EP1532272A2 - Immunmarker zur diagnostik und therapie im zusammenhang mit transplantat-reaktionen - Google Patents

Immunmarker zur diagnostik und therapie im zusammenhang mit transplantat-reaktionen

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Publication number
EP1532272A2
EP1532272A2 EP03750429A EP03750429A EP1532272A2 EP 1532272 A2 EP1532272 A2 EP 1532272A2 EP 03750429 A EP03750429 A EP 03750429A EP 03750429 A EP03750429 A EP 03750429A EP 1532272 A2 EP1532272 A2 EP 1532272A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
rejection
nucleotide sequence
tolerance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03750429A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Birgit Sawitzki
Hans-Dieter Volk
Kathryn Wood
Manfred Lehmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SAWITZKI, BIRGIT
Volk Hans-Dieter
Original Assignee
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Charite Universitaetsmedizin Berlin filed Critical Charite Universitaetsmedizin Berlin
Publication of EP1532272A2 publication Critical patent/EP1532272A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to nucleic acid molecules as immune markers for the detection of graft reactions, a method for the detection of graft reactions and the use of immune markers for medical prophylaxis, clinical follow-up, graft aftertreatment, clinical diagnostics and / or therapy in connection with cell and tissue - Or organ transplants, where graft reactions can be a tolerance, a rejection crisis or rejection.
  • the donor organ matches the recipient tissue as closely as possible. This correspondence is ensured by the HLA system, among other things
  • HLA molecules Due to the extreme genetic polymorphism, there is an extraordinarily large number of different HLA molecules. A complete agreement is only observed in identical twins, otherwise HLA molecules are unique for every human being.
  • transplantation is the treatment of choice for irreversible organ failure.
  • the immunoregulatory proteins can either be antibodies that cause depletion of the donor-reactive T cells, e.g. anti-CD3 immunotoxin, or antibodies and proteins that affect the activation of donor-reactive T cells, e.g. anti-CD4 antibody, anti-CD40L antibody or CTLA4-lg.
  • Chimerism means the parallel presence of donor and recipient blood leukocytes using non-myeloablative procedures for donor stem cell transplantation. i So far there has been a permanent one after the transplant
  • kidney transplant Case of a kidney transplant.
  • biopsies are taken and histologically according to the “Bänff Score w assessed. It can be used to assess whether changes associated with acute rejection - infiltration of mononuclear cells - or chronic rejection (vasculopathy) can be detected.
  • a disadvantage of the previous methods is that no decisions about. safe withdrawal of immunosuppressive therapy can be taken without risking the occurrence of rejection crises.
  • Another disadvantage is that the known methods do not allow during or " after treatment, too to allow prediction of rejection crises after conventional therapies before a graft function deterioration occurs.
  • the diagnostic tools and methods available so far can only be used to a limited extent to assess tolerance-inducing therapy.
  • the assessment of the therapy with regard to the function of the transplant - for example of serum creatinine - comes too late, since a detectable increase in serum creatinine has already caused damage to the transplanted organ, for example the kidney.
  • tolerance-inducing therapies a significant increase in serum creatinine means that the therapy has failed and that the patient will probably switch to conventional immunosuppressants with the known side effects.
  • the therapy ⁇ vary before a detectable damage to the graft - for example, increases in serum creatinine - present.
  • deterioration in organ function can also be caused by side effects of high-dose immunosuppressive therapy or by infections in the graft, which cannot be detected by known methods either.
  • the object of the invention is therefore to provide efficient and reliable immune markers which enable reliable and rapid predictability of the risk of graft rejection or the absence thereof - as a form of tolerance - in medical prophylaxis, clinical follow-up or graft follow-up treatment.
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 1 -
  • nucleiic acid molecule which hybridizes with a nucleotide sequence according to a) under stringent conditions
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence which has sufficient homology to be functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) or b),
  • nucleic acid molecule according to a nucleotide sequence according to a) - d), which is modified by deletions, additions, substitutions, translocations, inversions and / or insertions and is functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) to d).
  • nucleic acid molecules according to the invention are associated with inflammation, in particular chronic inflammation, autoimmune diseases, lesions, general wounds and graft reactions, in particular with graft rejection or other graft dysfunction and the absence of this - as a form of graft tolerance.
  • the nucleic acid molecule which has sufficient homology to be functionally analogous to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 1-8 or its complementary nucleotide sequences is at least 40% homologous.
  • the homologs show a behavior in transplant reactions which allows conclusions to be drawn about the Transplant and ' its relationship to the recipient organism.
  • the nucleic acid molecule has at least 60%, preferably 70%, preferably 80%, very particularly preferably 90% homology to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 1-8 or its complementary nucleotide , wherein this nucleic acid molecule has a biological activity like the sequences shown under SEQ ID No. 1-8 or their complementary sequences.
  • the nucleic acid molecule is a genomic DNA, a cDNA and / or an RNA.
  • the nucleic acid molecule is particularly preferably an mRNA.
  • the invention also relates to a vector which comprises a nucleic acid molecule according to the invention. Furthermore, the invention also relates to a host cell which comprises the vector in the vector according to the invention. The invention also relates to a polypeptide which is encoded by a nucleic acid molecule according to the invention.
  • the invention also relates to a recognition molecule which is directed against the nucleic acid molecule, the vector, the host cell and / or the polypeptide.
  • Detection substances in the sense of the invention are molecules which can interact with the structures mentioned such as nucleic acid molecules or sequences, vectors, host cells and / or polypeptides or their fragments; interact in particular so that a detection of these structures is possible.
  • the recognition substances can in particular be specific nucleic acids that bind with the nucleic acid molecules mentioned, but also labeled antibodies, fluorescent markers. Carbohydrates or lipids, antisense constructs, cDNA or mRNA molecules or their fragments. It is of course also possible that the recognition substances are not proteins or nucleic acids or antibodies, but rather antibodies directed against them. In such a case, the recognition substances can in particular be secondary antibodies.
  • the recognition molecules are an antibody, an antibody fragment and / or an antisense construct, in particular an RNA interference molecule.
  • the autoantibodies in the sense of the invention specifically bind the polypeptides according to the invention.
  • the antibodies can also be modified antibodies (eg oligomeric, reduced, oxidized and labeled antibodies).
  • the term antibody used in the present description includes both intact molecules and autoantibody fragments, such as Fab, F (ab ') 2 and Fv, which can bind certain epitope determinants of the polypeptides. In these fragments, the ability of the antibody to selective binding of its antigen or receptor has been partially preserved, the fragments being defined as follows:
  • Fab the fragment containing a monovalent antigen-binding fragment of an antibody molecule, can be produced by cleaving an entire antibody with the enzyme papain, an intact light
  • Chain and part of a heavy chain can be obtained; .
  • the Fab 'fragment of an antibody molecule can be obtained by treating an entire antibody with pepsin and then reducing it, with an intact light chain and part of the heavy chain be preserved; per antibody molecule there are two
  • F (ab ') 2 the fragment of the antibody which can be obtained by treating an entire antibody with the enzyme pepsin without subsequent reduction;
  • F (ab ') 2 is a dimer of two Fab' fragments held together by two disulfide bonds;
  • Fv defined as a genetically modified fragment that contains the variable region of the light chain and the variable region of the heavy chain
  • SCA Single chain antibody
  • Polypeptide linkers are linked to a genetically fused single chain molecule.
  • epitope used in the present invention means any antigenic determinant on the polypeptide.
  • Epitope determinants usually consist of chemically active surface groupings of molecules such as amino acids f or sugar side chains, and usually have both specific features of the three-dimensional structure and specific charge features.
  • the invention also relates to vaccines containing the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the Polypeptide and / or the recognition molecule optionally with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is a pharmaceutical auxiliary and / or additive known per se. These additives and carriers, which are known per se to the person skilled in the art, can also be liposomes or structures or solutions and / or buffer mixtures known in genetic engineering or other substances from the field of galenics.
  • the invention also relates to a method for the detection of transplant reactions in a sample from a patient, wherein in the sample a level of at least one nucleic acid molecule selected from the group comprising:
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 1-8 or their complementary nucleotide sequences,
  • nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleotide sequence according to a) under stringent conditions
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence which has sufficient homology to be functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) or b),
  • nucleic acid molecule which, as a result of the genetic code, has degenerated into a nucleotide sequence according to a) - c) and e) a nucleic acid molecule according to a nucleotide sequence according to a) - d), which is modified by deletions, additions, substitutions, translocations, inversions and / or insertions and is functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) to d)
  • the level is compared with a control level of a comparison sample from a healthy patient, whereby the graft reactions - which also includes the absence of the same as tolerance - are detected by a modified level in the sample compared to the control level.
  • a graft reaction within the meaning of the invention is understood to mean any physiological and pathophysiological interaction of the transplant with the recipient organism, but also any isolated reaction within the graft.
  • the graft reaction can therefore be a tolerance or a rejection of the graft.
  • a graft reaction in the sense of the invention is also a non-pathological, i.e. a normal or healthy condition in which the graft itself can be in relation to the recipient organism.
  • Invention is the designation for a biological good or a part or a small amount of one taken by sampling i, the nature of which is to be tested chemically, biologically, clinically or similarly. Sampling from the patient or from humoral or cellular components of the
  • Patients are " in particular - such that the removed Subset corresponds to an average of the total amount.
  • the characteristics determined by examining the sample are used to assess the amount recorded by the sample, which allows conclusions to be drawn about the total amount, for example an entire transplanted organ, such as the liver, spleen, blood or also of non-transplanted components, such as the immune system.
  • the samples can be pretreated by mixing, dividing, crushing, adding enzymes or markers or otherwise.
  • Various possibilities for pretreating the samples are known to the person skilled in the art. Of course, it can also be provided that the sample is taken in such a way that it does not correspond to an average of the total amount.
  • a sample can be all biological and non-biological materials, such as biological tissues and fluids such as blood, lymph, urine, cerebral fluid and others.
  • a transplant in the sense of the invention is an organ, tissue or a cell or a cell collection that is transplanted or to be transplanted.
  • grafts can also be certain implants which consist of substances or parts which are introduced into a body for a limited period or for life in order to fulfill certain replacement functions.
  • the implants can consist, for example, of inorganic matter that is coated with organic substances, such as cartilage or bone cells.
  • Under graft rejection according to the invention is the induction of an immune response of the recipient to the To understand graft, wherein an immune response of the recipient is a specific protective or defense response of the body against the antigens or other structures of the graft.
