EP1720975A2 - Procede de production d'un concentrat liquide de bacteries adaptees et viables a usage alimentaire - Google Patents

Procede de production d'un concentrat liquide de bacteries adaptees et viables a usage alimentaire

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Publication number
EP1720975A2
EP1720975A2 EP05732668A EP05732668A EP1720975A2 EP 1720975 A2 EP1720975 A2 EP 1720975A2 EP 05732668 A EP05732668 A EP 05732668A EP 05732668 A EP05732668 A EP 05732668A EP 1720975 A2 EP1720975 A2 EP 1720975A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
bacteria
culture medium
liquid concentrate
food
viable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05732668A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Luc Terragno
Guillaume Catonnet
Pascal Regulier
Christophe Daval
Philippe Teissier
Jean-Yves Barbeau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gervais Danone SA
Original Assignee
Gervais Danone SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gervais Danone SA filed Critical Gervais Danone SA
Publication of EP1720975A2 publication Critical patent/EP1720975A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a liquid concentrate of bacteria suitable and viable for food use.
  • the bacteria produced are lactic acid bacteria.
  • centrifugation is a traumatic process for bacteria, which can lead to high cell mortality, in particular due to high shear, and moreover, this process is not well suited for centrifugation of small volumes such as those required in production. bacteria intended to be added as probiotics to food products. Regarding a conventional filtration step, this also poses problems of mortality of bacteria and clogging of filters by bacteria. It would therefore be desirable to produce a desired volume of liquid concentrate of bacteria which exhibit maximum activity and viability after the concentration step and after introduction into the final product.
  • the inventors have shown that a step of adaptation of the bacteria would significantly increase the activity and the viability of the bacteria after the introduction into the final product.
  • a tangential filtration step under certain specific conditions (pressure, concentration, membrane porosity, etc.), makes it possible to concentrate the desired volumes of culture of bacteria, while preserving their viability and without clogging. filters. Tangential filtration makes it possible to produce two currents depending on the nature and structure of the membrane: the permeate (the culture medium substantially free of bacteria) and the retentate (containing the bacteria, also called concentrate).
  • the fluid circulates not perpendicularly but parallel to the surface of the membrane and thus ensures by its flow speed a self-cleaning which prevents the accumulation of deposits which block the filtration surface (commonly called clogging of the filters ).
  • An object of the present invention is therefore a process for producing a liquid concentrate of suitable and viable bacteria, for food use, comprising the following successive steps: a) The bacteria are propagated in a fermenter in an appropriate culture medium; b) The bacteria obtained in step a) are adapted; c) The culture medium containing the adapted bacteria is washed by tangential microfiltration with the aid of a washing solution; d) The washed medium containing the bacteria adapted by tangential microfiltration is concentrated in bacteria up to a bacterial concentration greater than 5.10 10 cfu / ml advantageously greater than 1.10 ⁇ cfu / ml; e) A liquid concentrate of suitable and viable bacteria is recovered for food use.
  • bacteria is intended to denote preferentially according to the present invention lactic acid bacteria, of the genus Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp, Lactococcus spp. and in particular Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis.
  • the culture medium of step a) is a synthetic medium.
  • synthetic medium is intended to denote, according to the present invention, a medium into which components are subjected to rigorous quantitative and qualitative control.
  • the washing solution is suitable for the food use of the bacteria concentrate and has an osmotic pressure compatible with the viability of the bacteria.
  • the culture medium, containing the bacteria in the fermenter at the end of step a) has a pH of between 3 and 6.
  • the concentration of bacteria, at the end of step a) of propagation is greater than 2.10 10 cfu / ml.
  • the inventors have shown that the adaptation of the bacteria carried out in step b) pe ⁇ net to reduce the mortality of the bacteria caused by the change in the medium of the bacteria, between their culture medium and the final food product to be added.
  • the adaptation of the bacteria is demonstrated by the measurement of parameters of the culture medium.
  • the parameters of the culture medium are preferably pH, osmotic pressure and / or temperature. Other parameters for demonstrating the adaptation of the bacteria are possible, such as for example the sugar concentration of the bacterial medium.
  • step b) is carried out by decreasing the pH by natural acidification.
  • the pH is no longer regulated and adaptation to the environment becomes very easy.
  • the sugar concentration of the fermentation medium of Lactobacillus casei is 9 g / L
  • the pH is no longer regulated and is approximately equal to 5. It then becomes easier for the adapted strain to be added to a new medium and this allows greater viability of the bacteria in the final medium.
  • the parameter of bacteria is the size of the bacteria.
  • the distribution of the lengths of each bacteria of said concentrate is mainly between 0.1 and 10 micrometers, advantageously between 0.5 and 5 micrometers.
  • the size of the bacteria is measured by suitable means.
  • a suitable means may for example be a regular sample of bacteria followed by a measurement of the size of the bacteria by flow cytometry.
  • tangential filtration can be used for step b) of adaptation of the bacteria.
  • the tangential filtration membrane or membranes have a porosity between 0.01 and 0.5 ⁇ m and preferably between 0.1 and 0.3 ⁇ m. These membranes are used for steps c) and d) of the process and optionally step b).
  • the filtration membranes are characterized by: - the porosity and the thickness of the filtering layer on which the permeate flow depends. - the diameter of the pores and their distribution on which the separation efficiency depends. - the material used on which depends the mechanical, chemical, thermal resistance and the ease of cleaning.
  • the term “filtration membrane” is intended to denote organic or mineral membranes.
  • the organic membranes can be composed, inter alia, of cellulose acetate, aromatic polyamides, polysulfone, cellulose esters, cellulose, cellulose nitrate, PVC, or Polypropylene.
  • the mineral membranes can be composed, inter alia, of sintered ceramic, sintered metal, carbon, or glass.
