EP1514240A2 - Procede d analyse d image pour la mesure du signal sur des biopuces - Google Patents

Procede d analyse d image pour la mesure du signal sur des biopuces

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Publication number
EP1514240A2
EP1514240A2 EP03760739A EP03760739A EP1514240A2 EP 1514240 A2 EP1514240 A2 EP 1514240A2 EP 03760739 A EP03760739 A EP 03760739A EP 03760739 A EP03760739 A EP 03760739A EP 1514240 A2 EP1514240 A2 EP 1514240A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
signal
image
spots
pixels
spot
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03760739A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas Ugolin
Olivier Alibert
Sylvie Chevillard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US10/173,672 external-priority patent/US7136517B2/en
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1514240A2 publication Critical patent/EP1514240A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to an image analysis method for measuring the signal on biochips.
  • a biochip consists of a small solid support, generally a microscope slide, on which are grafted or synthesized in situ, at well-defined positions, DNA probes specific for cell gene sequences.
  • the probes are grouped into a spot of a few square micrometers which contains approximately 10 9 identical molecules. All the spots thus form a two-dimensional matrix which can reach a complexity of 10 6 spots / cm 2 , as described in the document referenced [1] at the end of the description.
  • the type of addressing of the probes on the support, as described in the document referenced [2] can vary and therefore impose a particular geometry:
  • probes already synthesized by mechanical or electrochemical addressing are removed and placed on the slide by means of micropipettes or robotic needles.
  • the support can be structured or unstructured.
  • a biochip consisting of a matrix of wells having gold electrodes. Electropolymerization is carried out on each electrode between a normal pyroleum and a pyroleum on which a probe has been covalently attached.
  • the probes are, for example, deposited by a robot which has a printhead with several needles, or rings.
  • a robot with several rings, for example 4 makes it possible to take a small volume of the samples, the deposit itself being made by a small point which crosses the ring before coming into contact with the surface of the blade.
  • a system robot of several, for example 48, hollow or solid needles makes it possible to take the samples and deposit them on the surface of the support.
  • the geometry of the deposit depends on the geometry of the robot head, the type of plates used to store the probes, the size of the needles, the steps between each spot, etc. We generally obtain a set of spots grouped in several blocks separate, each block corresponding to a needle.
  • FIG. 1 illustrates a deposit made with a head with four needles or rings with probe plates 10 and a biochip 11. After the reading of the slide by a scanner, the intensity (or the intensities if a mixture was initially co -hybridized) fluorescence is (are) quantified (s) at each spot.
  • the acquisition of the images then consists in producing a digital image of the biochip after excitation in order to measure the intensities of the different fluorescence signals.
  • the biochip is read by a scanner fitted with excitation lasers corresponding respectively to the absorption wavelengths of the fluorochromes used.
  • the fluorescence intensity is measured by a photomultiplier.
  • the quality and resolution of the images obtained depend on the scanner used. Different types of devices can be used, confocal and non-confocal scanners, CCD camera scanners ...: - a confocal scanner has a high quality lens system allowing to excite a small surface x, y over a small depth of field around the focal plane.
  • the fluorescent emissions from this region are recovered at a point on the photomultiplier, this region corresponding to approximately one pixel of the image. Only the signal contained in the focal plane is read, everything outside this slice and this precise region does not reach the detector. Spurious signals, such as dust, are minimized if they are not in the focal plane of the lens. Otherwise, there is no mixing between the signals of two neighboring regions. The dust is therefore well insulated and can possibly be removed by further treatment. On the other hand, the acquisition plane being very thin, it may be necessary to carry out several passages on the slide to correct the reading errors of the photomultiplier and obtain less noisy images.
  • - a non-confocal scanner does not allow such precise focusing.
  • the recovered signal comes from a larger region and incorporates a large thickness of the blade.
  • the intensity recovered at a specific point of the photomultiplier corresponds to an average in a certain neighborhood. There is therefore a signal dilution.
  • the image is therefore very smooth and less contrasted, - a CCD camera scanner uses a high-precision camera for image acquisition.
  • the quality of the image directly depends on the acquisition time. This reading step is very important.
  • a good compromise between the contrast, the intensity of the background noise, and the resolution is essential to apprehend the difficulties of image analysis (location of spots, location of dust, segmentation of signals ...) and to optimize reliability results.
  • the precision and resolution of the scanner are determining factors for the analysis of DNA microarrays.
  • a digital image is obtained, for example, in a 16-bit Tiff format
  • Tag-based Image File Format This format allows a good compromise between the size of the files to be stored and the quality of information, that is to say the number of intensity levels capable of being coded. It is therefore widely used to save images from many scanners.
  • Tiff format is not specific to any system, it is easily manipulated and allows the addition of additional private information.
  • each pixel is discretized on a scale of 65536 gray levels, from the lowest intensity (0) to the strongest (65635).
  • a pixel is the smallest measurable area on the image. Its intensity represents the average fluorescence emitted by the surface of corresponding resolution on the biochip. It is the smallest hybridization unit measurable on an image of this type.
  • the intensity is proportional to the number of cDNA molecules attached to the corresponding region of the slide.
  • On a spot the density of the molecules is not necessarily homogeneous.
  • the spots which are composed of a variable number of pixels of different intensities, can present a very heterogeneous signal. As illustrated in FIG. 2, an image is in the form of a large number of spots whose relative addresses are perfectly listed.
  • spot Finding Problem The difficulty in automating a precise procedure for locating spots on the image of the biochip (Spot Finding Problem) comes from three main constraints:
  • each spot is composed of a variable number of pixels of heterogeneous intensity. This is due, on the one hand, to the method of depositing the probes which, depending on the robots used, generates more or less circular spots and, on the other hand, to the amount of cDNA which hybridizes on the probes .
  • the spots can have the shape of a ring, a disc or else consist of a set of small heterogeneous sub-regions.
  • the software for extracting fluorescence signals of the known art are most often based on four steps:
  • the localization of hybridization zones begins, in some software, with the semi-automatic placement of a grid. It is necessary to manually position each block of spots on the image. For each block, it is then necessary to provide the precise parameters of the two-dimensional matrix which constitutes it (number of lines, number of columns, steps between spots, spot size) in order to place a grid. By combining these geometric parameters and a protected analysis, the image is segmented into thumbnails inside which a more or less circular mask of variable size delimits the hybridization zone. This mask is centered on the maximum intensity. In software described in the document referenced [6], the spot location method is a little more automated and more reliable.
  • the measurement of the fluorescence intensity of the spots is imposed by the software used and is not necessarily suitable for the type of deposit used.
  • the object of the invention is therefore to solve the problems set out above, by proposing an image analysis method for measuring the reaction rate of the probes on a biochip.
  • the invention relates to an image analysis method for measuring the signal on biochips organized in one or more blocks each comprising a large number of spots each composed of at least one probe, said method comprising the following steps: - a deposit is made with a constant step, the spots appearing in the form of a periodic and regular signal,
  • this periodicity property is used to locate the blocks and the spots, this periodicity being sought on the x and y projections of the image, characterized in that it further comprises the following step:
  • - degrading filters are used to increase the contrast of the image in order to position the spots using the periodic properties of the image, on the one hand, and non-degrading filters to minimize variations due to background noise and spot signal to amplify each spot.
  • one uses averaged orthogonal projections with two axes x and y of the plane of the biochip making it possible to amplify the periodic signal, and one thus obtains two histograms H j and ⁇ f ⁇ .
  • FFTD discrete one-dimensional Fourier transform
  • a variable threshold can be applied to the two histograms R.
  • a window of width ⁇ 0 and length 2 ⁇ 0 is used centered on the global cutting line, which makes it possible to locally explore the presence of signals that are too intense, which are therefore suspect, and possibly redefine the block limit around signals.
  • the window can be extended by ⁇ 0/2 on one side of the limit then on the other, if there is an increase in the signal only for one of the two extensions of the window, the block boundary is moved by ⁇ 0 in the adjacent block for which there has been no signal increase, if there is no signal increase or if the signal has increased for the two displacements, this means either that it is a parasitic signal, or that the two blocks are very close, in these two cases we calculate the probability of belonging to the signal to the right and to the left of the cutting line, and we obtain P ( ⁇ ) for each half-projection with and without suspect signal, the gain obtained being equal to:
  • the signal considered is assigned to it by displacement of the cutting line by ⁇ 0/2 in the adjacent block; if, for neither of the two blocks, the gain is not greater than 1, it is a parasitic signal, the cutting line is not moved; if the gain is greater than 1 for the two half-projections, the signal is in phase with the two half-projections, the blocks are therefore close and in phase and the signal is allocated to the block for which the gain is the greatest, by displacement of the section line of ⁇ 0/2 in the adjacent block.
  • the binarized projection can be convolved by a sinusoidal function taken on ⁇ 0 such that:
  • an image with a high resolution is produced, then the resolution of the image is artificially reduced by replacing n neighboring pixels. by the average of the n pixels which thus makes it possible to reduce the size of the image of n, and a homogeneity filter is applied to eliminate the pixel which exhibits the greatest heterogeneity with respect to the adjacent pixels.
  • sorting the pixels within each spot makes it possible to identify the different types of pixels present: background noise, hybridization signal, spurious signal.
  • an algorithm is applied
  • Modified EM in which we narrow the classes and we introduce the notion of pixel not belonging to any class, by applying a threshold on the calculated probability that it belongs to one of the two or three main classes.
  • An initialization step which consists of the construction of a fuzzy distribution table Ci (k) of the pixels
  • An estimation step in which the new fuzzy distribution table is calculated
  • the invention relates to an image analysis method which comprises the following steps:
  • a step of automatic segmentation of the spot for. determine the pixels. representative of the reaction, and calculation of an evaluator of the spot signal by the mean, the median etc.
  • a method is used based on the location of the local loss of the periodic signal, such as the power of the Fourier transform of the signal of the projection of the spots along the axes by lines or by columns.
  • a first filter makes it possible to straighten the image, if necessary, by aligning the spots of a same block.
  • a second filter can also amplify the signals coming specifically from the spots and level the other types of signals.
  • the position of each block in the image is refined.
  • Figure 1 illustrates a probe deposition made with a device of known art.
  • Figure 2 illustrates a typical image of a chip.
  • FIG. 3 illustrates different types of spots obtained.
  • Figure 4 illustrates a Hi histogram
  • FIG. 5 illustrates a diagram of
  • Figure 7 illustrates an original image
  • Figure 8 illustrates a cut image
  • Figure 9 illustrates an image of a block.
  • Figure 10 illustrates a Hi histogram.
  • Figure 11 illustrates an alignment of the projections with a sinusoid.
  • Figure 12 illustrates a Hi histogram
  • Figure 13a illustrates a histogram after digital reconstruction.
  • Figure 13b illustrates a binarized histogram.
  • Figure 14a illustrates a projection and a sinusoidal function before adjustment.
  • FIG. 14b illustrates a projection and a sinusoidal function after adjustment.
  • FIG. 15 illustrates an example of a grid placed automatically on a block.
  • FIG. 16 illustrates an example of spots obtained with mechanical deposition.
  • Figure 17 illustrates the distribution of pixels in a spot.
  • FIGS. 18a to 18d illustrate different images of the same spot acquired under four different conditions, FIGS. 18c and 18d being filtered under different conditions.
  • FIG. 19 illustrates an example of a graph obtained by comparing, pixel to pixel, two images of the same spot taken at different wavelengths (different hybridization conditions).
  • FIG. 20 illustrates an estimate of the different populations of pixels present in a spot with a conventional EM method.
  • Figure 21a illustrates one. application of the modified EM method to find the pixel classes with a convergence evaluated with log-likelihood.
  • Figure 21b illustrates an application of the modified EM method to find the pixel classes with convergence evaluated with RMS-log-likelihood.
  • Figure 22a illustrates an image before filtering.
  • FIG. 22b illustrates this image after degrading filtering.
  • FIGS. 23a, 23b and 23c illustrate flowcharts which respectively describe a complete processing for a single image, a complete processing for several images of different hybridization conditions of the same slide with overlapping of the images, and a minimum processing for an image with use to implement the method of the invention.