  • a patient is any organism that comprises a transplant, in particular a human organism.
  • a healthy patient in the sense of the invention is a patient whose condition allows it to be used as a reference for the present method. Healthy in the sense of the invention does not have to mean the complete absence of diseases, transplants or pathogenic changes.
  • the healthy patient represents either a single patient or an average number of patients who can serve as a comparison group such that a change in the level of the nucleic acid molecules mentioned or the structures for which they code or the recognition substances can be determined.
  • a modification of the level compared to the control level means that the nucleic acid molecules or the immune markers mentioned, such as in particular the peptides or the recognition substances, have detectable changes in their concentration or activity as a protein, as a nucleic acid molecule or as antibodies compared to the control level ,
  • the graft is selected from the group consisting of lungs, spleen, heart, liver, pancreas and / or of tissues, in particular islets, aortas, cartilages.
  • the organs or Tissue structures can be transplanted alone or in combination.
  • the level is determined as a DNA, an RNA concentration, a geexpression, a copy number of a nucleic acid, a peptide concentration, a peptide activity and / or as a concentration of isoforms.
  • the person skilled in the art can advantageously choose various possibilities in order to determine the level of at least one nucleic acid molecule.
  • One possibility for example, is to determine the peptide concentration which is encoded by the nucleic acid molecule using spectrographic methods.
  • the level of the same only in the graft or in sections is determined either inside or outside of the body and that it in 'the surrounding tissue or K ⁇ rperenbergkeiten or in biopsy materials or liquids, such ⁇ as urine, lymph or Blood that is detected.
  • the level is determined as an mRNA concentration.
  • the graft reaction is a rejection crisis, a rejection reaction, a rejection course, a tolerance reaction and / or a tolerance course, which is detected by the method according to the invention.
  • the course of rejection and the rejection reaction can be clinical or subclinical, for example.
  • a tolerance in the sense of the invention is, for example, a long-lasting normal function of the transplanted organ without an increase in serum creatinine or proteinuria for more than 100, preferably 200, very particularly preferably 300 days.
  • a reduced level means that.
  • Nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group comprising
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 7 or their complementary nucleotide sequences,
  • nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleotide sequence according to a) under stringent conditions
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence which has sufficient homology to be functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) or b), i d) a nucleic acid molecule which is a result of the genetic
  • Codes to a nucleotide sequence according to a) - c) is degenerate and
  • nucleic acid molecule according to a nucleotide sequence according to a) - d). which is caused by deletions, additions, Substitutions, translocations, inversions and / or
  • a course of rejection can be, for example, the course of a rejection reaction with or without drug administration, whereby these drugs can be immunosuppressive substances, for example.
  • the reduced level of the nucleotide sequences or their complementary nucleotide sequences or nucleic acid molecules which hybridize with these nucleotide sequences under stringent conditions or nucleotide acid molecules which have sufficient homology to be functionally analogous to the nucleotide sequences mentioned can advantageously be used to determine whether the transplant tends to unphysiological or pathological processes themselves or in relation to the recipient organism.
  • an increased level of a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence is selected from the group comprising
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 or their complementary nucleotide sequences, b) a nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleotide sequence according to a) under stringent conditions,
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence which has sufficient homology to be functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) or b),
  • nucleic acid molecule according to a nucleotide sequence according to a) - d), which is modified by deletions, additions, substitutions, translocations, inversions and / or insertions and is functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) to d)
  • the nucleic acid molecules mentioned include in particular the nucleic acid molecules which hybridize under stringent conditions with the nucleic acid molecules mentioned, and also those nucleic acid molecules which have sufficient homology to be functionally analogous to the nucleic acid molecules mentioned and those which degenerate as a result of the genetic code are or modified by deletions, additions, substitutions, translocations, inversions and / or insertions and are functionally related to the nucleotide sequence of the nucleic acid molecules mentioned.
  • an elevated level of a nucleic acid molecule is selected from the group comprising
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8 or their complementary nucleotide sequences,
  • nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleotide sequence according to a) under stringent conditions
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence which has sufficient homology to be functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) or b),
  • nucleic acid molecule according to a nucleotide sequence according to a) - d), which by deletions, additions, substitutions, translocations, inversions and / or
  • the tolerance reaction or the tolerance curve is detected.
  • the invention also relates to the use of the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the polypeptide, the recognition molecule and / or the vaccine in medical prophylaxis, clinical course monitoring, graft aftertreatment, clinical diagnostics and / or therapy.
  • the person skilled in the art can use the nucleic acid molecules or vectors according to the invention, host cells, polypeptides, recognition molecules and / or vaccines in the field of prophylaxis, follow-up, diagnosis or therapy. For example, it is possible to lower the biological structures, which are increased in their level in the event of a rejection reaction or a reaction crisis, in the form of therapy, in order to enable tolerance or conditions for a subsequent tolerance of the transplant. to support.
  • RNA interference can be done, for example, by administering antisense constructs or RNA molecules that are able to generate RNA interference.
  • the peptides or proteins coded by the nucleic acid molecules the t level of which may also be increased, to be functionally impaired by antibodies such that a physiological state in the transplant or between the transplant and recipient organism indicates. can be achieved or supported.
  • reduced level of Increase nucleic acid molecules in the form of a therapeutic measure if a reduced level is associated with a rejection reaction or a rejection crisis.
  • Various possibilities are known to the person skilled in the art to modify the level of the substances or molecules mentioned, in particular to increase them in the present case.
  • An increase in a protein level is possible, for example, by adding an additional promoter to the nucleic acid encoding the corresponding protein, which may of course be present in the organism or transplant or being introduced into the transplanted organ, or by increasing the activity of the original promoter , It is also possible to increase the number of copies of the nucleic acids in the corresponding target tissue, as a result of which more nucleic acid molecules are provided and more proteins can be expressed. It is known to the person skilled in the art that such measures can be carried out not only within the therapy but also in a protocol for prophylaxis or for post-transplant treatment.
  • Clinical follow-up checks or diagnostic measures can advantageously be carried out in such a way that the expression of the nucleic acid molecules or the peptides or fragments encoding them is quantified in the urine or biopsy material over certain time intervals to be determined by the person skilled in the art.
  • the nucleic acid molecules and their homologues or the modified nucleic acid molecules are used for the detection of T- Cell-mediated immune processes, especially used by pathogenic T-cell-mediated immune processes.
  • the nucleic acid molecules according to the invention and also their descendants, their complementary structures and the peptides that encode them can be used, for example, to detect complement reactions or other processes in which T cells have a certain meaning.
  • pathogenic T-cell-mediated immune processes such as type I diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, chronic intestinal inflammation, dermatoses and / or allergies can be detected.
  • autoimmune diseases or inflammations are detected as T-cell-mediated immune processes, in particular an antiglomerular basement membrane disease, autoimmune diseases of the nervous system, a systemic lupus erythematosus, an Addison's disease, an antiphospholipid syndrome, an IgA glomerulonephritis Goodpasture syndrome, a Lambert-Eaton myasthenia syndrome, a bullous pemphigoid, a thrombocytopenic, idiopathic purpura, an autoimmune thyroiditis, a rheumatoid arthritis, an insulin-dependent diabetes mellitus, a pemphigus, an autoimmune hemiformismalemia anemia membranous glomerulonephritis, Graves disease, sympathetic ophthalmia, autoimmune polyendocrinopathies, multiple sclerosis and / or Reiter's disease.
  • the T-line-mediated immune processes are physiological
  • the graft reactions are a rejection crisis, a rejection reaction, a rejection course, a tolerance reaction and / or a tolerance course.
  • the invention also relates to a kit comprising the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the polypeptide, the recognition molecule and / or the vaccine, and to the use of the kit for the detection of the graft reaction.
  • the invention has several advantages. It is thus possible, in particular, to carry out a permanent check of the condition of the graft after transplantations, it being possible to obtain the nucleic acid molecules or peptides or recognition substances according to the invention used as markers from various samples of the patient, for example urine. It is thus possible, in particular, to detect deteriorations in the function of the graft at an early stage, so to speak at the beginning of the effector chain.
  • the substances according to the invention and the method according to the invention therefore make it possible to diagnose processes which are already subclinical at an early stage. Subclinical reactions therefore no longer need to be determined using control biopsies and conventional histology.
  • the substances mentioned can be used as markers for monitoring transplants Detect undesirable immune reactions before organ damage and with differential diagnosis.
  • Monitoring can be used, for example, as a follow-up in multiple immunosuppressive regimens, with good functions being able to discontinue one or more of the immunosuppressive components, with the occurrence of accelerated rejection processes being recognized at an early stage.
  • the procedure can also be optimized individually from patient to patient. It is also advantageously possible with the markers to transfer tolerance-induced protocols and tolerance-inducing therapies to humans, since after the tolerance induction therapy has been discontinued, treatment failures can be identified in good time in order to prevent irreversible damage to the transplant.
  • the substances according to the invention, the method according to the invention and the uses provide exact analytical methods in order to assess the induction, the success and the maintenance of a tolerance.
  • the breakdown of the tolerance for example due to the presence of an infection, can also be predicted. It is therefore possible to make decisions about safely stopping immunosuppressive therapy without advantageously risking the occurrence of reaction crises.
  • An important application of the nucleic acid according to the invention of the method according to the invention is therefore the prediction of reaction crises during or after the treatment, even after conventional therapies, before a deterioration in the function of the graft occurs.
  • conventional immunosuppression is also improved by the nucleic acid molecules according to the invention and the method according to the invention with regard to the early detection of clinical and subclinical acute rejection crises and the beginning of chronic reaction processes.
  • the invention makes it possible to vary the therapy before there is demonstrable damage to the graft. It is also possible to use the nucleic acid molecules according to the invention and the proteins or protein fragments encoded by them for the screening of medicaments which can be used in the diagnosis and therapy of transplant reactions.
  • nucleic acid molecules according to the invention can be found in
  • Kidney transplants induced in the Control antibodies from treated recipient animals are rejected between days 5 and 9.
  • the tolerance is characterized by long-lasting normal kidney function without increasing serum creatinine or proteinuria for more than 300 days.
  • the infiltration of donor-reactive T cells is only 50% reduced, but there is no destruction of the transplanted organ.
