EP1372697A2 - Utilisation de composes modulant l'activite de l'heterodimere rxr-ppar a tittre de medicament pour le traitement de l'hepatite c - Google Patents

Utilisation de composes modulant l'activite de l'heterodimere rxr-ppar a tittre de medicament pour le traitement de l'hepatite c

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EP1372697A2
EP1372697A2 EP02730347A EP02730347A EP1372697A2 EP 1372697 A2 EP1372697 A2 EP 1372697A2 EP 02730347 A EP02730347 A EP 02730347A EP 02730347 A EP02730347 A EP 02730347A EP 1372697 A2 EP1372697 A2 EP 1372697A2
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EP
European Patent Office
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rxr
hepatitis
virus
ppar
use according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02730347A
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German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Desreumaux
Sébastien DHARANCY
Johan Auwerx
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Lille 2 Droit et Sante
Centre Hospitalier Universitaire de Lille
Original Assignee
Auwerx Yohan
Universite Lille 2 Droit et Sante
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Filing date
Publication date
Application filed by Auwerx Yohan, Universite Lille 2 Droit et Sante filed Critical Auwerx Yohan
Publication of EP1372697A2 publication Critical patent/EP1372697A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
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    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1783—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
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    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
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    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to the field of medical biology and more particularly to preventive and curative treatments for viral infection with the hepatitis C virus.
  • the invention relates more particularly to a method of screening for a compound modulating the activity of a RXR-nuclear receptor heterodimer, preferably RXR-PPAR.
  • the invention also relates to the compound capable of being obtained by the screening method of the invention, in particular the agonist compounds of the RXR-PPAR hetarodimere as well as a compound capable of hybridizing selectively with the gene or a product of the gene coding for the RXR and PPAR subunits of said heterodimer, for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of an infection by the hepatitis C virus, associated hepatic steatosis or no to hepatitis C virus infection of hepatocytes, hepatic inflammation and liver damage associated or not with hepatitis C virus hepatocyte infection, as well as hepatic cirrhosis and / or to post-hepatic cancer associated or not with an infection of the hepatocytes by the hepatitis C virus.
  • HCV Hepatitis C virus
  • hepatitis C virus has been identified as the primary agent responsible for hepatitis post-transfusion and related to drug addiction (Kuo G, Science 1989). HCV infection represents a major public health problem since its frequency in France is estimated at 1.3% (Roudot-Thoraval F, Hepatology 1998). More than 600,000 people are therefore affected by this infection in our country. HCV is characterized by a strong affinity for liver cells (hepatocytes) resulting in acute inflammation of this organ or acute hepatitis. This acute hepatitis is most often asymptomatic clinically and turns in 80% of cases into chronic hepatitis which can be complicated by cirrhosis and liver cancer (Poynard T, Lancet 1997).
  • the identification of this new target is based on recent data from the literature and on results obtained by the inventors.
  • the hepatitis C virus enters hepatocytes using, in part, the receptor for low density lipoproteins (LDLR or CD36) (Monazahian M, J Med Virol 1999), then multiplies in the cell and can then invade others. This infection induces an immune response which is most often incapable of spontaneously eliminating the virus; this leads to chronic hepatitis in around 80% of cases (Alter M, N Engl J Med 1992).
  • IL-4 interleu ine 4
  • Other cytokines are also involved in the inflammatory mechanisms linked to infection with the hepatitis C virus, in particular by the production of TNF ⁇ , IL-l ⁇ and IL-18 (Nelson DR, Dig Dis Sci 1997; McGuinness PH, Gut 2000) leading to the activation of the NFKB complex and to the production of molecules involved in the inflammatory reaction.
  • IL-4 has been shown to be the main cytokine regulating the expression of PPAR ⁇ which plays an essential role in the regulation of the production of in lammatory cytokines such as TNF ⁇ and IL-l ⁇ via an inhibition of NFkB.
  • Hepatitis C infection is also the source of a fatty overload characteristic of hepatocytes called fatty liver (Goodman ZD, Semin Liver Dis 1995; Czaja A, J Hepatol 1998; Clouston AD, J Hepatol 2001) the first clinical manifestation of infection with the hepatitis C virus.
  • nuclear receptors represent one of the largest families of transcription some of which can be activated by small lipophilic molecules such as hormones and nutrients for example.
  • An important subfamily of these nuclear receptors corresponds to factors having the property of forming a heterodimer with the receptor X for retinoids (RXR).
  • This subfamily is composed in particular of the receptor for vitamin D (VDR), the receptor for retinoic acid (RAR), the receptor for thyroid hormones (TRs), proliferators of peroxisomes (PPARs), receptors for bile acids (BAR also called FXR), receptors for oxysterols (LXRs), steroids and xenobiotics (SXR also called PXR).
  • VDR vitamin D
  • RAR receptor for retinoic acid
  • TRs thyroid hormones
  • PPARs proliferators of peroxisomes
  • BAR also called FXR
  • receptors for oxysterols LXRs
  • steroids and xenobiotics SXR also called PXR
  • Peroxisome-activated receptors are nuclear receptors capable of forming a heterodimer with RXR.
  • the expression of PPAR ⁇ is mainly localized in the liver, the muscle and in a certain form of adipose tissue corresponding to brown fat.
  • the expression of PPAR ⁇ or ⁇ is ubiquitous whereas PPAR ⁇ is produced essentially at the level of adipose tissue, macrophages and colonic epithelial cells.
  • the production of PPAR ⁇ in the liver in humans remains unknown.
  • These PPAR receptors are involved in the transcription of many target genes after attachment to a specific DNA response element (PPRE).
  • PPAR Different synthetic and natural ligands can fix and activate PPAR.
  • Activation of PPAR leads to various biological effects including activation, differentiation and proliferation of fat cells (adipocytes), regulation of lipid metabolism, regulation of inflammation and regulation of insulin response (Lehmann JM, J Biol Chem 1995) (Shoonjans K, Biochim Biophys Acta 1996 ).
  • Other receptors which heterodimerize with RXR such as LXR, TRs, BAR / FXR, and SXR / PXR are strongly expressed by hepatocytes.
  • LXRs and FXR / BAR receptors probably play an important role in hepatic homeostasis since they control the metabolism of cholesterol and bile acids and that there is regulation between these receptors and PPAR.
  • PPARs are capable of inducing the expression of LXR ⁇ in the liver (Tobin & Auwerx, Mol. Endo 2000) and macrophages (Tontonoz & Evans, Mol. Cell, 2001).
  • the inventors therefore propose to use PPAR ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ the modulators of PPAR as well as the nuclear receptors capable of forming a heterodimer with RXR (LXR, TRs, BAR / FXR, and SXR / PXR) as a new therapeutic target and / or new therapeutic proteins for the treatment of viral hepatitis C, and this by having an action on the penetration of the virus into the cells, by reducing the inflammatory reaction and the fibrosis and / or by reducing the risk of cancer.
  • RXR LXR, TRs, BAR / FXR, and SXR / PXR
  • the present invention relates to a method for screening a compound modulating the activity of an RXR heterodimer-nuclear receptor characterized in that said method comprises the steps of (1) bringing into contact in the presence of the reagents necessary for carrying out at least one transcription reaction of said heterodimer RXR-nuclear receptor with at least one reporter gene having all the genetic information necessary for the expression of a reporter protein, said gene having at least one RE regulatory sequence; (2) contacting in the presence of the reagents necessary for carrying out at least one transcription reaction of the said heterodimer RXR-nuclear receptor and of the said compound with at least one reporter gene having all the genetic information necessary for the expression of a reporter protein which has at least one RE regulatory sequence; (3) qualitative, optionally quantitative determination of the expression of said protein triggered in steps 1) and 2) then comparison of said expressions; finally (4) selection, optionally of identification, of the compound if it is capable of selectively modulating the expression of said protein.
  • heterodimer activity is intended to denote the biological activity or the natural biological function performed by the heterodimer in a living cell, that is to say an activity of transcription factors.
  • a transcription factor within the meaning of the present invention is a diffusible protein factor capable of modulating positively or negatively the expression of one or more genes by interacting with their regulatory sequence (s).
  • said heterodimer RXR-receptor nuclear is selected from the group consisting of RXR-PPAR, RXR-LXR, RXR-TR, RXR-BAR / FXR and RXR-SXR / PXR.
  • nuclear receptors is intended to denote receptors which have an identical overall structure, namely: (1) an NH2 terminal end of variable length, not conserved and specific for the receptor (AB domain of the gene); (2) a region of approximately 65 amino acids, very conserved (domain C of the gene) which interacts with DNA; this region contains two glove finger patterns; (3) a non-conserved region of variable length (domain D); and (4) a domain of variable length which corresponds to the zone where the hormone or the ligand is fixed (domain E).
  • RE regulatory sequence for “responsive element” is intended to denote nucleic sequences necessary for the regulation of genes in eukaryotes. These sequences are distinguished from the promoter sequence stricto sensu, which corresponds to the sequence in which RNA polymerase II binds.
  • the RE regulatory sequences are generally located in the 5 ′ region upstream of the genes, upstream of the promoter sequence. They constitute CIS-regulatory sequences on which are fixed transcription factors which act in TRANS. In general, these RE sequences confer tissue specificity on the genes which possess them.
  • said RE regulatory sequence is selected from the group consisting of the PPRE regulatory response sequence PPAR, the LX-RE regulatory sequence LXR response, the regulatory sequence TRE of thyroid hormone receptor response (TR) , the regulatory sequence BAR / FXR-RE in response to BAR / FXR and the regulatory sequence SXR / PXR-RE in response to SXR / PXR.
  • the REs to steroid receptors SXR-RE
  • the regulatory sequence RE to glucocorticoid receptors (GRE) the regulatory sequence RE to estrogen receptors (ERE), the regulatory sequence RE to mineralocorticoid receptors (MRE), the regulatory sequence RE to progesterone receptors (PRE).
  • the heterodimer according to the invention is RXR-PPAR and the regulatory sequence RE (responsive element) is PPRE.
  • telomere sequence is at least one promoter, transcription initiation and termination signals, as well as suitable regions for transcription regulation.
  • the transcribed reporter gene can be translated. For this it is essential that the mRNA has the initiation and termination signals of the translation.
  • the reporter gene may be present in linear form, preferably it is cloned into an expression vector, allowing expression of the protein reporter in a cell host.
  • the vector may or may not be maintained in a stable manner in the cell and may optionally have specific signals specifying the secretion of the translated polypeptide.
  • the different control signals are chosen according to the cell host used.
  • Such vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods such as, for example, calcium phosphate precipitation transfection, lipofection, electroporation, thermal shock.
  • the compound obtained by the screening process activates or increases the expression of said reporter gene.
  • the compound obtained by the screening process preferably abolishes or inhibits the expression of said reporter gene.
  • the screening method is characterized in that at least one step is carried out in a living cell.
  • at least steps 1 and 2 of the method are carried out in a living cell.
  • prokaryotic cells such as bacteria and in particular Escherichia coli, yeasts, in particular Saccharomyces cerivisiae, animal cells.
  • these are mammalian cells preferably chosen from human, mouse, rat, rabbit, hamster cells. It is also within the scope of the invention to screen the compounds of the invention on laboratory animals or from cells derived from laboratory animals.
  • transgene which has all of the genetic information necessary for the expression of a reporter protein, the said gene having at minus one RE regulatory sequence, preferably PPRE.
  • This transgene can be present in the genome of at least one cell of the transgenic animal, this integration being carried out either by homologous recombination or by random integration. Alternatively, the transgene is present in an episomal form.
  • the method can be an in vitro screening method characterized in that the steps are carried out in an acellular system. In this case, this process is carried out in the presence of reagents necessary for carrying out at least one transcription reaction, and optionally in the presence of reagents necessary for carrying out at least one translation reaction of the reporter protein such as for example rabbit reticulocyte lysate.
  • reagents necessary for carrying out at least one transcription reaction and optionally in the presence of reagents necessary for carrying out at least one translation reaction of the reporter protein such as for example rabbit reticulocyte lysate.
  • any conventional procedure or test can be implemented to result in step 3 of said method in obtaining a detectable and / or quantifiable signal representative of the quantity of said expression product present in the reaction medium, depending on the expression product sought.