  • FIG. 24a represents an initial image of the chip
  • FIG. 24b represents an image of the background noise obtained by extrapolating the background noise at the spot level.
  • the method of the invention is an image analysis method for measuring the reaction rate of probes placed on a solid substrate forming a biochip organized in one or more blocks each comprising a large number of spots each composed of at least minus one probe.
  • the images obtained during the reading phase are composed of several blocks of spots relatively well aligned and arranged in a constant pitch.
  • the fixed geometry of the head of the robots used leads to the formation of blocks which can be approximated to homogeneous blocks x by y such as: 4 by 4 or 48 by 12, according to the number of needles available to this head. If the block is not homogeneous (blocks are missing at the end of the spot) the treatment will be done as a homogeneous block. Empty spot thumbnails will be eliminated later.
  • the deposit being made with a constant step the spots appear in the form of a periodic and regular signal. Between each block of spots, the signal periodicity is lost.
  • the method of the invention uses this periodicity property to locate the blocks and the spots.
  • This periodicity is sought on the row and column projections, respectively in x and y, of the image.
  • these projections cannot be used directly for all types of images. Delimitation of spot blocks
  • the blocks are more or less well aligned in x and in y. Average projections orthogonal to the axes make it possible to amplify the main periodic signal, the singular artefactual signals being minimized. Two histograms R. and
  • Ai, j intensity of a pixel with coordinates ( ⁇ , j), ni and n j : dimensions of the axes as a function of the height and width of the image.
  • FFTD discrete one-dimensional Fourier transform
  • the interval can possibly be adjusted to the frequency of the deposit if it is significantly different.
  • a variable threshold is therefore applied to the two histograms H j and ⁇ .
  • the value of this threshold is determined in the following manner. For a first threshold value S0, arbitrarily fixed very low, the ratio is calculated: ⁇ (3)
  • FIG. 6 which illustrates the diagram of P ( ⁇ 0 ), at each of the calculation positions we obtain P ( ⁇ 0max ) along this window, for intensity values greater than the threshold that 1 'we have previously determined, with:
  • P (C0 0 ) When arriving at the inter-block regions, P (C0 0 ) passes through a minimum which makes it possible to identify the limits of the blocks.
  • the block limit is moved by ⁇ 0 in the adjacent block for which there has been no increase in the signal.
  • the cutting line is displaced by ⁇ 0/2 on either side of the cutting line and P ( ⁇ ) is calculated (equation 3) for each half-projection obtained.
  • Each movement alternately includes and then excludes the suspect signal at one of the half-projections. We therefore obtain P ( ⁇ ) for each half-projection with and without suspect signal. We can then calculate the gain obtained:
  • the signal considered is assigned to it by displacement of the cutting line by ⁇ 0/2 in the adjacent block. If, for neither of the two blocks, the gain is not greater than 1, it is a spurious signal. The cutting line is not moved. If the gain is greater than 1 for the two half projections, the signal is in phase with the two half projections. The blocks are therefore close and in phase and the signal is assigned to the block for which the gain is greatest, by displacement of the cut line by ⁇ 0/2 in the adjacent block. Definitive membership in a block is determined by the cardinal or parity rules described later. The limits of each block can thus be defined. To avoid any encroachment in the neighboring block during displacements of the cutting limit (indeed it may be necessary to move the limits by a quantity lower or greater than the proposed values) the displacement can be carried out by searching for minima premises in the direction of travel.
  • Figure 9 thus illustrates the image of a spot.
  • it is very important to isolate the extinct spots that is to say the areas where probes have been deposited, but where no labeled cDNA of the analyzed mixture has hybridized.
  • This absence of hybridization is important information for biologists.
  • FIG. 10 thus illustrates a histogram R ..
  • the projections are aligned using the least squares method with a sinusoid of equation:
  • the average amplitude A of the projections is calculated as follows:
  • the phase of the sinusoid is calculated by sliding along the profile of the histogram H A a sinusoidal pattern of amplitude A calculated over a period ⁇ 0 .
  • the RMS Root Minimum Square
  • Figure 11 illustrates the alignment of the projections with a sinusoid.
  • FIG. 13a thus illustrates the histogram H. after digital reconstruction
  • Figure 13b thus illustrates the H binarized histogram.
  • the applied sinusoidal function is optimized such that:
  • the reconstructed histogram makes it possible to find precisely the position of the spots presenting a strong contrast. By adding to it the information of the sinusoid which gives the theoretical positions, one can find all the spots presenting a contrast too weak to be detected.
  • the binarized projection is convolved by a sinusoidal function taken on ⁇ 0 such that: .lambda.o
  • H l ⁇ (A sin ( ⁇ time j) xHb l + J _ ⁇ 0I ) (il)
  • Figure 14a illustrates a projection and a sinusoidal function before adjustment.
  • Figure 14b illustrates the projection and the sinusoidal function after adjustment.
  • the missing spots correspond to the maxima of the sinusoidal function (9) which have not been assigned to the convolution function.
  • the position of the missing spots can therefore be deduced.
  • the phase and spot size rules defined below are applied:
  • a convolution function signal cannot be defined as a row or column of spots only if it is in phase with the maxima of the sinusoidal function (9),
  • FIG. 15 illustrates an example of a grid placed automatically on a block.
  • the blocks of a biochip are not necessarily the same size.
  • the number of rows and columns depends on the deposit strategy chosen, the rules chosen being adaptable to the particular strategy.
  • the homogeneity of the image obtained by DNA biochips depends on the type of deposit used: mechanical deposition or deposition by ink jet.
  • FIG. 16 illustrates an example of spots obtained with mechanical deposition.
  • FIG. 17 illustrates, in fact, the distribution of the pixels in the spot, The average of the intensity of the spot being calculated with the pixels greater than the average of the background noise pixels plus 1.5 times the standard deviation of the background noise .
  • FIG. 18 illustrates different images of the same spot acquired under four different conditions, for example with a Packard scanner, and normalized at the same intensity; a) a single image with 10 ⁇ m resolution, fast passage, gain ⁇ 100 PMT 100
  • FIGS. 18a and 18b the acquisition conditions are illustrated by FIGS. 18a and 18b.
  • a variant consists in producing several images with low excitation and weak detection, which are combined into a single image.
  • FIG. 18c there is a clear improvement, by a factor of 1.38, in the signal / noise ratio of the background noise or of the hybridization signals (see table 1 at the end of the description). This improvement is faster for the spot signal than for the background noise.
  • a variant consists in producing a high resolution image, then in reducing the resolution of the image artificially by replacing n neighboring pixels by the average of the n pixels. This reduces the size of the image of n.
  • a homogeneity filter can then be applied by eliminating the pixel which has the most great heterogeneity compared to adjacent pixels. Heterogeneity is estimated at more than 2 ⁇ (standard deviation) of the homogeneity estimator chosen.
  • the homogeneity estimator chosen is the average of a window of 16 pixels centered on the four pixels to be averaged, ⁇ being calculated on the same window of 16.
  • the four measurements carried out are independent. The probability that the same error will be made on all four pixels is very low. This gives an image with a noise intensity reduced by a factor of 1.8. In this case, the intensity of the background noise is reduced by a factor of 2.3 and the signal / noise ratio of the background noise or of the hybridization signals increases by a factor of 1.27. On the other hand, the average intensity and the variance of the hybridization pixels are only slightly modified, which results in a gain in the more modest signal / noise ratio by a factor of 1.12. Maintaining the hybridization signal and decreasing the average and the variance of the background noise by the proposed filter make it possible, as with accumulation, to decrease the intensity of the spot acceptance threshold. The problem of fluorescence quenching is thus eliminated.
  • An alternative consists in using a filter which, from an image at 10 ⁇ m resolution of the DNA chip, is not or little degrading for the signal contained at the spot level, and minimizes the variance of the background noise .
  • This filter increases the signal / noise ratio of the image spots and therefore increase the sensitivity of the chip.
  • This filter is based on thumbnails delimiting the border between the position of the spots and that of the background noise of the image.
  • thumbnails delimiting the border between the position of the spots and that of the background noise of the image.
  • the background noise image thus obtained is subtracted from the original image. The resulting image is used to quantify the spots as described below.
  • sorting the pixels within each spot makes it possible to identify the different types of pixel present: background noise, hybridization signal, parasitic signal.
  • a modification of this method makes it possible to narrow the classes and to introduce the notion of pixel not belonging to any class, by applying a threshold on the calculated probability that it belongs to one of the two or three main classes.
  • Figure 21a illustrates an application of the EM method thus modified, to find the pixel classes; convergence being estimated by the log likelihood with bg: estimated distribution of background noise, Real distribution: distribution of pixels of the hybridization signal, and offset: saturated pixel.
  • Figure 21b illustrates an application of the modified EM method to find the pixel classes; convergence being estimated by RMS-log- likelihood with bg: estimated distribution of background noise, Real distribution: distribution of pixels in the spot, and offset: saturated pixel.
  • the background noise is measured inside the spot, it is therefore no longer under or over rated, which eliminates the problem of negative spots.
  • the method consists in classifying the pixels into three classes iteratively. To achieve such a classification, the maximization of the parameters of a mixture is used.
  • the pixels are classified in two, then in three classes if necessary: background noise, hybridization signal and possibly saturated pixels.
  • the first step consists in the construction of a fuzzy distribution table Ci 0 (k) of the pixels, where i is the intensity and k the class.
  • This table illustrated in table 2 at the end of the description, is constructed in such a way that the value 1 is assigned for the background noise class and 0 for the class of the hybridization signal for pixels whose intensity is less than the background noise value + 2 sigma (taken as a reference outside the spot).
  • the fuzzy distribution table Ci 0 (k) takes a value of 0 for the noise class background and 1 for the signal class, for pixels whose intensity is greater than the value of the background noise + 2 sigma (taken in reference outside the spot). At first, signals greater than 65500 are considered saturated and not taken into account.
  • - ni is the number of pixels with the intensity level i
  • Ci 0 (k) is the probability of assigning the intensity level i to class k and
  • Ci 0 (k) is the probability of assigning the intensity level i to class k
  • Steps 2 and 3 are repeated until the classification of the likelihood log defined as:
  • RMS log-likelihood is such that:
  • RMS l / R
  • R being the correlation coefficient between the theoretical distribution calculated from the mixture and the actual distribution curve.
  • the determination of the position of the spots is made all the more easily when there is contrast between background noise and spot signal. To increase this contrast, it is possible to use a degrading filter, which does not necessarily preserve the proportionality of the signals.
  • the image thus filtered is only used to find the position of the spots. Quantification is done from the raw image, or from the image filtered by a non-degrading filter.
  • - 500 and 65535 can be changed according to the amplitude of redistribution desired in the image.
  • the threshold is chosen so as to maximize equation (3):
  • a second "low pass" type filter assigns to each pixel (i, j) of the image the average of the signals of a window of (a + 1) side pixel centered on the pixel (i, j) such as:
  • FIGS. 22a and 22b show the results presented in FIGS. 22a and 22b, FIG. 22a illustrating an image before filtering, FIG. 22b illustrating this image after filtering.
  • FIG. 22a illustrating an image before filtering
  • FIG. 22b illustrating this image after filtering.
  • This amplification can be bidirectional by considering for example a cross of 2 ⁇ in height and 2 ⁇ in width, centered on ij such that:
  • the amplifying function can be any periodic function taking into account the period of the phenomenon sought.
  • the intensity of each pixel can be multiplied by a fraction of the power of the Fourier transform calculated in a window centered on the pixel considered.
  • I s pot being the average intensity measured at the level of the background noise
  • I bg being the average intensity of the background noise
  • ⁇ spo t being the standard deviation of the signal
  • ⁇ b g being the standard deviation of the background noise
  • the histogram of the first m lines of the image is calculated as follows:
  • each object found defines a class.
  • the EM method merges or does not combine the classes of the various objects and makes it possible to define the class of pixels of the hybridization signal while excluding parasitic pixels originating from dust, for example.
