EP1587548A1 - Microparticules echogenes, servant notamment comme agent de contraste pour l exploration ultrasonore et/ou comme emboles pour la detection ultrasonore - Google Patents

Microparticules echogenes, servant notamment comme agent de contraste pour l exploration ultrasonore et/ou comme emboles pour la detection ultrasonore

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Publication number
EP1587548A1
EP1587548A1 EP04705832A EP04705832A EP1587548A1 EP 1587548 A1 EP1587548 A1 EP 1587548A1 EP 04705832 A EP04705832 A EP 04705832A EP 04705832 A EP04705832 A EP 04705832A EP 1587548 A1 EP1587548 A1 EP 1587548A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polymers
copolymers
derivatives
microparticles
vinyl
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04705832A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Céline CHAIX
Nathalie Lassau
Angelo Paci
Pierre Peronneau
Philippe Reb
Alain Roche
Valérie ROUFFIAC
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Gustave Roussy (IGR)
Original Assignee
Biosphere Medical Europe
Institut Gustave Roussy (IGR)
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Filing date
Publication date
Application filed by Biosphere Medical Europe, Institut Gustave Roussy (IGR) filed Critical Biosphere Medical Europe
Publication of EP1587548A1 publication Critical patent/EP1587548A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasonic imaging preparations
    • A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasonic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
    • A61K49/225—Microparticles, microcapsules

Definitions

  • the present invention relates to microparticles and their manufacturing methods.
  • the invention is particularly, but not exclusively, concerned with the use of these microparticles as a contrast agent for ultrasonic exploration.
  • the physical principle underlying an ultrasound or Doppler examination is the backscattering of ultrasound by the tissues.
  • the examination probe generates a mechanical wave drawn from a given energy (calculated in terms of mechanical index) at a frequency conventionally between 5 to 13 MHz (megahertz). This wave then propagates deep from the surface of the probe to the tissues.
  • the laws of reflection apply and it follows that part of the energy is returned to the probe while the remaining energy continues its path in depth.
  • “Ultrasonic interface” is understood here to mean any break in acoustic impedance between two media. This impedance is defined as the product of the speed of propagation of the ultrasound - by the density of the medium considered.
  • a color image can be overlaid on the grayscale image.
  • This new representation makes it possible to locate the structures which are no longer fixed but mobile such as the red blood cells flowing in the vessels.
  • the physical principle is Doppler mode: when a wave, emitted at a frequency F, meets a moving diffuser (red blood cell), the latter emits a wave of frequency F ⁇ ⁇ F in return.
  • the frequency differential ⁇ F is proportional to the speed of movement of this diffuser.
  • An equation then governs the relationship between this speed of movement and the Doppler frequency ⁇ F.
  • the ultrasound system goes back to speed information from the Doppler frequency actually measured. This speed is then represented on the Doppler image by a color whose intensity allows an appreciation of the speed from the general color scale (red and blue scale depending on the direction of flow).
  • a contrast agent enhancing the backscattered signal can be injected into the body before ultrasound measurement.
  • a contrast agent for ultrasonic exploration comprising porous particles of an inorganic material which contain a trapped gas or liquid and whose average diameter is between 0, 05 and 500 microns, said inorganic material consisting of one or more substances selected from the group consisting of polymeric or monomeric borates, polymeric or monomeric aluminum oxides, polymeric or monomeric carbonates, polymeric or monomeric silicas and polymeric or monomeric phosphates, and pharmaceutically acceptable inorganic or organic cationic salts of said substances.
  • Trisacryl gelatin microspheres for therapeutic embolization by Beaujeux r et al, "trisacryl gelatin microspheres for therapeutic embolization,” by Laurent et al.,
  • the ultrasonic contrast products developed and / or on the market at the present time are composed by particles containing air or any gas (conferring the echogenic character) or else by perfluorinated derivatives which are matrices of hydrophobic polymers .
  • the inventors have demonstrated, for the first time, the echogenic character of a macromolecular network of hydrophilic polymers and / or copolymers.
  • the inventors have now prepared microparticles which can be used as a contrast agent and which do not have the drawbacks of the products of the prior art.
  • the microparticles of the invention offer the advantage of being particularly echogenic and appear to be resistant to a prolonged ultrasonic field, that is to say that they exhibit remarkable performances with respect to the phenomenon of insonification.
  • echogenic microparticles for ultrasonic exploration and / or their ultrasonic detection characterized in that they have a size of between 0.1 ⁇ m (micrometer) and 2000 ⁇ m and consist of a macromolecular network hydrophilic polymers and / or copolymers.
  • said hydrophilic polymers and copolymers comprise alcohol, amino or acid functions.
  • the microparticles will have a size varying from 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, preferably between 1 ⁇ m and 7 ⁇ m.
  • these microparticles will be used as an ultrasound contrast product.
  • Said microparticles can be used for the preparation of a contrast agent for ultrasonic exploration.
  • the microparticles will have a size varying from 30 ⁇ m to 2000 ⁇ m.
  • these microparticles will be used in the visualization of the embolism by ultrasound.
  • These microparticles are likely to constitute: - an implant for vascular occlusion, for filling natural cavities, for filling artificial cavities or for filling surgical cavities; a tissue reconstruction biomaterial.
  • microparticles having a size varying from 30 ⁇ m to 2000 ⁇ m can be used as an embolization particle intended for the treatment of cancers.
  • these microparticles (from 30 to 2000 ⁇ ms) could be used for the detection of emboli used for the treatment of cancers.
  • the polymers and copolymers which constitute the macromolecular network of the particle are preferably functionalized and / or hydrophilic derivatives such as, for example, alcohol, amino or acid derivatives.
  • polymers and copolymers are chosen from at least one of the groups comprising: acrylate and methacrylate polymers or copolymers, and their derivatives, salts, esters, amides, anhydrides, nitriles, such as, for example, diethyl amino ethane (DEAE) acrylamide, acrylamide, acrylic acid, sodium acrylate, hydroxyethyl acrylate or methacrylate; vinyl polymers and copolymers and their derivatives, such as, for example, vinyl acetate, vinyl pyridine, vinyl sulfonates or phosphates, vinyl pyrrolidone; - polymers and copolymers of ethylene glycol and its derivatives; polymers and copolymers of styrene sulfonate or styrene phosphonate and their derivatives; - polymers and copolymers of polycarboxylic acids such as fumaric, maleic, malic, succinic, citric acids, their salts
  • the microparticles consist of:
  • N-acryloyltris (hydroxymethyl) methylamine also called Trisacryl
  • MCA methylene bisacrylamide
  • the subject of the invention is also a composition for ultrasonic exploration comprising the microparticles according to the invention mixed with physiological serum as solvent in order to obtain an injectable solution.
  • the suspending medium used for the in vitro experiments could for example consist of a mixture of sterile water and glycerol. Furthermore, the microparticles are present in the composition for a concentration of between 0.25 grams per liter (gl "1 ) and 32 grams per liter (gl -1 ).
  • a subject of the invention is therefore also the use of the microparticles mentioned above for the preparation of a composition for ultrasonic exploration in which said microparticles constitute the contrast agent.
  • contrast agents according to the invention and the compositions containing them are useful for ultrasonic exploration of the human or animal body and more particularly in the context of the study of vascularization.
  • the invention also relates to a method for investigating blood vessels and certain organs or parts of a human body or animal, such as the heart, by standard ultrasound, consisting of the following stages: administration to the subject / patient of a dose of 0.25 to 32 grams of microparticles by blood, emission of ultrasound waves in the region being investigated , reception of ultrasonic wave returns from the microparticles stated above, calculation of ultrasonic enhancement produced by the microparticles using appropriate software on the recorded Doppler images.
