EP1292322A1 - Agents immunosuppresseurs derives de morbillivirus - Google Patents

Agents immunosuppresseurs derives de morbillivirus

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EP1292322A1
EP1292322A1 EP01951595A EP01951595A EP1292322A1 EP 1292322 A1 EP1292322 A1 EP 1292322A1 EP 01951595 A EP01951595 A EP 01951595A EP 01951595 A EP01951595 A EP 01951595A EP 1292322 A1 EP1292322 A1 EP 1292322A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
mice
morbillivirus
nucleoprotein
preparation
fragment
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01951595A
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German (de)
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Inventor
Branka Horvat
Julien Marie
Jeanne Kehren
Hélène VALENTIN
Chantal Rabourdin-Combe
Marie-Claude Biemont
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Original Assignee
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1292322A1 publication Critical patent/EP1292322A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to immunosuppressive agents derived from morbilliviruses.
  • the genus morbillivirus of the family Paramyxoviridae, includes in particular the measles virus
  • VPPR VPPR
  • Morbilliviruses are enveloped viruses.
  • the viral envelope of lipoprotein nature comprises two glycoproteins, hemagglutinin (HA) and the fusion protein (F) composed of two subunits F x and F 2 .
  • the HA protein is involved in fixing the virus on the receptor of host cells.
  • the RV receptor has been identified, at least in the case of vaccine strains, as being the CD46 membrane glycoprotein, expressed on all cells except erythrocytes.
  • the viral genome consisting of a single-stranded RNA of negative polarity, is protected by a nucleocapsid, a ribonucleoprotein particle of helical form.
  • the nucleocapsid is composed of three proteins: the nucleoprotein (NP) directly associated with viral RNA and two other proteins, also associated with RNA, phosphoprotein (P) and protein L, involved in the replication and transcription of viral genome.
  • NP nucleoprotein
  • P phosphoprotein
  • protein L protein L
  • T lymphocytes from the circulating blood of patients infected with a pathogenic strain or with a vaccine strain of VR exhibit a reduction in the capacity to proliferate in response to mitogens, allergens or booster antigens [COOVADIA et al . , Arch. Dis. Child, 53, no. 11, 861-867, (1978); HIRSCH et al. , this . supra; BORRO and OLDSTONE, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 191, 85-100, (1995); HUSSEY et al., Cf. supra].
  • the inventors have now developed a murine experimental model allowing the study of immunosuppression induced by morbilliviruses.
  • this inhibition of the cell-mediated immune response mainly involved the NP protein, and more particularly a region corresponding to approximately 125 C-terminal amino acids of this protein, and that it did not require the intervention of the CD46 cell receptor.
  • the envelope glycoproteins F and H as well as the CD46 receptor increase the immunosuppressive effect.
  • morbilliviruses can induce immunosuppression in a host different from their natural host, which shows a non-species specificity of the mechanisms governing the immunosuppression induced by these viruses.
  • the subject of the present invention is the use of a protein preparation comprising at least one morbillivirus nucleoprotein or a fragment thereof comprising all or part of the C-terminal region of approximately 100 to 130 amino acids of said nucleoprotein, for obtaining a drug which inhibits the cell-mediated immune response.
  • said fragment comprises at least one sequence of said C-terminal region which is conserved between the nucleoproteins of different morbilliviruses, and in particular between the nucleoproteins of the morbilliviruses VR, VMC, and VPPR.
  • said C-terminal region represents the portion of the nucleoprotein the sequence of which diverges the most from one morbillivirus to another, there are nevertheless within this region, several very conserved portions (cf. for example DIALLO et al. [J. Gen. Virol., 75, 233-237, (1994)].
  • - a fragment comprising amino acids 489-506 of the peptide sequence of the nucleoprotein of the measles virus, or the corresponding sequence of the nucleoprotein of another morbillivirus; - a fragment comprising amino acids 516-625 of the peptide sequence of the nucleoprotein of the measles virus, or the corresponding sequence of the nucleoprotein of another morbillivirus.
  • a preparation of proteins which can be used in accordance with the invention also comprises the envelope glycoproteins F and H of a morbillivirus.
  • a preparation which can be used in accordance with the invention can for example be obtained by inactivation of a morbillivirus, in particular by radiation treatment ultra-violet; it can also be obtained from proteins, or their fragments, mentioned above.
  • Morbillivirus proteins and their fragments which can be used in accordance with the invention, are known in themselves; they can be prepared by conventional methods, for example by purification from viral cultures, or advantageously, by genetic engineering, or by peptide synthesis.
  • the inhibition of cell-mediated immunity induced by morbillivirus protein preparations is comparable to that obtained during treatment with a high dose of anti-inflammatory drugs, or based on powerful immunosuppressants, such as dexamethasone.
  • the present invention can be implemented as part of the prevention or treatment of all pathologies where it is desirable to inhibit the cell-mediated immune response.
  • examples include inflammatory pathologies, resulting in particular from infection with a pathogenic agent (leprosy, tuberculosis, leishmaniasis, listeriosis, candidiasis, etc.) or allergic contact dermatitis induced by various sensitizing agents. It can also be used in the prevention or treatment of transplant rejection, or of graft versus host disease.
  • the present invention can also be used in the context of the development of new vaccines, in particular anti-measles vaccines, lacking immunosuppressive effects or having attenuated immunosuppressive effects.
  • These vaccines can in particular be obtained from morbilliviruses in which all or part of the nucleoprotein, and in particular the C-terminal region of 110 to 130 amino acids approximately from said nucleoprotein has been deleted or altered. It can be altered in particular by one or more modifications at the level of at least one of the sequences conserved between the different morbilliviruses and / or by deletion of one or more of said sequences conserved.
  • said modification or said deletion relates to at least one sequences 411-421, 489-506, or 516-625, mentioned above.
  • the present invention also relates to methods for evaluating the immunosuppressive potential of a preparation of a morbillivirus, for example of an anti-morbillivirus vaccine, or of a preparation which can be used as an immunosuppressant in accordance with the invention.
  • said immunosuppressive potential is evaluated by determining the amount of NP protein of said morbillivirus present in said preparation.
  • said method comprises bringing said preparation into contact with at least one antibody directed against said NP protein, and preferably, at least one antibody directed against an epitope carried by the region C-terminal of approximately 110 amino acids of said NP protein, and the quantification of the antibody / antigen complex formed, by any appropriate means, known in themselves to those skilled in the art.
  • said immunosuppressive potential is evaluated by the use of mice sensitized to DNFB or to KLH.
  • mice are transgenic mice expressing the CD46 receptor.
  • Transgenic mice expressing the CD46 receptor are known in themselves; they can for example be obtained as described by THORLEY et al. [Eur. J. Immunol., 27, 726-734, (1997)] or by EVLASHEV et al. [J. Virol., 74, 1373-1382, (2000)].
  • EXAMPLE 1 INHIBITION OF DELAYED HYPERSENSITIVITY REACTIONS IN MICE BY MEASUREMENT VIRUS INACTIVE TO UV.
  • VR Edmonston ATCC VR-24
  • RSV respiratory syncitial virus
  • the viruses were spread separately on fibroblastic monkey kidney cells (Vero). After mechanical lysis of the cells, carried out when 50% of them have a cytopathic appearance, the cell lysate containing the infectious viral particles was frozen at -80 ° C. and thawed, then centrifuged and finally stored at -80 ° C. Each batch of virus was inactivated by exposure to UV (254 nm) for 45 min at 4 ° C. The loss of infectiousness was tested on Vero cells. A “dummy” preparation consisting of the supernatant of cultures of uninfected Vero cells was used as a control.
  • Intra-peritoneal injections of VR were carried out either on wild type mice or on transgenic mice expressing the CD46 molecule.
  • DNFB 2,4-dinitrofluorobenzene, SIGMA
  • HSC contact hypersensitivity reaction
  • T and T 0 are respectively the values of the thickness of the ear before and after elicitation.
  • Delayed hypersensitivity was measured by a conventional test to measure leg pad edema.
  • the mice Six hours after the injection of the viral preparation or of the dummy preparation, the mice were sensitized by subcutaneous injection of 300 ⁇ g of KLH (keyhole limpet hemocyanin, SIGMA) emulsified in complete Freund's adjuvant. 7 days later, a second injection (150 ⁇ g of KLH in PBS buffer) was carried out in the pads of the left paw of sensitized animals, and non-sensitized animals of a control group; PBS alone was injected into the right paw. The thickness of the pads was measured 24 hours before and 48 hours after the booster injection. The edema of the pads is calculated by the following formula: [(TT 0 ) right pad] - [(TT 0 ) left pad], where T and T 0 are the values of the pad thickness before and after the booster injection.
