologie bzw. Transplantationsmedizin, sowie ein Verfahren zur Herstellung.
In der Frauenheilkunde stellt die Frühgeburtlichkeit ein großes medizinisches Problem dar. Bei einer Frühgeburt endet die Schwangerschaft vor der 37. Schwangerschaftswoche (normale Schwangerschaftsdauer: 40 Wochen). In Deutschland liegt die Frühgeburtsrate bei ca. 6 bis 7%. Trotz großer Bemühungen ist es in den vergangenen Jahrzehnten nicht gelungen, die Frühgeburtsrate zu senken. Circa zwei Drittel der perinatalen Todesfälle von Neugeborenen sind auf eine Frühgeburt zurückzuführen. „Frühgeborene" haben ein Gewicht von 500 bis 2500 g. Die neonatologische Versorgung der Frühgeburten zieht sich oftmals über mehrere Monate hin und ist ein sehr kostenintensives Gebiet der Kinderheilkunde. Trotz intensivmedizinischer Versorgung tragen von den überlebenden Frühgeburten ca. 7 % Spätschäden (neurologische Schäden, körperliche und geistige Entwicklungsstörung bzw. Retardierung, Seh- bzw. Hörstörungen) davon.
Bisher gibt es keine kausale Therapie für späte Schwangerschaftsstörungen bzw. eine Frühgeburt. Bei frühen Schwangerschaftsstörungen (Fertilitätsstörungen, Implantationsstörungen, frühe Schwangerschaftsverluste, imminenter und habitueller Abort) wird zur Stützung des Gelbkörpers Progesteron verordnet. Teilweise erfolgt auch die Gabe von hCG bis zur 10. Schwangerschaftswoche. Bei dem bisher verabreichten hCG handelt es sich um trophoblastäres hCG.
Späte Schwangerschaftsstörungen (Frühgeburt, Präeklampsie, Wachstumsretardierung) behandelt man zur Zeit symptomatisch mit Progesteron, Magnesium, ß-Sympathikomimetika bzw. Antihypertonika.
Seit Jahren werden Immunsuppressiva bei Patienten mit Organtransplantation und Autoimmunerkrankungen angewendet. Dabei müssen diese Medikamente dauerhaft eingenommen werden. Diese weisen aber nicht unbeträchtliche Nebenwirkungen auf, die für eine erhöhte Morbidität und Mortalität verantwortlich sind. Deshalb ist man seit Jahren bemüht, neue Methoden und Medikamente für die Behandlung von Patienten mit Organ- transplantation und Autoimmunerkrankungen zu erarbeiten. Für eine Immuntoleranz ist außerdem der Fas-Ligand bedeutungsvoll (Fandrich F., Lin X., Klöppel G. und Kremer B., 1998; Fandrich F., Lin X, Zhu X., Parwaresch R., Kremer B. und Henne-Bruns D., 1998).
Die Hormone humanes Choriongonadotropin (hCG), LH (luteinisierendes Hormon), FSH (Follikel-stimulierendes Hormon) und TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon) bilden eine Famile von Glycoproteinhormonen. Sie bestehen aus einem nicht-kovalent verknüpften Heterodimer aus einer α-Untereinheit und einer ß-Untereinheit. Die α-Untereinheit ist bei allen vier Hormonen identisch, die ß-Untereinheiten sind unterschiedlich und definieren die endokrinen Funktionen der Heterodimere (Pierce et al. 1981 ). Die ß-Untereinheit des Chorongonadotropins unterscheidet sich von den anderen ß-Untereinheiten der Glykoproteinhormone hauptsächlich dadurch, dass sie am C-Terminus um 23 Aminosäuren - das sog. C-terminale Peptid (CTP) - verlängert ist. Die ß-Untereinheit des hCG besitzt zwei Asparagin-N-glykosidischen Seitenketten, der C-terminale Peptid(CTP)-Anteil (Aminosäuren 122 bis 145) weist vier zusätzliche Serin-O-glykosidische Oligosaccharid-Seitenketten auf.
Die α-Untereinheit des LH, FSH, TSH und des humanen Choriongonadotropins (αCG) wird von einem Gen kodiert, das auf Chromosom 6 lokalisiert ist (Chromosom 6q21.1-q 23), während die ß-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins (ßhCG) von den sechs homologen Genen hCG ß1 , ß2, ß3, ß5, ß7 und ß8 kodiert wird, die in einem Gencluster auf Chromosom 19 (Chromosom 19q13.3) neben LH ß4 lokalisiert sind (Jameson et al. 1993). Das ßhCG-Gen ß6 ist wahrscheinlich ein Allel von ß7 mit Differenzen in der nichttranslatierenden Nukleotidsequenz des Promotorgens (Exon 1) und der translatierenden Sequenz (Exon 2) der ßhCG-Untereinheit.
Während der Schwangerschaft werden im Trophoblast des frühen Embryos (ab dem 6. bis 12. Tag nach der Konzeption) und später im Syncytiotrophoblast der Plazenta größere Mengen hCG-Heterodimer und freie αCG - und ßhCG-Untereinheiten gebildet und in das Blut sezerniert. Dieses trophoblastäre Gewebe exprimiert ausschließlich die ßhCG-Untereinheiten hCG ß5, ß8 und ß3. Diese ßhCG-Untereinheiten werden daher trophoblastäres ßhCG (tßhCG) oder Typ Il - ßhCG genannt. Dieses trophoblastäre hCG bindet am Gelbkörper, der so zur Produktion und weiteren Sekretion von Progesteron angeregt wird, die zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft erforderlich ist.
Das trophoblastäre hCG wirkt wie LH an einem gemeinsamen membrangebundenen G-Protein- gekoppelten Rezeptor. Dieser wird im Epithel, Endothel und den Stromazellen des Endometriums und anderer Organe, in Lymphozyten und Makrophagen nachgewiesen (Reshef et al. 1990; Licht et al. 1993; Lin et al. 1995; Zhang et al. 2003; Licht et al. 2003). Daneben wirkt eventuell trophoblastäres ßhCG auch über Signalwege, die nicht rezeptor-vermittelt sind (Cruz et al. 1987).
Aber auch in einigen nicht-trophoblastären Geweben wird hCG-Heterodimer bzw. freie αCG - und ßhCG-Untereinheiten in geringen Mengen exprimiert (Rothman et al. 1992; Dirnhofer et al. 1996; Lei et al. 1993; Yokotani et al. 1997; Berger et al. 1994). Nicht-trophoblastäre Gewebe, wie z. B. Mamma, Lunge, Prostata, Blase und Colon, exprimieren auschließlich die ßhCG- Untereinheiten hCG ß7 / ß6. Auch im endometrialen und dezidualen Epithelium der Gebärmutter wird nicht-trophoblastäres hCG gebildet (Alexander et al. 1998b; Wolkersdorfer et al. 1998; Zimmermann et al. 2003). Die ßhCG-Untereinheiten ß7 bzw. das ß7-Allel ß6 werden daher auch als nicht-trophoblastäres oder epitheliales ßhCG oder Typ I- ßhCG bezeichnet (Bellet et al. 1997). Die Funktion des nicht-trophoblastären hCG ist aber noch kaum untersucht.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Mittel zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen, insbesondere zur Behandlung von Fertilitätsstörungen, Implantationsstörungen, frühen Schwangerschaftsverlusten, imminentem und habituellen Abort sowie von Frühgeburt, Wachstumsretardierung und Präeklampsie bereitzustellen.
Aufgabe der Erfindung ist es ebenfalls, Mittel zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen bzw. zur Induktion einer Immuntoleranz bei Transplantationspatienten anzugeben.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen, das eine Präkursor-hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 1 oder alternativ SEQ ID NO 2, aus hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 5 oder eine mature hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 3 oder alternativ SEQ ID NO 4, aus hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder Fragmente daraus enthält.
Bestandteil der Erfindung ist auch die Verwendung einer Präkursor-hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2 und hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 5 oder einer maturen hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4, hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder glycan-behaftete Oligopeptid- Fragmenten daraus zur Behandlung von Schwanger-schaftsstörungen.
Bei den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 2 handelt es sich um die beiden möglichen Formen der Aminosäuresequenzen des Präkursors der endometrialen oder dezidualen hCG ß6-Untereinheit. Der Präkursor der hCG ß6-Untereinheit besteht aus 165 Aminosäuren (in SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 2 nummeriert von 1 bis 165). Die Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 20 ist das Signalpeptid, das im Golgiapparat abgespalten wird. Die spezifische, mature Form der dezidualen hCG ß6-Untereinheit entspricht der Aminosäuresequenz von Aminosäure 21 bis Aminosäure 165, d.h. einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 3 bzw. SEQ ID NO 4.
Die spezifische, mature Form der endometrialen oder dezidualen hCG ß6-Untereinheit besteht aus 145 Aminosäuren (in SEQ ID NO 3 bzw. SEQ ID NO 4 von 1 bis 145 nummeriert). Die Aminosäuresequenz der hCG ß6-Untereinheit enthält im Unterschied zu der Aminosäuresequenz der trophoblastären hCG ß-Untereinheiten ß3, ß5 und ß8 an Aminosäureposition 117 ein Alanin statt eines Aspartates. An Position 2 der hCG ß6- Untereinheit ist ein Lysin (SEQ ID NO 3) oder ein Arginin (SEQ ID NO 4). Bevorzugt ist die mature Form der endometriaien oder dezidualen hCG ß6-Untereinheit gemäß SEQ ID NO 3 bzw. SEQ ID NO 4 und/oder der Präkursor der dezidualen hCG ß6-Untereinheit gemäß SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 2 im Arzneimittel enthalten.
Bei SEQ ID NO 5 handelt es sich um den Präkursor der Aminosäuresequenz der endometrialen oder dezidualen hCG ß7-Untereinheit. Der Präkursor der hCG ß7-Untereinheit besteht aus 165 Aminosäuren (in SEQ ID NO 5 nummeriert von 1 bis 165). Die Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 20 entspricht dem Signalpeptid, das im Golgiapparat abgespalten wird. Die spezifische, biologisch mature Form der endometrialen oder dezidualen hCG ß7-Untereinheit entspricht der Aminosäuresequenz von Aminosäure 21 bis Aminosäure 165, d.h. einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 6.
Die mature Form der endometrialen oder dezidualen hCG ß7-Untereinheit besteht aus 145 Aminosäuren (in SEQ ID NO 6 von 1 bis 145 nummeriert). Die Aminosäuresequenz der hCG ß7-Untereinheit enthält im Unterschied zu der Aminosäuresequenz der trophoblastären hCG ß- Untereinheiten ß3, ß5 und ß8 an Aminosäureposition 117 ein Alanin statt eines Aspartates. An Aminosäureposition 2 enthält sie ein Arginin statt eines Lysins, an Aminosäureposition 4 enthält sie ein Methionin statt eines Prolins.