  • the invention also relates to a method for investigating the embolization of blood vessels, characterized in that it comprises the following steps: administration by blood to the subject / patient of a dose of 0.1 to 20 ml of the above microparticles, emission of ultrasonic waves in the region being investigated, reception of returns of ultrasonic waves from the microparticles stated above, calculation of ultrasound enhancement produced by microparticles using suitable software on the recorded Doppler images.
  • the invention also relates to a method for manufacturing defined microparticles.
  • a method for manufacturing defined microparticles previously, and more specifically the microparticles having a size varying between 0.1 and 10 ⁇ m, characterized in that it comprises the following steps: - production of a reverse mini-emulsion of identical or different monomers, or identical or different polymers in a organic phase comprising a surfactant, by means capable of creating very high shear or very strong stirring or thanks to membrane emulsification, copolymerization or crosslinking of the above stirred emulsion to obtain the microparticles of polymers or copolymers as defined previously, - recovery of the microparticles by centrifugation and redispersion in aqueous or organic media.
  • the crosslinking step of the polymer chains will consist in producing, using a reagent, said microparticles, said polymer (s) being chosen from the following list: acrylate and methacrylate polymers or copolymers, and their derivatives, salts, esters, amides, anhydrides, nitriles, such as, for example, DEAE acrylamide, acrylamide, acrylic acid, sodium acrylate, hydroxyethyl acrylate or methacrylate; vinyl polymers and copolymers and their derivatives, such as, for example, vinyl acetate, vinyl pyridine, vinyl sulfonates or phosphates, vinyl pyrrolidone; polymers and copolymers of ethylene glycol and its derivatives; polymers and copolymers of styrene sulfonate or styrene phosphonate and their derivatives; polymers and copolymers of polycarboxylic acids such as fumaric, maleic, malic, succinic,
  • dialdehyde compounds such as for example glutaraldehyde for crosslinking PVA chains, and their derivatives ..., co mp osed sd rivés sdi - poly ac ides / amines / alcohols allowing an ester ification reaction with a complementary function found on the polymer chain, compounds derived from di-poly isocyanates used for example in the crosslinking of polyethylene glycol chains.
  • the reagent allowing the crosslinking of the above-mentioned polymer (s) may consist of a reagent (or coupling agent) allowing the crosslinking by reacting two functions found on two chains of different polymers, such as crosslinking between two peptide or protein chains, or crosslinking of human serum albumin chains using EDC
  • the manufacturing process may also consist of a copolymerization of monomeric agents and of crosslinking monomeric agents.
  • the monomers may consist of one or more monomer (s) chosen from the following families of compounds: acrylate and methacrylate monomers, and their derivatives, salts, esters, amides, anhydrides, nitriles, ... as for example, DEAE acrylamide,
  • vinyl monomers and their derivatives such as for example vinyl acetate, vinyl pyridine, vinyl sulfonates or phosphates, vinyl pyrrolidone, ethylene glycol monomers and their derivatives, styrene sulfonate monomers or styrene phosphonate and their derivatives.
  • the crosslinking agent may in turn consist of any substance having at least two polymerizable functions on the same molecule, such as, for example, N, N 'methylene bisacrylamide (MBA), ethylene glycol dimethacrylate (EGDM) or divinyl benzene.
  • MBA N, N 'methylene bisacrylamide
  • EGDM ethylene glycol dimethacrylate
  • divinyl benzene ethylene glycol dimethacrylate
  • polymerization initiators or crosslinking agent
  • crosslinking agent can be chosen from the list below:
  • the process for manufacturing the microparticles may consist in modifying an existing polymer chain, by grafting thereon, for example, polymerizable functions, then by causing them to react so as to obtain a bond CC (carbon-carbon) coupling between the polymer chains.
  • a bond CC carbon-carbon coupling between the polymer chains.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the echogenicity of the microparticles according to the invention, having a size between 0.1 and 10 microns for various concentrations, depending on the frequency;
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the echogenicity of the microparticles according to the invention, having a size of between 30 and 2000 ⁇ m (“embosphere” registered trademark) for various sizes, depending on the frequency;
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the variation of the power returned by the microparticles according to the invention for a transmission power at 10 MHz as a function of time;
  • FIG. 4 illustrates the influence of an ultrasonic insonification at 10 kHz of repetition frequency for the same sample of microparticles as a function of two durations of time.
  • Figures 5 and 6 illustrate the visualization of vascularization in the kidney, before ( Figure 5) and after ( Figure 6) in vivo injection of microparticles.
  • FIG. 7 represents the quantification of the ultrasound enhancement, expressed in decibels (dB) produced by the microparticles at a 1/32 dilution in the kidney inside the region of interest.
  • Example 1 Manufacture of microparticles according to the invention.
  • the size of the microparticles depends on several parameters, the main ones being the speed of agitation, the concentration of surfactant and the viscosity ratio between the two media which are the monomer phase.
  • aqueous phase and the continuous phase (organic phase).
  • microparticles with a size of between 30 micrometers ( ⁇ m) and 2000 ⁇ ms for their use in visualizing vascular embolism by ultrasound we present below two operating modes; one to make microparticles based on trisacryl with porcine gelatin and the other to make microparticles based on sodium acrylate.
  • microparticles based on trisacryl with porcine gelatin (“Embosphere” registered trademark)
  • Embosphere registered trademark
  • the gelatin solution and 1.4 g of ammonium persulfate, previously dissolved in 20 ml of ultra pure water, are added.
  • the monomer phase is then poured into the oily phase at 60 ° C. with stirring. 4 ml of N, N, N ', N' tetraethylmethanediamine (TEMED) are then poured into the emulsion.
  • TEMED tetraethylmethanediamine
  • microparticles are then recovered by decantation and washed carefully. These microparticles are then treated with glutaraldehyde and washed several times at 60 and 90 ° C. Then they are sieved and sterilized by steam in a buffered medium.
  • a 10-liter beaker is also used for sodium acrylate-based microparticles.
  • the operator pours 4 liters of paraffin oil, 4 ml of Sorbitan trioleate and the mixture is heated in a water bath to a temperature between 54 ° C and 60 ° C.
  • the gelatin solution and 1.4 g of ammonium persulfate, previously dissolved in 20 ml of ultra pure water, are added.
  • the monomer phase is then poured into the oily phase at 60 ° C. with stirring.
  • the microparticles are then recovered by decantation and washed carefully. Then they are sieved and sterilized by steam in a buffered medium.
  • Example 2 Result and in vi tro studies relating to the echogenic properties of the microparticles according to the invention
  • microparticles As can be seen in FIG. 1, eight dilutions of microparticles were studied, namely 1/512, 1/256, 1/128, 1/64, 1/32, 1/16, 1/8 and 1/4; these dilutions being calculated relative to an initial concentration fixed at 5 grams of microparticles according to the invention in 40 milliliters of suspending medium.
  • the graph in FIG. 1 represents the different curves for each of the above concentrations as a function of the frequency.
  • - the backscattered power increases with the concentration the backscattered power by the particles is greater than 10 dB from the 1/512 dilution and increases until reaching 25 dB for the greatest concentration at 52 ⁇ J.
  • the particles the size of which is between 0.1 and 10 ⁇ m, thus have strong echogenicity properties.
  • Echogenicity of microparticles having a size between 30 and 2000 ⁇ m (“embosphere” registered trademark).
  • FIG. 2 shows the spectra representative of the backscattered power of the particles embosphere at the power 52 ⁇ J. 4 size ranges have been studied: from 300 to 500 ⁇ m, from 500 to 700 ⁇ m, from 700 to 900 ⁇ m and from 900 ⁇ m to 1200 ⁇ m.
  • microparticles present in the suspension were insonified with a 10 MHz wave with a repetition frequency of 1 kHz.
  • the backscatter measurements were taken at different time intervals. The results of these measurements are presented in Figure 3.