  • mice injected with VR-UV develop a delayed hypersensitivity response, whether it is contact hypersensitivity, or tuberculin-type hypersensitivity, approximately half as large as the control mice injected. with a dummy preparation.
  • control mice injected with VRS-UV develop a delayed hypersensitivity response, equivalent to that of control mice injected with the dummy preparation.
  • VR therefore induces immunosuppression in vivo, in the absence of any viral replication.
  • EXAMPLE 2 ROLE OF NUCLEOPROTEIN (NP) OF THE ROUGEOLE VIRUS IN THE INHIBITION OF DELAYED HYPERSENSITIVITY REACTIONS IN MICE.
  • the recombinant nucleoprotein was prepared according to the following protocol: Sf-9 cells of Spodoptera frugiperda were infected at a rate of 1 PFU per cell, by a recombinant baculovirus (AcNPVNP), comprising the NP NP coding sequence. After three days of culture, the cells collected by centrifugation (200 g, 5 min, 4 ° C) and the cell pellet washed in PBS buffer. The cells were then placed in a hypotonic buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM NaCl) and lysed by the addition of a nonionic detergent, Nonidet P-40 1%.
  • a hypotonic buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM NaCl
  • protease inhibitors were added at the time of cell lysis and the lysates were kept at 4 ° C.
  • the lysates were centrifuged at 1000 g, then an ultracentrifugation (1000 g, 10 min) in the presence of 10 M EDTA was carried out, thus eliminating cell debris.
  • the recovered supernatant was centrifuged in CsCl for
  • This gradient is composed of steps of 2 ml of 40% CsCl (W / V), 2 ml of 30% CsCl, 2 ml of 25% CsCl and 2 ml of 5% sucrose
  • Figure 2 (a) DNFB hypersensitivity test in C57BL / 6 mice
  • NP induces in C57BL / 6 mice an inhibition of the hypersensitivity reaction similar to DNFB to that caused by VR-UV . Additional experiments carried out with lower concentrations of NP show that this effect is dose-dependent; the inhibition induced by the injection of 40 ⁇ g of NP is slightly weaker than that observed after injection of 100 ⁇ g, and no inhibition is observed after injection of 4 ⁇ g of NP.
  • mice To analyze the role of the VR envelope proteins in induced immunosuppression in mice, a recombinant measles virus lacking the HA and F envelope glycoproteins was used, either on C57BL / 6 mice or on transgenic mice expressing the CD46 molecule.
  • the transgenic mice for CD46 were produced by the injection, in mouse oocytes, of the cDNA of the human gene coding for the molecular isoform CD46
  • the VR Edmonston tag (EDtag) is a recombinant VR derived from the Edmonston strain by molecular cloning of the entire genome [TOBER et al. , J. Virol., 72, no. 10, 8124-8132, (1998)].
  • VR MGV is a recombinant VR devoid of the HA and F envelope glycoproteins [SPIELHOFER et al. , J. Virol. , 72, no. 3, 2150-2159, (1998)].
  • the VR strains were propagated, harvested, and inactivated by UV according to the protocol described in Example 1 above.
  • MGV-UV is also comparable to that generated by VR-UV or the recombinant EDtag-UV control virus.
  • DNBS 2,4-dinitrobenzene sulfonic acid
  • 100 ⁇ g of NP, 5 ⁇ 10 6 particles of VR-UV, or 500 ⁇ l of dummy preparation were injected into the peritoneal cavity of the mice, and the animals were then sensitized to DNFB, according to the protocol described in Example 1 above.
  • the spleen of each animal was removed and a cell suspension was produced by grinding the organs between plates of sintered glass.
  • the splenocytes were washed and the red blood cells lysed in the presence of 0.83% NH 4 C1 for 5 minutes at 37 ° C.
  • Splenocytes were similarly isolated from spleens of naive mice, then irradiated at 1500 rad and loaded with hapten by incubation in a solution of DNBS 4 mM in order to play the role of CPAg.
  • splenocytes sensitized mice and splenocytes loaded hapten were co-cultured in RPMI 1640 10% FCS at 2 ⁇ lO ⁇ cells per ml. After 5 days in culture, the splenocytes restimulated by culturing in the presence of APCs are the effector population • the test.
  • EL-4 cells (10 6 cells per ml), acting as target cells were cultured in RPMI 1640, 10% FCS and in the presence of tritiated thymidine (10 ⁇ Ci per ml of culture medium for 3 hours at 37 ° C), then washed twice in RPMI 1640 10% SVF.
  • a part of the EL-4 cells labeled with tritium was then loaded with DNBS as described above.
  • the target cells were distributed in 96-well plates at the rate of 2 ⁇ 10 4 cells per well.
  • the effector cells were also distributed in the same wells in a decreasing target / effector ratio.
  • Control wells spontaneous lysis
  • LTCD8 T lymphocytes constituting the effector population involved in contact hypersensitivity to DNFB [KEHREN et al. , J. Exp. Med., 189, no. 5, 779-786, (1999) 3, it was investigated whether the inhibition of the HSC reaction to DNFB induced by VR-UV and NP was due to a defect in activation of LTCD8 during awareness phase. The experiments were carried out on C57BL / 6 mice, on transgenic mice expressing the CD46 molecule, or on mice lacking the Fc ⁇ R receptor.
  • the LTCD8 of each mouse originating from the lymph nodes draining the zone of application of DNFB, were isolated according to the following protocol:
  • lymph nodes draining the area of application of the aptene (inguinal, sub-brachial and axillary) of each animal were removed 4 days after sensitization of the animals, and placed in RPMI 1640, 10% SVF.
  • the cells were then incubated 30 min at 37 D C in the presence of rat monoclonal antibodies. ' GK1.5
  • M5 / 114 (anti-class II), RB6-8C5 (anti-granulocytes).
  • the cells were washed in RPMI 1640 10% FCS. The cells were then incubated for 30 min at 4 ° C. with shaking in the presence of magnetic beads coupled to an immunoglobulin directed against rat antibodies (BIOMAG). The cells bound to the antibodies, recognized by the immunoglobulins present on the surface of the beads, were eliminated by passing the suspension over a magnet. The purification of the lymphocytes was verified by labeling the cells selected negatively with an anti-CD8 antibody and an analysis by flow cytometry. The cell population thus negatively selected consisted of more than 95% of CD8 T lymphocytes.
  • the LT CD8 thus isolated were co-cultured for three days in the presence of either CPAg prepared from splenocytes of naive mice, coupled to DNBS, or coupled with a control hapten, TNBS (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid , SIGMA), or CPAg coupled to DNBS prepared from splenocytes of mice having received 100 ⁇ g of NP, 5 ⁇ 10 6 particles of VR-UV, 500 ⁇ l of dummy preparation, or 500 ⁇ l of PBS buffer by injection into the peritoneal cavity.
  • the CPAg were prepared according to the protocol described in Example 4 above.
  • LT CD8 T lymphocytes were cultured at the rate of 5 ⁇ 10 5 cells per well in the presence of 10 6 CPAg coupled or not with a hapten.
  • CPAg Cspecific progenitor
  • LT CD8 and CPAg were cultured separately to ensure the absence of spontaneous proliferation of LT CD8 and proper irradiation of CPAg.
  • Cell culture was carried out for 90 hours. After 72 hours, 0.5 ⁇ Ci of tritiated thymidine were added to each well, the cells were transferred to filters, and the number of counts per minute was counted in the presence of scintillation liquid (ALLAC counter).
  • ALLAC counter scintillation liquid
  • the hapten specific proliferation indices were calculated according to the following formula: [Cpm (LTCD8 + CPAg coupled to hapten)] / [Cpm (LTCD8 + CPAg not coupled to -'haptene)]
  • the values of the mean indices of specific proliferation of the antigen are represented by FIGS. 5 (a) (CPAg of naive mice) and 5 (b) (CPAg of mice having received the same treatment as the LTCD8 donors). The results illustrated in FIG.
  • mice 5 (a) show that the LTCD8 of mice injected with the dummy preparation and sensitized respond strongly to the CPAg of naive mice coupled to DNBS, but not to the CPAg of naive mice coupled with a control hapten, which shows the antigen-specific nature of the response.
  • mice injected with the preparation of VR-UV or NP an inhibition of the response of the LTCD8 of the C57BL / 6 mice or of the CD46 mice to the CPAg of naive mice coupled to DNBS is observed. This inhibition is not observed in the case of LTCD8 from mice lacking the Fc ⁇ R receptor.