  • Figures 23a, 23b and 23c illustrate all the steps to be followed to quantify the spot, in three exemplary embodiments, respectively: a complete processing for a simple image, in which there are successively non-degrading filtering steps, filtering degrading, overall positioning of the blocks, refinement of the positioning of the blocks, delimitation of the spots, pixel segmentation of each spot and calculation of an intensity evaluator for each spot, - a complete processing for several images, of different hybridization conditions of the same support slide, with image superposition, which repeats the same steps as that of FIG. 23a with an image superposition step, - minimum processing for an image, in which there is no not the two preliminary filtering steps shown in Figure 23a.
  • H LO complete processing for a simple image, in which there are successively non-degrading filtering steps, filtering degrading, overall positioning of the blocks, refinement of the positioning of the blocks, delimitation of the spots, pixel segmentation of each spot and calculation of an intensity evaluator for each spot
  • Probe nucleic acid molecule whose sequence is complementary to a desired sequence. For DNA chips, they are immobilized on the support.
  • DNA or Deoxyribonucleic Acid molecule supporting genetic information.
  • MRNA Messenger Ribonucleic Acid. Molecular form in which the genetic message, encoded in genes, is transferred from the nucleus to the cytoplasm. This mRNA is used in the cytoplasm for the synthesis of a protein.
  • CDNA or complementary DNA single-stranded DNA, which is complementary to an mRNA obtained by reverse transcription. Unlike DNA, it lacks introns (non-coding sequences). It can also be in double strand form, by copying the first strand with a DNA polymerase.
  • Condition represents all of the RNA or cDNA extracted from cells in a particular state.
  • Sequencing process used to determine the order (sequence) of amino acids of a protein or bases in nucleic acids (DNA and RNA).
  • Retro-Transcription enzymatic reaction allowing the synthesis of a complementary DNA molecule from an mRNA molecule.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Molecular hybridization Effect of the pairing of two nucleic sequences. It is based on the principle of complementarity of nucleic bases, more particularly between DNA and the strand of RNA or cDNA. It can make it possible to highlight within a cell or a tissue, a nucleic acid sequence.
  • Differential hybridization competitive hybridization of molecules from two different samples.
  • Pixel Unit of intensity of the corresponding image, in the case of the scanner used in the laboratory, with an area of 5 or 10 microns depending on the resolution used.
  • Sage “Serial Analysis of Gene Expression” (Nelculescu et al. 1995). A technique for quantitatively measuring the transcriptome of a cell.
  • Genome All of the DNA of an individual or a species.
  • Transcriptome Set of messenger RNAs transcribed from the genome into a cell at an instant t.
  • Proteome Set of proteins in a cell at an instant t.

Landscapes

  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Image Analysis (AREA)

Abstract

L'invention concerne un procédé d'analyse d'image pour la mesure du signal sur des biopuces organisées en un ou plusieurs blocs comportant chacun un grand nombre de spots composés chacun d'au moins une sonde, ledit procédé étant qui comprend les étapes suivantes: on réalise un dépôt avec un pas constant, les spots apparaissant sous la forme d'un signal périodique et régulier, on utilise cette propriété de périodicité pour localiser les blocs et les spots, cette périodicité étant recherchée sur les projections en x et y de l'image, on utilise des filtres dégradants pour augmenter le contraste de l'image afin de positionner les spots en utilisant les propriétés périodiques de l'image, d'une part, et des filtres non dégradants pour minimiser les variations dues au bruit de fond et de signal des spots pour amplifier chaque spot.

Description

PROCEDE D'ANALYSE D'IMAGE POUR LA MESURE DU SIGNAL SUR
DES BIOPUCES
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention concerne un procédé d'analyse d'image pour la mesure du signal sur les biopuces.
Etat de la technique antérieure
Une biopuce est constituée d'un petit support solide, généralement une lame de microscope, sur lequel sont greffées ou synthétisées in situ, en des positions bien définies, des sondes d'ADN spécifiques de séquences de gênes cellulaires. Les sondes sont regroupées en un spot de quelques micromètres carrés qui contient environ 109 molécules identiques. L'ensemble des spots forme ainsi une matrice bidimensionnelle pouvant atteindre une complexité de 106 spots/cm2, comme décrit dans le document référencé [1] en fin de description. Le type d'adressage des sondes sur le support, comme décrit dans le document référencé [2], peut varier et donc imposer une géométrie particulière :
- la méthode de synthèse in situ d'oligonucléotides, par exemple par adressage photochimique, qui est connue sous le nom de VLSIPS ( "Very Large Scale Immobilised Polymer Synthesis") : Cette méthode permet de synthétiser rapidement un grand nombre de sondes différentes,
- la fixation de sondes déjà synthétisées par adressage mécanique ou électrochimique. Pour l'adressage mécanique, les sondes sont prélevées et placées sur la lame par 1 ' intermédiaire de micropipettes ou d'aiguilles robotisées.
Le support peut être structuré ou non structuré. Est connue, par exemple, une biopuce constituée d'une matrice de puits possédant des électrodes en or. On réalise sur chaque électrode une électropolymérisation entre un pyrolle normal et un pyrolle sur lequel a été fixée une sonde de façon covalente.
L'ensemble de ces méthodes de l'art connu conduisent à une matrice bidimensionnelle qui permet de cribler et de quantifier en une étape un mélange de plusieurs milliers de molécules d'ADNc préalablement marquées par un fluorochrome ou toutes autres molécules, comme décrit dans le document référencé [3] . Le taux d'hybridation en une position donnée est déterminé à partir de l'intensité du signal émis, ce qui indique simultanément la nature et la quantité de molécules qui étaient présentes dans le mélange de molécules marquées étudiées. Il est également possible d'étudier plusieurs conditions simultanément. Il faut dans ce cas, marquer chaque condition par un fluorochrome différent et les mélanger avant de les hybrider sur la biopuce. A l'étape de la lecture des lames, il y a alors autant d'images que de fluorochromes .
Dans une étape de fabrication d'une biopuce les sondes sont, par exemple, déposées par un robot qui possède une tête d'impression à plusieurs aiguilles, ou anneaux. Un tel robot de plusieurs anneaux, par exemple 4, permet de prélever un petit volume des échantillons, le dépôt lui-même étant fait par une petite pointe qui traverse l'anneau avant de rentrer en contact avec la surface de la lame . Un robot système de plusieurs, par exemple 48, aiguilles creuses ou pleines permet de prélever les échantillons et de les déposer sur la surface du support . La géométrie du dépôt dépend de la géométrie de la tête du robot, du type de plaques utilisées pour stocker les sondes, de la taille des aiguilles, des pas entre chaque spot, etc.. On obtient généralement un ensemble de spots regroupés en plusieurs blocs distincts, chaque bloc correspondant à une aiguille.
La figure 1 illustre un dépôt réalisé avec une tête à quatre aiguilles ou anneaux avec des plaques de sondes 10 et une biopuce 11. Après la lecture de la lame par un scanner, l'intensité (ou les intensités si un mélange a été initialement co-hybridé) de la fluorescence est (sont) quantifiée (s) au niveau de chaque spot .
L'acquisition des images consiste alors à réaliser une image numérique de la biopuce après excitation afin de mesurer les intensités des différents signaux de fluorescence. La biopuce est lue par un scanner muni de lasers d'excitation correspondant respectivement aux longueurs d'onde d'absorption du ou des fluorochromes utilisés. L'intensité de fluorescence est mesurée par à un photomultiplicateur. La qualité et la résolution des images obtenues dépendent du scanner utilisé. Diffèrent types d'appareils peuvent être utilisés, les scanners confocaux et non-confocaux, les scanners à caméra CCD ... : - un scanner confocal possède un système de lentilles de grande qualité permettant d'exciter une petite surface x, y sur une petite profondeur de champ autour du plan focal. Les émissions fluorescentes de cette région sont récupérées en un point du photomultiplicateur, cette région correspondant à environ un pixel de l'image. Seul le signal contenu dans le plan focal est lu, tout ce qui se trouve en dehors de cette tranche et de cette région précise n'arrive pas jusqu'au détecteur. Les signaux parasites, tels que des poussières, sont minimisés s'ils ne sont pas dans le plan focal de la lentille. Dans le cas contraire, il n'y a pas de mélange entre les signaux de deux régions voisines. Les poussières sont donc bien isolées et peuvent éventuellement être éliminées par un traitement ultérieur. En revanche, le plan d'acquisition étant très mince, il peut être nécessaire de réaliser plusieurs passages sur la lame pour corriger les erreurs de lecture du photomultiplicateur et obtenir des images moins bruitées.
- un scanner non confocal ne permet pas une mise au point aussi précise. Le signal récupéré provient d'une région plus grande et intègre une grande épaisseur de la lame. L'intensité récupérée en un point précis du photomultiplicateur correspond à une moyenne dans un certain voisinage. Il y a donc une dilution de signal. L'image est par conséquent très lissée et moins contrastée, - un scanner à caméra CCD utilise une caméra de haute précision pour l'acquisition de l'image. La qualité de l'image dépend directement du temps d'acquisition. Cette étape de lecture est très importante. Un bon compromis entre le contraste, l'intensité du bruit de fond, et la résolution est indispensable pour appréhender les difficultés d'analyse des images (localisation des spots, localisation des poussières, segmentation des signaux...) et pour optimiser la fiabilité des résultats. La précision et la résolution du scanner sont des facteurs déterminants pour 1 ' analyse des biopuces à ADN.
Afin d'optimiser cette étape il est possible d'utiliser une méthode de filtrage pour améliorer statistiquement la résolution de l'image.
En sortie de scanner, on obtient une image numérique, par exemple, dans un format Tiff 16 bit
("Tag-based Image File Format") . Ce format permet un bon compromis entre la taille des fichiers à stocker et la qualité d'information, c'est-à-dire le nombre de niveaux d'intensité capable d'être codé. Il est de ce fait très utilisé pour enregistrer les images provenant de nombreux scanners. De plus, un tel format Tiff n'est spécifique d'aucun système, il est facilement manipulable et permet l'ajout d'informations complémentaires privées.
L'intensité de chacun des pixels est discrétisée sur une échelle de 65536 niveaux de gris, de l'intensité la plus faible (0) jusqu'à la plus forte (65635) . Un pixel est la plus petite surface mesurable sur l'image. Son intensité représente la fluorescence moyenne émise par la surface de résolution correspondante sur la biopuce. C'est la plus petite unité d'hybridation mesurable sur une image de ce type. L'intensité est proportionnelle au nombre de molécules d'ADNc fixées sur la région correspondante de la lame. Sur un spot, la densité des molécules n'est pas forcément homogène. Les spots, qui sont composés d'un nombre variable de pixels de différentes intensités, peuvent présenter un signal très hétérogène. Comme illustré sur la figure 2, une image se présente sous la forme d'un grand nombre de spots dont les adresses relatives sont parfaitement répertoriées .
Le problème que se propose de résoudre 1 ' invention est :
- de localiser avec précision les zones d'hybridation afin de détecter chaque sonde et de quantifier son niveau d'hybridation. En effet, la localisation des spots est une des étapes limitantes dans l'automatisation du processus d'analyse d'image. Elle requiert une grande précision pour garantir la fiabilité et la reproductibilité des données d'hybridation. Il n'existe, dans l'art antérieur, aucun logiciel de localisation des spots/signaux entièrement automatique.
- de quantifier très précisément l'intensité de fluorescence due à la seule hybridation, en élimant les signaux provenant du bruit fond et d'éventuelles poussières ou signaux parasites.
La difficulté à automatiser une procédure de localisation précise des spots sur l'image de la biopuce ("Spot Finding Problem") provient de trois contraintes principales :
- l'existence de bruit diffus et d'artefacts: en effet la fluorescence de la lame, des sondes non hybridées ainsi que des poussières confèrent à l'image un bruit de fond anisotrope,
- la variabilité dans la position des spots,
- la géométrie incertaine des spots, En effet, chaque spot est composé d'un nombre variable de pixels d'intensité hétérogène. Ceci est du, d'une part, à la méthode de dépôt des sondes qui, selon les robots utilisés, génère des spots plus ou moins circulaires et, d'autre part, à la quantité d'ADNc qui s 'hybride sur les sondes. Comme illustré sur la figure 3, les spots peuvent avoir une forme d'anneau, de disque ou bien être constitués d'un ensemble de petites sous-régions hétérogènes.