  • the mononuclear cells that had migrated into the transplant were isolated from recipient animals treated with control antibodies or RIB / 2 by collagenase digestion and Ficoll gradient on day 5 after the transplantation, and their mRNA expression was compared using the “PCR-Select” method For the isolation of cDNA fragments which are increasingly expressed in transplants of rejecting recipient animals: 2A5 and 2AI5 (corresponds to SEQ ID No. 1 and 2).
  • Recipient animals is increased: 1A50, 3A29, T4, T5, T8 and T10
  • Fig. 1 shows the cDNA sequence sections of the fragments mentioned.
  • Oligonucleotide sequences for carrying out a real-time RT-PCR were also derived from the sequence segments shown here. With the help of these oligonucleotide sequences, a relative quantification of the expression of the corresponding mRNAs in relation to the “house keeping gene” ⁇ -actin in rat cells is possible Mouse sequences Oligonucleotide sequences for the relative quantification of the corresponding mRNAs in relation to the “house keeping gene HPRT” have been established in mouse cells.
  • Fig. 2 shows the results of the expression analysis for fragments 1A50, 3A29, T4, T5, T8 and T10 in the kidney transplant model.
  • the mRNA expression of the fragments in the graft for control antibody-treated recipient animals (Co) is shown on day 0 (naive kidneys), 2 and 5 after the transplantation, and the expression for RIB5 / 2-treated tolerance-developing recipient animals (RIB5 / 2) shown on day 0, 2, 5, 10, 14 and 300 after the transplant. All cDNA fragments are strongly expressed in permanently accepted grafts, whereas their expression in grafts takes control antibodies treated. ' Receiving animals drastically decreased at the time of rejection.
  • Fig. 3 shows the expression of fragments 1A50 and T8 in the transplanted organ.
  • the mRNA expression in grafts of pretreated tolerance-developing recipient animals (DST + YTS177) was analyzed on day 0
  • cDNA fragments 2A5 and 2A15 were examined in the kidney transplant model (Fig. 5) and in the heart transplant model (Fig. 6). The expression of these cDNA fragments in the graft of rejecting recipient animals is shown in each case. Both models upregulate mRNA expression shortly before rejection. With the help of the identification and quantification of such gene markers, the expression of which in the graft, in graft fluids (urine, lavage) or peripheral blood either correlated with long-lasting good graft function or the occurrence of rejections, an assessment of the tolerance-inducing therapy would be better possible.
  • the expression of 2A5 and 2A15 can be used in the biopsy to assess acute subclinical rejection crises and early chronic rejections.
  • a strong, long-lasting expression would be associated with a rejection of the organ. This depends only to a limited extent on the extent of the infiltration of mononuclear cells into the transplant, since in anti-CD4 treated tolerance-developing recipient animals, the infiltration of the mononuclear cells is reduced by only 50% in the kidney transplantation model. This would significantly improve the evaluation of a biopsy, since not only the infiltration into the organ is used as a criterion for acute rejection, but also qualitative changes in the infiltrating cells.
  • Expression of T4, T5, T10, 3A29, T8 and 1A50 in the biopsy can e.g. be used to assess the success of therapy. This would enable a decision to be taken to safely end tolerance-inducing therapy.
  • the expression of 2A5 and 2A15 in the biopsy can be used to assess acute clinical and subclinical rejection crises and early chronic rejections. Strong, long-term expression is associated with immunological rejection of the organ. This depends only to a limited extent on the extent of the infiltration of mononuclear cells into the graft, since in anti-CD4 treated tolerance-developing recipient animals, the infiltration of the mononuclear cells is reduced by only 50% in the kidney transplant model. This significantly improves the evaluation of a biopsy, since not only the infiltration into the organ is used as a criterion for acute rejection, but also the qualitative change in the infiltrating cells.
  • T4, T5, T10, 3A29, T8 and 1A50 in the biopsy is used to assess the success of the therapy.
  • the sharp drop in expression of 1A50 and T8 in the periphery in rejecting recipient animals more than 2 days before the rejection enables a non-invasive diagnosis in the blood or other body fluids, such as in the urine, of the patient before organ deterioration, such as the increase in serum creatinine, can be demonstrated.
  • the following diagnostic model is therefore successful after the transplant: - 1. Detection of 1A50 and " T8 in the patient's blood or other body fluids (eg urine) daily shortly after the operation and weekly / monthly in the further course in order to predict a rejection crisis and thus failure of the therapy or to detect a suppression in the case of withdrawal attempts .
  • T4, T5, T8, T10, 1A50 _ and 3A29 in control biopsies or transplant-relevant body fluids to assess the success of the tolerance-inducing or conventional therapy, in particular to enable the therapy to be safely discontinued / reduced.
  • TIZ transplant-infiltrating cells
  • the first patient data thus confirm that the genes can also be detected in the human system and that their regulation is very similar to that in the animal models.
  • Nr. 1A50 (x10- 1) 2A15 (x10 "1) 2A5 (x10" 1)

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Abstract

Die Erfindung betrifft Immunmarker zur Detektion von Entzündungen, Immunreaktionen und insbesondere von Transplantattoleranzen bzw. Transplantat-Reaktionen, ein Verfahren zur Detektion von Transplantat-Reaktionen oder -toleranzen sowie die Verwendung von Immunmarkern zur medizinischen Prophylaxe, klinischen Verlaufskontrolle, Transplantat-Nachbehandlung, der klinischen Diagnostik und/oder der Therapie im Zusammenhang mit Zell-, Gewebe- bzw. Organtransplantationen.

Description

Immunmar er zur Diagnostik und Therapie im Zusammenhang mit Transplantat-Reaktionen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle als Immunmarker zur Detektion von Transplantat-Reaktionen, ein Verfahren zur Detektion von Transplantat-Reaktionen sowie die Verwendung von Immunmarkern zur medizinischen Prophylaxe, klinischen Verlaufskontrolle, Transplantatnachbehandlung, der klinischen Diagnostik und/oder der Therapie im Zusammenhang mit Zeil-, Gewebe- bzw. Organtransplantationen, wobei Transplantat-Reaktionen eine Toleranz, eine Rejektionskrise oder eine Abstoßung sein können.
Für eine erfolgreiche Organtransplantation ist es notwendig, dass das Spenderorgan lϊistologisch möglichst weitgehend mit dem Empfängergewebe übereinstimmt . Diese Übereinstimmung wird unter anderem durch das HLA-System
(Abk. für (engl.) human leucocyte antigen) bestimmt. Dabei t handelt es sich um ein komplexes System von Gewebe- antigenen, die auf fast allen Zellen vorkommen. Dieses
System spielt eine wichtige physiologische Rolle bei immunologischen Abwehrreaktionen (Erkennung von „Selbst" und „Nichtselbst") . Vor jeder Transplantation wird deshalb eine so genannte Gewebetypisierung bei Organspender und - empfänger vorgenommen, um eine möglichst weitgehende HLA- Kompatibilität zu gewähren.
Aufgrund des extremen genetischen Polymorphismus existiert eine außerordentlich große Anzahl verschiedener HLA-Mole- küle. Eine vollständige Übereinstimmung wird ausschließlich bei eineiigen Zwillingen beobachtet, ansonsten sind HLA-Mo- leküle für jeden Menschen einzigartig.
Problematisch ist jedoch, dass trotz einer weitgehenden HLA-Übereinstimmung zwischen Empfänger und Spender eine Abstoßungsreaktion gegen das transplantierte Organ nicht ausgeschlossen werden kann. Trotz dieser Schwierigkeiten stellt die Transplantation die Therapie der Wahl bei irreversiblem Organversagen dar.
Der ansteigende Bedarf an Organtransplantationen zusammen mit dem verminderten Angebot an Organen sowie die oben beschriebenen Probleme erfordern eine Optimierung der bekannten Therapien. Durch die Einführung neuer verbesserter Immunsuppressiva konnte die 1-Jahrüberle- bensrate auf 90% erhöht werden. Allerdings konnten die Langzeittransplantatüberlebensraten bisher nicht zufriedenstellend verbessert werden. Trotz moderner Immunsuppressiva kommt es immer noch bei der Mehrzahl der Patienten zur Entwicklung chronischer Transplantat- dysfunktionen. Klinische und subklinische akute Reaktionen, auch wenn sie zunächst erfolgreich mit einer Rejektionstherapie behandelt werden, stellen dabei den größten unabhängigen Risikofaktor für die Entwicklung dieser späten Transplantatverluste dar. Eine effiziente Diagnostik und/oder Therapie " derartiger - vor allem subklinisch verlaufender - Prozesse ist daher von großer Wichtigkeit .
Eine Induktion einer Langzeit- und vornehmlich medikamentenfreien Transplantatakzeptanz ohne Beeinträchtigung der Organ-, Gewebe- oder Zeilfunktionen und der Immunkapazität des Transplantatempfängers ist daher von großer Bedeutung. Klinisch wird die Toleranz als permanentes Transplantatüberleben mit normaler Organfunktion bei Abwesenheit akuter und chronischer Abstoßungsreaktionen und dem Erhalt der antimikrobiellen Immunreaktivität definiert .
Neue Strategien zur Induktion einer Transplantattoleranz bestehen in der Applikation immunregulatorischer Proteine oder in einer Induktion eines Chimerismus . Bei den immunregulatorischen Proteinen kann es sich entweder um Antikörper handeln, die eine Depletion der donor-reaktiven T-Zellen bewirken, z.B. anti-CD3-Immunotoxin, oder um Antikörper und Proteine, die die Aktivierung der donor- reaktiven T-Zellen beeinflussen, z.B. anti-CD4-Antikörper, anti-CD40L-Antikörper oder CTLA4-lg. Chimerismus bedeutet das parallele Vorhandensein von Blutleukozyten des Spenders und des Empfängers mit Hilfe nicht-myeloablativer Verfahren zur Transplantation von Stammzellen des Spenders . i Bisher erfolgte nach der Transplantation eine dauerhafte
Kontrolle des Zustandes des Transplantates dadurch, dass die Funktion des Transplantates als Maß herangezogen wird; z.B. durch die Bestimmung des Serumkreatininspiegels im
Falle eines Nierentransplantates . Außerdem werden Bioptate entnommen und nach dem „Bänff Scorew histologisch beurteilt. Damit kann beurteilt werden, ob Veränderungen assoziiert mit einer akuten Abstoßung - Infiltration mononukleärer Zellen - oder chronische Abstoßungen (Vaskulopathie) nachweisbar sind.
