EP1781696A1 - Nouvelles sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leurs utilisations - Google Patents

Nouvelles sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leurs utilisations

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EP1781696A1
EP1781696A1 EP05798193A EP05798193A EP1781696A1 EP 1781696 A1 EP1781696 A1 EP 1781696A1 EP 05798193 A EP05798193 A EP 05798193A EP 05798193 A EP05798193 A EP 05798193A EP 1781696 A1 EP1781696 A1 EP 1781696A1
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EP
European Patent Office
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phosphorylated
antibody
protein
sequence seq
serine residue
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05798193A
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German (de)
English (en)
Inventor
Bernard Ducommun
Martine Cazales
Bernard Monsarrat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the subject of the present invention is novel phosphorylated CDC25CB phosphatase sequences as well as polyclonal or monoclonal antibodies directed against these sequences.
  • the subject of the present invention is also the use of these novel phosphorylated sequences, in particular for the implementation of a method for in vitro screening of inhibitory compounds for cell mitosis, namely compounds which inhibit the entry into mitosis of cells. or progression of mitosis.
  • CDC25B is a cell cycle regulatory phosphatase essential for the control of mitotic entry and progression of mitosis. It belongs to a family that has three members encoded by different genes (CDC25A, B and C) in mammals.
  • the CDC25B protein is expressed and active at the end of the G2 phase of the cell cycle (Baldin et al., 1997, Gabrielli et al., 1996). Its intracellular localization is regulated by NES and NLS sequences (Davezac et al., 2000) and by its interaction with 14-3-3 proteins (Mils et al., 2000, Forrest et al., 2001).
  • CDC25B may act as a "starter" of early mitotic events (Nilsson et al., 2000). It may play a role in the initial activation of a CDC2 / cyclin B population at the centrosome before nuclear translocation (Kumagai et al., 1992, Hoffmann et al, 1993). CDC25B activates CDK / cyclin complexes to allow the architectural and biochemical reworkings that are required to enable the process of cell division. Its activity is regulated by the variations of its expression, by its association with regulatory partners and by phosphorylation events. Thus, a signaling cascade leads to the modulation of the catalytic activity of CDC25B involved in regulating the entry into mitosis.
  • One of the aims of the invention is to provide a new phosphorylated sequence of CDC25B phosphatase, as well as a new antibody directed against the phosphorylated phosphorylated CDC25B phosphatase epitope.
  • One of the aims of the present invention consists in providing a method of in vitro screening of inhibitory compounds for mitosis of cells, in particular the entry into mitosis, said inhibitory compounds being able to be especially used in the context of an anticancer therapy.
  • the present invention relates to a peptide sequence characterized in that it comprises or consists of a fragment of at least about 10 amino acids derived from the following sequence SEQ ID NO: 1:
  • phosphorylated residue refers to an amino acid carrying a phosphate group.
  • the present invention relates to a peptide sequence as defined above, characterized in that it comprises or consists of the following sequence SEQ ID NO: 2:
  • sequence SEQ ID NO: 2 corresponds to a fragment of the sequence SEQ ID NO: 1 mentioned above. More exactly, it corresponds to the fragment of SEQ ID NO: 1 delimited from the amino acid in position 4 to the amino acid in position 16.
  • the present invention also relates to a peptide sequence as defined above, characterized in that it comprises or consists of one of the following sequences:
  • sequence SEQ ID NO: 3 representing the CDC25B1 splice variant of the protein of human origin of the CDC25B phosphatase, whose serine residue in position
  • sequence SEQ ID NO: 4 representing a CDC25B2 splice variant of the protein of human origin of CDC25B phospliatase, whose serine residue at position 208 is phosphorylated
  • sequence SEQ ID NO: 5 representing a CDC25B3 splice variant of the protein of human origin of the CDC25B phosphatase, whose serine residue in position
  • sequence SEQ ID NO: 6 representing a CDC25B4 splice variant of the protein of human origin of the CDC25B phosphatase, whose serine residue at position 259 is phosphorylated
  • the present invention also relates to a polyclonal or monoclonal antibody capable of recognizing a peptide sequence as defined above, provided that said antibody does not recognize the sequence SEQ ID NO: 8 in which the serine residue in position 249 does not is not phosphorylated.
  • sequence SEQ ID NO: 8 corresponds to the protein sequence of unphosphorylated CDC25B.