  • the ultrasonic backscatter does not vary significantly over time when the microparticles of the invention are subjected to an ultrasonic field and this for a prolonged period. Consequently, it appears that the microparticles have not been altered or destroyed under the effect of a given and prolonged energy insonification. In view of the previous results, it was decided to continue the study for a higher emitted ultrasonic energy.
  • the amplitude of the transmitted wave having been set on the transmitter to its maximum level, the repetition frequency of the wave at 10 kHz has been increased. In this way, the ultrasonic power transmitted to the particles is generally greater for an equivalent time interval.
  • microparticles appear to be resistant both to an ultrasonic field and to a shear field applied for a prolonged period.
  • Example 3 Quantification of the ultrasonic enhancement of the particles, whose size is between 0.1 and 10 ⁇ m, at different dilutions in vivo in nude mice.
  • Suspension medium used in vivo The suspending medium used was composed of 100% sterile water + 9 ° / O0 NaCl
  • mice did not have a tumor except when specified
  • the syringes systematically had a diameter of 30 ⁇ m.
  • Table 2 The table represents the detection of the vessels before and after in vivo injection of the microparticles in nude mice. The vessels were counted by analysis of the echo-Doppler images recorded.
  • FIG. 7 shows an example of enhancements obtained in a xenografted tumor on two mice at 1/32 dilution.
  • FIG. 5 and 6 show an example of Doppler ultrasound images recorded before and after injection of the microparticles. Vessel detection is significantly improved after injection. From these images, it was possible to count the vessels detected before and after injection.
  • the second table summarizes the results obtained, for two study dilutions: 1/64 and 1/32. The average number of additional vessels detected after injection of the particles is on average 2 or 3 vessels.
  • the procedure is as follows: the probe is placed in contact with the patient's skin at the place where the examination is to be carried out.
  • An ultrasound gel is previously spread over the surface of the probe in order to ensure good transmission of the ultrasound beam between the probe and the tissues, the depth of measurement and the two-dimensional gain of the ultrasound system are respectively adjusted according to the depth where locates the organ of interest and the contrast of the image obtained, when the organ of interest is identified on the image, the examiner proceeds to measure the dimensions of the organ on the stopped image.
  • a photographic image is printed and the image is stored digitally, if a visualization of the vessels is necessary, the color Doppler mode is activated.
  • the operator activates the pulsed Doppler in order to obtain the triplex mode. This makes it possible to define a precise measurement volume in the flow and to obtain the velocity spectrum over time to measure the circulatory velocities.
  • ultrasound allows a descriptive analysis of the morphology and structure of the thyroid. It allows to appreciate: * the dimensions of each lobe (height, thickness and width);
  • lymph node areas size, appearance and situation of possible lymphadenopathy
  • a high frequency probe (7.5 MHz or more) is essential to obtain a high spatial resolution (linear strip).
  • the device must have a regular technical update and quality control.
  • a large linear probe, or a sector probe allowing the study of plunging goiter and the measurement of the height of the lobes of a goiter.
  • the microparticles are administered to the patient preferably by blood directly where the ultrasound is to be performed.
  • the dose administered is variable depending on the patient.
  • 0.2 milliliter of an emulsion having a concentration of 0.08 grams of microparticles according to the invention will be administered in 40 milliliters of suspending medium, ie a concentration of 2 grams of microparticles per liter of solvent.
  • the solvent will for example consist of physiological serum, containing, of course, no backscattering element.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des microparticules échogènes pour l'exploration ultrasonique et/ou leur détection ultrasonore caractérisée en ce qu'elles présentent une taille comprise entre 0,1 µm (micromètre) et 2000 µm et sont constituées d'un réseau macromoléculaire de polymères et/ou de copolymères hydrophiles. La présente invention se rapporte également au procédé de fabrication de ces microparticules et à leur utilisation en tant qu'agent de contraste et/ou d'embolisation.

Description

MICROPARTICULES ÉCHOGÈNES, SERVANT NOTAMMENT COMME
AGENT DE CONTRASTE POUR L'EXPLORATION ULTRASONORE ET/OU
COMME EMBOLES POUR LA DÉTECTION ULTRASONORE
La présente invention concerne des microparticules et leurs procédés de fabrication. L'invention s'intéresse tout particulièrement, mais non exclusivement, à l'utilisation de ces microparticules en tant qu'agent de contraste pour l'exploration ultrasonique.
Le principe physique à la base d'un examen échographique ou Doppler est la rétrodiffusion des ultrasons par les tissus. La sonde d'examen engendre une onde mécanique puisée d'une énergie donnée (calculée en termes d'indice mécanique) à une fréquence classiquement comprise entre 5 à 13 MHz (mégahertz) . Cette onde se propage ensuite en profondeur depuis la surface de la sonde jusque dans les tissus. À chaque interface ultrasonore rencontrée, les lois de la réflexion s'appliquent et il s'ensuit qu'une partie de l'énergie est renvoyée vers la sonde tandis que l'énergie restante continue son trajet en profondeur. On entend ici par « interface ultrasonore » toute rupture d'impédance acoustique entre deux milieux. Cette impédance se définit comme le produit de la vitesse de propagation des ultrasons-— par la masse volumique du milieu considéré. Autrement dit, lorsque l'onde arrive à l'interface entre deux structures différentes, par exemple entre un muscle et un os, une onde « rétrodiffusée » est renvoyée. L'énergie de cette onde dépend de la différence d' impédance entre ces deux milieux. Plus ce différentiel sera important, plus l'énergie renvoyée sera élevée. En termes de reconstruction d'image, cette énergie rétrodiffusée sera codée par un niveau de gris. Ainsi, deux informations sont disponibles à partir d'une image échographique : 1) la localisation en profondeur des structures tissulaires du fait de la pulsatilité de 1 ' onde ;
2) une appréciation de la densité tissulaire par le niveau de gris représenté.
Il est possible de superposer une image couleur à l'image en niveau de gris. Cette nouvelle représentation permet de localiser les structures non plus fixes mais mobiles comme les globules rouges en écoulement dans les vaisseaux. Le principe physique est le mode Doppler : lorsqu'une onde, émise à une fréquence F, rencontre un diffuseur (globule rouge) en mouvement, ce dernier émet une onde de fréquence F±ΔF en retour. Le différentiel en fréquence ΔF est proportionnel à la vitesse de déplacement de ce diffuseur. Une équation régit alors la relation entre cette vitesse de déplacement et la fréquence Doppler ΔF. Intégré dans son calculateur, l'échographe remonte à l'information vitesse depuis la fréquence Doppler réellement mesurée. Cette vitesse est ensuite représentée sur l'image Doppler par une couleur dont l'intensité permet une appréciation de la vitesse à partir de l'échelle couleur générale (échelle de rouge et bleu selon le sens de l'écoulement) .
Afin d'améliorer la sensibilité de détection de la vascularisation (macro circulatoire) , un agent de contraste rehausseur du signal rétrodiffusé peut être injecté dans l'organisme avant la mesure échographique .
L'art antérieur connaît déjà, par la demande de brevet WO 9219272, un agent de contraste pour exploration ultrasonique comprenant des particules poreuses d'un matériau inorganique qui contiennent un gaz ou un liquide piégé et, dont le diamètre moyen se situe entre 0,05 et 500 microns, ledit matériau inorganique étant constitué d'une ou plusieurs substances sélectionnées dans le groupe formé de borates polymères ou monomères, d'oxydes d'aluminium polymères ou monomères, de carbonates polymères ou monomères, de silices polymères ou monomères et de phosphates polymères ou monomères, et sels cationiques inorganiques ou organiques pharmaceut iquement acceptables desdites substances.
