EP1631665A1 - Sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leur utilisation - Google Patents

Sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leur utilisation

Info

Publication number
EP1631665A1
EP1631665A1 EP04767282A EP04767282A EP1631665A1 EP 1631665 A1 EP1631665 A1 EP 1631665A1 EP 04767282 A EP04767282 A EP 04767282A EP 04767282 A EP04767282 A EP 04767282A EP 1631665 A1 EP1631665 A1 EP 1631665A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
phosphorylated
peptide sequence
antibody
cdc25b
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04767282A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bernard Ducommun
Bernard Monsarrat
Claude Prigent
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Rennes 1
Universite de Toulouse
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Rennes 1
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Universite de Toulouse
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Rennes 1, Universite Toulouse III Paul Sabatier, Universite de Toulouse filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1631665A1 publication Critical patent/EP1631665A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the present invention is new phosphorylated sequences of the CDC25B phosphatase as well as polyclonal or monoclonal antibodies directed against these sequences.
  • the present invention also relates to the use of these new phosphorylated sequences in particular for the implementation of a method of in vitro diagnosis of cancers in humans or animals.
  • CDC25B is a regulating phosphatase of the cell cycle essential for the control of the entry into mitosis. It belongs to a family which has three members coded by different genes (CDC25A, B and C) in mammals. The CDC25B protein is expressed and active at the end of the G2 phase of the cell cycle (Baldin et al.,
  • CDC25B can act as a "starter" for early mitotic events (Nllsson et al., 2000). It could play a role in the initial activation of a CDC2 / cyclin B population at the centrosome before its nuclear translocation (Kumagai et al., 1992; Hoffmann et al., 1993). CDC25B activates the CDK / cyclin complexes to allow the architectural and biochemical changes that are necessary to allow the process of cell division. Its activity is regulated by variations in its expression, by its association with regulatory partners and by phosphorylation events.
  • the protein kinase Aurora A also known as STK5
  • STK5 The protein kinase Aurora A
  • This expression is correlated with a high tumor grade (Bischoff et al., 1998; Zhou et al., 1998).
  • This kinase is encoded by the STKl 5 gene localized as locus 20ql 3, an amplicon present in many tumors.
  • This protein is located at the centrosome (Dutertre et al., 2002). . Its function seems important for the separation of centrosomes (Giet et al., 2000), their duplication (Zhou et al., 1998) and the assembly of a bipolar mitotic spindle (Giet et al., 2000).
  • I 1 RNA interference technology leads to the formation of monopolar spindles and its overexpression is responsible for a centrosomal amplification and a polyploidization (Meraldi et al., 2002; Bischoff et al, 1998; Zhou et al., 1998).
  • the CDC25B phosphatase is the first identified substrate which is also co-located at the centrosome level and plays a clear role in controlling the cell cycle and proliferation.
  • the present invention derives from the discovery by the Inventors of the site of in vitro phosphorylation of the phosphatase CDC25B by the kinase Aurora A, and from the identification of the phosphorylated sequence of the splicing variant CDC25B3 of
  • One of the aims of the present invention is to provide new phosphorylated sequences of the different variants of the CDC25B phosphatase.
  • Another object of the invention consists in providing a new antibody directed against a phosphorylated CDC25B phosphatase, said antibody being able to be used within the framework of a medical diagnosis, or for the preparation of screens for the identification of molecules binding said phosphorylated sequence and likely to represent new agents usable in anti-tumor pharmacology.
  • Another object of the invention consists in providing a new tool for the study of molecular mechanisms which lead to polyploidization and cell transformation, as well as a new tool allowing the demonstration of the activity of the Aurora kinase. Has on one of its physiological substrates, and therefore the identification of possible quantitative, temporal and spatial disturbances of this activity.
  • the present invention relates to a peptide sequence characterized in that it comprises or consists of a fragment of at least approximately 10 amino acids derived from the following sequence SEQ ID NO: 1:
  • phosphorylated residue designates an amino acid carrying a phosphate group.
  • the present invention also relates to a peptide sequence as defined above, characterized in that it comprises or consists of the following sequence SEQ ID NO: 2:
  • sequence SEQ ID NO: 2 corresponds to a fragment of the sequence SEQ ID ' NO: 1 mentioned above. More precisely, it corresponds to the fragment of SEQ ID NO: 1 delimited from the amino acid in position 4 to the amino acid in position 17.
  • the present invention also relates to a peptide sequence as defined above, characterized in that it comprises or consists of one of the following sequences:
  • sequence SEQ ID NO: 3 representing the splicing variant CDC25B1 of the protein of human origin of the phosphatase CDC25B, the serine residue of which at position 339 is phosphorylated
  • sequence SEQ ID NO: 4 representing a variant splicing CDC25B2 of the protein of human origin of the phosphatase CDC25B, the serine residue of which at position 312 is phosphorylated
  • sequence SEQ TD NO: 5 representing a splicing variant CDC25B3 of the protein of human origin of the phosphatase CDC25B, the serine residue of which at position 353 is phosphorylated
  • sequence SEQ TD NO: 6 representing a splicing variant CDC25B4 of the protein of human origin of the phosphatase CDC25B, the serine residue of which at position 374 is phosphorylated
  • 361 is phosphorylated.