  • An advantageous polyclonal antibody of the invention is characterized in that it is capable of recognizing the sequence SEQ ID NO: 2 as defined above, provided that said antibody does not recognize the sequence SEQ ID NO: 8 in which the serine residue at position 249 is not phosphorylated.
  • Such an antibody directed against the phosphorylated epitope of sequence SEQ ID NO: 2 is generated by immunizing rabbits with said epitope. More specifically, said epitope is covalently coupled with a carrier protein such as hemocyanin, BSA or ovalbumin.
  • a carrier protein such as hemocyanin, BSA or ovalbumin.
  • the rabbits are then immunized for 3 months (4 injections in total) and the final bleeding allows the recovery of about 50 ml of serum.
  • the serum is then doubly purified by affinity on a phosphorylated peptide column and then on a non-phosphorylated peptide column.
  • the present invention also relates to a method for preparing a monoclonal antibody as defined above, in particular directed against the peptide sequence SEQ ID NO: 2 as defined above, characterized in that it results from the selection of a hybridoma secreting an antibody directed against the peptide sequence ' as defined above or the selection in an expression library of a complementary DNA encoding all or part of an antibody.
  • the present invention also relates to a method for preparing a monoclonal antibody as defined above, in particular directed against the peptide sequence SEQ ID NO: 2 as defined above, characterized in that it comprises the following steps:
  • the animal used for the immunization step is especially a mouse.
  • Mybites used for fusion come from a mouse.
  • the splenocytes used for the fusion come from an animal of the same species as that from which the myelomas originate, namely in particular from a mouse.
  • Hybridomas which secrete the antibodies against the peptide sequence SEQ ID NO: 2 are chosen on the basis of the production of antibodies capable of recognizing in an ELISA test the phosphorylated peptide used for the immunization but not the non-phosphorylated peptide.
  • the present invention also relates to a method for preparing a monoclonal antibody as defined above, in particular directed against the peptide sequence SEQ ID NO: 2 as defined above, characterized in that it comprises a selection step in an expression library of a cDNA encoding all or part of an antibody.
  • the antibodies are selected against the peptide sequence SEQ ID NO: 2 on the basis of their ability to recognize in an ELISA test, by protein transfer (western blot) or by any other appropriate method, the phosphorylated peptide used for the immunization, but not the unphosphorylated peptide.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it contains as active substance a peptide sequence as defined above or an antibody as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to the use of the peptide sequence as defined above, or of an antibody as defined above, for the preparation of a medicament for the treatment of hyperproliferative diseases such as cancers.
  • the present invention also relates to the use of an antibody as defined above, for the implementation of a method for the in vitro detection of mitotic cells, expressing a protein sequence as defined above, among cells in culture or sections of healthy or tumorous tissue.
  • the present invention also relates to the use of an antibody as defined above, for the implementation of a method for the in vitro detection of the overexpression of a protein sequence as defined above, in cells in culture or sections of healthy or tumorous tissue, especially in sections of tumors of the breast, lungs or pancreas.
  • the present invention also relates to a method for in vitro screening of compounds that inhibit mitosis, namely the entry into mitosis of cells or the progression of mitosis, said inhibitory compounds being able to be used especially in the context of a therapy.
  • anticancer agent characterized in that it comprises:
  • the selection of the inhibitory compounds by detecting the absence of binding of the antibody as defined above, said antibody being capable of recognizing a peptide sequence as defined above, by an appropriate method, especially using ELISA, protein transfer (Western Blot) or indirect immunofluorescence techniques.
  • FIGS. 1A, 1B, 1C, 1D and 1E show the detection of the phosphorylated form of CDC25B on serine 249 by immunofluorescence at different cell stages.
  • Figure IA corresponds to the interphase
  • Figure IB corresponds to prophase
  • Figure IC corresponds to the metaphase
  • Figure ID corresponds to anaphase / telophase
  • Figure IE corresponds to the Gl phase.
  • Figure 2 shows the detection of the phosphorylated form of CDC25B on serine 249 by protein transfer (western blot).
  • Mass spectrometry analysis performed on CDC25B detected phosphorylation of the serine residue at position 249.
  • the CDC25B protein was purified and then digested with trypsin. MS / MS mass spectrometry analysis revealed the presence of a monophosphorylated peptide. The fragmentation of this peptide allowed the identification of the phosphate group on serine 249.
  • Anti-S249P antibodies recognize CDC25B protein in mitotic cells.