  • the culture medium containing the bacteria is maintained at a temperature between 25 and 45 ° C, and preferably between 35 and 39 ° C.
  • the temperature is reduced from 1 to 44 ° C in step b ) so as to adapt the strain to the temperature of the final product where they will be added.
  • the inlet pressure of the culture medium in the filtration module is between 0 and 3.10 5 Pa.
  • the flow rate of permeate is between 0.001 and 0.1 lm 3 / h / m 2 of exchange surface.
  • the transmembrane pressure is between 0.1.10 5 and 2.10 5 Pa, preferably between 0.1.10 5 and 0.5.10 5 Pa and advantageously between 0.1.10 5 and 0.5.10 5 Pa.
  • the membrane presents itself as a pure mechanical barrier allowing the passage of compounds of size smaller than the diameter of the pores.
  • the separation between the two liquid phases is obtained by applying a pressure difference between the side where the culture medium containing the bacteria circulates and that through which the permeate circulates (the culture medium substantially free of bacteria). This pressure difference is commonly called transmembrane pressure.
  • the recirculation of the culture medium comprising the bacteria allows the concentration of the bacteria and the filtration of the culture medium through the membrane, limiting clogging.
  • the recirculation rate of the washed medium is between 0.5 and 3 m 3 / h / m 2 of exchange surface and advantageously between 0.8 and 1.25 m 3 / h / m 2 of exchange surface.
  • the process for producing a liquid concentrate of suitable and viable bacteria comprises, before step a), the successive steps of revivification and preculture of the bacteria. In order to minimize the lag phase in the fermenter, the microorganism is used during the exponential growth phase.
  • the inventors proceed in two stages: Realization of a revivification in a tube of bacteria previously frozen at -80 ° C. Preculture in Erlenmeyer which is used to multiply the number of microorganisms. Their growth should be stopped in the maximum exponential growth phase.
  • the method for producing a liquid concentrate of suitable and viable bacteria comprises an additional step f) after step e), of packaging in flexible, hermetic and sterile bags of the liquid concentrate of suitable and viable bacteria.
  • hermetic flexible bags is meant according to the present invention and preferably food plastic bags.
  • the method may include an additional step g) after the optional step f) of storage at low temperatures between -50 ° C to + 4 ° C of the liquid concentrate of suitable and viable bacteria packaged in flexible bags and airtight).
  • the method may include an additional step h), after step g) of reheating by a suitable means of said liquid concentrate of suitable and viable bacteria packaged in flexible and hermetic bags.
  • suitable means is meant to designate for example according to the present invention the use of a water bath at a non-lethal temperature for bacteria, for example 37 ° C.
  • An object of the present invention is also a device for implementing the process for producing a liquid concentrate of suitable and viable bacteria for food use according to the present invention characterized in that it comprises a tank (1) containing a washing solution, an inlet conduit (2) of said washing solution in a fermenter (3), said fermenter (3) serving for the propagation of bacteria in a culture medium, an outlet conduit (4) for conveying the culture medium containing the bacteria to one or more tangential microfiltration modules (5), said modules (5) allowing the separation of said culture medium into a permeate (6) not containing bacteria and into a concentrate (7) containing bacteria .
  • Figure 1 is shown the device according to the present invention. According to the present invention, the concentrate (7) is recycled at the outlet of the modules
  • the module or modules (5) of filtration comprise from 1 to 10 filtration membranes, each membrane representative of 0.1m 2 to 150 m 2 of filtering surface and a porosity of between 0.01 and 0.5 microns, and preferably between 0.1 and 0.4 ⁇ m.
  • An object of the present invention is also a liquid concentrate of suitable and viable bacteria capable of being obtained by the method according to the present invention.
  • An object of the present invention is also the use of the liquid concentrate of suitable and viable bacteria according to the present invention as a food additive.
  • food additive is meant according to the present invention any chemical substance added to food during preparation or for storage for obtaining a desired technical effect.
  • the liquid concentrate of bacteria has a stable count, the bacteria being viable and not carrying out fermentation in the final additive product.
  • An object of the present invention is also an additive food product, characterized in that the food additive used is the liquid concentrate of suitable and viable bacteria according to the present invention.
  • the food product is a dairy product and / or a drink.
  • dairy product is meant according to the present invention, in addition to milk, products derived from milk, such as cream, ice cream, butter, cheese, yogurt; secondary products, such as whey, casein and various prepared foods containing milk or milk components as the main ingredient.
  • drink is meant according to the present invention drinks such as for example fruit juices, mixtures of milk and fruit juice, vegetable juices such as for example soy juice, oat juice or juice rice, alcoholic drinks like for example kefir, sodas, and spring or mineral waters with or without added sugar or flavorings for example.
  • An object of the present invention is also a method of manufacturing an additive food product according to the present invention, characterized in that the liquid concentrate of suitable and viable bacteria is added to the food product at the end of the production line and preferably before the packaging of the food product.
  • the process for manufacturing an additive-based food product is characterized in that the liquid concentrate of suitable and viable bacteria is added to the food product online by pumping.
  • the starting culture medium is the MRS medium (selective culture medium used for the culture lactobacilli) liquid sugar-free bottle (95ml).
  • Our main carbon source is sterile added to it, to have finally 10g / 1 if it is a disaccharide or 20 g / 1 for a monosaccharide.
  • 1 g of lactose is taken up in 5 ml of hot distilled water, then the whole is filtered through a filter with a porosity of 0.2 ⁇ m and completely added to the 95 ml bottle of MRS. 10 ml are transferred to a sterile tube; they are intended for carrying out the revivification.
  • the rest (90 ml of MRS at 10 g / l of lactose) will be used for preculture.