  • the present invention also relates to a polyclonal or monoclonal antibody capable of recognizing a peptide sequence as defined above.
  • An advantageous polyclonal antibody of the invention is characterized in that it is capable of recognizing the sequence SEQ ID NO: 2 as defined above.
  • Such an antibody directed against the phosphorylated epitope of sequence SEQ ED NO: 2 is generated by immunizing rabbits with said epitope. More specifically, said epitope is covalently coupled with a carrier protein such as hemocyanin, BSA or Povalbumin. The rabbits are then immunized for 3 months (4 injections in total) and the final bleeding allows the recovery of approximately 50 ml of serum. The serum is then doubly purified by affinity on a column of phosphorylated peptide and then on a column of non-phosphorylated peptide.
  • a carrier protein such as hemocyanin, BSA or Povalbumin
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a monoclonal antibody as defined above, directed against the peptide sequence SEQ ED NO: 2 as defined above, characterized in that it comprises the following steps: - immunization of an animal by injection of the peptide sequence
  • the animal used for the immunization step is in particular a mouse.
  • the myébmes used for fusion come in particular from a mouse.
  • the splenocytes used for the fusion come from an animal of the same species as that from which the myelomas originate, namely in particular a mouse.
  • Hybridomas are chosen which secrete the antibodies against the peptide sequence SEQ ED NO: 2 on the basis of the production of antibodies capable of recognizing in an ELISA test the phosphorylated peptide used for immunization but not the nonphosphorylated peptide.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it contains, as active substance, a peptide sequence as defined above, an antibody as defined above, or an antibody anti-idiotypic as defined above, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • An advantageous pharmaceutical composition according to the invention is characterized in that it contains, as active substance, the peptide sequence represented by the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also relates to the use of a peptide sequence as defined above, of an antibody as defined above, or of an anti-idiotypic antibody as defined above, for the preparation of drugs used to treat cancers, such as breast cancer.
  • the present invention also relates to the use of an antibody as defined above, for the implementation of a method of in vitro diagnosis of cancers in humans or animals, in particular breast cancers.
  • the present invention relates to the use of a polyclonal antibody as defined above, directed against the phosphorylated epitope of sequence SEQ ID NO: 2, for the implementation of a method of
  • the present invention also relates to a method of in vitro diagnosis of cancers, in particular of breast cancers, in humans or animals, characterized in what it includes: - bringing an antibody as defined above into contact with a biological sample taken from an individual, said antibody being optionally fixed on a solid support,
  • a peptide sequence as defined above capable of being present in the biological sample using labeled reagents, in particular labeled antibodies, recognizing either the antibody linked to said peptide sequence, either the peptide sequence linked to said antibody in the complexes formed during the previous step between the antibody and the peptide sequence likely to be present in the biological sample, and this, if necessary, after appropriate rinsing of the solid support.
  • the present invention also relates to a method for in vitro prognosis of cancers, in particular breast cancers, in humans or animals, characterized in that it comprises:
  • an antibody as defined above into contact with a tumor sample taken from an individual, said antibody being optionally fixed on a solid support, the detection of a peptide sequence as defined above, capable of being present in the biological sample using labeled reagents, in particular labeled antibodies, recognizing either the antibody linked to said peptide sequence, or the peptide sequence linked to said antibody in the complexes formed during the previous step between the antibody and the peptide sequence likely to be present in the biological sample, and this, if necessary, after appropriate rinsing of the solid support.
  • the present invention also relates to the use of the abovementioned antibodies of the invention directed against a phosphorylated sequence of CDC25B within the framework of the implementation of a diagnostic test aiming to detect on tumor samples the presence or not of this sequence phosphorylated, this for diagnostic or prognostic purposes.
  • the present invention also relates to a method for screening a molecule capable of binding to a peptide sequence as defined above, said molecule being capable of being used as an anti-tumor agent or an anti-proliferative agent both on cells in culture only in a living organism or against infectious agents (parasites, pathogenic fungi), characterized in that it comprises:
  • the bond between said molecule and the phosphorylated peptide sequence can be detected according to the following method: the phosphorylated sequence (phosphorylated substrate) is linked to a solid support; incubation with the above-mentioned antibody in solution then allows its fixation which is revealed by the use of a secondary antibody carrying a chromophore or by the direct labeling of the primary antibody (antibody of the invention directed against the phosphorylated sequence). Simultaneous incubation with a compound capable of binding said phosphorylated sequence results in its fixation and the masking of the site recognized by the antibody. The visualization of this interaction could therefore be carried out and quantified by the drop in binding of the antibody. DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 shows a mass spectrum of the monophosphorylated peptide, 353- S (P) VTPPEEQQEAEEPK-367.
  • the abscissa axis corresponds to the m / z ratio and the ordinate axis corresponds to the percentage of relative abundance.