  • HeLa cells were fixed and used to perform immunofluorescence analysis with these antibodies. The cells were also stained with 4'-6-diamino-2-phenylindole (DAPI) to locate the nucleus.
  • DAPI 4'-6-diamino-2-phenylindole
  • the images presented in Figure 1 are representative of observations on a large number of cells. They indicate that the CDC25B protein phosphorylated on serine 249 (SEQ ID NO: 2) is accumulated very abundantly in mitotic cells, in particular at the spindle poles. This labeling is abolished when a competition is carried out with the test with the phosphorylated peptide having served for the immunization but not with the non-phosphorylated peptide (MEVEELSPLALGR) or with an unrelated phosphorylated peptide.
  • the CDC25B protein was purified from cultured cells and then analyzed by western blot with the antibodies against CDC25B phosphorylated phosphatase at serine 249. As shown in Figure 2, the CDC25B protein is phosphorylated in vivo at this site. Treatment with lambda phosphatase abolishes this phosphorylation. The detection is eliminated by competition with the phosphorylated peptide used for immunization.
  • a - Mitotic cell marker
  • the detection of the phosphorylation of the phosphorylated form of CDC25B makes it possible to detect the presence of mitotic cells on cells in culture or on tumor sections.
  • the phosphorylated form of CDC25B on serine 249 is present in the mitotic cell. Its location is nuclear in prophase, then it is concentrated in metaphase on the two mitotic hemi-spindles before invading the equatorial plane in telophase, then disappear at the end of mitosis.
  • the polyclonal or monoclonal antibodies directed against this phosphorylated form of CDC25B therefore allow the detection of any mitotic cell expressing CDC25B phosphatase.
  • This detection of mitotic cells can be carried out on cells in fixed culture or on sections of healthy or tumoral tissues, using indirect immunofluorescence or immunocytochemistry techniques.
  • the detection of mitotic cells by this method is thus a new tool at the disposal of cytologists and anatomo-pathologists.
  • CDC25B The expression of CDC25B is variable depending on the tissues. It has been shown that tumors (breast, lung, pancreas, ...) overexpress this protein. In the case of pancreatic tumors, tumor growth is dependent on the expression and function of CDC25B (Guo et al, 2004).
  • New pharmacological agents capable of targeting CDC25B are currently being developed by the industry (Prévost et al., 2003). It is therefore essential to take into account the level of expression of CDC25B phosphatase in order to determine the relevance of the use of such a treatment.
  • the use of antibodies directed against the phosphorylated form of CDC25B on serine 249 reveals the mitotic (and probably active) form of this phosphatase. Its detection (by immunocytochemistry) in biopsies or surgical specimens after surgical excision provides information likely to guide the therapeutic choice by possibly posing, if CDC25B is overexpressed, the indication of a use of inhibitors of CDC25 phosphatases.
  • the search for molecules interfering with the cell cycle may use the antibodies according to the invention to evaluate the inhibition of entry into mitosis.
  • An active search for molecules inhibiting progression in the cell cycle is currently being conducted by many pharmaceutical groups.
  • Demonstration of a mitotic cell marker is a tool of choice for simply exploring, in high-throughput screens, the ability of molecules to inhibit entry and progression into mitosis.
  • Antibodies against the phosphorylated form of CDC25B can meet this need. They can thus be used in immunocytochemistry, flow cytometry or any other suitable method for detecting the phosphorylated CDC25B protein.

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Abstract

La présente invention concerne une séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par un fragment d'au moins environ 10 acides aminés issus de la séquence SEQ ID NO : 1 suivante : DRKMEVEELS<SUB>p</SUB>PLALGRFSL SEQ ID NO: 1 dans laquelle le résidu serine en position 10 est phosphorylé, ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu serine phosphorylé. La présente invention concerne également un anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître une séquence peptidique telle que définie ci-dessus.

Description

NOUVELLES SEQUENCES PHOSPHORYLÉES DE LA PHOSPHATASE CDC25B, ANTICORPS DIRIGÉS CONTRE CES SÉQUENCES AINSI QUE LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet de nouvelles séquences phosphorylées de la phosphatase CDC25CB ainsi que des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre ces séquences. La présente invention a également pour objet l'utilisation de ces nouvelles séquences phosphorylées notamment pour la mise en œuvre d'un procédé de criblage in vitro de composés inhibiteurs de la mitose cellulaire, à savoir des composés inhibiteurs de l'entrée en mitose des cellules ou de la progression de la mitose.