Bevorzugt ist die mature Form der endometrialen oder dezidualen hCG ß7-Untereinheit gemäß SEQ ID NO 6 und/oder der Präkursor der dezidualen hCG ß7-Untereinheit gemäß SEQ ID NO 5 im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten. In einer besonderen Ausführungsform des Arzneimittel enthält dieses zusätzlich zu der endometrialen ß6- und/oder ß7-Einheit die trophoblastäre Untereinheit hCG ß5, hCG ß3 und hCG ß8 gemäß SEQ ID NO 7 und/oder SEQ ID NO 8
Bei SEQ ID NO 7 handelt es sich um den Präkursor der Aminosäuresequenz der tropho- blastären ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ß8. Der Präkursor der trophoblastären ßhCG- Untereinheiten ß5, ß3 und ß8 bestehen aus je 165 Aminosäuren (in SEQ ID NO 7 nummeriert von 1 bis 165). Die Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 20 entspricht dem Signaipeptid, das im Golgiapparat abgespalten wird. Die spezifischen, maturen Formen der trophoblastären ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ß8 entsprechen der Aminosäuresequenz von Aminosäure 21 bis Aminosäure 165, d.h. einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 8.
Die spezifischen, maturen Formen der trophoblastären ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ß8 bestehen aus 145 Aminosäuren (in SEQ ID NO 8 von 1 bis 145 nummeriert). Die Aminosäuresequenz der ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ß8 enthält im Unterschied zu der Aminosäuresequenz der dezidualen ßhCG-Untereinheiten ß6 und ß7 an Aminosäureposition 117 ein Aspartat statt eines Alanins. An Aminosäureposition 2 enthält sie ein Lysin, an Aminosäureposition 4 enthält sie ein Prolin.
Mit dem erfindungsgemäßen Mittel wird erstmals die Durchführung einer kausalen Therapie von Schwangerschaftsstörungen ermöglicht. Der für die Schwangerschafts-störungen ursächliche Verlust an dezidualem hCG wird durch die erfindungsgemäßen Mittel substituiert. Gleichzeitig stimuliert das zugeführte hCG die Bildung von hCG in der Dezidua, was wiederum die Gebärmuttermuskulatur ruhig stellt und die Durchblutung für die Plazenta verbessert. Somit ist die ursächliche Behandlung von Schwangerschaftsstörungen und der vorzeitige Geburtsbeginn im Sinne einer Frühgeburt möglich.
Bei den bisher in der Gynäkologie verwendeten hCG-Präparationen wird gereinigtes urinäres hCG bzw. ein gentechnisch hergestelltes rekombinantes humanes Choriogonadotropin eingesetzt. Dieses hCG besteht aus der ßhCG-Untereinheit ß5, ß8, ß3 sowie der αCG- Untereinheit und hat seinen Hauptwirkungsort am Gelbkörper (Corpus luteum) des Eierstockes. Da das Corpus luteum beim Menschen nur bis zur 10. Schwangerschaftswoche essentiell ist, wird dementsprechend nach dem Stand der Technik eine hCG-Therapie auch nur bis zur 10. Schwangerschaftswoche vorgenommen.
Humanes deziduales Choriongonadotropin, das aus der hCG ß-Untereinheit ß6 bzw. ß7 und der αCG-Untereinheit besteht, stützt zwar auch das Corpus luteum, ist aber darüber hinaus hauptsächlich für die Aufrechterhaltung der Immuntoleranz der Schwangerschaft notwendig. Die Induktion, Expression und Proteinbildung des ßhCG-Gens ß7 und/oder ß6 im endometrialen und dezidualen Drüsenepithel unterstützt die Fertilität und Schwangerschaft. Dabei erfolgt die Wirkung über verschiedene Mechanismen.
Die Schwangerschaft selbst ist ein immunologisches Paradox. Der Embryo bzw. Fetus ist ein sogenanntes „Semi-Allotransplantat", das zur Hälfte aus mütterlichen und zur Hälfte aus väterlichen Genen besteht und somit zur Hälfte „fremd" ist. Die Frucht muss bis zur Reife für 38 Wochen immunologisch toleriert werden. Dies ist ein komplexer und multifaktorieller Prozess, über dessen Mechanismen bisher nur wenig bekannt ist.
Die Gebärmutter ist ein immunprivilegierter Ort. Dabei stellt das endometriale hCG (ß6/ß7hCG und αCG) den Hauptfaktor für diese biologische Besonderheit dar, die erst eine erfolgreiche Schwangerschaft möglich macht.
hCG wirkt immunsuppressiv am Uterus. Auf diese Weise wirkt die Dezidua, die die Frucht umgibt und über die Eihäute auch das hCG in das Fruchtwasser abgibt, wie ein Schutzschild. Das hCG der Dezidua (ß6/ß7hCG und αCG) ist gleichzeitig verantwortlich für chemotaktische Attraktion von mononukleären Immunzellen, die ihrerseits eine Abstoßungsreaktion verhindern. Außerdem verbessert das deziduale hCG die Durchblutung der Gebärmutter und Plazenta.
Erst wenn die Fähigkeit zur hCG-Produktion und Sekretion durch die Dezidua am Ende der Schwangerschaft vor allem durch den abfallenden Progesteronspiegel nachlässt, wird auch die Immuntoleranz der Schwangerschaft beendet, der lokale Immunschutz wird aufgehoben, die protektiven mononukleären Zellen werden apoptotisch und die hCG-induzierte optimale Durchblutung der Dezidua und Plazenta wird vermindert. Es kommt zur Hypoxie und Nekrose der Dezidua und damit zur Bildung von Prostaglandinen sowie Oxytocin und zur Geburt. Bei Patientinnen mit Frühgeburt wird dieser Prozess durch eine Vielzahl von Störungen vorfristig ausgelöst.
Somit ist bei einem Mangel an dezidualem Choriongonadotropin dessen Substitution während der gesamten Schwangerschaft bis zur 37. Schwangerschaftswoche notwendig.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel dient der Behandlung von Schwangerschaftsstörungen. Unter Schwangerschaftsstörungen sind dabei Fertilitätsstörungen, Implantations-störungen, frühe Schwangerschaftsverluste, imminenter und habitueller Abort sowie Frühgeburt, Wachstumsretardierung und Präeklampsie zu verstehen. Insbesondere sind darunter solche Schwangerschaftsstörungen zu verstehen, die durch einen Mangel an dezidualem hCG verursacht sind.
Bei einer Fertilitätsstörung handelt es sich um eine Störung, die dadurch gekennzeichnet ist, das trotz regelmäßigen ungeschützten Geschlechtsverkehrs keine Schwangerschaft eintritt.
Eine Implantationsstörung liegt vor, wenn zwar eine Befruchtung der Eizelle erfolgt, diese sich jedoch in die Gebärmutterschleimhaut einnisten kann.
Frühe Schwangerschaftsverluste sind dadurch gekennzeichnet, dass sich ein Embryo zwar in die Gebärmutterschleimhaut einnistet, der Embryo jedoch kurz nach der Implantation abstirbt.
Ein imminenter Abort ist eine sogenannte drohende Fehlgeburt, die meist gekennzeichnet ist durch Blutungen und Unterbauchschmerzen. Während hingegen eine habituelle Abortneigung dann vorliegt, wenn eine Patientin drei- und mehrfach hintereinander eine Fehlgeburt hatte.
Eine Frühgeburt liegt vor, wenn es zwischen der 24. und 37. Schwangerschaftswoche zur Geburt kommt, bzw. wenn auch vor der 24. Schwangerschaftswoche ein Lebendes Kind geboren wird.
Bei einer intrauterinen Wachstumsretardierung ist der Fetus für sein Alter entsprechend der Schwangerschaftswoche zu klein. Dabei liegt die Abweichung des geschätzten Gewichtes um zwei Standardabweichungen unter dem Normalwert. Diese Abweichung des Größenwachstums wird nach Abmessen des Fetus mit dem Ultraschall und dem anschließenden Vergleich mit Wachstumskurven festgestellt.
Die Präeklampsie ist eine hypertensive Erkrankung in der Schwangerschaft (Schwangerschaftshypertonie). Sie beschreibt gleichzeitig das Auftreten von Ödemen und Eiweißausscheidung im Urin. In 20 Prozent der Falle kommt es zu einer Beteiligung der Leber mit Erhöhung der Transaminasen und des Bilirubins.
Mit den erfindungsgemäßen Mitteln wird auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen ermöglicht. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Mittel auch zur Induktion einer Immuntoleranz bei Transplantationspatienten geeignet.
Unter der Immuntoleranz wird das Ausbleiben einer Immunreaktion nach Gabe eines bestimmten Antigens verstanden. Die Autoimmunerkrankung ist ein Überbegriff für Krankheiten, deren Ursache in einer überschießenden Reaktion des Immunsystems gegen körpereigene Gewebe besteht. Dabei wird vom Immunsystem körpereigenes Gewebe irrtümlicherweise als zu bekämpfender Fremdkörper wahrgenommen. Dadurch kommt es zu schweren systemischen oder lokalen Entzündungsreaktionen, die zu Schäden an den betroffenen Organen führen.
hCG ist eine immunsuppressive Substanz. Deshalb kann eine hCG-Therapie in obengenannter Weise sowohl eine Immunreaktion des Körpers gegen ein Allotransplantat, d.h. gegen eine Organtransplantation von einem anderen Individuum, unterdrücken als auch eine fehlgeleitete Immunantwort gegen körpereigenes Gewebe im Rahmen einer Autoimmunerkrankung unterbinden.
Bevorzugt enthält das Arzneimittel zusätzlich den Präkursor der αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 oder die mature αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 10 oder glycan-behaftete Oligopeptid- Fragmente als Teile dieser Sequenzen.
Bei SEQ ID NO 9 handelt es sich um die Aminosäuresequenz des Präkursors der hCG α- Untereinheit (J.C.Fiddes and H. M. Goodman 1973). Der Präkursor der hCG α-Untereinheit besteht aus 116 Aminosäuren (hier nummeriert von 1 bis 116). Die Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 24 entspricht dem Signalpeptid, das im Golgiapparat abgespalten wird. Die spezifische, mature Form der hCG α-Untereinheit entspricht der Aminosäuresequenz von Aminosäure 25 bis Aminosäure 116, d.h. der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 10.
Die spezifische, mature Form der hCG α-Untereinheit besteht aus 92 Aminosäuren (in SEQ ID NO 10 von 1 bis 94 durchnummeriert). Bevorzugt ist die mature hCG α-Untereinheit gemäß der SEQ ID NO 10 im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten.