  • Revivification growth conditions (10 ml) o 37 ° C o static in an oven o 1% inoculation from a frozen tube at -80 ° C o duration: 16h o
  • Preculture growth conditions 500ml o 37 ° C o static in an oven o 1% inoculation from the preculture o duration: 16h o
  • IL Propagation in a fermenter Preparation of a base for the regulation of pH 38% KOH (ie 9.3 mol / 1) is used to neutralize the lactic acid produced. Sterilized at 121 ° C for 15 minutes. The prerequisite volume for a propagation of 10 liters is 1000 ml minimum.
  • This choice is optimized to minimize the risk of osmotic shock during the transition from a synthetic medium to the final product whose measured parameters are pH 5 and an osmotic pressure of 879 mOsm.
  • the steps during washing are the start of the filtration loop, recirculation of bacteria through the system and injection of the washing solution / drawing off the filtrate at the same rate.
  • Starting the filtration system When starting the filtration, the polarization layer is formed by operating the system for 5 minutes at reduced speed (20 to 50% of the maximum pump flow) with the inlet valves and output of the module in the 100% open position. The permeate outlet valve being closed. Once this period has passed, the pump speed is gradually increased to 100% of its operating range. The permeate valve is 100% open and kept in this position throughout the filtration step.
  • the permeation volume must be equivalent to that of the feed (Dl).
  • the feed rate of the washing solution is identical to that of the permeate.
  • the volume of the solution is passed in a period varying between 1 and 2 hours. After this time, the filtration conditions remain unchanged, the volume concentration begins.
  • the filtration module must be fitted with expansion compensation nuts.
  • Vt Q (m 3 / h) / (3600 x total filtration area) in m / s
  • total filtration area number of modules x number of channels x section (in m)
  • the concentration factor by volume (FCV) is 10.
  • FCV concentration factor by volume
  • the final population reached in batch is 2.10 10 cfu / ml.
  • the final population measured in the bacterial concentrate is greater than l, n 5.10 cfu / ml.
  • Reproducibility of the filtration operation This is evaluated by drawing the curves which appear in FIGS. 3 to 5 below, for the various filtration tests carried out over 4 weeks during the mouse test.
  • the tangential filtration step under the conditions described is perfectly reproducible, the flow, temperature and pressure parameters are controlled during the L.casei concentration step.
  • Tangential filtration platform Conditions for obtaining a final population of L.casei of 1.10 11 cfu / ml.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production d'un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables à usage alimentaire. De manière préférentielle mais non limitative, les bactéries produites sont des bactéries lactiques.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION D'UN CONCENTRAT LIQUIDE DE BACTERIES ADAPTEES ET VIABLES A USAGE ALIMENTAIRE.
La présente invention concerne un procédé de production d'un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables à usage alimentaire. De manière préférentielle mais non limitative, les bactéries produites sont des bactéries lactiques.
L'ingestion de certaines souches de bactéries, en particulier celles qui appartiennent aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium sont particulièrement bénéfiques au niveau de la santé, notamment en favorisant un bon fonctionnement de la flore intestinale. En effet, ces bactéries produisent des bactériocines et de l'acide lactique qui augmentent la digestibilité des aliments, favorisent le péristaltisme intestinal, et accélèrent l'évacuation des selles. De plus, ces bactéries produisent certaines vitamines du complexe B, et favorisent en général l'absorption des vitamines et minéraux, diminuent le cholestérol sanguin, renforcent le système immunitaire et tapissent les muqueuses intestinales afin de protéger contre l'invasion et les activités des microorganismes nuisibles. De ce fait, depuis plusieurs années, les industries agroalimentaires tentent d'incorporer de telles bactéries dans leurs produits finaux, le plus généralement des yaourts. Actuellement, ces bactéries sont produites de façon commerciale, sous une forme congelée ou lyophilisée. Cependant, ces processus de production sont traumatisants pour les bactéries qui perdent une partie de leur activité et parfois leur viabilité. Cela est préjudiciable pour les industriels producteurs et pour les consommateurs de ces produits car les bactéries doivent satisfaire aux exigences de qualité et de performances technologiques, si possible pendant plusieurs mois. Il serait donc souhaitable de produire les bactéries par un procédé leur assurant une viabilité et une activité maximale. A cet effet, une méthode consiste à produire les bactéries sous une forme liquide. Cependant il a été mis en évidence que cette méthode génère également une mortalité importante des bactéries, après l'introduction des bactéries dans le produit final. En outre, pour diminuer les coûts de stockage des bactéries et faciliter l'adjonction des bactéries dans le produit final, il serait souhaitable de concentrer les bactéries sous forme liquide. Pour cela, l'homme du métier utilise de manière habituelle une étape de centrifugation ou de filtration. Cependant, la centrifugation est un processus traumatisant pour les bactéries, qui peut entraîner une forte mortalité cellulaire notamment due à un fort cisaillement et de plus, ce procédé n'est pas bien adapté pour la centrifugation de faibles volumes tels que ceux requis dans la production de bactéries destinées à être additionnées en tant que probiotiques à des produits alimentaires. Concernant une étape de filtration classique, celle-ci pose également des problèmes de mortalité des bactéries et de colmatage des filtres par les bactéries. Il serait donc souhaitable de produire un volume souhaité de concentrât liquide de bactéries qui présentent une activité et une viabilité maximale après l'étape de concentration et après l'introduction dans le produit final. De manière surprenante et inattendue, les inventeurs ont montré qu'une étape d'adaptation des bactéries peπxiettait d'augmenter de manière significative l'activité et la viabilité des bactéries après l'introduction dans le produit final. De plus, les inventeurs ont montré qu'une étape de filtration tangentielle, sous certaines conditions particulières (pression, concentration, porosité de membrane, etc), permettait de concentrer les volumes souhaités de culture de bactéries, tout en préservant leur viabilité et sans colmatage des filtres. La filtration tangentielle permet de produire deux courants en fonction de la nature et de la structure de la membrane : le perméat (le milieu de culture sensiblement exempt de bactéries) et le rétentât (contenant les bactéries, appelé aussi concentrât). Dans une filtration tangentielle, le fluide circule non pas perpendiculairement mais parallèlement à la surface de la membrane et assure ainsi par sa vitesse d'écoulement un auto nettoyage qui prévient l'accumulation de dépôts qui obturent la surface de filtration (appelé communément colmatage des filtres). Un objet de la présente invention est donc un procédé de production d'un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables, à usage alimentaire comprenant les étapes successives suivantes : a) On propage les bactéries dans un fermenteur dans un milieu de culture approprié ; b) On adapte les bactéries obtenues à l'étape a) ; c) On lave le milieu de culture contenant les bactéries adaptées par microfiltration tangentielle avec l'aide d'une solution de lavage ; d) On concentre en bactéries le milieu lavé contenant les bactéries adaptées par microfiltration tangentielle jusqu'à une concentration bactérienne supérieure à 5.1010 ufc/ml avantageusement supérieure à 1.10π ufc/ml ; e) On récupère un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables, à usage alimentaire.