  • the expression product is a polypeptide corresponding to the translation product of the mRNA corresponding to said reporter gene; in this case, this expression product is highlighted and optionally quantified by the so-called “Western blot” method or by immunohistochemistry well known to those skilled in the art.
  • mRNA transcription product
  • said reporter protein is selected from the group of autofluorescent proteins and enzymes detectable by a histochemical process.
  • the autofluorescent protein is chosen from the group composed of green fluorescence protein (GFP), augmented green fluorescence protein (EGFP), protein of red fluorescence protein (RFP), protein blue fluorescence protein (BFP), yellow fluorescence protein (YFP) and fluorescent variants of these proteins.
  • said reporter gene codes for an enzyme detectable by a histochemical method chosen from the group consisting of ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucoronidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, glucose amylase, carbonic anhydrase, acetylcholine esterase, lyzozyme, malate dehydrogenase, glucose-6 phosphate dehydrogenase, alcoholic dehydrogenase, luciferase, chloramphenicol-acetyl transferase, growth hormone.
  • the said reporter gene can correspond to any gene which has at least one PPRE upstream regulatory sequence.
  • the present invention also relates to the compound capable of being obtained by the screening method according to the invention as well as all compounds modulating the activity of a nuclear receptor RXR heterodimer.
  • this compound activates or increases the activity of the heterodimer RXR-nuclear receptor, in particular RXR-PPAR.
  • the compound is selected from the group consisting of PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , RXR, a natural or synthetic agonist ligand of PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , RXR, RXR-nuclear receptor, preferably of RXR-PPAR and in particular RXR-PPAR ⁇ , RXR- PPAR ⁇ , RXR-PPAR ⁇ , RXR-PPAR ⁇ .
  • This agonist ligand of RXR-PPAR is preferably chosen from the group composed of prostaglandins J2, polyunsaturated fatty acids, thiazolinediones, non-inflammatory anti-inflammatories steroids, fibrates, including fenofibrate, pioglitazone.
  • the agonist compounds it is also worth mentioning the anti-ideotypic antibodies corresponding to the compounds PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , RXR.
  • the compound capable of being obtained by the screening method according to the invention abolishes or inhibits the activity of the nuclear receptor RXR heterodimer.
  • it is a natural or synthetic antagonist ligand.
  • antagonist ligand is intended to denote the compounds capable of reducing or abolishing the level of expression and / or the activity of RXR-nuclear receptor, in particular RXR-PPAR.
  • antagonist refers to a molecule which, when it binds to the polypeptide according to the invention, reduces the quantity or the duration of the effects of the biological activity of the RXR-PPAR polypeptide.
  • the polynucleotides capable of hybridizing specifically with the RE preferably PCERA.
  • the said polynucleotide enters into competition with the heterodimer RXR-PPAR for attachment to the response element PPRE.
  • the polynucleotide can also correspond to the RE sequence, preferably PPRE in excess, in order to fix by excess of substrate the heterodimer RXR-nuclear receptor, preferably RXR-PPAR, on the RE sequence, preferably PPRE of the polynucleotide.
  • the polynucleotide can also correspond to an antisense oligonucleotide.
  • the polynucleotide is capable of selectively hybridizing with the gene or a product of the gene coding for the RXR and PPAR subunits.
  • the oligonucleotides according to the invention have a minimum size of 9 bases, preferably at least 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 40, 50 bases.
  • this compound can be an antibody, or antibody fragment, monoclonal or polyclonal directed specifically against RXR-nuclear receptor, preferably RXR-PPAR; preferably, the antibody according to the invention is directed against the PPAR subunit of the heterodimer, preferably it is a PPAR ⁇ type subunit.
  • the antibodies according to the invention there may be mentioned rabbit polyclonal antibodies directed against PPAR ⁇ and marketed by WAK-CHEMIE (Bad Soden, Germany) or by TEBU (Le Perray en Yvelines, France).
  • monoclonal antibodies or their fragments directed against the PPAR ⁇ receptor In general, for the preparation of monoclonal antibodies or their fragments directed against the PPAR ⁇ receptor, reference may be made to the techniques which are in particular described in the “Antibodies” manual (Harlow et al., 1988) or to the preparation technique. from hybridomas described by Kohler and Milstein in 1975.
  • the monoclonal or polyclonal antibodies according to the invention can be obtained for example from the cell of an animal immunized against the PPAR ⁇ protein, or one of its fragments comprising the epitope specific (determinant of the protein responsible for the specific interaction with the antibody).
  • Said PPAR ⁇ receptor protein, or a fragment thereof may in particular be produced, according to the usual procedures, by genetic recombination from a nucleic acid sequence contained in the cDNA sequence coding for the PPAR ⁇ receptor protein, or by peptide synthesis.
  • the monoclonal or polyclonal antibody fragments according to the invention comprise any fragment of said monoclonal antibody capable of binding to the epitope of the PPAR ⁇ protein on which the monoclonal or polyclonal antibody from which said fragment is derived is attached.
  • fragments include in particular monoclonal or polyclonal single chain antibodies or monovalent fragments Fab or Fab 'and divalent fragments such as F (ab') 2, which have the same binding specificity as the monoclonal antibody of which they are from.
  • a fragment according to the invention may also be a single chain Fv fragment produced by methods known to those skilled in the art and as described for example by Skerra et al., 1988 and King et al., 1991.
  • a fragment according to the invention may also be an Fc fragment.
  • the monoclonal or polyclonal antibody fragments of the invention can be obtained from the monoclonal or polyclonal antibodies as described above by methods such as digestion with enzymes, such as pepsin or papain and / or by cleavage of the bridges disulfides by chemical reduction.
  • the monoclonal or polyclonal antibody fragments can be synthesized by synthesizers automatic peptides such as those supplied by the company Applied Biosystems, etc., or can be prepared manually using techniques known to those skilled in the art and as described for example by Geysen et al. (1978).
  • Agonist and antagonist ligands include proteins, nucleic acids, carbohydrates, lipids, chemical compounds.
  • agonist and antagonist ligands of a protein nature it is appropriate to designate all of the natural polypeptides capable of interacting with the heterodimer RXR-nuclear receptors, preferably RXR-PPAR.
  • ligand or compound is intended to define all of the compounds capable of interacting directly or indirectly with the binding of the heterodimer RXR-nuclear receptor, preferably RXR-PPAR to the RE sequence, preferably PPRE; a ligand within the meaning of the present invention forms a complex which affects transcriptional activity, that is to say increases, decreases, modulates or invalidates the transcription of a gene under the control of a promoter containing a sequence of RE DNA to which the nuclear receptor RXR heterodimer binds.
  • kits or a kit for the screening of ligands capable of affecting the transcriptional activity of a reporter gene whose promoter sequence comprises at least one RE sequence, preferably PPRE capable of binding a nuclear RXR-receptor heterodimer, preferably RXR-PPAR, and characterized in that it comprises the following elements: (i) a gene, optionally cloned in an expression vector, and optionally present in a living cell; (ii) a ligand; (iii) the reagents necessary for the implementation of a transcription and / or translation reaction.
  • the compound or ligand according to the invention is used as a medicament and in particular as active principles of medicament for humans or animals.
  • the compound is preferably in soluble form, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • pharmaceutically acceptable vehicle is intended to denote any type of vehicle usually used in the preparation of injectable compositions, that is to say a diluent, a suspending agent such as an isotonic or buffered saline solution.
  • the compound is administered systemically, in particular intravenously, intramuscularly, intradermally or orally.
  • the present invention also relates to the use of a compound modulating the activity of a nuclear receptor RXR heterodimer for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of an infection by a virus which uses to carry out its viral cycle at least one cellular protein coded by a gene which presents at least one regulatory sequence RE.
  • said cellular protein is the receptor for low density lipoproteins (LDLR or CD36) and said virus is hepatitis C virus.
  • the said heterodimer RXR-nuclear receptor is selected from the group consisting of RXR-PPAR, RXR-LXR, RXR-TR, RXR-BAR / FXR and RXR-SXR / PXR.
  • said regulatory sequence RE is selected from the group composed of the regulatory sequence PPRE in response to PPAR, the regulatory sequence LX-RE in response to LXR, the regulatory sequence TRE of response to the receptor to thyroid hormones (TR), of the BAR / FXR-RE regulatory sequence of response to BAR / FXR and of the SXR / PXR-RE regulatory sequence of response to SXR / PXR; preferably it is PPRE.
  • said heterodimer RXR-nuclear receptor is RXR-PPAR and said regulatory sequence RE is PPRE.
  • the invention also relates to the use of a compound modulating the activity of a nuclear receptor RXR-heterodimer for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of an infection by the virus of the hepatitis C, from cells selected from hepatocytes, bile cells, parenchymal liver cells, circulating blood cells.
  • the invention also relates to the use of a compound modulating the activity of a nuclear receptor RXR-heterodimer for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of chronic hepatitis.
  • the invention also relates to the use of a compound modulating the activity of a nuclear receptor RXR-heterodimer for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of hepatic steatosis associated or not with an infection of the hepatocytes with hepatitis C virus.
  • the invention also relates to the use of a compound modulating the activity of a nuclear receptor RXR-heterodimer for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of hepatic inflammation and associated hepatic lesions or no to infection of hepatocytes with the hepatitis C virus
  • the invention also relates to the use of a compound modulating the activity of a nuclear receptor RXR-heterodimer for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of hepatic cirrhosis and / or of cancer. post-hepatic or not associated with an infection of the hepatocytes by the hepatitis C virus.
  • the invention also relates to the use of a compound modulating the activity of a nuclear receptor RXR-heterodimer for the preparation of a medicament intended for controlling carbohydrate metabolism and / or for preventive and / or curative treatment of type II diabetes in patients carrying the hepatitis C virus.
  • the present invention also relates to the use of a compound according to the invention or of a compound capable of hybridizing selectively with the gene or a product of the gene coding for RXR and / or PPAR for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of an infection by a virus which uses to carry out its viral cycle at least one cellular protein encoded by a gene which has at least one RE regulatory sequence, preferably PPRE.
  • said cellular protein is the receptor for low density lipoproteins (LDLR or CD36) and said virus is hepatitis C.
  • the present invention relates to the use of a compound according to the invention or of a compound capable of hybridizing selectively with the gene or a product of the gene coding for RXR and / or PPAR for the preparation of a medicament. intended for the preventive and / or curative treatment of an infection of hepatocytes by the hepatitis C virus.
  • the present invention also relates to the use of a compound according to the invention or of a compound capable of selectively hybridizing with the gene or a product of the gene coding for RXR and / or PPAR for the preparation of a medicament intended preventive and / or curative treatment of fatty liver disease whether or not associated with hepatocyte infection by the hepatitis C virus.
  • the present invention also relates to the use of a compound according to the invention or of a compound capable of selectively hybridizing with the gene or a product of the gene coding for RXR and / or PPAR for the preparation of a medicament intended to the preventive and / or curative treatment of hepatic inflammation and hepatic lesions associated or not with an infection of the hepatocytes by the hepatitis C virus.
  • the present invention also relates to the use of a compound according to the invention or of a compound capable of hybridizing selectively with the gene or a product of the gene coding for RXR and / or PPAR for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of hepatic cirrhosis and / or of a post-hepatic cancer associated or not with an infection of the hepatocytes by the hepatitis C virus.
  • the invention also relates to a product comprising at least one compound according to the invention or a compound capable of hybridizing se lectively with the gene or a product of the gene coding for RXR and / or PPAR and at least one anticancer agent as a combination product for simultaneous, separate or spread over time in anticancer therapy.
  • the present invention also relates to the use of a compound according to the invention or of a compound capable of selectively hybridizing with the gene or a product of the gene coding for RXR and / or PPAR for the preparation of a medicament intended carbohydrate metabolism control and / or preventive treatment and / or curative of type II diabetes in patients with the hepatitis C virus.