  • Figures 2A, 2B and 2C show the results of western blot analyzes with the monoclonal antibody SE96 (Figure 2A), with the anti- ⁇ MBP antibody (New England Biolabs) ( Figure 2B) and with the anti- ⁇ Aurora antibody A (see French patent application 02/07212) ( Figure 2C).
  • the first column corresponds to the protein kinase Aurora A
  • the second column to a recombinant protein MBP-CDC25B
  • the third column corresponds to the Aurora A protein kinase and to the recombinant protein MBP-CDC25B
  • the fourth column corresponds to MBP alone.
  • FIGS. 3a to 3h represent images of indirect immunofluorescence produced on HeLa cells with the antibody SE96.
  • the HeLa cells of FIGS. 3 c and 3d were put in competition with the phosphorylated peptide which served for the immunization (SEQ ID NO: 2); the HeLa cells of Figures 3e and 3f were competed with the non-phosphorylated peptide (QNECRRRSVTPPEEQ); and the HeLa cells of Figures 3g and 3h were competed with a phosphorylated peptide unrelated to serine 353
  • the recombinant protein CDC25B3 is phosphorylated in vitro by the recombinant kinase Aurora A.
  • the product of the phosphorylation reaction was analyzed by mass spectrometry after excision of the electrophoresis gel and tryptic digestion.
  • the MSMS spectrum of the monophosphorylated peptide, 353-SVTPPEEQQEAEEPK-367 is presented in Figure 1. Its analysis indicates that it is the serine 353 which is phosphorylated by the kinase.
  • the recombinant Aurora A kinase phosphorylates
  • the peptide of sequence Q] SIE-RRRS (P) VTPPEEQ was used for the immunization of rabbits. After sacrifice of the animals, the serum was purified by chromatography in two stages: the first on a column of phosphorylated peptide to retain the specific antibodies, then the second on a column of the same non-phosphorylated peptide of sequence QNKRRRSVTPPEEQ, so as to purify in
  • the SE96 antibody recognizes CDC25B phosphorylated by Aurora A
  • HeLa cells were fixed and used to perform immunofluorescence analysis with SE96 antibodies. The cells were also stained with 4'-6 diamino-2-phenylindole (DAPI) to locate the nucleus.
  • DAPI 4'-6 diamino-2-phenylindole
  • the images shown in Figure 3 are representative of observations on a large number of cells. They indicate that the protein CDC25B phosphorylated on serine 353 is localized at the level of the centrosomes of the cells in mitosis. This marking is abolished when a competition is carried out with the phosphorylated peptide used for immunization (SEQ ID NO: 2), but not with the non-phosphorylated peptide
  • Tumor amplified kinase STK15 / BTAK induces centrosome amplification, aneuploidy and transformation, Nat Genêt, 20, 189-93.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne une séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par un fragment d'au moins environ 10 acides aminés issus de la séquence SEQ ID NO : 1 suivante : TPVQNKRRRSpVTPPEEQQE SEQ ID NO : 1 dans laquelle le résidu sérine en position 10 est phosphorylé, ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu sérine phosphorylé. La présente invention concerne également un anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître une séquence peptidique telle que définie ci-dessus.

Description

NOUVELLES SEQUENCES PHOSPHORYLEES DE LA PHOSPHATASE CDC25B, ANTICORPS DIRIGÉS CONTRE CES SÉQUENCES AINSI QUE LEUR UTILISATION
La présente invention a pour objet de nouvelles séquences phosphorylées de la phosphatase CDC25B ainsi que des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre ces séquences. La présente invention a également pour objet l'utilisation de ces nouvelles séquences phosphorylées notamment pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal.
Les mécanismes qui contrôlent la division des cellules mettent en jeu de nombreux acteurs dont les activités sont régulées par des réactions de phosphorylation et de déphosphorylation, impliquant des kinases et des phosphatases. Des dérégulations de ces mécanismes ont été identifiées dans de nombreux cancers. Leur identification et leur caractérisation ouvrent aujourd'hui de nouvelles perspectives pour le diagnostic et le traitement de la maladie cancéreuse.
CDC25B est une phosphatase régulatrice du cycle cellulaire essentielle pour le contrôle de l'entrée en mitose. Elle appartient à une famille qui compte trois membres codés par des gènes différents (CDC25A, B et C) chez les mammifères. La protéine CDC25B est exprimée et active en fin de phase G2 du cycle cellulaire (Baldin et al.,
1997 ; Gabrielli et al., 1996). Sa localisation intracellulaire est régulée par des séquences NES et NLS (Davezac et al., 2000) et par son interaction avec les protéines 14-3-3 (Mils et al, 2000 ; Forrest et al, 2001). Il a été suggéré que CDC25B puisse agir comme un "starter" des événements mitotiques précoces (Nllsson et al., 2000). Elle pourrait jouer un rôle dans l'activation initiale d'une population de CDC2/cycline B au niveau du centrosome avant sa translocation nucléaire (Kumagai et al., 1992 ; Hoffmann et al., 1993). CDC25B active les complexes CDK/cycline pour permettre les remaniements architecturaux et biochimiques qui sont nécessaires pour permettre le processus de division cellulaire. Son activité est régulée par les variations de son expression, par son association à des partenaires régulateurs et par des événements de phosphorylation.