Par bactéries, on entend désigner préférentiellement selon la présente invention des bactéries lactiques, du genre Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp, Lactococcus spp. et en particulier Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium brève, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis. Par bactéries adaptées, on entend désigner, selon la présente invention, des bactéries plus résistantes à différents stress, en particulier liés à différents stress physicochimiques. Selon la présente invention le milieu de culture de l'étape a) est un milieu synthétique. Par milieu synthétique, on entend désigner selon la présente invention un milieu dans lequel sont introduits des composants soumis à un contrôle quantitatif et qualitatif rigoureux. Selon la présente invention, la solution de lavage est adaptée à l'utilisation alimentaire du concentrât de bactéries et présente une pression osmotique compatible avec la viabilité des bactéries. Selon la présente invention le milieu de culture, contenant les bactéries dans le fermenteur à la fin de l'étape a), a un pH compris entre 3 et 6. Selon la présente invention, la concentration en bactéries, à la fin de l'étape a) de propagation, est supérieure à 2.1010 ufc/ml. De plus, les inventeurs ont montré que l'adaptation des bactéries réalisée à l'étape b) peπnet de réduire la mortalité des bactéries provoquée par le changement de milieu des bactéries, entre leur milieu de culture et le produit alimentaire final à additiver. Selon la présente invention l'adaptation des bactéries est mise en évidence par la mesure de paramètres du milieu de culture. Selon la présente invention, les paramètres du milieu de culture sont préférentiellement le pH, la pression osmotique et/ou la température. D'autres paramètres pour la mise en évidence de l'adaptation des bactéries sont possibles, comme par exemple la concentration en sucre du milieu bactérien. Préférentiellement, dans le cas où le paramètre du milieu de culture est le pH, l'étape b) est réalisée par diminution du pH par acidification naturelle. Afin d'effectuer l'étape d'adaptation des bactéries au pH par acidification naturelle, on peut par exemple mesurer la concentration en sucre du milieu de fermentation et au-delà d'une concentration seuil pour chaque espèce de bactéries, on sait que le pH n'est plus régulé et l'adaptation au milieu devient très aisée. Ainsi, par exemple, si la concentration en sucre du milieu de fermentation de Lactobacillus casei est de 9 g/L, le pH n'est plus régulé et est environ égal à 5. Il devient alors plus aisé pour la souche adaptée d'être ajoutée à un nouveau milieu et ceci permet une viabilité plus importante des bactéries dans le milieu final. Selon la présente invention, le paramètre des bactéries est la taille des bactéries. Préférentiellement, dans le cas où l'adaptation est mise en évidence par la taille des bactéries, la distribution des longueurs de chaque bactérie dudit concentrât se situe majoritairement entre 0,1 et 10 micromètres, avantageusement entre 0,5 et 5 micromètres. La mesure de la taille des bactéries se fait par un moyen adapté. Un moyen adapté peut être par exemple un prélèvement régulier de bactéries suivi d'une mesure de la taille des bactéries par cytométrie de flux. En outre, selon la présente invention, la filtration tangentielle peut être utilisée pour l'étape b) d'adaptation des bactéries. Selon la présente invention la ou les membranes de filtration tangentielle sont d'une porosité comprise entre 0.01 et 0,5μm et de manière préférentielle, entre 0.1 et 0.3 μm. Ces membranes sont utilisées pour les étapes c) et d) du procédé et éventuellement 1 ' étape b) . Les membranes de filtration sont caractérisées par: - la porosité et l'épaisseur de la couche filtrante dont dépend le débit de perméat. - le diamètre des pores et leur répartition dont dépend l'efficacité de séparation. - le matériau employé dont dépend la résistance mécanique, chimique, thermique et la facilité de nettoyage. Par membrane de filtration, on entend désigner des membranes organiques ou minérales. Les membranes organiques peuvent être composées entre autre d'acétate de cellulose, de polyamides aromatiques, de polysulfone, d'esters de cellulose, de cellulose, de nitrate de cellulose, de PVC, ou de Polypropylène. Les membranes minérales peuvent être composées entre autre de céramique frittée, de métal fritte, de carbone, ou de verre. Selon la présente invention le milieu de culture contenant les bactéries est maintenu à une température entre 25 et 45 °C, et préférentiellement entre 35 et 39°C Selon la présente invention la température est diminuée de 1 à 44°C à l'étape b) de façon à adapter la souche à la température du produit final où elles seront additionnées. Selon la présente invention, à l'étape c) la pression d'entrée du milieu de culture dans le module de filtration est comprise entre 0 et 3.105 Pa. Selon la présente invention, dans les étapes c) et d) le débit de perméat est compris entre 0,001 et 0,lm3/h/m2 de surface d'échange. Selon la présente invention dans l'étape d), la pression transmembranaire est comprise entre 0,1.105 et 2.105 Pa, préférentiellement entre 0,1.105 et 0,5.105 Pa et avantageusement entre 0,1.105 et 0,5.105 Pa. La membrane se présente comme une pure barrière mécanique laissant passer les composés de taille inférieure au diamètre des pores. La séparation entre les deux phases liquides est obtenue en appliquant une différence de pression entre le côté où circule le milieu de culture contenant les bactéries et celui où circule le perméat (le milieu de culture sensiblement exempt de bactéries). Cette différence de pression est communément appelée pression