EA039858B1 - Anti-c5 antibodies and uses thereof - Google Patents
Anti-c5 antibodies and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- EA039858B1 EA039858B1 EA201990022A EA201990022A EA039858B1 EA 039858 B1 EA039858 B1 EA 039858B1 EA 201990022 A EA201990022 A EA 201990022A EA 201990022 A EA201990022 A EA 201990022A EA 039858 B1 EA039858 B1 EA 039858B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- antigen
- amino acid
- seq
- Prior art date
Links
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
Abstract
Description
Заявка на данное изобретение, поданная 13 июня 2017 г. как международная патентная заявка РСТ, испрашивает преимущество приоритета предварительных заявок США № 62/349,705, поданной июня 2016 г.; 62/405,561, поданной 7 октября 2016 г.; и 62/422,10, поданной 15 ноября 2016 г., раскрытия каждой включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.The application for this invention, filed June 13, 2017 as a PCT International Patent Application, claims the benefit of priority of U.S. Provisional Application No. 62/349,705, filed June 2016; 62/405,561, filed October 7, 2016; and 62/422.10, filed November 15, 2016, the disclosures of each are incorporated herein by reference in their entirety.
Область изобретенияField of invention
Настоящее изобретение относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые специфически связываются с фактором комплемента С5, и к терапевтическим и диагностическим способам использования этих антител.The present invention relates to antibodies and antigen-binding antibody fragments that specifically bind to complement factor C5, and to therapeutic and diagnostic methods for using these antibodies.
Предпосылки изобретенияBackground of the invention
Система комплемента представляет собой группу белков плазмы, которые при активации ведут к лизису клетки-мишени и содействуют фагоцитозу через опсонизацию. Комплемент активируют через серию протеолитических стадий по трем основным путям: классический путь, который обычно активируют иммунные комплексы, альтернативный путь, который могут индуцировать незащищенные клеточные поверхности, и путь маннозосвязывающего лектина. Все три пути каскада комплемента сходятся к протеолитическому расщеплению белка компонента 5 (С5) комплемента. Расщепление компонента 5 комплемента (С5) ведет к образованию фрагментов С5а и С5Ь, этот процесс критичен во время активации каскада комплемента. С5а может вызывать плейотропные физиологические ответы через связывание со своими рецепторами (Monk et al., 2007, Br. J. Pharmacol. 152:429-448). C5a является сильным провоспалительным медиатором, который индуцирует хемотаксическую миграцию, усиливает клеточную адгезию, стимулирует окислительный взрыв и индуцирует высвобождение различных медиаторов воспаления, таких как гистамин или цитокины. С5Ь опосредует формирование мембраноатакующего комплекса (MAC или С5Ь-9), что ведет к лизису клеток в поздних фазах комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Кроме того, в ядросодержащих клетках, которые устойчивы к цитолизу посредством С5Ь-9, сублитические количества С5Ь-9 могут вызывать активацию клеток, результатом чего является клеточная пролиферация, образование провоспалительных медиаторов и продуцирование внеклеточного матрикса.The complement system is a group of plasma proteins that, when activated, lead to lysis of the target cell and promote phagocytosis through opsonization. Complement is activated through a series of proteolytic steps in three main pathways: the classical pathway, which is normally activated by immune complexes, an alternative pathway, which can be induced by unprotected cell surfaces, and the mannose-binding lectin pathway. All three pathways of the complement cascade converge to proteolytic cleavage of the protein component 5 (C5) of complement. Cleavage of component 5 of complement (C5) leads to the formation of fragments C5a and C5b, this process is critical during the activation of the complement cascade. C5a can elicit pleiotropic physiological responses through binding to its receptors (Monk et al., 2007, Br. J. Pharmacol. 152:429-448). C5a is a potent pro-inflammatory mediator that induces chemotactic migration, enhances cell adhesion, stimulates oxidative burst, and induces the release of various inflammatory mediators such as histamine or cytokines. C5b mediates the formation of a membrane attack complex (MAC or C5b-9), which leads to cell lysis in the late phases of complement-dependent cytotoxicity (CDC). Furthermore, in nucleated cells that are resistant to cytolysis by C5b-9, sublytic amounts of C5b-9 can induce cell activation resulting in cell proliferation, production of pro-inflammatory mediators, and extracellular matrix production.
Моноклональные антитела к С5 известны в данной области и описаны, например, в патентах США/публикациях № 9206251, 9107861, 9079949, 9051365, 8999340, 8883158, 8241628, 7999081, 7432356, 7361339, 7279158, 6534058, 6355245, 6074642, 20160299305, 20160051673, 20160031975, 20150158936, 20140056888, 20130022615, 20120308559 и в WO 2015/198243, WO 2015/134894, WO 2015/120130, ЕР 2563813В1, ЕР 2328616В1 и ЕР 2061810В1.Моноклональные антитела к С5 известны в данной области и описаны, например, в патентах США/публикациях № 9206251, 9107861, 9079949, 9051365, 8999340, 8883158, 8241628, 7999081, 7432356, 7361339, 7279158, 6534058, 6355245, 6074642, 20160299305, 20160051673 , 20160031975, 20158936, 20140056888, 20130022615, 20120308559 and in Wo 2015/198243, Wo 2015/134894, Wo 2015/120130, EP 2563813V1, EP 2328616V1 and EP 2061810V1.
Антитела полностью человека, которые специфически связываются с белком С5 с высокой аффинностью и обладают усовершенствованными фармакокинетическими свойствами, могут быть важны при предотвращении и лечении различных С5-ассоциированных заболеваний (например, атипичного гемолитико-уремического синдрома).Fully human antibodies that specifically bind to the C5 protein with high affinity and have improved pharmacokinetic properties may be important in the prevention and treatment of various C5-associated diseases (eg, atypical hemolytic uremic syndrome).
Краткая сущность изобретенияBrief summary of the invention
Настоящее изобретение обеспечивает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают белок фактора 5 комплемента (С5). Антитела по настоящему изобретению можно использовать, inter alia, для ингибирования или нейтрализации активности белка С5. В определенных вариантах осуществления антитела можно использовать при предотвращении, лечении или улучшении по меньшей мере одного симптома или показания С5-ассоциированного заболевания или нарушения у субъекта. В определенных вариантах осуществления антитела можно вводить профилактически или терапевтически субъекту, который имеет риск наличия или имеет С5-ассоциированное заболевание или нарушение. В определенных вариантах осуществления антитела против С5 представляют собой антитела полностью человека, которые связываются с С5 с высокой аффинностью и обладают усовершенствованными фармакокинетическими (PK) и фармакодинамическими (PD) свойствами. Такие высокоаффинные антитела с усовершенствованной PK/PD можно использовать для обеспечения превосходящего эффекта, наряду с менее частым дозированием у субъекта с С5-ассоциированным заболеванием или нарушением.The present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind complement factor 5 (C5) protein. The antibodies of the present invention can be used, inter alia, to inhibit or neutralize the activity of the C5 protein. In certain embodiments, antibodies can be used in preventing, treating, or improving at least one symptom or indication of a C5-associated disease or disorder in a subject. In certain embodiments, antibodies can be administered prophylactically or therapeutically to a subject who is at risk of having or has a C5-associated disease or disorder. In certain embodiments, anti-C5 antibodies are fully human antibodies that bind to C5 with high affinity and have improved pharmacokinetic (PK) and pharmacodynamic (PD) properties. Such high affinity PK/PD improved antibodies can be used to provide a superior effect along with less frequent dosing in a subject with a C5 associated disease or disorder.
Антитела по изобретению могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG4) или могут содержать только антигенсвязывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')2 или scFv), и их можно модифицировать для того, чтобы влиять на функциональность, например, чтобы увеличивать персистенцию в организме-хозяине или устранять остаточные эффекторные функции (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). В определенных вариантах осуществления антитела могут быть биспецифическими.Antibodies of the invention may be full-length (eg, an IgG1 or IgG4 antibody) or may contain only an antigen-binding portion (eg, a Fab fragment, F(ab') 2 or scFv) and may be modified to affect functionality, for example, to increase persistence in the host or eliminate residual effector functions (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). In certain embodiments, the antibodies may be bispecific.
В первом аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенные рекомбинантные моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются специфически с белком С5. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой моноклональные антитела полностью человека.In a first aspect, the present invention provides isolated recombinant monoclonal antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that bind specifically to the C5 protein. In some embodiments, the antibodies are fully human monoclonal antibodies.
Образцовые антитела против С5 по настоящему изобретению перечислены в табл. 1 и 2 в настоящем описании. В табл. 1 приведены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи (HCVR), вариабельных областей легкой цепи (LCVR), определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и определяющих комплементарность областей легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) образцовых антител против С5. В табл. 2 приве- 1 039858 дены идентификаторы последовательностей нуклеиновой кислоты для HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2Exemplary antibodies against C5 of the present invention are listed in table. 1 and 2 in the present description. In table. 1 shows the amino acid sequence identifiers for the heavy chain variable regions (HCVR), the light chain variable regions (LCVR), the heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) and the light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3) of exemplary anti-C5 antibodies. . In table. 2 shows the nucleic acid sequence identifiers for HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2
HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 образцовых антител против С5.HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 exemplary antibodies against C5.
Настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.The present invention provides antibodies or antigennegative fragments thereof, which contain HCVR containing an amino acid sequence selected from any of the HCVR amino acid sequences listed in table. 1, or a substantially similar sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат LCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.The present invention also relates to antibodies or antigennegative fragments thereof, which contain an LCVR containing an amino acid sequence selected from any of the LCVR amino acid sequences listed in table. 1, or a substantially similar sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), содержащую любые аминокислотные последовательности HCVR, перечисленные в табл. 1, в паре с любыми аминокислотными последовательностями LCVR, перечисленными в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, содержащихся в любых образцовых антителах против С5, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 98/114, 122/106, 98/130, 138/106, 146/106, 122/130, 146/114, 146/130, 138/130, 154/162, 170/178, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/258, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330 и 338/346. В определенных вариантах осуществления пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR выбирают из одной из SEQ ID NO: 50/58 (например, Н4Н12161Р), 98/106 (например, Н4Н12166Р), 138/106 (например, Н4Н12166Р5) или 202/210 (например, Н4Н12170Р). В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит аминокислотную последовательность, перечисленную в табл. 1, имеющую не больше пяти замен аминокислот, и указанная LCVR содержит аминокислотную последовательность, перечисленную в табл. 1, имеющую не больше двух замен аминокислот. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, имеющую не больше пяти замен аминокислот, и указанная LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, имеющую не больше двух замен аминокислот. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, имеющую по меньшей мере одну замену аминокислоты, и указанная LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, имеющую одну замену аминокислоты.The present invention also relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof, which contain a pair of amino acid sequences HCVR and LCVR (HCVR/LCVR), containing any of the amino acid sequences of HCVR listed in table. 1, paired with any of the LCVR amino acid sequences listed in Table. 1. In accordance with certain variants of implementation of the present invention provides antibodies or antigennegative fragments thereof, which contain a pair of amino acid sequences HCVR/LCVR contained in any exemplary anti-C5 antibodies listed in table. 1. In certain embodiments, the HCVR/LCVR amino acid sequence pair is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 98/114 122/106 98/130 138/106 146/106 122/130 146/114 146/130 138/130 154/162 170/178 186/194 202/ 210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/258, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330 and 338/346. In certain embodiments, the HCVR/LCVR amino acid sequence pair is selected from one of SEQ ID NOs: 50/58 (e.g. H4H12161P), 98/106 (e.g. H4H12166P), 138/106 (e.g. H4H12166P5) or 202/210 (e.g. , H4H12170P). In certain embodiments, the implementation of the present invention provides antibodies against C5 or antigennegative fragments containing HCVR and LCVR, the specified HCVR contains the amino acid sequence listed in table. 1, having no more than five amino acid substitutions, and the specified LCVR contains the amino acid sequence listed in table. 1 having no more than two amino acid substitutions. For example, the present invention provides anti-C5 antibodies or antigen-binding fragments thereof comprising HCVR and LCVR, said HCVR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98 having no more than five amino acid substitutions, and said LCVR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106 having no more than two amino acid substitutions. In another embodiment, the present invention provides anti-C5 antibodies or antigen-binding fragments thereof comprising HCVR and LCVR, said HCVR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98 having at least one amino acid substitution, and said LCVR comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106 having one amino acid substitution.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCDR1, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.The present invention also relates to antibodies or antigennegative fragments thereof, which contain a heavy chain CDR1 (HCDR1) containing an amino acid sequence selected from any of the HCDR1 amino acid sequences listed in Table. 1, or a substantially similar sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCDR2, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.The present invention also relates to antibodies or antigennegative fragments thereof, which contain a heavy chain CDR2 (HCDR2) containing an amino acid sequence selected from any of the HCDR2 amino acid sequences listed in Table. 1, or a substantially similar sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.The present invention also relates to antibodies or antigennegative fragments thereof, which contain a heavy chain CDR3 (HCDR3) containing an amino acid sequence selected from any of the HCDR3 amino acid sequences listed in Table. 1, or a substantially similar sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR1 легкой цепи (LCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCDR1, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.The present invention also relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof, which contain a light chain CDR1 (LCDR1) containing an amino acid sequence selected from any of the LCDR1 amino acid sequences listed in Table. 1, or a substantially similar sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR2 легкой цепи (LCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCDR2, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%,The present invention also relates to antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that comprise a light chain CDR2 (LCDR2) containing an amino acid sequence selected from any of the LCDR2 amino acid sequences listed in Table 1. 1, or an essentially similar sequence having at least 90%, at least 95%,
- 2 039858 по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.- 2 039858 at least 98% or at least 99% sequence identity.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR3 легкой цепи (LCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.The present invention also relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof, which contain a light chain CDR3 (LCDR3) containing an amino acid sequence selected from any of the LCDR3 amino acid sequences listed in Table 1. 1, or a substantially similar sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCDR3 и LCDR3 (HCDR3/LCDR3), содержащую любые аминокислотные последовательности HCDR3, перечисленные в табл. 1, в паре с любыми аминокислотными последовательностями LCDR3, перечисленными в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, содержащуюся в любых образцовых антителах против С5, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3 выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 56/64 (например, Н4Н12161Р), 104/112 (например, Н4Н12166Р), 144/112 (например, Н4Н12166Р5) и 208/216 (например, Н4Н12170Р).The present invention also relates to antibodies or antigennegative fragments thereof, which contain a pair of amino acid sequences HCDR3 and LCDR3 (HCDR3/LCDR3) containing any of the HCDR3 amino acid sequences listed in table. 1, paired with any of the LCDR3 amino acid sequences listed in Table 1. 1. In accordance with certain embodiments, the present invention provides antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that comprise the HCDR3/LCDR3 amino acid sequence pair contained in any of the exemplary anti-C5 antibodies listed in Table 1. 1. In certain embodiments, the HCDR3/LCDR3 amino acid sequence pair is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 56/64 (e.g., H4H12161P), 104/112 (e.g., H4H12166P), 144/112 (e.g., H4H12166P5), and 208 /216 (for example, H4H12170P).
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту, и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела,или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCVR и LCVR, указанная LCVR содержит LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту, и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 100 на одну аминокислоту, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 102 на одну аминокислоту, и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 104 на одну аминокислоту. В другом образцовом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCVR и LCVR, указанная LCVR содержит LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 108 на одну аминокислоту, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 110 на одну аминокислоту, и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 112 на одну аминокислоту.The present invention also relates to antibodies or antigennegative fragments thereof, which contain HCVR and LCVR, the specified HCVR contains HCDR1 containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence listed in table. 1, one amino acid, HCDR2, containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence listed in table. 1, one amino acid, and HCDR3 containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence listed in table. 1, per amino acid. In certain embodiments, the present invention provides antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that comprise HCVR and LCVR, said LCVR comprising an LCDR1 containing an amino acid sequence different from the amino acid sequence listed in Table 1. 1, one amino acid, LCDR2 containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence listed in table. 1, one amino acid, and LCDR3 containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence listed in table. 1, per amino acid. For example, the present invention provides antibodies against C5 or antigen-binding fragments thereof, which contain HCVR and LCVR, said HCVR contains HCDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO: 100 by one amino acid, HCDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 102 by one amino acid, and HCDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104 or an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 104 by one amino acid. In another exemplary embodiment, the present invention provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that comprise HCVR and LCVR, said LCVR comprising an LCDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO: 108 by one amino acid, LCDR2, containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO: 110 by one amino acid, and LCDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO: 112 by one amino acid.
Настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353 или по существу схожую с ней последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ней.The present invention provides antibodies or antigen-binding fragments thereof, which contain a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 353 or a sequence essentially similar to it, having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with it.
Настоящее изобретение также относится к антителам, или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 354 или по существу схожую с ней последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ней.The present invention also relates to antibodies, or antigen-binding fragments thereof, which contain a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 354 or a sequence essentially similar to it, having at least 80%, at least 85%, at least 90 %, at least 95%, at least 98% or at least 99% sequence identity with it.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353 или по существу схожую с ней последовательность, обладающую по меньшей мере 8 0% или по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с ней;In certain embodiments, the present invention provides antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that comprise a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 353, or a sequence substantially similar thereto, having at least 80% or at least 90% sequence identity with her;
и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 354 или по существу схожую с ней последовательность, обладающую по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с ней.and a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 354 or a sequence substantially similar to it, having at least 80% or at least 90% sequence identity with it.
Настоящее изобретение также относится к антителам, или их антигенсвязывающим фрагментам,The present invention also relates to antibodies, or antigen-binding fragments thereof,
- 3 039858 которые содержат набор из шести CDR (т.е. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащийся в любом из образцовых антител против С5, перечисленных в табл. 1.- 3 039858 which contain a set of six CDRs (ie HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contained in any of the exemplary anti-C5 antibodies listed in table. one.
В определенных вариантах осуществления набор аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52-54-56-60-62-64 (например, Н4Н12161Р), 100-102-104-108-110-112 (например, Н4Н12166Р), 140-142-144-108-110-112 (например, Н4Н12166Р5) и 204-206-208-212-214-216 (например, Н4Н12170Р).In certain embodiments, the set of amino acid sequences HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 52-54-56-60-62-64 (e.g., H4H12161P), 100-102-104 -108-110-112 (for example, H4H12166P), 140-142-144-108-110-112 (for example, H4H12166P5) and 204-206-208-212-214-216 (for example, H4H12170P).