Cette hétérogénéité dans la géométrie des spots et la présence de poussières ou d'artefacts sont gênants compte tenu de la taille des spots, et expliquent pourquoi les méthodes classiques de détection morphologique sont inefficaces. Ainsi, les méthodes basées sur la détection de contour, telles que définies dans le document référencé [4] , servant à la localisation des ADN radio-marqués sur des membranes de nylon, ou les méthodes développées pour la localisation des spots proteiques sur des gels 2D PAGE ne peuvent être appliquées à des spots de petite taille (environ 10 fois plus petit que les spots des membranes de nylon). L'existence de ces trois problèmes, à savoir la très petite taille des spots, leur morphologie imprécise et le bruit de fond anisotrope rendent ces méthodes inadaptées.
Les logiciels d'extraction des signaux de fluorescence de 1 ' art connu sont le plus souvent basés sur quatre étapes :
- une étape de délimitation de blocs,
- une étape de positionnement de grille,
- une étape de détermination des pixels appartenant à la zone d'hybridation,
- une étape de calcul d'un estimateur de l'intensité de fluorescence des spots (moyenne, médiane, etc, ... ) .
Tous ces logiciels nécessitent un paramétrage précis de la géométrie des zones d'hybridation.
Comme décrit dans le document référencé
[5], la localisation des zones d'hybridation commence, dans certains logiciels, par le placement semi- automatique d'une grille. Il est nécessaire de positionner manuellement chaque bloc de spots sur l'image. Pour chaque bloc, il faut ensuite fournir les paramètres précis de la matrice bidimensionnelle qui le constitue (nombre de lignes, nombre de colonnes, pas entre les spots, taille des spots) afin de placer une grille. En combinant ces paramètres géométriques et une analyse protégée, l'image est segmentée en vignettes à l'intérieur desquelles un masque plus ou moins circulaire de taille variable délimite la zone d'hybridation. Ce masque est centré sur le maximum d' intensité . Dans un logiciel décrit dans le document référencé [6] , la méthode de localisation des spots est un peu plus automatisée et plus fiable. Il est néanmoins nécessaire de fournir toutes les informations concernant la géométrie de dépôt des sondes, c'est-à-dire le nombre de lignes et de colonnes de chacun des blocs de 1 ' image . Les blocs sont isolés après la fourniture de la position du premier spot de l'image. La pré-grille est ensuite placée automatiquement autour des différents spots en fonction des paramètres fournis précédemment. Chaque vignette est analysée individuellement pour centrer au mieux la zone d'hybridation. Les spots n'ayant pas encore été réellement identifié, le centre de chaque spot est approché par le centre d'intensité de sa propre vignette, analogue au centre de masse. Par exemple, pour une image I avec des intensités de pixels I(x,y), le centre d'intensité en x est l'estimation :
Aucun de ces logiciels de l'art connu ne propose de solution complètement automatique pour les quatre étapes énoncées précédemment. L'étape de délimitation est particulièrement pénalisante. En effet, il faut apporter toute la connaissance sur la géométrie des dépôts et la plupart du temps positionner le bloc sur l'image. L'étape de positionnement de grille semi-automatique entraîne un manque de fiabilité important sur les zones de l'image faiblement contrastées. Or, pour réaliser des traitements analytiques les quantifications doivent être exactes et précises. Des imperfections de localisation sont d'inévitables sources d'erreurs. A l'issue de l'étape de calcul d'un estimateur de l'intensité de fluorescence des spots, une vérification minutieuse de l'ensemble de la biopuce est nécessaire. On constate en effet de nombreux problèmes dans les zones de faible contraste .
Toutes ces étapes d'initialisation, de vérification et de retouche peuvent prendre plusieurs heures et sont indispensables avant d'effectuer la quantification des spots. En laboratoire, une seule expérience peut être basée sur l'utilisation de plusieurs centaines de biopuces. Il est donc indispensable de développer un logiciel efficace et rapide, nécessitant un minimum d'interactions avec l'opérateur et réduisant le plus possible les étapes de vérification.
De plus, la mesure de l'intensité de fluorescence des spots est imposée par le logiciel utilisé et ne convient pas forcément au type de dépôt utilisé.
L'invention a donc pour objet de résoudre les problèmes énoncés ci-dessus, en proposant un procédé d'analyse d'image pour la mesure du taux de réaction des sondes sur une biopuce. Exposé de l'invention
L'invention concerne un procédé d'analyse d'image pour la mesure du signal sur les biopuces organisées en un ou plusieurs blocs comportant chacun un grand nombre de spots composés chacun d'au moins une sonde, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - on réalise un dépôt avec un pas constant, les spots apparaissant sous la forme d'un signal périodique et régulier,
- on utilise cette propriété de périodicité pour localiser les blocs et les spots, cette périodicité étant recherchée sur les projections en x et y de 1 ' image, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, l'étape suivante :
- on utilise des filtres dégradants pour augmenter le contraste de l'image afin de positionner les spots en utilisant les propriétés périodiques de l'image, d'une part, et des filtres non dégradants pour minimiser les variations dues au bruit de fond et de signal des spots pour amplifier chaque spot. Avantageusement, on utilise des projections moyennées orthogonales à deux axes x et y du plan de la biopuce permettant d'amplifier le signal périodique, et on obtient ainsi deux histogrammes Hj et ïf± . On peut utiliser ensuite la transformée de Fourier unidimensionnelle discrète (FFTD) pour identifier les fréquences principales en x et y de l'image, le maximum de la puissance de la transformée P(ω) donnant de répétition des spots en x et en y. Un seuil variable peut être appliqué aux deux histogrammes R. et
H± , le seuil optimal étant donné par la valeur qui
50 conduit au maximum de l'équation P(ωmax)/ P((ϋi) , la i=10 répartition de la périodicité λ étant ensuite examinée le long des deux histogrammes ïï. et H. , une fenêtre de taille 2 λo glissant le long de ces histogrammes. On explore localement les variations de la puissance de la transformée de Fourrier de ces histogrammes, les régions de perte de puissance correspondant aux régions inter-blocs, cette méthode fournissant une découpe globale de 1 ' image .
Afin de pouvoir délimiter finement les frontières de chaque bloc, on utilise une fenêtre de largeur λ0 et de longueur 2γ0 centrée sur la ligne de découpe globale ce qui permet d'explorer localement la présence de signaux trop intenses, qui sont de ce fait suspect, et éventuellement de redéfinir la limite des blocs autour des signaux. Pour ce faire, dans un premier temps la fenêtre peut être étendue de λ0/2 d'un coté de la limite puis de l'autre, s'il y a augmentation du signal uniquement pour une seule des deux extensions de la fenêtre, la limite de bloc est déplacée de λ0 dans le bloc adjacent pour lequel il n'y a pas eu d'augmentation du signal, s'il n'y a pas d'augmentation du signal ou s'il y a augmentation du signal pour les deux déplacements, cela signifie, soit qu'il s'agit d'un signal parasite, soit que les deux blocs sont très proches, dans ces deux cas on calcule la probabilité d'appartenance du signal à droite et à gauche de la ligne de découpe, et on obtient P(ω) pour chaque demi-projection avec et sans signal suspect, le gain obtenu étant égal à :
si le gain est supérieur à 1 pour l'une des deux demi- projections uniquement, le signal considéré lui est attribué par déplacement de la ligne de découpe de λ0/2 dans le bloc adjacent ; si, pour aucun des deux blocs, le gain n'est supérieur à 1, il s'agit d'un signal parasite, la ligne de découpe n'est pas déplacée ; si le gain est supérieur à 1 pour les deux demi- projections, le signal est en phase avec les deux demi-projections, les blocs sont donc proches et en phase et le signal est attribué au bloc pour lequel le gain est le plus fort, par déplacement de la ligne de coupe de λ0/2 dans le bloc adjacent.
Avantageusement pour isoler les spots éteints : - on réalise les histogrammes Hj et ΕLL , respectivement, pour les lignes et les colonnes d'un bloc,
- on applique une tranformëe FFTD sur les deux histogrammes de chaque bloc, le maximum de P(ω) donne la périodicité λ0 de la répétition des spots, et on aligne par la méthode des moindres carrés les projections avec une sinusoïde d'équation : Asin(ω0Xi + φ)
2π avec : - ωn = —- λ0
- A : amplitude moyenne des projections, - φ : déphasage à déterminer.
On peut appliquer ensuite à ces histogrammes un algorithme de reconstruction numérique, qui permet à partir des projections initiales de reconstituer un signal avec des amplitudes quasiment identiques, l'utilisation d'un seuil permettant ensuite de binariser l'histogramme reconstruit et de localiser les positions exactes des spots présents.
La projection binarisée peut être convoluée par une fonction sinusoïdale prise sur λ0 telle que :
λλθ0//22
Si = Σ∑ (A sin (ω time j)xHbi+j_λ , 4) j=0
et en recherchant les minima et les maxima de la fonction de convolution, il est alors possible de reconstruire automatiquement une grille englobant la totalité des spots détectables.
Avantageusement, on réalise plusieurs images a faible excitation et faible détection, qui sont cumulées en une seule image .
Avantageusement, on réalise une image à forte résolution, puis on diminue la résolution de l'image artificiellement en remplaçant n pixels voisins par la moyenne des n pixels ce qui permet de diminuer ainsi la taille de l'image de n, et un filtre d'homogénéité est appliqué pour éliminer le pixel qui présente la plus grande hétérogénéité par rapport aux pixels adjacents.
Avantageusement, un tri des pixels au sein de chaque spot permet de repérer les différents types de pixels présents: bruit de fond, signal d'hybridation, signal parasite. Avantageusement, on applique un algorithme
EM modifié dans lequel on rétrécit les classes et on introduit la notion de pixel n'appartenant à aucune classe, en appliquant un seuil sur la probabilité calculée qu'il appartienne à une des deux ou trois classes principales.
On peut avoir les étapes suivantes :
• Une étape d'initialisation, qui consiste en la construction d'une table de répartition floue Ci (k) des pixels, • Une étape d'estimation, dans laquelle on calcule la nouvelle table de répartition floue,
• Une étape de maximisation, dans laquelle on recalcule les paramètres de mélange θm, et ces deux dernières étapes sont réitérées jusqu'à la convergence de la classification du log-vraisemblance .
On peut introduire un nouvel estimateur de convergence basé sur la similarité ou la distance calculée entre la distribution réelle des pixels et la distribution recalculée à l'aide des paramètres de mélanges. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé d'analyse d'image qui comprend les étapes suivantes :
- une étape de filtrage de l'image pour diminuer le bruit de fond en altérant très peu le signal significatif, en augmentant le rapport signal sur bruit,
- une étape de filtrage dégradant augmentant le contraste de l'image entre le bruit de fond et le signal d'hybridation,
- une étape de localisation des blocs sur 1 ' image de la biopuce à partir des données externes du nombre de blocs en lignes et en colonnes ces deux données pouvant, dans certains cas, être omises, - une étape de détermination automatique de la position de chaque spot, y compris celle des spots pour lesquels il n'y a pas eu de signal car pas d'hybridation, au sein de son bloc,
- une étape de segmentation automatique du spot pour . déterminer les pixels . représentatifs de la réaction, et de calcul d'un évaluateur du signal du spot par la moyenne, la médiane etc.
Avantageusement , lors de 1 ' étape de localisation on utilise une méthode basée sur le repérage de la perte locale du signal périodique, tel que la puissance de la transformée de Fourier du signal de la projection des spots suivant les axes par lignes ou par colonnes .
Avantageusement, lors de l'étape de filtrage, un premier filtre permet de redresser l'image, si nécessaire, par alignements des spots d'un même bloc. Lors de l'étape de filtrage, un second filtre peut également amplifier les signaux provenant spécifiquement des spots et de niveler les autres types de signaux. Avantageusement, on affine la position de chaque bloc dans 1 ' image .
Brève description des dessins La figure 1 illustre un dépôt de sonde réalisé avec un dispositif de l'art connue.
La figure 2 illustre une image type d'une puce.
La figure 3 illustre différents types de spots obtenus.
La figure 4 illustre un histogramme Hi
(projection de l'image en colonnes).
La figure 5 illustre un diagramme des
P(G>i) . La figure 6 illustre un diagramme des
P(ω0).