Klinisch, manifeste Rejektionen werden durch Funktions- Verschlechterung der Organe definiert, wie beispielsweise Herzfunktion, dem Serumkreatinin in dem der Lungenfunktion oder anderen. Leider stehen diese Funktions- verschlechterungen am Ende einer Effektorkette. Eine frühzeitige Diagnostik bereits subklinisch ablaufender Prozesse wäre sehr hilfreich. .Auch ist eine Funktionsverschlechterung nicht immer durch eine Rejektion bedingt; es gibt auch andere Ursachen wie Toxizitat und Infektionen, die differentialdiagnostisch abgegrenzt werden müssen, was gegenwärtig viel Zeit beansprucht und oft sehr schwierig ist. Subklinisch verlaufende Reaktionen können bisher nur durch Protokollbiopsien und konventionelle Histologie, zumindest innerhalb gewisser Grenzen, verlässlich beurteilt werden. Jedoch werden dabei auch Infiltrate als negativ beurteilt, die möglicherweise eine protektive Wirkung auf das Transplantat haben, wie in Tierexperimenten gezeigt werden konnte. Für Nierentransplantate wurde nachgewiesen, dass molekularbiologische Untersuchungen iiri Urin- eine klinisch manifeste Rejektion reflektieren können, aber, es fehlen Untersuchungen zum subklinischen Bereich der Rejektionen. Es besteht also ein großer Bedarf an Markern für das. Monitoring von Transplantaten (Bioptate, Urin, Lavage, Blut etc) , um unerwünschte Immunreäktionen " gegen das Transplantat rechtzeitig - d.h. möglichst vor der Organschädigung,- und differentialdiagnόstisch sicher - als Abgrenzung gegen andere Prozesse, die die Organfunktion beeinträchtigen - zu erfassen.
Aufgrund der Nebenwirkungen der chronischen Applikation der derzeit üblichen Mehrfachimmunsuppressivaschemata wird immer wieder versucht, bei gut gehender Funktion einzelne oder mehrere der immunsuppressiven Komponenten abzusetzen - nachteilhafterweise ist dieser Ansatz immer durch das Auftreten von akzelerierten Abstoßungsprozessen, manchmal erst Jahre nach Absetzen, gefährdet. Es fehlt völlig an Parametern, die ein derartiges Vorgehen verlässlich individuell optimieren könnten. Eine Verbesserung der bisherigen Strategien durch Einführung toleranzinduzierter Protokolle würde die Therapie durch weniger Nebenwirkungen und weniger Kosten revolutionieren. Die Übertragung der oben erwähnten toleranzinduzierenden Therapien auf den Menschen birgt jedoch etliche Gefahren, da nach Absetzen der Toleranzinduktionstherapie rechtzeitig Therapieversager identifiziert werden müssen, um eine irreversible Schädigung des Transplantates durch Rejektion zu verhindern. Selbst in Tiermodellen werden niemals 100% der Empfänger tolerant .
Nachteilhaft bei den bisherigen Methoden ist es, dass keine Entscheidungen über . das sichere Absetzen einer immunsuppressiven Therapie getroffen werden können, ohne dabei das Auftreten von.Rejektionskrisen zu riskieren.
Ein weiterer Nachteil ist, dass die bekannten Methoden es nicht ermöglichen, während oder" nach der Behandlung, auch nach konventionellen Therapien, bevor eine Transplantats- funktionsVerschlechterung auftritt, eine Vorhersage von Rejektionskrisen zu ermöglichen. Die bisher zur Verfügung stehenden diagnostischen Mittel und Methoden sind nur begrenzt zur Beurteilung einer toleranzinduzierenden Therapie einsetzbar. Die Beurteilung der Therapie hinsichtlich der Funktion des Transplantates - z.B. des Serumkreatinins - kommt zu spät, da es bei einem nachweisbaren Anstieg des Serumkreatinins schon zu einer Schädigung des transplantierten Organs, beispielsweise der Niere, gekommen ist. Hinsichtlich der toleranzinduzierenden Therapien bedeutet ein signifikanter Anstieg des Serumkreatinins ein Fehlschlagen der Therapie und für den Patienten wahrscheinlich das Umsteigen auf konventionelle Immunsuppressiva mit den bekannten Nebenwirkungen. Auch die bekannte Analyse einer Biopsie ist in diesem Fall nur bedingt hilfreich, da viele toleranzinduzierenden Therapien, wie z.B. mit anti-CD4-Antikörpern nur bedingt die Infiltration mononukleärer Zellen in das Transplantat verhindern. Innerhalb der bisherigen Methoden und Verfahren würde dies als akute Abstoßungs- bzw. Rejektionskrise betrachtet werden, und der Patient würde mit hochdosierten konventionellen Immunsuppressiva behandelt werden. Eine hochdosierte Gabe konventioneller Immunsuppressiva kann sich jedoch zusätzlich negativ auf den Erfolg der toleranz- induzierten Therapie auswirken, was ebenfalls ein Fehlschlagen der Therapie bedeuten würde . Aber auch für die konventionellen Immunsuppressionen wären verbesserte diagnostische Mittel und Methoden hinsichtlich der Früherkennung klinischer und subklinischer akuter Abstoßungskrisen und beginnender chronischer Rejektions- prozesse hilfreich. Dies würde es unter anderem ermöglichen, die Therapie zu ■ variieren bevor eine nachweisbare Schädigung des Transplantates - z.B. Anstieg des Serumkreatinins - vorliegt . Außerdem kann eine Verschlechterung der Organfunktion auch durch Nebenwirkung einer hochdosierten immunsuppressiven Therapie oder durch Infektionen im Transplantat hervorgerufen werden, was durch bekannte Methoden ebenfalls nicht detektiert werden kann.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, effiziente und zu- verlässige Immunmarker bereitzustellen, welche eine sichere und schnelle Vorhersagbarkeit des Risikos einer Transplantatabstoßung bzw. des Fehlen selbiger - als Form einer Toleranz - in medizinischer Prophylaxe, klinischer Verlaufskontrolle oder der Transplantatnachbehandlung ermögliche .
Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung eines isolierten Nucleinsäure- moleküls ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 -
8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleiinsäuremolekül , welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert ,
c)' ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und
e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist .
Es war überraschend, dass die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle mit Entzündungen, insbesondere chronischen Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Läsionen, allgemeinen Wunden und Transplantat-Reaktionen, insbesondere mit Transplantatrejektionen oder anderen Transplantatdysfunktionen sowie dem Ausbleiben dieser - als Form der Transplantattoleranz - assoziiert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nucleinsäuremolekül, das eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1-8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen funktionsanalog zu sein, zumindest zu 40% «homolog. Im Sinne der Erfindung heißt, um zu den genannten Nucleotidsequenzen bzw. den mit diesen Nucleotidsequenzen hybridisierenden Sequenzen funktions- analog zu sein, dass die Homologen bei Transplantat- Reaktionen ein Verhalten zeigen, das Rückschlüsse auf das Transplantat und' dessen Verhältnis zum Empfängerorganismus zulässt .
Funktionsanaloge Sequenzen sind im Sinne der Erfindung all jene Sequenzen, die der Fachmann als gleichwirkend" identifizieren kann. Beispielsweise ist es' möglich, dass der Fachmann in verschiedenen Versuchstieren, wie z.B. der Ratte oder dem Kaninchen, erfindungsgemäße Nucleinsäure- moleküle identifiziert und so aufgrund von Homologie- Untersuchungen in der Lage ist7 funktionsanaloge Strukturen in anderen Organismen, wie beispielsweise Schimpansen oder Hunden, zu identifizieren. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass der Fachmann aufgrund seiner Kenntnis der in der Maus oder Ratte gefundenen Nucleinsäuremoleküle auch in humanen Patienten Analoge und Homologe aufgrund von Homologie- oder Analogie-Untersuchungen detektiert . Weiterhin ist es möglich, dass der Fachmann im humanen Bereich isolierte erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle in spezifischen Versuchstieren detektiert, mit denen bestimmte Transplantationsreaktionen untersucht werden können, wie beispielsweise in Schweinen oder auch in wirbellosen Organismen, wie z.B. Nematoden bzw. anderen Organismen, die für spezifische Fragestellungen der Transplantations- biologie herangezogen werden können.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist das Nucleinsäuremolekül mindestens 60%, vorzugsweise 70%, bevorzugt 80%, ganz besonders bevorzugt 90% Homologie zu einem Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1-8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen auf, wobei dieses Nucleinsäuremolekül eine biologische Aktivität wie die unter SEQ ID Nr. 1-8 aufgezeigten Sequenzen oder deren komplementären Sequenzen aufweist .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nucleinsäuremolekül eine genomische DNA, eine cDNA und/oder eine RNA. Besonders bevorzugt ist das Nucleinsäuremolekül eine mRNA.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül umfasst. Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine Wirtszelle, die den Vektor im erfindungsgemäßen Vektor umfasst. Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, was durch ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül kodiert wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Erkennungsmolekül, das gegen das Nucleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle und/oder das Polypeptid gerichtet ist . Erkennungssubstanzen im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die mit den genannten Strukturen wie Nucleinsäuremolekülen oder -Sequenzen, Vektoren, Wirtszellen und/oder Polypeptiden bzw. deren Fragmenten wechselwirken können; insbesondere so wechselwirken, dass eine Detektion dieser Strukturen möglich ist. Die ErkennungsSubstanzen können insbesondere spezifische Nucleinsäύren sein, die mit den genannten Nucleinsäuremolekülen binden, aber auch Antikörper, Floüreszenzmarker, markierte. Kohlenhydrate oder Lipide, Antisense-Konstrukte, cDNA oder mRNA-Moleküle bzw. deren Fragmente . Es ist selbstverständlich auch möglich, dass die Erkennungssubstanzen nicht Proteine oder Nücleinsäuren bzw. Antikörper sind, sondern gegen diese gerichtete Antikörper. Die Erkennungssubstanzen können in solch einem Fall insbesondere sekundäre Antikörper sein.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die Erkennungsmoleküle ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisensekonstrukt, insbesondere ein RNA- Interferenzmolekül .