  • the present invention relates to the use of a composition
  • a composition comprising a compound according to the invention modulating the activity of an RXR-nuclear receptor heterodimer, preferably RXR-PPAR, and a pharmaceutically acceptable vehicle as a medicament for the preventive and / or curative treatment of a man or an animal infected with the hepatitis C virus, characterized in that the ability of said compound to selectively modulate the activity of said heterodimer is determined by (a) the contacting in the presence of the reagents necessary for carrying out at least one transcription reaction of said heterodimer with at least one gene having all of the genetic information necessary for the expression of a protein, said gene having at least a RE regulatory sequence, preferably PPRE; (b) bringing into contact in the presence of the reagents necessary for carrying out at least one transcription reaction of said heterodimer and of said compound with at least one gene possessing all of the genetic information necessary for the expression of a protein and which has at least one RE regulatory sequence,
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition for the preventive and / or curative treatment of an infection with the hepatitis C virus, characterized in that it contains a therapeutically effective amount of a compound according to the invention or of a compound capable of hybridizing selectively with the gene or a product of the gene coding for RXR and / or PPAR.
  • This composition may also contain at least one antiviral agent as a combination product for simultaneous, separate or spread over time in antiviral therapy linked to an infection with the hepatitis C virus; this antiviral agent is preferably selected from the group composed of interferon alpha (IFN ⁇ ), ribavirin, delay interferon.
  • IFN ⁇ interferon alpha
  • ribavirin delay interferon
  • Figure 1 Demonstration of the expression of nuclear PPAR receptors in the liver cells of healthy individuals (controls) and of patients infected with the hepatitis C virus (HCV). Quantification by competitive RT-PCR of PPAR ⁇ expressed in number of PPAR ⁇ Arnm molecules per molecule of ⁇ -actin mRNA in the liver cells of 10 controls and 21 patients with chronic hepatitis C. The average is shown and deviations from the average are shown.
  • Figure 2a Hepatic expression of the messenger RNAs of RXR ⁇ , VDR, LXR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ and PPAR ⁇ in samples of human livers taken from patients with chronic hepatitis C and control subjects using the semi-quantitative RT-PCR technique . Results are expressed as means ⁇ standard deviation from healthy control livers.
  • Figure 4 Expression of PPAR ⁇ in human circulating mononuclear blood cells (PBMC) collected from patients with chronic hepatitis C and healthy controls using the competitive RT-PCR technique (4a) and the Western technique blot (4b). Results are expressed as mean ⁇ standard deviation from healthy control livers.
  • PBMC mononuclear blood cells
  • FIG. 5 Susceptibility of the PPAR ⁇ + " mouse to acute CC1-induced hepatitis 4.
  • the necrotico-inflammatory scores (A) are expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • the intensity of the lesions is evaluated by histological analysis of the livers of mice killed two days after induction of hepatitis by administration of CC1 4 (l ⁇ m / kg) using the Ishak score
  • Mortality (B) is expressed as a percentage of lethality two days after administration of CC1 4 .
  • FIG. 6 Susceptibility of PPAR ⁇ "_ mice to acute CC1-induced hepatitis 4.
  • the necrotico-inflammatory scores (A) are expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • the intensity of the lesions was evaluated by histological analysis using the score of Ishak on the livers of mice killed 5 days later induction of hepatitis by administration of CC1 (l ⁇ m / kg).
  • Mortality (B) is expressed as a percentage of lethality 5 days after the administration of CC1 4 .
  • Figure 7 Quantification of PPAR ⁇ messenger RNA in clones N3, N4 and SWX using competitive RT-PCR.
  • the results show an inhibition rate of the expression of PPAR ⁇ of 90% for the clone N4 (a) and 23% for the clone N3 (b).
  • the results are represented as the mean ⁇ standard deviation.
  • RT-PCR quantification of PPARs and other nuclear receptors forming a heterodimer with RXR was carried out on liver biopsies. All biopsies were equivalent in size and the mean weight was 8 ⁇ 4 mg. Biopsies were immediately frozen and stored at -80 ° C. After incubation of the samples in Trizol, the nucleic acids were extracted using chloroform. Following a 30 min treatment at 37 ° C with 20-50 units of DNase I RNase-free, the total RNAs were back-transcribed into cDNA as previously described. The RT reaction mixture was amplified by PCR using sense and antisense primers specific for these receptors and for ⁇ -actin.
  • the samples were subjected to 20-40 cycles of PCR and the quantification of the cDNA was carried out by electrophoresis on 3% agarose gel. As the precise quantification of RNA in samples is often difficult and imprecise, the number of mRNA molecules of nuclear receptors was expressed in comparison with the number of mRNA molecules of an internal control, ⁇ -actin, in the same sample.
  • Total protein extracts are obtained by homogenization of liver biopsies in a lysis buffer consisting of PBS with 1% NP -40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate and a classic cocktail of protease inhibitors.
  • the liver biopsies are fixed in 4% paraformaldehyde, included in the paraffin and cut to 4 micrometers for immunohistochemistry and immunofluorescence.
  • the sections are preincubated for 30 minutes at room temperature in a blocking solution containing avidin D and biotin (Blocking Kit, SP2001, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). They are then exposed to a specific antibody directed against PPARs or other RNs forming with a heterodimer with RXR for 2 hours at room temperature.
  • the sections are washed in PBS containing 0.05% of Triton X 100 and incubated with a secondary goat anti-rabbit biotinylated antibody (dilution 1/500 for 30 minutes, Dako, Trappes, France).
  • the immune complex is detected using avidin-biotin coupled to peroxidase (ABCOMPLEX / HRP, Dako, Trappes, France) and revealed using 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB, Dako, Trappes, France).
  • DABCOMPLEX / HRP avidin-biotin coupled to peroxidase
  • Dako Dako, Trappes, France
  • DAB 3, 3 '-diaminobenzidine
  • Liver biopsies are performed on 20 patients with chronic hepatitis C (7 women, 13 men; average age 43 ⁇ 12 years, range 21 to 70 years).
  • Surgical biopsies of histologically healthy livers are obtained by hepatectomy from 14 patients operated on for metastases of the liver.
  • the patients and controls received no treatment (anti-viral therapy, hepatotoxic drugs, corticosteroids, immunosuppressive therapy) before or during the study, and none of them consumed more than 20g of alcohol per day.
  • Biopsies are cut into two parts. They are immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C for protein and messenger RNA analyzes of nuclear receptors.
  • Cells peripheral blood mononuclear cells are isolated from fresh heparin blood obtained from 10 informed healthy volunteers and 10 patients with chronic hepatitis C.
  • the blood is centrifuged on Ficoll-Hypaque for 20 minutes at 4 ° C, the interphase mononuclear cells are collected, washed twice then resuspended and stored at -80 ° C for protein and mRNA analyzes of nuclear receptors.
  • HepG2 human hepatocellular carcinoma
  • the HepG2 cells are transfected as described above (Barba et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 1200-1205) with the vector pEF352 neo comprising, under the control of the elongation factor promoter, HCV cDNA including HCV lb sequences from the body to the NS3 region.
  • Two independent clones stably expressing the HCV body protein were analyzed (clone N3 and N4).
  • the clone transfected with the empty vector is used as a negative control (clone SWX).
  • clone SWX clone SWX
  • These different clones are cultured at 37 ° C. under an atmosphere comprising 5% of CO 2 and maintained in an Eagle's culture medium modified by Dulbecco (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum and comprising penicillin-streptomycin.
  • DMEM Dulbecco
  • the cells are cultured to confluence then the culture dishes are scraped off and the cells are harvested to prepare the cell extracts.
  • mice Experiments with animals are carried out in an accredited establishment (No. B59-108 and B67-218-5) according to government directives No. 86/609 / EEC.
  • the animals are grouped in cages (5 to 6 animals per cage) and have free access to water and rodent food.
  • the mice For a study of an acute pathology induced by CC1, the mice are anesthetized for 10 minutes and an intraperitoneal injection of a 1: 1 solution of CC1 4 and sterile mineral oil at a dose of lml / kg d animal is realized. Control mice receive a dose of mineral oil using the same technique.
  • the PPAR ⁇ - / - and PPAR ⁇ +/- mice both on a 129 / Sv genetic background are used (the homozygous mouse PPAR ⁇ - / - is not viable) to verify the potential susceptibility to the development of hepatitis in these disabled animals.
  • wild Balb / c mice are used in intervention studies with the PPAR ⁇ agonist, pioglitazone (50 mg / kg). This compound is administered once a day by oral gavage starting 3 days before the induction of hepatitis. The animals are killed by cervical dislocation between days 2 to 5 after the administration of CC1.
  • the livers are recovered and then fixed overnight in 4% paraformaldehyde and then included in paraffin.
  • the sections are stained with hematoxylin and eosin then examined blind by a pathologist and then evaluated according to the score of Ishak (Ishak, et al. J. Hepatol. 1995, 22: 696-699).
  • RNA is isolated from a sample of liver and mononuclear cells with the TRIzol® reagent (Life Technologies, Cergy Pontoise, France) as described by the manufacturer. After treatment at 37 ° C for 30 minutes with 20 to 50 units of DNase I RNAse-free (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) the total RNA (10 ⁇ g) is reverse transcribed into cDNA. The reverse transcription reaction mixture is amplified by PCR using sense and antisense primers specific for nuclear receptors (RXR ⁇ , LXR ⁇ , VDR, PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ ) and ⁇ -actin. The samples are subjected to 40 PCR cycles (Perkin-Elmer Corporation, Foster City, California, USA).
  • the quantification of the cDNA is carried out by electrophoresis on agarose gel 2 to 3% using an image analyzer (Gel Analyst, Clara Vision, Paris, France). Accurate quantification of RNA in the sample is often difficult and imprecise, the number of messenger RNA molecules in PPAR ⁇ in the livers is expressed in comparison with the number of 10 6 molecules of mRNA of an internal control, in this case ⁇ -actin in the same sample.
  • the protein preparation is carried out in liver and mononuclear cell biopsies as previously described.
  • the total protein extracts are obtained by homogenization of tissues and cells in an extraction buffer composed of PBS (Phosphate Buffered Saline) with 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate and a classic cocktail of protease inhibitors.
  • the total proteins are then separated by electrophoresis on polyacrylamide gel and then electrotransferred.
  • Immunosensing with a second antibody conjugated to peroxidase and with chemiluminescence is carried out according to the manufacturer's instructions (ECL, Hamersham, UK). The results are expressed as optical density units for 50 ⁇ g of total proteins.
  • HepG2, HuH7 hepatocyte lines maintained in culture with agonists and / or antagonists of PPAR ⁇ , ⁇ , ⁇ , and of LXR, TRs, BAR / FXR, and SXR / PXR, we demonstrated by immunohistochemistry respectively an increase and a decrease in the expression of CD36 by hepatocytes.
  • liver samples were taken from wild mice and invalidated mice for the different PPAR isoforms and for LXR, TRs, BAR / FXR, SXR / PXR.
  • the quantification of CD36 in these different models also highlights the in vivo involvement of these nuclear receptors in the expression of CD36 in the liver.
  • the use of modulators for these nuclear receptors will allow the inventors to control, in wild animals, their roles in the expression of CD36 in the liver.
  • hepatitis induced by chemical agents are used to demonstrate the effect anti-inflammatory and anti-fibrotic modulators of nuclear receptors PPARs, LXR, TRs, BAR / FXR, SXR / PXR.
  • the first gross results show the anti-inflammatory effect of these different modulators. 5.
  • Hepatocytes are transfected with a reporter gene (luciferase) under the control of a response element (PPRE, LXRE, ...) for the receptors described above. Visualization of the activation of the reporter gene by the virus will highlight the involvement of PPAR or other receptors during infection with the virus C.
  • a reporter gene luciferase
  • PPRE response element
  • LXRE response element
  • the inventors Using the RT-PCR technique, the inventors have quantified the messenger RNAs of RXR ⁇ ,
  • the inventors used a Western blot analysis to quantify the PPAR ⁇ protein in the same samples.
  • the inventors carried out a Western blot using an antibody directed against PPAR ⁇ in the liver of control individuals and of patients infected with HCV.
  • the inventors used explanted livers taken from patients who underwent liver transplantation because they were suffering from cirrhosis associated with an HCV infection.
  • the optical density (OD) of livers infected with HCV appears less intense than that of control livers (FIG. 3) suggesting that the expression of both proteins and mRNAs of PPAR ⁇ is affected in the liver of patients infected with HCV.