transmembranaire. La recirculation du milieu de culture comprenant les bactéries, en boucle fermée, dans le module de filtration tangentielle permet la concentration des bactéries et la filtration du milieu de culture à travers la membrane, en limitant le colmatage. Selon la présente invention dans l'étape d), le débit de recirculation du milieu lavé est compris entre 0,5 et 3 m3/h/m2 de surface d'échange et avantageusement entre 0,8 et 1,25 m3/h/m2 de surface d'échange. Selon la présente invention le procédé de production d'un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables comporte préalablement à l'étape a) les étapes successives de revivification et préculture des bactéries. Afin de réduire au maximum la phase de latence en fermenteur, le microorganisme est utilisé en pleine phase exponentielle de croissance. Pour ce faire, les inventeurs procèdent en deux étapes : Réalisation d'une revivification en tube de bactéries précédemment congelées à -80°C Préculture en erlenmeyer qui sert à multiplier le nombre de microorganismes. Il conviendra de stopper leur croissance en phase exponentielle maximale de croissance. Selon la présente invention, le procédé de production d'un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables comporte une étape supplémentaire f) après l'étape e), de conditionnement en poches souples, hermétiques et stériles du concentrât liquide de bactéries adaptées et viables . Par poches souples hermétiques, on entend désigner selon la présente invention et de manière préférentielle des poches en plastique alimentaire. Selon la présente invention, le procédé peut comporter une étape supplémentaire g) après l'étape optionnelle f) de conservation à des températures basses comprises entre -50°C à +4°C du concentrât liquide de bactéries adaptées et viables conditionné en poches souples et hermétiques). De manière optionnelle, il est possible de rajouter au concentrât liquide de bactéries adaptées et viables conditionné en poches souples, et conservé à des températures basses, des molécules cryoprotectrices telles que le saccharose par exemple. Selon la présente invention, le procédé peut comporter une étape supplémentaire h), après l'étape g) de réchauffage par un moyen adapté dudit concentrât liquide de bactéries adaptées et viables conditionné en poches souples et hermétiques.. Par moyen adapté, on entend désigner par exemple selon la présente invention l'utilisation d'un bain marie à une température non létale pour les bactéries, par exemple 37°C. Un objet de la présente invention est également un dispositif pour la mise en œuvre du procédé de production d'un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables à usage alimentaire selon la présente invention caractérisé en ce qu'il comprend une cuve (1) contenant une solution de lavage, un conduit d'arrivée (2) de ladite solution de lavage dans un fermenteur (3), ledit fermenteur (3) servant à la propagation des bactéries dans un milieu de culture, un conduit de sortie (4) pour acheminer le milieu de culture contenant les bactéries vers un ou plusieurs modules (5) de microfiltration tangentielle, lesdits modules (5) permettant la séparation dudit milieu de culture en un perméat (6) ne contenant pas de bactéries et en un concentrât (7) contenant les bactéries . Sur la figure 1 est représenté le dispositif selon la présente invention. Selon la présente invention, le concentrât (7) est recyclé à la sortie des modules
(5) de filtration par réincorporation dans le fermenteur (3). Selon la présente invention, le ou les modules (5) de filtration comprennent de 1 à 10 membranes de filtration, chaque membrane représentant de 0.1m2 à 150 m2 de surface totale de filtration et une porosité comprise entre 0.01 et 0.5 μm, et préférentiellement comprise entre 0.1 et 0.4 μm. Un objet de la présente invention est également un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables susceptibles d'être obtenu par le procédé selon la présente invention. Un objet de la présente invention est également l'utilisation du concentrât liquide de bactéries adaptées et viables, selon la présente invention en tant qu'additif alimentaire. Par additif alimentaire, on entend désigner selon la présente invention toute substance chimique ajoutée aux aliments durant leur préparation ou en vue de leur entreposage pour obtenir un effet technique désiré. De plus, selon la présente invention, le concentrât liquide de bactéries possède une numération stable, les bactéries étant viables et n'effectuant pas de fermentation dans le produit final additivé. Un objet de la présente invention est également un produit alimentaire additivé, caractérisé en ce que l'additif alimentaire utilisé est le concentrât liquide de bactéries adaptées et viables selon la présente invention. Selon la présente invention, le produit alimentaire est un produit laitier et/ou une boisson. Par produit laitier on entend désigner selon la présente invention, en plus du lait, les produits dérivés du lait, tels la crème, la crème glacée, le beurre, le fromage, le yogourt; les produits secondaires, comme le lactosérum, la caséine ainsi que divers aliments préparés contenant comme ingrédient principal du lait ou des constituants du lait. Par boisson on entend désigner selon la présente invention des boissons comme par exemple les jus de fruits, les mélanges de lait et de jus de fruits, les jus végétaux tels que par exemple le jus de soja, le jus d'avoine ou le jus de riz, les boissons alcoolisées comme par exemple le kéfir, les sodas, et les eaux des source ou minérales additionnées ou non de sucre ou d'arômes par exemple. Un objet de la présente invention est également un procédé de fabrication d'un produit alimentaire additivé selon la présente invention, caractérisé en ce que le concentrât liquide de bactéries adaptées et viables est additionné au produit alimentaire en fin de ligne de production et préférentiellement avant le conditionnement du produit alimentaire. Selon la présente invention, le procédé de fabrication d'un produit alimentaire additivé est caractérisé en ce que le concentrât liquide de bactéries adaptées et viables est additionné au produit alimentaire en ligne par pompage. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de concentrât liquide de bactéries adaptées et viables, selon la présente invention. Il va de soi, toutefois que ces exemples ne sont donnés qu'à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne sauraient constituer en aucune manière une limitation. LEGENDE DES FIGURES : Figure 1 : Dispositif de concentration des bactéries par filtration tangentielle Figure 2 : Evolution de la pression transmembranaire dans le temps Figure 3 : Evolution de la pression d'entrée module Figure 4 : Evolution des débits rétentat Figure 5 Evolution de la densité optique à 580 nm et de la pression transmembranaire. EXEMPLES: Dans ces exemples, les pressions sont indiquées en bars, un bar correspondant à 1.105 Pa. I. Revivification et préculture Préparation du milieu de culture Le milieu de culture de départ est le milieu MRS (milieu de culture sélectif utilisé pour la culture des lactobacilles) liquide sans sucre en bouteille (95ml). On y ajoute stérilement notre source de carbone principale pour avoir en final lOg/1 s'il s'agit d'un disaccharide ou de 20 g/1 pour un monosaccharide. Ici 1 g de lactose est repris dans 5 ml d'eau distillée chaude puis l'ensemble est filtré sur filtre de porosité 0.2μm et additionné en totalité dans la bouteille de 95 ml de MRS. 10 ml sont transférés dans un tube stérile ; ils sont destinés à la réalisation de la revivification. Le restant (90 ml de MRS à 10 g/1 de lactose) sera utilisé pour la préculture.
Conditions de croissance de la revivification (10 ml) o 37°C o en statique dans une étuve o inoculation à 1 % à partir d'un tube congelé à -80°C o durée : 16h o Densité Optique mesurée en fin de culture sur un échantillon dilué au 1/20 à 580 nm contre une cuve d'eau : 0.35 à 0.4 o pH : proche de 4
Conditions de croissance de la préculture (500ml) o 37°C o en statique dans une étuve o inoculation à 1 % à partir de la préculture o durée : 16h o Densité Optique mesurée en fin de culture sur un échantillon dilué au 1/20 à 580 nm contre une cuve d'eau : 0.35 à 0.4 o pH : proche de 4
IL Propagation en fermenteur Préparation d'une base de régulation dupH Le KOH à 38% (soit à 9.3 mol/1) est utilisé pour neutraliser l'acide lactique produit. On stérilise à 121 °C pendant 15 minutes. Le volume prérequis pour une propagation de 10 litres est de 1000 ml minimum.
Préparation d'un milieu de propagation Les sources carbonées et azotées sont stérilisées séparément pour éviter les réactions de dégradation du sucre (formation de composés de Maillard lors de la stérilisation) Pour 10 litres de milieu de propagation en final : o Pied de cuve
- Tryptone de peptone de caséine (Merck) 600g
- Extrait de levure (Merck) avec HC1 à 6mol/l 180 g Ajuster le pH à 6.5 - MnSo4, H2O 1 g qsp à 5.5 litres
Stériliser à 121 °C 15 minutes dans le fermenteur préalablement stérilisé à l'eau. o Solution de source de carbone - Lactose 800 g - Dissoudre à chaud puis compléter à 4 litres Stériliser à 110°C 30 minutes Transférer stérilement cette solution à froid dans le pied de cuve
Conditions de propagation en fermenteur o Volume avant inoculation : 9.5 litres o 37°C o pH régulé à 6.5 avec KOH 10 mol/1 o durée : 18h o agitation 200 rpm, axe d'agitation équipé de 3 pâles immergées o dégazage à 1 ' azote o alimentation permanente en azote par le dessus (débit Il/minute) o inoculation à 5% à partir de la préculture soit 500 ml o Densité Optique finale mesurée en fin de culture sur un échantillon dilué au 1/100 à 580 nm contre une cuve d'eau : 0.32 à 0.35 Après propagation, on obtient un milieu contenant 2.1010 ufc/ml de bactéries.
III. Adaptation et lavage de la culture Afin de préparer la biomasse produite au pH, et/ou à la pression osmotique et/ou à la température du produit final (type yoghourt) dans lequel elles seront injectées, deux étapes sont réalisées conjointement : -Après 17 heures de culture, une descente du pH est réalisée par acidification naturelle sur une heure pour passer de pH 6,5 à pH5 (= pH cible avant lavage). - Un lavage des bactéries (à 37°C) est effectué après le batch (après l'étape d'acidification à pH5). Le lavage est réalisé avec une solution de saccharose à 250 g/1, stérilisée 30 minutes à 100°C, qui correspond à une solution de pression osmotique de 1000 mOsm. Ce choix est optimisé pour minimiser les risques de choc osmotique lors du passage d'un milieu synthétique au produit final dont les paramètres mesurés sont pH 5 et une pression osmotique de 879 mOsm. Les étapes lors du lavage sont le démarrage de la boucle de filtration, recirculation des bactéries à travers le système et injection de la solution de lavage/soutirage du filtrat au même débit. Démarrage du système de filtration Lors du démarrage de la filtration, on procède à la formation de la couche de polarisation en faisant fonctionner le système 5 minutes à vitesse réduite (20 à 50% du débit maximal de la pompe) avec les vannes d'entrée et de sortie du module en position ouverte à 100%. La vanne de sortie perméat étant fermée. Une fois ce délai passé, le régime de la pompe est progressivement augmenté à 100% de sa plage d'utilisation. La vanne perméat est ouverte à 100% et conservée dans cette position durant toute l'étape de filtration.