Die Autoantikörper im Sinne der Erfindung binden die erfindungsgemäßen Polypeptide spezifisch. Die Antikörper können auch modifizierte Antikörper sein (z.B. oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper) . Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Antikörper umfasst sowohl intakte Moleküle als auch Autoantikörper- Fragmente, wie Fab, F(ab')2 und Fv, die bestimmte Epitop- Determinanten der Polypeptide binden können.. Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit des Antikörpers zur selektiven Bindung seines Antigens oder Rezeptors teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind:
(1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes Antigenbin- dungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte
Kette und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden; ,
(2) das Fab' -Fragment eines Antikörper-Moleküls lässt sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden zwei
Fab' -Fragmente erhalten;
(3) F(ab')2, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F(ab')2 ist eine Dimer von zwei Fab' -Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
(4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält und in
Form von zwei Ketten exprimiert wird; und
(5) Einzelketten-Antikörper („SCA") , definiert als gentechnisch verändertes Molekül, das ölen variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten
Polypeptid-Linker zu einem genetisch fusionierten Einzelketten-Molekül verbunden sind.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff Epitop bedeutet eine beliebige Antigen-Determinante auf dem Polypeptid. Epitop-Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächen-Gruppierungen von Molekülen, wie Aminosäuren f oder Zucker-Seitenketten, und besitzen normalerweise sowohl spezifische Merkmale der dreidimensionalen Struktur als auch spezifische Ladungsmerkmale .
Die Erfindung betrifft auch Vakzine, die das Nucleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, das Polypeptid und/oder das Erkennungsmolekül gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Bei dem pharmazeutisch akzeptablen Träger handelt es sich um an sich bekannte pharmazeutische Hilfs- und/oder Zusatzstoffe. Bei diesen, dem Fachmann an sich bekannten Zusatz- und Trägerstoffen, kann es sich auch um Liposomen bzw. um in der Gentechnik bekannte Strukturen bzw. Lösungen und/oder Puffergemische oder um andere Substanzen aus dem Bereich der Galenik handeln.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Detektion von Tranplantat-Reaktionen in einer Probe von einem Patienten, wobei in der Probe ein Level von mindestens einem Nucleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 - 8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleinsäuremolekül, welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert ,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotid- sequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist
bestimmt und der Level mit einem Kontroll-Level einer Vergleichsprobe von einem gesunden Patienten verglichen wird, wobei durch einen modifizierten Level in der Probe im Vergleich zu dem Kotroll-Level die Transplantat-Reaktionen - was auch das Fehlen selbiger als Toleranz einschließt - detektiert wird.
Als Transplantat-Reaktion im Sinne der Erfindung wird demgemäß jede physiologische und pathophysiologische Wechselwirkung des Tranplantates mit dem Empfängerorganismus aber auch jede isolierte Reaktion innerhalb des Transplantates verstanden. Die Transplantat-Reaktion kann daher im Sinne der Erfindung eine Toleranz sein bzw. eine Abstoßung des Transplantates . Demgemäß ist eine Transplantat-Reaktion im Sinne der Erfindung auch ein nicht pathologischer, d.h. ein normaler oder gesunder, Zustand, in dem sich das Transplantat selbst und in Bezug auf den Empfängerorganismus befinden kann. Eine Probe im Sinne der
Erfindung ist die Bezeichnung für ein durch Probenentnahme i entnommenes biologisches Gut oder eines Teiles bzw. einer kleinen Menge eines solchen, dessen Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden soll. Die Probenentnahme aus dem Patienten bzw. aus gewonnenen humoralen oder zellulären Bestandteilen des
Patienten erfolgt "insbesondere- so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht . Die durch Untersuchung der Probe ermittelten Merkmale dienen der Beurteilung der durch die Probe erfassten Menge, die Rückschlüsse auf die Gesamtmenge, z.B. ein gesamtes tranplantiertes Organ, wie Leber, Milz, Blut oder aber auch von nicht transplantierten Bestandteilen, wie z.B. dem Immunsystem, zulässt. Für die Untersuchung können die Proben durch Mischen, Zerteilen, Zerkleinern, Zugabe von Enzymen oder Markern bzw. anders vorbehandelt werden. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten der Vorbehandlung der Proben bekannt . Selbstverständlich kann es auch vorgesehen sein, dass die Probe so entnommen wird, dass sie keinem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Eine Probe können alle biologischen und nichtbiologischen Materialien sein, wie biologische Gewebe und Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Lymphe, Urin, Gehirnflüssigkeit und andere .
Ein Transplantat im Sinne der Erfindung ist ein transplan- tiertes oder zu transplantierendes Organ, Gewebe oder eine Zelle bzw. eine Zellansammlung . Im Sinne der Erfindung können Transplantate jedoch auch bestimmte Implantate sein, die aus Stoffen bzw. Teilen bestehen, die zur Erfüllung bestimmter Ersatzfunktionen für einen begrenzten Zeitraum oder auf Lebenszeit in einen Körper eingebracht werden. Die Implantate können beispielsweise aus anorganischer Materie bestehen, die mit organischen Substanzen, wie beispielsweise Knorpel oder Knochenzellen, beschichtet ist.
Unter einer Transplantatabstoßung gemäß der Erfindung ist die Induktion einer Immunreaktion des Empfängers auf das Transplantat zu verstehen, wobei eine Immunreaktion des Empfängers eine spezifische Schutz- oder Abwehrreaktion des Körpers gegen die Antigene bzw. andere Strukturen des Transplantates ist.
Ein Patient im Sinne der Erfindung ist jeder Organismus, der ein Transplantat umfasst, insbesondere ein humaner Organismus . Ein gesunder Patient im Sinne der Erfindung ist ein Patient, dessen Zustand es erlaubt, als Referenz für das vorliegende Verfahren verwendet zu werden. Gesund im Sinne der Erfindung muss nicht die völlige Abwesenheit von Krankheiten, Transplantaten oder pathogenen Veränderungen bedeuten. Der gesunde Patient stellt entweder einen einzelnen Patienten oder eine Durchschnittsmenge von Patienten dar, die als Vergleichsgruppe dergestalt dienen können, dass eine Veränderung des Levels der genannten Nucleinsäuremoleküle oder der Strukturen, für die sie kodieren bzw. den Erkennungssubstanzen bestimmt werden kann. Eine Modifikation des Levels im Vergleich zum Kontrolllevel heißt, dass die genannten Nucleinsäuremoleküle bzw. die oben genannten Immunmarker, wie insbesondere die Peptide oder die Erkennungssubstanzen, in ihrer Konzentration oder Aktivität als Protein, als Nucleinsäuremolekül oder als Antikörper detektierbare Veränderungen gegenüber dem Kontroll-Level aufweisen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Transplantat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Milz, Herz, Leber, Pankreas und/oder von Geweben, insbesondere Inseln, Aorten, Knorpeln. Selbstverständlich ist es möglich, dass die jeweils aufgezeigten Organe bzw. Gewebestrukturen allein oder in Kombination transplantiert werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Level als eine DNA-, eine RNA-Konzentration, eine Gehexpression, eine Kopienanzahl einer Nucleinsäure, eine Peptidkonzentration, eine Peptidaktivität und/oder als eine Konzentration von Isoformen bestimmt. Mit Vorteil kann der Fachmann verschiedene Möglichkeiten wählen, um den Level von mindestens einem Nucleinsäuremolekül zu bestimmen. Eine Möglichkeit ist beispielsweise die Bestimmung der Peptidkonzentration, die durch das Nucleinsäuremolekül kodiert werden, mit spektrografisehen Methoden. Es ist jedoch auch möglich, den Level auf der RNA- bzw. DNA-, insbesondere mRNA- und/oder cDNA-Ebene zu bestimmen oder beispielsweise über die Aktivität der durch sie kodierten Proteine und/oder Peptide bzw. deren Fragmente. Es ist selbstverständlich möglich, dass der Level nur in dem Transplantat oder in Teilstücken desselben innerhalb oder außerhalb des Körpers bestimmt wird bzw. dass er in 'dem umgebenden Gewebe bzw. Kδrperflüssigkeiten bzw. in Biopsiematerialien oder in Flüssigkeiten, wie ^beispielsweise Urin, Lymphe oder Blut, detektiert wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung i wird der Level als eine mRNA-Konzentration bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Transplantatreaktion eine Rejektionskrise, eine Abstoßungsreaktion, ein Abstoßungsverlauf, eine Toleranzreaktion und/oder ein ..Toleranzverlauf, der durch das erfindungsgemäße Verfahren detektiert wird. Der Abstoßungsverlauf und die Abstoßungsreaktion können beispielsweise klinisch bzw. subklinisch verlaufen. Eine Toleranz im Sinne der Erfindung ist beispielsweise eine lang anhaltende normale Funktion des transplantierten Organs ohne Serumkreatininanstieg bzw. Proteinurie über mehr als 100, bevorzugt 200, ganz besonders bevorzugt 300 Tage.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch einen verminderten Level eines . Nucleinsäuremoleküls umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend
a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 7 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleinsäuremolekül, welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein, i d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches
Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und
e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) - d) ,. welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder
Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist
die Abstoßungsreaktion, der Abstoßungsverlauf und/oder die Rejektionskrise detektiert. Ein Abstoßungsverlauf kann beispielsweise der Verlauf einer Abstoßungsreaktion mit bzw. ohne Medikamentengabe sein, wobei diese Medikamente beispielsweise immunsuppressierende Substanzen sein können. Mit Vorteil kann durch den verminderten Level der Nucleotidsequenzen bzw. deren komplementären Nucleotidsequenzen bzw. Nucleinsäuremolekülen, welche mit diesen Nucleotidsequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren oder Nucleotidsäuremoleküle, die eine ausreichende Homolgie aufweisen, um zu den genannten Nucleotidsequenzen funktionsanalog zu sein, bestimmt werden, ob das Transplantat selbst oder in -Bezug auf den Empfängerorganismus zu unphysiologischen bzw. pathologischen Prozessen neigt .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch einen erhöhten Level eines Nucleinsäuremoleküls umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend
a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen, b) ein Nucleinsäuremolekül welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und
e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanälog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist
die Abstoßungsreaktion, der Abstoßungsverlauf und/oder die Rejektionskrise detektiert. Im Sinne der Erfindung gehören zu den genannten Nucleinsäuremolekülen insbesondere die Nucleinsäuremoleküle, die unter stringenten Bedingungen mit den genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren als auch solche Nucleinsäuremolekülen, die eine ausreichende Homologie aufweisen, um zu den genannten Nucleinsäuremolekülen funtionsanalog zu sein sowie solche, die infolge des gentischen Codes degeneriert sind bzw. durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanlaog zu der genannten Nucleotidsequenz der Nucleinsäuremoleküle sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch einen erhöhten Level eines Nucleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe umfassend
a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr . 7 und SEQ ID Nr. 8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleinsäuremolekül welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und
e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder
Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer i Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist
die Toleranzreaktion oder der Toleranzverlauf detektiert .