Enthält das Arzneimittel zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen, Fertilitäts- Störungen bzw. Autoimmunerkrankungen und zur Induktion einer immunologischen Toleranz neben einer hCG ß-Untereinheit zusätzlich die αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 bzw. SEQ ID NO 10 oder glycan-behaftete Oligopeptid-Fragmente davon, liegen bevorzugt äquimolare Mengen von ßhCG-Untereinheiten und αCG-Untereinheiten vor. Besteht das Arzneimittel beispielsweise aus der hCG ß-Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID NO 1 und der α-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9, so enthält das erfindungsgemäße Arzneimittel bevorzugt äquimolare Mengen der hCG ß-Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID NO 1 und der α-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9. Enthält das Arzneimittel zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen verschiedene Formen der ßhCG-Untereinheit, wie ßhCG ß6 und/oder ß7, so enthält das Arzneimittel bevorzugt eine αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 bzw. SEQ ID NO 10 bzw. Fragmente davon pro im Arzneimittel vorliegender ßhCG-Untereinheit bzw. pro im Arzneimittel vorliegender Fragmente von hCGß-Untereinheiten. Enthält das Arzneimittel z. B. die hCG ß-Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID No 1 und ein Fragment der hCG ß- Untereinheit ß5 als hCGß-Untereinheiten, so enthält das Arzneimittel zusätzlich so viele αCG- Untereinheiten gemäß SEQ ID NO 9 bzw. SEQ ID NO 10 bzw. glycan-behaftete Oligopeptid- Fragmenten von αCG-Unterheiten, dass jede ßhCG-Untereinheit bzw. jedes Fragment einer ßhCG-Untereinheit mit einer αCG-Untereinheit bzw. mit dem Fragment einer α-Untereinheit ein Heterodimer ausbilden kann.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Untereinheiten des humanen Choriongonadotropins umfassen dabei beispielsweise aus natürlichen Quellen isolierte Choriongonadotropine, rekombinant hergestellte Formen sowie degiykosyliert, nicht-glykosylierte, modifiziert glykosylierte und andere Formen. Die im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthaltene ßhCG- Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID 1 , SEQ ID NO 2 bzw. SEQ ID NO 3 bzw. SEQ ID NO 4 oder die ßhCG-Untereinheit ß7 gemäß SEQ ID NO 5 bzw. SEQ ID NO 6 sowie die ßhCG-Untereinheiten ß5, ß3 und ßδ gemäß SEQ ID NO 7 bzw. SEQ ID NO 8 des humanen Choriongonadotropins bzw. die glycan-behaftete Oligopeptid-Fragmente davon sind bevorzugt rekombinant hergestellt. Sind zusätzlich die αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 bzw. SEQ ID NO 10 oder Fragmente davon im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten, so sind diese bevorzugt ebenfalls rekombinant hergestellt.
Die gentechnische Herstellung von humanen Gonadotropinen ist als Standardmethode für das rekombinante FSH und das trophoblastäre hCG beschrieben. Dabei werden geeignete Zellen (wie z. B. Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters - CHO-Zellen) mit geklonten ßhCG- und αhCG-DNA-Sequenzen transfiziert und das von diesen Zellen hergestellte Protein isoliert. Für die gentechnische Herstellung werden bisher eukaryontische Zelllinien, wie z. B. Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters - CHO-Zellen, Insektenzelllinien, für die Expression des Proteins bevorzugt.
Vorzugsweise werden für die Expression Säugetier-Epithelzelllinien, bevorzugt menschliche Epithelzelllinien, besonders bevorzugt des Endometriums oder der Dezidua, verwendet. Wegen seiner komplexen Struktur sollte die Integrität des hCG-Moleküls in der Isolation der αCG- und ß-hCG-DNA-Fragmente gewährleistet sein. Serin-O- und Asparagin-N-gebundene Glykosaccharid-Seitenketten (Glycane), und gegebenfalls auch Disulfidbrückenbindungen, garantieren die biologische Aktivität des hCG.
In bisher unveröffentlichten Western Blot-Untersuchungen zum endometrialen hCG (Fig. 9) können wir mehrere glykosylierte und partiell deglykosylierte ßhCG-Molekülformen analog dem trophoblastären resp. plazentaren hCG der Schwangerschaft nachweisen. Vergleichbar zu dem plazentaren hCG-Pattern von 56, 44, 38 und 35 kDa für das glykosylierte und partiell deglykosylierte αß-dimere hCG und von 32, 29, 24, 21 und 17 kDa für das glykosylierte und partiell deglykosylierte ßhCG konnten wir im Western Blot erstmals auch die identischen molekulare hCG-Formen endometrialer Herkunft nachweisen. Differente molekulare Formen des glykosylierten αCG von 24 und 21 kDa wurden ebenso für das Endometrium gefunden.
Die alpha-Untereinheit (α-hCG, αCG) ist bevorzugt an den Aminosäuren Asn-52 und/oder Asn- 78 der reifen, maturen Aminosäuresequenz (SEQ ID NO 10) bzw. Asn-76 und/oder Asn-102 des Präkursors (SEQ ID NO 9) N-glykosyliert und bildet N-Glycanketten mit spezifischen Zuckerrest-Anteilen aus.
Die maturen (reifen) endometrialen oder dezidualen beta-Untereinheiten hCG ß6 (SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4) und hCG ß7 (SEQ ID NO 6) sind bevorzugt an den Aminosäuren Asn-13 und/oder Asn-30 N-glykosyliert und bevorzugt an mindestens einer der CTP-Positionen Ser- 121 , Ser-127, Ser-132 und SeM 38 O-glykosyliert.
Die Präkursor-hCG ß-Untereinheit ß6 gemäß SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2 oder ß7 gemäß SEQ ID NO 5 ist bevorzugt an mindestens einer der folgenden Aminosäuren Asn-33, Asn-50 n- glykosidisch und/oder Ser-141 , SeM 47, SeM 52, SeM 58 o-glykosidisch glykolisidiert.
Die (bis zu) zwei Asn-N-Glycanketten der αhCG- und ß6- oder ß7-hCG-Untereinheit sind bevorzugt drei- bis zweiantennig und tri-, di-, mono- oder non-sialinysiert. Die Asn-N- Glycanketten enthalten jeweils bevorzugt 2 bis 15, besonders bevorzugt 4 bis 10 Zuckerreste, bevorzugt mit absteigenden Anteil NAc-Glucosamin, Sialinsäure, Galactose, Mannose.
Die (bis zu) vier Ser-O-Glycanketten der CTP-Region in der ß6- oder ß7-hCG-Untereinheit enthalten bevorzugt vier- bis zweiantennige und stärker sialinysierte 2 bis 10 Zuckerreste, besonders bevorzugt 4 bis 8 Zuckerreste, bevorzugt mit absteigendem Anteil Sialinsäure, NAc- Galactosamin, Galactose, Mannose, Fucose.
Die reife, mature alpha-Untereinheit αhCG enthält besonders bevorzugt 3 Disulfidbrücken- bindungen zwischen den Cysteinpaaren AS 10-60, AS 28-82 und AS 59-87 sowie weitere 2 bevorzugte SH-Brücken zwischen AS 7-31 und AS 32-84.
Die reife, mature beta-Untereinheit ß6- oder ß7-hCG- enthält besonders bevorzugt 2 Disulfid- brückenbindungen zwischen den Cysteinpaaren AS 9-57 und AS 38-90 sowie weiteren 4 bevorzugten SH- Brücken zwischen AS 23-72, AS 26-110, AS 34-88 und AS 93-100.
Die bevorzugten Disulfidbrückenbindungen im dimeren hCG sind für die Ausbildung der typischen Cysteinknotenstruktur verantwortlich, die sich in einer Reihe von Cysteinknoten- proteinen analog wiederfindet. Andererseits zeigen geänderte Bedingungen der SH-Brücken- bildung im hCG nur geringe Änderungen der biologischen Aktivität.
In bisher unveröffentlichten Primärzelllkultur-Untersuchungen zeigte sich sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene, daß in Endometriumzellkultur die epitheliale Bildung der ßhCG- und αCG-Untereinheiten durch Mediatoren wie Oestradiol, Progesteron, hCG, LPS undTh2-Cytokine induziert und durch Inhibitoren wie Th1-Cytokine, Cycloheximid und Actinomycin D vermindert werden kann. Das bedeutet für Herstellung von dimeren epithelialem hCG mit der beta-Untereinheit hCG ß6 oder hCG ß7, daß für diesen Prozeß bevorzugt Epithelzellen des sekretorisch transformierten Endometriums verwendet oder epitheliale Endometrium-Zelllinien eingesetzt werden, die zur sekretorischen Transformation befähigt sind. Epitheliale Endometrium-Zelllinien kanzerogener Herkunft sind zumeist auszuschließen oder müssen überprüft werden, keine zusätzliche beta-Untereinheit hCG ß5, ßδ und ß3 zu exprimieren.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel wird beispielsweise durch Injektion verabreicht. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Arzneimittels ist so angepasst, dass die parenterale Verabreichung des Arzneimittel ermöglicht wird. Dazu wird bevorzugt das Präkursor- oder mature hCG mit der Subunit hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 5 oder SEQ ID NO 6 oder des Präkursor- oder maturen hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 4 oder glycan- behaftete Oligopeptid-Fragmente davon in einer Injektionslösung gelöst und in eine Fertigspritze überführt. Bevorzugt werden zusätzlich der Präkursor der αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 oder die mature αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 10 oder glycan-behaftete Oligopeptid-Fragmente davon verabreicht.
Das Arzneimittel wird z.B. subkutan, intramuskulär, intraamnial, sublingual, intrathekal oder intravenös verabreicht. Unter Notfallbedingungen ist dabei die intravenöse Verabreichung bevorzugt. Im Fall einer Störung der frühen Schwangerschaft wie z.B. bei Implantationsstörungen, frühen Schwangerschaftsverlusten, imminentem oder habituellem Abort erfolgt die Verabreichung des Arzneimittels bevorzugt durch subkutane Injektion.
Die zu verabreichende endometriale hCG-Dosis ist vom Krankheitszustand und dem speziellen zu behandelnden Patienten abhängt. Bevorzugt ist das Arzneimittel so angepasst, dass die Menge an verabreichtem humanem Choriongonadotropin 1 bis 10 μg, besondes bevorzugt 3 bis 6 μg, pro kg Körpergewicht pro Tag beträgt. Bevorzugte Einzeldosen sind 50 μg bis 1000 μg des beschriebenen hCG.
Zur parenteralen Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels werden beispielsweise 250 Mikrogramm des maturen hCG gebildet aus einer endometrialen ß-Untereinheit (ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder des maturen hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4) und einer α- Untereinheit (SEQ ID NO 9 oder SEQ ID NO 10) in 0,5 ml einer Injektionslösung gelöst und in eine Fertigspritze überführt.
Die Erfindung betrifft weiter eine Methode zur Behandlung von Fertilitäts- und Schwangerschaftsstörungen oder zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder Transplatationsprozessen bei der eine Präkursor-hCG ß- Untereinheit des humanen Choriongonadotropins ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2, hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 5 oder eine mature hCG ß-Untereinheit ausgewählt aus hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4, hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder glycan-behaftete Oligopeptid-Fragmenten dieser Sequenzen einem Patienten verabreicht wird.
Bevorzugt werden zusätzlich der Präkursor der αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 9 oder die mature αCG-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäß SEQ ID NO 10 oder glycanbehaftete Oligopeptid-Fragmente davon verabreicht. Bevorzugt beträgt die Menge an verabreichtem humanem Choriongonadotropin 1 bis 10 μg, besonders bevorzugt 3 bis 6 μg, jeweils pro kg Körpergewicht pro Tag. Bevorzugte Einzeldosen sind 50 μg bis 1000 μg hCG.
Die Injektionen mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel erfolgen bei einer drohenden Frühgeburt, bei Präeklampsie oder bei intrauteriner Wachstumsretardierung beispielsweise täglich, im Falle einer drohenden Frühgeburt mit Beginn regelmäßiger Wehen. Nach Abklingen der Wehen erfolgt die Injektion mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel in Abständen von 2 bis 4 Tagen.
Im Falle eines akuten Wehenbeginns bei fortgeschrittener Eröffnung des Muttermundes ist die Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels durch intravenöse Infusion bevorzugt. Hierbei wird das Proteindimer - hCG ß7/α oder hCGß6/α (mature hCG ß7 gemäß SEQ ID NO 6 oder des mature hCG ß6 gemäß SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4 mit hCG α SEQ ID NO 9 oder 10) - in einer Infusionslösung gelöst und über einen Zeitraum von bevorzugt vier Stunden verabreicht. Bevorzugte Dosis: 500 μg bis 1500 μg, vorzugsweise 1000 μg hCG ß7/α oder hCGß6/α in 500 ml Infusionslösung.