  • the PPAR / RXR heterodimer is involved in the regulation of the inflammatory process; the inventors have therefore hypothesized that the lack of expression of PPAR ⁇ in the liver is capable of influencing the development of inflammation after liver injury.
  • mice as well as wild mice of the same litter have a genetic background of 129 / Sv. compared to wild PPAR ⁇ + + individuals of the same litter, PPAR ⁇ + " mice have more pronounced microscopic liver lesions evaluated according to Ishak (10.6 ⁇ 0.22 versus 4 ⁇ 0.8) ( Figure 5a). are characterized by a confluent necrosis in certain places with multiple bridges linking different vascular structures.
  • the inflammatory infiltra is moderate, from some to all of the portal areas. This susceptibility to acute hepatitis is associated with a mortality rate dramatically increased (40% compared to 0%) (Figure 5b) only 2 days after the injection of CC1 4 .
  • PPAR ⁇ ⁇ _ mice develop microscopic liver lesions much more pronounced 5 days after injection with CC1 (9.2 ⁇ 0.7 versus 4.2 ⁇ 0.13) ( Figure 6a). These lesions are characterized by confluent necrosis in most regions and slight portal inflammatory infiltration. However, these lesions appear to be less severe than for PPAR ⁇ + / " mice. This increase in hepatic lesions is also associated with a higher mortality rate (50% versus 0%) ( Figure 6b). 9. Disturbed expressions of PPAR ⁇ mRNA in HepG2 cells transfected by the core.
  • the average inhibition rates of the expression of PPAR ⁇ is 90% for the clone N4 (FIG. 7a) and 23% for the clone N3 (FIG. 7b) compared with the corresponding control SWX cells.
  • the inventors characterized the development of acute hepatitis in Balb / c mice subjected to treatment with CC1 4 whereas the control mice killed three days after the administration of mineral oil did not show microscopic lesions in the liver.
  • the inventors evaluated the activation of PPAR ⁇ on hepatitis induced by CC1 4 using pioglitazone (50 ⁇ g / kg / day) as a preventive measure. Compared to mice without a preventive diet, the mortality rate linked to hepatitis is reduced (40% compared to 0%) in animals which received pioglitazone three days after treatment with CC1 4 .
  • Clouston AD et al. Steatosis and chronic hepatitis C: analysis of fibrosis and stellate cell activation. J Hepatol 2001; 34: 314-20.
  • Knobler H et al. Increased risk of type 2 diabetes in noncirrhotic patients with chronic hepatitis C virus infection. Mayo Clin Proc 2000; 75: 355-9.
  • Mehta SH et al. Prevalence of type 2 diabetes mellitus among persons with hepatitis C virus infection in the United States. Ann Intern Med

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Abstract

L'invention concerne un procédé de criblage d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR-récepteur nucléaire, de préférence RXR-PPAR. L'invention concerne également le composé capable de s'hybrider sélectivemment avec le gène ou un produit du gène codant pour les sous-unités RXR et PPAR dudit hétérodimère, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une infection par le virus de l'hépatite C, ou de la stéatose hépatique, de l'inflammation hépatique, des lésions hépatiques, de la cirrhose hépatique, du cancer post-hépatique associés ou non à une infection par le virus de l'hépatite C.

Description

Utilisation de composés modulant l 'activité de l ' hétérodimère RXR-PPAR à titre de médicament pour le traitement de l 'hépatite C, et procédé de criblage correspondan t
La présente invention est relative au domaine de la biologie médicale et plus particulièrement aux traitements préventifs et curatifs d' infection virale par le virus de l'hépatite C. L'invention concerne plus particulièrement un procédé de criblage d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR-récepteur nucléaire, de préférence RXR-PPAR. L'invention concerne également le composé susceptible d'être obtenu par le procédé de criblage de l'invention, notamment les composés agonistes de l' hetarodimere RXR-PPAR ainsi que d'un composé capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour les sous- unités RXR et PPAR du dit hétérodimère, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une infection par le virus de l'hépatite C, de la stéatose hépatique associée ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C, de l'inflammation hépatique et des lésions hépatiques associées ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C, ainsi qu'à la cirrhose hépatique et/ou au cancer post-hépatique associée ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C.
Le virus de l'hépatite C (VHC) a été identifié comme le principal agent responsable des hépatites post-transfusionnelles et liées à la toxicomanie (Kuo G, Science 1989). L'infection par le VHC représente un problème de santé publique majeur puisque sa fréquence en France est estimée à 1,3% (Roudot-Thoraval F, Hepatology 1998) . Plus de 600 000 personnes sont donc touchées par cette infection dans notre pays. Le VHC est caractérisé par une forte affinité pour les cellules du foie (hépatocytes) entraînant une inflammation aiguë de cet organe ou hépatite aiguë. Cette hépatite aiguë est le plus souvent asymptomatique sur le plan clinique et se transforme dans 80% des cas en hépatite chronique qui peut se compliquer de cirrhose et de cancer du foie (Poynard T, Lancet 1997) . On estime dans le monde que 3 millions de patients ont une hépatite virale C chronique dont 20% vont évoluer vers la cirrhose sur une période de 10 années; ces patients atteints de cirrhose auront alors un risque annuel de cancer du foie de 3%. Une autre complication de la maladie serait l'apparition de diabète puisque des études épidémiologiques récentes mettent en évidence que les patients porteurs du VHC ont un risque augmenté de diabète type II (risque relatif 2 à 6) (Mehta SH, Ann Intern Med 2000; Sangiorgio L, Diabètes Res Clin Pract 2000) . Le traitement de l'hépatite chronique C repose actuellement sur une association de deux molécules : l'interféron alpha et la ribavirine (McHutchison J, N Engl J Med 1998) . Ces médicaments ont de nombreuses contre-indications et sont globalement mal tolérés par les malades. De plus, cette association de médicaments est inefficace chez environ un patient sur deux malgré une utilisation prolongée (6 à 12 mois) . Un nouveau protocole thérapeutique par Interféron retard (Laboratoire Schering Plough) ayant obtenu l'AMM en mars 2001 va débuter dans notre pays. Les résultats attendus permettent une augmentation de la réponse au traitement de 10% pour un coût de 100 KF/an/patient . Face à l'absence de vaccin disponible et à la difficulté de traiter efficacement les malades atteints d'hépatite C, il est existe un besoin urgent et réel de développer de nouvelles stratégies préventives et thérapeutiques des hépatites C.
Ceci est justement l'objet de la présente invention. Les inventeurs ont ainsi identifié une nouvelle cible thérapeutique constituée par les récepteurs des proliférateurs des péroxysomes PPAR
(Peroxysome Proliferator-Activated Receptor) pour le traitement des infections par le virus de l'hépatite C.
L' identification de cette nouvelle cible repose sur les données récentes de la littérature et sur des résultats obtenus par les inventeurs. Le virus de l'hépatite C pénètre dans les hépatocytes en utilisant, en partie, le récepteur pour les lipoprotéines de faible densité (LDLR ou CD36) (Monazahian M, J Med Virol 1999) , puis se multiplie dans la cellule et peut ensuite en envahir d'autres. Cette infection induit une réponse immunitaire qui est le plus souvent incapable d'éliminer spontanément le virus ; ceci conduit à une hépatite chronique dans environ 80% des cas (Alter M, N Engl J Med 1992) . La qualité de la réponse immunitaire nécessaire à l'élimination du virus reste mal connue mais les inventeurs ont montré que la production d' interleu ine 4 (IL-4) constitue un facteur de mauvais pronostic pour l'évolution de l'infection (Dharancy et al.). D'autres cytokines sont également impliquées dans les mécanismes inflammatoires liés à l'infection par le virus de l'hépatite C notamment par la production de TNFα, IL-lβ et IL-18 (Nelson DR, Dig Dis Sci 1997; McGuinness PH, Gut 2000) conduisant à l'activation du complexe NFKB et à la production de molécules impliquées dans la réaction inflammatoire. Ces études sur la production de cytokines suggèrent que des récepteurs nucléaires pourraient être impliqués dans la régulation de la réponse immunitaire au cours des infections virales C. Ainsi, il a été démontré que l'IL-4 est la principale cytokine régulant l'expression de PPARγ qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la production de cytokines in lammatoires telles que le TNFα et l' IL-lβ via une inhibition de NFkB. L'infection par l'hépatite C est également à l'origine d'une surcharge graisseuse caractéristique des hépatocytes appelée stéatose hépatique (Goodman ZD, Semin Liver Dis 1995 ; Czaja A, J Hepatol 1998 ; Clouston AD, J Hepatol 2001) qui constitue la première manifestation clinique de l'infection par le virus de l'hépatite C. L'origine de cette stéatose hépatique est inconnue mais pourrait être secondaire à une modulation de l'activation de récepteurs nucléaires qui représentent une des plus grandes familles de facteurs de transcription dont certains peuvent être activés par de petites molécules lipophiles telles que les hormones et les nutriments par exemple. Une importante sous- famille de ces récepteurs nucléaires correspond aux facteurs ayant la propriété de former un hétérodimère avec le récepteur X pour les rétinoïdes (RXR) . Cette sous-famille est composée notamment du récepteur pour la vitamine D (VDR) , du récepteur pour l'acide rétinoïque (RAR) , du récepteur pour les hormones thyroïdiennes (TRs) , des proliférateurs des péroxysomes (PPARs), des récepteurs pour les acides biliaires (BAR aussi appelés FXR) , des récepteurs pour les oxystérols (LXRs) , les stéroides et les xénobiotiques (SXR aussi appelés PXR) .
Les récepteurs activés par les péroxysomes (PPAR) sont des récepteurs nucléaires capables de former un hétérodimère avec RXR. Il existe 4 types de PPAR : α, β, γ, δ. L'expression de PPAR α est principalement localisée dans le foie, le muscle et dans une certaine forme de tissu adipeux correspondant à la graisse brune. L'expression de PPAR δ ou β est ubiquitaire alors que PPAR γest produit essentiellement au niveau du tissu adipeux, des macrophages et des cellules épithéliales coliques. La production de PPARγ au niveau hépatique chez l'homme reste inconnue. Ces récepteurs PPARs interviennent dans la transcription de nombreux gènes cibles après fixation sur un élément de réponse spécifique de l'ADN (PPRE) . Différents ligands synthétiques et naturels peuvent fixer PPAR et l'activer. L'activation de PPAR conduit à différents effets biologiques dont l'activation, la différenciation et la prolifération des cellules graisseuses (adipocytes) , la régulation du métabolisme lipidique, la régulation de l'inflammation et la régulation de la réponse à l'insuline (Lehmann JM, J Biol Chem 1995) (Shoonjans K, Biochim Biophys Acta 1996). D'autres récepteurs qui s' hétérodimérisent avec le RXR tels que les LXR, TRs, BAR/FXR, et SXR/PXR sont fortement exprimés par les hépatocytes. Les récepteurs LXRs et FXR/BAR jouent probablement un rôle important dans l' homeostasie hépatique puisqu'ils contrôlent le métabolisme du cholestérol et des acides biliaires et qu' il existe une régulation entre ces récepteurs et PPAR. Ainsi, les PPARs sont capables d'induire l'expression de LXRα dans le foie (Tobin & Auwerx, Mol. Endo 2000) et les macrophages (Tontonoz & Evans, Mol. Cell, 2001) .
Les inventeurs proposent donc d'utiliser PPAR α, β, δ, γ les modulateurs de PPAR ainsi que les récepteurs nucléaires capables de former un hétérodimère avec RXR (LXR, TRs, BAR/FXR, et SXR/PXR) comme nouvelle cible thérapeutique et/ou nouvelles protéines thérapeutiques pour le traitement des hépatites virales C, et ceci en ayant une action sur la pénétration du virus dans les cellules, en diminuant la réaction inflammatoire et la fibrose et/ou en diminuant le risque de cancer.