Mit Vorteil ist es also möglich, durch die Detektion eines erhöhten Levels der genannten Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen, ob das transplantierte Organ, das transplantierte Gewebe bzw. die einzelne Zelle von dem Empfängerorganismus in einer Art und Weise akzeptiert wird, dass pathologische Reaktionen weitestgehend ausbleiben.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Nucleinsäuremoleküls, des Vektors, der Wirtszelle, des Polypeptids, des Erkennungsmoleküls und/oder der Vakzine in der medizinischen Prophylaxe, der klinischen Verlaufskontrolle, der Transplantatnachbehandlung, der klinischen Diagnostik und/oder der Therapie . Der Fachmann kann die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle bzw. Vektoren, Wirtszellen, Polypeptide, Erkennungsmoleküle und/oder Vakzine im Bereich der Prophylaxe, Verlaufskontrolle, Diagnostik oder Therapie einsetzen. Beispielsweise ist es möglich, die biologischen Strukturen, die bei einer Abstoßungsreaktion bzw. einer Reaktionskrise in ihrem Level erhöht sind, in Form einer Therapie zu erniedrigen, um somit eine Toleranz bzw. Bedingungen für eine nachfolgende Toleranz des Transplantates zu ermöglichen, zu indizieren bzw. zu unterstützen. Dies kann beispielsweise durch die Gabe von Antisense-Konstrukten bzw. RNA-Molekülen erfolgen, die in der Lage sind, eine RNA-Interferenz zu erzeugen. Es ist jedoch auch möglich, die durch die Nucleinsäuremoleküle kodierten Peptide bzw. Proteine, deren t Level auch erhöht sein kann, durch Antikörper funktional so zu beeinträchtigen, dass ein physiologischer Zustand im Transplantat bzw. zwischen Transplantat und Empfängerorganismus indiziert, . erreicht oder unterstützt werden kann. Selbstverständlich ist es auch möglich, einen . verminderten Level von Nucleinsäuremolekülen in Form einer therapeutischen Maßnahme zu erhöhen, wenn ein verminderter Level mit einer Abstoßungsreaktion bzw. einer Rejektionskrise assoziiert ist. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten bekannt, den Level der genannten Substanzen oder Moleküle zu modifizieren, im vorliegenden Fall insbesondere zu erhöhen. Eine Erhöhung eines Proteinlevels ist beispielsweise dadurch möglich, dass der Nucleinsäure, die das entsprechende Protein kodiert, die natürlich im Organismus oder Transplantat vorliegen kann bzw. in das transplantierte Organ eingebracht wird, ein zusätzlicher Promoter vorgeschaltet bzw. der ursprüngliche Promoter in seiner Aktivität verstärkt wird. Weiterhin ist es möglich, die Kopienanzahl der Nucleinsäuren im entsprechenden Zielgewebe zu erhöhen, wodurch mehr Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt werden und mehr Proteine exprimiert werden können. Dem Fachmann ist bekannt, dass derartige Maßnahmen nicht nur innerhalb der Therapie sondern auch in einem Protokoll zur Prophylaxe bzw. das zur Transplantat- nachbehandlung durchgeführt werden können. Klinische Verlaufskontrollen bzw. diagnostische Maßnahmen können mit Vorteil so erfolgen, dass im Verlauf von bestimmten, durch den Fachmann festzulegenden Zeitabständen im Urin bzw. Biopsiematerial eine Quantifizierung der Expression der Nucleinsäuremoleküle bzw. der sie kodierenden Peptide oder Fragmente erfolgt .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Nucleinsäuremoleküle und ihre Homologe bzw. die modifizierten Nucleinsäuremoleküle zur Detektion von T- Zell-vermittelten Immunprozessen, insbesondere von pathogenen T-Zell-vermittelteή Immunprozessen verwendet. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und auch ihre Abkömmlinge, ihre komplementären Strukturen sowie die Peptide, die sie kodieren, können beispielsweise genutzt werden, um Komplementreaktionen bzw. andere Prozesse zu detektieren, bei denen T-Zellen eine gewisse Bedeutung haben. Insbesondere können pathogene T-zell-vermittelte Immunprozesse wie z.B. Diabetes mellitus Typ I, rheumatoide Arthritis, chronische Darmentzündung, Dermatosen und/oder Allergien detektiert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als T-Zell-vermittelte Immunprozesse Autoimmunerkrankungen oder Entzündungen detektiert, insbesondere eine antiglomeruläre Basalmembrankrankheit, Autoimmunkrankheiten des Nervensystems, ein systemischer Lupus erythematodes, eine Addison-Krankheit, ein Antiphospholipid-Syndrom, eine IgA-Glomerulonephritis, ein Goodpasture-Syndrom, ein Lambert-Eaton-Myasthenie-Syndrom, ein bullöses Pemphigoid, eine thrombozytopenische, idiopathische Purpura, eine Autoimmun-Thyreoiditis, eine rheumatoide Arthritis, ein insulinabhängiger Diabetes mellitus, ein Pemphigus, eine autoimmunhämolytische Anämie, ein Dermatitis therpetiformis Duhring, eine membranöse Glomerulonephritis, eine Graves-Krankheit, eine sympathische Ophthalmie, Autoimmun-Polyendokrinopathien, multiple Sklerose und/oder Reiter-Krankheit. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die T-Zeil-vermittelten Immunprozesse physiologische, pathologische und/oder klinische Transplantat-Reaktionen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Transplantat-Reaktionen eine Rejektionskrise, eine Abstoßungsreaktion, ein Abstoßungsverlauf, eine Toleranzreaktion und/oder ein Toleranzverlauf.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der das Nucleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, das Polypeptid, das Erkennungsmolekül und/oder die Vakzine umfasst, sowie die Verwendung des Kits zur Detektion der Transplantatreaktion.
Die Erfindung weist mehrere Vorteile auf. So ist es insbesondere möglich, nach Transplantationen eine dauerhafte Kontrolle des Zustandes des Transplantates durchzuführen, wobei es möglich ist, die als Marker verwendeten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Peptide bzw. ErkennungsSubstanzen aus verschiedenen Proben des Patienten, beispielsweise Urin, zu gewinnen. Somit ist es insbesondere möglich, frühzeitig Funktionsver- schlechterungen des Transplantates, sozusagen am Beginn der Effektorkette, festzustellen. Durch die erfindungsgemäßen Substanzen und das erfindungsgemäße Verfahren ist es also möglich, bereits subklinisch ablaufende Prozesse frühzeitig zu diagnostizieren. Somit müssen subklinisch verlaufende Reaktionen nicht mehr mit Kontrollbiopsien und konventioneller Histologie bestimmt werden. Weiterhin können die genannten Substanzen als Marker für das Monitoring von Transplantaten benutzt werden, um unerwünschte Immunreaktionen vor der Organschädigung und differentialdiagnostisch sicher zu erfassen. Das Monitoring kann beispielsweise als Verlaufskontrolle bei Mehrfach- immunsuppressivaschemata verwandt werden, wobei gutgehende Funktionen einzelne oder mehrere der immunsuppressiven Komponenten abgesetzt werden können, wobei das Auftreten von akzelerierten Abstoßungsprozessen frühzeitig erkannt werden kann. Das Verfahren lässt sich dadurch auch individuell von Patient zu Patient optimieren. Auch ist es durch die Marker mit Vorteil möglich, toleranzinduzierte Protokolle und toleranzinduzierende Therapien auf den Menschen zu übertragen, da nach Absetzen der Toleranzinduktionstherapie rechtzeitig Therapieversager identifiziert werden können, um eine irreversible Schädigung des Transplantates zu verhindern. Das heißt, die erfindungsgemäßen Substanzen, das erfindungsgemäße Verfahren und die Verwendungen stellen exakte Analysemethoden zur Verfügung, um die Induktion, den Erfolg und die Erhaltung einer Toleranz zu beurteilen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann unter anderem auch das Zusammenbrechen der Toleranz, beispielsweise durch Vorliegen einer Infektion, vorhergesagt werden. Es ist daher möglich, Entscheidungen über das sichere Absetzen einer immunsuppressiven Therapie zu treffen, ohne dass vorteilhafterweise das Auftreten von Reaktionskrisen riskiert werden muss. Eine wichtige Anwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Vorhersage von Reaktionskrisen während oder nach der Behandlung, auch nach konventionellen Therapien, bevor eine Transplantatfunktionsverschlechterung auftritt. Weiterhin wird aber auch die konventionelle I munsuppression durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und das erfindungsgemäße Verfahren hinsichtlich der Früherkennung klinischer und subklinischer akuter Abstoßungskrisen und beginnender chronischer Reaktionsprozesse verbessert. Es ist durch die Erfindung möglich, die Therapie zu variieren, bevor eine nachweisbare Schädigung des Transplantates vorliegt. Weiterhin ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und die durch sie kodierten Proteine bzw. Proteinfragmente zum Screening von Arzneimitteln zu verwenden, die bei der Diagnose und Therapie von Transplantat-Reaktionen eingesetzt werden können.
Die Erfindung soll im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne sie darauf einzuschränken.
Beispiele
Beispiel 1
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können in
Labortieren identifiziert werden, so beispielsweise in dem anerkannten orthotropen Nierentransplantationsmodell : der t Ratte, bei dem die Expression der erfindungsgemäßen Marker zur postoperativen Diagnostik verwendet werden kann. In dem verwendeten Transplantationsmodell (WF Spendernieren nach
BDIX Rezipienten) kann durch mehrmalige Applikation eines anti-CD4-Antikörpers RIB5/2 eine Toleranz gegenüber
Nierentransplantaten induziert werden, die im Kontrollantikörper behandelter Empfängertiere zwischen Tag 5 und 9 abgestoßen werden. Die Toleranz zeichnet sich durch eine lang anhaltende normale Nierenfunktion ohne Serumkreatininanstieg bzw. Proteinurie über mehr als 300 Tage aus. Die Infiltration donor-reaktiver T-Zellen ist nur zu 50% herabgesetzt, jedoch kommt es nicht zur Zerstörung des transplantierten Organs .