В связанном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат набор из шести CDR (т.е. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, как определено с помощью любых образцовых антител против С5, перечисленных в табл. 1. Например, настоящее изобретение включает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат набор аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50/58 (например, Н4Н12161Р), 98/106 (например, Н4Н12166Р), 138/106 (например, Н4Н12166Р5) или 202/210 (например, Н4Н12170Р). Способы и приемы идентификации CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR хорошо известны в данной области, и их можно использовать для того, чтобы идентифицировать CDR в конкретных аминокислотных последовательностях HCVR и/или LCVR, раскрытых в настоящем описании. Образцовые конвенции, которые можно использовать для того, чтобы идентифицировать границы CDR, включают, например, определение Kabat, определение Chothia и определение AbM. Вообще говоря, определение Kabat основано на вариабельности последовательностей, определение Chothia основано на местоположении областей структурных петель, а определение AbM представляет собой компромисс между подходами Kabat и Chothia. См., например, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); и Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989). Публичные базы данных также доступны для идентификации последовательностей CDR в антителе.In a related embodiment, the present invention provides antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that comprise a set of six CDRs (i.e., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contained within the HCVR/LCVR amino acid sequence pair as determined by any exemplary antibodies against C5 listed in table. 1. For example, the present invention includes antibodies, or antigen-binding fragments thereof, which comprise a set of amino acid sequences HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contained in an HCVR/LCVR amino acid sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID NO: 50 /58 (eg H4H12161P), 98/106 (eg H4H12166P), 138/106 (eg H4H12166P5) or 202/210 (eg H4H12170P). Methods and techniques for identifying CDRs in HCVR and LCVR amino acid sequences are well known in the art and can be used to identify CDRs in specific HCVR and/or LCVR amino acid sequences disclosed herein. Exemplary conventions that can be used to identify CDR boundaries include, for example, the definition of Kabat, the definition of Chothia, and the definition of AbM. Generally speaking, the Kabat definition is based on sequence variability, the Chothia definition is based on the location of structural loop regions, and the AbM definition is a compromise between the Kabat and Chothia approaches. See, for example, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA 86:9268-9272 (1989). Public databases are also available for identifying CDR sequences in an antibody.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с С5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (CDR) (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), и три CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в вариабельной области легкой цепи (LCVR), где HCVR содержит (i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98;In certain embodiments, the present invention includes an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to C5, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises three heavy chain complementarity determining regions (CDRs) (HCDR1, HCDR2, and HCDR3) contained within a heavy chain variable region ( HCVR), and three light chain CDRs (LCDR1, LCDR2, and LCDR3) contained in a light chain variable region (LCVR), wherein the HCVR comprises (i) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98;
(ii) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 98;(ii) an amino acid sequence having at least 90% identity with SEQ ID NO: 98;
(iii) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 98;(iii) an amino acid sequence having at least 95% identity with SEQ ID NO: 98;
или (iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, имеющую не больше 5 замен аминокислот;or (iv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98 having no more than 5 amino acid substitutions;
и LCVR содержит (i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106;and LCVR contains (i) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106;
(ii) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 106;(ii) an amino acid sequence having at least 90% identity with SEQ ID NO: 106;
(iii) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 106; или (iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, имеющую не больше 5 замен аминокислот.(iii) an amino acid sequence having at least 95% identity with SEQ ID NO: 106; or (iv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106 having no more than 5 amino acid substitutions.
Настоящее изобретение включает антитела против С5, имеющие модифицированный паттерн гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления можно использовать модификацию для того, чтобы удалять нежелательные участки гликозилирования, или антитело, не содержащее фрагмент фукозы, присутствующий на олигосахаридной цепи, например, для увеличения функции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002), JBC, 277:26733). В других применениях можно выполнять модификацию галактозилирования для того, чтобы модифицировать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).The present invention includes anti-C5 antibodies having a modified glycosylation pattern. In some embodiments, a modification may be used to remove unwanted glycosylation sites, or an antibody lacking a fucose moiety present on the oligosaccharide chain, e.g., to increase the function of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) (see Shield et al. (2002) , JBC, 277:26733). In other applications, modification of galactosylation can be performed in order to modify complement-dependent cytotoxicity (CDC).
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые ингибируют рН-зависимое связывание с С5. Например, настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают С5 с более высокой аффинностью при нейтральном рН, чем при кислом рН (т.е. сниженное связывание при кислом рН).In certain embodiments, the present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that inhibit pH-dependent binding to C5. For example, the present invention includes antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind C5 with higher affinity at neutral pH than at acidic pH (ie, reduced binding at acidic pH).
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые проявляют усовершенствованные фармакокинетические и фармакодинамические свойства, например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5, которые обладают увеличенным временем полужизни в сыворотке. В определенных вариантах осущест- 4 039858 вления антитела против С5 по настоящему изобретению имеют концентрацию в сыворотке больше чем мкг/мл до суток 40 у С5-гуманизированных мышей. В определенных вариантах осуществления антитела против С5 по настоящему изобретению блокируют СР и АР гемолиз до суток 35 при введении С5гуманизированным мышам.In certain embodiments, the present invention provides antibodies and antigen binding fragments that exhibit improved pharmacokinetic and pharmacodynamic properties, for example, the present invention provides anti-C5 antibodies that have an increased serum half-life. In certain embodiments, the anti-C5 antibodies of the present invention have a serum concentration of greater than µg/mL up to day 40 in C5 humanized mice. In certain embodiments, the anti-C5 antibodies of the present invention block CP and AP hemolysis up to day 35 when administered to C5 humanized mice.
Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые конкурируют за специфическое связывание с С5 с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим CDR из HCVR и CDR из LCVR, где каждая HCVR и LCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей HCVR и LCVR, перечисленных в табл. 1.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments thereof that compete for specific binding to C5 with an antibody or antigen-binding fragment thereof containing a CDR from HCVR and a CDR from LCVR, where each HCVR and LCVR has an amino acid sequence selected from the sequences of HCVR and LCVR, listed in Table. one.
Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые перекрестно конкурируют за связывание с С5 с эталонным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим CDR из HCVR и CDR из LCVR, где каждая HCVR и LCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей HCVR и LCVR, перечисленных в табл. 1.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments thereof that cross-compete for binding to C5 with a reference antibody or antigen-binding fragment thereof containing a CDR from HCVR and a CDR from LCVR, where each HCVR and LCVR has an amino acid sequence selected from the sequences of HCVR and LCVR listed in Table. one.
Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с тем же эпитопом, что и эталонное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий CDR из HCVR и CDR из LCVR, где каждая HCVR и LCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей HCVR и LCVR, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом, что и эталонное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий CDR из HCVR и CDR из LCVR, где пара аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR имеет SEQ ID NO: 98/106.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to the same epitope as a reference antibody or antigen-binding fragment containing a CDR from HCVR and a CDR from LCVR, where each HCVR and LCVR has an amino acid sequence selected from the sequences of HCVR and LCVR listed in Table. 1. In certain embodiments, the present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to the same epitope as a reference antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising a CDR from HCVR and a CDR from LCVR, wherein the HCVR/LCVR amino acid sequence pair has SEQ ID NO: 98/106.
Настоящее изобретение также относится к антителам против С5 и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с одним или несколькими аминокислотными остатками, содержащимися в α цепь и/или β цепи С5. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с одной или несколькими аминокислотами в α цепи С5 и одной или несколькими аминокислотами в β цепи С5. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с одной или несколькими аминокислотами в α и β цепях С5, где антитела не связываются с доменом анафилатоксина С5а. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в С5 человека (SEQ ID NO: 359). В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в С5 человека (SEQ ID NO: 359), где антитела не связываются с доменом анафилатоксина С5а из С5. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из (а) аминокислот с 591 до 599 из SEQ ID NO: 359; (b) аминокислот с 593 до 599 из SEQ ID NO: 359; (с) аминокислот с 775 до 787 из SEQ ID NO: 359; (d) аминокислот с 775 до 794 из SEQ ID NO: 359 и (е) аминокислот с 779 до 787 из SEQ ID NO: 359. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 359, например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют по меньшей мере с 5 аминокислотами, по меньшей мере 10 аминокислотами или по меньшей мере 15 аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 361. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 359, например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют по меньшей мере с 5 аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 360. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют по меньшей мере с 5 аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 360 и 361. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 360 (соответствующей аминокислотам с 591 до 599 из SEQ ID NO: 359) и с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 361 (соответствующей аминокислотам с 775 до 794 из SEQ ID NO: 359).The present invention also relates to C5 antibodies and antigen-binding fragments thereof, which bind to one or more amino acid residues contained in the α chain and/or β chain of C5. In certain embodiments, the present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to one or more amino acids in the C5 α chain and one or more amino acids in the C5 β chain. In certain embodiments, the present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to one or more amino acids in the α and β chains of C5, wherein the antibodies do not bind to the C5a anaphylatoxin domain. In certain embodiments, the present invention provides anti-C5 antibodies that interact with one or more amino acids contained in human C5 (SEQ ID NO: 359). In certain embodiments, the present invention provides anti-C5 antibodies that interact with one or more amino acids contained in human C5 (SEQ ID NO: 359), wherein the antibodies do not bind to the C5a anaphylatoxin domain of C5. In certain embodiments, the present invention provides anti-C5 antibodies and antigen-binding fragments thereof that interact with an amino acid sequence selected from the group consisting of (a) amino acids 591 to 599 of SEQ ID NO: 359; (b) amino acids 593 to 599 of SEQ ID NO: 359; (c) amino acids 775 to 787 of SEQ ID NO: 359; (d) amino acids 775 to 794 of SEQ ID NO: 359; and (e) amino acids 779 to 787 of SEQ ID NO: 359. In certain embodiments, the present invention provides anti-C5 antibodies and antigen-binding fragments thereof that interact with one or several amino acids contained in SEQ ID NO: 359, for example, the present invention provides antibodies against C5 and antigen-binding fragments thereof, which interact with at least 5 amino acids, at least 10 amino acids, or at least 15 amino acids contained in SEQ ID NO: : 361. In certain embodiments, the present invention provides anti-C5 antibodies and antigen-binding fragments thereof that interact with one or more amino acids contained in SEQ ID NO: 359, for example, the present invention provides anti-C5 antibodies and antigen-binding fragments thereof that interact with at least 5 amino acids contained in SEQ ID NO: 360. In certain embodiments, the present invention provides anti-C5 antibodies and antigen-binding fragments thereof that interact with at least 5 amino acids contained in SEQ ID NOs: 360 and 361. In certain embodiments, the present invention provides anti-C5 antibodies and their antigen-binding fragments that interact with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 360 (corresponding to amino acids 591 to 599 of SEQ ID NO: 359) and with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 361 (corresponding to amino acids 775 to 794 of SEQ ID NO: 359 ).
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться специфически с С5 агонистическим образом, т.е. они могу усиливать или стимулировать связывание и/или активность С5; в других вариантах осуществления антитело может связываться специфически с С5 антагонистическим образом, т.е. оно может блокировать связывание и/или активность С5.In some embodiments, the antibody, or antigen-binding fragment thereof, can bind specifically to C5 in an agonistic manner, ie. they can enhance or stimulate C5 binding and/or activity; in other embodiments, the antibody may bind specifically to C5 in an antagonistic manner, ie. it may block the binding and/or activity of C5.
Настоящее изобретение также относится к выделенным антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют связывание С5 с С5-конвертазой. В некоторых вариантах осуществле- 5 039858 ния антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые блокируют связывание С5 сThe present invention also relates to isolated antibodies and antigen-binding fragments thereof which block the binding of C5 to C5 convertase. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof that blocks C5 binding to
С5-конвертазой, могут связываться с тем же эпитопом на С5, что и С5-конвертаза, или могут связываться с другим эпитопом на С5, нежели С5-конвертаза. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые блокируют связывание С5 с С5-конвертазой обезьяны.C5 convertase may bind to the same epitope on C5 as C5 convertase, or may bind to a different epitope on C5 than C5 convertase. In some embodiments, the present invention provides antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that block C5 binding to monkey C5 convertase.
В определенных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению являются биспецифическими и имеют первую специфичность связывания с первым эпитопом белка С5 и вторую специфичность связывания со вторым эпитопом белка С5, где первый и второй эпитопы являются различными и не перекрывающимися.In certain embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments of the present invention are bispecific and have a first binding specificity for a first epitope of a C5 protein and a second binding specificity for a second epitope of a C5 protein, wherein the first and second epitopes are distinct and non-overlapping.
В определенных вариантах осуществления антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связываются с С5а с IC50 меньше чем 0,5 нМ. В определенных вариантах осуществления антитела содержат HCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 290, 306, 322 и 338. В определенных вариантах осуществления антитела содержат LCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 298, 314, 330 и 346.In certain embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments of the present invention bind to C5a with an IC 50 of less than 0.5 nM. In certain embodiments, the antibodies comprise an HCVR comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 290, 306, 322, and 338. In certain embodiments, the antibodies comprise an LCVR comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 298, 314, 330 and 346.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые имеют одну или несколько следующих характеристик:In certain embodiments, the present invention provides an isolated antibody, or antigen-binding fragment thereof, that has one or more of the following characteristics:
(а) представляет собой моноклональное антитело полностью человека;(a) is a fully human monoclonal antibody;
(b) связывается с С5 человека с константой диссоциации (KD) меньше чем 0,9 нМ при 25°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(b) binds to human C5 with a dissociation constant (KD) of less than 0.9 nM at 25° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(с) связывается с С5 человека с KD меньше чем 0,3 нМ при 37°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(c) binds to human C5 with a KD of less than 0.3 nM at 37° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(d) связывается с С5 обезьяны с KD меньше чем 65 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(d) binds to monkey C5 with a KD of less than 65 nM as measured in a surface plasmon resonance assay;
(е) связывается с вариантом С5 человека R885H (SEQ ID NO: 356) с KD меньше чем 0,5 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(e) binds to human C5 variant R885H (SEQ ID NO: 356) with a K D of less than 0.5 nM as measured in a surface plasmon resonance assay;
(f) связывается с вариантом С5 человека R885C (SEQ ID NO: 357) с KD меньше чем 0,5 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(f) binds to human C5 variant R885C (SEQ ID NO: 357) with a K D of less than 0.5 nM as measured in a surface plasmon resonance assay;
(g) блокирует опосредованный С5 человека классический путь (СР) гемолиза больше чем на 95% и с IC50 меньше чем 6 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;(g) blocks the human C5-mediated classical pathway (CP) of hemolysis by greater than 95% and with an IC 50 of less than 6 nM as measured in the hemolysis CP assay;
(h) блокирует опосредованный С5 человека альтернативный путь (АР) гемолиза больше чем на 70% и с IC50 меньше чем 165 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза;(h) blocks the human C5 mediated alternative pathway (AR) of hemolysis by more than 70% and with an IC 50 of less than 165 nM as measured by the hemolysis AR assay;
(i) ингибирует опосредованный С5 африканской зеленой мартышки СР гемолиз с IC50 меньше чем 185 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;(i) inhibits African green monkey C5 mediated CP hemolysis with an IC 50 of less than 185 nM as measured in the Hemolysis CP assay;
(j) ингибирует опосредованный С5 африканской зеленой мартышки АР гемолиз с IC50 меньше чем 235 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза;(j) inhibits African green monkey C5-mediated AR hemolysis with an IC 50 of less than 235 nM as measured by the AR hemolysis assay;
(k) ингибирует опосредованный С5 яванского макака СР гемолиз с IC50 меньше чем 145 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;(k) inhibits cynomolgus C5 mediated CP hemolysis with an IC 50 of less than 145 nM as measured in the CP hemolysis assay;
(l) ингибирует опосредованный С5 яванского макака АР гемолиз с IC50 меньше чем 30 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза.(l) inhibits cynomolgus C5 mediated AR hemolysis with an IC 50 of less than 30 nM as measured by the AR hemolysis assay.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное рекомбинантное моноклональное антитело против С5 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые имеют одну или несколько следующих характеристик:In certain embodiments, the present invention provides an isolated recombinant anti-C5 monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, that has one or more of the following characteristics:
(а) содержит набор из шести CDR, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 100-102-104-108-110-112;(a) contains a set of six CDRs containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 100-102-104-108-110-112;
(b) связывается с С5 человека с константой диссоциации (KD) меньше чем 0,2 нМ при 25°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(b) binds to human C5 with a dissociation constant (KD) of less than 0.2 nM at 25° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(с) связывается с С5 человека с KD меньше чем 0,3 нМ при 37°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(c) binds to human C5 with a KD of less than 0.3 nM at 37° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(d) связывается с вариантом С5 человека (R885H) с KD меньше чем 0,4 нМ при 37°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(d) binds to human C5 variant (R885H) with a KD of less than 0.4 nM at 37° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(е) ингибирует опосредованный классическим путем (СР) гемолиз в сыворотке человека с IC50 меньше чем 3 нМ;(e) inhibits classically mediated (CP) hemolysis in human serum with an IC 50 of less than 3 nM;
(f) ингибирует опосредованный альтернативным путем (АР) гемолиз в сыворотке человека с IC50 меньше чем 27 нМ;(f) inhibits alternative pathway (AP) mediated hemolysis in human serum with an IC 50 of less than 27 nM;
(g) ингибирует СР-опосредованный гемолиз в сыворотке обезьяны с IC50 меньше чем 21 нМ;(g) inhibits CP-mediated hemolysis in monkey serum with an IC 50 less than 21 nM;
(g) ингибирует АР-опосредованный гемолиз в сыворотке обезьяны с IC50 меньше чем 10 нМ;(g) inhibits AP-mediated hemolysis in monkey serum with an IC50 of less than 10 nM;
(h) имеет время полужизни в сыворотке (t1/2) больше чем 10 суток у С5-гуманизированных мышей;(h) has a serum half-life (t 1/2 ) greater than 10 days in C5 humanized mice;
(i) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 40 при введении С5-гуманизированным мышам;(i) has a serum concentration greater than 10 μg/ml up to day 40 when administered to C5 humanized mice;
- 6 039858 (j) блокирует СР-опосредованный гемолиз до суток 50 у С5-гуманизированных мышей;- 6 039858 (j) blocks CP-mediated hemolysis up to day 50 in C5 humanized mice;
(k) связывается с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в α цепи и/или β цепи SEQ ID NO: 359, где антитело не связывается с доменом анафилатоксина С5а из С5.(k) binds to one or more amino acids contained in the α chain and/or β chain of SEQ ID NO: 359, wherein the antibody does not bind to the C5a anaphylatoxin domain of C5.
Во втором аспекте настоящее изобретение предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против С5 или их части. Например, настоящее изобретение предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые аминокислотные последовательности HCVR, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCVR, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.In a second aspect, the present invention provides nucleic acid molecules encoding anti-C5 antibodies or portions thereof. For example, the present invention provides nucleic acid molecules encoding any of the HCVR amino acid sequences listed in Table. one; in certain embodiments, the implementation of the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the HCVR nucleic acid sequences listed in table. 2, or a sequence that is substantially similar to them, having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности LCVR, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCVR, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding any of the LCVR amino acid sequences listed in table. one; in certain embodiments, the implementation of the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the LCVR nucleic acid sequences listed in table. 2, or a sequence that is substantially similar to them, having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности HCDR1, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCDR1, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding any of the HCDR1 amino acid sequences listed in table. one; in certain embodiments, the implementation of the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the nucleic acid sequences HCDR1 listed in table. 2, or a sequence that is substantially similar to them, having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности HCDR2, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCDR2, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding any of the HCDR2 amino acid sequences listed in table. one; in certain embodiments, the implementation of the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the nucleic acid sequences HCDR2 listed in table. 2, or a sequence that is substantially similar to them, having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности HCDR3, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCDR3, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding any of the HCDR3 amino acid sequences listed in table. one; in certain embodiments, the implementation of the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the nucleic acid sequences HCDR3 listed in table. 2, or a sequence that is substantially similar to them, having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности LCDR1, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCDR1, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding any of the LCDR1 amino acid sequences listed in Table. one; in certain embodiments, the implementation of the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the LCDR1 nucleic acid sequences listed in table. 2, or a sequence that is substantially similar to them, having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности LCDR2, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCDR2, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding any of the LCDR2 amino acid sequences listed in Table. one; in certain embodiments, the implementation of the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the LCDR2 nucleic acid sequences listed in table. 2, or a sequence that is substantially similar to them, having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности LCDR3, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCDR3, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding any of the LCDR3 amino acid sequences listed in Table. one; in certain embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the LCDR3 nucleic acid sequences listed in Table 1. 2, or a sequence that is substantially similar to them, having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим HCVR, где HCVR содержит набор из трех CDR (т.е. HCDR1-HCDR2-HCDR3), где набор аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3 представляет собой то, что определено с помощью любых образцовых антител против С5, перечисленных в табл. 1.The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding HCVR, where HCVR contains a set of three CDRs (i.e. HCDR1-HCDR2-HCDR3), where the set of amino acid sequences HCDR1-HCDR2-HCDR3 is that determined using any exemplary antibodies against C5 listed in table. one.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим LCVR, где LCVR содержит набор из трех CDR (т.е. LCDR1-LCDR2-LCDR3), где набор аминокислотных последовательностей LCDR1-LCDR2-LCDR3 представляет собой то, что определено с помощью любых образцовых антител против С5, перечисленных в табл. 1.The present invention also relates to nucleic acid molecules encoding LCVR, where the LCVR contains a set of three CDRs (i.e. LCDR1-LCDR2-LCDR3), where the set of amino acid sequences LCDR1-LCDR2-LCDR3 is that determined using any exemplary antibodies against C5 listed in table. one.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим какThe present invention also relates to nucleic acid molecules encoding both
- 7 039858- 7 039858
HCVR, так и LCVR, где HCVR содержит аминокислотную последовательность из любой из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в табл. 1, и где LCVR содержит аминокислотную последовательность из любой из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 1.HCVR and LCVR, where HCVR contains an amino acid sequence from any of the HCVR amino acid sequences listed in table. 1, and where LCVR contains an amino acid sequence from any of the LCVR amino acid sequences listed in table. one.