  • results illustrated in FIG. 5 (b) show that, in the presence of CPAg originating from mice injected with VR-UV, or from NP, the specific antigen proliferation of CD8 T lymphocytes of C57BL / 6 mice or transgenic for CD46, sensitized DNFB is inhibited.
  • CD8 T cells from sensitized mice having received an injection of VR-UV or NP have a proliferation of CD8 T cell proliferation.
  • the CPAg from mice injected with VR-UV or NP are unable to activate CD8 T lymphocytes in vitro.
  • mice were sensitized to DNFB as described in Example 1 above. 5 days later, 100 ⁇ g of NP, 5 ⁇ 10 6 particles of VR-UV, or 500 ⁇ l of dummy preparation were injected into the peritoneal cavity of the mice, and the application of DNFB was carried out 6 hours later, according to the protocol described in Example 1 above.
  • FIGS. 6 (a) The thickness of the edema at different times following the application of DNFB was measured, and the results are illustrated in FIGS. 6 (a) for the C57BL / 6 mice and 6 (b) for the transgenic mice for CD46.
  • the VR-UV inhibitory effect is also analogous to that observed in the case of an injection carried out before there sensitization to DNFB (cf. Example 3). A complete inhibition of the formation of edema is observed.
  • the amount of nucleoprotein in virus preparations was measured by ELISA.
  • 96-well plates were coated with anti-NP 33.4 antibodies [LIBEAU et al. , Vet. Rec, 134, 300-304, (1994)] in carbonate buffer (1/600 dilution of ascites liquids).
  • C57BL / 6 mice or mice lacking the Fc ⁇ R receptor received intraperitoneal injections of 5 ⁇ 10 6 particles of UV-inactivated Square Disease Virus (MCV-UV), of 100 ⁇ g of VR NP, of 5 ⁇ 10 6 particles of VR-UV, or 500 ⁇ l of PBS, and were then sensitized to DNFB, according to the protocol described in Example 1 above.
  • MCV-UV UV-inactivated Square Disease Virus
  • mice non-sensitized mice
  • NPs are only effective in mice deficient in the FcR receptor ( Figure 7b), indicating the need for FcR for the immunosuppressive effect of morbilliviruses.
  • NPc was purified from the QIAexpressionist® cell pellet from QIAGEN, according to the protocol indicated by the manufacturer.
  • C57BL / 6 mice received intraperitoneal injections of 100 ⁇ g of PPRVNP, 100 ⁇ g of VR-NPc, 1 g of dexamethasone or 500 ⁇ l of PBS, and were then sensitized to KLH, according to the protocol described in Example 1 above.
  • Figure 8 represents the average size of the edema of the pads at 24 hours and 48 hours after the booster injection.
  • the mixed lymphocyte reaction constitutes an in vitro model of allograft rejection.
  • mice BALB / c mice were injected intraperitoneally with 10 5 particles of VR-UV, or 500 ⁇ l of dummy preparation.
  • splenocytes were prepared from the spleens of these mice, and stimulated, in mixed culture, with splenocytes obtained from C57BL / 6 mice irradiated at 1500 rad.
  • results are illustrated in FIG. 9. These results show an inhibition, by the VR-UV of the reaction of BALB / c mouse lymphocytes in response to stimulation by C57BL / 6 mouse cells.

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Abstract

L'invention est relative à l'utilisation de nucléoprotéines de morbillivirus, ou de fragments de celles-ci comprenant la portion C-terminale de 100 à 130 acides aminés pour la préparation de médicaments immunosuppresseurs, ainsi qu'à l'utilisation de morbillivirus dans lesquels ladite portion C-terminale a été délétée ou altérée, pour la préparation de vaccins.

Description

AGENTS IMMUNOSUPPRESSEURS DERIVES DE MORBILLIVIRUS
La présente invention est relative à des agents immunosuppresseurs dérivés de morbillivirus.
Le genre morbillivirus, de la famille des Paramyxoviridae, comprend notamment le virus de la rougeole
(VR) , le virus de la Maladie de Carré (VMC) , le virus de la peste bovine, et le virus de la peste des petits ruminants
(VPPR) . Ils présentent un tropisme infectieux étroit. Par exemple, le virus de la rougeole n'infecte que l'homme et quelques espèces de grands singes.
Les morbillivirus sont des virus enveloppés .
L'enveloppe virale, de nature lipoprotéique comprend deux glycoprotéines, 1 ' hémagglutinine (HA) et la protéine de fusion (F) composée de deux sous-unités Fx et F2. La protéine HA intervient dans la fixation du virus sur le récepteur des cellules de l'hôte. Chez l'homme, le récepteur du VR a été identifié, du moins dans le cas des souches vaccinales, comme étant la glycoprotéine membranaire CD46, exprimée sur toutes les cellules à l'exception des érythrocytes . Le génome viral, constitué d'un ARN simple brin de polarité négative, est protégé par une nucléocapside, particule ribonucléoprotéique de forme hélicoïdale. La nucléocapside est composée de trois protéines : la nucléoprotéine (NP) directement associée à l'ARN viral et deux autres protéines, également associées à l'ARN, la phosphoprotéine (P) et la protéine L, impliquées dans la réplication et la transcription du génome viral. La cohésion de l'ensemble enveloppe-nucléocapside est assurée par la protéine de matrice (M) localisée à l'interface de la nucléocapside et de l'enveloppe virale.
L'existence d'effets i munosuppresseur's résultant d'une infection par le VR est connue depuis longtemps. Elle a été décrite pour la première fois en 1908 par VON PIRQUET qui a rapporté que la majorité des patients atteints de rougeole présentait une diminution transitoire de l'intensité de la réaction d'hypersensibilité retardée cutanée aux tests tuberculiniques [VON PIRQUET, Dtsch. Med. Wochenschr . , 30, 1297-1300, (1908)]. Ces effets immunosuppresseurs ont depuis été confirmés par d'autres chercheurs [TAMASHIRO et al. ; Pediatr. Infect. Dis., 6, 451-454, (1987) ; BECKFORD et al . , S. Afr. Med. J. , 68, no. 12, 858-863, (1985) ; HIRSCH et al., Clin. Immunol. Immunopath . , 31, 1-12, (1984)], et il est reconnu qu'en favorisant le développement d'infections secondaires, ils constituent une cause majeure des décès consécutifs aux infections par le VR.
En outre, cette immunosuppression a également été observée, bien qu'à un degré moindre, dans le cas de la vaccination anti-rougeoleuse, où l'on utilise des souches vivantes atténuées du virus de la rougeole [FIREMAN et al., Pediatrics, 43, 264-272, (1969) ; WEISS, Science, 258, 546- 547, (1992) ; HUSSEY et al., J. Infect. Dis., 173, 1320-1326, (1996) ; BOUCHAUD et MOUAS, Ann.. Med. Interne, 149, no. 6, 351-360, (1998) ] .
Il a été observé que les lymphocytes T issus du sang circulant de patients infectés par une souche pathogène ou par une souche vaccinale de VR, présentent une réduction de la capacité à proliférer en réponse à des mitogènes, des allergènes ou des antigènes de rappel [COOVADIA et al . , Arch. Dis. Child, 53, no. 11, 861-867, (1978) ; HIRSCH et al . , ci . supra ; BORRO et OLDSTONE, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 191, 85-100, (1995) ; HUSSEY et al., cf. supra] .
Les mécanismes régissant les effets immunosuppresseurs des morbillivirus, et notamment du VR, sont encore mal connus. En effet, faute de modèle expérimental animal facile à étudier, la plupart .des observations concernant ces mécanismes ont été effectuées in vitro. II a ainsi été observé que le VR induisait une mort par apoptose de cellules immunitaires infectées, telles que les macrophages [ESOLEN et al . , J. Virol . , 69, no. 6, 3955-3958, (1995)], les cellules épithéliales thymiques [VALENTIN et al . , J. Virol. 73, no. 3, 2212-2221, (1999)], et les cellules dendritiques dérivées de monocytes [FUGIER- VIVIER et al . , J. Exp . Med., 186, no. 6, 813-823, (1997) ; SCHNORR et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, no. 10, 5326- 53331, (1997)] ou de sang de cordon ombilical [GROSJEAN et al . , J. Exp. Med., 186, no. 6, 801-812, (1997)], ainsi qu'une perte de la réponse lymphoproliférative aux mitogènes et un arrêt du cycle cellulaire des lymphocytes T en phase G0/Gχ [McCHESNEY et al . , J. Immunol . , 140, no. 4, 1269-1273, (1988) ; NANICHE et al . , J. Virol., 73, no. 3, 1894-1901, (1999)]. Une inhibition de la production d'anticorps par les lymphocytes B infectés in vi tro a également été observée [GALAMA et al . , Cell Immùno., 50, no. 2, 405-415, (1980) ; CASALI et al . , J. Exp. Med., 159, no. 5, 1322-1337, (1984)], ainsi qu'une perturbation de la production de cytokines par les lymphocytes T et les cellules présentatrices d'antigène [GRIFFIN, Curr. Top Microbiol. Immunol., 191, 117-134, (1995) ; LEOPARDI et al . , J. Immunol., 149, no. 7, 2397-2401, (1992) . Les composants viraux impliqués dans ces différents effets restent encore mal connus.