Plus particulièrement la présente invention concerne un procédé de criblage d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR-récepteur nucléaire caractérisé en ce que le dit procédé comprend les étapes de (1) mise en contact en présence des réactifs nécessaires à la réalisation d'au moins une réaction de transcription du dit hétérodimère RXR-récepteur nucléaire avec au moins un gène rapporteur possédant l'ensemble des informations génétiques nécessaires à l'expression d'une protéine rapporteuse, le dit gène possédant au moins une séquence régulatrice RE ; (2) de mise en contact en présence des réactifs nécessaires à la réalisation d'au moins une réaction de transcription du dit hétérodimère RXR-récepteur nucléaire et du dit composé avec au moins un gène rapporteur possédant l'ensemble des informations génétiques nécessaires à l'expression d'une protéine rapporteuse et qui présente au moins une séquence régulatrice RE; (3) de détermination qualitative, facultativement quantitative, de l'expression de la dite protéine déclenchée aux étapes 1) et 2) puis comparaison desdites expressions; enfin (4) de sélection, facultativement d'identification, du composé si celui-ci est capable de moduler sélectivement l'expression de la dite protéine.
Par activité de l' hétérodimère, on entend désigner l'activité biologique ou la fonction biologique naturelle accomplie par l' hétérodimère dans une cellule vivante, c'est-à-dire une activité de facteurs de transcription. Un facteur de transcription au sens de la présente invention, est un facteur protéique diffusible capable de moduler positivement ou négativement l'expression d'un ou plusieurs gènes en interagissant avec leur (s) séquence (s) régulatrices (s) . De préférence, le dit hétérodimère RXR-récepteur nucléaire est sélectionné dans le groupe composé de RXR-PPAR, RXR-LXR, RXR-TR, RXR-BAR/FXR et RXR-SXR/PXR. Parmi les récepteurs aux stéroïdes SXR, il convient notamment de citer les récepteurs aux glucocorticoïdes (GR) , aux oestrogènes (ER) , aux minéralocorticoïdes (MR) , à la progestérone (PR). Par récepteurs nucléaires, on entend désigner des récepteurs qui possèdent une structure globale identique, à savoir : (1) une extrémité NH2 terminale de longueur variable, non conservée et spécifique du récepteur (domaine A-B du gène) ; (2) une région d'environ 65 acides aminés, très conservée (domaine C du gène) qui interagit avec l'ADN ; cette région contient deux motifs en doigts de gant ; (3) une région non conservée de longueur variable (domaine D) ; et (4) un domaine de longueur variable qui correspond à la zone où se fixe l'hormone ou le ligand (domaine E) .
Au sens de la présente invention, on entend désigner par séquence régulatrice RE (pour « responsive élément ») , des séquences nucléiques nécessaires à la régulation des gènes chez les eucaryotes. Ces séquences se distinguent de la séquence promotrice stricto sensu, qui correspond à la séquence où se fixe l'ARN- polymérase II. Les séquences régulatrices RE sont situées en général dans la région 5' amont des gènes, en amont de la séquence promotrice. Elles constituent des séquences CIS-régulatrices sur lesquelles viennent se fixer des facteurs de transcription qui agissent en TRANS. En général ces séquences RE confèrent une spécificité tissulaire aux gènes qui les possèdent. De préférence, la dite séquence régulatrice RE est sélectionnée dans le groupe composé de la séquence régulatrice PPRE de réponse à PPAR, de la séquence régulatrice LX-RE de réponse à LXR, de la séquence régulatrice TRE de réponse du récepteur aux hormones thyroïdiennes (TR) , de la séquence régulatrice BAR/FXR- RE de réponse à BAR/FXR et de la séquence régulatrice SXR/PXR-RE de réponse à SXR/PXR. Parmi les RE aux récepteurs aux stéroïdes (SXR-RE) , il convient notamment de citer la séquence régulatrice RE aux récepteurs aux glucocorticoïdes (GRE) , la séquence régulatrice RE aux récepteurs aux oestrogènes (ERE) , la séquence régulatrice RE aux récepteurs aux minéralocorticoïdes (MRE) , la séquence régulatrice RE aux récepteurs à la progestérone (PRE) .
De manière encore préférée, l' hétérodimère selon l'invention est RXR-PPAR et la séquence régulatrice RE (responsive élément) est PPRE.
L'ensemble des informations génétiques nécessaires à une réaction de transcription est connu de l'homme de l'art ; il s'agit d'au moins un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la transcription, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Facultativement, le gène rapporteur transcrit peut être traduit. Pour cela il est indispensable que l'ARNm possède les signaux d'initiation et de terminaison de la traduction.
Le gène rapporteur peut être présent sous forme linéaire, de préférence il est clone dans un vecteur d'expression, permettant l'expression de la protéine rapporteur dans un hôte cellulaire. Le vecteur peut être maintenu de façon stable ou non dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion du polypeptide traduit. Les différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards telles par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, 1' électroporation, le choc thermique.
Le composé obtenu par le procédé de criblage active ou augmente l'expression du dit gène rapporteur. Alternativement, le composé obtenu par le procédé de criblage, de préférence abolit ou inhibe l'expression du dit gène rapporteur.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le procédé de criblage se caractérise en ce que au moins une étape est réalisée dans une cellule vivante. Selon un mode préféré de réalisation au moins les étapes 1 et 2 du procédé sont réalisées dans une cellule vivante. Parmi les cellules dans lesquelles le procédé de criblage selon l'invention est réalisée, il convient de citer les cellules procaryotes, telles que les bactéries et notamment Escherichia coli, les levures, notamment Saccharomyces cerivisiae, les cellules animales. De préférence, il s'agit de cellules de mammifères choisies de préférence parmi les cellules humaines, de souris, de rat, de lapin, de hamster. Il entre également dans l'étendue de l'invention de réaliser le criblage de composés de l'invention sur des animaux de laboratoire ou à partir de cellules dérivées d'animaux de laboratoire. Ces animaux de laboratoire, de préférence la souris, le rat ou le lapin, sont de manière préférée génétiquement modifiés pour exprimer un transgène qui possède l'ensemble des informations génétiques nécessaires à l'expression d'une protéine rapporteuse, le dit gène possédant au moins une séquence régulatrice RE, de préférence PPRE. Ce transgène peut être présent dans le génome d' au moins une cellule de l'animal transgénique, cette intégration étant faite soit par recombinaison homologue ou par intégration aléatoire. Alternativement, le transgène est présent sous forme épisomale.
Alternativement, le procédé peut être un procédé de criblage in vitro caractérisé en ce que les étapes sont réalisées dans un système acellulaire. Dans ce cas, ce procédé est réalisé en présence de réactifs nécessaires à la réalisation d'au moins une réaction de transcription, et facultativement en présence de réactifs nécessaires à la réalisation d'au moins une réaction de traduction de la protéine rapporteuse tel par exemple le lysat de réticulocyte de lapin. Ces différents procédés in vitro sont bien connus de l'homme de l'art (Sambrook et al . , 1989).
Dans le procédé de criblage selon la présente invention, toute procédure ou test classique peut être mise en œuvre pour aboutir à l'étape 3 du dit procédé à l'obtention d'un signal détectable et/ou quantifiable représentatif de la quantité dudit produit d'expression présent dans le milieu réactionnel, en fonction du produit d'expression recherché. De préférence, le produit d'expression est un polypeptide correspondant au produit de traduction de l'ARNm coresppondant au dit gène rapporteur ; dans ce cas, ce produit d'expression est mis en évidence et facultativement quantifié par la méthode dite de « Western blot » ou par immunohistochimie bien connue de l'homme de l'art. Lorsqu'il s'agit d'un produit de transcription (ARNm) codant pour le dit gène rapporteur, celui-ci peut être mis en évidence, facultativement quantifié par RT-PCR, par Northern blotting, ou par la méthode dite d'hybridation in situ également bien connues de l'homme de l'art.
Selon un mode préféré de réalisation, la dite protéine rapporteuse est sélectionnée dans le groupe des protéines autofluorescentes et des enzymes détectables par un procédé histochimique. De préférence, la protéine autofluorescente est choisie dans le groupe composé de la protéine de fluorescence verte (GFP) , de la protéine de fluorescence verte augmentée (EGFP) , de la protéine de la protéine de fluorescence rouge (RFP) , de la protéine de la protéine de fluorescence bleue (BFP) , de la protéine de fluorescence jaune (YFP) et des variants fluorescents de ces protéines. Alternativement, ledit gène rapporteur code pour un enzyme détectable par un procédé histochimique choisie dans le groupe composé de la β-galactosidase, de la β-glucoronidase, de la phosphatase alcaline, de la glucose-oxydase, de la glucose amylase, de l'anhydrase carbonique, de l' acétyl-choline estérase, du lyzozyme, de la malate deshydrogénase, de la glucose-6 phosphate deshydrogénase, de la deshydrogénase alcoolique, de la luciférase, de la chloramphénicol-acétyl-transférase, de l'hormone de croissance. Plus généralement, le dit gène rapporteur peut correspondre à n' importe quel gène qui possède au moins une séquence régulatrice amont PPRE. Ce peut être un gène présent dans son environnement naturel ou un gène génétiquement manipulé afin de placer une séquence codante sous le contrôle d'une séquence promotrice fonctionnelle comportant au moins la séquence RE, de préférence PPRE. La présente invention concerne également le composé susceptible d'être obtenu par le procédé de criblage selon l'invention ainsi que tous composés modulant l'activité d'un hétérodimère RXR-récepteur nucléaire.
Selon un premier mode de réalisation, ce composé active ou augmente l'activité de l' hétérodimère RXR- récepteur nucléaire, notamment RXR-PPAR.
De manière préférée le composé est sélectionné dans le groupe composé de PPARα, PPARβ, PPARγ, PPARδ, RXR, d'un ligand agoniste naturel ou synthétique de PPARα, PPARγ, PPARβ, PPARδ, RXR, de RXR-récepteur nucléaire, de préférence de RXR-PPAR et notamment RXR-PPARα, RXR- PPARβ, RXR-PPARγ, RXR-PPARδ. Ce ligand agoniste de RXR- PPAR est de préférence choisi dans le groupe composé des prostaglandines J2, des acides gras polyinsaturés, des thiazolinédiones, des anti-inflammatoires non- stéroidiens, des fibrates, notamment du fénofibrate, de la pioglitazone. Parmi les composés agonistes, il convient également de citer les anticorps anti- idéotypique correspondant aux composés PPARα, PPARβ, PPARγ, PPARδ, RXR.
Selon un second mode de réalisation, le composé susceptible d'être obtenu par le procédé de criblage selon l'invention abolit ou inhibe l'activité de 1' hétérodimère RXR-récepteur nucléaire. De préférence, il s'agit d'un ligand antagoniste naturel ou synthétique. On entend désigner par ligand antagoniste, les composés susceptibles de diminuer ou d'abolir le taux d'expression et/ou l'activité de RXR-récepteur nucléaire, notamment RXR-PPAR. Le terme "antagoniste" se réfère à une molécule qui, lorsqu'elle se lie au polypeptide selon l'invention, diminue la quantité ou la durée des effets de l'activité biologique du polypeptide RXR-PPAR. Parmi les composés susceptibles d'être obtenus par le procédé de criblage selon l'invention qui abolissent ou inhibent l'activité de l' hétérodimère RXR-récepteur nucléaire, on peut citer les polynucléotides capables de s'hybrider spécifiquement avec le RE, de préférence PPRE. Ainsi par exemple le dit polynucléotide entre en compétition avec l' hétérodimère RXR-PPAR pour la fixation sur l'élément de réponse PPRE. Le polynucléotide peut également correspondre à la séquence RE, de préférence PPRE en excès, afin de fixer par excès de substrat 1' hétérodimère RXR-récepteur nucléaire, de préférence RXR-PPAR, sur la séquence RE, de préférence PPRE du polynucléotide. Le polynucléotide peut également correspondre à un oligonucléotide anti-sens. Dans ce cas, le polynucléotide est capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour les sous-unités RXR et PPAR. Les oligonucléotides selon l'invention présente une taille minimale de 9 bases, de préférence d'au moins 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 40, 50 bases. Selon encore un autre mode de réalisation, ce composé peut être un anticorps, ou fragment d'anticorps, monoclonal ou polyclonal dirigé spécifiquement contre RXR-récepteur nucléaire, de préférence RXR-PPAR ; de manière préférée, l'anticorps selon l'invention est dirigé contre la sous-unité PPAR de l' hétérodimère, de préférence il s'agit d'une sous- unité de type PPARγ. Parmi les anticorps selon l'invention, on peut citer les anticorps polyclonaux de lapin dirigé contre PPARγ et commercialisés par WAK- CHEMIE (Bad Soden, Allemagne) ou par TEBU (Le Perray en Yvelines, France) . En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments dirigés contre le récepteur PPARγ, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel « Antibodies » (Harlow et al., 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention peuvent être obtenus par exemple à partir de cellule d'un animal immunisé contre la protéine PPARγ, ou un de ses fragments comportant l'épitope spécifique (déterminant de la protéine responsable de l'interaction spécifique avec l'anticorps). Ladite protéine récepteur PPARγ, ou un de ses fragments, pourra notamment être produite, selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la séquence de l'ADNc codant pour la protéine récepteur PPARγ, ou par synthèse peptidique. Les fragments d' anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur l'épitope de la protéine PPARγ sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux ou polyclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al., 1988 et King et al., 1991. Un fragment selon l'invention pourra également être fragment Fc. Les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière, les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al . (1978) .