В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCVR, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними, и полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCVR, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними. В определенных вариантах осуществления в соответствии с этим аспектом изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует HCVR и LCVR, где и HCVR и LCVR получены из одного и того же антитела против С5, перечисленного в табл. 1.In certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the HCVR nucleic acid sequences listed in Table 1. 2, or a sequence substantially similar thereto, having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity therewith, and a polynucleotide sequence selected from any of the LCVR nucleic acid sequences listed in Table. 1, or a substantially similar sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity with them. In certain embodiments according to this aspect of the invention, the nucleic acid molecule encodes HCVR and LCVR, where both HCVR and LCVR are derived from the same anti-C5 antibody listed in Table 1. one.
В связанном аспекте настоящее изобретение предусматривает рекомбинантные экспрессирующие векторы, способные экспрессировать полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела против С5. Например, настоящее изобретение включает рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие любые молекулы нуклеиновой кислоты, указанные выше, т.е. молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые последовательности HCVR, LCVR и/или CDR, как изложено в табл. 2. Также в объем настоящего изобретения включены клетки-хозяева, в которые введены такие векторы, а также способы получения антител или их частей посредством культивирования клеток-хозяев в условиях, допускающих получение антител или фрагментов антител и извлечение антител и фрагментов антител, полученных таким образом.In a related aspect, the present invention provides recombinant expression vectors capable of expressing a polypeptide containing the heavy or light chain variable region of an anti-C5 antibody. For example, the present invention includes recombinant expression vectors containing any of the nucleic acid molecules mentioned above, ie. nucleic acid molecules encoding any sequence of HCVR, LCVR and/or CDR, as set forth in table. 2. Also included within the scope of the present invention are host cells into which such vectors are introduced, as well as methods for producing antibodies or parts thereof by culturing the host cells under conditions capable of producing antibodies or antibody fragments and recovering the antibodies and antibody fragments thus obtained. .
В третьем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного рекомбинантного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают С5, и фармацевтически приемлемый носитель. В связанном аспекте изобретение отличается композицией, которая представляет собой комбинацию антитела против С5 и второго терапевтического средства. В одном из вариантов осуществления второе терапевтическое средство представляет собой любое средство, которое благоприятно объединяют с антителом против С5. Образцовые средства, которые могут быть полезно объединены с антителом против С5, включают, без ограничения, другие средства, которые связывают и/или ингибируют активность С5 (в том числе другие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты и т.д.), и/или средства, которые непосредственно не связывают С5, но, тем не менее, лечат или улучшают по меньшей мере один симптом или показание С5-ассоциированного заболевания или нарушения. Дополнительная комбинированная терапия и комбинированные составы с вовлечением антител против С5 по настоящему изобретению раскрыты в другом месте в настоящем описании.In a third aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of at least one recombinant monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds C5 and a pharmaceutically acceptable carrier. In a related aspect, the invention is characterized by a composition that is a combination of an anti-C5 antibody and a second therapeutic agent. In one embodiment, the second therapeutic agent is any agent that combines favorably with an anti-C5 antibody. Exemplary agents that may be usefully combined with an anti-C5 antibody include, without limitation, other agents that bind and/or inhibit C5 activity (including other antibodies or antigen-binding fragments thereof, etc.) and/or agents that do not directly bind C5, but nevertheless treat or improve at least one symptom or indication of a C5-associated disease or disorder. Additional combination therapy and combination formulations involving antibodies against C5 of the present invention are disclosed elsewhere in the present description.
В четвертом аспекте изобретение относится к терапевтическим способам для лечения заболевания или нарушения, связанного с С5, у субъекта с использованием антитела против С5 или антигенсвязывающей части антитела по изобретению, где терапевтические способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по изобретению, субъекту, нуждающемуся в этом. Нарушение, которое лечат, представляет собой любое заболевание или состояние, которое усовершенствуют, улучшают, ингибируют или предотвращают посредством ингибирования активности С5. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам предотвращения, лечения или улучшения по меньшей мере одного симптома атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS), способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела против С5 или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы улучшения или снижения тяжести по меньшей мере одного симптома или показания пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH) у субъекта посредством введения антитела против С5 по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить профилактически или терапевтически субъекту с наличием или риском наличия С5-ассоциированного заболевания или нарушения. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством субъекту, нуждающемуся в этом. Второе терапевтическое средство можно выбирать из группы, состоящей из противовоспалительного лекарственного средства (такого как кортикостероиды и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства), другого антитела к белку С5, пищевой добавки, такой как антиоксиданты, и любого другого лекарственного средства или терапии, известных в данной области. В определенных вариантах осуществления второе терапевтическое средство может представлять собой средство, которое помогает противодействовать или снижать любой возможный побочный эффект(ы), связанный с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению, если такой побочный эффект(ы) должен проявиться. Антитело или его фрагмент можно вводить подкожно, внутривенно, внутрикожно, интраперитонеально, перорально или внутримышечно. Антитело или его фрагмент можно вводить в дозе приблизительно от 0,1 до приблизительно 100 мг/кгIn a fourth aspect, the invention relates to therapeutic methods for treating a C5 related disease or disorder in a subject using an anti-C5 antibody or an antigen-binding portion of an antibody of the invention, wherein the therapeutic methods comprise administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment of an antibody of the invention. invention, the subject in need of it. A disorder being treated is any disease or condition that is ameliorated, ameliorated, inhibited or prevented by inhibition of C5 activity. In certain embodiments, the invention relates to methods for preventing, treating, or improving at least one symptom of atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS), the method comprising administering a therapeutically effective amount of an anti-C5 antibody, or antigen-binding fragment thereof, of the invention to a subject in need thereof. In some embodiments, the present invention provides methods for improving or reducing the severity of at least one symptom or indication of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) in a subject by administering an anti-C5 antibody of the invention. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof can be administered prophylactically or therapeutically to a subject with or at risk of having a C5-associated disease or disorder. In certain embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention is administered in combination with a second therapeutic agent to a subject in need thereof. The second therapeutic agent may be selected from the group consisting of an anti-inflammatory drug (such as corticosteroids and non-steroidal anti-inflammatory drugs), another anti-C5 protein antibody, a nutritional supplement such as antioxidants, and any other drug or therapy known in the art. In certain embodiments, the second therapeutic agent may be an agent that helps to counteract or reduce any possible side effect(s) associated with the antibody or antigen-binding fragment of the invention, if such side effect(s) should occur. The antibody or fragment thereof can be administered subcutaneously, intravenously, intradermally, intraperitoneally, orally, or intramuscularly. The antibody or fragment thereof may be administered at a dose of about 0.1 to about 100 mg/kg
- 8 039858 массы тела субъекта. В определенных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению можно вводить в одной или нескольких дозах, составляющих между 50 и 600 мг.- 8 039858 body weight of the subject. In certain embodiments, an antibody of the present invention may be administered in one or more doses between 50 and 600 mg.
Настоящее изобретение также относится к применению антитела против С5 или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению при изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, для которого будет полезна блокада связывания и/или активности С5.The present invention also relates to the use of an anti-C5 antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or disorder that would benefit from blockade of C5 binding and/or activity.
Другие варианты осуществления будут видны при просмотре следующего подробного описания.Other embodiments will become apparent upon review of the following detailed description.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
На фиг. 1 представлено ингибирование уровней С5а антителом против С5 Н4Н12166Р в зависимости от дозы, как определяют посредством ELISA (описано в примере 9 в настоящем документе).In FIG. 1 shows dose dependent inhibition of C5a levels by anti-C5 antibody H4H12166P as determined by ELISA (described in Example 9 herein).
На фиг. 2 представлена общая концентрация в сыворотке в зависимости от времени после одной 15 мг/кг внутривенной инъекции Н4Н12166Р, Н4Н12161Р или объекта сравнения 2 самцам яванского макака (описано в примере 10 в настоящем документе). Профили концентрация-время наносили на график от первого после дозы до результата на пределе количественного определения (BLQ), если применимо, который рассчитывали как LLOQ/2. Каждая точка данных представляет среднее (±SD) (n=4 животных/группа); концентрации, которые, как предполагали, находились под влиянием ADA, исключали у одного животного в группе Н4Н12166Р и одного животного в группе Н4Н12161Р, начиная с суток 36 и суток 29 соответственно. LLOQ = нижний предел количественного определения.In FIG. 2 shows the total serum concentration versus time after a single 15 mg/kg intravenous injection of H4H12166P, H4H12161P or reference 2 male cynomolgus monkeys (described in Example 10 herein). The concentration-time profiles were plotted from the first post-dose to the limit of quantitation (BLQ) result, if applicable, which was calculated as LLOQ/2. Each data point represents the mean (±SD) (n=4 animals/group); concentrations that were expected to be influenced by ADA were excluded in one animal in the H4H12166P group and one animal in the H4H12161P group, starting on day 36 and day 29, respectively. LLOQ = lower limit of quantification.
На фиг. 3 представлен процент гемолиза в зависимости от времени ex vivo в красных клетках крови для анализов (А) классического пути и (В) альтернативного пути после одной внутривенной инъекции Н4Н12166Р, Н4Н12161Р или объекта сравнения 2 самцам яванского макака. % гемолиза, вычисляемый как соотношение экспериментального и максимального лизиса за вычетом % фонового лизиса из обоих значений, связан с количеством С5, ингибированного конкретным антителом против С5, присутствующим в сыворотке в данный момент времени. Каждая точка данных представляет среднее (±SD).In FIG. 3 shows the percentage of hemolysis versus time ex vivo in red blood cells for (A) classical pathway and (B) alternative pathway assays after a single intravenous injection of H4H12166P, H4H12161P or reference 2 male cynomolgus monkeys. The % hemolysis, calculated as the ratio of experimental and maximum lysis minus % background lysis from both values, is related to the amount of C5 inhibited by a particular anti-C5 antibody present in serum at a given time. Each data point represents the mean (±SD).
На фиг. 4 представлены профили общей концентрации в сыворотке в зависимости от времени для выбранных антител против С5 у мышей, гуманизированных по С5 (описано в примере 11 в настоящем документе). Гуманизированным С5 мышам вводили одну 15 мг/кг подкожную дозу Н4Н12166Р, объект сравнения 1 или объект сравнения 2. Каждая точка данных представляет среднее ± SEM (n=4-5 кажд.). Осуществляли мониторинг концентраций антител в сыворотках через 1, 10, 20, 30 и 40 суток после инъекции с использованием сэндвич ELISA.In FIG. 4 shows total serum concentration versus time profiles for selected anti-C5 antibodies in C5 humanized mice (described in Example 11 herein). Humanized C5 mice were administered a single 15 mg/kg subcutaneous dose of H4H12166P, Comparator 1 or Comparator 2. Each data point represents the mean±SEM (n=4-5 each). Serum antibody concentrations were monitored 1, 10, 20, 30 and 40 days after injection using a sandwich ELISA.
На фиг. 5 представлен процент гемолиза в зависимости от времени ex vivo в анализе гемолиза по классическому пути комплемента для выбранных антител против С5 у мышей, гуманизированных по С5. Гуманизированным С5 мышам вводили одну 15 мг/кг подкожную дозу Н4Н12166Р, объекта сравнения 1 или объекта сравнения 2. Каждая точка данных представляет среднее ± SEM (n=4-5 кажд.). Осуществляли мониторинг процента гемолиза в сыворотке перед дозой, через 10, 20, 30, 40 и 50 суток после инъекции. % гемолиза, который вычисляли как соотношение экспериментального и максимального лизиса за вычетом % фонового лизиса из обоих значений, связан с количеством С5, ингибированного конкретным антителом против С5, присутствующим в сыворотке в данный момент времени.In FIG. 5 shows the percent hemolysis versus time ex vivo in the classical complement pathway hemolysis assay for selected anti-C5 antibodies in C5 humanized mice. Humanized C5 mice were administered a single 15 mg/kg subcutaneous dose of H4H12166P, Comparator 1, or Comparator 2. Each data point represents mean±SEM (n=4-5 each). Carried out monitoring of the percentage of hemolysis in serum before the dose, 10, 20, 30, 40 and 50 days after injection. The % hemolysis, which was calculated as the ratio of experimental and maximum lysis minus % background lysis from both values, is related to the amount of C5 inhibited by a particular anti-C5 antibody present in serum at a given time.
На фиг. 6 представлены профили общей концентрации в сыворотке в зависимости от времени для выбранных антител против С5 у мышей, гуманизированных по С5 (описано в примере 11 в настоящем документе). Мышам вводили одну 15 мг/кг подкожную дозу Н4Н12166Р, Н4Н12161Р, объекта сравнения 1 или изотипического контроля IgG4P. Каждая точка данных представляет среднее+SEM (n=5 кажд.). Осуществляли мониторинг уровней антител в сыворотках через 6 ч, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 30, 45 и 59 суток после инъекции с использованием сэндвич ELISA.In FIG. 6 shows total serum concentration versus time profiles for selected anti-C5 antibodies in C5 humanized mice (described in Example 11 herein). Mice were given a single 15 mg/kg subcutaneous dose of H4H12166P, H4H12161P, Comparator 1, or IgG4P isotype control. Each data point represents the mean+SEM (n=5 each). Serum antibody levels were monitored 6 hours, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 30, 45 and 59 days post-injection using sandwich ELISA.
На фиг. 7 представлен график, показывающий оценки оптической когерентной томографии (ОСТ) у мышей, которых лечили изотипическим контролем или антителом против С5 M1M17628N по 10 или 50 мг/кг (описано в примере 14 в настоящем документе). ****р<0,0001, двухфакторный дисперсионный анализ лечения антителом против С5 по 50 мг/кг в сравнении с отсутствием лечения или лечением изотипическим контролем.In FIG. 7 is a graph showing optical coherence tomography (OCT) scores in mice treated with the isotype control or anti-C5 antibody M1M17628N at 10 or 50 mg/kg (described in Example 14 herein). ****p<0.0001, two-way ANOVA of anti-C5 antibody treatment at 50 mg/kg versus no treatment or isotype control treatment.
На фиг. 8 представлено ингибирование гемолиза по классическому пути антителом против С5 M1M17628N в отсутствие С3 (А) и в присутствии 80 мкг/мл С3 человека (В) (описано в примере 14 в настоящем документе).In FIG. 8 shows the classical pathway inhibition of hemolysis by the anti-C5 antibody M1M17628N in the absence of C3 (A) and in the presence of 80 μg/ml human C3 (B) (described in Example 14 herein).
На фиг. 9 представлено число клеточных кластеров у С5 гуманизированных мышей, которых лечили изотипическим контролем или антителом против С5 человека Н4Н12170Р по 10 или 50 мг/кг (описано в примере 15 в настоящем документе). n=8-12 глаз для каждой группы.In FIG. 9 shows the number of cell clusters in C5 humanized mice treated with isotype control or anti-human C5 antibody H4H12170P at 10 or 50 mg/kg (described in Example 15 herein). n=8-12 eyes for each group.
На фиг. 10 представлен график, показывающий оценки ОСТ у С5 гуманизированных мышей, которых лечили изотипическим контролем или антителом против С5 человека Н4Н12170Р по 10 или 50 мг/кг (описано в примере 15 в настоящем документе). n=8-12 глаз для каждой группы.In FIG. 10 is a graph showing OCT scores in C5 humanized mice treated with the isotype control or anti-human C5 antibody H4H12170P at 10 or 50 mg/kg (described in Example 15 herein). n=8-12 eyes for each group.
На фиг. 11 представлен график, показывающий оценки ОСТ у С5 гуманизированных мышей, которых лечили изотипическим контролем, антителом против С5 человека Н4Н12166Р по 3 или 10 мг/кг или объектом сравнения 2 по 10 мг/кг. n=6-12 глаз для каждой группы (описано в примере 15 в настоящем документе).In FIG. 11 is a graph showing OCT scores in C5 humanized mice treated with isotype control, anti-human C5 antibody H4H12166P at 3 or 10 mg/kg, or comparator 2 at 10 mg/kg. n=6-12 eyes for each group (described in Example 15 herein).
- 9 039858- 9 039858
На фиг. 12 представлено число клеточных кластеров у С5 гуманизированных мышей, которых лечили изотипическим контролем, антителом против С5 человека Н4Н12166Р по 3 или 10 мг/кг или объектом сравнения 2 по 10 мг/кг. n=6-12 глаз для каждой группы (описано в примере 15 в настоящем документе).In FIG. 12 shows the number of cell clusters in C5 humanized mice treated with isotype control, anti-human C5 antibody H4H12166P at 3 or 10 mg/kg, or comparator 2 at 10 mg/kg. n=6-12 eyes for each group (described in Example 15 herein).
На фиг. 13 представлена кривая выживаемости мышей NZBWF1, которых лечили изотипическим контролем или антителами против С5 M1M17628N или M1M17627N (описано в примере 17 в настоящем описании).In FIG. 13 is a survival curve of NZBWF1 mice treated with isotype control or anti-C5 antibodies M1M17628N or M1M17627N (described in Example 17 herein).
На фиг. 14 представлены уровни (А) альбумина в моче и (В) альбумина в моче, нормализованного по креатинину в моче, у мышей NZBWF1, которых лечили изотипическим контролем или антителами против С5 M1M17628N или M1M17627N (описано в примере 17 в настоящем документе).In FIG. 14 shows the levels of (A) urinary albumin and (B) urinary albumin normalized to urinary creatinine in NZBWF1 mice treated with isotype control or anti-C5 antibodies M1M17628N or M1M17627N (described in Example 17 herein).
На фиг. 15 представлены уровни азота мочевины в крови у мышей NZBWF1, которых лечили изотипическим контролем или антителами против С5 M1M17628N или M1M17627N (описано в примере 17 в настоящем документе).In FIG. 15 shows blood urea nitrogen levels in NZBWF1 mice treated with isotype control or anti-C5 antibodies M1M17628N or M1M17627N (described in Example 17 herein).
На фиг. 16 представлен график, показывающий ингибирование антитело-зависимой цитотоксичности для астроцитов посредством антител против С5 Н4Н12166Р, Н4Н12170Р, объекта сравнения 1 и объекта сравнения 2, как описано в примере 18.In FIG. 16 is a graph showing the inhibition of antibody-dependent cytotoxicity for astrocytes by anti-C5 antibodies H4H12166P, H4H12170P, Comparator 1 and Comparator 2 as described in Example 18.
Подробное описаниеDetailed description
Перед описанием данных способов следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, по существу способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, служит только цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена в качестве ограничения, поскольку объем настоящего изобретения ограничен только приложенной формулой изобретения.Before describing these methods, it should be understood that this invention is not limited to the particular methods and experimental conditions described, as such, the methods and conditions may vary. It should also be understood that the terminology used in this specification is only for the purpose of describing specific embodiments and is not intended to be limiting, as the scope of the present invention is only limited by the appended claims.
Пока не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, в каком их обычно понимает специалист в области, к которой относится это изобретение. Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, можно использовать при практической реализации или тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны далее. Все публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in the present description have the same meaning as they are commonly understood by a person skilled in the art to which this invention pertains. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are described below. All publications mentioned in the present description are incorporated into the present description by reference in their entirety.