Im Rahmen der Erfindung wurden von mit Kontrollantikörpern bzw. RIB/2 behandelten Empfängertieren die in das Transplantat eingewanderten mononukleären Zellen am Tag 5 nach der Transplantation durch Kollagenaseverdau und Ficollgradient isoliert und deren mRNA Expression mit Hilfe der „PCR-Select" Methode verglichen. Dies führte zur Isolierung von cDNA Fragmenten, die verstärkt in Transplantaten rejizierender Empfängertiere exprimiert werden: 2A5 und 2AI5 (entspricht SEQ ID Nr. 1 und 2) .
Ebenso konnten cDNA Fragmente isoliert werden, deren
Expression in Transplantaten toleranzentwickelnder
Empfängertiere erhöht ist: 1A50, 3A29, T4, T5, T8 und T10
(entspricht SEQ ID Nr. 3, 4, 5, 6, 7 und 8) . In Abb. 1 sind die cDNA Sequenzabschnitte der erwähnten Fragmente dargestellt .
Von den hier dargestellten Sequenzabschnitten wurden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotidsequenzen für die Durchführung einer Real Time RT-PCR abgeleitet. Mit Hilfe dieser Oligonukleotidsequenzen ist eine relative Quantifizierung der Expression der korrespondierenden mRNA' s in Bezug zum „house keeping gene" ß-actin in Rattenzellen möglich. Ebenso wurden anhand der homologen Maussequenzen Oligonukleotidsequenzen zur relativen Quantifizierung der korrespondierenden mRNA' s in Bezug zum „house keeping gene HPRT" in Mauszellen etabliert.
Mit Hilfe der so etablierten Oligonukleotidsequenzen wurden im Rahmen der Erfindung kinetische Expressionsstudien in mehreren Transplantationsmodellen durchgeführt . Neben dem bereits erwähnten Nierentransplantationsmodell in der Ratte wurde die Expression der Fragmente auch in einem Herztransplantationsmodell in der Maus analysiert . In diesem Modell wird den Empfängertieren (CBA) 4 Wochen vor der Transplantation eine donor-spezifisch Bluttransfusion
(BIO) in Kombination mit dem anti-CD4 Antikörper YTS177 verabreicht . Das führt zur Induktion einer donor- spezifischen Toloranz zum Zeitpunkt der Transplantation.
Kontrollherzen in unbehandelten Empfängertieren werden zwischen Tag 7 und Tag 8 abgestoßen.
In Abb. 2 sind die Ergebnisse der Expressionsanalyse für die Fragmente 1A50, 3A29, T4, T5, T8 und T10 im Nierentransplantationsmodell dargestellt. Abgebildet ist die mRNA Expression der Fragmente im Transplantat für Kontroll-Antikörper behandelte Empfängertiere (Co) am Tag 0 (naive Nieren) , 2 und 5 nach der Transplantation, außerdem ist die Expression für RIB5/2-behandelte toleranzentwickelnde Empfängertiere (RIB5/2) am Tag 0, 2, 5, 10, 14 und 300 nach der Transplantation dargestellt. Alle cDNA Fragmente werden in permanent akzeptierten Transplantaten stark exprimiert, hingegen nimmt ihre Expression in Transplantaten Kontroll-Antikörper behandelter .' Empfängertiere zum Zeitpunkt der Rejektion drastisch ab.
Anschließend wurde . die Expression . der korrespondierenden mRNA' s im Herztransplantationsmodell untersucht. In Abb. 3 ist die Expression der Fragmente 1A50 und T8 im transplantierten Organ dargestellt. Analysiert wurde die mRNA Expression in Transplantaten vorbehandelter toleranzentwickelnder Empfängertiere (DST+YTS177) am Tag 0
(naive Herzen), 2, 5, 7, 8, 10, 40 und 100 nach
Transplantation. Verglichen wurden die Ergebnisse mit der mRNA Expression im Transplantat unbehandelter Kontrolltiere (Co) am Tag 0 (naive Herzen), 2, 5, 7 und 8. Auch im Herztransplantationsmodell weisen permanent akzeptierte Transplantate eine hohe mRNA Expression an 1A50 und T8 auf. In Transplantaten rejizierender Empfängertiere ist die Expression wiederum stark vermindert.
Die unterschiedliche Expression an 1A50 und T8 widerspiegelt sich auch im peripheren Blut . Nur in Blutzellen von unbehandelten Empfängertieren (Co) kommt es kurz vor der Rejektion" (Tag 5) zum Abfall der Expression von 1A50 und T8 (Abb. 4) . "
Weiterhin wurde die Expression der cDNA Fragmente 2A5 und 2A15 im Nierentransplantationsmodell (Abb. 5) und im Herztransplantationsmodell (Abb. 6) untersucht. Dargestellt ist jeweils die Expression dieser cDNA Fragmente im Transplantat rejizierender Empfängertiere. In beiden Modellen kommt es zur Hochregulation der mRNA Expression kurz vor der Rejektion. Mit Hilfe der Identifi ierung und Quantifizierung von solchen Genmarkern, deren Expression im Transplantat, in Flüssigkeiten aus dem Transplantat (Urin, Lavage) oder peripherem Blut entweder mit einer lang anhaltenden guten Transplantatfunktion oder dem Auftreten von Rejektionen korreliert, wäre eine Beurteilung der toleranzinduzierenden Therapie besser möglich.
Die Expression von 2A5 und 2A15 kann in der Biopsie zur Beurteilung von akuten subklinischen Rejektionskrisen und beginnender chronischer Rejektionen verwendet werden. Dabei wäre eine starke, lang anhaltende Expression mit einer Rejektion des Organs assoziiert. Dies ist nur bedingt abhängig vom Ausmaß der Infiltration mononukleärer Zellen in das Transplantat, da in anti-CD4 behandelten toleranzentwickelnden Empfängertieren im Nierentransplan- tationsmodell die Infiltration der mononukleären Zellen nur zu 50% reduziert ist. Dies würde die Auswertung einer Biopsie erheblich verbessern, da nicht nur die Infiltration in das Organ als Kriterium für eine akute Abstoßung herangezogen wird, sondern auch qualitative Veränderungen der infiltrierenden Zellen. Die Expression von T4, T5, T10, 3A29, T8 und 1A50 in der Biopsie kann z.B. zur Beurteilung des Therapieerfolges herangezogen werden. Dies würde eine Entscheidung über die sichere Beendigung der toleranzinduzierenden Therapie ermöglichen.
Der starke Expressionsabfall von 1A50 und T8 in der Peripherie in rejizierenden Empfängertieren mehr als 2 Tage vor klinischer Manifestation der Rejektion ermöglicht eine non-invasive Diagnostik im Blut- des Patienten bevor eine Organvers.chl'echterung (z.B. Anstieg des Serumkreatinins) nachweisbar- ist .
Die Expression von 2A5 und 2A15 in der Biopsie kann zur Beurteilung von akuten klinischen und subklinischen Rejektionskrisen und beginnender chronischer Rejektionen verwendet werden. Dabei ist eine starke lang anhaltende Expression mit einer immunologischen Rejektion des Organs assoziiert. Dies ist nur bedingt abhängig vom Ausmaß der Infiltration mononukleärer Zellen in das Transplantat, da in anti-CD4 behandelten toleranzentwicklenden Empfängertieren im Nierentransplantationsmodell die Infiltration der mononukleären Zellen nur zu 50% reduziert ist . Dies verbessert die Auswertung einer Biopsie erheblich, da nicht nur die Infiltration in das Organ als Kriterium für eine akute Abstoßung herangezogen wird, sondern auch die qualitative Veränderung der infiltrierenden Zellen. Die Expression von T4, T5, T10, 3A29, T8 und 1A50 in der Biopsie wird zur Beurteilung des Therapieerfolges herangezogen. Dies ermöglicht eine Entscheidung über die sichere Beendigung der toleranzinduzierenden Therapie. Der starke Expressionsabfall von 1A50 und T8 in der Peripherie in rej izierenden Empfängertieren mehr als 2 Tage vor der Rejektion ermöglicht eine non-invasive Diagnostik im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, wie in dem Urin, der Patienten bevor eine Organverschlechterung, wie der Anstieg des Serumkreatinins, nachgewiesen • werden kann. Somit ist folgendes Diagnostikmodell nach der Transplantation erfolgreich: - 1. Nachweis von 1A50 und" T8 im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten (z.B. Urin) des Patienten täglich kurz nach der Operation und wöchentlich/monatlich im weiteren Verlauf, um eine Rejektionskrise und damit Fehlschlagen der Therapie vorherzusagen bzw. bei Absetzversuchen eine Untersuppression zu detektieren,
. bevor eine Organverschlechterung nachweisbar ist .
2. Nachweis von 2A5 und 2A15 in Kontrollbiopsien oder transplantatrelevanten Körperflüssigkeiten (z.B. Urin bei Nierentransplantation) , um ebenfalls Rejektionskrisen bzw. eine Untersuppression rechtzeitig zu detektieren und die Gefahr der Entwicklung einer chronischen Abstoßung vorherzusagen.
3. Nachweis von T4, T5, T8, T10, 1A50 _und 3A29 in Kontrollbiopsien oder transplantatrelevanten Körperflüssigkeiten, um den Erfolg der toleranzinduzierenden oder konventionellen Therapie einzuschätzen, insbesondere, um das gefahrlose Absetzen/Reduzieren der Therapie zu ermöglichen.
Beispiel 2
In einem weiteren Tiermodell für Toleranz wurden Biopsien t von Mäusen untersucht, die spontan, d.h. ohne medikamentöse
Beeinflussung allogene Lebern akzeptieren
(Lebertransplantate von BIO Mäusen auf CBA Empfängermäuse), d.h. eine spontane Toleranz entwickeln - ein Phänomen, dass auch nach allogener Lebertransplantation nach einigen
Jahren auftreten kann. Am Tag 0-, 1,2,5,7,8,10,40,100 nach Transplantation wurden in den Transplantaten dieselben Marker wie zuvor nach Nieren- bzw. Herztransplantation untersucht. Abb. 7 fasst die Ergebnisse vergleichend zusammen. Die Spontantoleranz mit transienter selbstlimitierender Abstoßungskrise in diesem Modell spiegelt sich in einer stabil hohen Expression der Toleranz-Marker T8 und 1A50 über den gesamten Beobachtungszeitraum sowie einem nur temporären Anstieg der Rej ektionsmarker 1A6, 2A5, 2A15 in der ersten ' Woche nach Transplantation wider.