La protéine kinase Aurora A, également connue sous le nom de STK5, est surexprimée dans de nombreuses tumeurs du sein. Cette expression est corrélée avec un haut grade tumoral (Bischoff et al., 1998 ; Zhou et al., 1998). Cette kinase est codée par le gène STKl 5 localisé que le locus 20ql 3, un amplicon présent dans de nombreuses tumeurs. Cette protéine est localisée au niveau du centrosome (Dutertre et al., 2002).. Sa fonction semble importante pour la séparation des centrosomes (Giet et al., 2000), leur duplication (Zhou et al., 1998) et l'assemblage d'un fuseau mitotique bipolaire (Giet et al., 2000). L'inhibition de sa fonction par la technologie de I1ARN interférence conduit à la formation de fuseaux monopolaires et sa surexpression est responsable d'une amplification centrosomale et d'une polyploïdisation (Meraldi et al., 2002 ; Bischoff et al, 1998 ; Zhou et al., 1998).
A ce jour, l'identification des substrats de la kinase Aurora A est encore très parcellaire. La phosphatase CDC25B est le premier substrat identifié qui est également co-localisé au niveau des centrosomes et joue un rôle clair dans le contrôle du cycle cellulaire et de la prolifération.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du site de phosphorylation in vitro de la phosphatase CDC25B par la kinase Aurora A, et de l'identification de la séquence phosphorylée du variant d'épissage CDC25B3 de
CDC25B sur le résidu serine en position 353.
L'un des buts de la présente invention consiste à fournir de nouvelles séquences phosphorylées des différents variants de la phosphatase CDC25B.
Un autre but de l'invention consiste à fournir un nouvel anticorps dirigé contre une phosphatase CDC25B phosphorylée, ledit anticorps pouvant être utilisé dans le cadre d'un diagnostic médical, ou pour la préparation de cribles pour l'identification de molécules liant ladite séquence phosphorylée et susceptibles de représenter de nouveaux agents utilisables en pharmacologie anti-tumorale.
Un autre but de l'invention consiste à fournir un nouvel outil pour l'étude des mécanismes moléculaires qui conduisent à la polyploïdisation et à la transformation cellulaire, ainsi qu'un nouvel outil permettant la mise en évidence de l'activité de la kinase Aurora A sur un de ses substrats physiologiques, et par conséquent l'identification d'éventuelles perturbations quantitatives, temporelles et spatiales de cette activité. La présente invention concerne une séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par un fragment d'au moins environ 10 acides aminés issus de la séquence SEQ ID NO : 1 suivante :
TPVQNKRRRSpVTPPEEQQE SEQ ID NO : 1 dans laquelle le résidu serine en position 10 est phosphorylé, notamment par traitement in vitro de la séquence SEQ TD NO : 1 par la kinase Aurora A5 ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu serine phosphorylé.
L'expression "résidu phosphorylé" désigne un acide aminé porteur d'un groupement phosphate.
La présente invention concerne également une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par la séquence SEQ ID NO : 2 suivante :
QNKRRRSpVTPPEEQ SEQ ID NO : 2 dans laquelle le résidu serine en position 7 est phosphorylé.
La séquence SEQ ID NO : 2 correspond à un fragment de la séquence SEQ ID' NO : 1 susmentionnée. Plus exactement, elle correspond au fragment de SEQ ID NO : 1 délimité de l'acide aminé en position 4 à l'acide aminé en position 17.
La présente invention concerne également une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes :
- la séquence SEQ ID NO : 3, représentant le variant d'épissage CDC25B1 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 339 est phosphorylé, - la séquence SEQ ID NO : 4, représentant un variant d'épissage CDC25B2 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 312 est phosphorylé,
- la séquence SEQ TD NO : 5, représentant un variant d'épissage CDC25B3 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 353 est phosphorylé,
- la séquence SEQ TD NO : 6, représentant un variant d'épissage CDC25B4 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 374 est phosphorylé,
- la séquence SEQ TD NO : 7, représentant un variant d'épissage CDC25B5 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position
361 est phosphorylé.
La présente invention concerne également un anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître une séquence peptidique telle que définie précédemment. Un anticorps polyclonal avantageux de l'invention est caractérisé en ce qu'il est susceptible de reconnaître la séquence SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus.
Un tel anticorps dirigé contre l'épitope phosphorylé de séquence SEQ ED NO : 2 est généré en immunisant des lapins avec ledit épitope. Plus précisément, ledit épitope est couplé de façon covalente avec une protéine porteuse telle que l'hémocyanine, le BSA ou Povalbumine. Les lapins sont alors immunisés pendant 3 mois (4 injections au total) et la saignée finale permet la récupération d'environ 50 ml de sérum. Le sérum est ensuite doublement purifié par affinité sur une colonne de peptide phosphorylé puis sur une colonne de peptide non phosphorylé.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dirigé contre la séquence peptidique SEQ ED NO : 2 telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - l'immunisation d'un animal par injection de la séquence peptidique
SEQ ED NO : 2 telle que définie ci-dessus,
- la fusion entre des myélomes d'un animal et des splénocytes d'un animal afin d'obtenir des hybridomes,
- la mise en culture des hybridomes ainsi obtenus, - la récupération et purification par clonage d'un hybridome, choisi parmi ceux obtenus à l'étape précédente et sécrétant un anticorps dirigé contre la séquence peptidique SEQ ED NO : 2 telle que définie ci-dessus.