Alternativ erfolgt die Injektion von hCG ß7/α oder hCGß6/α intramnial. Bevorzugte Dosis: 500 μg bis 1500 μg, vorzugsweise 1000 μg hCG ß7/α oder hCGß6/α
Zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Transplantationspatienten werden dem Patienten bevorzugt mononukleäre Zellen entnommen, mit den oben genannten hCG-Formen in vitro inkubiert und danach wieder subkutan, intravenös oder lokal an den jeweiligen Patienten zurückgegeben. Bei diesem Schritt werden die mononukleären Zellen (vor allem Monozyten, NK-Zellen und T-Zellen) in ihren Eigenschaften so verändert, daß sie eine Immuntoleranz bewirken.
Dabei induziert die Inkubation von mononukleären Zellen mit hCG in vitro die Bildung und Sekretion von hCG in diesen Zellen. Dieser Effekt läßt sich hauptsächlich bei Monozyten und NK-Zellen nachweisen. Eine systemische hCG-Gabe wirkt ebenfalls über diesen Effekt.
Eine Aufrechterhaltung dieser Immunität kann durch intravenöse und lokale Applikation der oben genannten hCG-Formen oder deren Fragmente erzielt werden. Durch die lokale hCG- Applikation (Ort der Transplantation, Gelenkspalt, Blase, Darm, Haut, Liquor) in Form von Injektion, Instillation, Cremes, Sprays oder Kapseln wird der chemotaktische Effekt des hCG auf die mononukleären Zellen, die eine Immuntoleranz induzieren, ausgenutzt. Herstellungsverfahren: Nach dem Stand der Technik erfolgte die Herstellung eines rekombinanten trophoblastären hCG in einer Kultur von Ovarzellinien des chinesischen Hamsters (CHO)-Zellen wie CHO-DUKX Fibroblastzellen, COS-7 Zellen oder weitere in der Literatur beschriebene CHO-Zelllinien (Chappel et al. 1992, Matzuk et al. 1989, Garcia- Campayo et al. 2002, Birken et al. 2003). Dabei wurden das αGen wie die ßGene des Trophoblast transfiziert.
Die Erfinder haben festgestellt, das sich die Glykolisierung des nach dem Stand des Technik produzierten rekombinanten hCG nachteilig von dem natürlicherweise im menschlichen Endometrium und Dezidua exprimierten hCG unterscheidet. Die Glykolisierung des hCG hat sich als erstaunlich epithelspezifisch erwiesen. Wobei die Glyklosierung starke Auswirkungen auf die Spezifität und die biologische Aktivität des hCG hat.
Ebenso konnten die Erfinder erstmals durch Sequenzanalyse die exakte ßhCG-Nukieotidfolge des Exon 1 und Exon 2 aufführen, die im gesunden sekretorisch transformierten Endometrium und der Dezidua des Menschen als RNA hCG ß7 oder hCG ß6 oder hCG ß7+ß6 exprimiert (s. SEQ ID No. 11 bis 13).
Die Erfindung betrifft daher weiter ein Verfahren zur Herstellung von humanem hCG mit den Untereinheiten α-Choriongonadotropin (αCG) und ß-humanem Choriongonadotropin (ßhCG) in isolierten humanen Epithelzellen oder Epithelzelllinien endometrialen oder dezidualen Ursprungs. Vorzugsweise besteht dabei die exprimierte ß-Untereinheit aus ßhCG ß6 und/oder ßhCG p7.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren hat mit der Zielstellung des Einsatzes natürlicher oder artifizieller menschlicher Epithelzellen gegenüber bisher den Vorteil der Produktion eines epithelspezifischen hCG-Sekretionsproduktes mit epithelspezifischen Giykosylierung, die im humanen Epithel ausgeprägter ist. Sie vermeidet zudem die Nachteile, die nach dem Stand der Technik dadurch entstanden, dass das hCG bisher in einer Säugetierzellkultur ohne unmittelbaren Bezug zum natürlichen humanen, epithelspezifischen Glykolysierungsprogramm hergestellt wurde.
Die isolierten endometrialen und dezidualen Epithelzellen sind bevorzugt Zelllinien humanen Ursprungs. Abgeleitete endometriale Epithelzelllinien oder Epithelzelllinien mit zusätzlicher Transfektion von ßhCG Genen ß6 und ß7 und/oder weiteren ßhCG Genen (ß5, ß3, ß8, ß1 , ß2) und/oder von Genen zur Giykosylierung des Hormones sind hierbei ausdrücklich einbezogen. Die Epithelzellen werden bevorzugt aus nativem endometrialen Gewebe gewonnen. Vorteilhaft weist das in diesen Zellen exprimierte hCG, das oben erwähnte bevorzugte Glykolisierungsmuster und die oben erwähnten Disulfidbrücken auf.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird es daher möglich ein hCG bereitzustellen, dessen Glykolisierung, Faltung und Disulfidbrücken den natürlichen Gegebenheiten entsprechen.
Weitere Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Arzneimittels werden nachfolgend genannt:
Zur Behandlung einer Sepsis werden bevorzugt täglich hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) infundiert. Bevorzugte Dosis: 500 bis 1000 μg/d hCG. Virus-bedingte Karzinome und Sarkome werden systemisch und lokal mit Dosen von bevorzugt 1000 μg/d behandelt.
Zur Verwendung zur Kontrazeption (Schwangerschaftsverhütung) wird hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) subkutan injiziert bzw. sublingual appliziert. Bevorzugte Dosis: täglich 10 μg hCG. Alternativ wird das hCG in Stäbchen aus Polymeren subcutan oder Ringe aus Polymeren intravaginal apppliziert. Die Stäbchen oder Ringe bestehen bevorzugt aus Polyethylen-co-vinylacetat und setzen bevorzugt täglich 2, 5 bis 20, vorzugsweise 4 bis 7,5 μg hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) frei
Zur Prophylaxe einer HIV Infektion werden hCG-haltige Gels und Cremes, die hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) in einer Konzentration von bevorzugt 1% enthalten, eingesetzt.
Zur Behandlung schwerer Gewebsischämien wie bei Apoplexie, Herzinfarkt oder schweren postpartalen Hirnödeme Neugeborener wird hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt infundiert bzw. bei Verbrennungen lokal in Form von Sprays aufgebracht. Bevorzugte Dosis: täglich 500 bis 1000 μg.
Zur Behandlung und Prophylaxe einer allergischen-entzündlichen Reaktionen der oberen Luftwege (Heuschnupfen, Asthma bronchiale) wird hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt in Form eines Spray (alternativ einer Creme bzw. Gel) verwendet. Bevorzugte Dosis: täglich 50 bis 100 μg.
Zur Behandlung der Benignen Prostathyperplasie (BPH) wird hCG (zusammengesetzt aus α- CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt sublingual verordnet. Bevorzugte Dosis: zweimal täglich 0,5 μg Behandlung von Autoimmunerkrankung des Auges: Bei Autoimmunuveitis werden bevorzugt im 4 bis 7-tägigen Abstand eine Lösung zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden enthält injekziert. Bevorzugte Dosis: 0,5ml mit 10μg/ml hCG. Diese Therapie kann auch bei einer therapieresistenten Glaukomtherapie bzw. bei Gefahr der Abstoßung eines Hornhauttransplantates verordnet werden.
Bei Patienten mit Multipler Sklerose werden wöchentlich hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt intrathekal instilliert. Bevorzugte Dosis: 2 ml in einer Konzentration von 10 μg / ml
Behandlung von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa: Perorale Gabe von hCG zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden in eine Biomembrankapsel, die erst im Dünn- bzw. Dickdarm hCG freisetzen, bevorzugt in einer Konzentration von 5μg/ml.
Zur Transplantation von autologen und/oder xenogenen Inselzellen werden diese bevorzugt vor der Transplantation für vorzugsweise 24 bis 72 Stunden 48 Stunden in einer hCG-Emulsion mit 2μg/ml hCG stimuliert und anschließend intravenös injiziert. Alternativ werden autologe oder xenogene Inselzellen in eine hCG freisetzende Biomembranen vorzugsweise zusammengesetzt aus einem biologisch abbaubaren Polymer, wie Poly(s-caprolactone) (PCL) eingekapselt und so implantiert.
Zur Behandlung von Behandlung der interstitiellen Cystitis und von chronischen Cystitiden erfolgt bevorzugt die Einlage eines biologisch abbaubaren Implantates, vorzugsweise aus Poly(ε-caprolactone) (PCL), in Form eines Stiftes bei chronischer Blasenentzündung bzw. einer Interstitiellen Cystitis, der kontinuierlich hCG freigibt.
Behandlung bei HIV Infektion: Bei ausgeprägtem T-Zellabfall im Rahmen einer HIV Infektion werden hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG bzw. den glykolysierten Oligopeptiden) bevorzugt intravenös injiziert. Die Verabreichung erfolgt bevorzugt täglich über 2 Wochen. Bevorzugte Dosis: 1000 μg/ml. Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert. Dabei zeigen die Abbildungen weitgehende Analogien und spezifische Unterschiede in der molekularen Organisationsstruktur der plazentaren und endometrialen hCG-Bildung. Untersuchungen zur Genexpression, Sequenzanalyse, Hormonbestimmungen im Gewebe, molekularem Nachweis mit spezifischen hCG-Antikörpern (Western Blot) und mit immunhistochemischen Methoden bestätigen die zyklusabhängige hCG-Bildung im gesunden sekretorischen Endometrium.
Fig. 1: Organisation der ßhCG Gene ß5, ßδ und ß3 sowie der ßhCG Gene ß6 und ß7
Fig. 2: Genexpression und Nukleotidsequenz der mRNA von ßhCG Gene ß5, ß6 und ß7 und von ßl_H Gen ß4 in Verbindung zur kodierten Aminosäuresequenz Fig. 3: Lokalisation unterschiedlicher Nukleotidsequenzen der ßhCG mRNA von Gen ß5, ß6 und ß7 in Exon 1 , 2 und 3
Fig. 4: Genexpression von ßhCG und αCG nach RT-PCR im sekretorischen Endometrium Fig. 5: Zyklusabhängigkeit der endometrialen Genexpression von ßhCG Fig. 6: (A) Sequenzanalyse des Transkripts der endometrialem Genexpression ßhCG ß6
(B) Sequenzanalyse des Transkripts der endometrialen Genexpression ßhCG ß7
(C) Sequenzanalyse des Transkripts der endometrialen Genexpression ßhCG ß6 und ßhCG ß7
Fig. 7: Konzentrationsbestimmung des endometrialen hCG im Endometriumhomogenat Fig. 8: Western Biot-Untersuchung zur molekularen Struktur und zur Glykolisierung des plazentaren und endometrialen hCG mit
(A1B) polyklonalem hCG- und CTP-hCG-Antikörper
(C1D) monoklonalem ßhCG-Antikörper
(E1F) monoklonalem αCG-Antikörper
Fig. 9: Western Blot-Untersuchungen zur Unterscheidung zwischen ßhCG endometrialen (ß7, ß6) und trophoblastären (ß5) Ursprungs
Die Organisation der ßhCG plazentaren Gene ß5, ßδ und ß3 sowie der endometrialen Gene ß6 und ß7 ist in Fig. 1 dargestellt. Die Gene der ßhCG-Untereinheit bestehen aus jeweils drei Exons und zwei dazwischenliegenden Introns. Exon 1 beinhaltet die Promotorsequenz, die beiden Strukturgene Exon 2 und Exon 3 einschließlich des C-terminalen Peptids (CTP) kodieren die reife (mature) ßhCG-Untereinheit mit 145 Aminosäuren (aa). Das ßhCG-Gen wird von bp -366 im Exon 1 (Transkriptionsstart, ***) über bp +1 im Exon 1 (Translationsstart, Tr) bis zum bp +495 im CTP des Exon 3 exprimiert. Das Exon 1 überstreicht den bp-Bereich von -366 bis +15, das Exon 2 von +16 bis +183 und das Exon 3 von +184 bis +495. Vier intron- überspannende ßhCG-Primerpaare mit den resultierenden Amplikons von 548, 423, 378 und 300 bp bestätigen die full-length ßhCG-Genexpression.