Les ligands agonistes et antagonistes incluent les protéines, les acides nucléiques, les carbohydrates, les lipides, les composés chimiques. Parmi les ligands agonistes et antagonistes de nature protéique, il convient de désigner l'ensemble des polypeptides naturels susceptibles d' interagir avec l' hétérodimère RXR-récepteurs nucléaires, de préférence RXR-PPAR.
Par ligand ou composé, on entend définir tous les composés susceptibles d' interagir directement ou indirectement avec la fixation de l' hétérodimère RXR- récepteur nucléaire, de préférence RXR-PPAR sur la séquence RE, de préférence PPRE ; un ligand au sens de la présente invention forme un complexe qui affecte l'activité transcriptionnelle, c'est-à-dire augmente, diminue, module ou invalide la transcription d'un gène sous le contrôle d'un promoteur contenant une séquence d'ADN RE à laquelle se lie l' hétérodimère RXR-récepteur nucléaire .
C'est également un des objets de l'invention de fournir un kit ou un nécessaire pour le criblage de ligands susceptibles d'affecter l'activité transcriptionnelle d'un gène rapporteur dont la séquence promotrice comporte au moins une séquence RE, de préférence PPRE susceptible de lier un hétérodimère RXR-récepteur nucléaire, de préférence RXR-PPAR, et caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) un gène, facultativement clone dans un vecteur d'expression, et facultativement présent dans une cellule vivante; (ii) un ligand ; (iii) les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction de transcription et/ou de traduction.
Selon un autre aspect, le composé ou ligand selon l'invention est utilisé à titre de médicament et notamment en tant que principes actifs de médicament pour l'homme ou les animaux. Le composé est préférentiellement sous forme soluble, associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de véhicule employé habituellement dans la préparation de compositions injectables, c'est-à-dire un diluant, un agent de suspension tel une solution saline isotonique ou tamponnée. De préférence, le composé est administré par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR-récepteur nucléaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une infection par un virus qui utilise pour réaliser son cycle viral au moins une protéine cellulaire codée par un gène qui présente au moins une séquence régulatrice RE. De préférence, la dite protéine cellulaire est le récepteur pour les lipoprotéines de faible densité (LDLR ou CD36) et le dit virus est le virus de l'hépatite C.
De préférence le dit hétérodimère RXR-récepteur nucléaire est sélectionné dans le groupe composé de RXR-PPAR, RXR-LXR, RXR-TR, RXR-BAR/FXR et RXR-SXR/PXR. Selon un mode préféré de réalisation, la dite séquence régulatrice RE est sélectionnée dans le groupe composé de la séquence régulatrice PPRE de réponse à PPAR, de la séquence régulatrice LX-RE de réponse à LXR, de la séquence régulatrice TRE de réponse du récepteur aux hormones thyroïdiennes (TR) , de la séquence régulatrice BAR/FXR-RE de réponse à BAR/FXR et de la séquence régulatrice SXR/PXR-RE de réponse à SXR/PXR ; de préférence, il s'agit de PPRE. De manière préférée, le dit hétérodimère RXR-récepteur nucléaire est RXR-PPAR et la dite séquence régulatrice RE est PPRE.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR- récepteur nucléaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une infection, par le virus de l'hépatite C, de cellules sélectionnées parmi les hépatocytes, les cellules biliaires, les cellules parenchymateuses du foie, les cellules du sang circulant. L'invention concerne également l'utilisation d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR- récepteur nucléaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une hépatite chronique.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR- récepteur nucléaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de la stéatose hépatique associée ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR- récepteur nucléaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'inflammation hépatique et des lésions hépatiques associées ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR- récepteur nucléaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de la cirrhose hépatique et/ou d'un cancer post-hépatique associé ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR- récepteur nucléaire pour la préparation d'un médicament destiné au contrôle du métabolisme glucidique et/ou au traitement préventif et/ou curatif du diabète de type II chez les patients porteurs du virus de l'hépatite C. La présente invention concerne également, l'utilisation d'un composé selon l'invention ou d'un composé capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour RXR et/ou PPAR pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une infection par un virus qui utilise pour réaliser son cycle viral au moins une protéine cellulaire codée par un gène qui présente au moins une séquence régulatrice RE, de préférence PPRE. De préférence, la dite protéine cellulaire est le récepteur pour les lipoprotéines de faible densité (LDLR ou CD36) et le dit virus est l'hépatite C.
Egalement, la présente invention concerne l'utilisation d'un composé selon l'invention ou d'un composé capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour RXR et/ou PPAR pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé selon l'invention ou d'un composé capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour RXR et/ou PPAR pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de la stéatose hépatique associée ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C. La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé selon l'invention ou d'un composé capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour RXR et/ou PPAR pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'inflammation hépatique et des lésions hépatiques associée ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C. La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé selon l'invention ou d'un composé capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour RXR et/ou PPAR pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de la cirrhose hépatique et/ou d'un cancer post-hépatique associée ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C. L'invention concerne également un produit comprenant au moins un composé selon l'invention ou un composé capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour RXR et/ou PPAR et au moins un agent anticancéreux comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie anti-cancéreuse. La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé selon l'invention ou d'un composé capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour RXR et/ou PPAR pour la préparation d'un médicament destiné au contrôle du métabolisme glucidique et/ou au traitement préventif et/ou curatif du diabète de type II chez les patients porteurs du virus de l'hépatite C.
Enfin, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant un composé selon l'invention modulant l'activité d'un hétérodimère RXR- récepteur nucléaire, de préférence RXR-PPAR, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable à titre de médicament pour le traitement préventif et/ou curatif d'un homme ou d'un animal infecté par le virus de l'hépatite C, caractérisé en ce que l'aptitude dudit composé à moduler sélectivement l'activité du dit hétérodimère est déterminée par (a) la mise en contact en présence des réactifs nécessaires à la réalisation d'au moins une réaction de transcription du dit hétérodimère avec au moins un gène possédant l'ensemble des informations génétiques nécessaires à l'expression d'une protéine, le dit gène possédant au moins une séquence régulatrice RE, de préférence PPRE ; (b) la mise en contact en présence des réactifs nécessaires à la réalisation d'au moins une réaction de transcription du dit hétérodimère et du dit composé avec au moins un gène possédant l'ensemble des informations génétiques nécessaires à l'expression d'une protéine et qui présente au moins une séquence régulatrice RE, de préférence PPRE ; (c) la détermination qualitative, facultativement quantitative, de l'expression de la dite protéine déclenchée en a) et b) puis comparaison desdites expressions; (d) enfin l'identification du composé qui module sélectivement l'expression de la dite protéine. L'invention concerne également une composition pharmaceutique pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection par le virus de l'hépatite C caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé selon l'invention ou d'un composé capable de s'hybrider sélectivement avec le gène ou un produit du gène codant pour RXR et/ou PPAR. Cette composition peut contenir en outre au moins un agent antiviral comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie antivirale liée à une infection par le virus de l'hépatite C ; cet agent antiviral est sélectionné de préférence dans le groupe composé de l'interféron alpha (IFNα), de la ribavirine, de l'interféron retard.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples représentés ci-après. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes.
FIGURES
Figure 1 : Mise en évidence de l'expression des récepteurs nucléaires PPAR au niveau des cellules hépatiques d'individus sains (témoins) et de patients infectés par le virus de l'hépatite C (HVC) . Quantification par RT-PCR compétitive de PPARγ exprimée en nombre de molécules d'Arnm de PPARγ par molécules d'ARNm de β-actine dans les cellules hépatiques de 10 témoins et de 21 patients atteints d'hépatite C chronique. La moyenne est représentée et les écarts à la moyenne sont indiqués.
Figure 2a : Expression hépatique des ARN messagers de RXRα, VDR, LXRα, PPARα, PPARδ et PPARγ dans des échantillons de foies humains prélevés chez des patients ayant une hépatite chronique C et des sujets contrôles en utilisant la technique de RT-PCR semi- quantitative. Les résultats sont exprimés en moyennes ± déviation standard par rapport aux foies contrôles sains .
Figure 2b : Concentration hépatique de l'ARNm de
PPARα dans des échantillons de foies humains prélevés chez des patients atteints d'une hépatite C chronique et chez des contrôles sains en utilisant la technique de RT-PCR compétitive. Les résultats sont exprimés en moyennes ± déviation standard par rapport aux foies contrôles sains.
Figure 3 : Expression hépatique de PPARα dans des échantillons de foies humains prélevés chez des patients présentant une cirrhose induite par le HCV (n=3), une cirrhose induite par le HBV (n=2), une cirrhose alcoolique (n=5) et des contrôles sains (n=5) en utilisant la technique du Western blot. Les résultats sont exprimés en moyennes ± déviation standard.
Figure 4 : L'expression de PPARα dans des cellules sanguines mononuclées circulantes (PBMC) humaines prélevées chez les patients atteints d'une hépatite C chronique et des contrôles sains en utilisant la technique de RT-PCR compétitive (4a) et la technique de Western blot (4b) . Les résultats sont exprimés en moyenne ± déviation standard par rapport aux foies contrôles sains.
Figure 5 : Susceptibilité de la souris PPARγ+ " envers une hépatite aiguë induite par le CC14. Les scores de nécrotico-inflammatoires (A) sont exprimés en moyenne ± déviation standard. L'intensité des lésions est évaluée par analyse histologique des foies de souris tuées deux jours après induction de l'hépatite par administration de CC14 (lμm/kg) en utilisant le score de Ishak. La mortalité (B) est exprimée en pourcentage de létalité deux jours après l'administration du CC14.
Figure 6: Susceptibilité des souris PPARα" _ envers une hépatite aiguë induite par le CC14. Les scores nécrotico-inflammatoires (A) sont exprimés en moyenne ± déviation standard. L'intensité des lésions a été évaluée par analyse histologique en utilisant le score de Ishak sur des foies de souris tuées 5 jours après induction de l'hépatite par administration de CC1 (lμm/kg) . La mortalité (B) est exprimée en pourcentage de léthalité 5 jours après l'administration de CC14.
Figure 7: La quantification de l'ARN messager de PPARα dans les clones N3, N4 et SWX en utilisant la RT- PCR compétitive. Les résultats montrent un taux d'inhibition de l'expression de PPARα de 90% pour le clone N4 (a) et de 23% pour le clone N3 (b) . Les résultats sont représentés comme la moyenne ± déviation standard.
EXEMPLES
1_. Matériels et méthodes
1.1 Quantification de PPARs et autres R formant un hétérodimère avec RXR dans le foie par PCR :
La quantification par RT-PCR des PPARs et autres récepteurs nucléaires formant un hétérodimère avec RXR a été effectuée sur des biopsies de foie. Toutes les biopsies avaient une taille équivalente et la moyenne de poids est de 8 ± 4 mg. Les biopsies étaient immédiatement congelées et stockées à -80°C. Après l'incubation des prélèvements dans le Trizol, les acides nucléiques étaient extraits à l'aide de chloroforme. Suite à un traitement de 30 min à 37 °C avec 20-50 unités de DNase I RNase-free, les ARN totaux étaient rétro-transcrits en ADNc comme précédemment décrit. Le mélange réactionnel issu de la RT était amplifié par PCR à l'aide d'amorces sens et antisens spécifiques pour ces récepteurs et pour la β-actine. Les échantillons ont été soumis à 20-40 cycles de PCR et la quantification de l'ADNc était effectuée près électrophorèse sur gel d'agarose à 3%. Comme la quantification fine de l'ARN dans les échantillons est souvent difficile et imprécise, le nombre de molécules d'ARNm de récepteurs nucléaires était exprimé en comparaison avec le nombre de molécules d'ARNm d'un contrôle interne, la β-actine, dans le même échantillon.