SCHLENDER et al. [Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 93, no. 23, 13194-13199, (1996)] et NIEWIESK et al. [J. Virol., 71, 7214-7219, (1997)] rapportent que le VR ou le VR inactivé aux UV (VR-UV) , induit in vi tro une perte de la prolifération des lymphocytes T induite par un mitogène ; cet effet impliquerait les protéines d'enveloppe H et F.
Il a également été observé que l'interaction du VR inactivé aux UV avec la molécule CD46 inhibait la sécrétion d'IL-12 par les monocytes [KARP et al . , Science, 273, no. 5272, 228231, (1996)].
Enfin, RAVANEL et al., [J. Exp. Med., 186, 269-
278, (1997)] rapportent que la protéine NP affecte les fonctions des lymphocytes B en inhibant leur production d'immunoglobuline [RAVANEL et al., J. Exp. Med., 186, no. 2,
269-278, (1997) ] .
Il apparaît donc que les connaissances actuellement disponibles sur les effets immunosuppresseurs des morbillivirus sont encore très fragmentaires. En outre, les résultats disponibles résultant principalement d'études in vi tro sur des populations cellulaires isolées ne reflètent qu'imparfaitement la complexité des interactions physiologiques aboutissant à la réponse immunitaire. Une meilleure connaissance du ou des mécanisme (s) impliqué (s) dans l' immunosuppression induite par les morbillivirus peut notamment permettre d'obtenir de nouveaux traitements immunosuppresseurs, ou bien de préparer des vaccins anti-morbillivirus dépourvus d'effets immunosuppresseurs ou ne présentant que des effets immunosuppresseurs atténués.
Les Inventeurs ont maintenant développé un modèle expérimental murin permettant l'étude de l' immunosuppression induite par les morbillivirus.
Ils ont ainsi pu observer que, même en l'absence de toute réplication virale, les protéines de morbillivirus induisaient une inhibition de la réponse immunitaire à médiation cellulaire (réactions de type IV selon la classification de GELL et COOMBS) , selon 2 modalités différentes :
1) une inhibition de l'hypersensibilité de contact, CD8 dépendante ;
2) une inhibition de l'hypersensibilité retardée de type tuberculinique, CD4 dépendante.
Ils ont également constaté que, de façon surprenante, cette inhibition de la réponse immunitaire à médiation cellulaire impliquait principalement la protéine NP, et plus particulièrement une région correspondant à environ 125 acides aminés C-terminaux de cette protéine, et qu'elle ne nécessitait pas l'intervention du récepteur cellulaire CD46. Les glycoprotéines d'enveloppe F et H ainsi que le récepteur CD46 augmentent toutefois l'effet immunosuppresseur . Les Inventeurs ont également observé que les morbillivirus pouvaient induire- une immunosuppression chez un hôte différent de leur hôte naturel, ce qui montre une non- spécificité d'espèce des mécanismes régissant 1' immunosuppression induite par ces virus. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une préparation de protéines comprenant au moins une nucléoprotéine de morbillivirus ou un fragment de celle-ci comprenant tout ou partie de la région C-terminale d' environ 100 à 130 acides aminés de ladite nucléoprotéine, pour l'obtention d'un médicament inhibiteur de la réponse immunitaire à médiation cellulaire.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, ledit fragment comprend au moins une séquence de ladite région C-terminale qui est conservée entre les nucléoprotéines de différents morbillivirus, et notamment entre les nucléoprotéines des morbillivirus VR, VMC, et VPPR.
Bien que ladite région C-terminale représente la portion de la nucléoprotéine dont la séqUence diverge le plus d'un morbillivirus à l'autre, il existe quand même au sein de cette région, plusieurs portions très conservées (cf. par exemple DIALLO et al. [J. Gen. Virol., 75, 233-237, (1994)].
Parmi les fragments de ladite région C-terminale correspondant à des portions conservées, et utilisables conformément à l'invention, on citera notamment :
- un fragment comprenant les acides aminés 411- 421 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus ;
- un fragment comprenant les acides aminés 489- 506 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus ; - un fragment comprenant les acides aminés 516- 625 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d' un autre morbillivirus .
Les positions indiquées ci-dessus se réfèrent à la numérotation des acides aminés dans les séquences publiées par DIALLO et al . [cf. supra] .
Avantageusement, une préparation de protéines utilisables conformément à l'invention comprend en outre les glycoprotéines d'enveloppe F et H d'un morbillivirus. Une préparation utilisable conformément à l'invention peut par exemple être obtenue par inactivation d'un morbillivirus, notamment par un traitement par rayons ultra-violets ; elle peut également être obtenue à partir des protéines, ou de leurs fragments, mentionnés ci-dessus.
Les protéines de morbillivirus ainsi que leurs fragments, utilisables conformément à l'invention, sont connus en eux-mêmes ; ils peuvent être préparés par des méthodes classiques, par exemple par purification à partir de cultures virales, ou avantageusement, par génie génétique, ou par synthèse peptidique.
L'inhibition de l'immunité à médiation cellulaire induite par les préparations de protéines de morbillivirus est comparable à celle obtenue lors d'un traitement à forte dose d' anti-inflammatoires, ou à base d' immunosuppresseurs puissants, comme la dexaméthasone .
La présente invention peut être mise en œuvre dans le cadre de la prévention ou du traitement de toutes les pathologies où il est souhaitable d' inhiber la réponse immunitaire à médiation cellulaire. On citera par exemple les pathologies inflammatoires, résultant notamment d'une infection par un agent pathogène (lèpre, tuberculose, leishmaniose, listériose, candidose, etc.) ou les dermites allergiques de contact induites par différents agents sensibilisants. Elle peut également être mise en œuvre dans la prévention ou le traitement du rejet de greffe, ou de la maladie du greffon contre l'hôte. La présente invention peut également être utilisée dans le cadre de la mise au point de nouveaux vaccins, notamment de vaccins anti-rougeoleux, dépourvus d'effets immunosuppresseurs ou possédant des effets immunosuppresseurs atténués. Ces vaccins peuvent notamment être obtenus à partir de morbillivirus dans lesquels tout ou partie de la nucléoprotéine, et en particulier la région C- terminale de 110 à 130 acides aminés environ de ladite nucléoprotéine a été délétée ou altérée. Elle peut être altérée notamment par une ou plusieurs modifications au niveau d' au moins une des séquences conservées entre les différents morbillivirus et/ou par délétion d'une ou plusieurs desdites séquences conservées. Avantageusement, ladite modification ou ladite délétion concerne au moins une des séquences 411-421, 489-506, ou 516-625, mentionnées ci- dessus .
La présente invention a également pour objet des procédés permettant d'évaluer le potentiel immunosuppresseur d'une préparation d'un morbillivirus, par exemple d'un vaccin anti-morbillivirus, ou d'une préparation utilisable comme immunosuppresseur conformément à l'invention.
Selon une première variante de la présente invention, ledit potentiel immunosuppresseur est évalué par détermination de la quantité de protéine NP dudit morbillivirus présente dans ladite préparation.
Selon un mode de mise en œuvre préféré de cette première variante, ledit procédé comprend la mise en contact de ladite préparation avec au moins un anticorps dirigé contre ladite protéine NP, et de préférence, au moins un anticorps dirigé contre un épitope porté par la région C- terminale d'environ 110 acides aminés de ladite protéine NP, et la quantification du complexe anticorps/antigène formé, par tous moyens appropriés, connus en eux même de l'homme de l'art.
Selon une première variante de la présente invention, ledit potentiel immunosuppresseur est évalué par l'utilisation de souris sensibilisées au DNFB ou au KLH.
Avantageusement, et en particulier pour évaluer le potentiel immunosuppresseur d'une préparation comprenant les protéines d'enveloppe H et F de morbillivus, lesdites souris sont des souris transgéniques exprimant le récepteur CD46. Des souris transgéniques exprimant le récepteur CD46 sont connues en elles-mêmes ; elles peuvent par exemple être obtenues comme décrit par THORLEY et al . [Eur. J. Immunol., 27, 726-734, (1997)] ou par EVLASHEV et al . [J. Virol., 74, 1373-1382, (2000)].