Les mécanismes qui contrôlent la division des cellules mettent en jeu de nombreux acteurs dont les activités sont régulées par des réactions de phosphorylation et de déphosphorylation, impliquant des kinases et des phosphatases. Des dérégulations de ces mécanismes ont été identifiées dans de nombreux cancers. Leur identification et leur caractérisation ouvrent aujourd'hui de nouvelles perspectives pour le diagnostic et le traitement de la maladie cancéreuse.
CDC25B est une phosphatase régulatrice du cycle cellulaire essentielle pour le contrôle de l'entrée en mitose et de la progression de la mitose. Elle appartient à une famille qui compte trois membres codés par des gènes différents (CDC25A, B et C) chez les mammifères. La protéine CDC25B est exprimée et active en fin de phase G2 du cycle cellulaire (Baldin et al., 1997 ; Gabrielli et al., 1996). Sa localisation intracellulaire est régulée par des séquences NES et NLS (Davezac et al., 2000) et par son interaction avec les protéines 14-3-3 (Mils et al., 2000 ; Forrest et al., 2001). Il a été suggéré que CDC25B puisse agir comme un "starter" des événements mitotiques précoces (Nilsson et al., 2000). Elle pourrait jouer un rôle dans l'activatiori initiale d'une population de CDC2/cycline B au niveau du centrosome avant sa translocation nucléaire (Kumagai et al., 1992 ; Hoffmann et al, 1993). CDC25B active les complexes CDK/cycline pour permettre les remaniements architecturaux et biochimiques qui sont nécessaires pour permettre le processus de division cellulaire. Son activité est régulée par les variations de son expression, par son association à des partenaires régulateurs et par des événements de phosphorylation. Ainsi, une cascade de signalisation conduit à la modulation de l'activité catalytique de CDC25B participant à la régulation de l'entrée en mitose.
Un des buts de l'invention consiste à fournir une nouvelle séquence phosphorylée de la phosphatase CDC25B, ainsi qu'un nouvel anticorps dirigé contre l'épitope phosphorylé de la phosphatase CDC25B phosphorylée.
Un des buts de la présente invention consiste à fournir un procédé de criblage in vitro de composés inhibiteurs de la mitose des cellules, notamment de l'entrée en mitose, lesdits composés inhibiteurs pouvant être notamment utilisés dans le cadre d'une thérapie anticancéreuse. La présente invention concerne une séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par un fragment d'au moins environ 10 acides aminés issus de la séquence SEQ ID NO : 1 suivante :
DRKMEVEELSpPLALGRPSL SEQ ID NO : 1 dans laquelle le résidu serine en position 10 est phosphorylé, ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu serine phosphorylé.
L'expression "résidu phosphorylé" désigne un acide aminé porteur d'un groupement phosphate.
Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par la séquence SEQ ID NO : 2 suivante :
MEVEELSpPLALGR SEQ ID NO : 2 dans laquelle le résidu serine en position 7 est phosphorylé.
La séquence SEQ ID NO : 2 correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1 susmentionnée. Plus exactement, elle correspond au fragment de SEQ ID NO : 1 délimité de l'acide aminé en position 4 à l'acide aminé en position 16.
La présente invention concerne également une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes :
- la séquence SEQ ID NO : 3, représentant le variant d'épissage CDC25B1 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position
235 est phosphorylé, - la séquence SEQ ID NO : 4, représentant un variant d'épissage CDC25B2 de la protéine d'origine humaine de la phospliatase CDC25B, dont le résidu serine en position 208 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 5, représentant un variant d'épissage CDC25B3 de la .5 protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position
249 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 6, représentant un variant d'épissage CDC25B4 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 259 est phosphorylé,
[0 - la séquence SEQ ID NO : 7, représentant un variant d'épissage CDC25B5 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 284 est phosphorylé.
La présente invention concerne également un anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, sous L 5 réserve que ledit anticorps ne reconnaisse pas la séquence SEQ ID NO : 8 dans laquelle le résidu serine en position 249 n'est pas phosphorylé.
La séquence SEQ ID NO : 8 correspond à la séquence protéique de CDC25B non phosphorylée.
Un anticorps polyclonal avantageux de l'invention est caractérisé en ce qu'il est 20 susceptible de reconnaître la séquence SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus, sous réserve que ledit anticorps ne reconnaisse pas la séquence SEQ ID NO : 8 dans laquelle le résidu serine en position 249 n'est pas phosphorylé.