Il est également proposé dans le brevet américain N°US 6203778 un procédé caractérisant une propriété de l'espace extravasculaire d'un tissu utilisant le contraste particulaire opaque aux rayons X. Ce document décrit une nouvelle classe d'agents particulaires consistant en un noyau organique ou inorganique entouré d'un revêtement organique du type polyéthylène glycol, acide glucuronique , acide sialique, ou des mélanges de ces polymères.
L'art antérieur connaît également les articles scientifiques suivants :
« magnetic résonance imaging out corne after utérine artery embolization for leiomyomata with use of tris-acryl gelatin microspheres » de Banovac F. et al . , « micro carrier culture of fibroblastic cells on modified acryl beads » de Obrenovitch et al.,
« trisacryl gelatin microspheres for therapeutic embolization » de Beaujeux r et al, « trisacryl gelatin microspheres for therapeutic embolization, » de Laurent et al.,
mais ces articles divulguent des solutions pour 1 ' embolisation des vaisseaux tumoraux et la culture cellulaire, et ne proposent aucune solution intéressante pour des produits échogènes, c'est-à-dire destinés à l'exploration et/ou la détection ultrasonore.
Concernant l'exploration et/ou la détection ultrasonore, et les produits échogènes destinés à de telles utilisations, les produits et les procédés de l'art antérieur présentent un certain nombre d'inconvénients. En effet, les particules sont souvent instables ou présentent une durée de vie limitée et les procédés de fabrication de ces particules constituent des coûts très importants.
Les produits de contraste ultrasonore développés et/ou sur le marché à l'heure actuelle sont composés par des particules contenant de l'air ou un gaz quelconque (conférant le caractère échogène) ou bien par des dérivés perfluorés qui sont des matrices de polymères hydrophobes. Les inventeurs ont mis en évidence, pour la première fois, le caractère échogène d'un réseau macromoléculaire de polymères et/ou de copolymères hydrophiles. Les inventeurs ont maintenant préparé des microparticules qui peuvent être utilisées comme agent de contraste et qui ne présentent pas les inconvénients des produits de l'art antérieur. En effet, les microparticules de l'invention offrent l'avantage d'être particulièrement échogènes et apparaissent résistantes à un champ ultrasonore prolongé, c'est-à- dire qu'elles présentent des performances remarquables vis-à-vis du phénomène d' insonification.
Ce but est atteint grâce à des microparticules échogènes pour l'exploration ultrasonore et/ou leur détection ultrasonore, caractérisé en ce qu'elles présentent une taille comprise entre 0,1 μm (micromètre) et 2000 μm et sont constituées d'un réseau macromoléculaire de polymères et/ou de copolymères hydrophiles.
Avantageusement, lesdits polymères et copolymères hydrophiles comprennent des fonctions alcools, aminés ou acides.
Selon un premier mode d'exécution de l'invention, les microparticules présenteront une taille variant de 0,1 μm à 10 μm, de préférence entre 1 μm et 7 μm. Dans ce cas, ces microparticules seront utilisées en tant que produit de contraste échographique . Lesdites microparticules pourront être utilisées pour la préparation d'un agent de contraste pour l'exploration ultrasonore.
Selon un second mode d'exécution de l'invention, les microparticules présenteront une taille variant de 30 μm à 2000 μm. Dans ce cas, ces microparticules seront utilisées dans la visualisation de l'embolie par échographie. Ces microparticules seront susceptibles de constituer : - un implant pour occlusion vasculaire, pour le comblement de cavités naturelles, pour le comblement de cavités artificielles ou pour le comblement de cavités chirurgicales ; un biomatériau de reconstruction tissulaire.
Les microparticules présentant une taille variant de 30 μm à 2000 μm pourront être utilisées en tant que particule d' embolisation destinée au traitement des cancers. Autrement dit, ces microparticules (de 30 à 2000 μms) pourront être utilisées pour la détection d'embole utilisée pour le traitement des cancers .
Les polymères et les copolymères qui constituent le réseau macromoléculaire de la particule sont de préférence des dérivés fonctionnalisés et/ou hydrophiles comme par exemple des dérivés alcools, des aminés ou des acides.
Ces polymères et copolymères sont choisis dans l'un au moins des groupes comprenant : les polymères ou copolymères acrylates et méthacrylates, et leurs dérivés, sels, esters, amides, anhydrides, nitriles, comme par exemple, le di éthyl amino éthane (DEAE) acrylamide, 1 ' acrylamide, l'acide acrylique, l'acrylate de sodium, 1 ' hydroxyéthyl acrylate ou méthacrylate ; les polymères et copolymères vinyliques et leurs dérivés, comme par exemple acétate de vinyle, la vinyle pyridine, les vinyles sulfonates ou phosphates, vinyle pyrrolidone ; - les polymères et copolymères d'éthylène glycol et ses dérivés ; les polymères et copolymères de sulfonate de styrène ou phosphonate de styrène et leurs dérivés ; - les polymères et copolymères des acides polycarboxyliques tels que les acides fumariques, maléiques, maliques, succiniques, citriques, leurs sels, esters, amides, anhydrides, nitriles ; les polymères et copolymères de polyéthylimine, et ses dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyle sulfonate et le polyvinyle phosphonate, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyalcool vinylique, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyles pyridines, leurs sels, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyle pyrrolidone, et leurs dérivés.
Selon un mode d'exécution préféré de l'invention, les microparticules sont constituées de :
- N-acryloyltris (hydroxyméthyl)méthylaminé, également dénommé Trisacryl, et de méthylène- bisacrylamide (MBA) ,
- De Trisacryl, MBA et DEAE,
- De Sodium acrylate, MBA et DEAE,
- De Methacrylamide, MBA et DEAE,
- De Polyvinyl alcool (PVA) . Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont permis de mettre en évidence les propriétés d ' échogénicité particulièrement intéressantes des microparticules citées ci-dessus.
L'invention a également pour objet une composition pour l'exploration ultrasonore comprenant les microparticules selon l'invention mélangées à du sérum physiologique comme solvant afin d'obtenir une solution injectable.
Le milieu suspendant utilisé pour les expériences in vitro pourra par exemple consister en un mélange d'eau stérile et de glycérol . Par ailleurs, les microparticules sont présentes dans la composition pour une concentration comprise entre 0,25 gramme par litre (g.l"1) et 32 grammes par litre (g.l-1).
L'invention a donc aussi pour objet, l'utilisation des microparticules citées ci-dessus pour la préparation d'une composition pour l'exploration ultrasonore dans laquelle lesdites microparticules constituent l'agent de contraste.
Les agents de contraste selon l'invention et les compositions les contenant sont utiles pour l'exploration ultrasonore du corps humain ou animal et plus particulièrement dans le cadre de l'étude de la vascularisation.
Ainsi, l'invention s'intéresse également à un procédé d' investigation des vaisseaux sanguins et de certains organes ou parties d'un corps humain ou animal, tels que le cœur, par échographie standard, consistant en les étapes suivantes : administration au sujet/patient d'une dose de 0,25 à 32 grammes de microparticules par voie sanguine, émission d'ondes ultrasonores au niveau de la région investiguée, réception des retours d'ondes ultrasonores provenant des microparticules énoncées précédemment, calcul de réhaussement ultrasonore produit par les microparticules à l'aide d'un logiciel adéquat sur les images écho-Doppler enregistrées.
De la même manière, dans le cas des microparticules présentant une taille variant entre 30 μm et 2000 μm, l'invention concerne également un procédé d'investigation de 1 ' embolisation de vaisseaux sanguins, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : administration par voie sanguine au sujet/patient d'une dose de 0.1 à 20 ml des susdites microparticules, émission d'ondes ultrasonores au niveau de la région investiguée, réception des retours d'ondes ultrasonores provenant des microparticules énoncées précédemment, calcul de réhaussement ultrasonore produit par les microparticules à l'aide d'un logiciel adéquat sur les images écho-Doppler enregistrées.