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant les effets inhibiteurs in vivo dans un modèle murin, de différentes préparations de morbillivirus sur les réactions d'hypersensibilité retardée. EXEMPLE 1 : INHIBITION DES REACTIONS D'HYPERSENSIBILITE RETARDEE CHEZ LA SOURIS PAR LE VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV.
L'effet du virus de la rougeole inactivé aux UV sur la réponse immunitaire à médiation cellulaire a été testé in vivo, chez la souris, en utilisant des modèles représentatifs des 2 aspects de l'hypersensibilité de type retardé : l'hypersensibilité de contact au DNFB, et l'hypersensibilité retardée au KLH, représentatif de l'hypersensibilité de type tuberculinique.
Des souris C57BL/6 (IFFA CREDO), âgées de 7 à 11 semaines, ont été utilisées pour ces expérimentations.
Le VR Edmonston (ATCC VR-24), et, à titre de témoin, un autre paramyxovirus, le virus respiratoire syncitial (VRS, groupe A souche Long), ont été utilisés. Les virus ont été propagés séparément sur des cellules rénales fibroblastiques de singe (Vero) . Après lyse mécanique des cellules, effectuée lorsque 50% d'entre elles présentent un aspect cytopathique, le lysat cellulaire contenant les particules virales infectieuses a été congelé à -80°C et décongelé, puis centrifugé et enfin stocké à -80°C. Chaque lot de virus a été inactivé par une exposition aux UV (254 nm) pendant 45 min à 4°C. La perte du caractère infectieux a été testée sur des cellules Vero. Une préparation « factice » constituée par le surnageant de cultures de cellules Vero non-infectées a été utilisée à titre de contrôle.
Des injections intra-péritonéales de VR ont été réalisées soit sur des souris de type sauvage, soit sur des souris transgéniques exprimant la molécule CD46.
Les différentes préparations ont été injectées
(volume d'une injection : 500 μl) dans la cavité péritonéale
(IP) des souris, à raison de 5χl06 particules virales pour le
VRS inactivé par une exposition aux UV (VRS-UV) , de 106 ou 5χl06 particules virales pour le VR inactivé par une exposition aux UV (VR-UV) . Test d'hypersensibilité de contact au DNFB
Le DNFB (2, 4-dinitrofluorobenzène, SIGMA) a été dilué dans de l'acétone huile d'olive (4:1) immédiatement avant usage. La réaction d'hypersensibilité de contact au DNFB (HSC) a été réalisée comme décrite d'après GARRIGUE et al . , [Contact Dermatitis, 30, no. 4, 231-237, (1994)]. Six heures après l'injection de la préparation virale ou de la préparation factice, 25 μl d'une solution à 0,5% de DNFB ont été appliqués sur 2 cm2 de peau ventrale préalablement rasée. Après 5 jours les animaux sensibilisés, et les animaux d'un groupe contrôle, non-sensibilisés, ont reçu 10 μl de solution non irritante de DNFB répartie sur chacune des faces de l'oreille droite, et 10 μl de solution d'acétone-huile d'olive sur l'oreille gauche. L'épaisseur des oreilles a été mesurée avec un micromètre (J15; Bell SA, France) avant et chaque jour suivant l'application. L'œdème de l'oreille est calculé par la formule suivante : [ (T-T0) oreille droite] -
[ (T-T0) oreille gauche] , ou T et T0 sont respectivement les valeurs de l'épaisseur de l'oreille avant et après élicitation.
Les résultats sont illustrés par la Figure 1 (a) , qui représente la taille moyenne de l'œdème de l'oreille à différents temps suivant l'application.
Légende de la Figure l(a) : ^ : VRS-UV
• : VR-UV 5xl06
D : VR-UV 105
O : préparation factice
Δ : souris non-sensibilisées Test d'hypersensibilité retardée au KLH
L'hypersensibilité retardée a été mesurée par un test conventionnel de mesure de l'œdème des coussinets des pattes. Six heures après l'injection de la préparation virale ou de la préparation factice, les souris ont été sensibilisées par injection sous-cutanée de 300 μg de KLH (keyhole limpet hemocyanin, SIGMA) émulsifié dans de l'adjuvant complet de Freund. 7 jours plus tard, une seconde injection (150 μg de KLH dans du tampon PBS) a été effectuée dans les coussinets de la patte gauche des animaux sensibilisés, et des animaux non sensibilisés d'un groupe contrôle ; du PBS seul a été injecté dans la patte droite. L'épaisseur des coussinets a été mesurée 24 heures avant et 48 heures après l'injection de rappel. L'œdème des coussinets est calculé par la formule suivante : [ (T-T0) coussinet droit] - [ (T-T0) coussinet gauche] , ou T et T0 sont respectivement les valeurs de l'épaisseur du coussinet avant et après l'injection de rappel.
Les résultats sont illustrés par la Figure 1 (b) , qui représente la taille moyenne de l'œdème des coussinets à 24 heures après l'injection de rappel.
Légende de la Figure 1 (b) : Barres hachurées : préparation factice
Barres noires : VR-UV 5xl06
Barres grises : VR-UV 106
Barres blanches : souris non-sensibilisées
Ces résultats montrent que les souris injectées avec du VR-UV développent une réponse d'hypersensibilité retardée, qu'il s'agisse d'hypersensibilité de contact, ou d'hypersensibilité de type tuberculinique, environ deux fois moins importante que les souris contrôle injectées avec une préparation factice. Dans les mêmes conditions des souris témoin injectées avec du VRS-UV développent une réponse d'hypersensibilité retardée, équivalente à celle des souris contrôle injectées avec la préparation factice.
Le VR induit donc une immunosuppression in vivo, et ce, en l'absence de toute réplication virale.
EXEMPLE 2 : ROLE DE LA NUCLEOPROTEINE (NP) DU VIRUS DE LA ROUGEOLE DANS L'INHIBITION DES REACTIONS D'HYPERSENSIBILITE RETARDEE CHEZ LA SOURIS.
Pour étudier la contribution de la NP dans l'effet immunosuppresseur induit par le VR-UV chez la souris, il a été procédé à des injections intra-péritonéales de NP recombinante purifiée sur des souris C57BL/6, ou sur des souris dépourvues du récepteur FcγR (FcγRII_ ~ x FcγR-/~ ; 0005856MM ; TACONIC, USA) .
La nucléoprotéine recombinante a été préparée selon le protocole suivant : Des cellules Sf-9 de Spodoptera frugiperda ont été infectées à raison de 1 PFU par cellule, par un baculovirus recombinant (AcNPVNP) , comportant la séquence codante de la NP du VR. Après trois jours de culture, les cellules ont recueillies par centrifugation (200 g, 5 min, 4°C) et le culot cellulaire lavé en tampon PBS. Les cellules ont ensuite été placées dans un tampon hypotonique (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 ; 10 mM NaCl) et lysées par l'ajout d'un détergent non ionique, le Nonidet P-40 1%. Afin d'éviter des problèmes de dégradation, des inhibiteurs de protéases ont été ajoutés au moment de la lyse des cellules et les lysats ont été maintenus à 4°C. Afin d'éliminer les noyaux, les lysats ont été centrifugés à 1000 g, puis une ultracentrifugation (1000 g, 10 min) en présence de EDTA 10 M a été réalisée, éliminant ainsi les débris cellulaires. Le surnageant récupéré a été centrifugé en CsCl pendant
2 heures à 36000 rpm à 12°C, rotor SW41 (BECKMAN) . Ce gradient est composé de paliers de 2 ml de 40% CsCl (P/V) , 2 ml de 30% CsCl, 2 ml de 25% CsCl et de 2 ml de 5% saccharose
(P/V) . La NP qui forme une bande visible à la densité de 30% CsCl a été récupérée par aspiration, diluée dans du PBS et centrifugée 2 heures à 36000 rpm. Le culot final est resuspendu dans du PBS. Chaque lot a été testé, par dosage des protéines (Kit BCA PIERCE) , par gel d' acrylamide et en western blot. Pour chaque expérience, 100 μg de NP, 5χl05 particules de VR-UV, ou 500 μl de la préparation factice ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus.
Ces animaux ont été ensuite sensibilisés au DNFB, ou au KLH, comme décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus.