Un tel anticorps dirigé contre l'épitope phosphorylé de séquence SEQ ID NO : 2 est généré en immunisant des lapins avec ledit épitope. 5 Plus précisément, ledit épitope est couplé de façon covalente avec une protéine porteuse telle que l'hémocyanine, la BSA ou l'ovalbumine. Les lapins sont alors immunisés pendant 3 mois (4 injections au total) et la saignée finale permet la récupération d'environ 50 ml de sérum. Le sérum est ensuite doublement purifié par affinité sur une colonne de peptide phosphorylé puis sur une colonne de peptide non 0 phosphorylé.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'il résulte de la sélection d'un hybridome sécrétant un anticorps dirigé contre la séquence peptidique' telle que définie ci-dessus ou de la sélection dans une banque d'expression d'un ADN complémentaire codant pour toute ou partie d'un anticorps.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre la séquence peptidique SEQ TD NO : 2 telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la fusion entre des myélomes d'un animal immunisé, notamment d'un animal non humain préalablement immunisé, par injection de la séquence peptidique telle que définie ci-dessus et des splénocytes d'un animal, notamment d'un animal non humain, afin d'obtenir des hybridomes,
- la mise en culture des hybridomes ainsi obtenus,
- la récupération et purification par clonage d'un hybridome, choisi parmi ceux obtenus à l'étape précédente et sécrétant un anticorps dirigé contre la séquence peptidique telle que définie ci-dessus. L'animal utilisépour l'âape d'immunisation est notamment une souris.
Les myébmes utilisés pour la fusion proviennent notamment d'une souris. Les splénocytes utilisés pour la fusion proviennent d'un animal de la même espèce que celle dont provient les myélomes, à savoir notamment d'une souris.
On choisit les hybridomes qui sécrètent les anticorps contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 sur la base de la production d'anticorps capables de reconnaître dans un test ELISA le peptide phosphorylé utilisé pour l'immunisation mais pas le peptide non phosphorylé.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de sélection dans une banque d'expression d'un ADNc codant pour toute ou partie d'un anticorps.
Les anticorps sont sélectionnés contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 sur la base de leur capacité à reconnaître dans un test ELISA, par transfert de protéines (western blot) ou par toute autre méthode appropriée, le peptide phosphorylé utilisé pour l'immunisation, mais pas le peptide non phosphorylé.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active une séquence peptidique telle que définie ci-dessus ou un anticorps tel que défini ci-dessus, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également l'utilisation de la séquence peptidique telle que définie ci-dessus, ou d'un anticorps tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies hyperprolifératives telles que les cancers.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un anticorps tel que défini ci-dessus, pour la mise en œuvre d'un procédé de détection in vitro de cellules mitotiques, exprimant une séquence protéique telle que définie ci-dessus, parmi des cellules en culture ou des coupes de tissus sains ou tumoraux.
Les cellules en culture sont fixées, perméabilisées puis incubées en présence de l'anticorps. La révélation de l'anticorps est effectuée par utilisation d'un anticorps secondaire porteur d'un fluorochrome (l'observation est alors effectuée avec un microscope à fluorescence) ou d'une molécule permettant l'hydrolyse d'un substrat et la production d'une réaction colorée observable en lumière visible. Une stratégie expérimentale similaire peut être appliquée sur des coupes de tissus.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un anticorps tel que défini ci-dessus, pour la mise en œuvre d'un procédé de détection in vitro de la surexpression d'une séquence protéique telle que définie ci-dessus, dans des cellules en culture ou des coupes de tissus sains ou tumoraux, notamment dans des coupes de tumeurs du sein, des poumons ou du pancréas.
La mise en évidence de la surexpression de CDC25B repose sur la même stratégie expérimentale que décrite ci-dessus pour le procédé de détection de cellules mitotiques.
Elle peut également être effectuée par transfert de protéines (western blot) ou par toute autre méthode capable de quantifier une protéine d'intérêt sur des extraits protéiques totaux préparés à partir des cellules saines ou tumorales.
La présente invention concerne également un procédé de criblage in vitro de composés inhibiteurs de la mitose, à savoir de l'entrée en mitose des cellules ou de la progression de la mitose, lesdits composés inhibiteurs pouvant être notamment utilisés dans le cadre d'une thérapie anticancéreuse, caractérisé en ce qu'il comprend :
— la mise en présence dudit composé avec des cellules, et
- la sélection des composés inhibiteurs par détection de l'absence de liaison de l'anticorps tel que défini ci-dessus, ledit anticorps étant susceptible de reconnaître une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, par une méthode appropriée, notamment en utilisant les techniques ELISA, de transfert de protéines (Western Blot) ou d'immunofluorescence indirecte.