L'invention se rapporte également à un procédé de fabrication des microparticules définies précédemment, et plus spécifiquement les microparticules présentant une taille variant entre 0.1 et 10 μm, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - réalisation d'une mini-émulsion inverse de monomères identiques ou différents, ou polymères identiques ou différents dans une phase organique comportant un tensioactif, grâce à un moyen apte à créer un très fort cisaillement ou une très forte agitation ou grâce à 1 ' émulsification par membrane, copolymérisation ou réticulation de la susdite émulsion agitée pour obtenir les microparticules de polymères ou copolymères tels que définis précédemment, - récupération des microparticules par centrifugation et redispersion dans des milieux aqueux ou organiques .
L'étape de réticulation des chaînes de polymères consistera à réaliser grâce à un réactif lesdites microparticules, le ou lesdits polymère (s) étant choisi (s) parmi la liste suivante : les polymères ou copolymères acrylates et méthacrylates, et leurs dérivés, sels, esters, amides, anhydrides, nitriles, comme par exemple, le DEAE acrylamide, 1 ' acrylamide , l'acide acrylique, l'acrylate de sodium, 1 ' hydroxyéthyl acrylate ou méthacrylate ; les polymères et copolymères vinyliques et leurs dérivés, comme par exemple acétate de vinyle, la vinyle pyridine, les vinyles sulfonates ou phosphates, vinyle pyrrolidone ; les polymères et copolymères d'éthylène glycol et ses dérivés ; les polymères et copolymères de sulfonate de styrène ou phosphonate de styrène et leurs dérivés ; les polymères et copolymères des acides polycarboxyliques tels que les acides fumariques, maléiques, maliques, succiniques, citriques, leurs sels, esters, amides, anhydrides, nitriles ; les polymères et copolymères de polyéthylène glycol ou le polyoxyéthylène, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyéthylimine, et ses dérivés ; les polymères et copolymères de polystyrène sulfonate et le polystyrène phosphonate, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyle sulfonate et le polyvinyle phosphonate, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyalcool vinylique, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyles pyridines, leurs sels, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyle pyrrolidone, et leurs dérivés. De la même manière, le réactif permettant la réticulation du ou des susdit (s) polymère (s) appartiendra à la liste suivante : composés dialdéhydes, comme par exemple la glutaraldéhyde pour réticuler des chaînes de PVA, et leurs dérivés..., c o mp o s é s d é r i v é s d i - p o l y ac ides /amines /alcool s permettant une réact ion d' estérif ication avec une fonction complémentaire se trouvant sur la chaîne du polymère, composés dérivés di-poly isocyanates utilisés par exemple dans la réticulation des chaînes de polyéthylène glycol .
Selon une possibilité offerte par l'invention, le réactif permettant la réticulation du ou des susdit (s) polymère (s) pourra consister en un réactif (ou agent de couplage) permettant la réticulation en faisant réagir deux fonctions se trouvant sur deux chaînes de polymère différentes, comme par exemple la réticulation entre deux chaînes peptidiques ou proteiniques, soit la réticulation de chaînes de sérum albumine humaine en utilisant de l'EDC
(1- [3- (Diméthylamino)propyl] -3-éthylcarbodiimide hydrochloride) .
Le procédé de fabrication pourra également consister en une copolymérisation d'agents monomères et d'agents monomères réticulant.
Dans ce cas, les monomères pourront consister en un ou plusieurs monomère (s) choisi (s) parmi les familles de composés suivants : monomères acrylates et méthacrylates, et leurs dérivés, sels, esters, amides, anhydrides, nitriles , ...comme par exemple, le DEAE acrylamide,
1' acrylamide, l'acide acrylique, l'acrylate de sodium,
1 ' hydroxyéthyl acrylate ou méthacrylate, monomères vinyliques et leurs dérivés, comme par exemple acétate de vinyle, la vinyle pyridine, les vinyles sulfonates ou phosphates, vinyle pyrrolidone, monomères d'éthylène glycol et leurs dérivés, monomères de sulfonate de styrène ou phosphonate de styrène et leurs dérivés.
L'agent réticulant pourra quant à lui consister en toute substance ayant au moins deux fonctions polymérisables sur la même molécule, comme par exemple du N,N' méthylène-bisacrylamide (MBA), éthylène glycol diméthacrylate (EGDM) ou du divinyl benzène .
D'autre part, les initiateurs de polymérisation, ou agent réticulant, peuvent être choisi parmi la liste ci-dessous :
2, 2'- Azobis (2 -amidino-propane ) dihydrochloride, AIBN (2, 2'- Azobisisobutyronitrile) , 2, 2 ' - Azobis (2-méthyl-N- (2 -hydroxyéthyl) propionamide) , persulfate de potassium, peroxyde ou système redox du type H202 et fer.
Selon une variante du procédé de fabrication des microparticules selon l'invention, le procédé de fabrication des microparticules pourra consister à modifier une chaîne de polymère existante, en y greffant par exemple des fonctions polymérisables, puis en les faisant réagir de manière à obtenir une liaison C-C (carbone-carbone) de couplage entre les chaînes de polymères. À titre d'exemple, il pourra être envisagé de greffer une fonction acrylate sur une chaîne de PVA et de reticuler ces chaînes au moyen d'un système redox à base de fer ou de persulfate.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples ci-après concernant la préparation des microparticules de l'invention et leur utilisation comme agent de contraste dans des méthodes d'exploration ultrasonore. Il sera fait référence dans ces exemples aux dessins en annexe dans lesquels : la figure 1 est un diagramme illustrant
1 ' échogénicité des microparticules selon l'invention, présentant une taille comprise entre 0,1 et 10 μm pour diverses concentrations, en fonction de la fréquence ; la figure 2 est un diagramme illustrant 1 ' échogénicité des microparticules selon l'invention, présentant une taille comprise entre 30 et 2000 μm (« embosphère » marque déposée) pour diverses tailles, en fonction de la fréquence ; la figure 3 est un diagramme illustrant la variation de la puissance renvoyée par les microparticules selon l'invention pour une puissance d'émission à 10 MHz en fonction du temps ; la figure 4 illustre l'influence d'une insonification ultrasonore à 10 kHz de fréquence de répétition pour un même échantillon de microparticules en fonction de deux durées de temps.
Les figures 5 et 6 illustrent la visualisation de la vascularisation au niveau du rein, avant (figure 5) et après (figure 6) injection in vivo des microparticules.
La figure 7 représente la quantification du rehaussement ultrasonore, exprimé en décibels (dB) produit par les microparticules à la dilution 1/32 au niveau du rein à l'intérieur de la région d'intérêt. Exemple 1 ; Fabrication des microparticules selon l' invention.
a . Fabrication de microparticules présentant une taille comprise entre 0.1 et 10 μm
Il existe plusieurs modes opératoires pour réaliser les microparticules sphériques présentant la taille requise, soit une taille comprise entre 0,1 et 10 micromètres (μm) . Ainsi, la taille des microparticules dépend de plusieurs paramètres dont les principaux sont la vitesse d'agitation, la concentration de tensioactif et le rapport de viscosité entre les deux milieux qui sont la phase monomère
(phase aqueuse) et la phase continue (phase organique) .
Nous allons décrire dans la suite un exemple de fabrication de microparticules selon l'invention grâce à une polymérisation en mini-émulsion qui se caractérise par des vitesses d'agitation très élevées, et une concentration de tensioactif supérieure à la polymérisation en suspension pour former une pré- émulsion. La polymérisation s'effectue donc ensuite sur cette pré-émulsion.