L'animal utilisépour l'étape d'immunisation est notamment une souris. Les myébmes utilisés pour la fusion proviennent notamment une souris. Les splénocytes utilisés pour la fusion proviennent d'un animal de la même espèce que celle dont provient les myélomes, à savoir notamment une souris.
On choisit les hybridomes qui sécrètent les anticorps contre la séquence peptidique SEQ ED NO : 2 sur la base de la production d'anticorps capables de reconnaître dans un test ELISA le peptide phosphorylé utilisé pour rimmunisation mais pas le peptide non phosphorylé.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active une séquence peptidique telle que définie précédemment, un anticorps tel que défini ci-dessus, ou un anticorps anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable.
Une composition pharmaceutique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active la séquence peptidique représentée par la séquence SEQ ID NO : 2.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, d'un anticorps tel que défini ci-dessus, ou d'un anticorps anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de cancers, tels que les cancers du sein. La présente invention concerne également l'utilisation d'un anticorps tel que défini ci-dessus, pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal, notamment de cancers du sein.
Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation d'un anticorps polyclonal tel que défini ci-dessus, dirigé contre l'épitope phosphorylé de séquence SEQ ID NO : 2, pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal, notamment de cancers du sein La présente invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro de cancers, notamment de cancers du sein, chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en présence d'un anticorps tel que défini ci-dessus, avec un échantillon biologique prélevé chez un individu, ledit anticorps étant le cas échéant fixé sur un support solide,
- la détection d'une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, susceptible d'être présente dans l'échantillon biologique à l'aide de réactifs marqués, notamment d'anticorps marqués, reconnaissant soit l'anticorps lié à ladite séquence peptidique, soit la séquence peptidique liée audit anticorps dans les complexes formés lors de l'étape précédente entre l'anticorps et la séquence peptidique susceptible d'être présente dans l'échantillon biologique, et ce, le cas échéant, après rinçage approprié du support solide.
La présente invention concerne également une méthode de pronostic in vitro de cancers, notamment de cancers du sein, chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en présence d'un anticorps tel que défini ci-dessus, avec un échantillon tumoral prélevé chez un individu, ledit anticorps étant le cas échéant fixé sur un support solide, - la détection d'une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, susceptible d'être présente dans l'échantillon biologique à l'aide de réactifs marqués, notamment d'anticorps marqués, reconnaissant soit l'anticorps lié à ladite séquence peptidique, soit la séquence peptidique liée audit anticorps dans les complexes formés lors de l'étape précédente entre l'anticorps et la séquence peptidique susceptible d'être présente dans l'échantillon biologique, et ce, le cas échéant, après rinçage approprié du support solide.
La présente invention concerne également l'utilisation des anticorps susmentionnés de l'invention dirigés contre une séquence phosphorylée de CDC25B dans le cadre de la mise en œuvre d'un test de diagnostic visant à détecter sur des prélèvements tumoraux la présence ou non de cette séquence phosphorylée, ceci dans un but diagnostique ou pronostique.
La présente invention concerne également un procédé de criblage d'une molécule capable de se lier à une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, ladite molécule étant susceptible d'être utilisée comme agent anti-tumoral ou agent anti-prolifératif tant sur les cellules en culture que chez un organisme vivant ou encore contre des agents infectieux (parasites, champignons pathogènes), caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en présence de ladite molécule avec la séquence peptidique susmentionnée, et
- la détection de la liaison de ladite molécule par l'utilisation de méthodes de compétition appropriées, notamment par la compétition vis-à-vis de la liaison d'un anticorps tel que défini ci-dessus.
La liaison entre ladite molécule avec la séquence peptidique phosphorylée peut être détectée selon le procédé suivant : la séquence phosphorylée (substrat phosphorylé) est liée à un support solide ; l'incubation avec l'anticorps Susmentionné en solution permet ensuite sa fixation qui est révélée par l'utilisation d'un anticorps secondaire porteur d'un chromophore ou par le marquage direct de l'anticorps primaire (anticorps de l'invention dirigé contre la séquence phosphorylée). L'incubation simultanée avec un composé capable de lier ladite séquence phosphorylée entraîne sa fixation et le masquage du site reconnu par l'anticorps. La visualisation de cette interaction pourra donc être réalisée et quantifiée par la baisse de liaison de l'anticorps. DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente un spectre de masse du peptide monophosphorylé, 353- S(P)VTPPEEQQEAEEPK-367. L'axe des abscisses correspond au rapport m/z et l'axe des ordonnées correspond au pourcentage d'abondance relative.