DESCRIPTION DES FIGURES Les Figures IA, IB, IC, ID et IE représentent la détection de la forme phosphorylée de CDC25B sur la serine 249 par immunofluorescence à différents stades cellulaires. La Figure IA correspond à l'interphase ; la Figure IB correspond à la prophase ; la Figure IC correspond à la métaphase ; la Figure ID correspond à l'anaphase/télophase ; et la Figure IE correspond à la phase Gl.
La Figure 2 représente la détection de la forme phosphorylée de CDC25B sur la serine 249 par transfert de protéines (western blot).
La colonne 1 correspond à la protéine CDC25B purifiée seule ; la colonne 2 correspond à la protéine CDC25B purifiée avec le peptide phosphorylé ; la colonne 3 correspond à la protéine CDC25B purifiée avec le peptide non phosphorylé ; et la colonne 4 correspond au traitement de CDC25B avec la phosphatase lambda.
METHODES ET RESULTATS
La phosphatase CDC25B est phosphorylée sur la serine 249
L'analyse par spectrométrie de masse réalisée sur CDC25B a permis de détecter la phosphorylation du résidu serine en position 249.
La protéine CDC25B a été purifiée puis digérée par la trypsine. L'analyse par spectrométrie de masse MS/MS a révélé la présence d'un peptide monophosphorylé. La fragmentation de ce peptide a permis l'identification du groupement phosphate sur la serine 249.
Production d'anticorps contre la protéine CDC25B phosphorylée sur l'acide aminé serine 249 Le peptide de séquence MEVEELS (p)PL ALGR (SEQ ID NO : 2), où (p) désigne la serine phosphorylée, a été utilisé pour l'immunisation de lapins. Après sacrifice des animaux, le sérum a été purifié par chromatographie en deux étapes : la première sur une colonne de peptide phosphorylé pour retenir les anticorps spécifiques, puis la deuxième sur une colonne du même peptide non phosphorylé de séquence MEVEELSPLALGR (SEQ ID NO : 9), de manière à purifier dans Muât les anticorps spécifiques de la forme phosphorylée. La reconnaissance du peptide phosphorylé par les anticorps a été validée dans un test ELISA. Par la suite, ces anticorps sont désignés sous le nom de anti-S249P.
Les anticorps anti-S249P reconnaissent la protéine CDC25B dans des cellules en mitose.
A) Des cellules HeLa ont été fixées et utilisées pour effectuer une analyse par immunofluorescence avec ces anticorps. Les cellules ont également été colorées avec le 4'-6-diamino-2-phénylindole (DAPI) pour localiser le noyau. Les images présentées à la figure 1 sont représentatives d'observations sur un grand nombre de cellules. Elles indiquent que la protéine CDC25B phosphorylée sur la serine 249 (SEQ ID NO : 2) est accumulée de façon très abondante dans les cellules en mitose, en particulier au niveau des pôles du fuseau. Ce marquage est aboli lorsqu'une compétition est réalisée avec le test avec le peptide phosphorylé ayant servi à l'immunisation mais pas avec le peptide non phosphorylé (MEVEELSPLALGR) ni avec un peptide phosphorylé sans rapport.
B) La protéine CDC25B a été purifiée à partir de cellules en culture puis analysée par transfert de protéines (western blot) avec les anticorps contre la phosphatase CDC25B phosphorylée au niveau de la serine 249. Comme le montre la figure 2, la protéine CDC25B est phosphorylée in vivo sur ce site. Le traitement par la phosphatase lambda abolit cette phosphorylation. La détection est éliminée par compétition avec le peptide phosphorylé ayant servi à l'immunisation.
Ces observations valident l'utilisation de ces anticorps pour la détection de la protéine CDC25B phosphorylée dans les cellules mitotiques.
DOMAINES D'APPLICATION
A - Marqueur de cellules mitotiques :
La détection de la phosphorylation de la forme phosphorylée de CDC25B permet de détecter la présence de cellules mitotiques sur des cellules en culture ou sur des coupes de tumeurs.