ОпределенияDefinitions
Термин С5, также называемый компонентом 5 комплемента или фактор комплемента 5, относится к белку сыворотки из каскада комплемента. Белок С5 представляет собой белок из 1676 аминокислот, который содержит две цепи, α и β. Белок является точкой схождения трех путей активации комплемента: классического пути, альтернативного пути и пути маннозосвязывающего лектина. Аминокислотная последовательность полноразмерного белка С5 приведена в качестве примера в аминокислотной последовательности, предоставленной в GenBank под номером доступа NP_001726.2 (SEQ ID NO: 355). Термин С5 включает рекомбинантный белок С5 или его фрагмент. Термин также охватывает белок С5 или его фрагмент, сопряженный, например, с гистидиновой меткой, Fc мыши или человека или сигнальной последовательностью, такой как ROR1. Например, термин включает последовательности, примерами которых являются последовательности, представленные в SEQ ID NO: 356 или 357, которые содержат на С-конце гистидиновую метку, сопряженную с аминокислотными остатками 19-1676 полноразмерного белка С5. Термин также включает варианты белков, которые содержат гистидиновую метку на С-конце, сопряженную с аминокислотными остатками 19-1676 полноразмерного белка С5 с заменой R885H или заменой R885C.The term C5, also called complement component 5 or complement factor 5, refers to a serum protein from the complement cascade. The C5 protein is a 1676 amino acid protein that contains two chains, α and β. The protein is the point of convergence of three pathways of complement activation: the classical pathway, the alternative pathway, and the mannose-binding lectin pathway. The amino acid sequence of the full-length C5 protein is exemplified in the amino acid sequence provided by GenBank Accession Number NP_001726.2 (SEQ ID NO: 355). The term C5 includes recombinant C5 protein or a fragment thereof. The term also encompasses a C5 protein or a fragment thereof conjugated to, for example, a histidine tag, a mouse or human Fc, or a signal sequence such as ROR1. For example, the term includes sequences, exemplified by those shown in SEQ ID NO: 356 or 357, which contain at the C-terminus a histidine tag conjugated to amino acid residues 19-1676 of the full-length C5 protein. The term also includes protein variants that contain a C-terminal histidine tag conjugated to amino acid residues 19-1676 of the full-length C5 protein with an R885H substitution or an R885C substitution.
Термин антитело, как используют в настоящем описании, предназначен для обозначения молекул иммуноглобулинов, состоящих из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных дисульфидными связями (т.е. полные молекулы антител), а также их мультимеров (например, IgM) или их антигенсвязывающих фрагментов. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи (состоит из доменов СН1, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (LCVR или VL) и константной области легкой цепи (CL). Области VH и VL дополнительно можно подразделять на области гипервариабельности, обозначаемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с областями, которые более консервативны и которые называют каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В определенных вариантах осуществления FR антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) могут быть идентичны последовательностям зародышевой линии человека или могут быть модифицированы естественным или искусственным путем.The term antibody, as used herein, is intended to refer to immunoglobulin molecules consisting of four polypeptide chains, two heavy (H) chains, and two light (L) chains linked by disulfide bonds (i.e., complete antibody molecules), as well as their multimers (eg IgM) or their antigen-binding fragments. Each heavy chain is composed of a heavy chain variable region (HCVR or V H ) and a heavy chain constant region (composed of C H 1 , C H 2 and C H 3 domains). Each light chain is composed of a light chain variable region (LCVR or V L ) and a light chain constant region (C L ). The V H and V L regions can be further subdivided into regions of hypervariability, referred to as complementarity-determining regions (CDRs), which alternate with regions that are more conserved and are referred to as framework regions (FRs). Each V H and V L consists of three CDRs and four FRs, arranged from amino to carboxy in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. In certain embodiments, the FR of an antibody (or antigen-binding fragment thereof) may be identical to human germline sequences or may be naturally or artificially modified.
Консенсусную аминокислотную последовательность можно определять на основе сравнительного анализа двух или больше CDR.The consensus amino acid sequence can be determined based on a comparative analysis of two or more CDRs.
Также возможна замена одного или нескольких остатков CDR или пропуск одной или нескольких CDR. В научной литературе описаны антитела, в которых могут быть распределены одна или две CDR для связывания. Padlan et al. (1995, FASEB J. 9:133-139) анализировали области контакта между антите- 10 039858 лами и их антигенами на основе опубликованных кристаллических структур и заключали, что только приблизительно от одной пятой до одной третьей остатков CDR фактически контактируют с антигеном.It is also possible to replace one or more CDR residues or skip one or more CDRs. The scientific literature describes antibodies in which one or two CDRs can be distributed for binding. Padlan et al. (1995, FASEB J. 9:133-139) analyzed the contact regions between antibodies and their antigens based on published crystal structures and concluded that only about one fifth to one third of the CDRs actually contact the antigen.
Padlan также обнаружил множество антител, в которых одна или две CDR не имеют аминокислот в контакте с антигеном (см. также Vajdos et al. 2002, J. Mol. Biol. 320:415-428).Padlan has also found many antibodies in which one or two CDRs lack amino acids in contact with the antigen (see also Vajdos et al. 2002, J. Mol. Biol. 320:415-428).
Остатки CDR, не контактирующие с антигеном, можно идентифицировать на основе предыдущих исследований (например, остатки Н60-Н65 в CDRH2 часто не требуются), в областях CDR по Kabat, лежащих вне CDR no Chothia, посредством молекулярного моделирования и/или эмпирически. Если CDR или ее остаток(остатки) пропускают, обычно ее заменяют на аминокислоту, занимающую соответствующее положение в другой последовательности антитела человека или консенсусе таких последовательностей. Положения для замены в CDR и аминокислоты для замен также можно выбирать эмпирически. Эмпирические замены могут представлять собой консервативные или неконсервативные замены.Non-antigen contacting CDR residues can be identified based on previous studies (eg, H60-H65 residues in CDRH2 are often not required), in Kabat CDR regions outside the no Chothia CDR, by molecular modeling and/or empirically. If a CDR or its residue(s) is omitted, it is usually replaced with an amino acid at the appropriate position in another human antibody sequence or consensus of such sequences. CDR substitution positions and amino acid substitutions can also be empirically selected. Empirical substitutions may be conservative or non-conservative substitutions.
Моноклональные антитела полностью человека против С5, раскрытые в настоящем описании, могут содержать одну или несколько замен, инсерций и/или делеций аминокислот каркасных и/или CDR областях вариабельных доменов тяжелых и легких цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии. Такие мутации легко определять посредством сравнения аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании, с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, в публичных базах данных о последовательностях антител. Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые получают из любых аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании, в которых одну или несколько аминокислот в одной или нескольких каркасных и/или CDR областях мутируют в соответствующий остаток(остатки) последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело, или в соответствующий остаток(остатки) другой последовательности зародышевой линии человека, или в консервативную аминокислотную замену соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие замены в последовательности обозначают в настоящем описании в совокупности как генеративные мутации). Специалист в данной области, начиная с последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, раскрытых в настоящем описании, может легко получать множество антител и антигенсвязывающих фрагментов, которые содержат одну или несколько индивидуальных генеративных мутаций или их сочетания. В определенных вариантах осуществления все остатки каркаса и/или CDR в доменах VH и/или VL мутируют обратно в остатки, встречающиеся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой антитело получено. В других вариантах осуществления только определенные остатки мутируют обратно в исходную последовательность зародышевой линии, например, только мутированные остатки, встречающиеся в пределах первых 8 аминокислот в FR1 или в пределах последних 8 аминокислот в FR4, или только мутированные остатки, встречающиеся в пределах CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или несколько остатков каркаса и/или CDR мутируют в соответствующие остатки другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой антитело исходно получено). Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию двух или больше генеративных мутаций в каркасных и/или CDR областях, например, где определенные индивидуальные остатки мутируют в соответствующий остаток конкретной последовательности зародышевой линии, тогда как определенные другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии, сохраняют или мутируют в соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии. Когда получены антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько генеративных мутаций, можно легко тестировать на одно или несколько желаемых свойств, таких как усовершенствованная специфичность связывания, увеличенная аффинность связывания, усовершенствованные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от случая), сниженная иммуногенность и т.д.The fully human anti-C5 monoclonal antibodies disclosed herein may contain one or more amino acid substitutions, insertions and/or deletions in the heavy and light chain variable domain framework and/or CDR regions compared to the corresponding germline sequences. Such mutations are readily identified by comparing the amino acid sequences disclosed herein with germline sequences available, for example, from public antibody sequence databases. The present invention includes antibodies and antigen-binding fragments thereof, which are derived from any of the amino acid sequences disclosed herein, in which one or more amino acids in one or more framework and/or CDR regions are mutated into the corresponding germline sequence residue(s) from which an antibody is generated, either to the corresponding residue(s) of another human germline sequence, or to a conservative amino acid substitution of the corresponding germline residue(s) (such sequence substitutions are collectively referred to herein as generative mutations). One skilled in the art, starting from the heavy and light chain variable region sequences disclosed herein, can readily generate a variety of antibodies and antigen-binding fragments that contain one or more individual generative mutations, or combinations thereof. In certain embodiments, all framework and/or CDR residues in the V H and/or V L domains are mutated back to residues occurring in the original germline sequence from which the antibody is derived. In other embodiments, only certain residues are mutated back to the original germline sequence, e.g., only mutated residues occurring within the first 8 amino acids in FR1 or within the last 8 amino acids in FR4, or only mutated residues occurring within CDR1, CDR2, or CDR3. In other embodiments, one or more framework and/or CDR residues are mutated to corresponding residues of a different germline sequence (ie, a germline sequence that differs from the germline sequence from which the antibody was originally derived). In addition, the antibodies of the present invention may contain any combination of two or more generative mutations in the framework and/or CDR regions, for example, where certain individual residues mutate into the corresponding residue of a particular germline sequence, while certain other residues that differ from the original sequence germline, retain or mutate into the corresponding residue of another germline sequence. Once antibodies and antigen-binding fragments have been obtained that contain one or more generative mutations, one or more desired properties can be easily tested, such as improved binding specificity, increased binding affinity, improved or enhanced antagonistic or agonistic biological properties (as appropriate), reduced immunogenicity, etc.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, получаемые таким общим путем, включены в настоящее изобретение.Antibodies and antigen-binding fragments obtained in this general way are included in the present invention.
Настоящее изобретение также относится к моноклональным антителам полностью человека против С5, содержащим варианты любых аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем описании, которые имеют одну или несколько консервативных замен. Например, настоящее изобретение включает антитела против С5, имеющие аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или меньше, 8 или меньше, 6 или меньше, 4 или меньше и т.д. консервативными аминокислотными заменами относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем описании.The present invention also provides fully human anti-C5 monoclonal antibodies containing variants of any of the HCVR, LCVR and/or CDR amino acid sequences disclosed herein that have one or more conservative substitutions. For example, the present invention includes anti-C5 antibodies having the amino acid sequences HCVR, LCVR and/or CDR, e.g., 10 or less, 8 or less, 6 or less, 4 or less, etc. conservative amino acid substitutions relative to any of the HCVR, LCVR and/or CDR amino acid sequences disclosed herein.
Термин антитело человека, как используют в настоящем описании, предназначен включать антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов человека эмбрионального типа. mAb человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов человека эмбрионального типа (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или с помощью соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Однако термин антитело человека, как используют в настоящем описании, не предназначен включать mAb, в которых последователь- 11 039858 ности CDR, полученные из зародышевой линии млекопитающих других биологических видов (например, мыши), пересажены в последовательности FR человека. Термин включает антитела, рекомбинантно полученные у не относящегося к человеку млекопитающего или в клетках не относящегося к человеку млекопитающего. Термин не предназначен включать антитела, выделенные у человеческого субъекта или созданные в нем.The term human antibody, as used herein, is intended to include antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. The human mAbs of the invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by in vitro random or site-directed mutagenesis or by in vivo somatic mutation), e.g., in CDRs and, in particular, in CDR3 . However, the term human antibody, as used herein, is not intended to include mAbs in which CDR sequences derived from a mammalian germline of other species (eg, mice) are grafted into human FR sequences. The term includes antibodies recombinantly produced in a non-human mammal or in cells of a non-human mammal. The term is not intended to include antibodies isolated from or generated in a human subject.
Термин рекомбинантный, как используют в настоящем описании, относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам по изобретению, которые создают, экспрессируют, выделяют или получают посредством технологий или известные в данной области способов, как технология рекомбинантных ДНК, которая включает, например, сплайсинг ДНК и трансгенную экспрессию. Термин относится к антителам, экспрессируемым у не относящегося к человеку млекопитающего (в том числе трансгенные не относящиеся к человеку млекопитающие, например трансгенные мыши) или в клеточной экспрессирующей системе (например, клетках СНО) или выделенным из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител человека.The term recombinant, as used herein, refers to antibodies or antigen-binding fragments thereof of the invention that are made, expressed, isolated, or produced by technologies or methods known in the art, such as recombinant DNA technology, which includes, for example, DNA splicing and transgenic expression. The term refers to antibodies expressed in a non-human mammal (including transgenic non-human mammals, e.g., transgenic mice) or in a cellular expression system (e.g., CHO cells) or isolated from a combinatorial library of recombinant human antibodies.
Термин специфически связывает или специфически связывается с или тому подобное обозначает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который относительно стабилен при физиологических условиях. Специфическое связывание можно охарактеризовать равновесной константой диссоциации по меньшей мере приблизительно 1х10-8 М или меньше (например, более низкая KD обозначает более прочное связывание). Способы определения того, специфически ли связываются две молекулы, хорошо известны в данной области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п. Как раскрыто в настоящем описании, с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™, идентифицированы антитела, которые связываются специфически с С5. Кроме того, полиспецифические антитела, которые связываются с одним доменом в С5 и одним или несколькими дополнительными антигенами, или биспецифические, которые связываются с двумя различными областями в С5, тем не менее, представляют собой рассматриваемые антитела, которые специфически связываются, как используют в настоящем описании.The term specifically binds or specifically binds to or the like means that an antibody, or antigen-binding fragment thereof, forms a complex with an antigen that is relatively stable under physiological conditions. Specific binding can be characterized by an equilibrium dissociation constant of at least about 1 x 10 -8 M or less (eg, lower K D means stronger binding). Methods for determining whether two molecules specifically bind are well known in the art and include, for example, equilibrium dialysis, surface plasmon resonance, and the like. As disclosed herein, using surface plasmon resonance, for example BIACORE™, antibodies have been identified that bind specifically to C5. In addition, polyspecific antibodies that bind to one domain at C5 and one or more additional antigens, or bispecific antibodies that bind to two different regions at C5, are nonetheless considered antibodies that specifically bind as used herein. .
Термин высокоаффинное антитело относится к тем mAb, которые обладают аффинностью связывания с С5, выражаемой в виде KD, по меньшей мере 10-8 М; предпочтительно 10-9 М; более предпочтительно 10-10 М, даже более предпочтительно 10-11 М, даже более предпочтительно 10-12 М, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™ или ELISA аффинности в растворе.The term high affinity antibody refers to those mAbs that have a C5 binding affinity, expressed as a KD, of at least 10 -8 M; preferably 10 -9 M; more preferably 10 -10 M, even more preferably 10 -11 M, even more preferably 10 -12 M, as measured by surface plasmon resonance, for example BIACORE™ or ELISA affinity in solution.
Под термином низкая скорость диссоциации, Koff или kd понимают, что антитело диссоциирует с С5 с константой скорости 1х10-3 с-1 или меньше, предпочтительно 1х10’4 с-1 или меньше, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™.By the term low dissociation rate, K off or kd is meant that the antibody dissociates from C5 with a rate constant of 1 x 10 -3 s -1 or less, preferably 1 x 10' 4 s -1 or less, as determined by surface plasmon resonance, for example BIACORE™.
Термины антигенсвязывающая часть антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и т.п., как используют в настоящем описании, включают любые встречаемые в природе, получаемые ферментативно, синтетические или генетически сконструированные полипептиды или гликопротеины, которые специфически связывают антиген для того, чтобы формировать комплекс. Термины антигенсвязывающий фрагмент антитела или фрагмент антитела, как используют в настоящем описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность связываться с белком С5.The terms antigen-binding portion of an antibody, antigen-binding fragment of an antibody, and the like, as used herein, include any naturally occurring, enzymatically produced, synthetic, or genetically engineered polypeptides or glycoproteins that specifically bind an antigen in order to form a complex. The terms antigen-binding antibody fragment or antibody fragment, as used herein, refers to one or more antibody fragments that retain the ability to bind to the C5 protein.
В конкретных вариантах осуществления, антитело или фрагменты антител по изобретению можно конъюгировать с фрагментом, таким как лиганд или терапевтический фрагмент (иммуноконъюгат), второе антитело против С5 или любой другой терапевтический фрагмент, который можно использовать для лечения С5-ассоциированного заболевания или нарушения.In specific embodiments, an antibody or antibody fragments of the invention can be conjugated to a fragment such as a ligand or therapeutic fragment (immunoconjugate), a second anti-C5 antibody, or any other therapeutic fragment that can be used to treat a C5 associated disease or disorder.
Выделенное антитело, как используют в настоящем описании, предназначено для обозначения антитела, которое по существу не содержит другие антитела (Ab), обладающие другими антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфически связывает С5, или его фрагмент по существу не содержит Ab, которые специфически связывают антигены, отличные от С5.An isolated antibody, as used herein, is intended to mean an antibody that is substantially free of other antibodies (Abs) having different antigenic specificities (e.g., an isolated antibody that specifically binds C5, or a fragment thereof, is substantially free of Abs that specifically bind antigens other than C5.
Блокирующее антитело или нейтрализующее антитело, как используют в настоящем описании (или антитело, которое нейтрализует активность С5, или антагонистическое антитело), предназначено для обозначения антитела, у которого связывание с С5 ведет к ингибированию по меньшей мере одной биологической активности С5. Например, антитело по изобретению может предотвращать или блокировать комплемент-опосредованный гемолиз по классическому пути или альтернативному пути.A blocking antibody or neutralizing antibody as used herein (or an antibody that neutralizes C5 activity or an antagonist antibody) is intended to mean an antibody in which binding to C5 leads to inhibition of at least one C5 biological activity. For example, an antibody of the invention may prevent or block complement-mediated hemolysis via the classical pathway or an alternative pathway.
Термин поверхностный плазмонный резонанс, как используют в настоящем описании, относится к оптическому феномену, который делает возможным анализ биомолекулярных взаимодействий в реальном времени посредством обнаружения изменений в концентрациях белков на матрице биосенсора, например, с использованием системы BIACORE™ (Pharmacia Biosensor АВ, Uppsala, Sweden и Piscataway, N.J.).The term surface plasmon resonance, as used herein, refers to an optical phenomenon that makes it possible to analyze biomolecular interactions in real time by detecting changes in protein concentrations on a biosensor array, for example, using the BIACORE™ system (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).
Термин KD, как используют в настоящем описании, предназначен для обозначения равновесной константы диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.The term K D , as used herein, is intended to mean the equilibrium dissociation constant of a particular antibody-antigen interaction.
Термин эпитоп относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует с конкретным антигенсвязывающим участком в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп. ОдинThe term epitope refers to an antigenic determinant that interacts with a particular antigen-binding site in the variable region of an antibody molecule, known as a paratope. One
- 12 039858 антиген может иметь больше чем один эпитоп. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными участками на антигене и могут иметь различные биологические эффекты. Термин эпитоп также относится к месту на антигене, на который отвечают В- и/или Т-клетки. Также он относится к области антигена, которую связывает антитело. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы в целом представляют собой подмножество структурных эпитопов и имеют те остатки, которые осуществляют непосредственный вклад в аффинность взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными, то есть состоять из нелинейных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления могут иметь конкретные характеристики трехмерной структурны и/или конкретные зарядовые характеристики.- 12 039858 an antigen may have more than one epitope. Thus, different antibodies may bind to different sites on the antigen and may have different biological effects. The term epitope also refers to a location on an antigen to which B and/or T cells respond. It also refers to the region of an antigen that an antibody binds. Epitopes can be defined as structural or functional. Functional epitopes are generally a subset of structural epitopes and have those residues that directly contribute to the affinity of the interaction. Epitopes can also be conformational, that is, composed of non-linear amino acids. In certain embodiments, epitopes may include determinants that are reactive surface groupings of molecules, such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl groups, or sulfonyl groups, and in certain embodiments, may have specific three-dimensional structural and/or specific charge characteristics.