La figure 7 illustre une image d'origine.
La figure 8 illustre une image découpée.
La figure 9 illustre une image d'un bloc. La figure 10 illustre un histogramme Hi .
La figure 11 illustre un alignement des projections avec une sinusoïde.
La figure 12 illustre un histogramme Hi .
La figure 13a illustre un histogramme après reconstruction numérique.
La figure 13b illustre un histogramme binarisé. La figure 14a illustre une projection et une fonction sinusoïdale avant ajustement.
La figure 14b illustre une projection et une fonction sinusoïdale après ajustement. La figure 15 illustre un exemple de grille posée automatiquement sur un bloc.
La figure 16 illustre un exemple de spots obtenus avec dépôt mécanique .
La figure 17 illustre la distribution des pixels dans un spot.
La figure 18a à 18d illustrent différentes images du même spot acquises dans quatre conditions différentes, les figures 18c et 18d étant filtrées dans des conditions différentes. La figure 19 illustre un exemple de graphe obtenu en comparant, pixel à pixel, deux images du même spot prises à des longueurs d'onde différentes (conditions d'hybridation différentes) .
La figure 20 illustre une estimation des différentes populations de pixels présents dans un spot avec une méthode EM classique.
La figure 21a illustre une. application de la méthode EM modifiée pour trouver les classes de pixel avec une convergence évaluée avec log- vraisemblance.
La figure 21b illustre une application de la méthode EM modifiée pour trouver les classes de pixel avec la convergence évaluée avec le RMS-log- vraisemblance . La figure 22a illustre une image avant filtrage. La figure 22b illustre cette image après filtrage dégradant.
Les figures 23a, 23b et 23c illustrent des organigrammes qui décrivent respectivement un traitement complet pour une image simple, un traitement complet pour plusieurs images de conditions d'hybridation différentes de la même lame avec superposition des images, et un traitement minimum pour une image à utiliser pour mettre en œuvre le procédé de l'invention.
La figure 24a représente une image initiale de la puce, et la figure 24b représente une image du bruit de fond obtenue par l'extrapolation du bruit de fond au niveau des spots .
Exposé détaillé de modes de réalisation
Le procédé de l'invention est un procédé d'analyse d'image pour la mesure du taux de réaction de sondes disposées sur un substrat solide formant une biopuce organisée en un ou plusieurs blocs comportant chacun un grand nombre de spots composés chacun d'au moins une sonde.
Les images obtenues lors de la phase de lecture sont composées de plusieurs blocs de spots relativement bien alignés et disposés selon un pas constant .
Dans le procédé de l'invention, en raison des difficultés existant dans les dispositifs de l'art antérieur les quatre étapes principales de l'analyse d'image énoncées précédemment, à savoir :
- délimitation des blocs de spots,
- positionnement d'une grille autour de chaque bloc pour trouver les zones d'hybridation,
- détermination des pixels appartenant au spot,
- calcul d'un estimateur de l'intensité de fluorescence du spot, sont traitées indépendamment en les automatisant le plus possible.
La géométrie fixe de la tête des robots utilisés entraîne la formation de blocs qui peuvent être approximés à des blocs homogènes x par y tels que : 4 par 4 ou 48 par 12, selon le nombre de d'aiguilles dont dispose cette tête. Si le bloc n'est pas homogène (il manque des blocs en fin de spot) le traitement se fera comme un bloc homogène . Les vignettes de spot vide seront éliminées par la suite. Le dépôt se faisant avec un pas constant, les spots apparaissent sous la forme d'un signal périodique et régulier. Entre chaque bloc de spots, la périodicité du signal est perdue.
Le procédé de l'invention utilise cette propriété de périodicité pour localiser les blocs et les spots. Cette périodicité est recherchée sur les projections ligne et colonne, respectivement en x et y, de l'image. Toutefois en raison des variations possibles dans l'image ces projections ne peuvent être utilisées directement pour tous les types d'images. Délimitation des blocs de spots
Les blocs sont plus ou moins bien alignés en x et en y. Des projections moyennées orthogonales aux axes permettent d'amplifier le signal périodique principal, les signaux artéfactuels singuliers étant minimisés. On obtient ainsi deux histogrammes R. et
Η. , tel que celui illustré sur la figure 4, pour l'ensemble des pixels des lignes d'une part, et des colonnes d'autre part.
avec :
Ai,j : intensité d'un pixel de coordonnées (ι,j) , ni et nj : dimensions des axes en fonction de la hauteur et de la largeur de l'image.
On peut utiliser ensuite la transformée de Fourier unidimensionnelle discrète (FFTD) pour identifier la fréquence principale de l'image. Cet outil mathématique est très utilisé en analyse d'image, son résultat étant la représentation frêquentielle de l'espace d'origine. Le choix de travailler sur les deux histogrammes Hj et H., est fait pour des raisons de rapidité, l'utilisation de la transformée FFTD 2D sur l'image entière étant en effet beaucoup trop lourde.
La puissance de la transformée P(ω) est calculée pour des ω tels que ω=2π/λ, λ étant compris, par exemple, dans l'intervalle [10 pixels, 50 pixels] correspondant respectivement à l'amplitude minimale et maximale de la distance entre les spots pour les robots utilisés :
Le maximum de P(ω) donne la valeur ω0, dont est déduite la périodicité λ0 de répétition des spots. La figure 5 illustre le diagramme des P(G)i) .
L'intervalle peut être éventuellement ajusté à la fréquence du dépôt s'il est significativement différent.
Le bruit de fond peut parasiter la périodicité λ0. Un seuil variable est donc appliqué aux deux histogrammes Hj et ^ . On détermine la valeur de ce seuil, de la manière suivante. Pour une première valeur de seuil S0, fixée arbitrairement très basse, on calcule le rapport : → (3)
1=10 où P(û)i) correspond au P(Cû) calculé pour les seules valeurs H±>S0 et où P(comax)= maP(ω). On augmente ensuite la valeur du seuil d'un pas fixé, et on réitère ce calcul. Le seuil optimal est donné par la valeur qui conduit au maximum de l'équation (3) ci-dessus.
La répartition de la périodicité λ est ensuite examinée le long des deux histogrammes H., et
Η.± . Une fenêtre de taille 2 λo glisse le long de ces histogrammes. Comme illustré sur la figure 6 qui illustre le diagramme des P(ω0), à chacune des positions de calcul on obtient P(ω0max) le long de cette fenêtre, pour des valeurs d'intensité supérieures au seuil que 1 ' on a déterminé précédemment, avec :
En arrivant aux régions inter-blocs, P(C00) passe par un minimum qui permet de repérer les limites des blocs .
Pour une image contenant n blocs sur un de ses axes, il existe n+1 espaces inter-blocs. Mais en raison des spots manquants, le signal P(ω0) peut passer par plus de n+1 minima. Les régions interblocs, correspondant à une absence totale de spots, génèrent les minima les plus faibles. Connaissant le nombres de blocs, il est donc aisé d'extraire les n+1 valeurs pertinentes sur les lignes et sur les colonnes. Il est alors possible, à partir d'une image d'origine que telle que celle illustrée sur la figure 7 de découper 1 ' image dans le nombre de blocs attendus, comme illustré sur la figure 8.
Toutefois, dans un grand nombre de cas les blocs ne sont pas bien alignés. Pour affiner les positions des limites de chaque bloc, on utilise une fenêtre qui glisse le long de la ligne de découpe de chaque bloc . Cette fenêtre a par exemple une longueur de 2 λ0, parallèle à la ligne de découpe entre deux blocs, et une largeur de λ0, perpendiculaire a la ligne de découpe. Cette fenêtre est centrée sur la ligne de découpe. Durant le glissement de cette fenêtre, si le signal moyen calculé à l'intérieur de celle-ci devient notablement supérieur au signal moyen le long de la ligne de découpe (par exemple la moyenne +2σ) , cette augmentation peut être due à la présence d'un ou plusieurs spots. On vérifie donc si le signal est en phase avec un des blocs, de part et d'autre de la ligne de découpe. Dans un premier temps la fenêtre est étendue de λo/2 d'un coté de la limite puis de 1 ' autre :
- S'il y a augmentation du signal moyen uniquement pour une seule des deux extensions de la fenêtre, la limite de bloc est déplacée de λ0 dans le bloc adjacent pour lequel il n'y a pas eu d'augmentation du signal.
- S'il n'y a pas d'augmentation du signal ou s'il y a augmentation du signal pour les deux déplacements, cela signifie, soit qu'il s'agit d'un signal parasite, soit que les deux blocs sont très proches. Dans ces deux cas on calcule la probabilité d'appartenance du signal à droite et à gauche de la ligne de découpe. Pour ce faire, on effectue une projection, parallèlement à la ligne de découpe considérée, de la bande de l'image correspondant à la hauteur de la fenêtre glissante. La bande correspond pour la dimension perpendiculaire à ligne de coupe à la juste apposition des deux blocs consécutifs et pour la dimension parallèle à la hauteur de la fenêtre glissante. On obtient alors une projection de la bande des deux blocs consécutifs. La ligne de découpe est déplacée de λ0/2 de part et d'autre de la ligne de découpe et on calcule P(ω) (équation 3) pour chaque demi-projection obtenue. Chacun des déplacements inclut puis exclut alternativement le signal suspect à une des demi-projections. On obtient donc P(ω) pour chaque demi-projection avec et sans signal suspect. On peut alors calculer le gain obtenu :
si le gain est supérieur à 1 pour l'une des deux demi- projections uniquement, le signal considéré lui est attribué par déplacement de la ligne de découpe de λ0/2 dans le bloc adjacent. Si, pour aucun des deux blocs, le gain n'est supérieur à 1, il s'agit d'un signal parasite. La ligne de découpe n'est pas déplacée. Si le gain est supérieur à 1 pour les deux demi- projections, le signal est en phase avec les deux demi-projections. Les blocs sont donc proches et en phase et le signal est attribué au bloc pour lequel le gain est le plus fort, par déplacement de la ligne de coupe de λ0/2 dans le bloc adjacent. L'appartenance définitive à un bloc est déterminée par les règles cardinales ou de parité décrites ultérieurement . Les limites de chaque bloc peuvent ainsi être définies. Pour éviter tout empiétement dans le bloc voisin lors des déplacements de la limite de coupe (en effet il se peut qu'il faille déplacer les limites d'une quantité inférieure ou supérieure aux valeurs proposées) le déplacement peut être effectué par la recherche des minima locaux dans la direction du déplacement.
Positionnement d'une grille autour de chaque spot
En raison de l'hétérogénéité dans la géométrie des spots, d'une possible absence d'hybridation en certains points, ainsi que de la présence de spots faiblement contrastés, une localisation basée sur une étude de morphologie mathématique sur l'image entière est difficile. La figure 9 illustre ainsi l'image d'un spot. En outre, il est très important d'isoler les spots éteints, c'est-à-dire les zones où des sondes ont été déposées, mais où aucun ADNc marqué du mélange analysé ne s'est hybride. Cette absence d'hybridation est une information importante pour les biologistes. On travaille à nouveau à partir des projections orthogonales sur les axes en utilisant les propriétés de périodicité du signal. Ainsi, on peut retrouver les positions des spots allumés et extrapoler les positions théoriques des spots éteints.
De la même façon que pour la localisation des blocs, on réalise les histogrammes ïï. et R. , respectivement, pour les lignes et les colonnes d'un bloc en lui appliquant les équations (1) . La figure 10 illustre ainsi un histogramme R..
Afin d'affiner la mesure de périodicité λ0 du signal des spots, on applique une tranformee FFTD sur les deux histogrammes de chaque bloc. Là encore, le maximum de P(ω) dans l'équation (2) donne la périodicité λ0 de la répétition des spots.
Dans le but de repérer les positions théoriques des zones d'hybridations (spots allumés ou éteints) on aligne par la méthode des moindres carrés les projections avec une sinusoïde d'équation :
- A : amplitude moyenne des projections, - φ : déphasage à déterminer.
L'amplitude moyenne A des projections est calculée de la manière suivante:
La phase de la sinusoïde est calculée en faisant glisser le long du profil de l'histogramme HA un motif sinusoïdal d'amplitude A calculé sur une période λ0. A chaque position, on calcule la valeur RMS ("Root Minimum Square") entre le motif et la projection.