Die ßhCG Gene ß1 und ß2 enthalten eine Punktmutation in der Donor Splice Site des ersten Introns. Eine aus alternativem Splicing von Intron 1 resultierende mRNA kodiert Proteine von 132 Aminosäuren, deren Sequenzen jedoch keinerlei Ähnlichkeit zu den Aminosäuresequenzen der anderen ßhCGs aufweisen (Policastro et al. 1983; Talmadge et al. 1984; Bo and Boime 1992).
In Fig. 2 sind die differierenden Nukleotidsequenzen des plazentaren ßhCG Gene ß5 (CG5) den epithelialen ßhCG Genen ß6 und ß7 (CG6, CG7) und dem ßl_H Gen ß4 (LH4) sowie den ermittelten Endometriumsequenzen (Endo) gegenübergestellt. Ebenso sind die zugehörigen unterschiedlichen Aminosäuresequenzen im Proteinmolekül aufgeführt. Die mRNA der ßhCG- Gene umfaßt den Nukleotidbereich von - 366 bis +495 bp, die Nukleotide von +1 bis +496 bp kodieren das Prähormon (ßhCG precursor) mit 165 Aminosäuren, die Nukleotide von +60 bis +495 bp kodieren die reife (mature) ß-Untereinheit mit 145 Aminosäuren. In der Tabelle steht M in der Endometrium-Sequenz für C oder A, R für G oder A und S für G oder C. Der Start des Exon 1 ist mit *** , des Exon 2 mit ** und des Exon 3 mit * markiert.
Fig. 3 zeigt die Unterschiede in den Nukleotidsequenzen der Exons 1 (bp -358 bis -21 , n=25), Exon 2 (bp +65 bis +71 , n=3) und Exon 3 (bp +410, n=1). Promotorgen und die Strukturgene insgesamt unterscheiden sich zwischen den Genen hCG ß5 und hCG ß7 in 27 Nukleotidpositionen, das hCG Gen ß7 unterscheidet sich von hCG ß6 in zehn Nukleotidpositionen. Die Nukleotidsequenzen der hCG-Untereinheiten ß3, ß5 und ßδ im Promotorgen zeigen mehrere Differenzen, die Aminosäuresequenzen der Prähormon- und maturen hCG-Untereinheiten ß3, ß5 und ß8 sind aber identisch. Die Zählung der bp-Nummern in Fig. 3 bezieht sich jeweils auf den Transkriptionsstart oder Translationsstart.
Wie aus Tabelle 1 und der vorangegangenen Figur hervorgeht, unterscheidet sich die resultierende Aminosäuresequenz des plazentaren hCG trotz seiner vielfältigen ßhCG ß5, ßδ, ß3-Untereinheitenstruktur nicht. Für das endometriale hCG mit seinen ßhCG ß7 und ß6- Untereinheiten sind neben der Aminosäure +117 im C-terminalen Bereich jedoch noch weitere Aminosäuren im N-terminaien Bereich zum plazentaren hCG verändert.
Diese Untereinheiten αCG und ßhCG, exprimiert von unterschiedlichen Genen, kombinieren intrazellulär bald nach Proteinsynthese im endoplasmatischen Retikulum und erfahren post- translatorische Modifikationen in die spezifische, biologisch aktive heterodimere Form (Disulfidbrückenbindungen und Glykosylierung im endoplasmatischen Retikulum, Hetero- dimerisierung, seat belt - Konfiguration und Prähormonspaltung im Golgiapparat). Die resultierenden Aminosäuresequenzen der maturen hCG ß7-Untereinheit und der hCG ß3, ß5, ß8-Untereinheit unterscheiden sich in den Aminosäurepositionen +2 (Arginin/Lysin), +4 (Methionin/Prolin) und +117 (Alanin/Aspartat), die der hCG ß6- wie der hCG ß7- mit der hCG ß5-Untereinheit ebenso in der Aminosäureposition +117 (Alanin/Aspartat) und die der hCG ß6- und der hCG ß7-Untereinheit noch in den Aminosäure-Position +2 (Lysin/Arginin) und +4 (Prolin/Methionin). Zudem kann in Position +2 für hCG ß6 ein Arginin mit der Nukleotidfolge AGG dargestellt werden (b). Die Differenzen der Aminosäuresequenz sind in Tab.1 zusammengestellt.
Tabelle 1:
AS-Position hCG ßδ hCG ß7 hCG ß6
+ 2 Lys Arg Lys oder Arg
+ 4 Pro Met Pro
+ 117 Asp AIa AIa
In der Fig.4 können wir mit unseren Laborergebnissen erstmals nachweisen, daß im normalen sekretorischen Endometrium gesunder Frauen epitheliales hCG exprimiert wird. Die Genexpression des sekretorischen Endometriums umfaßt sowohl die αCG-Untereinheit als auch die full-length RNA der ßhCG-Untereinheit von Exon 1 bis Exon 3 einschließlich des CTP- Anteils.
Aus Gewebeproben des Endometriums und der Plazenta als Kontrolle wurde RNA durch Trizol- Extraktion isoliert und mittels semi-quantitativer RT-PCR mit Primerpaaren, die spezifisch ßhCG (A-D in Fig. 4), αhCG (E, F in Fig. 4) und GAPDH (G in Fig. 4) erkennen, analysiert. Dafür wurden die in der Tabelle 2 aufgeführten Primerpaare in einer RT-PCR unter Standardbedingungen eingesetzt: Tabelle 2: r. Gen Primer Exon Strand Primersequenz bp Nr. location Amp- Pair- licon* ed
1 ßhCG -353 / -337 1 sense 5'-TCGGGTCACGGCCTCCT-3' 548 4
2 ßhCG -228 / -209 1 sense 5'-TCACTTCACCGTGGTCTCCG-3' 423 4
3 ßhCG 108 / 127 2 sense δ'-GGCTGTGGAGAAGGAGGGCT-S' 5,6
4 ßhCG 197 / 178 2,3 anti-s. 5'-CAGCACGCGGGTCATGGT-3' 1.2
5 ßhCG 406 / 384 3 anti-s. 5'-GAAGCGGGGGTCATCACAGGTC-3I 300 3
6 ßhCG 484 / 468 3 anti-s. 5'-TCGGGGTGTCCGAGGGC-3I 378 3
7 αhCG 83 / 102 sense δ'-TGCAGGATTGCCCAGAATGC-S' 231 8
8 αhCG 313 / 294 anti-s. 51-CCGTGTGGTTCTCCACTTTG-3I 7
9
GAPDH 335 / 352 sense 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-31 196 10 0
GAPDH 530 / 510 anti-s. 5'-CCAAAGTTGTCATGGATGACC-3' 9
Die Basenpaarlänge der durch die RT-PCR amplifizierte DNA-Produkte sind in bp an-gegeben. Die Primer sind mit den SEQ ID 15 bis 24 im beiliegenden Sequenzprotokoll enthalten. Die spezifischen ßhCG-Primer amplifizierten keine ßLH-mRNA.
In Fig. 4 sind die Ergebnisse der RT-PCR für 4 Gewebeproben des Endometriums in den Bahnen 3 bis 6 („endometrium") und in Bahn 8 als Kontrolle eine Gewebeprobe einer "early gestation" Plazenta („plac") gezeigt. In Bahn 1 ist zur Größenbestimmung eine DNA-Leiter als Standard („stand.") aufgetragen. In Bahn 2 wurde eine Negativkontrolle (ohne Primer, ohne RNA) aufgetragen.
In Fig. 4 A kamen die ßhCG spezifischen Primer 1 und 4 der Tabelle 2 zum Einsatz. Der Vergleich mit der DNA-Leiter zeigt, dass die amplifizierte DNA die erwartete Länge von 548 bp aufweist. In Fig. 4 B kamen die ßhCG spezifischen Primer 2 und 4 der Tabelle 2 zum Einsatz. Der Vergleich mit der DNA-Leiter zeigt, dass die amplifizierte DNA die erwartete Länge von 423 bp aufweist. In Fig. 4 C kamen die ßhCG spezifischen Primer 3 und 6 der Tabelle 2 zum Einsatz. Die amplifizierte DNA weist die erwartete Länge von 378 bp. In Fig. 4 D kamen die ßhCG spezifischen Primer 3 und 5 der Tabelle 2 zum Einsatz. Die amplifizierte DNA weist die erwartete Länge von 300 bp auf. In Fig. 4E und Fig. 4F kamen die αCG spezifischen Primer 7 und 8 zum Einsatz. Das DNA-Produkt weist in Fig. E die erwartete Länge von 231 bp auf. Ohne Revertase im cDNA-Ansatz (- RTase) bleibt die Reaktion aus, d.h. ist RNA und nicht etwa endogene DNA.
In Fig. 4 E kamen als Kontrolle und für eine semiquantitative Bestimmung weiterhin die GAPDH- spezifische Primer 9 und 10 der Tabelle 2 zum Einsatz. Der Vergleich mit der DNA- Leiter zeigt, dass die amplifizierte DNA die erwartete Länge von 196 bp aufweist. Die Ergebnisse zeigen, dass ßhCG and αhCG mRNA in der sekretorischen Phase von gesundem Endometrium in etwa gleicher Konzentration wie die Plazenta exprimiert werden.
Die Fig. 5 zeigt, daß die ßhCG mRNA Expression abhängig vom Differenzierungsgrad der sekretorischen Transformation des Endometriums ist. Die Endometriumbiopsien wurden stets nach diagnostischer Curettage von erfahrenen Pathologen als ein zyklusgerecht und als ein normales Gewebe der proliferativen Phase bis zur späten sekretorischen Phase bewertet. Die endometriale RNA wurde extrahiert und durch RT-PCR halbquantitativ zur korrespondierenden GAPDH-Amplifikation bestimmt. Für die Messungen wurden Patientinnen der proliferativen (P, n=22), frühen sekretorischen (ES, n=28), mittleren sekretorischen (MS, n=26) und späten sekretorischen (LS, n=15) Phase des menstruellen Zyklus ausgewählt. Es erfolgte ein optische densitometrische Auswertung (± SEM).