Термин перекрестно конкурирует, как используют в настоящем описании, обозначает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с антигеном и ингибирует или блокирует связывание другого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Термин также включает конкуренцию между двумя антителами в обеих ориентациях, т.е. первое антитело, которое связывает и блокирует связывание второго антитела, и наоборот. В определенных вариантах осуществления первое антитело и второе антитело могут связываться с одним и тем же эпитопом. Альтернативно, первое и второе антитела могут связываться с различными, но перекрывающимися эпитопами так, что связывание одного ингибирует или блокирует связывание второго антитела, например, через стерическое затруднение. Перекрестную конкуренцию между антителами можно измерять известными в данной области способами, например посредством анализа интерферометрии биослоев без меток в реальном времени. Перекрестная конкуренция между двумя антителами может выражаться в связывании второго антитела, которое меньше, чем фоновый сигнал, из-за связывания с самим собой (где первое и второе антитела представляют собой одно и то же антитело). Перекрестную конкуренцию между двумя антителами можно выражать, например, в виде % связывания второго антитела, который меньше базового уровня фонового связывания с самим собой (где первое и второе антитела представляют собой одно и то же антитело).The term cross-compete, as used herein, means that an antibody or antigen-binding fragment thereof binds to an antigen and inhibits or blocks the binding of another antibody or antigen-binding fragment thereof. The term also includes competition between two antibodies in both orientations, ie. the first antibody that binds and blocks the binding of the second antibody, and vice versa. In certain embodiments, the first antibody and the second antibody can bind to the same epitope. Alternatively, the first and second antibodies may bind to different but overlapping epitopes such that binding of one inhibits or blocks binding of the second antibody, eg, through steric hindrance. Cross-competition between antibodies can be measured by methods known in the art, for example by real-time analysis of unlabeled biolayer interferometry. Cross-competition between two antibodies can be expressed in the binding of the second antibody, which is less than the background signal due to binding to itself (where the first and second antibodies are the same antibody). Cross-competition between two antibodies can be expressed, for example, as % binding of the second antibody, which is less than the base level of background binding to itself (where the first and second antibodies are the same antibody).
Термин существенная идентичность или по существу идентичный в отношении нуклеиновой кислоты или ее фрагмента, указывает на то, что при оптимальном выравнивании с подходящими нуклеотидными инсерциями или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной нитью) имеет место идентичность нуклеотидных последовательностей по меньшей мере приблизительно в 90% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95, 96, 97, 98 или 99% нуклеотидных оснований, как измеряют с помощью любого общеизвестного алгоритма для идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или GAP, как рассмотрено далее. Молекула нуклеиновой кислоты, обладающая существенной идентичностью с эталонной молекулой нуклеиновой кислоты, может в определенных случаях кодировать полипептид, которые имеет такую же или по существу схожую аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый эталонной молекулой нуклеиновой кислоты.The term substantial identity, or substantially identical with respect to a nucleic acid or fragment thereof, indicates that, when optimally aligned with suitable nucleotide insertions or deletions with another nucleic acid (or its complementary strand), there is a nucleotide sequence identity of at least about 90 % and more preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% nucleotide bases, as measured by any commonly known algorithm for sequence identity such as FASTA, BLAST, or GAP, as discussed below. A nucleic acid molecule that has substantial identity with a reference nucleic acid molecule may, in certain instances, encode a polypeptide that has the same or substantially similar amino acid sequence as the polypeptide encoded by the reference nucleic acid molecule.
В применении к полипептидам термин существенное сходство или по существу схожий обозначает, что две пептидные последовательности, когда выровнены оптимально, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием весов пропусков по умолчанию, обладают по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей, даже более предпочтительно по меньшей мере 95, 98 или 99% идентичностью последовательностей. Предпочтительно положения остатков, которые не идентичны, различаются консервативными аминокислотными заменами.When applied to polypeptides, the term significant similarity or substantially similar means that two peptide sequences, when aligned optimally, for example, using the GAP or BESTFIT programs using the default gap weights, have at least 90% sequence identity, even more preferably at least 95, 98 or 99% sequence identity. Preferably, positions of residues that are not identical are distinguished by conservative amino acid substitutions.
Консервативная аминокислотная замена представляет собой ту, в которой аминокислотный остаток заменяют на другой аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь (группу R) со схожими химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В целом, консервативная аминокислотная замена по существу не меняет функциональные свойства белка. В случаях, когда две или больше аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процент или степень сходства можно корректировать в большую сторону для того, чтобы вносить поправки на консервативную природу замены. Средства внесения таких поправок хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Pearson (1994), Methods Mol. Biol. 24:307-331, которая включена в настоящее описание посредством ссылки. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со схожими химическими свойствами, включают:A conservative amino acid substitution is one in which an amino acid residue is replaced with another amino acid residue having a side chain (R group) with similar chemical properties (eg, charge or hydrophobicity). In general, a conservative amino acid substitution does not substantially change the functional properties of a protein. In cases where two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the percent or degree of similarity may be adjusted upwards to allow for the conservative nature of the substitution. The means of making such adjustments are well known to those skilled in the art. See, for example, Pearson (1994), Methods Mol. Biol. 24:307-331, which is incorporated herein by reference. Examples of groups of amino acids that have side chains with similar chemical properties include:
1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин;1) aliphatic side chains: glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine;
2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серин и треонин;2) aliphatic hydroxyl side chains: serine and threonine;
3) амид-содержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин;3) amide-containing side chains: asparagine and glutamine;
4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан;4) aromatic side chains: phenylalanine, tyrosine and tryptophan;
5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин;5) main side chains: lysine, arginine and histidine;
6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат и6) acidic side chains: aspartate and glutamate and
7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин.7) sulfur-containing side chains: cysteine and methionine.
Предпочтительные группы консервативных аминокислотных замен представляют собой валинлейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин- 13 039858 глутамин. Альтернативно, консервативная замена представляет собой любое изменение, которое имеет положительное значение в логарифмической вероятностной матрице РАМ250, раскрытой в Gonnet et al.Preferred groups of conservative amino acid substitutions are valineleucine-isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, glutamate-aspartate, and asparagine-glutamine. Alternatively, a conservative substitution is any change that has a positive value in the PAM250 log probability matrix disclosed in Gonnet et al.
(1992), Science 256:1443 45, включенной в настоящее описание посредством ссылки. Умеренно консервативная замена представляет собой любую замену, которая имеет неотрицательное значение в логарифмической вероятностной матрице РАМ250.(1992), Science 256:1443 45, incorporated herein by reference. A moderately conservative substitution is any substitution that has a non-negative value in the PAM250 log probability matrix.
Сходство последовательностей для полипептидов обычно измеряют с использованием программного обеспечения анализа последовательностей. Программное обеспечение анализа белков сопоставляет схожие последовательности с использованием мер сходства, присваиваемых различным заменам, делециям и другим модификациям, в том числе консервативным аминокислотным заменам. Например, программное обеспечение GCG содержит программы, такие как GAP и BESTFIT, которые можно использовать с параметрами по умолчанию для того, чтобы определять гомологию последовательностей или идентичность последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды, от различных видов организмов или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с использованием FASTA с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами; программа в GCG версии 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) предоставляет выравнивания и процент идентичности последовательностей областей с наилучшим перекрытием между запрашиваемыми и искомыми последовательностями (Pearson (2000), выше). Другой предпочтительный алгоритм для сравнения последовательности по изобретению с базой данных, содержащей большое число последовательностей от различных организмов, реализован в компьютерной программе BLAST, в частности BLASTP или TBLASTN, с использованием параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 и (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки.Sequence similarity for polypeptides is typically measured using sequence analysis software. Protein analysis software matches similar sequences using similarity measures assigned to various substitutions, deletions, and other modifications, including conservative amino acid substitutions. For example, the GCG software contains programs such as GAP and BESTFIT that can be used with default parameters to determine sequence homology or sequence identity between closely related polypeptides, such as homologous polypeptides, from different species, or between a wild-type protein and his mutein. See, for example, GCG version 6.1. Polypeptide sequences can also be compared using FASTA with default or recommended parameters; program in GCG version 6.1. FASTA (eg, FASTA2 and FASTA3) provides alignments and percent sequence identity for regions with the best overlap between query and search sequences (Pearson (2000), supra). Another preferred algorithm for comparing a sequence of the invention with a database containing a large number of sequences from different organisms is implemented in the BLAST computer program, in particular BLASTP or TBLASTN, using default parameters. See, for example, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 and (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, each of which is incorporated herein by reference.
Под фразой терапевтически эффективное количество понимают количество, которое вызывает желаемый эффект, ради которого его вводят. Точное количество зависит от цели лечения, и его определит специалист в данной области с использованием известных способов (см., например, Lloyd (1999), The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).By the phrase "therapeutically effective amount" is meant an amount that produces the desired effect for which it is administered. The exact amount depends on the purpose of the treatment and will be determined by those skilled in the art using known methods (see, for example, Lloyd (1999), The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Как используют в настоящем описании, термин субъект относится к животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно к человеку, нуждающемуся в улучшении, предотвращении и/или лечении С5-ассоциированного заболевания или нарушения, такого как атипичный гемолитикоуремический синдром (aHUS) или пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH). Термин включает человеческие субъекты, которые обладают таким заболеванием или нарушением или имеют риск его наличия.As used herein, the term subject refers to an animal, preferably a mammal, more preferably a human, in need of amelioration, prevention, and/or treatment of a C5-associated disease or disorder, such as atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) or paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH). ). The term includes human subjects who have or are at risk of having such a disease or disorder.
Как используют в настоящем описании, термины лечить, лечащий или лечение относятся к снижению или улучшению тяжести по меньшей мере одного симптома или показания С5-ассоциированного заболевания или нарушения благодаря введению терапевтического средства, такого как антитело по настоящему изобретению, нуждающемуся в этом субъекту. Термины включают ингибирование прогрессирования заболевания или ухудшения симптома/показания. Термины также включают положительный прогноз заболевания, т.е. субъекта можно освобождать от заболевания или он может иметь уменьшенное заболевание при введении терапевтического средства, такого как антитело по настоящему изобретению. Терапевтическое средство можно вводить субъекту в терапевтической дозе.As used herein, the terms treat, treating, or treating refer to reducing or improving the severity of at least one symptom or indication of a C5-associated disease or disorder by administering a therapeutic agent, such as an antibody of the present invention, to a subject in need thereof. The terms include inhibition of disease progression or worsening of a symptom/indication. The terms also include a positive prognosis of the disease, ie. the subject may be freed from disease or may have reduced disease upon administration of a therapeutic agent, such as an antibody of the present invention. The therapeutic agent may be administered to a subject at a therapeutic dose.
Термины предотвращать, предотвращающий или предотвращение относятся к ингибированию манифестации С5-ассоциированного заболевания или нарушения или любых симптомов или показаний такого заболевания или нарушения при введении антитела по настоящему изобретению.The terms prevent, preventing, or prevention refer to the inhibition of the manifestation of a C5-associated disease or disorder, or any symptoms or indications of such a disease or disorder, upon administration of an antibody of the present invention.
Антигенсвязывающие фрагменты антител.Antigen-binding fragments of antibodies.
Если конкретно не указано иное, термин антитело, как используют в настоящем описании, следует понимать как охватывающий молекулы антител, содержащие две тяжелые цепи иммуноглобулинов и две легкие цепи иммуноглобулинов (т.е. полные молекулы антител), а также их антигенсвязывающие фрагменты. Термины антигенсвязывающая часть антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и т.п., как используют в настоящем описании, включают любой встречаемый в природе, получаемый ферментативно, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, который специфически связывает антиген, чтобы формировать комплекс. Термины антигенсвязывающий фрагмент антитела или фрагмент антитела, как используют в настоящем описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с белком С5. Фрагмент антитела содержат фрагмент Fab, фрагмент F(ab')2, фрагмент Fv, фрагмент dAb, фрагмент, содержащий CDR, или выделенную CDR. В определенных вариантах осуществления термин антигенсвязывающий фрагмент относится к полипептидному фрагменту полиспецифической антигенсвязывающей молекулы.Unless specifically stated otherwise, the term antibody, as used herein, should be understood to encompass antibody molecules containing two immunoglobulin heavy chains and two immunoglobulin light chains (i.e., complete antibody molecules), as well as antigen-binding fragments thereof. The terms antigen-binding portion of an antibody, antigen-binding fragment of an antibody, and the like, as used herein, include any naturally occurring, enzymatically produced, synthetic, or genetically engineered polypeptide or glycoprotein that specifically binds an antigen to form a complex. The terms antigen-binding antibody fragment or antibody fragment, as used herein, refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind to the C5 protein. An antibody fragment contains a Fab fragment, an F(ab')2 fragment, an Fv fragment, a dAb fragment, a fragment containing a CDR, or an isolated CDR. In certain embodiments, the term antigen-binding fragment refers to a polypeptide fragment of a polyspecific antigen-binding molecule.
Антигенсвязывающие фрагменты антитела можно извлекать, например, из полных молекул антител с использованием любых подходящих стандартных способов, таких как протеолитическое расщепление или рекомбинантные способы генетической инженерии с использованием манипуляций и экспрессии ДНК, которая кодирует вариабельные и (необязательно) константные домены антитела. Такая ДНК из- 14 039858 вестна и/или легко доступна, например, в коммерческих источниках, библиотеках ДНК (включая, например, фаговые библиотеки антител) или ее можно синтезировать. ДНК можно секвенировать и манипулировать ею химически или с использованием способов молекулярной биологии, например, чтобы располагать один или несколько вариабельных и/или константных доменов в подходящей конфигурации или вводить кодоны, создавать остатки цистеина, модифицировать, добавлять или удалять аминокислоты и т.д.Antigen-binding fragments of an antibody can be extracted, for example, from whole antibody molecules using any suitable standard methods such as proteolytic cleavage or recombinant genetic engineering techniques using the manipulation and expression of DNA that encodes the variable and (optionally) constant domains of an antibody. Such DNA is known and/or readily available from, for example, commercial sources, DNA libraries (including, for example, antibody phage libraries), or can be synthesized. DNA can be sequenced and manipulated chemically or using molecular biology techniques, for example, to arrange one or more variable and/or constant domains in an appropriate configuration or introduce codons, create cysteine residues, modify, add or remove amino acids, etc.
Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают:Non-limiting examples of antigen-binding fragments include:
(i) фрагменты Fab;(i) Fab fragments;
(ii) фрагменты F(ab')2;(ii) F(ab')2 fragments;
(iii) фрагменты Fd;(iii) Fd fragments;
(iv) фрагменты Fv;(iv) Fv fragments;
(v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv);(v) single chain Fv molecules (scFv);
(vi) фрагменты dAb и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенную определяющую комплементарность область (CDR), такую как пептид CDR3) или ограниченный пептид FR3-CDR3-FR4.(vi) dAb fragments; and (vii) minimal recognition units consisting of amino acid residues that mimic an antibody hypervariable region (e.g., an isolated complementarity determining region (CDR) such as a CDR3 peptide) or a restricted FR3-CDR3-FR4 peptide.
Другие сконструированные молекулы, такие как домен-специфические антитела, однодоменные антитела, антитела с удаленными доменами, химерные антитела, антитела с пересаженными CDR, диатела, триатела, тетратела, мини-антитела, нанотела (например, одновалентные нанотела, двухвалентные нанотела и т.д.), небольшие модульные иммунофармацевтические средства (SMIP) и вариабельные домены акулы IgNAR, также охвачены выражением антигенсвязывающий фрагмент, как используют в настоящем описании.Other engineered molecules such as domain specific antibodies, single domain antibodies, domain deleted antibodies, chimeric antibodies, CDR grafted antibodies, diabodies, tribodies, tetrabodies, minibodies, nanobodies (e.g., monovalent nanobodies, divalent nanobodies, etc.) .), small modular immunopharmaceuticals (SMIPs), and shark IgNAR variable domains are also encompassed by the term antigen binding fragment as used herein.
Антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно содержит по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может быть любого размера или аминокислотного состава и в целом содержит по меньшей мере одну CDR, которая находится смежно с или в рамке с одной или несколькими каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен VH, связанный с доменом VL, домены VH и VL можно располагать друг относительно друга в любом подходящем расположении. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры VH-VH, VH-VL или VL-VL. Альтернативно, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен VH или VL.An antigen binding fragment of an antibody typically contains at least one variable domain. The variable domain can be of any size or amino acid composition and generally contains at least one CDR that is adjacent to or in frame with one or more framework sequences. In antigen-binding fragments having a VH domain associated with a VL domain, the VH and VL domains can be positioned relative to each other in any suitable arrangement. For example, the variable region may be dimeric and contain V H -V H , V H -V L or V L -V L dimers. Alternatively, the antigen-binding fragment of an antibody may comprise a VH or VL monomeric domain.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный по меньшей мере с одним константным доменом. Неограничивающие образцовые конфигурации вариабельных и константных доменов, которые можно найти в антигенсвязывающем фрагменте антитела по настоящему изобретению, включают:In certain embodiments, an antigen-binding fragment of an antibody may comprise at least one variable domain covalently linked to at least one constant domain. Non-limiting exemplary variable and constant domain configurations that can be found in an antigen-binding fragment of an antibody of the present invention include:
(i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv)(i) V H -C H 1; (ii) V H -C H 2; (iii) V H -C H 3; (iv)
VH-CH1-CH2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii)V H -C H 1 -C H 2; (v) V h -Ch1-C h 2-C h 3; (vi) V H -C H 2 -C H 3; (vii) V H -C L ; (viii)
VL-CH1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; и (xiv) VL-CL.V L -CH 1; (ix) V l -C h 2; (x) V l -C h 3; (xi) V L -C H 1 -C H 2; (xii) V L -C H 1 -C H 2C H 3; (xiii) V L -C H 2 -C H 3; and (xiv) V L -C L .
В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, в том числе любых образцовых конфигурациях, перечисленных выше, вариабельные и константные домены можно или непосредственно связывать друг с другом, или связывать с помощью полной или частичной шарнирной или линкерной области. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или больше) аминокислот, что ведет к гибкой или полугибкой связи между смежными вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) из любых конфигураций вариабельных и константных доменов, перечисленных выше, в нековалентной связи друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами VH или VL (например, с помощью дисульфидной связи(ей)).In any configuration of the variable and constant domains, including any of the exemplary configurations listed above, the variable and constant domains can either be linked directly to each other, or linked via a complete or partial hinge or linker region. The hinge region may be at least 2 (eg, 5, 10, 15, 20, 40, 60 or more) amino acids, resulting in a flexible or semi-flexible bond between adjacent variable and/or constant domains in a single polypeptide molecule. In addition, the antigen-binding fragment of an antibody of the present invention may comprise a homodimer or heterodimer (or other multimer) of any of the variable and constant domain configurations listed above in non-covalent association with each other and/or with one or more V H or V L monomeric domains. (for example, via disulfide bond(s)).
Как и в случае полных молекул антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или полиспецифическими (например, биспецифическими).As with full antibody molecules, antigen binding fragments can be monospecific or polyspecific (eg, bispecific).
Полиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно содержит по меньшей мере два различных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен специфически связываться с отдельным антигеном или с отличающимся эпитопом на одном и том же антигене. Полиспецифическое антитело в любом формате, в том числе образцовые биспецифические форматы антител, раскрытые в настоящем описании, можно адаптировать для использования в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению с использованием стандартных способов, доступных в данной области.A polyspecific antigen-binding fragment of an antibody typically contains at least two distinct variable domains, where each variable domain is capable of specifically binding to a different antigen or to a different epitope on the same antigen. A polyspecific antibody in any format, including the exemplary bispecific antibody formats disclosed herein, can be adapted for use in the context of an antigen-binding fragment of an antibody of the present invention using standard techniques available in the art.
Получение антител человека.Obtaining human antibodies.
Способы создания антител человека у трансгенных мышей известны в данной области. Любые такие известные способы можно использовать в контексте настоящего изобретения для того, чтобы полуMethods for generating human antibodies in transgenic mice are known in the art. Any such known methods can be used in the context of the present invention in order to
- 15 039858 чать антитела человека, которые специфически связываются с белком С5.- 15 039858 part of a human antibody that specifically binds to the C5 protein.