ΛO , y2
RMSt = ∑ A[sm(ύj)- Hi+jj (7)
Le plus petit RMSi obtenu donne la position où le motif est le mieux aligné avec le signal d'une ligne de spot. A partir de cette position j, le déphasage obtenu est tel que :
φ ≈ -CÛO x j (8)
La figure 11 illustre l'alignement des projections avec une sinusoïde.
Pour localiser avec précision les positions moyennes des spots on identifie les maxima des histogrammes Rj et Ht , un histogramme H. étant illustré sur la figure 12.
Les valeurs des histogrammes sont donc centrées. On applique ensuite à ces histogrammes un algorithme de . reconstruction numérique, qui permet à partir des projections initiales de reconstituer un signal avec des amplitudes quasiment identiques. La figure 13a illustre ainsi l'histogramme H. après reconstruction numérique
L'utilisation d'un seuil permet ensuite de binariser l'histogramme reconstruit et de localiser les positions exactes des spots présents. La figure 13b illustre ainsi l'histogramme H binarisê.
Lors du dépôt, on peut observer une éventuelle déviance du spot qui entraîne un eloignement local entre la sinusoïde optimale et la projection elle même ou la projection binarisée.
Afin de rattraper cette divergence on optimise la fonction sinusoïdale appliquée telle que :
où le paramètre α corrige la sinusoïde sur la déviance de dépôts. La quantité α est choisie telle que :
st minimum
L'histogramme reconstruit permet de retrouver avec précision la position des spots présentant un fort contraste. En y ajoutant les informations de la sinusoïde qui donne les positions théoriques, on peut retrouver l'ensemble des spots présentant un contraste trop faible pour être détectés. Afin d'optimiser le recouvrement entre les positions théoriques (sinusoïde) et les positions réelles (projection binarisée) , la projection binarisée est convoluee par une fonction sinusoïdale prise sur λ0 telle que : ΛO
Hl = ∑ (A sin(ω time j)xHbl+J_λ0I ) (il)
/=o
La figure 14a illustre une projection et une fonction sinusoïdale avant l'ajustement.
La figure 14b illustre la projection et la fonction sinusoïdale après ajustement.
En recherchant les minima et les maxima de la fonction de convolution, il est alors possible de reconstruire automatiquement une grille englobant la totalité des spots détectables. La position des spots manquants est alors déduite par recoupement entre la fonction de convolution (équation 11) et la fonction sinusoïdale (équation 9) . Chacun des maxima de la fonction de convolution est attribué au maximum de la fonction sinusoïdale (9) minimisant la distance euclidienne telle que :
Les spots manquants correspondent aux maxima de la fonction sinusoïdale (9) qui n'ont pas été attribués à la fonction de convolution. La position des spots manquants peut donc être déduite. Pour éviter l'attribution de lignes ou de colonnes de spots supplémentaires aux extrémités des blocs, on applique les règles de phase et de taille de spot définies ci-après :
Un signal de la fonction de convolution ne peut être défini comme une ligne ou une colonne de spots que s'il est en phase avec les maxima de la fonction sinusoïdale (9) ,
Dans un premier temps, un maximum de la fonction de convolution (11) ne peut avoir un maximum
5 voisin compris entre i + λ0/4 et i+λ0/2 (ces seuils peuvent bien sûr être paramétrés en fonction du type de lame utilisée) ,
Enfin pour les maxima extrêmes de la fonction de convolution (délimitant un bloc de spots
10 sur l'axe des x par exemple) , on impose que la somme de la quantité centrée sur le maximum, définie comme :
(13) 15 avec nmax : le nombre de maxima répertorié
et les quantités centrées sur. les deux minima voisins de la fonction sinusoïdale définie comme :
20
(14) avec nmin : le nombre de minima répertorié soient tels que : RMSmaκ + RMSmin < Hmsκ
En appliquant ces règles, les extrémités 25 de chaque bloc peuvent être automatiquement délimitées .
Il reste maintenant à vérifier la première, respectivement la dernière, ligne et colonne de chaque bloc. En effet les blocs pour lesquels les spots en début de ligne ou de colonne sont éteints ne sont pas détectés.
Pour retrouver les positions de ces spots éteints on applique des règles cardinales entre les différents blocs. On calcule le nombre le plus probable de lignes et de colonnes de chaque bloc. Les blocs pour lesquels il manque une ligne ou une colonne se voient attribuer cette ligne ou cette colonne à une des extrémités du bloc à 1 ' aide de la fonction sinusoïdale (9) , de manière telle que cette ligne respectivement cette colonne supplémentaire minimise au mieux la distance euclidienne entre les fonctions sinusoïdales restreintes au nombre de spots des blocs situés au-dessus et en dessous, respectivement de part et d'autre, du bloc considéré. S'il manque plus d'une ligne ou plus d'une colonne aux extrémités, cette opération peut être réitérée le nombre de fois nécessaire.
La figure 15 illustre un exemple de grille posé automatiquement sur un bloc.
Les blocs d'une biopuce ne sont pas forcément de la même taille. Le nombre de lignes et de colonnes dépend de la stratégie de dépôt choisie, les règles choisies étant adaptables à la stratégie particulière.
Identification des pixels de chaque spot
Une fois trouvée la position des spots, les deux dernières étapes de l'analyse d'image doivent être effectuées . Ces étapes peuvent être ou non abordées indépendamment .
L'homogénéité de l'image obtenue par des biopuces à ADN dépend du type de dépôt utilisé: dépôt mécanique ou dépôt par jet d'encre.
Le problème à résoudre reste le même, c'est-à-dire déterminer pour chaque spot les pixels significatifs contenant le signal d'hybridation, le niveau du bruit de fond, et les pixels parasites. La figure 16 illustre un exemple de spots obtenus avec un dépôt mécanique.
Comme illustré sur la figure 17, une mauvaise estimation du bruit de fond et des pixels parasites entraîne une mauvaise estimation du signal. Cette figure 17 illustre, en effet, la distribution des pixels dans le spot, La moyenne de l'intensité du spot étant calculée avec les pixels supérieurs à la moyenne des pixels du bruit de fond plus 1.5 fois l'écart type du bruit de fond. Deux solutions à ce problème sont possibles :
- éliminer les spots présentant une trop grande distorsion par rapport à la valeur attendue, comme décrit dans le document référencé [7] , - ou sélectionner parmi les pixels d'un spot, ceux qui représentent réellement le signal d'hybridation,
Pour repérer au mieux le signal d'hybridation, il est important de disposer d'une image homogène, c'est-à-dire une image dont les pixels d'un même type soient peu dispersés (bruit de fond, signal d'hybridation). Une telle dispersion est due pour une grande part aux conditions d'acquisition, qui devraient permettre de détecter au mieux les signaux faibles et les signaux forts. La figure 18 illustre différentes images d'un même spot acquises dans quatre conditions différentes par exemple avec un scanner Packard, et normalisées à la même intensité ; a) une image unique avec 10 μm de résolution, un passage rapide, un gain ≈ 100 PMT 100
(échelle arbitraire) , b) une image unique avec 10 μm de résolution, un passage lent, un gain ≈ 80 PMT 80 (échelle arbitraire) , c) dix images indépendantes avec 10 μm de résolution, un passage rapide, un gain = 80 PMT 80 (échelle arbitraire) puis une superposition et une moyenne de l'image en une seule image, d) une image unique avec 5 μm de résolution, un passage rapide, un gain = 80 PMT 80 (échelle arbitraire) puis une réduction à 10 μm avec élimination du pixel le plus éloigné.
Sur cette figure il s'agit du même spot acquis dans quatre conditions différentes. Il apparaît qu'il est difficile d'appliquer une forte excitation et une forte détection et d'obtenir une image homogène avec un rapport signal/bruit élevé pour les spots faibles. En effet, les conditions d'acquisition sont illustrées par les figures 18a et 18b. Une variante consiste à réaliser plusieurs images à faible excitation et faible détection, qui sont cumulées en une seule image. Comme illustré sur la figure 18c, on observe une nette amélioration, d'un facteur 1,38, du rapport signal/bruit du bruit de fond ou des signaux d'hybridation (voir le tableau 1 en fin de description) . Cette amélioration est plus rapide pour le signal des spots que pour celui du bruit de fond. Le mélange ou recouvrement entre les signaux classés en bruit de fond et les signaux dus à "l'hybridation" diminue fortement avec l'accumulation des images. Toutefois avec la multiplication des acquisitions on observe un phénomène d'extinction de la fluorescence qui est plus important pour les signaux forts. Par contre l'intensité du signal est additive pour le bruit de fond, il peut donc en résulter une erreur sur l'estimation des signaux d'hybridation si l'accumulation est mal maîtrisée.
La variance du bruit de fond étant diminuée, le seuil d'acceptation des spots de faible intensité est abaissé. II n'est donc pas toujours souhaitable ou possible de réaliser plusieurs acquisitions de la même lame. Une variante consiste à réaliser une image a forte résolution, puis à diminuer la résolution de l'image artificiellement en remplaçant n pixels voisins par la moyenne des n pixels. On diminue ainsi la taille de 1 ' image de n.
La figure 18d illustre ainsi une image acquise à 5 μm ramenée a 10 μm grâce à cette variante, ce qui correspond à n = 4. Un filtre d'homogénéité peut alors être appliqué en éliminant le pixel qui présente la plus grande hétérogénéité par rapport aux pixels adjacents. L'hétérogénéité est estimée à plus de 2σ (écart type) de l'estimateur d'homogénéité choisi. Dans ce cas, l'estimateur d'homogénéité choisi est la moyenne d'une fenêtre de 16 pixels centrée sur les quatre pixels à moyenner, σ étant calculé sur la même fenêtre de 16.
Les quatre mesures réalisées sont indépendantes. La probabilité que la même erreur soit commise sur les quatre pixels est très faible. On obtient ainsi une image avec un intensité de bruit diminuée d'un facteur 1,8. Dans ce cas, l'intensité du bruit de fond est diminuée d'un facteur 2,3 et le rapport signal/bruit du bruit de fond ou des signaux d'hybridation augmente d'un facteur 1,27. En revanche, 1 ' intensité moyenne et la variance des pixels d'hybridation ne sont que très peu modifiées, ce qui entraîne un gain du rapport signal/bruit plus modeste d'un facteur 1,12. Le maintien du signal d'hybridation et la baisse de la moyenne et de la variance du bruit de fond par le filtre proposé permettent, comme pour l'accumulation, de diminuer l'intensité de seuil d'acceptation des spots. Le problème de l'extinction de fluorescence est ainsi éliminé.
Dans de nombreux cas, il n'est pas possible de réaliser un balayage (« scan ») de la puce à 5 μm de résolution. Une alternative consiste à utiliser un filtre qui, à partir d'une image à 10 μm de résolution de la puce à ADN, n'est pas ou peu dégradant pour le signal contenu au niveau des spots, et minimise la variance du bruit de fond. Ce filtre permet d'augmenter le rapport signal/bruit des spots de l'image et donc d'augmenter la sensibilité de la puce.
Ce filtre repose sur des vignettes délimitant la frontière entre la position des spots et celle du bruit de fond de l'image. Une fois les régions des spots délimitées sur l'image, pour chaque pixel inclus dans une vignette de spot, on considère une croix centrée sur le pixel, cette croix étant par exemple inscrite dans un cercle de diamètre 2λ. La moyenne Mv de la branche verticale de la croix est calculée pour les pixels n'appartenant à aucune vignette. Le même calcul est réalisé pour la branche horizontale de la croix, tel que :
tel que Xi, j+k et Xi+k,j (à une vignette )
Ce calcul est répété pour tout les pixels de toutes les vignettes et il permet d'avoir une extrapolation du bruit de fond attendu au niveau de chaque pixel de chaque vignette.
Pour évaluer le calcul du bruit de fond au niveau de chaque spot, on substitue chaque pixel des vignettes par la quantité M telle que : =Mh si Mh<Mv sinon M=MV. On peut constater sur la figure 24 que les positions des spots sont complètement invisibles par rapport au bruit de fond. L'extrapolation faite permet donc d'examiner très finement le bruit de fond local. L'image de bruit de fond ainsi obtenue est soustraite à l'image d'origine. L'image résultante sert à quantifier les spots comme décrit ci-dessous.