La forme phosphorylée de CDC25B sur la serine 249 est présente dans la cellule en mitose. Sa localisation est nucléaire en prophase, puis elle est concentrée en métaphase sur les deux hémi-fuseaux mitotiques avant d'envahir le plan équatorial en télophase, puis disparaître en fin de mitose.
Les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre cette forme phosphorylée de CDC25B permettent par conséquent la détection de toute cellule mitotique exprimant la phosphatase CDC25B.
Cette détection des cellules mitotiques peut être réalisée sur des cellules en culture fixées ou sur des coupes de tissus sains ou tumoraux, en utilisant les techniques d'immuno fluorescence indirecte ou d'immunocytochimie.
La détection des cellules mitotiques par cette méthode est ainsi un outil nouveau à la disposition des cytologistes et des anatomo-pathologistes.
B - Aide à la décision thérapeutique :
La prise en compte des niveaux d'expression de CDC25B dans les tumeurs a un intérêt majeur dans le choix de la décision thérapeutique (utilisation ou non de drogues ciblant la protéine CDC25B). La détection de la forme phosphorylée de CDC25B sur la serine 249 a un intérêt majeur dans cette application.
L'expression de CDC25B est variable en fonction des tissus. Il a été montré que des tumeurs (sein, poumon, pancréas, ...) surexpriment cette protéine. Dans le cas des tumeurs du pancréas, la croissance tumorale est dépendante de l'expression et de la fonction de CDC25B (Guo et al, 2004).
De nouveaux agents pharmacologiques capables de cibler CDC25B sont actuellement développés par l'industrie (Prévost et al., 2003). Il est donc essentiel de prendre en compte le niveau d'expression de la phosphatase CDC25B afin de déterminer la pertinence de l'utilisation d'un tel traitement. L'utilisation d'anticorps dirigés contre la forme phosphorylée de CDC25B sur la serine 249 permet de révéler la forme mitotique (et probablement active) de cette phosphatase. Sa détection (par immunocytochimie) dans des biopsies ou sur les pièces opératoires après exérèse chirurgicale apporte des éléments d'information de nature à orienter le choix thérapeutique en posant éventuellement, si CDC25B est surexprimée, l'indication d'une utilisation d'inhibiteurs des phosphatases CDC25.
C - Mise en place de criblage à haut débit :
La recherche de molécules interférant avec le cycle cellulaire peut utiliser les anticorps selon l'invention pour évaluer l'inhibition de l'entrée en mitose. Une recherche active de molécules inhibitrices de la progression dans le cycle cellulaire est actuellement menée par de nombreux groupes pharmaceutiques.
La mise en évidence d'un marqueur de cellules mitotiques représente un outil de choix pour explorer de façon simple et dans des cribles à haut débit la capacité de molécules à inhiber l'entrée et la progression en mitose.
Les anticorps contre la forme phosphorylée de CDC25B peuvent répondre à ce besoin. Ils peuvent ainsi être utilisés en immunocytochimie, en cytométrie de flux ou par toute autre méthode adaptée permettant de détecter la protéine CDC25B phosphorylée.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
- Baldin, V., Cans, C, Superti-Furga, G. & Ducommun, B (1997) Alternative splicing of the human CDC25B tyrosine phoshatase. Possible implications for growth control? Oncogene, 14, 2485-2495,
- Davezac, N. et al. (2000) Régulation of CDC25B phosphatases subcellular localization, Oncogene, 19, 2179-85,
- Forrest A. & Gabrielli, B. (2001) Cdc25B activity is regulated by 14-3-3, Oncogene, 20, 4393-401,
- Gabrielli, B. G. et al. (1996) Cytoplasmic accumulation of CDC25B phosphatase in mitosis triggers centrosomal microtubule nucleation in HeLa cells, J CeIl. Science, 109, 1081-1093,
- Guo et al. (2004) Expression and functional significance of CDC25B in human pancreatic ductal adenocarcinoma, Oncogene, 23, 71-81,
- Hoffmann, L, Clarke, P., Marcote, M. J., Karsenti, E. & Draetta, G. (1993) Phosphorylation and activation of human cdc25-C by cdc2-cyclin B and its involvement in the self amplification of MPF at mitosis, EMBO J, 12, 53-63,
- Kumagai, A. & Dunphy, W. (1992) Régulation of the cdc25 protein during the cell cycle in Xenopus extracts, CeIl, 70, 139-151,
- Mils, V. et al. (2000) Spécifie interaction between 14.3.3 isoforms and the human CDC25B phosphatase, Oncogene, 19, 1257-1265,
- Nilsson, I. & Hoffmann, I. (2000) Cell cycle régulation by the Cdc25 phosphatase family, Prog Cell Cycle Res, 4, 107-14, - Prévost, G. et al. (2003) Inhibitors of the CDC25 phosphatases in "Progress in cell cycle research" Ed. Meijer, L., Jézéquel, A., Roberge, M., vol. 5, 225-234.

Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par un fragment d'au moins environ 10 acides aminés issus de la séquence
SEQ DD NO : 1 suivante :
DRKMEVEELSpPLALGRFSL SEQ ID NO : 1 dans laquelle le résidu serine en position 10 est phosphorylé, ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu serine phosphorylé.
2. Séquence peptidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par la séquence SEQ ID NO : 2 suivante :
MEVEELSpPLALGR SEQ ID NO : 2 dans laquelle le résidu serine en position 7 est phosphorylé.
3. Séquence peptidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par Tune des séquences suivantes :
- la séquence SEQ ID NO : 3, représentant le variant d'épissage CDC25B1 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 235 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 4, représentant un variant d'épissage CDC25B2 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 208 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 5, représentant un variant d'épissage CDC25B3 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position
249 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 6, représentant un variant d'épissage CDC25B4 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 259 est phosphorylé, - la séquence SEQ ID NO : 7, représentant un variant d'épissage CDC25B5 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 284 est phosphorylé.
4. Anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, sous réserve que ledit anticorps ne reconnaisse pas la séquence SEQ ID NO : 8 dans laquelle le résidu serine en position 249 n'est pas phosphorylé.
5. Anticorps polyclonal susceptible de reconnaître la séquence SEQ ID NO : 2 telle que définie dans la revendication 2, sous réserve que ledit anticorps ne reconnaisse pas la séquence SEQ ID NO : 8 dans laquelle le résidu serine en position 249 n'est pas phosphorylé.
6. Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal selon la revendication 4, notamment dirigé contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 telle que définie dans la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la fusion entre des myélomes d'un animal immunisé, notamment d'un animal non humain préalablement immunisé, par injection de la séquence peptidique selon la revendication 2 et des splénocytes d'un animal, notamment d'un animal non humain afin d'obtenir des hybridomes,
- la mise en culture des hybridomes ainsi obtenus,
- la récupération et purification par clonage d'un hybridome, choisi parmi ceux obtenus à l'étape précédente et sécrétant un anticorps dirigé contre la séquence peptidique selon la revendication 2.
7. Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal selon la revendication 4, notamment dirigé contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 telle que définie dans la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de sélection dans une banque d'expression d'un ADNc codant pour toute ou partie d'un anticorps, ledit anticorps étant sélectionné sur la base de sa capacité à reconnaître dans un test ELISA, par transfert de protéines ou par toute autre méthode appropriée le peptide phosphorylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, utilisé pour l'immunisation, mais pas le p eptide non pho sphorylé .
8. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou un anticorps selon la revendication 4 ou 5, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable.
9. Utilisation de la séquence peptidique selon l'une des revendications 1 à 3, ou d'un anticorps selon la revendication 4 ou 5, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies hyperprolifératives telles que les cancers.
10. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 4 ou 5, pour la mise en œuvre d'un procédé de détection in vitro de cellules mitotiques, exprimant une séquence protéique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, parmi des cellules en culture ou des coupes de tissus sains ou tumoraux.
11. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 4 ou 5, pour la mise en œuvre d'un procédé de détection in vitro de la surexpression d'une séquence protéique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans des cellules en culture ou des coupes de tissus sains ou tumoraux, notamment dans des coupes de tumeurs du sein, des poumons ou du pancréas.
12. Procédé de criblage in vitro de composés inhibiteurs de la mitose cellulaire, à savoir de l'entrée en mitose des cellules ou de la progression de la mitose, lesdits composés inhibiteurs pouvant être notamment utilisés dans le cadre d'une thérapie anticancéreuse, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en présence dudit composé avec des cellules, et
— la sélection des composés inhibiteurs par détection de l'absence de liaison de l'anticorps selon la revendication 4 ou 5, ledit anticorps étant susceptible de reconnaître une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, par une méthode appropriée, notamment en utilisant les techniques ELISA, de transfert de protéines (Western Blot) ou d'immunofluorescence indirecte.
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