Иммуноген, содержащий любое одно из следующего, можно использовать для того, чтобы создавать антитела к белку С5. В определенных вариантах осуществления антитела по изобретению получают от мышей, иммунизированных полноразмерным нативным белком С5 (см., например, номер доступа Genbank NP_001726.2) (SEQ ID NO: 355) или ДНК, кодирующей белок или его фрагмент. Альтернативно, белок или его фрагмент можно получать с использованием стандартных биохимических способов и модифицировать и использовать в качестве иммуногена. В определенных вариантах осуществления иммуноген представляет собой фрагмент белка С5, который находится в пределах аминокислотных остатков 19-1676 в SEQ ID NO: 355.An immunogen containing any one of the following can be used to generate antibodies to the C5 protein. In certain embodiments, antibodies of the invention are obtained from mice immunized with full-length native C5 protein (see, for example, Genbank accession number NP_001726.2) (SEQ ID NO: 355) or DNA encoding the protein or fragment thereof. Alternatively, the protein or fragment thereof can be prepared using standard biochemical methods and modified and used as an immunogen. In certain embodiments, the immunogen is a C5 protein fragment that is within amino acid residues 19-1676 of SEQ ID NO: 355.
В некоторых вариантах осуществления иммуноген может представлять собой рекомбинантный белок С5 или его фрагмент, который экспрессируют в Е. coli или любых других эукариотических клетках или клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка (СНО).In some embodiments, the immunogen may be a recombinant C5 protein or fragment thereof that is expressed in E. coli or any other eukaryotic or mammalian cell, such as Chinese hamster ovary (CHO) cells.
Используя технологию VELOCIMMUNE® (см., например, US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) или любой другой известный способ создания моноклональных антител, изначально выделяют высокоаффинные химерные антитела к С5, имеющие вариабельную область человека и константную область мыши. Технология VELOCIMMUNE® включает создание трансгенной мыши, имеющей геном, который содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей человека, функционально связанные с эндогенными локусами константных областей мыши так, что мышь продуцирует антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши, в ответ на антигенную стимуляцию. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелых и легких цепей антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные области тяжелых и легких цепей человека. Затем ДНК экспрессируют в клетке, способно экспрессировать антитело полностью человека.Using VELOCIMMUNE® technology (see, for example, US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) or any other known method for creating monoclonal antibodies, high affinity chimeric anti-C5 antibodies having a human variable region and a mouse constant region are initially isolated. The VELOCIMMUNE® technology involves generating a transgenic mouse having a genome that contains human heavy and light chain variable regions operably linked to endogenous mouse constant region loci such that the mouse produces an antibody comprising a human variable region and a mouse constant region in response to antigen challenge . The DNA encoding the heavy and light chain variable regions of the antibody is isolated and operably linked to the DNA encoding the human heavy and light chain constant regions. The DNA is then expressed in a cell capable of expressing the fully human antibody.
В целом, мышь VELOCIMMUNE® стимулируют антигеном, представляющим интерес, и у мышей получают лимфатические клетки (такие как В-клетки), которые экспрессируют антитела. Лимфатические клетки можно сливать с линией миеломных клеток для того, чтобы получать бессмертные гибридомные клеточные линии, и осуществляют скрининг и отбор таких гибридомных клеточных линий для того, чтобы идентифицировать гибридомные клеточные линии, которые продуцируют антитела со специфичностью к антигену, представляющему интерес. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, можно выделять и связывать с желаемыми изотипическими константными областями тяжелой цепи и легкой цепи. Такой белок антитела можно получать в клетке, такой как клетка СНО. Альтернативно, ДНК, кодирующую антигенспецифические химерные антитела или вариабельные домены легких и тяжелых цепей, можно выделять непосредственно из антигенспецифических лимфоцитов.In general, a VELOCIMMUNE® mouse is stimulated with an antigen of interest and lymphatic cells (such as B cells) are obtained from the mice that express antibodies. The lymphatic cells can be fused with a myeloma cell line to obtain immortal hybridoma cell lines, and such hybridoma cell lines are screened and selected to identify hybridoma cell lines that produce antibodies with specificity for the antigen of interest. DNA encoding the heavy chain and light chain variable regions can be isolated and linked to the desired isotypic heavy chain and light chain constant regions. Such an antibody protein can be produced in a cell, such as a CHO cell. Alternatively, DNA encoding antigen-specific chimeric antibodies or light and heavy chain variable domains can be isolated directly from antigen-specific lymphocytes.
Изначально выделяют высокоаффинные химерные антитела, имеющие вариабельную область человека и константную область мыши. Как в экспериментальном разделе далее, определят характеристики антител и отбирают их по желательным характеристикам, в том числе аффинности, избирательности, эпитопу и т.д. Константные области мыши заменяют на желаемую константную область человека для того, чтобы создавать антитело полностью человека по изобретению, например, дикого типа или модифицированное IgG1 или IgG4. Хотя выбранная константная область может варьировать в соответствии с конкретным использованием, характеристики высокоаффинного связывания антигенов и специфичности к мишени присутствуют в вариабельной области.Initially, high-affinity chimeric antibodies are isolated having a human variable region and a mouse constant region. As in the experimental section below, antibodies will be characterized and selected for desired characteristics, including affinity, selectivity, epitope, and so on. The mouse constant regions are replaced with the desired human constant region in order to generate a fully human antibody of the invention, eg wild-type or modified IgG1 or IgG4. Although the constant region chosen may vary according to the particular use, the characteristics of high affinity antigen binding and target specificity are present in the variable region.
Биоэквиваленты.Bioequivalents.
Антитела против С5 и фрагменты антител по настоящему изобретению охватывают белки, имеющие аминокислотные последовательности, которые варьируют относительно таковых у описанных антител, но сохраняют способность к связыванию белка С5. Такие вариантные антитела и фрагменты антител содержат одно или несколько добавлений, делеций или замен аминокислот по сравнению с родительской последовательностью, чтобы проявлять биологическую активность, которая по существу эквивалента таковой у описанных антител. Аналогичным образом, последовательности ДНК, кодирующее антитела, по настоящему изобретению охватывают последовательности, которые содержат одно или несколько добавлений, делеций или замен нуклеотидов по сравнению с раскрытой последовательностью, но которые кодируют антитело или фрагмент антитела, которые по существу являются биоэквивалентами антитела или фрагмента антитела по изобретению.The anti-C5 antibodies and antibody fragments of the present invention encompass proteins having amino acid sequences that vary from those of the described antibodies but retain the ability to bind the C5 protein. Such variant antibodies and antibody fragments contain one or more amino acid additions, deletions, or substitutions relative to the parent sequence to exhibit biological activity that is substantially equivalent to that of the disclosed antibodies. Similarly, DNA sequences encoding antibodies of the present invention encompass sequences that contain one or more additions, deletions, or substitutions of nucleotides compared to the disclosed sequence, but which encode an antibody or antibody fragment that is substantially bioequivalents of the antibody or antibody fragment according to invention.
Два антигенсвязывающих белка или антитела считают биоэквивалентами, если, например, они являются фармацевтическими эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, у которых скорость и степень абсорбции не демонстрируют значимых различий при схожих экспериментальных условиях при введении в одинаковой молярной дозе, или однократной дозе или нескольких дозах. Некоторые антитела следует считать эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они эквивалентны по степени их абсорбции, но не по скорости их абсорбции, и еще можно считать биоэквивалентом, поскольку такие различия в скорости абсорбции являются преднамеренными и отражены на этикетке, не являются важными для достижения эффективных концентраций лекарственного средства в организме, например, при хроническом применении и считаются медицински несущественными для конкретного исследуемого лекарственного продукта.Two antigen-binding proteins or antibodies are considered bioequivalent if, for example, they are pharmaceutical equivalents or pharmaceutical alternatives in which the rate and extent of absorption does not show significant differences under similar experimental conditions when administered at the same molar dose, or a single dose, or multiple doses. Some antibodies should be considered equivalents or pharmaceutical alternatives if they are equivalent in their absorption but not in their absorption rate, and may still be considered bioequivalent because such differences in absorption rates are intentional and labeled, not essential to achieving effective concentrations drug in the body, such as chronic use, and are considered medically irrelevant for the particular investigational medicinal product.
- 16 039858- 16 039858
В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентами, если нет клинически значимых различий в их безопасности, чистоте или активности.In one embodiment, two antigen-binding proteins are bioequivalent unless there are clinically significant differences in their safety, purity, or potency.
В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентами, если пациента можно переключать один или несколько раз между эталонным продуктом и биологическим продуктом без ожидаемого увеличения риска нежелательных эффектов, в том числе клинически значимого изменения иммуногенности или сниженной эффективности, по сравнению с продолжением терапии без такого переключения.In one embodiment, two antigen-binding proteins are bioequivalent if the patient can be switched one or more times between a reference product and a biological product without an expected increase in the risk of adverse effects, including a clinically significant change in immunogenicity or reduced efficacy, compared with continuing therapy without such switching.
В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка представляют собой биоэквиваленты, если оба они действуют по общему механизму или механизмам действия для условия или условий применения, до такой степени, в которой такие механизмы известны.In one embodiment, two antigen-binding proteins are bioequivalent if they both act by a common mechanism or mechanisms of action for the condition or conditions of use, to the extent that such mechanisms are known.
Биоэквивалентность можно демонстрировать способами in vivo и/или in vitro. Меры биоэквивалентности включают, например:Bioequivalence can be demonstrated by in vivo and/or in vitro methods. Bioequivalence measures include, for example:
(а) тест in vivo у человека или других млекопитающих, в котором концентрацию антитела или его метаболитов измеряют в крови, плазме, сыворотке или другой биологической жидкости в качестве функции времени;(a) an in vivo test in humans or other mammals, in which the concentration of an antibody or its metabolites is measured in blood, plasma, serum, or other body fluid as a function of time;
(b) тест in vitro, который обладает корреляцией с данными о биодоступности у человека in vivo и обоснованной предсказательной способностью в их отношении;(b) an in vitro test that is correlated with and reasonably predictive of human in vivo bioavailability data;
(с) тест in vivo у человека или других млекопитающих, в котором подходящий острый фармакологический эффект антитела (или его мишени) измеряют в качестве функции времени; и (d) строго контролируемое клиническое исследование, в котором устанавливают безопасность, эффект или биодоступность или биоэквивалентность антитела.(c) an in vivo test in humans or other mammals, in which the appropriate acute pharmacological effect of the antibody (or its target) is measured as a function of time; and (d) a strictly controlled clinical trial that establishes the safety, effect, or bioavailability or bioequivalence of an antibody.
Биоэквивалентные варианты антител по изобретению можно конструировать, например создавая различные замены остатков или последовательностей или удаляя концевые или внутренние остатки или последовательности, не необходимые для биологической активности. Например, остатки цистеина, которые не важны для биологической активности, можно удалять или заменять на другие аминокислоты для того, чтобы предотвращать формирование не необходимых или неправильных внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других контекстах биоэквивалентные антитела могут включать варианты антител, которые содержат изменения аминокислот, которые модифицируют характеристики гликозилирования антител, например мутации, которые элиминируют или устраняют гликозилирование.Bioequivalent variants of the antibodies of the invention can be engineered, for example by creating various residue or sequence substitutions, or by deleting terminal or internal residues or sequences not necessary for biological activity. For example, cysteine residues that are not important for biological activity can be removed or replaced with other amino acids in order to prevent the formation of unnecessary or incorrect intramolecular disulfide bridges during renaturation. In other contexts, bioequivalent antibodies may include antibody variants that contain amino acid changes that modify the glycosylation characteristics of the antibodies, such as mutations that eliminate or abolish glycosylation.
Антитела против С5, содержащие варианты Fc.Anti-C5 antibodies containing Fc variants.
В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела против С5, которые содержат домен Fc, содержащий одну или несколько мутаций, которые усиливают или уменьшают связывание антитела с рецептором FcRn, например, при кислом рН по сравнению с нейтральным рН. Например, настоящее изобретение включает антитела против С5, содержащие мутацию в области СН2 или СН3 домена Fc, где мутация(и) увеличивает аффинность домена Fc к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где рН находится в диапазоне приблизительно от 5,5 до приблизительно 6,0). Такие мутации могут вести к увеличению времени полужизни антитела в сыворотке при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например:In accordance with certain embodiments of the present invention, anti-C5 antibodies are provided that contain an Fc domain containing one or more mutations that increase or decrease the binding of the antibody to the FcRn receptor, for example, at acidic pH versus neutral pH. For example, the present invention includes anti-C5 antibodies containing a mutation in the C H 2 or C H 3 region of the Fc domain, wherein the mutation(s) increases the affinity of the Fc domain for FcRn in an acidic environment (e.g., in the endosome, where the pH is in the range of approximately 5.5 to about 6.0). Such mutations can lead to an increase in the serum half-life of the antibody when administered to an animal. Non-limiting examples of such Fc modifications include, for example:
модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K) и/или 434 (например, А, W, H, F или Y [N434A, N434W, N434H, N434F или N434Y]); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434.modification at position 250 (eg, E or Q); 250 and 428 (for example, L or F); 252 (eg L/Y/F/W or T), 254 (eg S or T) and 256 (eg S/R/Q/E/D or T); or a modification at position 428 and/or 433 (e.g. H/L/R/S/P/Q or K) and/or 434 (e.g. A, W, H, F or Y [N434A, N434W, N434H, N434F or N434Y]); or a modification at position 250 and/or 428; or modification at position 307 or 308 (eg 308F, V308F) and 434.
В одном из вариантов осуществления модификация содержит модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S);In one embodiment, the modification comprises modification 428L (eg M428L) and 434S (eg N434S);
модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F);modification 428L, 259I (for example, V259I) and 308F (for example, V308F);
модификацию 433K (например, Н433К) и 434 (например, 434Y);modification 433K (for example, H433K) and 434 (for example, 434Y);
модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т, и 256Е);modification 252, 254 and 256 (for example, 252Y, 254T, and 256E);
модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L) и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р).modification 250Q and 428L (for example, T250Q and M428L); and modification 307 and/or 308 (for example, 308F or 308P).
В еще одном другом варианте осуществления модификация содержит модификацию 265А (например, D265A) и/или 297А (например, N297A).In yet another embodiment, the modification comprises modification 265A (eg, D265A) and/or 297A (eg, N297A).
Например, настоящее изобретение включает антитела против С5, содержащие домен Fc, содержащий одну или несколько пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей из:For example, the present invention includes anti-C5 antibodies containing an Fc domain containing one or more pairs or groups of mutations selected from the group consisting of:
250Q и 248L (например, T250Q и M248L);250Q and 248L (for example, T250Q and M248L);
252Y, 254Т и 256Е (например, M252Y, S254T и Т256Е);252Y, 254T and 256E (eg M252Y, S254T and T256E);
428L и 434S (например, M428L и N434S);428L and 434S (eg M428L and N434S);
257I и 311I (например, P257I и Q311I);257I and 311I (for example, P257I and Q311I);
2571 и 434Н (например, P257I и N434H);2571 and 434H (eg P257I and N434H);
376V и 434Н (например, D376V и N434H);376V and 434H (for example, D376V and N434H);
- 17 039858- 17 039858
307А, 380А и 434А (например, Т307А, Е380А и N434A) и307A, 380A and 434A (for example, T307A, E380A and N434A) and
433K и 434F (например, Н433К и N434F).433K and 434F (for example, H433K and N434F).
Все возможные комбинации мутаций вышеуказанного домена Fc и других мутаций в вариабельных доменах антител, раскрытые в настоящем описании, предусмотрены в объеме настоящего изобретения.All possible combinations of mutations of the above Fc domain and other mutations in the variable domains of antibodies disclosed in the present description are provided within the scope of the present invention.
Настоящее изобретение также относится к антителам против С5, содержащим химерную константную область (Сн) тяжелой цепи, где химерная область Сн содержит сегменты, полученные из областей Сн больше чем одного изотипа иммуноглобулинов. Например, антитела по изобретению могут содержать химерную область Сн, содержащую частичный или полный домен СН2, полученный из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в комбинации с частичным или полным доменом СН3, полученным из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В соответствии с определенными вариантами осуществления антитела по изобретению содержат химерную область Сн, имеющую химерную шарнирную область. Например, химерный шарнир может содержать аминокислотную последовательность верхнего шарнира (аминокислотные остатки из положений с 216 до 227 в соответствии с нумерацией EU), полученную из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в комбинации с последовательностью нижнего шарнира (аминокислотные остатки из положений с 228 до 236 в соответствии с нумерацией EU), полученной из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В соответствии с определенными вариантами осуществления химерная шарнирная область содержит аминокислотные остатки, полученные из верхнего шарнира IgG1 человека или IgG4 человека, и аминокислотные остатки, полученные из нижнего шарнира IgG2 человека. Антитело, содержащее химерную область Сн, как раскрыто в настоящем описании, в определенных вариантах осуществления может проявлять модифицированные эффекторные функции Fc, не оказывая нежелательного влияния на терапевтические или фармакокинетические свойства антитела. (См., например, публикацию патентной заявки США 2014/0243504, раскрытие которой, таким образом, включено посредством ссылки в полном объеме).The present invention also provides anti-C5 antibodies comprising a heavy chain chimeric constant region (C n ), wherein the chimeric C n region contains segments derived from C n regions of more than one immunoglobulin isotype. For example, antibodies of the invention may comprise a C H chimeric region comprising a partial or complete CH 2 domain derived from a human IgG1, human IgG2, or human IgG4 molecule, in combination with a partial or complete CH 3 domain derived from a human IgG1 molecule, human IgG2 or human IgG4. In accordance with certain embodiments, the antibodies of the invention comprise a chimeric CH region having a chimeric hinge region. For example, a chimeric hinge may comprise an upper hinge amino acid sequence (amino acid residues from positions 216 to 227 according to EU numbering) derived from the hinge region of human IgG1, human IgG2, or human IgG4, in combination with a lower hinge sequence (amino acid residues from positions 228 to 236 according to EU numbering) derived from the hinge region of human IgG1, human IgG2 or human IgG4. In certain embodiments, the chimeric hinge region comprises amino acid residues derived from the upper hinge of human IgG1 or human IgG4 and amino acid residues derived from the lower hinge of human IgG2. An antibody containing a C n chimeric region as disclosed herein may, in certain embodiments, exhibit modified Fc effector functions without adversely affecting the therapeutic or pharmacokinetic properties of the antibody. (See, for example, US Patent Application Publication 2014/0243504, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety.)
Биологические характеристики антител.Biological characteristics of antibodies.