Une fois que le bruit électronique est minimisé, un tri des pixels au sein de chaque spot permet de repérer les différents types de pixel présents: bruit de fond, signal d'hybridation, signal parasite.
Le fait de ne retenir que les pixels du type signal permet de conserver ou de rattraper des mesures qui auraient été éliminées sur les critères de qualité habituels (voir les documents référencés [7] et [8] ) . En effet, une approche de segmentation par le calcul des rapports pixel à pixel ne permet pas de différencier le signal d'hybridation de celui du bruit de fond quand ceux-ci sont trop proches, comme illustré sur la figure 19, qui donne un exemple de graphe obtenu en comparant pixel à pixel deux images d'un même spot . Une approche algorithmique EM
("Estimation, Maximization" ) (voir document référencé [9]) peut être utilisée. Cependant, il est montré que le signal ne suit pas une distribution gaussienne pure (voir document référencé [4] ) .
En appliquant un algorithme EM classique de 2 ou 3 classes, basé sur une distribution gaussienne on obtient les distributions illustrées sur la figure 20, qui illustre l'estimation des différentes populations de pixels présentes dans un spot avec une méthode EM classique avec bg : distribution estimée du bruit de fond, Real distribution : distribution des pixels de signal d'hybridation. Avec cette méthode aucun pixel saturant n'a été identifié. Cet exemple illustre bien que les hypothèses gaussiennes appliquées sont trop dilatées par rapport à la distribution réelle de chacune des classes. Cela provient du fait que cet algorithme attribue les pixels de transition entre le signal et le bruit, soit au bruit de fond, soit au signal, soit aux signaux parasites.
Une modification de cette méthode permet de rétrécir les classes et d'introduire la notion de pixel n'appartenant à aucune classe, en appliquant un seuil sur la probabilité calculée qu'il appartienne à une des deux ou trois classes principales
Il est alors possible de déterminer la classe présentant le signal de l'hybridation qui logiquement est la classe la plus peuplée et qui correspond le plus souvent à la classe intermédiaire.
La figure 21a illustre une application de la méthode EM ainsi modifiée, pour trouver les classes de pixel; la convergence étant estimée par le log vraisemblance avec bg : distribution estimée du bruit de fond, Real distribution : distribution des pixels du signal d'hybridation, et offset : pixel saturant .
La figure 21b illustre une application de la méthode EM modifiée, pour trouver les classes de pixel; la convergence étant estimée par le RMS-log- vraisemblance avec bg : distribution estimée du bruit de fond, Real distribution : distribution des pixels dans le spot, et offset : pixel saturant.
Ainsi en utilisant la méthode EM modifiée, le bruit de fond est mesuré à l'intérieur même du spot, il n'est donc plus sous ou sur évalué, ce qui permet d'éliminer le problème des spots négatifs.
Comme une telle analyse est réalisée de manière indépendante, le problème d'une parfaite superposition des images est éliminé. De plus, les signaux plus proches du bruit de fond peuvent encore être mesurés de manière fiable.
Méthode EM
Après la pause automatique d'un cache délimitant chaque spot, la méthode consiste à classer les pixels en trois classes de manière itérative. Pour réaliser un tel classement on utilise la maximisation des paramètres d'un mélange.
En première approximation, les pixels sont classés en deux, puis en trois classes si nécessaire : bruit de fond, signal d'hybridation et éventuellement pixels saturants.
• Etape 1 d' initialisation
La première étape consiste en la construction d'une table de répartition floue Ci0 (k) des pixels, où i est l'intensité et k la classe. Cette table illustrée dans le tableau 2 en fin de description, est construite de manière telle que la valeur 1 est attribuée pour la classe bruit de fond et 0 pour la classe du signal d'hybridation pour des pixels dont l'intensité est inférieure à la valeur du bruit de fond + 2 sigma (pris en référence à l'extérieur du spot) .La table de répartition floue Ci0 (k) prend une valeur de 0 pour la classe du bruit de fond et de 1 pour la classe du signal, pour des pixels dont l'intensité est supérieure à la valeur du bruit de fond + 2 sigma (pris en référence à l'extérieur du spot). Dans un premier temps les signaux supérieur à 65500 sont considérés comme saturant et non pris en compte.
Cette première table de répartition floue à deux classe (K=2) est construite pour une première segmentation à deux classes.
On définit alors la probabilité p (k) de chaque classe, telle que:
où : - ni est le nombre de pixels avec le niveau d'intensité i,
Ci0 (k) est la probabilité d'attribuer à la classe k le niveau d'intensité i et
- P(k) est la densité de probabilité de la classe k,
K est le nombre de classes pris en considération (dans ce premier modèle, K=2) . Les paramètres de mélange :
^0( 0(l)yσ,0U),/* l)v»^°(^σ0(X),/*β(*))
(16) sont définis comme suit
(18) où : - ni est le nombre de pixels avec le niveau d'intensité i,
- Ci0 (k) est la probabilité d'attribuer à la classe k le niveau d'intensité i,
- μ° (k) représente la moyenne de la classe k à l'étape 0,
- σ°(k) représente l'écart type de la classe k.
• Etape 2 d'estimation A partir des paramètres θ"1"1, on calcule la nouvelle table de répartition floue telle que :
(19) ou • Etape 3 de maximisation
A partir de cette nouvelle table de répartition Cmi(k), on recalcule les paramètres de mélange θm.
Les étapes 2 et 3 sont réitérées jusqu'à la convergence de la classification du log vraisemblance défini comme :
Cette approche impose :
Mais la quantité Θ(K), permettant le calcul de l'appartenance à l'une ou l'autre de chaque classe, peut s'avérer extrêmement faible pour les pixels intermédiaires très distants des classes considérées .
La définition de l'algorithme EM oblige à attribuer ces pixels à une des classes, ce qui entraîne un élargissement des distributions de classes et donc un mélange artificiel des différentes classes. Ceci a pour conséquence une mauvaise évaluation de l'intensité d'hybridation observable choisie (moyenne, médiane, etc..) Pour remédier à ce problème, on peut utiliser une méthode de relâchement des distances en modifiant la quantité φκ afin qu'elle converge vers 0 pour ces pixels distants, tel que Θ(K) :
Dans ces conditions, les probabilités Ci(0) et Ci(l) convergent vers 0. Ainsi, un pixel trop éloigné, pour les paramètres de mélange considéré, n'est attribué à aucune des deux classes à cette étape. Le pixel n'est plus pris en compte à cette étape dans les calculs.
De manière similaire, la convergence du log-vraisemblance peut entraîner un élargissement des classes simplement par un arrêt précoce de la classification. On introduit donc un nouvel estimateur de convergence basé sur la similarité ou la distance calculée entre la distribution réelle des pixels et la distribution recalculée à l'aide des paramètres de mélanges. RMS log-vraisemblance est tel que :
On peut avoir, par exemple, RMS=l/R, R étant le coefficient de corrélation entre la distribution théorique calculée à partir du mélange et la courbe de distribution réelle.
Lorsqu'il y a convergence de cet estimateur,, l'estimation est arrêtée. On obtient alors des classes beaucoup plus proches de la distribution réelle.
Lorsqu'il existe des pixels saturants dans le spot (supérieur à 65500) une nouvelle table de partition floue est créée avec une classe supplémentaire K=3 (colonne) et de nouveaux niveaux complétant la table jusqu'à 65535 (ligne). La nouvelle colonne est initialisée par 0 jusqu'au niveau 65500, puis par 1 jusqu'au niveau final. Les niveaux supplémentaires des colonnes existantes sont initialisés à 0. l'ensemble de la procédure est relancé à partir de cette nouvelle matrice. La limite supérieure passe de 65500 à 65535 dans les équations (15), (17) , (18) et (21) .
Amélioration de l'image en vue de mieux détecter la position des spots .
La détermination de la position des spots se fait d'autant plus facilement qu'il existe du contraste entre le bruit de fond et le signal des spots. Pour augmenter ce contraste, il est possible d'utiliser un filtre dégradant, qui ne conserve pas forcément la proportionnalité des signaux. L'image ainsi filtrée n'est utilisée que pour trouver la position des spots. La quantification se fait à partir de l'image brute, ou à partir de l'image filtrée par un filtre non dégradant.
Le filtre dégradant proposé est basé sur la périodicité du signal recherché. A partir des projections (équation 1) , un seuil est appliqué à la projection H£ (ou Η.i ) tel que si R. < seuil H^ = 0 ou si Hi≥ seuil on a :
- maximage représente l'intensité la plus forte détectée dans 1 ' image
- 500 et 65535 peuvent être changées selon l'amplitude de redistribution souhaitée dans l'image. Le seuil est choisi de manière à maximiser l'équation (3) :
P(ω ax)
~5Ô =10 calculée à partir de la projection modifiée H± . Une fois le seuil déterminé, les pixels de l'image Aij<seuil sont ramenés à 0 (Aij=0) dans l'image et les pixels de l'image Alij>seuil sont ramenés à on peut également choisir de remplacer les pixels Alij>seuil par une valeur constante telle que Aij=500 par exemple.
Puis on applique un second filtre de type "passe bas" qui attribue à chaque pixel (i,j) de l'image la moyenne des signaux d'une fenêtre de (a+1) pixel de côté centrée sur le pixel (i,j) tel que :
Un grand nombre de signaux parasites sont ainsi éliminés, l'application de ces filtres donne les résultats présentés sur les figures 22a et 22b, la figure 22a illustrant une image avant filtrage, la figure 22b illustrant cette image après filtrage. En plus de ce seuillage et de cette redistribution, il est possible d'amplifier l'intensité des pixels appartenant aux spots en amplifiant les pixels en phase avec une fréquence de λ dans une fenêtre de taille 2λ. Pour ce faire, il suffit de redéfinir chaque pixel Xij tel que :
Cette amplification peut être bidirectionnelle en considérant par exemple une croix de 2λ de hauteur et 2λ de largeur, centré sur ij tel que :
D'une manière générale, la fonction amplificatrice peut être n'importe quelle fonction périodique prenant en compte la période du phénomène recherché. Par exemple, l'intensité de chaque pixel peut être multipliée par une fraction de la puissance de la transformée de Fourier calculée dans une fenêtre centrée sur le pixel considéré.
Une alternative à l'utilisation du rapport signal/bruit qui ne tient compte que de la variance du bruit de fond consiste à déterminer la quantité Q définie comme : spot *- l
Q ≈ σspot + σ
Ispot étant l'intensité moyenne mesurée au niveau du bruit de fond, Ibg étant l'intensité moyenne du bruit de fond, σspot étant l'écart type du signal et σbg étant l'écart type du bruit de fond.
Ce facteur Q moyen des images montre une nette amélioration de la qualité des images, après l'application des filtres non dégradant, qui se traduit par une augmentation d'un facteur 2 à 3 de la valeur Q selon le traitement appliqué à l'image. Réalignement des spots (cisaillement de l'image)
Il arrive que les spots ne soient pas bien alignés en x et/ou en y , ce qui peut gêner la découpe des blocs et le positionnement des grilles. Pour pallier ce problème, l'histogramme des m premières lignes de l'image est calculé de la manière suivante :
H(m)J = ΣZA m
Puis la ligne m + 1 est ajoutée à l'histogramme avec tous les décalages ou translations α possibles compris entre +λ0/2, -λ0/2 de manière telle que :
H(m )i ≈ H(m)J +A(m+1)J+a
Pour chaque translation α la valeur de la puissance de la transformée de Fourrier de l'histogramme H(m )j est calculée. On retient le décalage c x: maximisant le score. La ligne m+1 est décalée de la quantité (Xmax dans l'image. Une telle procédure est réalisée pour toutes les lignes de l'image à partir de la position m=λ0 ligne jusqu'à la position x=n-λ0 où n représente la dernière ligne. La même procédure peut être appliquée en y sur l'image. En complément de la méthode EM, il est possible de réaliser une approche morphomathématique sur chaque vignette en utilisant la connexitê (voir document référencé [10]) pour définir l'ensemble des objets présents dans la vignette. Ces objets servent à définir et à initialiser les classes supplémentaires de la matrice Ci(k) . En plus de la classe des pixels saturants et de celles des pixels du bruit de fond, chaque objet trouvé définit une classe. La méthode EM fusionne ou non les classes des différents objets et permet de définir la classe des pixels du signal d'hybridation tout en excluant les pixels parasites provenant des poussières, par exemple.