On introduit un litre d'heptane et 4 millilitres de Sorbitan trioleate dans un réacteur de deux litres. Cette solution est portée à la température de 40°C (Celsius) sous très forte agitation et une solution aqueuse de 125 grammes (g) de trisacryl, 29 g de Méthylène Bis-acrylamide et 2,51 g de 2, 2 ' -Azobis (2- amidino-propane) dihydrochloride (ou V-50) est introduite. Après quinze minutes, l'agitation est arrêtée et cette émulsion est portée à la température de 80 °C pendant quatre heures. La dispersion résultante est lavée à 1 ' hexane et séchée. Les microparticules sont ensuite re-dispersées dans une solution saline.
Le même mode opératoire a été utilisé pour synthétiser des micro-particules à base de méthacrylamide et de DEAE acrylamide .
b . Fabrication de microparticules présentant une taille comprise entre 30 et 2000 μm
Pour fabriquer des microparticules présentant une taille comprise 30 micromètres (μm) et 2000 μms pour leur utilisation dans la visualisation de l'embolie vasculaire par échographie, nous présentons ci-après deux modes opératoires ; l'un pour réaliser des microparticules à base de trisacryl avec gélatine porcine et l'autre pour réaliser des microparticules à base de sodium acrylate .
Pour les microparticules à base de trisacryl avec gélatine porcine (« Embosphere » marque déposée), on utilise un bêcher de 10 litres, on verse 4 litres d'huile de paraffine, 4 ml de Sorbitan trioleate et on chauffe au bain marie entre 54°C et 60°C (Celsius) .
Dans un bêcher de 1 litre, on pèse 87 g de chlorure de sodium et 40.8 g d'acétate de sodium. On les met en solution dans 300 ml d'eau déminéralisée. On ajoute ensuite 400 ml de Glycérine et les différents monomères le Trisacryl (90 grammes) , le DEAE Acrylamide (35 grammes) et du Méthylène Bis Acrylamide (10 grammes) . D'autre part, la gélatine est mise en suspension dans 120 ml d'eau ultra pure et chauffée à 60°C.
Lorsque les monomères sont dissous, on ajoute la solution de gélatine et 1,4 g de persulfate d'ammonium, préalablement dissout dans 20 ml d'eau ultra pure. La phase monomère est ensuite coulée dans la phase huileuse à 60°C sous agitation. On verse ensuite 4 ml de N, N, N', N' tétraéthylméthanediamine (TEMED) dans l'émulsion.
Les microparticules sont ensuite récupérées par décantation et lavées soigneusement. Ces microparticules sont alors traitées avec de la glutaraldéhyde et lavées plusieurs fois à 60 et 90 °C. Puis on les tamise et stérilise à la vapeur en milieu tamponné.
Pour les microparticules à base de sodium acrylate, on utilise également un bêcher de 10 litres. L'opérateur verse 4 litres d'huile de paraffine, 4 ml de Sorbitan trioleate et on chauffe au bain marie à une température comprise entre 54°C et 60°C.
Dans un bêcher de 1 litre, on pèse 87 g de chlorure de sodium et 40.8 g d'acétate de sodium. On les met en solution dans 300 ml d'eau déminéralisée. On ajoute ensuite 400 ml de Glycérine. On ajoute du sodium acrylate (104 g) et du Méthylène Bis Acrylamide (27.5 g) .
Lorsque les monomères sont dissous, on ajoute la solution de gélatine et 1,4 g de persulfate d'ammonium, préalablement dissout dans 20 ml d'eau ultra pure. La phase monomère est ensuite coulée dans la phase huileuse à 60°C sous agitation. On verse ensuite 4 ml de TEMED dans l'émulsion. Les microparticules sont ensuite récupérées par décantation et lavées soigneusement. Puis on les tamise et stérilise à la vapeur en milieu tamponné.
Exemple 2) Résultat et études in vi tro relatives aux propriétés échogènes des microparticules selon 1 ' invention
a . Echogénicité des microparticules présentant une taille comprise entre 0.1 et 10 μm.
Comme cela est visible sur la figure 1, huit dilutions de microparticules ont été étudiées, soit 1/512, 1/256, 1/128, 1/64, 1/32, 1/16, 1/8 et 1/4; ces dilutions étant calculées par rapport à une concentration initiale fixée à 5 grammes de microparticules selon l'invention dans 40 millilitres de milieu suspendant.
Le graphe de la figure 1 représente les différentes courbes pour chacune des susdites concentrations en fonction de la fréquence. Ainsi, comme on peut le remarquer sur cette figure: - la puissance rétrodiffusée augmente avec la concentration la puissance rétrodiffusée par les particules est supérieure à 10 dB dés la dilution 1/512 et augmente jusqu'à atteindre 25 dB pour la plus grande concentration à 52 μJ.
Les particules, dont la taille est comprise entre 0,1 et 10 μm, ont ainsi de fortes propriétés d' échogénicité . b . Echogénicité des microparticules présentant une taille comprise entre 30 et 2000 μm (« embosphere » marque déposée) .
La figure 2 présente les spectres représentatifs de la puissance rétrodiffusée des particules embosphere à la puissance 52μJ. 4 gammes de tailles ont été étudiées : de 300 à 500 μm, de 500 à 700 μm, de 700 à 900 μm et de 900 μm à 1200 μm.
Influence de 1 ' insonification ultrasonore sur l'intégrité des microparticules ;
Il a ensuite été testé les propriétés des microparticules « PRIIIO » (composées de Trisacryl et de MBA) vis-à-vis du phénomène d' insonification. Pour ce faire, il a été utilisé la dilution l/8ème.
Durant ce protocole, les microparticules présentes dans la suspension ont été insonifiées avec une onde de 10 MHz avec une fréquence de répétition de 1 kHz. Les mesures de rétrodiffusion ont été relevées à différents intervalles de temps. Les résultats de ces mesures sont présentés sur la figure 3.
Il a été observé que la rétrodiffusion ultrasonore ne varie pas de manière significative dans le temps lorsque les microparticules de l'invention sont soumises à un champ ultrasonore et ce de manière prolongée. En conséquence, il apparaît que les microparticules n'ont pas été altérées ou détruites sous l'effet d'une insonification d'énergie donnée et prolongée . Compte tenu des résultats précédents, il a été décidé de poursuivre l'étude pour une énergie ultrasonore émise plus élevée. L'amplitude de l'onde émise ayant été réglée sur l'émetteur à son niveau maximal, la fréquence de répétition de l'onde à 10 kHz a été augmentée. De cette sorte, la puissance ultrasonore transmise aux particules est globalement plus importante pour un intervalle de temps équivalent.
Comme cela est visible sur la figure 4, il apparaît que le niveau maximal disponible de puissance émise n'est pas suffisant pour détruire, même partiellement, les microparticules. En effet, la puissance recueillie 90 minutes après le début du protocole est identique à celle relevée seulement 1,45 minute après le début de 1 ' insonification.
Enfin, il a été choisi de tester l'influence du taux de cisaillement sur la résistance des microparticules. Ainsi, dans ce test, l'onde n'a été émise qu'au moment d'effectuer la mesure ; deux mesures ayant été relevées, à 1,45 minute et 90 minutes après le déclenchement de la circulation de la suspension.
Comme pour l ' influence d' une insonif ication ult rasonore prolongée , nous n ' observons aucune vari at ion s igni f i cat ive de l a rét rodi f f us i on ultrasonore des microparticules lorsque celles-ci sont soumi ses à un champ de c isai llement constant et durable . Ains i , i l peut être conclu que les microparticules sont non seulement résistantes à l ' onde ultrasonore employée mai s également à un champ mécanique de cisaillement . Des tests de stabilité ont été réalisés in vitro sur les microparticules de l'invention. Ces microparticules ont été soumises à un champ de cisaillement et à un champ ultrasonore tous deux appliqués de façon prolongée, 1 ' échogénicité des microparticules est demeurée constante pendant toute la durée de l'expérience c'est-à-dire deux heures. A l'inverse, le Levovist est beaucoup moins stable : le pic de rehaussement se produit quasi instantanément après l'injection du produit pour ensuite diminuer progressivement jusqu'à complète disparition lO n après l'injection. Ce dernier point est un facteur limitant lors d'un examen échographique.