In Fig. 6 sind die Ergebnisse der Sequenzanalyse zur Bestätigung der Genexpression von ßhCG mRNA im sekretorischen Endometrium dargestellt. Die verwendeten cDNA-Amplifikate wurden nach RNA-Extraktion des endometrialen Gewebes und nach RT-PCR unter Standardbedingungen für die Sequenzierung eingesetzt. In Fig. 6 A ist nach Sequenzierung des ßhCG-Amplifikates eine Nukleotidsequenz für ßhCG ß6, in Fig. 6 B eine Nukleotid-sequenz für ßhCG ß7 und in Fig. 6 C eine Nukleotidsequenz für ßhCG ß7 mit ßhCG ß6 dargestellt. Die Sequenzfolgen bestätigen in hoher Genauigkeit die in Tab. 2 zusammen-gestellten Nukleotidsequenzen für die Expression der endometrialen ßhCG ß7- und ßhCG ß6-Untereinheit. Die ermittelte Nukleotidsequenz basiert auf der Kenntnis des für die Untersuchungen eingesetzte cDNA-Amplifikates mit 548 bp über das Exon 1 und Exon 3. Mit diesen Ergebnissen wird zum ersten Mal eine mRNA-Sequenz für die Expression einer endometrialen ßhCG-Untereinheit vorgestellt.
Neben der endometrialen Transkription der beiden ßhCG-Untereiheiten können wir hier auch die Translation die Translation des endometrialen hCG bestätigen. Die Konzentrationen des endometrialen hCG werden in Endometriumhomogenaten zyklusabhängug erfaßt. In Fig. 7 sind die Hormonkonzentrationen von Total-hCG/ßhCG, freier ßhCG-Untereinheit und von LH in Endometriumhomogenaten dargestellt worden. Die Hormonkonzentrationen wurden im Überstand von etwa 100 mg Gewebe pro ml Puffer gemessen. Die Gewebeproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten des menstruellen Zyklus erhalten und für den die Untersuchungen eingesetzt (proliferate, n=19; early secretory, n=24; mid secretory, n=23; late secretory, n=10; ± SEM). Das endometriale hCG steigt mit der sekretorischen Transformation auf Werte um 60 mU/ml, während LH bei basalen Werten verbleibt und die freie ßhCG- Untereinheit nur in geringem Maß ansteigt,
Unter dem Gesichtspunkt der endometrialen Translation eines epithelialen hCG stellen wir hier in Fig. 8 erstmals Ergebnisse zur SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese und zu Western Blot- Untersuchungen in Homogenaten des normalen sekretorischen Endometriums vor. Die jeweils vier Bahnen der Endometriumproben (lane 4-8) werden verglichen mit kommerziellen gereinigten hCG Präparationen oder αCG- und ßhCG-Untereinheiten (lane 1-3) und einen Schwangerschaftsserum des ersten Schwangerschaftstrimesters.
In der Fig. 8 AB werden die Blots mit einem polyklonalen hCG-Antikörper (Dako) und einem polyklonalen CTP-h CG-Antikörper (Biotrend) als Primärantikörper behandelt. In der Fig. 8 CD werden die Blots mit einem monoklonalen ßhCG-Antikörper (INN22) unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen behandelt. In der Fig. 8 EF werden die Blots mit einem monoklonalen αCG-Antikörper (INN 132) unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen behandelt.
Die endometrialen Gewebeproben zeigen prädominante ßhCG-Untereinheitenbanden von etwa 31 kDa oder 29 kDa und αCG-Untereinheitenbanden von 24 kDa oder 21 kDa wie auch αßhCG Dimer-Banden von 44 kDa, 38 kDa und 35 kDa oder weitere ßhCG Monomer-Banden von 24 kDa, 21 kDa, 17 kDa und 15 kDa, abhängig vom Desialysierungs- oder De- glxkolysierungsfrad,
Zusätzlich werden hier bisher unveröffentlichte Laborergebnisse des Western Blots in Gewebehomogenaten mehrerer sekretorisch transformierter Endometriumproben zyklusgesunder Frauen vorgestellt, die mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen unterschiedlich glykosylierte und partiell deglykosylierte molekulare Formen des dimeren αßhCG und der αCG- und ßhCG-Untereinheit im Vergleich zum plazentaren hCG beweisen (Fig. 8). Eigens entwickelte genspezifische ßhCG-Antikö rper für den alternativen Nachweis des hCG ß7- und ß5-Dimers belegen im Western Blot den genauen Nachweis über den endometrialen oder plazentaren (trophoblastären) Ursprung (Fig. 9).
Auch Immunhistochemisch ist mit den hCG-, ßhCG- und αCG-spezifischen Antikörpern die zyklusabhängige epitheliale hCG-Sekretion im endometrialen Drüsen- und Luminalepithelium der gesunden Frau an Gewebeschnitten vor allem der mittleren und späten Sekretions-phase besonders eindeutig zu belegen.
Ausführungsbeispiel 1 : Gentechnische Herstellung von rekombinantem hCG
(angelehnt an Loumaye et al. 1995 ; Howles 1996 ; Matzuk et al. 1989 ; Garcia-Campayo et al. 2003 ; Birken et . 2003 )
A. Präparation von humaner DNA:
Isolation und Charakterisierung des gesamten ßhCG-Gens (Promotorgen Exon 1 , Struktur-gene Exon 2 und Exon 3 einschließlich der Introns) für die ßhCG-Gene ß6 und ß7, die für das Präkursor- und mature Reifetranskript codieren. Isolation und Charakterisierung des gesamten αCG (hCG α)-Gens, das für das Präkursor- und mature Reifetranskript codiert.
B. Insertion der ßhCG- und αCG-DNA in einen Vektor (Plasmidkonstruktion)
Verwendung eines TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen oder alternativ des pGEM-T Vektorsystem Promega) unter Hersteller-Anweisung je für hCG ß6, hCG ß7 und hCG α (SEQ ID NO 11 bis SEQ ID NO 13 und SEQ ID NO 15) und Insertion in den Expressionsvektor. Die eingeschleusten DNA werden mit der DNA-Sequenz von Dehydrofolsäurereduktase (DHFR) kombiniert, die für die Synthese der Kernsäurepräkursoren in DHFR-defizienten Säugetier- Wirtszellen erforderlich ist.
C. Inkorporation (Co-Transfektion) der ßhCG und αCG-Expressionsvektoren in eine Säugetier- Wirtszelle
Die αCG und ßhCG-Expressionsvektoren werden durch Ca-Copräzipitation in die gut charakterisierte tierische CHO (Chinese Hamster Ovarian)-Zelllinie, die DHFR-defiziente Zellen darstellen, transfiziert. Für die Herstellung der epithelialen und nicht-trophoblastären dimeren Form des glykolysierten hCG werden die Klone ßhCG Gene ß6 oder ßhCG Gen ß7 gemeinsam mit αCG kotransfiziert und kultiviert.
D. Selektion der individuellen Klone nach folgenden Kriterien:
Die aus je einer Zelle stammenden Klone werden überprüft hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bildung von hCG, ihrer biologischen Aktivität des hCG und ihrer genetischen Stabilität. E. Etablierung einer Master-Zellbank (MZB) aus einer einzelnen kotransfizierten CHO-ZeIIe mit αhCG und jeweiligem ßhCG-Expressionsvektoren, die von einem als optimal eingeschätzten Klon stammt.
F. Etablierung einer Arbeits-Zellbank (AZB)
Etablieren durch Ausbreiten von Zellen eines einzigen MZB-Behälter.
G. Kommerzielle Herstellung von rekombinantem hCG (r-hCG), genspezifisch:
- Vermehrung von Zellen aus der Arbeitsbank (AZB)
- Kulturausweitung in Glaskolben, Rollflaschen
- Bioreaktor: Anheften und Wachstum der Zellen, hCG-Produktion, Sammeln des hCG- Kulturmediums
H. Feinreinigung des rekombinanten hCG aus den Kulturmedium:
- Ultrafiltration
- Chromatographie über Säulen
- Immun-Affinitätschromatographie
- Chromatographie
- Ultrafiltration
- gereinigtes Rohprodukt r-hCG ( αhCG und ßhCG-Gen ß6 oder ß7).
/. Kontrolle der batch to batch-Qualität
- Kombination von Chromatographie und MALD-TOF-Massenspektrometrie
- N-glycosidische und O-giycosidische Glykoproteinseitenketten-(Glycan-)charakterisierung
- Glycan mapping-Methode für Chargenkontrolle des Sialysierungsgrades
- komplette Auflösung der N-Glycan- und O-Glycan-Bindungen am αCG- und ßhCG-Molekül
- Erhalt der batch to batch-Konsistenz für die kommerzielle Produktion (analog Gervais et al. 2003 ; Garn et al. 2003 ; Birken 2005)
Ausführungsbeispiel 2:
Gentechnische Herstellung von rekombinantem αßhCG (ßhCG Gen ß7- oder Gen ß6- oder Gen ß5-spezifisch) in menschlichen Epithelzellen des sekretorisches Endometrium oder der Dezidua:
- Verwendung eines TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen oder alternativ des pGEM-T Vektorsystem Promega) unter Hersteller-Anweisung je für hCG α und hCG ß6, ß7 (SEQ ID NO 11 bis SEQ ID NO 13 und SEQ ID NO 15) und Insertion in den Expressionsvektor entsprechend Ausfϋhrungsbeispiel 1.
- Zellseparation und Kultivation von menschlichen Epithelzellen des sekretorischen Endometriums oder der Dezidua
- Inkorporation (Transfektion) der Vektoren entsprechend Ausführungsbeispiel 1.
- Nutzung der nativen Syntheseleistung der menschlichen Epithelzelle des Endometriums oder der Dezidua zur N-glykosidischen und O-glykosidischen Glykoproteinseitenketten- produktion (N-Glycan und O-Glycan) von αCG und ßhCG.
- Fortführung der Ausführung Selektion, Etablierung der Master-Zellbank, Arbeits-Zellbank, Kulturausweitung, Feinreinigung und Qualitätskontrolle erfolgt wie in Ausführungsbeispiel 1 angegeben.
Ausführungsbeispiel 3: Behandlung von Fertilitätsstörungen / Behandlung von Implantationsstörungen / Behandlung von frühen Schwangerschaftsverlusten
Zur Behandlung von Fertilitäts- und Implantationsstörungen sowie zur Behandlung von frühen Schangerschaftsverlusten erhalten die Patientin das wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 beschrieben hergestellte hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) am 21. Zyklustag und weiter aller 3 Tage 250 μg subcutan bis zur Diagnostik einer Schwangerschaft.
Ausführungsbeispiel 4: Behandlung von Aborten
Bei Patientinnen mit drohendem Früh- oder Spätabort erhalten die Patientinnen das wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 beschrieben hergestellte hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) zweimal pro Woche 250 μg α und ß 6/7 hCG subcutan injiziert. Ab der 20. Schwangerschaftswoche werden zusätzlich wöchentlich bis zur 28. Schwangerschaftswoche 1000μg des wie in Bsp. 1 beschrieben hergestellte hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) in das Fruchtwasser instilliert.
Ausführungsbeispiel 5: Behandlung der Frühgeburt
Bei einer diagnostizierten drohenden Frühgeburt erhalten die Patientinnen 1000 μg des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 beschrieben hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7- hCG) in das Fruchtwasser instilliert. Diese Instillation wird wöchentlich bis zur 32. Schwangerschaftswoche durchgeführt. Zusätzlich erhalten die Patientinnen täglich 250 μg α und ß 6/7 hCG subcutan injiziert. Ausführungsbeispiel 6: Behandlung von Präeklampsie
Bei schweren Präeklampsien erhalten die Patienten 500 μg des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG ) einmal wöchentlich in das Fruchtwasser instilliert. Zusätzlich wird im 3-tägigen Abstand 250μg subcutan injiziert.