1.2 Quantification de PPARs et autres récepteurs nucléaires (RN) formant un hétérodimère avec RXR dans le foie par estern-blot : Des extraits de protéines totales sont obtenus par homogénéisation de biopsies de foie dans un tampon de lyse constitué de PBS avec 1% de NP-40, 0,5% de désoxycholate de sodium, 0.1% de sodium dodecyl sulfate et un cocktail classique d'inhibiteurs de protéases. La séparation des protéines totales (50 μ) , le transfert sur membrane de PVDF et l' immunodétection des PPAR et autres RN formant un hétérodimère avec RXR par incubation de la membrane avec un antisérum polyclonal de lapin pendant 12 heures (dilution l/500e, TEBU, Le Perray en Yvelines, France) ont été effectués comme précédemment décrit. Le complexe est révélé par chimioluminescence (ECL, Amersham, UK) . Les résultats sont exprimés en unité de densité optique (DO) pour 50 ng de protéines totales. 1.3 Immunomarquage de PPARs et autres RN formant un hétérodimère avec RXR dans le foie : Les biopsies de foie sont fixées dans du paraformaldéhyde 4%, incluses dans la paraffine et coupées à 4 micromètres pour l' immunohistochimie et 1' immunofluorescence. Les coupes sont préincubées 30 minutes à température ambiante dans une solution de blocage contenant de l'avidine D et de la biotine (Blocking Kit, SP2001, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) . Elles sont ensuite exposées à un anticorps spécifique dirigé contre les PPARs ou autres RN formant avec un hétérodimère avec RXR pendant 2 heures à température ambiante. Les coupes sont lavées en PBS contenant 0,05% de Triton X 100 et incubées avec un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin biotinylé (dilution l/500e pendant 30 minutes, Dako, Trappes, France) . Le complexe immun est détecté grâce à 1' avidine-biotine couplé à la peroxydase (ABCOMPLEX/HRP, Dako, Trappes, France) et révélé à l'aide de 3, 3' -diaminobenzidine (DAB, Dako, Trappes, France). Comme contrôle négatif, l'anticorps primaire est remplacé par un sérum de lapin irrelevant.
1.4 Patient et collecte des spécimens de foie et de sang.
L'étude a été approuvée par le Comité Ethique local et tous les sujets ont donné leur consentement éclairé. Les biopsies de foie sont réalisées sur 20 patients atteints d'hépatite C chronique (7 femmes, 13 hommes ; moyenne d'âge 43 ± 12 ans, gamme 21 à 70 ans).
L'hépatite C chronique est définie par la présence d'anomalies biochimiques (taux moyen d'AST (amino- transférase) dans le sérum : 94 ± 61 U/l) , la positivité au test immunologique enzymatique du virus de l'hépatite C (EIA), la présence d'ARN du HCV dans le sérum détecté par PCR ( charge virale moyenne : 603 330 ± 480 000 copies/ml) , et par les données histologiques consistantes (index d'activité histologique moyenne : 6,5 ± 2,4). Comme contrôles inflammatoires, les biopsies de foie sont traitées dans les mêmes conditions chez des patients atteints d'hépatites chroniques B (n=3) , et des patients atteints de cirrhose alcoolique (n=5) . Les biopsies chirurgicales de foies histologiquement sains sont obtenues par hépatectomie de 14 patients opérés pour des métastases du foie. Les patients et les contrôles n'ont reçus aucun traitement (thérapie anti-virale, drogues hépatotoxiques, corticostéroïdes, traitement immuno-suppresseur) avant, ni pendant l'étude, et aucun d'entre eux ne consomment plus de 20g d'alcool par jour .
Tous les spécimens de biopsies sont traitées dans les mêmes conditions et tous les échantillons ont une taille similaire et un poids moyen de 4 ± 1 mg. Les biopsies sont coupées en deux parties. Elles sont immédiatement congelées dans de l'azote liquide et stockées à -80°C pour les analyses protéiques et d'ARN messagers des récepteurs nucléaires. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC, pour peripheral blood mononuclear cells) sont isolées à partir de sang frais héparine obtenu à partir de 10 volontaires sains informés et de 10 patients atteints d'hépatite chronique C. Après élimination du plasma riche en plaquettes, le sang est centrifugé sur Ficoll- Hypaque pendant 20 minutes à 4°C, les cellules mononucléaires de l' interphase sont collectées, lavées deux fois puis resuspendues et stockées à -80°C pour les analyses proteiques et d'ARNm des récepteurs nucléaires .
1.5 Cellules exprimant la protéine du corps du virus de l'hépatite C (HCV). La lignée cellulaire transfectée de carcinome hépato-cellulaire humain (HepG2) est utilisée pour analyser l'impact de la protéine du corps du HCV sur l'expression de PPARα. Les cellules HepG2 sont transfectées telles que décrit précédemment (Barba et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94 : 1200-1205) avec le vecteur pEF352 neo comportant, sous le contrôle du promoteur du facteur la d' élongation, un ADNc du HCV incluant les séquences HCV lb du corps jusqu'à la région NS3. Deux clones indépendants exprimant de manière stable la protéine du corps du HCV ont été analysés (clone N3 et N4). Le clone transfecté avec le vecteur vide est utilisé comme contrôle négatif (clone SWX) . Ces différents clones sont cultivés à 37 °C sous une atmosphère comprenant 5% de C02 et maintenu dans un milieu de culture Eagle's modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fétal et comprenant de la pénicilline-streptomycine. Les cellules sont cultivées jusqu'à confluence puis les boites de cultures sont grattées et les cellules sont récoltées pour préparer les extraits cellulaires.
1.6 Induction de l'hépatite induite par le CC14 dans les souris .
Les expériences avec les animaux sont réalisées dans un établissement accrédité (N°B59-108 et B67-218- 5) selon les directives gouvernementales n°86/609/CEE. Les animaux sont groupés dans des cages (5 à 6 animaux par cage) et ont un libre accès à de l'eau et de la nourriture pour rongeur. Pour une étude d'une pathologie aiguë induite par le CC1 , les souris sont anesthésiées pendant 10 minutes et une injection intra- péritonéale d'une solution 1 :1 de CC14 et d'huile minérale stérile à une dose de lml/kg d'animal est réalisée. Les souris contrôles reçoivent une dose d'huile minérale en utilisant la même technique. Premièrement, les souris PPARα-/- et PPARγ+/- toutes les deux sur un fond génétique 129/Sv sont utilisées (la souris homozygote PPARγ-/- n'est pas viable) pour vérifier la susceptibilité potentielle au développement de l'hépatite chez ces animaux invalidés. Dans un second type d'expérience, des souris sauvages maies Balb/c sont utilisées dans des études d'intervention avec l'agoniste de PPARγ, la pioglitazone (50mg/kg). Ce composé est administré une fois par jour par gavage oral en commençant 3 jours avant l'induction de l'hépatite. Les animaux sont tués par dislocation cervicale entre les jours 2 à 5 après l'administration de CC1 . Les foies sont récupérés puis fixés sur la nuit dans du paraformaldéhyde à 4% puis inclut dans de la paraffine. Les sections sont colorées avec de 1' hématoxyline et de l'éosine puis examinée en aveugle par un pathologiste puis évaluée selon le score de Ishak (Ishak, et al . J. Hepatol. 1995, 22 : 696-699).
1.7 Quantification des ARN messagers des récepteurs nucléaires et de la β-actine par RT-PCR.
L'ARN est isolé à partir d'échantillon de foie et de cellules mononucléaires avec le réactif TRIzol® (Life Technologies, Cergy Pontoise, France) tel que décrit par le fabricant. Après un traitement à 37 °C pendant 30 minutes avec 20 à 50 unités de DNase I RNAse-free (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) l'ARN total (lOμg) est reverse transcrit en ADNc. Le mélange réactionnel de reverse transcription est amplifié par PCR en utilisant des amorces sens et anti-sens spécifiques des récepteurs nucléaires (RXRα, LXRα, VDR, PPARα, PPARβ, PPARγ) et de la β-actine. Les échantillons sont soumis à 40 cycles de PCR (Perkin-Elmer Corporation, Foster City, California, USA) . La quantification de l'ADNc est réalisée par électrophorèse sur gel d'agarose 2 à 3% en utilisant un analyseur d'images (Gel Analyst, Clara Vision, Paris, France) . Une quantification précise de l'ARN dans l'échantillon est souvent difficile et imprécise, le nombre de molécules d'ARN messagers de PPARα dans les foies est exprimé en comparaison du nombre de 106 molécules d'ARNm d'un contrôle interne, en l'occurrence la β-actine dans le même échantillon.
1.8 Quantification de PPARα par analyse en Western blot.
La préparation de protéines est réalisée dans des biopsies de foie et de cellules mononucléaires telles que précédemment décrites. Les extraits proteiques totaux sont obtenus par homogénéisation de tissus et de cellules dans un tampon d'extraction composé de PBS (Phosphate Buffered Saline) avec 1% de NP-40, 0,5% de sodium déoxycholate, 0,1% de sodium dodécyle sulfate et un cocktail classique d'inhibiteurs de protéases. Les protéines totales sont ensuite séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide puis électrotransférées. L' immuno-détection avec un second anticorps conjugué à la peroxydase et avec de la chemiluminescence est réalisée selon les instructions du fabricant (ECL, Hamersham, UK) . Les résultats sont exprimés comme des unités de densité optique pour 50μg de protéines totales.
1.9 Méthodes statistiques . La comparaison de la moyenne ± l'écart type des ARN messagers et des protéines de PPARγ entre les patients avec une colite ulcéreuse (UC, ulcerative colitis) et la maladie de Crohn (CD, crohn disease) et les contrôles est analysée par le test ANOVA unique non paramétrique Kruskal-Wallis . Les différences sont statistiquement significatives si p est < à 0,05.
2. Mise en évidence de l'expression des récepteurs nucléaires au niveau hépatique .
Par des techniques de PCR, les inventeurs ont mis en évidence chez 10 témoins et 21 patients atteints d'hépatite virale C chronique des taux comparables et importants de PPARγ au niveau hépatique (Figure N°l) .
Les études par Western blot et immunohistochimie donnent des résultats comparables mettant en évidence l'expression de la protéine PPARγ en particulier au niveau des hépatocytes. Le même type d'étude est en cours pour montrer l'expression de PPAR α, β, δ et de LXR, TRs, BAR/FXR, et SXR/PXR. La présence en grande quantité de ces récepteurs dans le foie laisse supposer que les modulateurs de PPAR α, β, δ, γ et de LXR, TRs, BAR/FXR, et SXR/PXR seront actifs au niveau hépatique.
3. Modulation de l'expression hépatocytaire du CD36 par les récepteurs nucléaires .
Grâce à l'utilisation de lignées d' hépatocytes (HepG2, HuH7) maintenues en culture avec des agonistes et/ou des antagonistes de PPAR α, β, δ, et de LXR, TRs, BAR/FXR, et SXR/PXR, nous avons mis en évidence par immunohistochimie respectivement une augmentation et une diminution de l'expression de CD36 par les hépatocytes. Ces résultats sont en cours de confirmation par d'autres techniques de PCR, western blot et cytométrie de flux.
Parallèlement, la réalisation de prélèvements hépatiques chez des souris sauvages et des souris invalidées pour les différentes isoformes de PPAR et pour LXR, TRs, BAR/FXR, SXR/PXR a été réalisée. La quantification du CD36 dans ces différents modèles mettent également en évidence l'implication in vivo de ces récepteurs nucléaires dans l'expression de CD36 au niveau hépatique. De même, l'utilisation de modulateurs pour ces récepteurs nucléaires permettra aux inventeurs de contrôler chez des animaux sauvages leurs rôles sur l'expression de CD36 au niveau hépatique.