Ces tests et études ont permis de mettre en évidence le caractère échogène des microparticules selon l'invention. Par ailleurs, ces microparticules apparaissent résistantes à la fois à un champ ultrasonore et à un champ de cisaillement appliqués de manière prolongée .
Exemple 3 ; Quantification du réhaussement ultrasonore des particules, dont la taille est comprise 0,1 et 10 μm, à différentes dilutions in vivo chez des souris nude.
- Déroulement des injections in vivo:
• Milieu de suspension utilisé in vivo Le milieu suspendant utilisé était composé de 100% eau stérile + 9°/O0NaCl
• Appareil utilisé Les explorations sur animal ont été réalisées avec un échographe ATL HDI5000. Cet appareil est relié à un logiciel de recherche (HDILab) pour la quantification a posteriori du réhaussement ultrasonore dans une région d'intérêt sélectionnée.
• Conditions
Les souris utilisées étaient des nudes
(immuno-dépressives imberbes), facilitant dans un premier temps les essais echographiques. La plupart des souris ne comportaient pas de tumeur sauf quand précisé
(cf. tableau) et le réhaussement a été observé principalement au niveau des reins et de la rate.
Les injections ont été réalisées aux dilutions suivantes :
- Dilution 1/64 l,95mg CCII03-14 /tti
- Dilution 1/32 3,9mg CCII03-14 /mL
- Dilution 1/16 7,8125mg CCII03-14 /mL Chaque injection correspondait à 0,1 mL soit 0,195 mg, 0,39 mg et 0,78125 mg pour les dilutions 1/64, 1/32 et 1/16 respectivement.
Les seringues avaient systématiquement un diamètre de 30 μm.
Le tableau suivant récapitule les conditions d'injections et de sacrifices :
Tableau 1
Tableau 2 : Le tableau représente la détection des vaisseaux avant et après injection in vivo des microparticules chez des souris nude. Les vaisseaux ont été dénombrés par analyse des images écho-Doppler enregistrées.
- Résultats
Les résultats ont été exprimés de deux manières
1- en calculant le rehaussement ultrasonore produit par les microparticules à l'intérieur d'une région d'intérêt :
Pour chaque souris, le rein a été choisi comme région d'intérêt (ROI) (représentée en pointillés sur les figures 5 et 6) . Les contours de la ROI ont été dessinés sur chacune des séquences echographiques à l'aide du logiciel HDILab. L' échogénicité a donc été quantifiée avant et après injection à l'intérieur de la ROI . La figure 7 présente un exemple de réhaussements obtenus au niveau d'une tumeur xenogreffées sur deux souris à la dilution 1/32.
2- en dénombrant les vaisseaux à l'intérieur du rein : Une meilleure détection de la vascularisation après injection des microparticules a été constatée dans quasiment tous les cas. Les figures 5 et 6 montrent un exemple d'images écho-Doppler enregistrées avant et après injection des microparticules. La détection des vaisseaux est nettement améliorée après injection. À partir de ces images, il a été possible de dénombrer les vaisseaux détectés avant et après injection. Le second tableau résume les résultats obtenus, pour deux dilutions d'étude : 1/64 et 1/32. Le nombre moyen de vaisseaux supplémentaires détectés après injection des particules est en moyenne de 2 ou 3 vaisseaux.
Exemple 4 ; Utilisation ou mise en œuyre des microparticules
Lorsqu'un patient nécessite un examen échographique-Doppler classique, la procédure est la suivante : la sonde est placée en contact avec la peau du patient à l'endroit où doit être effectué l'examen. Un gel échographique est préalablement étalé sur la surface de la sonde afin d'assurer une bonne transmission du faisceau ultrasonore entre la sonde et les tissus, la profondeur de mesure ainsi que le gain bidimensionnel de l'échographe sont respectivement réglés suivant la profondeur où se situe l'organe d'intérêt et le contraste de l'image obtenue, lorsque l'organe d'intérêt est repéré sur l'image, l'examinateur procède à la mesure des dimensions de l'organe sur image arrêtée. Généralement un cliché photographique est imprimé et l'image est stockée numériquement, si une visualisation des vaisseaux est nécessaire, le mode Doppler couleur est activé. Apparaît alors un secteur sur l'image qui est correctement positionné par l'opérateur afin de le superposer au niveau des vaisseaux d'intérêt, la vitesse maximale mesurable est réglée par l'opérateur de sorte à ne pas générer des erreurs de mesure (« aliasing ») . l'opérateur enclenche le Doppler puisé afin d'obtenir le mode triplex. Cela permet de définir un volume de mesure précis dans l'écoulement et obtenir le spectre de vitesse au cours du temps pour mesurer les vitesses circulatoires .
À titre d'exemple, 1 ' échographie permet une analyse descriptive de la morphologie et de la structure de la thyroïde. Elle permet d'apprécier : * les dimensions de chaque lobe (hauteur, épaisseur et largeur) ;
* ses contours ;
* d'éventuels nodules et d'étudier leurs caractéristiques (échostructure, échogénicité) ; * les aires ganglionnaires : taille, aspect et situation d'éventuelles adénopathies ;
* les éventuelles compressions et déformations des organes de voisinage ; et éventuellement, elle permet : * d'étudier la vascularisation thyroïdienne ;
* de guider la cytoponction d'un nodule thyroïdien non ou mal palpable . Pour ce type d'investigation, une sonde de haute fréquence (7,5 MHz ou plus) est indispensable pour obtenir une haute résolution spatiale (barrette linéaire). L'appareil doit avoir régulièrement une mise à jour technique et un contrôle de qualité. Une sonde linéaire de grande taille, ou une sonde sectorielle permettant l'étude des goitres plongeants et la mesure de la hauteur des lobes d'un goitre.
On administre au patient par voie sanguine les microparticules préférentiellement directement là où 1 ' échographie doit être réalisée. La dose administrée est variable en fonction du patient. Pour un petit animal tel qu'une souris, on administrera par exemple 0,2 millilitre d'une émulsion présentant une concentration de 0,08 grammes de microparticules selon l'invention dans 40 millilitres de milieu suspendant, soit une concentration de 2 grammes de microparticules par litre de solvant. Le solvant sera par exemple constitué de sérum physiologique, ne contenant, bien entendu, aucun élément rétrodiffusant .

Claims

REVENDICATIONS
1. Microparticules échogènes pour l'exploration ultrasonore et/ou leur détection ultrasonore, caractérisées en ce qu'elles présentent une taille comprise entre 0,1 μm (micromètre) et 2000 μm et sont constituées d'un réseau macromoléculaire de polymères et/ou de copolymères hydrophiles.
2. Microparticules selon la revendication 1, caractérisées en ce que lesdits polymères et copolymères hydrophiles comprennent des fonctions alcools, aminés ou acides .
3. Microparticules selon l'une des revendications 1 ou 2 , caractérisées en ce que les polymères et les copolymères sont choisis parmi l'un au moins des groupes comprenant : les polymères ou copolymères acrylates et méthacrylates , et leurs dérivés, sels, esters, amides, anhydrides, nitriles, comme par exemple, le DEAE acrylamide, l' acrylamide, l'acide acrylique, l' acrylate de sodium, 1 ' ydroxyéthyl acrylate ou méthacrylate ; les polymères et copolymères vinyliques et leurs dérivés, comme par exemple acétate de vinyle, la vinyle pyridine, les vinyles sulfonates ou phosphates, vinyle pyrrolidone ; les polymères et copolymères d'éthylène glycol et ses dérivés ; - les polymères et copolymères de sulfonate de styrène ou phosphonate de styrène et leurs dérivés ; les polymères et copolymères des acides polycarboxyliques tels que les acides fumariques, maléiques, maliques, succiniques, citriques, leurs sels, esters, amides, anhydrides, nitriles ; les polymères et copolymères de polyéthylimine, et ses dérivés ; - les polymères et copolymères de polyvinyle sulfonate et le polyvinyle phosphonate, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyalcool vinylique, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyles pyridines, leurs sels, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyle pyrro1idone, et leurs dérivés.
4. Microparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de N-acryloyl-tris (hydroxyméthyl)méthylamine, également dénommé Trisacryl, et de méthylêne-bisacrylamide
(MBA) .
5. Microparticules selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles présentent un diamètre variant entre 0,1 micromètre (μm) et 10 micromètres (μm) , de préférence compris entre 1 μm et 7 μm.
6. Microparticules selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles présentent un diamètre compris entre 30 micromètres (μm) et 2000 micromètres (μm) .
7. Composition pour l'exploration ultrasonique comprenant les microparticules selon l'une des revendications 1 à 6 et un milieu suspendant.
8. Composition selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu suspendant consiste en un mélange d'eau stérile et de glycerol ou de sérum physiologique.
9. Composition selon la revendication 8, caractérisé en ce que les microparticules sont présentes dans ladite composition à une concentration comprise entre 0,25 gramme par litre (g.l-1) et 32 grammes par litre
(g.l"1) .
10. Procédé d'investigation des vaisseaux sanguins et de certains organes ou parties d'un corps humain ou animal, tels que le cœur, par échographie standard et/ou échographie Doppler, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : administration, par voie sanguine, au sujet/patient d'une dose d'une composition selon l'une des revendications 7 à 9, comprenant des microparticules selon la revendication 5, émission d'ondes ultrasonores au niveau de la région investiguée, réception des retours d'ondes ultrasonores provenant des microparticules énoncées précédemment,
- calcul de réhaussement ultrasonore produit par les microparticules à l'aide d'un logiciel adéquat sur les images écho-Doppler enregistrées.
11. Procédé d'investigation de l' embolisation de vaisseaux sanguins, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : administration par voie sanguine au sujet/patient d'une dose d'une composition selon l'une des revendications 7 à 8 comprenant des microparticules selon la revendication 6, émission d'ondes ultrasonores au niveau de la région investiguée, - réception des retours d'ondes ultrasonores provenant des microparticules énoncées précédemment,
- calcul de réhaussement ultrasonore produit par les microparticules à l'aide d'un logiciel adéquat sur les images écho-Doppler enregistrées.
12. Utilisation de microparticules selon la revendication 5 pour la préparation d'un agent de contraste pour l'exploration ultrasonique.
13. Utilisation de moyens ultrasonores pour la détection d'emboles, constitués des microparticules selon la revendication 6, utilisé pour le traitement des cancers .
14. Procédé de fabrication des microparticules selon les revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : réalisation d'une mini-émulsion inverse de monomères identiques ou différents, ou polymères identiques ou différents dans une phase organique comportant un tensioactif, grâce à un moyen apte à créer un très fort cisaillement ou une très forte agitation ou grâce à l' émulsification par membrane, copolymérisation ou réticulation de la susdite émulsion agitée pour obtenir les microparticules de polymères ou copolymères selon l'une des revendications
1 à 5, récupération des microparticules par centrifugation et redispersion dans des milieux aqueux ou organiques .
15. Procédé de fabrication de microparticules selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation est réalisée grâce à un réactif, le ou lesdits polymère (s) étant choisi (s) parmi la liste suivante : - les polymères ou copolymères acrylates et méthacrylates, et leurs dérivés, sels, esters, amides, anhydrides, nitriles, comme par exemple, le DEAE acrylamide, l' acrylamide, l'acide acrylique, l' acrylate de sodium, 1 ' hydroxyéthyl acrylate ou méthacrylate ; - les polymères et copolymères vinyliques et leurs dérivés, comme par exemple acétate de vinyle, la vinyle pyridine, les vinyles sulfonates ou phosphates, vinyle pyrrolidone ; les polymères et copolymères d'éthylène glycol et ses dérivés ; les polymères et copolymères de sulfonate de styrène ou phosphonate de styrène et leurs dérivés ; les polymères et copolymères des acides polycarboxyliques tels que les acides fumariques, maléiques, maliques, succiniques, citriques, leurs sels, esters, amides, anhydrides, nitriles ;
- les polymères et copolymères de polyéthylène glycol ou le polyoxyéthylène, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyéthylimine, et ses dérivés ; les polymères et copolymères de polystyrène sulfonate et le polystyrène phosphonate, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyle sulfonate et le polyvinyle phosphonate, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyalcool vinylique, et leurs dérivés ; - les polymères et copolymères de polyvinyles pyridines, leurs sels, et leurs dérivés ; les polymères et copolymères de polyvinyle pyrrolidone, et leurs dérivés.
16. Procédé de fabrication de microparticules selon la revendication 15, caractérisé en ce que le réactif, permettant la polymérisation du susdit ou des susdit polymère, appartient à la liste de composés suivants : - composés dialdéhydes, comme par exemple la glutaraldehyde pour reticuler par exemple du PVA, et leurs dérivés..., composés dérivés di-poly acides/amines/ alcools permettant une réaction d' estérification avec une fonction complémentaire se trouvant sur la chaîne du polymère, composés dérivés di-poly isocyanates utiliser par exemple dans la réticulation des chaînes de polyéthylène glycol .
17. Procédé de fabrication de microparticules selon la revendication 16 , caractérisé en ce que le susdit réactif consiste en un réactif permettant la réticulation en faisant réagir deux fonctions se trouvant sur deux chaînes de polymère différentes , comme par exemple la rét i culat ion entre deux chaînes pept idiques ou proteiniques , soit la réticulation de chaînes de sérum albumine humaine en ut i l i sant de 1 ' EDC ( l - [ 3 -
(Diméthylamino) propyl] -3 -éthylcarbodiimide hydrochloride) .
18. Procédé de fabrication des microparticules selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il consiste en une copolymérisation d'agent monomères et d'agents réticulant.
19. Procédé de fabrication des microparticules selon la revendication 18, caractérisé en ce que les monomères consistent en un ou plusieurs monomère (s) choisi (s) parmi les familles de composés suivants : monomères acrylates et méthacrylates , et leurs dérivés, sels, esters, amides, anhydrides, nitriles, comme par exemple, le DEAE acrylamide, 1 ' acrylamide, l'acide acrylique, l' acrylate de sodium, l' hydroxyéthyl acrylate ou méthacrylate, monomères vinyliques et leurs dérivés, comme par exemple acétate de vinyle, la vinyle pyridine, les vinyles sulfonates ou phosphates, vinyle pyrrolidone, monomères d'éthylène glycol et leurs dérivés, monomères de sulfonate de styrène ou phosphonate de styrène et leurs dérivés .
20. Procédé de fabrication des microparticules selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'agent réticulant consiste en toute substance ayant au moins deux fonctions polymérisables sur la même molécule, comme par exemple du N,N' méthylène-bisacrylamide (MBA) , éthylène glycol diméthacrylate (EGDM) ou du divinyl benzène.
21. Procédé de fabrication des microparticules selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'agent réticulant, ou initiateur de polymérisation, consiste en un agent choisi parmi la liste suivante : - 2, 2'- Azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride, AIBN (2, 2'- Azobisisobutyronitrile) 2, 2'- Azobis (2- méthyl-N- (2-hydroxyéthyl) propionamide) , persulfate de potassium, peroxyde ou système redox du type H202 et fer.
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