Ausführungsbeispiel 7: Behandlung der Wachstumsretardierung
Zur Behandlung der Wachstumsretardierung erhält die Patientin bis zur 34. Schwangerschaftswoche alle zwei Tage 250 μg wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus αCG und ß6/7-hCG) subcutan.
Ausführungsbeispiel 8: Behandlung von Autoimmunerkrankungen und zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Transplantatϊonspatienten
Zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen werden dreimal täglich 0,5 μg des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) sublingual verordnet.
Zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Transplantationspatienten werden den Patienten täglich 50 μg des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) subcutan appliziert. Zusätzlich werden den Patienten bereits vor der Transplantation und 12 Wochen danach wöchentlich entnommene mononukleäre Blutzellen in vitro mit etwa 3 μg dem wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α- CG und ß6/7-hCG) 8 Stunden inkubiert und dem Patienten intravenös appliziert. Um eine Immuntoleranz für transplantierte Organe zu ermöglichen, muss für dieses Organ ein immun-privilegierter Raum geschaffen werden, in dem die Organe in eine eng anliegenden Biomembran eingehüllt werden, aus der täglich 1 μg wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestelltes hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) langsam freigesetzt wird.
Ausführungsbeispiel 9: Vermeidung einer graft-versus-host-Reaktion
Zur Vermeidung einer graft-versus-host - Reaktion soll das Präparat nach der Spenderentnahme mit dem wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) in einer Dosis von mit 250 μg / 0,5ml sowohl von arterieller als auch von venöser Seite durchspült werden. Auch dem Transportmedium wird diese hCG Form in gleicher Konzentration zugegeben. Ausführungsbeispiel 10: Behandlung der Sepsis
Zur Behandlung einer Sepsis werden täglichen 500 bis 1000 μg des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) infundiert. Virus-bedingte Karzinome und Sarkome werden systemisch und lokal mit Dosen von 1000 μg/d behandelt.
Ausführungsbeispiel 11:Verwendung zur Kontrazeption
Dabei werden täglich 10 μg des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) subkutan injiziert bzw. sublingual appliziert. Außerdem können Stäbchen aus Polyethylen-co-vinylacetat zur subcutanen Anwendung oder Ringe aus Polyethylen-co-vinylacetat für eine intravaginale Applikation, die täglich 5 μg wie in Bsp. 1 hergestelltes hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) freisetzen, eigesetzt werden.
Ausführungsbeispiel 12: Verwendung zur Prophylaxe einer HIV Infektion hCG-haltige Gels und Cremes, die wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestelltes hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) in einer Konzentration von 1% enthalten, werden zur Prophylaxe einer HIV Infektion eingesetzt.
Ausführungsbeispiel 13:, Behandlung von Gewebsischämien und schweren Nekrosen
Zur Behandlung schwerer Gewebsischämien wie bei Apoplexie, Herzinfarkt oder schweren postpartalen Hirnödeme Neugeborener werden täglich 500 bis 1000 μg des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) infundiert bzw. bei Verbrennungen lokal in Form von Sprays aufgebracht.
Ausführungsbeispiel 14: Behandlung allergischen-entzündlichen Reaktionen
Zur Behandlung und Prophylaxe einer allergischen-entzündlichen Reaktionen der oberen Luftwege (Heuschnupfen, Asthma bronchiale) werden 50 bis 100 μg des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG ) in Form eines Spray (alternativ einer Creme bzw. Gel) verwendet.
Ausführungsbeispiel 15: Behandlung der Benignen Prostathyperplasie (BPH)
Zur Behandlung der Benignen Prostathyperplasie (BPH) werden zweimal täglich 0,5 μg des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) sublingual verordnet. Ausführungsbeispiel 16: Behandlung von Autoimmunerkrankung des Auges
Bei Autoimmunuveitis werden im 4 bis 7-tägigen Abstand 0,5ml einer Lösung injiziert, die 10μg/ml des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) enthält. Diese Therapie kann auch bei einer therapieresistenten Glaukomtherapie bzw. bei Gefahr der Abstoßung eines Hornhauttransplantates verordnet werden.
Ausführungsbeispiel 17: Behandlung von Multipler Sklerose
Bei Patienten mit Multipler Sklerose werden wöchentliche 2ml hCG-Lösung, die das wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellte hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) in einer Konzentration von 10 μg / ml enthält, intrathekal instilliert.
Ausführungsbeispiel 18: Behandlung von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa
Perorale Gabe des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCGs zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG in eine (Biomembran)kapsel, die erst im Dünn- bzw. Dickdarm hCG in einer Konzentration von 5μg/ml freisetzen.
Ausführungsbeispiel 19: Transplantation von autologen und xenogenen Inselzellen
Autologe Inselzellen werden vor der Transplantation für 48 Stunden in einer Emulsion mit 2μg/ml des wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellten hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) stimuliert und anschließend intravenös injiziert.
Alternativ: Einkapslung von autologen und xenogene Inselzellen in hCG (zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) freisetzenden Biomembranen zusammengesetzt aus einem biologisch abbaubaren Poly(ε-caprolactone) (PCL).
Ausführungsbeispiel 20: Behandlung der interstitiellen Cystitis und von chronischen Cystitiden
Einlage eines biologisch abbaubaren Implantates aus Poly(ε-caprolactone) (PCL) in Form eines Stiftes bei chronischer Blasenentzündung bzw. einer Interstitiellen Cystitis, der kontinuierlich hCG (wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellt, zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7-hCG) freigibt.
Ausführungsbeispiel 21: Behandlung bei HIV Infektion
Bei ausgeprägtem T-Zellabfall im Rahmen einer HIV Infektion werden täglich über 2 Wochen 1000 μg/ml hCG (wie in Bsp. 1 bzw. Bsp. 2 hergestellt, zusammengesetzt aus α-CG und ß6/7- hCG) intravenös injiziert. Ausführungsbeispiel 22:
Gentechnische Herstellung von rekombinanten αßhCG (ßhCG Gen ß7- oder Gen ß6- oder Gen ß5-spezifisch) in menschlichen Epithelzellen des sekretorischen Endometriums oder der Dezidua mit zusätzlicher Insertion der Synthesefunktion der humanen N-glykosidischen und O- glykosidischen Glycansubstitution der αCG- und ßhCG-Untereinheit neben der Insertion von ßhCG und αCG wie in Ausführungsbeispiel 2.
Zusätzlich zu den Ausführungsbeispiel 2 genannten Vektoren werden die menschlichen Epithelzellen mit einem Vektor cotransfiziert, der Proteine enthält, die für die humane N- glykosidischen und O-glyko-sidischen Glykoprotein-Seitenkettenproduktion wichtig ist.
Ansonsten wird wie in Ausführungsbeispiel 2 verfahren.
Ausführungsbeispiel 23:
Herstellung von humanen nativem αßhCG mit nativen N- und O-glykosidischer Glycan-
Seitenkettenbildung in physiologischen Epithelzellen des sekretorisch transformation Endometriums mit ausgewählter ßhCG 66- oder ßhCG ß7-Genexpession
- Isolation von Endometrialem oder dezidualem luminalem oder Drüsenepithel nach Collagenase/DNAse- Zelldispersion und Zellseparation.
- Primärzellkultur unter optimalen Bedingungen (Oestradiol, Progesteron und andere Mediatoren) und Selektion der Zellen nach Sequenzanalyse, ßhCG ß6 oderß7.
- Fortführung der Ausführung Selektion, Etablierung der Master-Zellbank, Arbeits-Zellbank, Kulturausweitung, Feinreinigung und Qualitätskontrolle erfolgt wie in Ausführungsbeispiel 1 angegeben.
Ausführungsbeispiel 24:
In bisher unveröffentlichten Primärzellkultur-Untersuchungen zeigte sich sowohl auf der Transkriptions- als auf der Tanslationebene, daß in Endometriumzellkultur die Bildung der ßhCG- und der αCG-Untereinheiten durch Mediatoren wie Oestradiol, Progesteron, hCG, Th2- Cytokine und LPS induziert und durch Inhibitoren vermindert werden kann.
Ausführungsbeispiel 25:
In bisher unveröffentlichten Primärzellkultur-Untersuchungen zeigte sich sowohl auf der Transkriptions- als auf der Tanslationebene, daß in Endometriumzellkultur die Bildung der ßhCG- und der αCG-Untereinheiten durch Mediatoren wie Oestradiol, Progesteron, hCG, Th2- Cytokine und LPS induziert und durch Inhibitoren vermindert werden kann. Zitierte Nicht-Patentliteratur
(1) J.C.Pierce, T.F.Parsons, Annu.Rev.Biochem., 50 (1981) 465-495
(2) E.Reshef, Z.M.Lei, C.V.Rao et al., J.Clin.Endocrinol.Metab., 70 (1990) 421 -430
(3) P.Licht, H.Cao, Z.M.Lei et al., Endocrinology, 133 (1993) 3014 -3025
(4) J.Lin, S.Lojun, Z.M.Lei et al., Mol.Cell Endocrinol., 111 (1995) 13-17
(5) J.M.Zhang, Ch.V.Rao, Z.M.Lei et al., Am.J.Reprod.lmmunol., 49 (2003) 93-100
(6) P.Licht M.v.Wolff, A.Berklitz et al., Fertil.Steril., 79 (2003) 718-723
(7) R.I.Cruz, D.M.Anderson, E. G. Armstrong et al., J.Clin.Endocrinol.Metab., 64 (1987) 433-440
(8) J.L.Jameson, and A.N.HolIenberg, Endocrine Rev., 14 (1993) 203-221
(9) P.Policastro, C.Ovitt, M.Hoshinaet al., J.Biol.Chem., 258 (1983) 11492-11499
(10) K.Talmadge, N.C.Vamvakopoulus und J.C.Fiddes, Nature, 307 (1984) 37-40
(1 1) M.Bo and I.J.Boime, J.Biol.Chem., 267 (1992) 3179-3184
(12) J.F.Fiddes and H.M.Goodman, Nature, 281 (1979) 351 -356
(13) PARothman, V.A.Chao, M.R. Taylor et al., Mol.Reprod.Dev., 33 (1992) 1 -6
(14) S.Dirnhofer, M.Hermann, A.Hittmair et al., J.Clin.Endocrinol.Metab., 81 (1996) 4212-4217
(15) Z.M.Lei, P.Toth, C.V.Rao und D.Pridham, J.Clin.Endocrinol.Metab., 77 (1993) 863-972
(16) T.Yokotani, T.Koizumi, R.Taniguchi et al., IntJ.Cancer, 71 (1997) 539-544
(17) P.Berger, W.Kranewitter, S.Madersbacher et al., FEBS Lett., 343 (1994) 229-233
(18) H.Alexander, G.Zimmermann et al., Hum.Reprod.Update, 4 (1998) 550-559
(19) G.W.Wolkersdorfer, S.R. Bornstein, G.Zimmermann et al., Mol.Hum.Reprod., 4 (1998) 179- 184
(20) G.Zimmermann, D.Baier, J.Majer and H.Alexander, Mol.Hum.Reprod., 9 (2003) 81 -89
(21) D.Bellet, V.Lazar, I.Bieche et a!., Cancer Res., 57 (1997) 516-523
(22) C.F.Barker and RE Billingham, Adv.lmmunol., 25 (1977) 1 -54
(23) B.R. Ksander and J.W. Streilein, Chem.lmmunol., 58 (1994) 117-145
(24) R.A. Pattillo, M.R.Shalaby, R.O.Hussa et al., Obstet.Gynecoi, Al (1976) 557-561
(25) B.Nisula and A.Bartocci, Ann.d'Endocrinol., 45 (1984) 315-319
(26) U.C.Hedge, Med.Hypotheses, 35 (1991) 159-164
(27) J.L.Bartha, R.Romero-Carmona, M.Escobar-Llompart et al., Obstet.Gynecoi., 102, 995- 999
(28) P.Toth, Semin.Reprod.Med., 19, 55-61
(29) J.Zaidi, R.Pittrof, A.Shaker et al., Fertil.Steril., 65 (1996) 377-381
(30) AJ.Ziecik, G.Golba and J.Kiesielewska, Exp. CiIn. Endocrinol. Diabetes, 104 (1996) 158- 163
(31) L.-H. Garn and A.Latiff, Int. J. Biol. Sei., 1 (2005) 103-109
(32) Garcia-Campayo,V. et al., 194 (2002) 63-70 (33) F. Fandrich, X. Lin et al., Transplant.Proc, 30 (1998) 2360-2361
(34) F. Fandrich, X. Lin et al., Nat.Med., 8 (2002) 171 -178
(35) M.M. Matzuk, J.L. Keene et al. J.Biol.Chem., 264 (1989) 2409-2414
(36) V. Garcia-Campayo, T. Sugahara, et al., Mol.Cell Endocrinol. 194 (2002) 63-70
(37) S. Birken, P. Berger et al., Clin.Chem., 49 (2003) 144-154
(38) CM. Howles, Hum.Reprod.Update, 2 (1996) 172-191

Claims

Patentansprüche
1. Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen oder zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder Transplatationsprozessen, enthaltend mindestens je a.) eine Präkursor-hCG ss-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins ausgewählt aus hCG ss6 gemäss SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2 und hCG ss7 gemäss SEQ ID NO 5 oder eine mature hCG ss-Untereinheit ausgewählt aus hCG ss6 gemäss SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4 und hCG ss7 gemäss SEQ ID NO 6 oder glykolisierte Fragmente dieser Sequenzen, b.)