Les Figures 2A, 2B et 2C représentent les résultats d'analyses western blot avec l'anticorps monoclonal SE96 (Figure 2A), avec l'anticorps anti-αMBP (New England Biolabs)(Figure 2B) et avec l'anticorps anti-αAurora A (voir demande de brevet français 02/07212)(Figure 2C). Dans ces Figures, la première colonne correspond à la protéine kinase Aurora A ; la seconde colonne à une protéine recombinante MBP- CDC25B ; la troisième colonne correspond à la protéine kinase Aurora A et à la protéine recombinante MBP-CDC25B et la quatrième colonne correspond à MBP seule.
Les Figures 3a à 3h représentent des images d'immunofluorescence indirecte réalisées sur des cellules HeLa avec l'anticorps SE96.
Dans les Figures 3a, 3c, 3e et 3g, les cellules HeLa ont été fixées et utilisées pour effectuer une analyse par immunofluorescence avec les anticorps SE96 et elles ont également été colorées avec du DAPI. Dans les Figures 3b, 3d, 3f et 3h, les cellules HeLa ont été fixées et utilisées pour effectuer une analyse par immunofluorescence avec les anticorps SE96.
Les cellules HeLa des Figures 3 c et 3d ont été mises en compétition avec le peptide phosphorylé ayant servi à l'immunisation (SEQ ID NO : 2) ; les cellules HeLa des Figures 3e et 3f ont été mises en compétition avec le 'peptide non phosphorylé (QNECRRRSVTPPEEQ) ; et les cellules HeLa des Figures 3g et 3h ont été mises en compétition avec un peptide phosphorylé sans rapport avec la serine 353
(MEVEELS(P)PLALGR).
Ces Figures démontrent que le marquage observé avec l'anticorps SE96 est bien éliminé par le peptide immunogène sous sa forme phosphorylée, mais pas par le même peptide non phosphorylé. Par ailleurs, un peptide phosphorylé irrelevant n'a aucun effet compétiteur, démontrant la spécificité vis-à-vis de la séquence phosphorylé et non de la présence du groupement phosphate uniquement. METHODES ET RESULTATS
La kinase Aurora A recombinante phosphoryle CDC25B3 sur la serine 353
La protéine recombinante CDC25B3 est phosphorylée in vitro par la kinase recombinante Aurora A. Le produit de la réaction de phosphorylation a été analysé par spectrométrie de masse après excision du gel d'électrophorèse et digestion tryptique. Le spectre MSMS du peptide monophosphorylé, 353-SVTPPEEQQEAEEPK-367 est présenté en Figure 1. Son analyse indique que c'est la serine 353 qui est phosphorylée par la kinase. De même, il a été montré que la kinase Aurora A recombinante phosphoryle
CDC25B1 sur la serine 339, CDC25B2 sur la serine 312, CDC25B4 sur la serine 374 et CDC25B5 sur la serine 361.
Production d'anticorps contre la protéine CDC25B phosphorylée par la kinase Aurora A
Le peptide de séquence Q]SIE-RRRS(P)VTPPEEQ (SEQ ID NO : 2) a été utilisé pour l'immunisation de lapins. Après sacrifice des animaux, le sérum a été purifié par chromatographie en deux étapes : la première sur une colonne de peptide phosphoryle pour retenir les anticorps spécifiques, puis la deuxième sur une colonne du même peptide non phosphoryle de séquence QNKRRRSVTPPEEQ, de manière à purifier dans
Muât les anticorps spécifiques de la forme phosphorylée. La reconnaissance du peptide phosphoryle par les anticorps a été validée dans un test ELISA. Dans la suite du document, ces anticorps seront désignés sous le nom de SE96.
L'anticorps SE96 reconnaît CDC25B phosphoryle par Aurora A
Des protéines recombinantes CDC25B-MBP (Maltose Binding protein) ou MBP seule ont été incubées en présence ou non de kinase Aurora A. Les échantillons ont ensuite été analysés par transfert de protéines (western blot) avec l'anticorps SE96 et des anticorps permettant la reconnaissance de la MBP et d'Aurora A. Comme le montre la Figure 2, la protéine CDC25B phosphorylée par Aurora A est reconnue par SE96, ce qui valide l'utilisation de cet anticorps dans un test Western blot. La protéine CDC25B phosphorylée sur Ia serine 353 est localisée au niveau du centrosome
Des cellules HeLa ont été fixées et utilisées pour effectuer une analyse par immunofluorescence avec les anticorps SE96. Les cellules ont également été colorées avec le 4'-6 diamino-2-phenylindole (DAPI) pour localiser le noyau. Les images présentées à la Figure 3 sont représentatives d'observations sur un grand nombre de cellules. Elles indiquent que la protéine CDC25B phosphorylée sur la serine 353 est localisée au niveau des centrosomes des cellules en mitose. Ce marquage est aboli lorsqu'une compétition est réalisée avec le peptide phosphorylé ayant servi à l'immunisation (SEQ ID NO : 2), mais pas avec le peptide non phosphorylé
(QNKRRRSVTPPEEQ) ni avec un peptide phosphorylé sans rapport avec la serine 353 (MEVEELS(p)PLALGR). Ces observations valident l'utilisation de ce réactif en immunofluorescence.