4. Rôles anti-inflammatoires et anti-fibrosants des récepteurs nucléaires au niveau hépatique .
Etant donné qu'aucun modèle animal en-dehors du singe ne peut être infecté par le virus C et a fortiori développer une hépatite virale C, des hépatites induites par des agents chimiques (tetrachloride de carbone) sont utilisées pour mettre en évidence l'effet anti-inflammatoire et anti-fibrosant des modulateurs des récepteurs nucléaires PPARs, LXR, TRs, BAR/FXR, SXR/PXR. Les premiers résultats macroscopiques témoignent de l'effet anti-inflammatoire de ces différents modulateurs. 5. Activation de PPRE par le virus de l'hépatite C ou le sang de patients contaminés par le virus de l'hépatite C.
Des hépatocytes sont transfectés par un gène rapporteur (luciférase) sous la contrôle d'un élément de réponse (PPRE, LXRE, ... ) pour les récepteurs décrits plus haut. La visualisation de l'activation du gène rapporteur par le virus mettra en évidence l'implication de PPAR ou des autres récepteurs au cours de l'infection par le virus C.
6. Rôle des fénofibrates , agoniste de PPARα, sur la gravité des hépatites virales C .
Le rôle des fénofibrates sur la gravité des lésions hépatiques sera analysé dans la cohorte de patients suivis par les inventeurs au CHRU de Lille. Le rôle de ces agonistes de PPARα sera évalué sur des critères biologiques et histologiques .
7. Expression des récepteurs nucléaires durant l'infection par le HCV.
En utilisant la technique de RT-PCR, les inventeurs ont quantifié les ARN messagers de RXRα,
VDR, LXRα, PPARα, PPARδ et PPARγ dans des échantillons de foies prélevés sur des patients atteints d'hépatite C chronique et d'individus sains contrôles. Alors que des concentrations similaires d'ARN messagers de β-actine sont observées partout dans les deux groupes testés, le taux d'expression de l'ARNm de PPARα est particulièrement abaissé (15 ± 1,8 versus 198 ± 35,5, p=0,0003), de même pour PPARβ (6 ± 2,25 versus 40 ± 14, p=0,0002) et une tendance à la baisse est également observée pour le taux d'expression de l'ARNm de PPARγ dans le foie de patients infectés par le HCV comparé à des contrôles sains (Figure 2A) . Le déficit hépatique en concentration de PPARα est confirmé en utilisant la technique de RT-PCR compétitive (51 ± 25,7 versus 304 ± 110, p=0,0006) (figure 2B) .
Pour analyser plus avant le taux d'expression anormal d'ARNm PPARα dans le foie de patients infectés par le HCV, les inventeurs ont utilisé une analyse Western blot pour quantifier la protéine PPARα dans les mêmes échantillons. Les inventeurs ont réalisés un Western blot en utilisant un anticorps dirigé contre PPARα dans le foie d'individus contrôle et de patients infectés par le HCV. Compte-tenu des considérations éthiques des inventeurs ont utilisé des foies expiantes prélevés sur des patients qui subissaient une transplantation hépatique car ils étaient atteints de cirrhoses associées à une infection au HCV. En utilisant cette analyse, la densité optique (OD) de foies infectés par le HCV apparait moins intense que celle de foies contrôles (figure 3) suggérant que l'expression à la fois des protéines et des ARNm de PPARα est affectée dans le foie de patients infectés par le HCV.
A l'inverse de l'expression de PPARα dans les PBMC n'est pas différente chez les patients infectés par le HCV par rapport aux contrôles sains au niveau des taux d'ARNm (12,36 ± 6,18 versus 13,15 ± 6,57) (figure 4a) ainsi qu'au niveau protéique (421 210 ± 6 899 versus 270 504 ± 82 252) (figure 4b) . Ce résultat suggère qu'une expression anormale de PPARα pourrait être confinée au seul foie et ne pas s'étendre à d'autres cellules exprimant classiquement PPARα.
8. Susceptibilité accrue des souris PPARγ^" et PPARα~/- à l'hépatite induite par le CC14.
Comme l'a démontré la précédente étude, 1' hétérodimère PPAR/ RXR est impliqué dans la régulation du processus inflammatoire; les inventeurs ont donc émis l'hypothèse que le défaut d'expression de PPARα dans le foie est susceptible d'influencer le développement de l'inflammation après une blessure hépatique.
Dans ce but, les inventeurs ont cherché à déterminer si une souris hétérozygote pour la déficience en PPARγ (PPARγ+ ~) ou homozygote pour une déficience en PPARγ (PPARγ" _) était davantage susceptible de développer une hépatite aiguë induite par le CC14. Ces souris ainsi que les souris sauvages de la même portée sont de fond génétique 129/Sv. Par rapport aux individus sauvages PPARγ+ + de la même portée, les souris PPARγ+ " ont davantage de lésions microscopiques hépatiques prononcées évaluées selon Ishak (10,6 ± 0,22 versus 4 ± 0,8) (figure 5a). Les lésions hépatiques sont caractérisées par une nécrose confluente à certains endroits avec des ponts multiples liant différentes structures vasculaires. L' infiltra inflammatoire est modéré concernant de quelques unes à l'ensemble des aires portales. Cette susceptibilité à l'hépatite aiguë est associée avec un taux de mortalité dramatiquement augmenté (40% par rapport à 0%) (Figure 5b) seulement 2 jours après l'injection de CC14.
Par rapport aux individus sauvages PPARα+ +, les souris PPARα~ _ développent 5 jours après une injection avec le CC1 , des lésions microscopiques hépatiques beaucoup plus prononcées (9,2 ± 0,7 versus 4,2 ± 0,13) (Figure 6a) . Ces lésions sont caractérisées par une nécrose confluente dans la plupart des régions et une légère infiltration inflammatoire portale. Néanmoins, ces lésions apparaissent être moins sévères que pour les souris PPARγ+/". Cette augmentation des lésions hépatiques est également associée avec un taux de mortalité supérieur (50% versus 0%) (Figure 6b) . 9. Expressions perturbées de l'ARNm de PPARα dans les cellules HepG2 transfectées par le core .
Comme de nombreuses études ont démontré la régulation de la transcription de plusieurs gènes cellulaires immuno-régulateurs par le core du HCV, les inventeurs ont testé si la protéine du core du HCV pouvait influencer l'expression de PPARα dans les lignées cellulaires d' hépatocytes humains transfectés. En utilisant la RT-PCR compétitive, les inventeurs ont quantifié la concentration cellulaire de l'ARNm de PPARα dans deux clones indépendants de HepG2 exprimant de manière stable (clone N3 et N4) ou non (clone SWX) la protéine du core du HCV. Alors que des concentrations similaires d'ARNm de β-actine est observée dans les deux clones testés, un taux d'expression d'ARN messager de PPARα plus bas est observé dans les clones transfectés comparé aux clones SWX. Les taux d'inhibitions moyens de l'expression de PPARα est de 90% pour le clone N4 (figure 7a) et de 23% pour le clone N3 (figure 7b) comparé aux cellules SWX contrôles correspondantes.
Ainsi, ces résultats suggèrent que l'expression anormale de l'ARNm de PPARα observée durant l'hépatite C chronique peut être le résultat d'une interaction directe ou indirecte entre la protéine du corps de HCV et de PPARα. 10. L'hépatite aiguë induite par le CC14 est amélioré par les agonistes de PPARγ.
Les inventeurs ont caractérisé le développement de l'hépatite aiguë dans des souris Balb/c soumises à un traitement au CC14 alors que les souris contrôles tuées trois jours après l'administration d'huile minérale ne présentaient pas de lésions microscopiques dans le foie. Trois jours après l'induction de l'hépatite, les inventeurs ont évalués l'activation de PPARγ sur l'hépatite induite par CC14 en utilisant la pioglitazone (50μg/kg/jr) de manière préventive. Par rapport aux souris sans régime préventif, le taux de mortalité lié à l'hépatite est diminué (40% par rapport à 0%) chez les animaux qui ont reçu de la pioglitazone trois jours après le traitement avec le CC14.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un composé modulant l'activité d'un hétérodimère RXR-récepteur nucléaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une infection par un virus qui utilise pour réaliser son cycle viral au moins une protéine cellulaire codée par un gène qui présente au moins une séquence régulatrice RE.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le dit hétérodimère RXR- récepteur nucléaire est sélectionné dans le groupe composé de RXR-PPAR, RXR-LXR, RXR-TR, RXR-BAR/FXR et RXR-SXR/PXR.
3. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que le dit hétérodimère est RXR- PPAR.
4. Utilisation selon les revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la dite séquence régulatrice RE est sélectionnée dans le groupe composé de la séquence régulatrice PPRE de réponse à PPAR, de la séquence régulatrice LX-RE de réponse à LXR, de la séquence régulatrice TRE de réponse du récepteur aux hormones thyroïdiennes (TR) , de la séquence régulatrice BAR/FXR-RE de réponse à BAR/FXR et de la séquence régulatrice SXR/PXR-RE de réponse à SXR/PXR.
5. Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que la dite séquence régulatrice RE est PPRE.
6. Utilisation selon les revendications 3 à 5 caractérisée en ce que le dit hétérodimère RXR- récepteur nucléaire est RXR-PPAR et la dite séquence régulatrice RE est PPRE.
7. Utilisation sellon les revendications 1 à 6 caractérisée en ce que la dite protéine cellulaire est le récepteur pour les lipoprotéines de faible densité (LDLR ou CD36) .
8. Utilisation selon les revenications 1 à 7 caractérisée en ce que le dit composé active ou augmente l'activité de l' hétérodimère RXR-récepteur nucléaire.
9. Utilisation selon la revenication 8 caractérisée en ce que le dit composé est sélectionné dans le groupe composé de PPARα, PPARβ, PPARγ, PPARδ, RXR, d'un ligand agoniste naturel ou synthétique de PPARα, PPARβ, PPARγ, PPARδ, RXR, RXR-PPARα, RXR-PPARβ, RXR-PPARγ, RXR-PPARδ.
10. Utilisation selon la revendication 9 caractérisée en ce que le dit ligand agoniste de RXR- PPARα, RXR-PPARβ, RXR-PPARγ, RXR-PPARδ est choisi dans le groupe composé des prostaglandines J2, des acides gras polyinsaturés, des thiazolinédiones, des antiinflammatoires non-stéroidiens, des fibrates, de la pioglitazone .
11. Utilisation selon les revenications 1 à 7 caractérisée en ce que le dit composé abolit ou inhibe l'activité de l' hétérodimère RXR-récepteur nucléaire.
12. Utilisation selon les revendications 1 à 11 caractérisée en ce que le dit virus est le virus de l'hépatite C.
13. Utilisation selon la revendication 12 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une infection par le virus de l'hépatite C de cellules sélectionnées parmi les hépatocytes, les cellules biliaires, les cellules parenchymateuses du foie, les cellules du sang circulant.
14. Utilisation selon les revendications 1 à 13 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif d'une hépatite chronique.
15. Utilisation selon les revendications 1 à 13 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de la stéatose hépatique associée ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C.
16. Utilisation d'un composé selon les revendications 1 à 13 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'inflammation hépatique et des lésions hépatiques associée ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C.
17. Utilisation d'un composé selon les revendications 1 à 13 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de la cirrhose hépatique et/ou d'un cancer post-hépatique associée ou non à une infection des hépatocytes par le virus de l'hépatite C.
18. Utilisation d'un composé selon la revendication 1 à 13 pour la préparation d'un médicament destiné au contrôle du métabolisme glucidique et/ou au traitement préventif et/ou curatif du diabète de type II chez les patients porteurs du virus de l'hépatite C.
19. Composition pharmaceutique pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection par le virus de l'hépatite C caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé tel que défini à l'une des revendications 9 ou 10.
20. Composition selon la revendication 19 caractérisée en ce qu' elle contient en outre au moins un agent antiviral comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie antivirale liée à une infection par le virus de l'hépatite C.
21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, caractérisée en ce que ledit agent antiviral est sélectionné dans le groupe composé de l'interféron alpha (IFNα), de la ribavirine, de l'interféron retard.
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