eine Präkursor [alpha]-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäss SEQ ID NO 9 oder die mature [alpha]-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäss SEQ ID NO 10 oder glykolisierte Fragmente dieser Sequenzen Fragmente wobei die ss-Untereinheiten und [alpha]-Untereinheiten bevorzugt in äquimolaren Mengen eingesetzt werden.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass a) die Präkursor-hCG ss-Untereinheit ss6 gemäss SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2 oder ss7 gemäss SEQ ID NO 5 an mindestens einer der folgenden Aminosäuren glycolisiert ist: Asn-33, Asn-50, Ser-141, Ser-147, SeM 52, Ser158 und/oder b) die mature ss-Untereinheit ss6 gemäss SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4 oder hCG ss7 gemäss SEQ ID NO 6 an mindestens einer der folgenden Aminosäuren glycolisiert ist: Asn-13, Asn-30, Ser-121 , Ser-127, Ser-132, Ser138 und/oder c) die Präkursor-hCG [alpha]-Untereinheit gemäss SEQ ID NO 9 an mindestens einer der folgenden Aminosäuren glycolisiert ist: Asn-76, Asn-102 und/oder d) die mature [alpha]-Untereinheit gemäss SEQ ID NO 10 an mindestens einer der folgenden Aminosäuren glycolisiert ist: Asn-52, Asn-78.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die PräkursorhCG ss-Untereinheit, die mature hCG ss-Untereinheit, die Präkursor [alpha]-Untereinheit, die mature [alpha]-Untereinheit und/oder die Fragmente rekombinant hergestellt sind.
4. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel für eine parenterale Verabreichung oder eine subkutane Injektion angepasst ist.
5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel so angepasst ist, dass die Menge an verabreichtem humanem Choriongonadotropin 3 bis 6 [mu]g pro kg Körpergewicht pro Tag beträgt.
6. Verwendung einer Präkursor-hCG ss-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins ausgewählt aus hCG ss6 gemäss SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2 und hCG ss7 gemäss SEQ ID NO 5 oder einer maturen hCG ss-Untereinheit ausgewählt aus hCG ss6 gemäss SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4 und hCG ss7 gemäss SEQ ID NO 6 oder glykolisierten Fragmenten dieser Sequenzen in Kombination mit einer Präkursor [alpha]-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäss SEQ ID NO 9 oder der maturen [alpha]-Untereinheit des humanen Choriongonadotropins gemäss SEQ ID NO 10 oder glykolisierten Fragmenten dieser Sequenzen, wobei die ss-Untereinheiten und [alpha]-Untereinheiten bevorzugt in äquimolaren Mengen eingesetzt werden, zur Behandlung von Schwangerschaftsstörungen oder zur Induktion einer immunologischen Toleranz bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder Transplatationsprozessen.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Präkursor-hCG ss-Untereinheit ss6 gemäss SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 2 oder ss7 gemäss SEQ ID NO 5 an mindestens einer der folgenden Aminosäuren glycolisiert ist: Asn-33, Asn-50, Ser-141 , Ser-147, Ser-152, Ser158 und/oder b) die mature ss-Untereinheit ss6 gemäss SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4 oder hCG ss7 gemäss SEQ ID NO 6 an mindestens einer der folgenden Aminosäuren glycolisiert ist: Asn-13, Asn-30, Ser-121 , SeM 27, SeM 32, Ser138 und/oder c) die Präkursor-hCG [alpha]-Untereinheit gemäss SEQ ID NO 9 an mindestens einer der folgenden Aminosäuren glycolisiert ist: Asn-76, Asn-102 und/oder d) die mature [alpha]-Untereinheit gemäss SEQ ID NO 10 an mindestens einer der folgenden Aminosäuren glycolisiert ist: Asn-52, Asn-78.
8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dadurch gekennzeichnet, dass die Präkursor-hCG ss-Untereinheit, die mature hCG ss-Untereinheit, die Präkursor [alpha]-Untereinheit, die mature [alpha]-Untereinheit und/oder die Fragmente rekombinant hergestellt sind.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Präkursor-hCG ss-Untereinheit, die mature hCG ss-Untereinheit, die Präkursor [alpha]- Untereinheit, die mature [alpha]-Untereinheit und/oder die Fragmente rekombinant hergestellt sind.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Schwangerschaftsstörung eine Fertilitätsstörung, eine Implantationsstörung, früher Schwangerschaftsverlust, imminenter und habitueller Abort sowie Frühgeburt, Wachstumsretardierung oder Präeklampsie ist.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Verabreichung parenteral, durch subkutane oder intravenöse Injektion erfolgt.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass 3 bis 6 [mu]g humanes Choriongonadotropin pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden.
13. Verwendung nach einem der Anprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass dem Patienten entnommene mononukleäre Blutzellen in vitro behandelt und dem Patienten subkutan oder intravenös zurück injiziert werden.
EP06805531A 2005-11-22 2006-11-21 Arzneimittel zur behandlung von fertilitäts- und schwangerschaftsstörungen, autoimmunerkrankungen und zur induktion einer immunologischen toleranz bei transplantationspatienten und verfahren zur herstellung Withdrawn EP1951287A2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005056832 2005-11-22
PCT/DE2006/002089 WO2007059761A2 (de) 2005-11-22 2006-11-21 Arzneimittel zur behandlung von fertilitäts- und schwangerschaftsstörungen, autoimmunerkrankungen und zur induktion einer immunologischen toleranz bei transplantationspatienten und verfahren zur herstellung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1951287A2 true EP1951287A2 (de) 2008-08-06

Family

ID=38067562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP06805531A Withdrawn EP1951287A2 (de) 2005-11-22 2006-11-21 Arzneimittel zur behandlung von fertilitäts- und schwangerschaftsstörungen, autoimmunerkrankungen und zur induktion einer immunologischen toleranz bei transplantationspatienten und verfahren zur herstellung

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100021447A1 (de)
EP (1) EP1951287A2 (de)
DE (1) DE112006003712A5 (de)
WO (1) WO2007059761A2 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110267068A (zh) * 2014-04-27 2019-09-20 Lg电子株式会社 广播接收机及其方法以及用于发送广播信号的方法和设备
WO2016171543A1 (en) * 2015-04-22 2016-10-27 Cadens Beheer B.V. Improved contraceptive methods and compositions and devices for use therein
WO2020013830A1 (en) 2018-07-12 2020-01-16 Prima-Temp, Inc. Vaginal temperature sensing apparatus and methods

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5639639A (en) * 1983-11-02 1997-06-17 Genzyme Corporation Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof
GB9403600D0 (en) * 1994-02-24 1994-04-13 Univ Glasgow Three dimensional hormone structure
US6844315B2 (en) * 1998-05-20 2005-01-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Immunoregulator
AT249835T (de) * 1998-05-20 2003-10-15 Univ Erasmus Immunoregulator
DE112004001498D2 (de) * 2003-06-06 2006-04-27 Univ Leipzig Verfahren und mittel zur Bestimmung von Definierten Zuständen oder Veränderungen in der Uterusschleimhaut oder im Epithel anderer Organe

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007059761A2 (de) 2007-05-31
WO2007059761A3 (de) 2007-09-07
DE112006003712A5 (de) 2008-10-30
US20100021447A1 (en) 2010-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huirne et al. Contemporary pharmacological manipulation in assisted reproduction
HUE028357T2 (en) Improved recombinant human follicle-stimulating hormone
Ludwig et al. Ovarian stimulation: from basic science to clinical application
Loumaye et al. Clinical assessment of human gonadotrophins produced by recombinant DNA technology
Abucham et al. Acromegaly and pregnancy: a contemporary
EP1951287A2 (de) Arzneimittel zur behandlung von fertilitäts- und schwangerschaftsstörungen, autoimmunerkrankungen und zur induktion einer immunologischen toleranz bei transplantationspatienten und verfahren zur herstellung
ES2399962T3 (es) Método de hiperestimulación ovárica controlada y kit farmacéutico para uso en este método
Ron-El et al. The comparison of early follicular and midluteal administration of long-acting gonadotropin-releasing hormone agonist
DE2421943C2 (de)
Fujita et al. Administration of thymocytes derived from non-pregnant mice induces an endometrial receptive stage and leukaemia inhibitory factor expression in the uterus.
DE69835368T2 (de) Verwendung von tgf beta oder activin zur behandlung und diagnose von unfruchtbarkeit
Goa et al. Follitropin alpha in infertility
EP1386615B1 (de) EG-VEGF/Prokineticin 2 Rezeptor Antagonisten
JP2866196B2 (ja) 不妊症治療用医薬
EP2148694A2 (de) Arzneimittel zur behandlung von fertilitäts- und trächtigkeitsstörungen, immunologisch-bedingten erkrankungen und transplantation für die anwendung in der tiermedizin, insbesondere bei pferden sowie verfahren zur herstellung und therapiekontrolle
Gordon New developments in gonadotrophin pharmacology
DE69907725T2 (de) Verbesserung der follikelgenese
Belt et al. Fine structural study of a possible mechanism of secretion by the interrenal cells of the brown pelican
EP0538394B1 (de) Behandlung von männerunfruchtbarkeit
AU2002353464B2 (en) The use of leptin in fertility
Emperaire