Les résultats sont illustrés par les Figures 2 (a) à 2 (d) . Figure 2 (a) Test d'hypersensibilité au DNFB chez les souris C57BL/6
• : VR-UV 5x106 : NP recombinante O : préparation factice
Δ : souris non-sensibilisées
Figure 2 (b) : Test d' hypersensibilité au DNFB chez les souris FcγR_/~
• : VR-UV 5xl06 Φ : NP recombinante
O : préparation factice Δ : souris non-sensibilisées
Figure 2 (c) : Test d'hypersensibilité au KLH chez les souris C57BL/6 Figure 2 (d) : Test d'hypersensibilité au KLH chez les souris FcγR_ ~
Alors que les souris injectées avec la préparation factice présentent un œdème caractéristique de la réaction d'hypersensibilité au DNFB, la NP induit chez les souris C57BL/6 une inhibition de la réaction d'hypersensibilité similaire au DNFB à celle engendrée par le VR-UV. Des expérimentations complémentaires effectuées avec des concentrations plus faibles de NP montrent que cet effet est dose-dépendant ; l'inhibition induite par l'injection de 40 μg de NP est légèrement plus faible que celle observée après injection de 100 μg, et aucune inhibition n'est observée après injection de 4 μg de NP.
Dans le cas de la réaction d'hypersensibilité au KLH, l'inhibition induite par la NP est comparable à celle induite par le VR-UV, bien qu'un peu plus forte .
En revanche, chez les souris dépourvues du récepteur FcγR, aucun effet immunosuppresseur de la NP ou du VR-UV n'est observé dans le cas de la réaction d'hypersensibilité au DNFB. Dans le cas de la réaction d'hypersensibilité au KLH, on n'observe aucun effet immunosuppresseur de la NP, et un faible effet immunosuppresseur du VR-UV. EXEMPLE 3 : ROLE DES GLYCOPROTEINES HA ET F DE L'ENVELOPPE DU VIRUS DE LA ROUGEOLE DANS L' INHIBITION DES REACTIONS D'HYPERSENSIBILITE RETARDEE CHEZ LA SOURIS
Pour analyser le rôle des protéines de l'enveloppe du VR dans l' immunosuppression induite chez la souris, un virus de la rougeole recombinant dépourvu des glycoprotéines HA et F de l'enveloppe a été utilisé, soit sur des souris C57BL/6, soit sur des souris transgéniques exprimant la molécule CD46. Les souris transgéniques pour CD46 ont été réalisées par l'injection, dans des ovocytes de souris, de l'ADNc du gène humain codant pour l' isoforme moléculaire CD46
BC Cyt-1 sous le contrôle du promoteur de CD46. Ces souris expriment de façon ubiquitaire la molécule CD46 dans le fond génétique H-2b [THORLEY et al . , Eur. J. Immunol., 27, 726-
734, (1997) ] .
Le VR Edmonston tag (EDtag) est un VR recombinant dérivé de la souche Edmonston par clonage moléculaire de la totalité du génome [TOBER et al . , J. Virol., 72, no. 10, 8124-8132, (1998)]. Le VR MGV est un VR recombinant dépourvu des glycoprotéines de l'enveloppe HA et F [SPIELHOFER et al . , J. Virol . , 72, no. 3, 2150-2159, (1998)].
Les souches de VR ont été propagées, récoltées, et inactivées aux UV selon le protocole décrit à l'Exemple 1 ci-dessus.
Pour chaque expérience, 5χl06 particules de VR- UV, de EDtag-UV, de MGV-UV, ou 500 μl de préparation factice ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1. Les animaux ont été ensuite sensibilisés au DNFB comme décrit dans l'Exemple 1.
Les résultats sont illustrés par la Figure 3 (a) , pour les souris C57BL/6 et 3 (b) pour les souris transgéniques pour CD46. Légende des Figures 3 (a) et 3 (b) :
• : VR-UV D : EDtag-UV M : MGV-UV
O : préparation factice Δ : souris non-sensibilisées
Chez les souris C57BL/6, ou chez les souris transgéniques pour CD46 ayant reçu une injection de MGV-UV, on observe un effet inhibiteur d'intensité équivalente. Dans les 2 cas cet effet est comparable à celui résultant de l'injection de 100 μg de NP purifiée (résultats non illustrés) . Chez les souris C57BL/6, l'effet inhibiteur de
MGV-UV est également comparable à celui engendré par le VR-UV ou le virus recombinant contrôle EDtag-UV.
En revanche, chez les souris transgéniques pour CD46, l'effet inhibiteur de VR-UV et de EDtag-UV est plus important que celui de MGV-UV dans l'inhibition de réaction d'HSC au DNFB. L'injection de MGV-UV n'induit qu'une inhibition partielle de la formation de l'œdème alors que l'injection de VR-UV ou de EDtag-UV inhibe complètement la formation de l'œdème. Ces résultats montrent que bien que les glycoprotéines H et F de l'enveloppe virale ne soient pas essentielles pour l'induction d'une inhibition de la réaction d'hypersensibilité, elles permettent, en présence du récepteur CD46, d'augmenter l'effet immunosuppresseur, jusqu'à inhiber totalement cette réaction.
Des expérimentations complémentaires, dans lesquelles la sensibilisation par le DNFB a été effectuée 2 semaines après l'injection de préparation virale, ont été effectuées. Dans ces conditions un effet inhibiteur de la réaction d'hypersensibilité a été observé, pour les préparations virales contenant les glycoprotéines H et F, dans le cas les souris transgéniques pour CD46, ce qui indique que l'expression de ce récepteur peut permettre d'augmenter la durée de l'effet immunosuppresseur des protéines virales. EXEMPLE 4 : EFFET DU VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV SUR L'ACTIVITE CYTOTOXIQUE DES LYMPHOCYTES (CTL) SPECIFIQUES DE L ' HAPTENE .
Afin d'analyser l'activité cytotoxique induite après sensibilisation, les cellules spléniques de souris C57BL/6, transgéniques pour CD46, injectées ou non avec du VR-UV ou de la NP et sensibilisées au DNFB, ont été testées pour leur capacité à lyser les cellules cibles EL-4 couplées au DNBS (acide 2, 4-dinitrobenzène sulfonique ; SIGMA). Pour chaque expérience, 100 μg de NP, 5χl06 particules de VR-UV, ou 500 μl de préparation factice ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, et les animaux ont été ensuite sensibilisés au DNFB, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. La rate de chaque animal a été prélevée et une suspension cellulaire a été réalisée par broyage, des organes entre lames de verre fritte. Les splenocytes ont été lavés et les globules rouges lysés en présence de NH4C1 0,83% pendant 5 minutes à 37 °C. Des splenocytes ont été isolés de la même façon à partir de rates de souris naïves, puis irradiés à 1500 rad et chargés en haptène par une incubation dans une solution de DNBS 4 mM afin de jouer le rôle de CPAg.
Les splenocytes des souris sensibilisées et les splenocytes chargés en haptène ont été co-cultivés en RPMI 1640, 10% SVF à raison de 2χlOδ cellules par ml. Après 5 jours de culture, les splenocytes restimulés par la culture en présence des CPAg constituent la population effectrice • du test . Des cellules EL-4 (106 cellules par ml), faisant office de cellules-cibles ont été cultivées en RPMI 1640, 10% SVF et en présence de thymidine tritiée (10 μCi par ml de milieu de culture pendant 3 heures à 37 °C), puis lavées deux fois en RPMI 1640 10% SVF. Une partie des cellules EL-4 marquée au tritium a été chargée ensuite en DNBS comme décrit ci-dessus. Les cellules cibles ont été réparties dans des plaques de 96 puits à raison de 2xl04 cellules par puits. Les cellules effectrices ont également été réparties dans les mêmes puits selon un rapport cible/effecteur décroissant. Les puits témoin (lyse spontanée) contiennent uniquement des cellules cibles. sans Après 4 heures de co-culture, les cellules ont été transférées sur filtres, et le nombre de coups par minute a été compté en présence de liquide à scintillation (compteur ALLAC) .
Le pourcentage de cytotoxicité est déterminé par la formule : % de cytotoxicité =100 (S-E) /S où S correspond à la lyse spontanée (EL-4 tritiées et hapténisées sans cellules effectrices), E correspond à la lyse expérimentale (EL-4 tritiées et hapténisées en présence de cellules effectrices) . Les résultats sont illustrés par les Figures 4 (a) à 4 (c) .