Pour maintenir un volume constant de milieu réactionnel lors du lavage, le volume de perméation doit être équivalent à celui de l'alimentation (Dl). Le débit d'alimentation de la solution de lavage est identique à celui du perméat. Le volume de la solution est passé dans une période variant entre 1 et 2 heures. Passé ce délai, les conditions de filtration restent inchangées, la concentration volumique débute.
IV. Concentration par microfiltration tangentielle. La filtration du milieu est effectuée dans une plage de température comprise entre 25 et 44°C au pH cible compris entre 3,5 et 5,5 durant 4 heures. Le débit de filtration diminue fortement avec l'avancement de la culture et les modifications des caractéristiques rhéologiques du milieu. La pression d'entrée de la boucle augmente pour atteindre une valeur de 3 bars, représentant la limite supérieure supportable par les membranes de filtration. La recirculation du milieu est alors stoppée et le concentrât bactérien est récupéré stérilement. Cette méthode permet l'obtention d'un litre de liquide crémeux contenant au moins 1.1011 ufc/ml de bactéries. Conditions opératoires 1. Stérilisation du système complet. - la boucle de filtration est stérilisée par passage de vapeur fluente. Pour effectuer cette opération, le module de filtration doit être équipé d'écrous de compensation de dilatation. L'efficacité du traitement est évaluée par le calcul de la valeur stérilisatrice Fo. C'est le temps en minutes d'un barème de stérilisation qui a la même efficacité à la température de référence : 121.1°C. Soit t, le temps du traitement, soit T la température du traitement, avec z = 10°C par convention internationale. Fo = t.lO (τ-TreÉ,2)
Deux passages d'eau stérile (121, 1°C 20 min) provenant du fermenteur, sont effectués dans la boucle avant la filtration des bactéries. 2. Nettoyage, recyclage des membranes. La récupération des membranes après filtration est aisée mais doit suivre les consignes décrites ci-dessous : - traitement par une solution NaOH 0,5 M à 45°C durant 30 minutes, pompe au débit maximal avant rinçage. Ainsi traitées, les membranes peuvent être réutilisées au moins 5 cycles reproductibles de production de L. casei concentré.
3. Le stockage des membranes en place. L'ensemble du module est conservé avec une solution NaOH 0,1 M toutes vannes fermées si nécessaire.
4. Démarrage de l'étape de microfiltration. Un des risques majeurs lors de l'utilisation de la technique de microfiltration est un colmatage important et rapide de la membrane. Ce colmatage est caractérisé par trois phénomènes : -adsorption et adhésion de particules et de solutés aux surfaces membranaires -couche de polarisation et formation d'un gâteau -obturation des pores En règle générale, une pression transmembranaire faible ainsi qu'une vitesse de circulation tangentielle élevée sont des paramètres fondamentaux dans la conduite de cette opération. III Caractérisation de la plate-forme. 1. Paramètre de mesure. La plage de mesure est réalisée sur une durée de 300 minutes en moyenne. En se référant aux essais réalisés (voir figure 2) la plage de temps comprise entre 15 et 175 minutes présente une phase de stabilité des pressions d'entrée et sortie module et par conséquent de la pression transmembranaire. Cette plage de 160 minutes est représentative des conditions optimales de filtration qu'il faut maintenir. Nos tableaux représentent les valeurs mesurées au début, au milieu et à la fin du temps de filtration.
1.1. Evolution des pressions L'agent moteur de la séparation sélective sur une membrane poreuse est le différentiel de pression existant entre le circuit rétentat et le circuit perméat.
Tableau 1 : Evolution des pressions
-mesure de la pression transmembranaire (PTM)
PTM — ( (Pentrée module + Psortie module ) 11) - Pperméat
Avec pression entrée module égale à la pression de recirculation Après 15 minutes de cycle, nous considérons l'ensemble du système stabilisé. La couche de polarisation est alors établie, les pressions globales ainsi que les débits se stabilisent.
Valeur moyenne mesurée lors des essais sur la plage de mesure stabilisée : Pression d'entrée du module : 1,211 bar Pression de sortie du module : 0.145 bar Pression perméat : 0.196 bar
Evolution de la PTM 0.465 bar
1.2. Evolution des débits. Tableau 2 : Evolution des débits et de la vitesse tangentielle
-vitesse linéaire (m/s) Vt=Q(m3/h) / (3600 x surface totale de filtration) en m/s Avec surface de filtration totale = nombre de modules x nombre de canaux x section (en m)
Sur la plage de mesure stabilisée : Débit rétentat maximal moyen mesuré : 124.8 1/h Débit maximal perméat 2.19 1/h Débit perméat moyen : 1.46 1/h Vitesse tangentielle moyenne maximale 0.579 m s
1.3. Evolution de la température. Lors de tous nos essais, l'élévation maximale mesurée par rapport à la consigne a été de 2°C . Un échangeur thermique placé en sortie pompe ou module pourra aisément contenir cette élévation de température. De manière générale la température mesurée est constante à 37°C avec un écart de mesure de 0,3°C.
1.4. Facteurs de concentration Le facteur volumique de concentration (FCV) est de 10. La population finale atteinte en batch est de 2.1010 ufc/ml. La population finale mesurée dans le concentrât bactérien est supérieure à l,5.10n ufc/ml. 1.5. Reproductibilité de l'opération de filtration Celle-ci est évaluée par le tracé des courbes qui apparaissent sur les figures 3 à 5 ci après, pour les différents essais de filtration réalisés sur 4 semaines lors du test souris. L'étape de filtration tangentielle dans les conditions décrites est parfaitement reproductible, les paramètres de débit, température et de pression sont maîtrisés durant l'étape de concentration de L.casei.