RÉFÉRENCES
- Baldin, V., Cans, C, Superti-Furga, G. & Ducommun, B (1997) Alternative splicing of the human CDC25B tyrosine phoshatase. Possible implications for growth control? Oncogene, 14, 2485-2495,
- Bischoff, J. R. et al. (1998) A homologue of Drosophila aurora kinase is oncogenic and amplified in human colorectal cancers, EMBO J, 17, 3052-65,
- Davezac, N. et al. (2000) Régulation of CDC25B phosphatases subcellular localization, Oncogene, 19, 2179-85, - Dutertre, S., Descamps, S. & Prigent, C. (2002) On the rôle of aurora-A in centrosome function, Oncogene, 21, 6175-83,
- Forrest, A. & Gabrielli, B. (2001) Cdc25B activity is regulated by 14-3-3, Oncogene, 20, 4393-401,
- Gabrielli, B. G. et al. (1996) Cytoplasmic accumulation of CDC25B phosphatase in mitosis triggers centrosomal microtubule nucleation in HeLa cells, J.
CeIl. Science, 109, 1081-1093,
- Giet, R. & Prigent, C. (2000) The Xenopus laevis aurora/Ipl lp-related kinase pEg2 participâtes in the stability of the bipolar mitotic spindle, Exp CeIl Res, 258, 145- 51, - Giet, R. et al. (2002) Drosophila Aurora A kinase is required to localize D-
TACC to centrosomes and to regulate astral microtubules, JCellBiol, 156, 437-51,
- Hoffmann, L, Clarke, P., Marcote, M. J., Karsenti, E. & Draetta, G. (1993) Phosphorylation and activation of human cdc25-C by cdc2-cyclin B and its involvement in the self amplification of MPF at mitosis, EMBO J, 12, 53-63, - Kumagai, A. & Dunphy, W. (1992) Régulation of the cdc25 protein during the cell cycle in Xenopus extracts, CeIl, 70, 139-151,
- Meraldi, P., Honda, R. & Nigg, E. A. (2002) Aurora-A overexpression reveals tetraploidization as a major route to centrosome amplification in p53-/- cells, Embo J, 21, 483-92, - Mils, V. et al. (2000) Spécifie interaction between 14.3.3 isoforms and the human CDC25B phosphatase, Oncogene, 19, 1257-1265,
- Nilsson, I. & Hoffmann, I. (2000) Cell cycle régulation by the Cdc25 phosphatase family, Pr og Cell Cycle Res, 4, 107-14,
- Zhou, H. et al. (1998) Tumour amplified kinase STK15/BTAK induces centrosome amplification, aneuploidy and transformation, Nat Genêt, 20, 189-93.

Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par un fragment d'au moins environ 10 acides aminés issus de la séquence
SEQ ID NO : 1 suivante :
TPVQNKRRRSpVTPPEEQQE SEQ K) NO : 1 dans laquelle le résidu serine en position 10 est phosphorylé, ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu serine phosphorylé.
2. Séquence peptidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par la séquence SEQ ED NO : 2 suivante :
QNKRRRSpVTPPEEQ SEQ ID NO : 2 dans laquelle le résidu serine en position 7 est phosphorylé.
3. Séquence peptidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes :
- la séquence SEQ K) NO : 3, représentant le variant d'épissage CDC25B1 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 339 est phosphorylé, ou
- la séquence SEQ K) NO : 4, représentant un variant d'épissage CDC25B2 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 312 est phosphorylé, ou
- la séquence SEQ K) NO : 5, représentant un variant d'épissage CDC25B3 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position
353 est phosphorylé, ou
- la séquence SEQ K) NO : 6, représentant un variant d'épissage CDC25B4 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 374 est phosphorylé, ou - la séquence SEQ K) NO : 7, représentant un variant d'épissage CDC25B5 de la protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu serine en position 361 est phosphorylé.
4. Anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Anticorps polyclonal susceptible de reconnaître la séquence SEQ E) NO : 2 telle que définie dans la revendication 2.
6. Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal selon la revendication 4, dirigé contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 telle que définie dans la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : — l'immunisation d'un animal par injection de la séquence peptidique selon la revendication 2,
- la fusion entre des myélomes d'un animal et des splénocytes d'un animal afin d'obtenir des hybridomes,
- la mise en culture des hybridomes ainsi obtenus, et - la récupération et purification par clonage d'un hybridome, choisi parmi ceux obtenus à l'étape précédente et sécrétant un anticorps dirigé contre la séquence peptidique selon la revendication 2.
7. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, un anticorps selon la revendication 4 ou 5, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable.
8. Utilisation d'une séquence peptidique selon ' l'une quelconque des revendications 1 à 3, d'un anticorps selon la revendication 4 ou 5, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de cancers, tels que les cancers du sein.
9. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 4 ou 5, pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic ou pronostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal, notamment de cancers du sein.