Figure 4 (a) : Activité cytotoxique des cellules de souris C57BL/6 injectées avec VR-UV
*• : VR-UV H : préparation factice
Figure 4 (b) : Test d'hypersensibilité au DNFB chez les souris C57BL/6 injectées avec NP recombinante
• : NP recombinante
M : préparation factice Figure 4 (c) : Test d'hypersensibilité au KLH chez les souris CD46 injectées avec VR-UV : VR-UV
M : préparation factice
Comme le montrent les Figures 4A et 4B, l'injection à des souris C57BL/6 de VR-UV ou de NP n'affecte pas l'activité CTL par rapport à celle des souris contrôle
(préparation factice). En revanche, l'injection de VR-UV inhibe de façon significative l'activité CTL des lymphocytes provenant de souris CD46 transgéniques (p<0,05) (Figure 4C) . Ce défaut d'activité CTL apparaît donc dépendant de l'expression de la molécule CD46. EXEMPLE 5 : EFFETS DU VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV ET DE LA NP SUR LA PROLIFERATION DES LYMPHOCYTES T CD8 SPECIFIQUES DE L'HAPTENE
Les lymphocytes T CD8 (LTCD8) constituant la population effectrice impliquée dans l'hypersensibilité de contact au DNFB [KEHREN et al . , J. Exp. Med., 189, no. 5, 779-786, (1999)3, il a été recherché si l'inhibition de la réaction d'HSC au DNFB induite par le VR-UV et la NP relevait d'un défaut d'activation des LTCD8 au cours de la phase de sensibilisation. Les expérimentations ont été effectuées sur des souris C57BL/6, sur des souris transgéniques exprimant la molécule CD46, ou sur des souris dépourvues du récepteur FcγR.
Pour chaque expérience, 100 μg de NP, 5χl06 particules de VR-UV, 500 μl de préparation factice, ou 500 μl de tampon PBS ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, et les animaux ont été ensuite sensibilisés au DNFB, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus.
Les LTCD8 de chaque souris, issus des ganglions lymphatiques drainant la zone d'application du DNFB, ont été isolés selon le protocole suivant :
Les ganglions drainant la zone d' application de 1' aptène (inguinaux, sous brachiaux et axillaires) de chaque animal ont été prélevés 4 jours après sensibilisation des animaux, et placés dans du RPMI 1640, 10% SVF. Les ganglions ont été broyés entre lames de verre fritte et les cellules extraites lavées, puis placés deux heures dans un incubateur à 37 °C afin d'éliminer les macrophages par adhésion sur plastique. Les cellules ont été ensuite incubées 30 min à 37 DC en présence d'anticorps monoclonaux de rat .' GK1.5
(anti-CD4), Ml/70 (anti-macrophage), RA3-6B2 (anti-B220),
M5/114 (anti-classe II), RB6-8C5 (anti-granulocytes) . Afin d'éliminer l'excès d'anticorps non liés aux cellules, les cellules ont été lavées en RPMI 1640 10% SVF. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 30 min à 4°C sous agitation en présence de billes magnétiques couplées à une immunoglobuline dirigée contre les anticorps de rat (BIOMAG) . Les cellules liées aux anticorps, reconnues par les immunoglobulines présentes à la surface des billes ont été éliminées par passage de la suspension sur un aimant. La purification des lymphocytes a été vérifiée par un marquage des cellules sélectionnées négativement avec un anticorps anti-CD8 et une analyse en cytométrie de flux. La population cellulaire ainsi sélectionnée négativement était constituée de plus de 95% de lymphocytes T CD8.
Les LT CD8 ainsi isolés ont été co-cultivés pendant trois jours en présence soit de CPAg préparées à partir de splenocytes de souris naïves, couplées au DNBS, ou couplées avec un haptène contrôle, le TNBS (acide 2,4,6- trinitrobenzène sulfonique, SIGMA) , soit de CPAg couplées au DNBS préparées à partir de splenocytes de souris ayant reçu 100 μg de NP, 5χl06 particules de VR-UV, 500 μl de préparation factice, ou 500 μl de tampon PBS par injection dans la cavité péritonéale. Les CPAg ont été préparées selon le protocole décrit à l'Exemple 4 ci-dessus.
Les cultures cellulaires ont été réalisées en RPMI 1640, 10% SVF dans des plaques de 96 puits. Les lymphocytes T CD8 (LT CD8) ont été cultivés à raison de 5xl05 cellules par puits en présence de 106 CPAg couplées ou non avec un haptène. Pour chaque condition, les LT CD8 et les CPAg ont été mis en culture séparément permettant de s'assurer de l'absence de prolifération spontanée des LT CD8 et d'une irradiation correcte des CPAg. La culture cellulaire a été réalisée pendant 90 heures. Au bout de 72 heures 0,5 μCi de thymidine tritiée ont été rajoutés dans chaque puits, les cellules ont été transférées sur filtres, et le nombre de coups par minute a été compté en présence de liquide à scintillation (compteur ALLAC) .
Les index de prolifération spécifique d' haptène ont été calculés d'après la formule suivante : [Cpm(LTCD8+CPAg couplées à l'haptène)]/[Cpm(LTCD8+CPAg non-couplées à -'haptène)] Les valeurs des index moyens de prolifération spécifique de l'antigène sont représentées par les Figures 5 (a) (CPAg de souris naïves) et 5 (b) (CPAg de souris ayant reçu le même traitement que les donneurs de LTCD8). Les résultats illustrés par la Figure 5 (a) montent que les LTCD8 de souris injectées avec la préparation factice et sensibilisées répondent fortement aux CPAg de souris naïves couplées au DNBS, mais pas aux CPAg de souris naïves couplées avec un haptène contrôle, ce qui montre le caractère antigène-spécifique de la réponse. En revanche, dans le cas des souris injectées avec la préparation de VR-UV ou de NP, on observe une inhibition de la réponse des LTCD8 des souris C57BL/6 ou des souris CD46 aux CPAg de souris naïves couplées au DNBS. Cette inhibition n'est pas observée dans le cas des LTCD8 des souris dépourvues du récepteur FcγR.
Les résultats illustrés par la Figure 5 (b) montent qu'en présence de CPAg provenant de souris injectées avec du VR-UV, ou de la NP la prolifération antigène spécifique des lymphocytes T CD8 de souris C57BL/6 ou transgéniques pour CD46, sensibilisées au DNFB est inhibée.
Cette inhibition n'est pas observée dans le cas des LTCD8 des souris dépourvues du récepteur FcγR. Les lymphocytes T CD8 issus de souris sensibilisées ayant reçu une injection de VR-UV ou de NP présentent un défaut de prolifération des lymphocytes T CD8. En outre, les CPAg issues de souris injectées avec du VR-UV ou de la NP, sont incapables d'activer in vi tro des lymphocytes T CD8.
Ces phénomènes sont indépendants de l'expression de la molécule CD46, mais ne sont pas observés chez des souris déficientes pour le récepteur FcγR, ce qui indique que le VR-UV ainsi que la NP peuvent altérer la fonction des CPAg par l'intermédiaire de ce récepteur, en agissant non seulement au niveau de la phase de sensibilisation des lymphocytes CD8 naïfs, mais également au niveau de la phase effectrice, suivant le contact secondaire avec l'antigène. EXEMPLE 6 : EFFET DU VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV OU DE LA NUCLEOPROTEINE NP SUR LA PHASE EFFECTRICE DE LA REACTION D'HYPERSENSIBILITE DE CONTACT.
Cet effet a été testé sur des souris C57BL/6, ou sur des souris transgéniques exprimant la molécule CD46.
Les animaux ont été sensibilisés au DNFB comme décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. 5 jours plus tard, 100 μg de NP, 5χl06 particules de VR-UV, ou 500 μl de préparation factice ont été injectés dans la cavité péritonéale des souris, et l'application de DNFB a été effectuée 6 heures plus tard, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci- dessus .
L'épaisseur de l'œdème à différents temps suivant l'application de DNFB a été mesurée, et les résultats sont illustrés par les Figures 6 (a) pour les souris C57BL/6 et 6 (b) pour les souris transgéniques pour CD46.
Légende des Figures 6 (a) et 6(b) : # : VR-UV 5xl06 Φ : NP recombinante O : préparation factice
Δ : souris non-sensibilisées
Chez les souris C57BL/6, on observe un effet inhibiteur important de VR-UV ou de NP, analogue à celui observé dans le cas d'une injection effectuée avant la sensibilisation au DNFB (cf. Exemple 2).
Chez les souris transgéniques pour CD46, l'effet inhibiteur de VR-UV est également analogue à celui observé dans le cas d'une injection effectuée avant là sensibilisation au DNFB (cf. Exemple 3) . On observe une inhibition complète de la formation de l'œdème.