В целом, антитела по настоящему изобретению функционируют посредством связывания с белком С5 и предотвращения его расщепления на С5а и С5Ь. Например, настоящее изобретение включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, которые связывают белок С5 (например, при 25 или при 37°С) с KD меньше чем 9 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают С5 с KD приблизительно меньше чем 9 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 2 нМ, приблизительно меньше чем 1 нМ, приблизительно меньше чем 500 пМ, меньше чем 250 пМ или меньше чем 100 пМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.In general, the antibodies of the present invention function by binding to the C5 protein and preventing it from being cleaved into C5a and C5b. For example, the present invention includes antibodies and antigen-binding antibody fragments that bind the C5 protein (e.g., at 25 or 37°C) with a KD of less than 9 nM as measured by surface plasmon resonance, for example, using the assay format as defined in example 3 in the present description. In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, bind C5 with a K D of less than about 9 nM, about less than 5 nM, about less than 2 nM, about less than 1 nM, about less than 500 pM, less than 250 pM, or less than 100 pM as measured by surface plasmon resonance, for example, using the assay format as defined in Example 3 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связывают белок С5 человека с диссоциационным временем полужизни (t1/2) больше чем приблизительно 2 мин, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса при 25°С, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 4 в настоящем описании, или по существу схожего анализа. В определенных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связывают белок С5 с t1/2 больше чем приблизительно 5 мин, больше чем приблизительно 10 мин, больше чем приблизительно 30 мин, больше чем приблизительно 50 мин, больше чем приблизительно 100 мин, больше чем приблизительно 150 мин, больше чем приблизительно 200 мин или больше чем приблизительно 250 мин, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса при 25°С, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании (например, формат с захватом mAb или с захватом антигена), или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind human C5 protein with a dissociative half-life (t 1/2 ) of greater than about 2 minutes, as measured by surface plasmon resonance at 25°C, for example, using the assay format, as defined in Example 4 herein, or a substantially similar analysis. In certain embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments of the present invention bind the C5 protein with a t 1/2 greater than about 5 minutes, greater than about 10 minutes, greater than about 30 minutes, greater than about 50 minutes, greater than about 100 minutes, more greater than about 150 minutes, greater than about 200 minutes, or greater than about 250 minutes, as measured by surface plasmon resonance at 25°C, e.g., using the assay format as defined in Example 3 herein (e.g., mAb capture format or with antigen capture), or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связывают белок С5 человека с диссоциационным временем полужизни (t1/2) больше чем приблизительно 1,5 мин, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса при 37°С, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 4 в настоящем описании, или по существу схожего анализа. В определенных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связывают белок С5 с t1/2 больше чем приблизительно 2 мин, больше чем приблизительно 5 мин, больше чем приблизительно 10 мин, больше чем приблизительно 25 мин, больше чем приблизительно 50 мин, больше чем приблизительно 100 мин, больше чем приблизительно 150 мин или больше чем приблизительно 200 мин, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса при 37°С, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании (например, формат с захватом mAb или с захватом антигена), или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind human C5 protein with a dissociation half-life (t 1/2 ) greater than about 1.5 min, as measured by surface plasmon resonance at 37°C, for example, using the format assay as defined in Example 4 herein, or a substantially similar assay. In certain embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments of the present invention bind the C5 protein with a t 1/2 greater than about 2 minutes, greater than about 5 minutes, greater than about 10 minutes, greater than about 25 minutes, greater than about 50 minutes, more greater than about 100 minutes, greater than about 150 minutes, or greater than about 200 minutes, as measured by surface plasmon resonance at 37°C, e.g., using the assay format as defined in Example 3 herein (e.g., mAb capture format or with antigen capture), or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител,The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments of antibodies,
- 18 039858 которые связывают белок С5 обезьяны (например, при 25°С или при 37°С) с KD меньше чем 120 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают С5 обезьяны с KD приблизительно меньше чем 120 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ, приблизительно меньше чем 25 нМ, приблизительно меньше чем 10 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 1 нМ, приблизительно меньше чем 500 пМ или меньше чем 250 пМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.- 18 039858 which bind monkey C5 protein (for example at 25° C. or at 37° C.) with a K D of less than 120 nM as measured by surface plasmon resonance, for example using the assay format as defined in Example 3 herein description. In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, bind monkey C5 with a K D of less than about 120 nM, about less than 100 nM, about less than 50 nM, about less than 25 nM, about less than 10 nM, about less than 5 nM , less than about 1 nM, less than about 500 pM, or less than 250 pM, as measured by surface plasmon resonance, for example, using the assay format as defined in Example 3 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые связывают модифицированный белок С5 человека с заменой R885H (примером служит SEQ ID NO: 356) с KD меньше чем 70 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании. Варианты С5 показали слабый ответ на антитела против С5, ранее раскрытые в данной области (например, Nishimura et al. 2014, New Engl. J. Med. 370:632-639). В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают модифицированный С5 человека с KD приблизительно меньше чем 65 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ, приблизительно меньше чем 20 нМ, приблизительно меньше чем 10 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 3 нМ или меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding antibody fragments that bind a modified human C5 protein with R885H substitution (an example is SEQ ID NO: 356) with a K D of less than 70 nM, as measured by surface plasmon resonance, for example, using the assay format as defined in Example 3 herein. C5 variants showed a poor response to anti-C5 antibodies previously disclosed in the art (eg, Nishimura et al. 2014, New Engl. J. Med. 370:632-639). In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, bind modified human C5 with a K D of less than about 65 nM, about less than 50 nM, about less than 20 nM, about less than 10 nM, about less than 5 nM, about less than 3 nM or less than 2 nM as measured by surface plasmon resonance, for example using the assay format as defined in Example 3 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые связывают модифицированный белок С5 человека с заменой R885C (примером служит SEQ ID NO: 357) с KD меньше чем 160 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании. Варианты С5 показали слабый ответ на антитела против С5, ранее раскрытые в данной области (например, Nishimura et al. 2014, New Engl. J. Med. 370:632-639). В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают модифицированный С5 человека с KD приблизительно меньше чем 150 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ, приблизительно меньше чем 20 нМ, приблизительно меньше чем 10 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ или меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding antibody fragments that bind a modified human C5 protein with R885C substitution (an example is SEQ ID NO: 357) with a KD of less than 160 nM, as measured by surface plasmon resonance, for example, using the assay format, as defined in Example 3 herein. C5 variants showed a poor response to anti-C5 antibodies previously disclosed in the art (eg, Nishimura et al. 2014, New Engl. J. Med. 370:632-639). In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, bind modified human C5 with a K D of less than about 150 nM, about less than 100 nM, about less than 50 nM, about less than 20 nM, about less than 10 nM, about less than 5 nM or less than 2 nM as measured by surface plasmon resonance, for example using the assay format as defined in Example 3 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые ингибируют комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) с IC50 меньше чем 10 нМ, как измеряют посредством анализа люминесценции, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 6 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты ингибируют CDC с IC50 приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 3,5 нМ или приблизительно меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством анализа люминесценции В-клеток, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 6 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding antibody fragments that inhibit complement dependent cytotoxicity (CDC) with an IC 50 of less than 10 nM as measured by a luminescence assay, e.g. using the assay format as defined in Example 6 herein. In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, inhibit CDC with an IC 50 of less than about 5 nM, about less than 3.5 nM, or about less than 2 nM, as measured by a B cell luminescence assay, e.g., using the assay format, as defined in Example 6 herein, or a substantially similar analysis.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 человека классический путь (СР) гемолиз больше чем на 94% и с IC50 меньше чем 6 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют СР гемолиз с IC50 приблизительно меньше чем 6 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 4 нМ, приблизительно меньше чем 3 нМ или приблизительно меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments that block human C5-mediated classical pathway (CP) hemolysis by greater than 94% and with an IC 50 of less than 6 nM as measured by a hemolysis CP assay, e.g. using an assay format as defined in example 8 in the present description. In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, block CP hemolysis with an IC 50 of less than about 6 nM, about less than 5 nM, about less than 4 nM, about less than 3 nM, or about less than 2 nM, as measured by CP assay. hemolysis, for example, using the assay format as defined in Example 8 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 человека альтернативный путь (АР) гемолиза больше чем на 70% и с IC50 меньше чем 165 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют АР гемолиз с IC50 приблизительно меньше чем 160 нМ, приблизительно меньше чем 150 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ или приблизительно меньше чем 20 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments that block human C5-mediated alternative pathway (AR) hemolysis by greater than 70% and with an IC 50 of less than 165 nM as measured by a hemolysis AR assay, e.g. using an assay format as defined in example 8 in the present description. In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, block AP hemolysis with an IC 50 of less than about 160 nM, about less than 150 nM, about less than 100 nM, about less than 50 nM, or about less than 20 nM, as measured by AP assay. hemolysis, for example, using the assay format as defined in Example 8 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 африканской зеленой мартышки классический путь (СР) гемолиза больше чем на 40% и с IC50 меньше чем 185 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, сThe present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments that block the African green monkey C5 mediated classical pathway (CP) of hemolysis by greater than 40% and with an IC 50 of less than 185 nM as measured by a hemolysis CP assay, e.g.
- 19 039858 использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют СР гемолиз с IC50 приблизительно меньше чем 180 нМ, приблизительно меньше чем 150 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 75 нМ или приблизительно меньше чем 50 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.- 19 039858 using the analysis format as defined in example 8 in the present description. In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, block CP hemolysis with an IC 50 of less than about 180 nM, about less than 150 nM, about less than 100 nM, about less than 75 nM, or about less than 50 nM, as measured by CP assay hemolysis, for example, using the assay format as defined in Example 8 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 африканской зеленой мартышки альтернативный путь (АР) гемолиза с IC50 меньше чем 235 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют АР гемолиз с IC50 приблизительно меньше чем 200 нМ, приблизительно меньше чем 150 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ или приблизительно меньше чем 20 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments that block the African green monkey C5-mediated alternative pathway (AP) of hemolysis with an IC 50 of less than 235 nM as measured by a hemolysis AP assay, e.g. using the assay format as defined in Example 8 in this description. In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, block AP hemolysis with an IC 50 of less than about 200 nM, about less than 150 nM, about less than 100 nM, about less than 50 nM, or about less than 20 nM, as measured by AP assay. hemolysis, for example, using the assay format as defined in Example 8 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют больше чем 90% опосредованного С5 яванского макака классического пути (СР) гемолиза с IC50 меньше чем 145 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют СР гемолиз с IC50 приблизительно меньше чем 140 нМ, приблизительно меньше чем 120 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 75 нМ или приблизительно меньше чем 50 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen binding fragments that block greater than 90% of C5-mediated cynomolgus monkey classical pathway (CP) hemolysis with an IC 50 of less than 145 nM as measured by a hemolysis CP assay, e.g. using the assay format as defined in example 8 in the present description. In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, block CP hemolysis with an IC 50 of less than about 140 nM, about less than 120 nM, about less than 100 nM, about less than 75 nM, or about less than 50 nM, as measured by CP assay. hemolysis, for example, using the assay format as defined in Example 8 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 яванского макака альтернативный путь (АР) гемолиза с IC50 меньше чем 30 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют АР гемолиз с IC50 приблизительно меньше чем 25 нМ, приблизительно меньше чем 20 нМ, приблизительно меньше чем 10 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ или приблизительно меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments that block the cynomolgus monkey C5-mediated alternative pathway (AP) of hemolysis with an IC 50 of less than 30 nM as measured by a hemolysis AP assay, e.g. using the assay format as defined in Example 8 in the present description. In certain embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, block AP hemolysis with an IC 50 of less than about 25 nM, about less than 20 nM, about less than 10 nM, about less than 5 nM, or about less than 2 nM, as measured by AP assay. hemolysis, for example, using the assay format as defined in Example 8 herein, or a substantially similar assay.
Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые демонстрируют усовершенствованные фармакокинетические (PK) и фармакодинамические (PD) свойства по сравнению с антителами против С5 в данной области. Антитела против С5 по настоящему изобретению демонстрируют меньшую подверженность опосредованному мишенью клиренсу при введении, как показано в примерах 9 и 10 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение включает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые демонстрируют концентрации в сыворотке в течение продолжительных периодов, например больше чем 20 суток, больше чем 25 суток, больше чем 30 суток, больше чем 35 суток, больше чем 40 суток, больше чем 45 суток, больше чем 50 суток, больше чем 55 суток или больше чем 60 суток, как описано в примерах 9 и 10 в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления антитела против С5 по настоящему изобретению демонстрируют увеличенное время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток по сравнению с антителами против С5 в данной области.The present invention also relates to antibodies and antigen-binding fragments that exhibit improved pharmacokinetic (PK) and pharmacodynamic (PD) properties compared to anti-C5 antibodies in the art. Anti-C5 antibodies of the present invention show less susceptibility to target-mediated clearance upon administration, as shown in Examples 9 and 10 herein. In certain embodiments, the present invention includes anti-C5 antibodies and antigen-binding fragments thereof that exhibit serum concentrations over extended periods, e.g., greater than 20 days, greater than 25 days, greater than 30 days, greater than 35 days, greater than 40 days. , greater than 45 days, greater than 50 days, greater than 55 days, or greater than 60 days, as described in examples 9 and 10 herein. In certain embodiments, the anti-C5 antibodies of the present invention exhibit an increased serum half-life of greater than 10 days compared to anti-C5 antibodies in the art.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые обладают высокой аффинностью к С5 человека (например, KD меньше чем 0,3 нМ) и более низким клиренсом (например, увеличенное время полужизни в сыворотке, усовершенствованная фармакодинамическая активность в течение большего числа суток, чем ранее известные антитела против С5). Такие антитела по настоящему изобретению можно полезно применять при менее частом дозировании у субъекта с С5-ассоциированным заболеванием или нарушением.In certain embodiments, the present invention provides anti-C5 antibodies and antigen-binding fragments thereof that have high affinity for human C5 (e.g., KD less than 0.3 nM) and lower clearance (e.g., increased serum half-life, improved pharmacodynamic activity in for more days than previously known anti-C5 antibodies). Such antibodies of the present invention can be usefully used at less frequent dosing in a subject with a C5 associated disease or disorder.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком С5, где антитело или его фрагмент проявляют одну или несколько следующих характеристик:In one embodiment, the present invention provides an isolated recombinant antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the C5 protein, wherein the antibody or fragment thereof exhibits one or more of the following characteristics:
(а) представляет собой моноклональное антитело полностью человека;(a) is a fully human monoclonal antibody;
(b) связывается с С5 человека с константой диссоциации (KD) меньше чем 0,9 нМ при 25°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(b) binds to human C5 with a dissociation constant (KD) of less than 0.9 nM at 25° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(с) связывается с С5 человека с KD меньше чем 0,3 нМ при 37°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(c) binds to human C5 with a KD of less than 0.3 nM at 37° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(d) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 70 при введении яванскому(d) has a serum concentration greater than 10 µg/mL up to day 70 when administered to Javanese
- 20 039858 макаку;- 20 039858 macaque;
(е) блокирует СР и АР гемолиз до суток 35 при введении яванскому макаку, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo;(e) blocks SR and AR hemolysis up to day 35 when administered to cynomolgus monkey as measured in an ex vivo hemolysis assay;
(f) имеет время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток у яванского макака;(f) has a serum half-life greater than 10 days in the cynomolgus monkey;
(g) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 40 при введении С5-гуманизированным мышам;(g) has a serum concentration greater than 10 μg/ml up to day 40 when administered to C5 humanized mice;
(h) блокирует СР гемолиз до суток 30 при введении С5-гуманизированным мышам, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo; и (i) имеет время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток у С5-гуманизированных мышей.(h) blocks CP hemolysis up to day 30 when administered to C5 humanized mice as measured in an ex vivo hemolysis assay; and (i) has a serum half-life greater than 10 days in C5 humanized mice.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком С5, где антитело или его фрагмент демонстрируют одну или несколько следующих характеристик:In one embodiment, the present invention provides an isolated recombinant antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the C5 protein, wherein the antibody or fragment thereof exhibits one or more of the following characteristics:
(а) представляет собой моноклональное антитело полностью человека;(a) is a fully human monoclonal antibody;
(b) связывается с С5 человека с константой диссоциации (KD) меньше чем 0,9 нМ при 25°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(b) binds to human C5 with a dissociation constant (K D ) of less than 0.9 nM at 25° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(с) связывается с С5 человека с KD меньше чем 0,3 нМ при 37°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(c) binds to human C5 with a K D of less than 0.3 nM at 37° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(d) связывается с С5 обезьяны с KD меньше чем 65 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(d) binds to monkey C5 with a K D of less than 65 nM as measured in a surface plasmon resonance assay;
(е) связывается с вариантом С5 человека R885H (SEQ ID NO: 356) с KD меньше чем 0,5 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(e) binds to human C5 variant R885H (SEQ ID NO: 356) with a K D of less than 0.5 nM as measured in a surface plasmon resonance assay;
(f) связывается с вариантом С5 человека R885C (SEQ ID NO: 357) с KD меньше чем 0,5 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(f) binds to human C5 variant R885C (SEQ ID NO: 357) with a K D of less than 0.5 nM as measured in a surface plasmon resonance assay;
(g) блокирует опосредованный С5 человека классический путь (СР) гемолиза больше чем на 95% и с IC50 меньше чем 6 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;(g) blocks the human C5-mediated classical pathway (CP) of hemolysis by greater than 95% and with an IC 50 of less than 6 nM as measured in the hemolysis CP assay;
(h) блокирует опосредованный С5 человека альтернативный путь (АР) гемолиза больше чем на 70% и с IC50 меньше чем 165 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза;(h) blocks the human C5 mediated alternative pathway (AR) of hemolysis by more than 70% and with an IC 50 of less than 165 nM as measured by the hemolysis AR assay;
(i) ингибирует опосредованный С5 африканской зеленой мартышки СР гемолиз с IC50 меньше чем 185 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;(i) inhibits African green monkey C5 mediated CP hemolysis with an IC 50 of less than 185 nM as measured in the Hemolysis CP assay;
(j) ингибирует опосредованный С5 африканской зеленой мартышки АР гемолиз с IC50 меньше чем 235 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза;(j) inhibits African green monkey C5-mediated AR hemolysis with an IC 50 of less than 235 nM as measured by the AR hemolysis assay;
(k) ингибирует опосредованный С5 яванского макака СР гемолиз с IC50 меньше чем 145 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза; и (l) ингибирует опосредованный С5 яванского макака АР гемолиз с IC50 меньше чем 30 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза.(k) inhibits cynomolgus C5 mediated CP hemolysis with an IC 50 of less than 145 nM as measured in the CP hemolysis assay; and (l) inhibits cynomolgus C5 mediated AR hemolysis with an IC 50 of less than 30 nM as measured by the AR hemolysis assay.
Антитела по настоящему изобретению могут обладать одной или несколькими из указанных выше биологических характеристик или любыми их сочетаниями. Другие биологические характеристики антител по настоящему изобретению будут видны специалисту в данной области при просмотре настоящего раскрытия, включая рабочие примеры в настоящем описании.The antibodies of the present invention may have one or more of the above biological characteristics, or any combination thereof. Other biological characteristics of the antibodies of the present invention will be apparent to those skilled in the art upon review of the present disclosure, including the working examples in the present specification.
Картирование эпитопов и связанные технологии.Epitope mapping and related technologies.
Настоящее изобретение включает антитела против С5, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, встречающимися в одной или нескольких областях молекулы белка С5, включая а полипептид и β полипептид. Эпитоп, с которым связываются антитела, может состоять из одной непрерывной последовательности из 3 или больше (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше) аминокислот, расположенных в любом из указанных выше доменов молекулы белка С5 (например, линейный эпитоп в домене). Альтернативно, эпитоп может состоять из множества не непрерывных аминокислот (или аминокислотных последовательностей), которые расположены в любом или обоих указанных выше доменах молекулы белка (например, конформационный эпитоп).The present invention includes anti-C5 antibodies that interact with one or more amino acids occurring in one or more regions of the C5 protein molecule, including an a polypeptide and a β polypeptide. The epitope to which antibodies bind may be one contiguous sequence of 3 or more (e.g., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more) amino acids located in any of the above domains of the C5 protein molecule (eg, a linear epitope in the domain). Alternatively, an epitope may consist of a plurality of non-contiguous amino acids (or amino acid sequences) that are located in any or both of the above domains of a protein molecule (eg, a conformational epitope).
Различные способы, известные специалистам в данной области, можно использовать для того, чтобы определять, взаимодействует ли антитело с одной или несколькими аминокислотами в полипептиде или белке. Образцовые способы включают, например, стандартные перекрестные конкурентные анализы, такие как те, что описаны в Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Другие способы включают анализ сканирующего аланином мутагенеза, анализ пептидного блоттинга (Reineke (2004), Methods Mol. Biol. 248:443-63), кристаллографические исследования при пептидном анализе расщепления и ЯМР анализ. Кроме того, можно использовать такие способы, как вырезание эпитопов, извлечение эпитопов и химическая модификация антигенов (Tomer (2000), Prot. Sci. 9:487496). Другой способ, который можно использовать для того, чтобы идентифицировать аминокислоты в полипептиде, с которыми антитело взаимодействует, представляет собой водород-дейтериевый обмен, обнаруживаемый посредством масс-спектрометрии. Вообще говоря, водород-дейтериевый обмен способ включает мечение белка, представляющего интерес, дейтерием, после чего следует связывание антителаVarious methods known to those skilled in the art can be used to determine if an antibody interacts with one or more amino acids in a polypeptide or protein. Exemplary methods include, for example, standard cross-competitive assays such as those described in Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Other methods include alanine-scanning mutagenesis assay, peptide blot assay (Reineke (2004), Methods Mol. Biol. 248:443-63), crystallographic studies in peptide digestion assay, and NMR assay. In addition, methods such as excision of epitopes, extraction of epitopes and chemical modification of antigens can be used (Tomer (2000), Prot. Sci. 9:487496). Another method that can be used to identify amino acids in a polypeptide with which an antibody interacts is hydrogen-deuterium exchange, detected by mass spectrometry. Generally speaking, the hydrogen-deuterium exchange method involves labeling the protein of interest with deuterium, followed by antibody binding.