Dies unterstreicht in einem weiteren experimentellen Modell die klare Assoziation der Expression der genannten Marker mit Toleranz bzw. Rejektion.
Beispiel 3
Im beschriebenen Maus-Herztransplantationsmodell konnte gezeigt werden, dass ein Großteil der Herzen nach Toleranzinduktion mit beschriebenen Protokoll langfristig überlebt, dass jedoch einige Herzen Zeichen einer chronischen Rejektion . entwickeln, die mit einer Funktionseinschränkung einhergehen. Diese kann durch den "Herzpalpationscore" (palpatorische Bestimmung der Stärke und des Rhythmus' des Herzschlages) bestimmt werden, wobei ein hoher Score (>3) eine gute Herzfunktion bedeutet. Im Doppelblindansatz wurden Herzpalpationsscore und Expression der Toleranzmarker T8 und 1A50 vergleichend bestimmt und gegeneinander- korreliert (Abb. 8) . Es ergab sich eine klare Korrelation zwischen der Herzfunktionsfähigkeit und der Expression von T8 (r=0,785) bzw. 1A50 (r=0,784). Dies bedeutet, dass die beiden Toleranzmarker sich sehr gut für die Voraussage einer inkompletten Toleranz, die zwar eine akute. Rejektion nicht aber die Entwicklung einer' chronischen Rejektion verhindert, eignen.
Beispiel 4
Zahlreiche Untersuchungen zeigen, dass für die Aufrechterhaltung einer stabilen peripheren Toleranz die Bildung von spezifischen regulatorischen CD4+ T-Zellen notwendig ist, die offenbar im toleranten Transplantat akkumulieren und dort die Aktivierung und Wirkung von Effektor-T-Zellen hemmen. Wie publiziert kann man auch in unseren Modellen mit Milzzellen und noch effektiver mit transplantatinfiltrierenden Zellen (TIZ) Toleranz auf naive Empfängertiere übertragen ("infectious tolerance") . Um zu prüfen, ob die benannten Toleranzmarker T8 und 1A50 in diesen Zellen überexprimiert sind, wurden die TIZ mittels Kollagenaseverdaus aus den Transplantaten isoliert, mittels spezifischer Antikörper sortiert und hinsichtlich ihrer Genexpression charakterisiert. Die Daten zeigen, dass 1A50 und noch stärker ausgeprägt T8 in TIZ von Transplantaten toleranter Tiere im Vergleich zu denen rejezierender Tiere stark überexprimiert ist und dass diese Expression in sortierten CD4+ TIZ nachweisbar wird (Abb. 9) . Dies weist daraufhin, dass offenbar transplantatinfiltrierende regulatorische T-Zellen diese Toleranzmarker exprimieren. Beispiel 5
Es wurden die humanen Homologe der genannten Sequenzen identifiziert. Es wurde nun geprüft, ob die Marker mittels real-time RT-PCR auch in Biopsien und Blutleukozyten von nierentransplantierten Patienten detektierbar sind. ,1A50, 2A5, 2A15 waren in allen Biopsien bzw. Blutproben nach Nierentransplantation nachweisbar. Patient 1 entwickelte eine akute Abstoßung am Tag 23 nach Lebendspendetransplantation. Zu diesem Zeitpunkt konnte eine Abnahme des Toleranzmarkers 1A50 und eine Zunahme des Rejektionsmarkers 2A15 in den peripheren Leukozyten beobachtet werden (Abb. 10) . Patient 2 zeigte einen komplikationslosen Verlauf und kaum Schwankungen in der Expression dieser Marker.
Weiterhin wurden Biopsien aus den Transplantaten nierentransplantierter Patienten mittels real-time RT-PCR analysiert . Patient 3 und 4 zeigten in Biopsien Zeichen einer subklinischen Rejektion Banff - Grad Ia bzw. Ib. Der Toleranzmarker 1A50 war bei Rejektion relativ niedrig exprimiert (besonders Patient 4) im Vergleich zu Biopsien von Patienten mit stabiler Funktion und ohne Zeichen einer Abstoßung" im Transplantat (Patient 5+6) (Tabelle 1) . Im
Gegensatz dazu, war die Expression des 2A15 f Rejektionsmarkers am höchsten in den beiden Proben m t
Rejektion (Patient 3+4) und deutlich niedriger bei normaler Funktion (Patient 5+6) . 2A5 war ähnlich detektierbar zeigte aber geringere Unterschiede . 3?
Damit bestätigen die ersten Patientendaten, dass die Gene auch im Humansystem detektierbar- sind und dass sich ihre Regulation sehr ähnlich zu der in den Tiermodellen verhält.
Tabelle 1: Genexpression in Nierenbiopsien transplantierter Patienten
Patient Transplantatfunktion Genexpression (Units Ratio zu HPRT)
Nr. 1A50 (x10-1) 2A15(x10"1) 2A5(x10"1)
3 akute Rejektion . 3,0 5,2 0,2
4 akute Rejektion 1,8 4,0 0,2
5 stabil normale Funktion 5,5 0,4 0,1
6 stabil normale Funktion 7,9 0,2 0,1
7 Kontrollniere
(kein Transplantat) 4,0 0,2 0,1

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Nucleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend:.
a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 - 8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleinsäuremolekül, welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) - c)- degeneriert ist und
e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist .
2. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die unter c) angegebene Nucleotidsequenz mindestens 40% homolog zu einer der unter a) angegebenen Nucleotidsequenz ist .
3. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die unter c) angegebene Nucleotidsequenz mindestens 60%,- vorzugsweise 70%, bevorzugt 80%, ganz besonders bevorzugt 90% homolog zu einer der unter a) angegebenen
Nucleotidsequenz ist.
4. Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine genomische DNA, eine cDNA und/oder eine RNA ist.
5. Vektor umfassend ein Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,
6. Wirtszelle umfassend den Vektor gemäß Anspruch 5.
7. Polypeptid, kodiert durch ein Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
8. Erkennungsmolekül gerichtet gegen ein Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß
Anspruch 6 und/oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7.
9. Erkennungsmolekül nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, dass es ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein
Antisense-Konstrukt ist, insbesondere ein RNA- Interferenzmolekül .
10. Vakzine, umfassend ein Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 , einen Vektor gemäß Anspruch 5 , eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6 und/oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7.und/oder ein Erkennungsmolekül nach Anspruch 8 oder 9 gegebenenfalls mit einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
11. Verfahren zur Detektion von Transplantat-Reaktionen in einer Probe von einem Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass in der Probe ein Level von mindestens einem Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Anspruch 1 bis 4 bestimmt und der Level mit einem Kontroll-Level einer
Vergleichsprobe von einem gesunden Patienten verglichen t wird, wobei durch einen modifizierten Level in der Probe im Vergleich zu dem Kotroll-Level die Transplantat-Reaktionen bzw. das Fehlen selbiger
(Toleranz) detektiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Transplantat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Milz, Herz, Niere, Leber, Pankreas allein oder in Kombination und/oder von Geweben, insbesondere Inseln, Aorten, Knorpel.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass als der Level eine DNA-, eine RNA-Konzentration, eine Genexpression, eine Kopienanzahl einer Nucleinsäure, eine Peptidkonzentration, eine Peptidaktivität und/oder eine Konzentration von Isoformen, bestimmt werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Level als eine mRNA-Konzentration bestimmt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass als die Transplantatreaktion eine Rejektionskrise, eine
Abstoßungsreaktion, ein Abstoßungsverlauf, eine-
Toleranzreaktion und/oder ein Toleranzverlauf j detektiert werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass durch einen verminderten Level eines
Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 7 oder deren komplementären
Nucleotidsequenzen die Abstoßungsreaktion, der Abstoßungsverlauf und/oder die Rejektionskrise detektiert wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass durch einen erhöhter Level eines Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz- ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID 1 und Nr. SEQ 2 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen die
Abstoßungsreaktion, der Abstoßungsverlauf~ und/oder die Rejektionskrise detektiert wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass durch einen erhöhter Level eines Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen die Toleranzreaktion oder der Toleranzverlauf detektiert wird .
19. Verwendung eines nucleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis' 4, eines Vektor gemäß Anspruch 5, einer Wirtszelle . gemäß Anspruch 6, eines Polypeptid gemäß
Anspruch 7, eines Erkennungsmolekül nach Anspruch 8 oder 9 und/oder einer Vakzine gemäß Anspruch 10 in der medizinischen Prophylaxe, klinischer Verlaufskontrolle, Transplantat-nachbehandlung, klinischer Diagnostik und/oder Therapie .
20. Verwendung nach Anspruch 19 zur Detektion von T-Zell- vermittelten Immunprozessen, insbesondere pathogenen T- Zell-vermittelten Immunprozessen.
21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet dass die T-Zell-vermittelten Immunprozesse^ Autoimmunerkrankungen oder Entzündungen sind, insbesondere eine antiglomeruläre Basalmembrankrankheit, Autoimmunkrankheiten des Nervensystems, ein systemischer Lupus erythematodes, eine Addison-Krankheit, ein Antiphospholipid-Syndrom, eine IgA-Glomerulonephritis, ein Goodpasture-Syndrom, ein Lambert-Eaton-Myasthenie- Syndrom, ein bullöses Pemphigoid, eine thrombozytopenische, idiopathische Purpura, eine Autoimmun-Thyreoiditis, eine rheumatoide Arthritis, ein insulinabhängiger Diabetes mellitus, ein Pemphigus, eine autoimmunhämolytische Anämie, ein Dermatitis herpetiformis DUhring, eine membranöse
Glomerulonephritis, eine Graves- rankheit, eine sympathische Ophthalmie, Autoimmun-Polyendo- krinopathien, multiple Sklerose und/oder Reiter-
Krankheit .-
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet dass die T-Zell-vermittelten Immunprozesse physiologische, pathologische, klinische und/oder subklinische Transplantat-Reaktionen sind.
23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Transplantat-Reaktionen eine Rejektionskrise, eine Abstoßungsreaktion, ein Abstoßungsverlauf, eine Toleranzreaktion und/oder ein Toleranzverlauf.
24. Kit umfassend ein Nucleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6, ein Polypeptid gemäß Anspruch 7, ein Erkennungsmolekül nach Anspruch 8 oder 9 und/oder eine Vakzine gemäß Anspruch 10.
25. Verwendung des Kits nach Anspruch 24 zur Detektion einer Transp1antatreaktion.
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