Ces résultats montrent que les protéines de VR sont efficaces non seulement dans la prévention, mais également dans le traitement d'une réponse inflammatoire, et que, dans ce cas également, l'expression du récepteur CD46 augmente l'effet immunosuppresseur. EXEMPLE 7 : DOSAGE DE LA NUCLEOPROTEINE NP DU VR PAR ELISA
La quantité de nucléoprotéine dans les préparations de virus a été mesurée par ELISA.
Des plaques de 96 puits ont été recouvertes d'anticorps anti-NP 33.4 [LIBEAU et al . , Vet . Rec, 134, 300- 304, (1994)] dans du tampon carbonate (dilution au 1/600 des liquides d'ascites).
Après incubation 1 nuit à 4°C, les plaques sont bloquées avec du tampon PBS dans 5% de lait écrémé, et incubées à nouveau 1 nuit à 4°C avec des surnageants de VR- UV. Après addition de 1 μg/ml d'anticorps biotinylé anti-NP cl.120 [GIRAUDON et ILD, J. Gen. Virol., 54, 325-332, (1981)], les plaques sont incubées avec un conjugué ExtrAvidin®-peroxydase dilué au 1/1000 (SIGMA) . Après addition du substrat (ABTS ; SIGMA) , et incubation pendant 45 n la DO est lue à 400 nm. Une courbe étalon est établie avec une série de dilutions de NP purifiée à partir de cellules Vero infectées par le VR.
EXEMPLE 8 : INHIBITION DES REACTIONS D'HYPERSENSIBILITE RETARDEE PAR DES PROTEINES DE DIFFERENTS MORBILLIVIRUS
Inhibition de la réaction d' hypersensibilité de contact au DNFB par le Virus de la Maladie de Carré inactivé aux UV.
Des souris C57BL/6, ou des souris dépourvues du récepteur FcγR ont reçu des injections intra-péritonéales de 5χl06 particules de Virus de la Maladie de Carré inactivé aux UV (MCV-UV) , de 100 μg de NP de VR, de 5χl06 particules de VR-UV, ou 500 μl de PBS, et ont été ensuite sensibilisés au DNFB, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus.
L'épaisseur de l'œdème à différents temps suivant l'application de DNFB a été mesurée. Les résultats sont illustrés par les Figures 7 (a) et 7 (b) :
Figure 7 (a) : Test d'hypersensibilité au DNFB chez les souris C57BL/6
O VR-UV
CDV-UV
NP recombinante
PBS X : souris non-sensibilisées
Figure 7(b) : Test d'hypersensibilité au DNFB chez les souris FcγR_ ~
O : VR-UV : CDV-UV
•*- : NP recombinante
M : PBS
X : souris non-sensibilisées
Ces résultats montrent que la réaction d'hypersensibilité de contact est bloquée de façon significative par le virus CDV inactivé aux UV (CDV-UV)
(autant qu'avec la nucléoprotéine NP) dans les souris normales C57BL/6 (Figure 7a) . Par contre, ni le virus, ni la
NP ne sont efficaces dans les souris déficientes pour le récepteur FcR (Figure 7b) , indiquant la nécessité de FcR pour l'effet immunosuppresseur des morbillivirus.
Inhibition de la réaction d' hypersensibilité retardée au KLH par la NP
Des préparations recombinantes de nucléoprotéine du virus de la peste des petits ruminants (PPRVNP obtenue à partir de la séquence publiée par DIALLO et al . ) ou des 125 acides aminés C-terminaux de nucléoprotéine du virus de la rougeole (VR-NPc) ont été obtenues comme décrit dans l'Exemple 2. Pour la production de NPc, la construction codant pour 125 acides aminés C-terminaux de nucléoprotéine du virus de la rougeole a été clonée dans le secteur pQE-32
(QIAGEN) , contenant un Tag Histidine. La partie de NPc + Tag
His a été ensuite clonée dans un baculovirus, qui a été utilisé pour infecter des cellules Sf-9, comme décrite dans l'Exemple 2. Après trois jours de culture, les cellules ont été recueillies. La NPc a été purifiée à partir du culot cellulaire QIAexpressionist® de QIAGEN, selon le protocole indiqué par fabricant. Des souris C57BL/6, ont reçu des injections intra-péritonéales de 100 μg de PPRVNP, de 100 μg de VR-NPc, de 1 g de dexaméthasone ou de 500 μl de PBS, et ont été ensuite sensibilisés au KLH, selon le protocole décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus. Les résultats sont illustrés par la Figure 8, qui représente la taille moyenne de l'œdème des coussinets à 24 heures et 48 heures après l'injection de rappel.
Légende de la Figure 8 : Barres gris moyen : PBS
Barres gris foncé : PPRVNP
Barres gris clair : dexaméthasone
Barres blanches : VR-NPc
Barres noires : souris non-sensibilisées Ces résultats montrent que les souris injectées avec la PPRVNP, la VR-NPc, ou la dexaméthasone VR-UV développent une réponse d'hypersensibilité retardée moins importante que les souris contrôle injectées avec le PBS.
L'effet inhibiteur le plus important est observé avec la VR-NPc. L'effet inhibiteur de la PPRVNP est similaire à celui de la dexaméthasone.
EXEMPLE 9 : INHIBITION DE LA REACTION LYMPHOCYTAIRE MIXTE PAR LE VIRUS DE LA ROUGEOLE INACTIVE AUX UV.
La réaction lymphocytaire mixte constitue un modèle in vitro du rejet d' allogreffe .
Des souris BALB/c ont été injectées par voie intrapéritonéale avec 105 particules de VR-UV, ou 500 μl de préparation factice.
48 heures plus tard, des splenocytes ont été préparés à partir des rates de ces souris, et stimulés, en culture mixte, avec des splenocytes obtenus de souris C57BL/6 irradiés à 1500 rad.
Des cellules répondeuses de souris BALB/c
(5xl06/ml) ont été cultivées avec le même nombre de cellules stimulatrices C57BL/6 dans du milieu RPMI supplémenté avec
10% SVF, 10 Mm HEPES, 2 Mm gluta ine, 5xlOs M 2β- mercaptoethanol, et 50 μg/ml de gentamicyne pendant 3 jours à
37 °C, 7% C02 La prolifération cellulaire a été évaluée le
3e e jour, par incorporation de thymidine3H (lμCi/puits) pendant 16 heures.
Les résultats sont illustrés par la Figure 9. Ces résultats montrent une inhibition, par le VR-UV de la réaction des lymphocytes de souris BALB/c en réponse à la stimulation par les cellules des souris C57BL/6.
Légende de la Figure 9 :
D : Préparation factice M : VR-UV

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'une préparation de protéines comprenant au moins une nucléoprotéine de morbillivirus ou un fragment de celle-ci comprenant tout ou partie de la région C-terminale d'environ 100 à 130 acides aminés de ladite nucléoprotéine, pour l'obtention d'un médicament inhibiteur de la réponse immunitaire à médiation cellulaire.
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit fragment comprend au moins une séquence de ladite région C-terminale conservée entre les nucléoprotéines de différents morbillivirus.
3) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit fragment est choisi parmi :
- un fragment comprenant les acides aminés 411- 421 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus ;
- un fragment comprenant les acides' aminés 489- 506 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus ;
- un fragment comprenant les acides aminés 516- 625 de la séquence peptidique de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, ou la séquence correspondante de la nucléoprotéine d'un autre morbillivirus.
. 4) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite préparation de protéines comprend en outre les glycoprotéines d'enveloppe F et H d'un morbillivirus. 5) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à la prévention ou au traitement d' une pathologie inflammatoire .
6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à la prévention ou au traitement d'une dermite allergique de contact. 7) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à la prévention ou au traitement du rejet de greffe, ou de la maladie du greffon contre l'hôte. 8) Procédé permettant d'évaluer le potentiel immunosuppresseur d'une préparation d'un morbillivirus, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la quantité de protéine NP dudit morbillivirus présente dans ladite préparation. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu' il comprend la mise en contact de ladite préparation avec au moins un anticorps dirigé contre ladite protéine NP, et de préférence, au moins un anticorps dirigé contre un épitope porté par la région C-terminale d'environ 110 acides aminés de ladite protéine, et la quantification du complexe anticorps/antigène formé.
10) Utilisation de souris sensibilisées au DNFB ou au KLH pour évaluer le potentiel immunosuppresseur d'une préparation de protéines d'un morbillivirus. 11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que lesdites souris sont des souris transgéniques exprimant le récepteur CD46.
12) Utilisation d'un morbillivirus dans lequel la région C-terminale de 110 à 130 acides aminés de la nucléoprotéine a été délétée ou altérée, au niveau d'au moins une séquence de ladite région N-terminale conservée entre les différents morbillivirus, pour l'obtention d'un vaccin.
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