10. Méthode de diagnostic ou pronostic in vitro de cancers, notamment de cancers du sein, chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en présence d'un anticorps selon la revendication 4 ou 5, avec un échantillon biologique prélevé chez un individu, ledit anticorps étant le cas échéant fixé sur un support solide, et
- la détection d'une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, susceptible d'être présente dans l'échantillon biologique à l'aide de réactifs marqués, notamment d'anticorps marqués, reconnaissant soit l'anticorps lié à ladite séquence peptidique, soit la séquence peptidique liée audit anticorps dans les complexes formés, lors de l'étape précédente entre l'anticorps et la séquence peptidique susceptible d'être présente dans l'échantillon biologique, et ce, le cas échéant, après rinçage approprié du support solide.
11. Procédé de criblage d'une molécule capable de se lier à une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ladite molécule étant susceptible d'être utilisée comme agent anti-tumoral ou agent anti-prolifératif, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en présence de ladite molécule avec la séquence peptidique susmentionnée, et -, la détection de la liaison de ladite molécule par l'utilisation de méthodes de compétition appropriées, notamment par la compétition vis-à-vis de la liaison d'un anticorps selon la revendication 4 ou 5.
EP04767282A 2003-06-12 2004-06-08 Sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leur utilisation Withdrawn EP1631665A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0307095A FR2856068B1 (fr) 2003-06-12 2003-06-12 Nouvelles sequences phosphorylees de la phosphatase cd25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leur utilisation
PCT/FR2004/001416 WO2004111215A1 (fr) 2003-06-12 2004-06-08 Nouvelles sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leur utilisation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1631665A1 true EP1631665A1 (fr) 2006-03-08

Family

ID=33484391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP04767282A Withdrawn EP1631665A1 (fr) 2003-06-12 2004-06-08 Sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leur utilisation

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20080008712A1 (fr)
EP (1) EP1631665A1 (fr)
CA (1) CA2528844A1 (fr)
FR (1) FR2856068B1 (fr)
WO (1) WO2004111215A1 (fr)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040151713A1 (en) * 2001-06-04 2004-08-05 Makoto Nakanishi Cell cycle regulatory factor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2004111215A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004111215A1 (fr) 2004-12-23
FR2856068B1 (fr) 2005-08-19
FR2856068A1 (fr) 2004-12-17
CA2528844A1 (fr) 2004-12-23
US20080008712A1 (en) 2008-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Son et al. Roles of mitochondria in neuronal development
Hogan et al. Interaction of γ1-syntrophin with diacylglycerol kinase-ζ: regulation of nuclear localization by PDZ interactions
Barker et al. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function
Mayfield et al. Tyr1 phosphorylation promotes phosphorylation of Ser2 on the C-terminal domain of eukaryotic RNA polymerase II by P-TEFb
Tifft et al. Tyrosine phosphorylation of nuclear-membrane protein emerin by Src, Abl and other kinases
FR2827866A1 (fr) Peptides synthetiques ou naturels liant la proteine phosphatase 2a, methode d'identification et utilisations
Li et al. FSCB, a novel protein kinase A-phosphorylated calcium-binding protein, is a CABYR-binding partner involved in late steps of fibrous sheath biogenesis
Meetei et al. Involvement of protein kinase A in the phosphorylation of spermatidal protein TP2 and its effect on DNA condensation
US6875581B1 (en) Method for screening of modulators of calcineurin activity
Conor Moran et al. Mitoribosome biogenesis
EP1699460A2 (fr) Utilisation d'inhibiteurs enzymatiques de h-prune pour la prevention et le traitement des metastases de tumeurs sur-exprimant h-prune
EP1631665A1 (fr) Sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leur utilisation
EP1511771B1 (fr) Anticorps monoclonal anti-aurora-a, son procede d obtention, et ses utilisations dans le diagnostic et le traitement des cancers
RU2281973C2 (ru) Гистидин-протеин-фосфатаза
WO2006024796A1 (fr) Nouvelles sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leurs utilisations
WO2003031615A1 (fr) Inhibiteur de l'acide lysophosphatidique synthase
Paudel Involvement of calcium-dependent protein kinases and phosphatases in sperm capacitation-associated events
EP1723167A1 (fr) Nouvelles sequences phosphorylees de la phosphatase cdc25b, anticorps diriges contre ces sequences ainsi que leur utilisation
Taylor-Robinson Recovery of Protein Kinases from Renatured SDS-Polyacrylamide Gels for Biochemical Studies
Papke Signaling Alterations in PPP2R5D-Variant Disorder
Patel Characterization of Endothelial Nitric Oxide Synthase Serine-600 Phosphorylation
Walker Requirement for the* Rho insert domain of Cdc42 in activation of phospholipase D and cellular transformation
Adams Downstream targets of protein kinase C
Rettich Characterisation of the DNA endonuclease subunit EME1 as novel substrate of sumoylated Ubc9
da Silva Phosphorylation of Cdk2 at Threonine 39 by Akt Facilitates Cyclin-CDK2 Activation

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20051209

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LI LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

RTI1 Title (correction)

Free format text: PHOSPHORYLATED SEQUENCES OF THE PHOSPHATASE CDC25B, ANTIBODIES FOR SAID SEQUENCES AND USE THEREOF

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20061228