Plate-forme de filtration tangentielle : Conditions d'obtention d'une population finale de L.casei de 1.1011 ufc/ml. Conditions générales : Population fin de batch : 2.1010 ufc/ml Lavage des bactéries par une solution saccharosée (250 g/1) pression osmotique 1000 mOsm. (injection par pompe / soutirage par filtration aux mêmes débits : 66 ml/min) : durée lh30 - Durée de filtration : durée 4 h
Tableau 3 : récapitulatif
10
15
20
25
30

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables, à usage alimentaire comprenant les étapes successives suivantes : a) On propage les bactéries dans un fermenteur dans un milieu de culture approprié ; b) On adapte les bactéries obtenues à l'étape a) ; c) On lave le milieu de culture contenant les bactéries adaptées par microfiltration tangentielle avec l'aide d'une solution de lavage ; d) On concentre en bactéries le milieu lavé contenant les bactéries adaptées par microfiltration tangentielle jusqu'à une concentration bactérienne supérieure à 5.1010 ufc/ml avantageusement supérieure à 1.1011 ufc/ml ; e) On récupère un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables, à usage alimentaire.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries sont des bactéries lactiques, en particulier des bactéries du genre Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Streptococcus spp et Lactococcus spp.
3. Procédé selon la revendication 1 et 2, caractérisé en ce que le milieu de culture de l'étape a) est un milieu synthétique.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu de culture contenant les bactéries dans le fermenteur à la fin de l'étape a) a un pH compris entre 3 et 6.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en bactéries à la fin de l'étape a) de propagation est supérieure à 2.1010 ufc/ml.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'adaptation des bactéries effectuée à l'étape b) est mise en évidence par la mesure de paramètres du milieu de culture et/ou de paramètres des bactéries.
7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les paramètres du milieu de culture sont le pH, la pression osmotique et/ou la température du milieu de culture.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le paramètre du milieu de culture est le pH et en ce que l'étape b) est réalisée par diminution du pH par acidification naturelle.
9. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le paramètre du milieu de culture est la température et en ce que l'étape b) est réalisée par diminution de la température.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que le paramètre des bactéries est la taille des bactéries.
11. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que la distribution des longueurs de chaque bactérie se situe majoritairement entre 0,1 et 10 micromètres, avantageusement entre 0,5 et 5 micromètres.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape b) d'adaptation est réalisée par microfiltration tangentielle.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la ou les membranes de microfiltration tangentielle ont une porosité comprise entre 0,01 et 0,5μm, avantageusement entre 0,1 et 0,3 μm.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que dans l'étape c) la pression d'entrée du milieu de culture dans le module de microfiltration est comprise entre 0 et 3.105 Pa.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que dans les étapes c) et d) le débit du perméat est compris entre 0,001 et 0,1 m3/h/m2 de surface d'échange.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que dans l'étape d) la pression transmembranaire est comprise entre 0,1.105 et 2.105 Pa et avantageusement entre 0, 1.105 et 0,5.105 Pa.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que dans l'étape d) le débit de recirculation du milieu lavé est compris entre 0,5 et 3 m3/h/m2 de surface d'échange et avantageusement entre 0,8 et 1,2 m3/h/m2de surface d'échange.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend préalablement à l'étape a) les étapes successives de revivification et préculture des bactéries.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire f), après l'étape e) de conditionnement en poches souples et hermétiques du concentrât liquide de bactéries adaptées et viables.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire g), après l'étape f), de conservation à une température comprise entre -50°C à +4°C du concentrât liquide de bactéries adaptées et viables conditionné en poches souples et hermétiques.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire h), après l'étape g), de réchauffage par un moyen adapté du concentrât liquide de bactéries adaptées et viables conditionné en poches souples et hermétiques.
22. Dispositif pour la mise en œuvre du procédé de production d'un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables à usage alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 caractérisé en ce qu'il comprend une cuve (1) contenant une solution de lavage, un conduit d'arrivée (2) de ladite solution de lavage dans un fermenteur (3), ledit fermenteur (3) servant à la propagation des bactéries dans un milieu de culture, un conduit de sortie (4) pour acheminer le milieu de culture contenant les bactéries vers un ou plusieurs modules (5) de microfiltration tangentielle, lesdits modules (5) permettant la séparation dudit milieu de culture en un perméat (6) ne contenant pas de bactéries et en un concentrât (7) contenant les bactéries.
23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que le concentrât (7) est recyclé à la sortie des modules (5) de filtration par réincorporation dans le fermenteur (3).
24. Dispositif selon les revendications 22 et 23 caractérisé en ce que le ou les modules (5) de filtration comprennent de 1 à 10 membranes de filtration, chaque membrane représentant de 0,1m2 à 150 m2 de surface totale de filtration
25. Concentrât liquide de bactéries adaptées et viables caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21.
26. Utilisation du concentrât liquide de bactéries adaptées et viables selon la revendication 25 en tant qu'additif alimentaire.
27. Produit alimentaire additivé, caractérisé en ce que l'additif alimentaire utilisé est un concentrât liquide de bactéries adaptées et viables selon la revendication 25.
28. Produit alimentaire additivé selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il s ' agit d'un produit laitier et/ou d'une boisson.
29. Procédé de fabrication d'un produit alimentaire additivé selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que le concentrât liquide de bactéries adaptées et viables est additionné au produit alimentaire en fin de ligne de production et préférentiellement avant le conditionnement du produit alimentaire.
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