Les figures 23a, 23b et 23c illustrent l'ensemble des étapes à suivre pour quantifier le spot, dans trois exemples de réalisation, respectivement : un traitement complet pour une image simple, dans laquelle on a successivement des étapes de filtrage non dégradant, de filtrage dégradant, de positionnement global des blocs, d'affinement du positionnement des blocs, de délimitation des spots, de segmentation de pixels de chaque spot et de calcul d'un évaluateur d'intensité pour chaque spot, - un traitement complet pour plusieurs images, de conditions d'hybridation différentes de la même lame support, avec superposition des images, qui reprend les mêmes étapes que celle de la figure 23a avec une étape de superposition d'images, - un traitement minimum pour une image, dans laquelle on n'a pas les deux étapes préliminaires de filtrage représentées sur la figure 23a. H LO
Tableau 2
10
REFERENCES
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Nguyen, F. & Hinsgerg, . (1996) . "Light directed synthesis of high density oligonucleotide arrays using semiconductor phoresists" {Proc. Natl . Acad . Sei. USA,
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[10] D. Marr : "Vision", EDW.h. freemar and co 1982.
GLOSSAIRE
Sonde : molécule d'acide nucléique nucléique dont la séquence est complémentaire à une séquence recherchée . Pour les puces à ADN, elles sont immobilisées sur le support .
ADN ou Acide Désoxyribonucléique : molécule support de 1 ' information génétique .
ARNm : Acide Ribonucléique messager. Forme moléculaire sous laquelle le message génétique, codé dans les gènes, est transféré du noyau vers le cytoplasme. Cet ARNm est utilisé, dans le cytoplasme pour la synthèse d'une protéine.
ADNc ou ADN complémentaire : ADN simple brin, qui est complémentaire d'un ARNm obtenu par une transcription inverse. Contrairement à l'ADN, il est dépourvu d'introns (séquences non codantes). Il peut également être sous forme double brin, en copiant le premier brin par une ADN polymérase .
Condition : représente l'ensemble des ARN ou ADNc extraits de cellules dans un état particulier.
Séquençage : procédé utilisé pour déterminer l'ordre (la séquence) des acides aminés d'une protéine ou des bases dans les acides nucléiques (ADN et ARN) . Rétro-Transcription : réaction enzymatique permettant la synthèse d'une molécule d'ADN complémentaire à partir d'une molécule d'ARNm.
PCR ("polymérase Chain Réaction") : réaction de polymérisation en chaîne. C'est une technique d'amplification exponentielle d'une molécule d'ADN ou d'ADNc. Elle permet, à partir d'un fragment d'ADN et de la Taq DNA polymérase, d'obtenir un grand nombre (plusieurs millions) de copies identiques d'une molécule d'ADN donnée. Cette réaction est réalisée in vitro.
Hybridation moléculaire : Effet de 1 'appariement de deux séquences nucléiques. Elle est basée sur le principe de complémentarité des bases nucléiques, plus particulièrement entre l'ADN et le brin d'ARN ou d'ADNc. Elle peut permettre de mettre en évidence au sein d'une cellule ou d'un tissu, une séquence d'acide nucléique.
Hybridation différentielle : hybridation compétitive de molécules issues de deux échantillons différents.
Pixel : Unité d'intensité de l'image correspondante, dans le cas du scanner utilisé au laboratoire, à une superficie de 5 ou 10 microns selon la résolution utilisée. Sage : "Sériai Analysis of Gène Expression" (Nelculescu et al. 1995). Technique de mesure quantitative du transcriptome d'une cellule.
Génome : Totalité de 1 'ADN d'un individu ou d'une espèce.
Transcriptome : Ensemble des ARN messagers transcrits à partir du génome dans une cellule à un instant t.
Protéome : Ensemble des protéines dans une cellule à un instant t .

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'analyse d'image pour la mesure du signal sur les biopuces organisées en un ou plusieurs blocs comportant chacun un grand nombre de spots composés chacun d'au moins une sonde, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
- on réalise un dépôt avec un pas constant, les spots apparaissant sous la forme d'un signal périodique et régulier,
- On utilise cette propriété de périodicité pour localiser les blocs et les spots, cette périodicité étant recherchée sur les projections en x et y de l'image, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, l'étape suivante :
- on utilise des filtres dégradants pour augmenter le contraste de l'image afin de positionner les spots en utilisant les propriétés périodiques de l'image, d'une part, et des filtres non dégradants pour minimiser les variations dues au bruit de fond et de signal des spots pour amplifier chaque spot.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on utilise des projections moyennées orthogonales à deux axes x et y du plan de la biopuce permettant d'amplifier le signal périodique, et on obtient ainsi deux histogrammes Rj et H± .
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel on utilise ensuite la transformée de Fourier unidimensionnelle discrète (FFTD) pour identifier les fréquences principales en x et y de l'image, le maximum de la puissance de la transformée P (ω) donnant les valeurs ωo, dont sont déduites les périodicités λ0 de répétition des spots en x et en y.
4. Procédé selon la revendication 3 , dans lequel un seuil variable est appliqué aux deux histogrammes j et R. , le seuil optimal étant donné par la valeur qui conduit au maximum de l'équation P(comaχ)/
, la répartition de la périodicité λ étant ensuite examinée le long des deux histogrammes ÏÏ, et H. , une fenêtre de taille 2 λo glissant le long de ces histogrammes, et dans lequel on explore localement les variations de la puissance de la transformée de Fourrier de ces histogrammes, les régions de perte de puissance correspondant aux régions inter-blocs, cette méthode fournissant une découpe globale de l'image.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel, afin de pouvoir délimiter finement les frontières de chaque bloc, on utilise une fenêtre de largeur λ0 centrée sur la ligne de découpe globale ce qui permet d'explorer localement la présence de signaux trop intenses, qui sont de ce fait suspects, étant suspects de fait et éventuellement de redéfinir la limite des blocs autour des signaux, dans lequel, pour ce faire, dans un premier temps la fenêtre est étendue de λ0/2 d'un coté de la limite puis de l'autre, dans lequel, s'il y a augmentation du signal uniquement pour une seule des deux extensions de la fenêtre, la limite de bloc est déplacée de λ0 dans le bloc adjacent pour lequel il n'y a pas eu d'augmentation du signal, dans lequel s'il n'y a pas d'augmentation du signal ou s'il y a augmentation du signal pour les deux déplacements, cela signifie, soit qu'il s'agit d'un signal parasite, soit que les deux blocs sont très proches , dans lequel dans ces deux cas on calcule la probabilité d'appartenance du signal à droite et à gauche de la ligne de découpe, et dans lequel on obtient P(ω) pour chaque demi- projection avec et sans signal suspect, le gain obtenu étant égal à :
dans lequel, si le gain est supérieur à 1 pour l'une des deux demi-projections uniquement, le signal considéré lui est attribué par déplacement de la ligne de découpe de λ0/2 dans le bloc adjacent ; si, pour aucun des deux blocs, le gain n'est supérieur à 1, il s'agit d'un signal parasite, la ligne de découpe n'est pas déplacée ; si le gain est supérieur à 1 pour les deux demi-projections, le signal est en phase avec les deux demi-projections, les blocs sont donc proches et en phase et le signal est attribué au bloc pour lequel le gain est le plus fort, par déplacement de la ligne de coupe de λ0/2 dans le bloc adjacent.
6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel pour isoler les spots éteints :
- on réalise les histogrammes R. et R. , respectivement, pour les lignes et les colonnes d'un bloc,
- on applique une transformée FFTD sur les deux histogrammes de chaque bloc, dans lequel le maximum de P(ω) donne la périodicité λ0 de la répétition des spots, et dans lequel on aligne par la méthode des moindres carrés les projections avec une sinusoïde d'équation :
Asin(ω0Xi + φ)
A : amplitude moyenne des projections, φ : déphasage à déterminer.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel on applique ensuite à ces histogrammes un algorithme de reconstruction numérique, qui permet à partir des projections initiales de reconstituer un signal avec des amplitudes quasiment identiques, l'utilisation d'un seuil permettant ensuite de binariser l'histogramme reconstruit et de localiser les positions exactes des spots présents.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la projection binarisée est convoluee par une fonction sinusoïdale prise sur λ0 telle que :
Ht = ∑(Asin(ωtime j)xHbi+J_À ) =o
et dans lequel en recherchant les minima et les maxima de la fonction de convolution, il est alors possible de reconstruire automatiquement une grille englobant la totalité des spots détectables.
9. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on réalise plusieurs images a faible excitation et faible détection, qui sont cumulées en une seule image .
10. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on réalise une image à forte résolution, puis on diminue la résolution de l'image artificiellement en remplaçant n pixels voisins par la moyenne des n pixels ce qui permet de diminuer ainsi la taille de 1 ' image de n, et dans lequel un filtre d'homogénéité est appliqué pour éliminer le pixel qui présente la plus grande hétérogénéité par rapport aux pixels adjacents.
11. Procédé selon la revendication 1, dans lequel un tri des pixels au sein de chaque spot permet de repérer les différents types de pixels présents: bruit de fond, signal d'hybridation, signal parasite.
12. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on applique un algorithme EM modifié dans lequel on rétrécit les classes et on introduit la notion de pixel n'appartenant à aucune classe, en appliquant un seuil sur la probabilité calculée qu'il appartienne à une des deux ou trois classes principales.
13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel on a les étapes suivantes :
• Une étape d'initialisation, qui consiste en la construction d'une table de répartition floue Ci(k) des pixels,
• Une étape d'estimation, dans laquelle on calcule la nouvelle table de répartition floue,
• Une étape de maximisation, dans laquelle on recalcule les paramètres de mélange θm, et dans lequel ces deux dernières étapes sont réitérées jusqu'à la convergence de la classification du log-vraisemblance .
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel on introduit un nouvel estimateur de convergence basé sur la similarité ou la distance calculée entre la distribution réelle des pixels et la distribution recalculée à l'aide des paramètres de mélanges .
15. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on a les étapes suivantes : - une étape de filtrage de 1 ' image pour diminuer le bruit de fond en altérant très peu le signal significatif, et en augmentant le rapport signal sur le bruit de l'image, - une étape de filtrage dégradant augmentant le contraste de 1 ' image entre le bruit de fond et le signal d'hybridation,
- une étape de localisation des blocs sur l'image d'une biopuce à partir de la seule donnée, externe du nombre de blocs en lignes et en colonnes,
- une étape de détermination automatique de la position de chaque spot, y compris celle des spots pour lesquels il n'y a pas eu de signal car pas d'hybridation, au sein de son bloc, - une étape de segmentation automatique du spot pour déterminer les pixels représentatifs de la réaction, et de calcul d'un evaluateur du signal du spot par la moyenne ou la médiane.
16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel, lors de l'étape de localisation on utilise une méthode basée sur le repérage de la perte locale du signal périodique tel que la puissance de la transformée de Fourier du signal de la projection des spots suivant les axes par lignes ou par colonnes.
17. Procédé selon la revendication 15, dans lequel, lors de l'étape de filtrage, un premier filtre permet de redresser l'image, si nécessaire, par alignements des spots d'un même bloc.
18. Procédé selon la revendication 15, dans lequel, lors de l'étape de filtrage, un second filtre permet d'amplifier les signaux provenant spécifiquement des spots et de niveler les autres types de signaux.
19. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on affine la position de chaque bloc dans 1 ' image .
20. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on réalise la segmentation des pixels d'hybridation à l'aide d'une méthode EM.
21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel on réalise un relâchement de contrainte dans la méthode EM utilisée, c'est à dire une non attribution des pixels trop distants aux classes supposées.
22. Procédé selon la revendication 15, dans lequel une méthode morphomathématique définit les objets présents dans la vignette du spot pour initier les classes de segmentation.
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