- 21 039858 с меченным дейтерием белком. Затем комплекс белок/антитело переносят в воду, и подлежащие обмену протоны в аминокислотах, которые защищены антительным комплексом, подвергаются обратному обмену дейтерия на водород с более низкой скоростью, чем подлежащие обмену протоны в аминокислотах, которые не являются частью области контакта. Как результат, аминокислоты, которые образуют часть области контакта белка/антитела, могут сохранять дейтерий и, следовательно, демонстрировать относительно более высокую массу по сравнению с аминокислотами, не включенными в область контакта. После диссоциации антитела целевой белок подвергают протеазному расщеплению и массспектрометрическому анализу, тем самым выявляя меченные дейтерием остатки, которые соответствуют конкретным аминокислотам, с которыми антитело взаимодействует. См., например, Ehring (1999), Analytical Biochemistry, 267:252-259; Engen and Smith (2001), Anal. Chem. 73:256A-265A.- 21 039858 with deuterium labeled protein. The protein/antibody complex is then transferred to water and the protons to be exchanged in amino acids that are protected by the antibody complex are deuterium-to-hydrogen back exchanged at a slower rate than the protons to be exchanged in amino acids that are not part of the interface. As a result, amino acids that form part of the protein/antibody interface may retain deuterium and therefore exhibit a relatively higher mass compared to amino acids not included in the interface. After dissociation of the antibody, the target protein is subjected to protease digestion and mass spectrometric analysis, thereby identifying deuterium labeled residues that correspond to the specific amino acids with which the antibody interacts. See, for example, Ehring (1999), Analytical Biochemistry, 267:252-259; Engen and Smith (2001), Anal. Chem. 73:256A-265A.
Термин эпитоп относится к месту на антигене, на которое отвечают В- и/или Т-клетки. В-клеточные эпитопы можно формировать из непрерывных аминокислот или не непрерывных аминокислот, которые сближены за счет третичной укладки белка. Эпитопы, формируемые из непрерывных аминокислот, обычно сохраняются под воздействием денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образуемые посредством третичной укладки, обычно утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3 и более обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.The term epitope refers to a location on an antigen to which B and/or T cells respond. B-cell epitopes can be formed from continuous amino acids or non-contiguous amino acids that are brought together by tertiary folding of the protein. Epitopes formed from continuous amino acids are usually retained by exposure to denaturing solvents, while epitopes formed by tertiary folding are usually lost upon treatment with denaturing solvents. An epitope usually contains at least 3 and more, usually at least 5 or 8-10 amino acids in a unique spatial conformation.
Профилирование с помощью модификаций (MAP), также известное как профилирование антител на основе структуры антигена (ASAP), представляет собой способ классификации большого числа моноклональных антител (mAb), обнаруживаемых для одного и того же антигена, в соответствии со сходствами профиля связывания каждого антитела с поверхностями химически или ферментативно модифицированных антигенов (см. US 2004/0101920, в настоящем описании конкретно включенную посредством ссылки в полном объеме). Каждая категория может отражать уникальный эпитоп, который или отчетливо отличается от эпитопа, представляемого другой категорией, или частично перекрывается с ним. Эта технология делает возможной быструю фильтрацию генетически идентичных антител так, что определение характеристик можно сосредоточить на генетически различных антителах. Когда применят к скринингу гибридом, MAP может облегчать идентификацию редких клонов гибридом, которые продуцируют mAb, обладающие желаемыми характеристиками. MAP можно использовать для сортировки антител по изобретению по группам антител, связывающих различные эпитопы.Modification-assisted profiling (MAP), also known as antigen structure-based antibody profiling (ASAP), is a method of classifying a large number of monoclonal antibodies (mAbs) found for the same antigen according to the similarities in the binding profile of each antibody to surfaces of chemically or enzymatically modified antigens (see US 2004/0101920, herein specifically incorporated by reference in its entirety). Each category may reflect a unique epitope that is either distinctly different from, or partially overlaps with, the epitope represented by the other category. This technology allows rapid filtering of genetically identical antibodies so that characterization can be focused on genetically different antibodies. When applied to hybridoma screening, MAP can facilitate the identification of rare hybridoma clones that produce mAbs having the desired characteristics. MAP can be used to sort the antibodies of the invention into groups of antibodies that bind different epitopes.
В определенных вариантах осуществления антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты связывают эпитоп в любой одной или нескольких из областей, примеры которых приведены в белке С5, или в естественной форме, как показано на примере в SEQ ID NO: 355, или рекомбинантно полученной, или с его фрагментом. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению связываются с областью, содержащей одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков 19-1676 белка С5 человека.In certain embodiments, anti-C5 antibodies, or antigen-binding fragments thereof, bind an epitope in any one or more of the regions exemplified in the C5 protein, or in natural form as exemplified in SEQ ID NO: 355, or recombinantly produced, or with its fragment. In some embodiments, the antibodies of the invention bind to a region containing one or more amino acids selected from the group consisting of amino acid residues 19-1676 of the human C5 protein.
В определенных вариантах осуществления антитела по изобретению, взаимодействуют с по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных остатков в диапазоне от приблизительно положения 19 приблизительно до положения 750; или аминокислотных остатков в диапазоне от приблизительно положения 751 приблизительно до положения 1676 в SEQ ID NO: 355.In certain embodiments, the antibodies of the invention interact with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid residues ranging from about position 19 to about position 750; or amino acid residues ranging from about position 751 to about position 1676 in SEQ ID NO: 355.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение включает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с одним или несколькими эпитопами, встречающимися в α и/или β цепи С5 (SEQ ID NO: 359). Эпитоп(ы) может состоять из одной или нескольких непрерывных последовательностей из 3 или больше (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше) аминокислот, расположенных в α цепи и/или β цепи С5. Альтернативно, эпитоп может состоять из множества не непрерывных аминокислот (или аминокислотных последовательностей), расположенных в С5. Как показано в примере 11 в настоящем описании, эпитоп С5, с которым взаимодействует образцовое антитело по изобретению Н4Н12166Р, определяют с помощью:In certain embodiments, the present invention includes anti-C5 antibodies and antigen-binding fragments thereof that interact with one or more epitopes occurring in the α and/or β chain of C5 (SEQ ID NO: 359). The epitope(s) may consist of one or more contiguous sequences of 3 or more (e.g., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20 or more) amino acids located in the α chain and/or β chain of C5. Alternatively, an epitope may be composed of a plurality of non-contiguous amino acids (or amino acid sequences) located at C5. As shown in Example 11 herein, the C5 epitope with which the exemplary antibody of the invention H4H12166P interacts is determined by:
(i) аминокислотной последовательности NMATGMDSW (SEQ ID NO: 360), которая соответствует аминокислотам с 591 до 599, содержащимся в β цепи SEQ ID NO: 359; и (ii) аминокислотной последовательности WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361), которая соответствует аминокислотам с 775 до 794, содержащимся в а цепи SEQ ID NO: 359.(i) the amino acid sequence NMATGMDSW (SEQ ID NO: 360) which corresponds to amino acids 591 to 599 contained in the β chain of SEQ ID NO: 359; and (ii) the amino acid sequence WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361) which corresponds to amino acids 775 to 794 contained in a chain of SEQ ID NO: 359.
Соответственно, настоящее изобретение включает антитела против С5, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в области, состоящей из:Accordingly, the present invention includes anti-C5 antibodies that interact with one or more amino acids contained in a region consisting of:
(i) аминокислотной последовательности NMATGMDSW (SEQ ID NO: 360), которая соответствует аминокислотам с 591 до 599 из SEQ ID NO: 359; и (ii) аминокислотной последовательности WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361), которая соответствует аминокислотам с 775 до 794 из SEQ ID NO: 359.(i) the amino acid sequence NMATGMDSW (SEQ ID NO: 360) which corresponds to amino acids 591 to 599 of SEQ ID NO: 359; and (ii) the amino acid sequence WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361) which corresponds to amino acids 775 to 794 of SEQ ID NO: 359.
Настоящее изобретение включает антитела против С5, которые связываются с тем же эпитопом, или частью эпитопа, что и любые из специфических образцовых антител, перечисленных в табл. 1. Аналогичным образом, настоящее изобретение также относится к антителам против С5, которые конкури- 22 039858 руют за связывание с белком С5 или его фрагментом с любым из специфических образцовых антител, перечисленных в табл. 1. Например, настоящее изобретение включает антитела против С5, которые перекрестно конкурируют за связывание с белком С5 с одним или несколькими антителами, перечисленными в табл. 1.The present invention includes C5 antibodies that bind to the same epitope, or part of an epitope, as any of the specific exemplary antibodies listed in Table 1. 1. Similarly, the present invention also provides anti-C5 antibodies that compete for binding to the C5 protein or fragment thereof with any of the specific exemplary antibodies listed in Table 1. 1. For example, the present invention includes anti-C5 antibodies that cross-compete for binding to the C5 protein with one or more of the antibodies listed in Table. one.
Можно легко определять, связывается ли антитело с тем же эпитопом или конкурирует за связывание с эталонным антителом против С5 с использованием стандартных известных в данной области способов. Например, для того чтобы определять, если тестовое антитело связывается с тем же эпитопом, что и эталонное антитело против С5 по изобретению, эталонному антителу позволяют связываться с белком или пептидом С5 при насыщающих условиях. Затем оценивают способность тестового антитела связываться с молекулой белка С5. Если тестовое антитело способно связываться с С5 после насыщающего связывания с эталонным антителом против С5, то можно заключить, что тестовое антитело связывается с другим эпитопом, нежели эталонное антитело против С5. С другой стороны, если тестовое антитело не способно связываться с белком С5 после насыщающего связывания с эталонным антителом против С5, то тестовое антитело может связываться с тем же эпитопом, что эпитоп, связываемый эталонным антителом против С5 по изобретению.Whether an antibody binds to the same epitope or competes for binding with a reference anti-C5 antibody can be readily determined using standard methods known in the art. For example, in order to determine if a test antibody binds to the same epitope as a reference anti-C5 antibody of the invention, the reference antibody is allowed to bind to the C5 protein or peptide under saturating conditions. The ability of the test antibody to bind to the C5 protein molecule is then evaluated. If the test antibody is able to bind to C5 after saturation binding to the reference anti-C5 antibody, then it can be concluded that the test antibody binds to a different epitope than the reference anti-C5 antibody. On the other hand, if the test antibody is unable to bind to the C5 protein after saturation binding to the reference anti-C5 antibody, then the test antibody may bind to the same epitope as the epitope bound by the reference anti-C5 antibody of the invention.
Для того чтобы определять, если антитело конкурирует за связывание с эталонным антителом против С5, описанный выше способ связывания осуществляют в двух ориентациях: в первой ориентации эталонному антителу позволяют связываться с белком С5 при насыщающих условиях, после чего следует оценка связывания тестового антитела с молекулой С5. Во второй ориентации тестовому антителу позволяют связываться с молекулой С5 при насыщающих условиях, после чего следует оценка связывания эталонного антитела с молекулой С5. Если в обеих ориентациях только первое (насыщающее) антитело способно связываться с молекулой С5, то заключают, что тестовое антитело и эталонное антитело конкурируют за связывание с С5. Специалист в данной области примет во внимание, что антитело, которое конкурирует за связывание с эталонным антителом, может необязательно связываться с идентичным эпитопом, как эталонное антитело, но может стерически блокировать связывание эталонного антитела посредством связывания перекрывающегося или смежного эпитопа.In order to determine if an antibody competes for binding with a reference anti-C5 antibody, the binding method described above is carried out in two orientations: in the first orientation, the reference antibody is allowed to bind to the C5 protein under saturating conditions, followed by evaluation of the binding of the test antibody to the C5 molecule. In the second orientation, the test antibody is allowed to bind to the C5 molecule under saturating conditions, followed by evaluation of the binding of the reference antibody to the C5 molecule. If in both orientations only the first (saturating) antibody is able to bind to the C5 molecule, then it is concluded that the test antibody and the reference antibody compete for binding to C5. One skilled in the art will appreciate that an antibody that competes for binding with a reference antibody may not necessarily bind to the same epitope as the reference antibody, but may sterically block reference antibody binding by binding to an overlapping or contiguous epitope.
Два антитела связываются с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом, если каждое конкурентно ингибирует (блокирует) связывание другого с антигеном. То есть, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратных избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75, 90 или даже 99%, как измеряют в анализе конкурентного связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990, 50:1495-1502). Альтернативно, два антитела имеют один и тот же эпитоп, если по существу все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или устраняют связывание с одним антителом, снижают или устраняют связывание с другим. Два антитела имеют перекрывающиеся эпитопы, если некоторые аминокислотные мутации, которые снижают или устраняют связывание с одним антителом, снижают или устраняют связывание с другим.Two antibodies bind to the same or overlapping epitope if each competitively inhibits (blocks) the other from binding to the antigen. That is, a 1-, 5-, 10-, 20-, or 100-fold excess of one antibody inhibits the binding of the other by at least 50%, but preferably by 75, 90, or even 99%, as measured in a competitive binding assay (see ., for example, Junghans et al., Cancer Res. 1990, 50:1495-1502). Alternatively, two antibodies share the same epitope if substantially all amino acid mutations in the antigen that reduce or eliminate binding to one antibody reduce or eliminate binding to the other. Two antibodies have overlapping epitopes if certain amino acid mutations that reduce or eliminate binding to one antibody reduce or eliminate binding to another.
Затем можно осуществлять дополнительные стандартные эксперименты (например, мутации в пептидах и анализы связывания) для того, чтобы подтверждать, обусловлено ли наблюдаемое отсутствие связывания тестового антитела фактически связыванием с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, или если стерическое блокирование (или другой феномен) отвечает за отсутствие наблюдаемого связывания. Эксперименты этого типа можно осуществлять с использованием ELISA, RIA, поверхностного плазмонного резонанса, проточной цитометрии или любого другого количественного или качественного анализа связывания антител, доступного в данной области.Additional routine experiments (e.g., peptide mutations and binding assays) can then be performed to confirm whether the observed lack of binding of the test antibody is actually due to binding to the same epitope as the reference antibody, or if steric blocking (or other phenomenon) responsible for the lack of observable binding. Experiments of this type can be performed using ELISA, RIA, surface plasmon resonance, flow cytometry, or any other quantitative or qualitative antibody binding assay available in the art.
Иммуноконъюгаты.Immunoconjugates.
Данное изобретение относится к моноклональному антителу человека против С5, конъюгированному с терапевтическим фрагментом (иммуноконъюгат), чтобы лечить С5-ассоциированное заболевание или нарушение (например, атипичный гемолитико-уремический синдром). Как используют в настоящем описании, термин иммуноконъюгат относится к антителу, которое химически или биологически связывают с радиоактивным средством, цитокином, интерфероном, фрагментом мишени или репортера, ферментом, пептидом или белком или терапевтическим средством. Антитела можно связывать с радиоактивным средством, цитокином, интерфероном, фрагментом мишени или репортера, ферментом, пептидом или терапевтическим средством в любом местоположении вдоль молекулы при условии, что они способны связываться со своей мишенью. Примеры иммуноконъюгатов включают конъюгаты антител и лекарственных средств и слитые белки антитело-токсин. В одном из вариантов осуществления средство может представлять собой второе отличающееся антитело к белку С5. Тип терапевтического фрагмента, который можно конъюгировать с антителом против С5, должен учитывать состояние, подлежащее лечению, и желаемый терапевтический эффект, подлежащий достижению. Примеры подходящих средств для формирования иммуноконъюгатов известны в данной области; см., например, WO 05/103081.The present invention relates to a human anti-C5 monoclonal antibody conjugated to a therapeutic moiety (immunoconjugate) to treat a C5-associated disease or disorder (eg, atypical hemolytic uremic syndrome). As used herein, the term immunoconjugate refers to an antibody that is chemically or biologically linked to a radioactive agent, cytokine, interferon, target or reporter fragment, enzyme, peptide or protein, or therapeutic agent. Antibodies can be bound to a radioactive agent, cytokine, interferon, target or reporter fragment, enzyme, peptide, or therapeutic agent at any location along the molecule, provided they are capable of binding to their target. Examples of immunoconjugates include antibody-drug conjugates and antibody-toxin fusion proteins. In one embodiment, the agent may be a second distinct antibody to the C5 protein. The type of therapeutic moiety that can be conjugated to an anti-C5 antibody should take into account the condition being treated and the desired therapeutic effect to be achieved. Examples of suitable agents for forming immunoconjugates are known in the art; see, for example, WO 05/103081.
Полиспецифические антитела.polyspecific antibodies.
Антитела по настоящему изобретению могут быть моноспецифическими, биспецифическими или полиспецифическими. Полиспецифические антитела могут обладать специфичностью к различным эпитопам одного целевого полипептида или могут содержать антигенсвязывающие домены со специфичностью больше чем к одному целевому полипептиду. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69;The antibodies of the present invention may be monospecific, bispecific or polyspecific. Multispecific antibodies may have specificity for different epitopes of the same target polypeptide or may contain antigen-binding domains with specificity for more than one target polypeptide. See, for example, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69;
- 23 039858- 23 039858
Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244.Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244.
Любые полиспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению или их варианты можно конструировать с использованием стандартных способов молекулярной биологии (например, технология рекомбинантной ДНК и экспрессии белка), как известно специалистам в данной области.Any polyspecific antigen-binding molecules of the invention, or variants thereof, can be constructed using standard molecular biology techniques (eg, recombinant DNA and protein expression technology) as is known to those skilled in the art.
В некоторых вариантах осуществления С5-специфические антитела создают в биспецифическом формате (биспецифические), в котором вариабельные области, связывающиеся с различными доменами белка С5, связаны вместе, чтобы придавать двухдоменную специфичность одной связывающей молекуле. Надлежащим образом разработанные биспецифические средства могут усиливать общий ингибирующий белок С5 эффект через увеличение как специфичности, так и авидности связывания. Вариабельные области со специфичностью к индивидуальным доменам (например, сегменты N-концевого домена) или которые могут связываться с различными областями в одном домене, образуют пары на структурном остове, который позволяет каждой области связываться одновременно с отдельными эпитопами или с различными областями в одном домене. В одном из примеров для биспецифического средства вариабельные области тяжелой цепи (VH) из связывающего средства со специфичностью к одному домену рекомбинируют с вариабельными областями легкой цепи (VL) из серии связывающих средств со специфичностью ко второму домену для того, чтобы идентифицировать не когнатных VL партнеров, которые могут образовывать пары с исходной VH без нарушения исходной специфичности для этой VH. Таким образом, один сегмент VL (например, VL1) можно комбинировать с двумя различными доменами VH (например, VH1 и VH2) для того, чтобы создавать биспецифическое средство, состоящее из двух связывающих плеч (VH1-VL1 и VH2-VL1). Использование одного сегмента VL снижает сложность системы и, тем самым, упрощает и увеличивает эффективность в процессах клонирования, экспрессии и очистки, используемых для того, чтобы создавать биспецифическое средство (см., например, USSN13/022759 и US 2010/0331527).In some embodiments, C5-specific antibodies are created in a bispecific format (bispecific) in which variable regions that bind to different domains of the C5 protein are linked together to confer dual domain specificity on a single binding molecule. Properly designed bispecific agents can enhance the overall inhibitory C5 protein effect by increasing both specificity and avidity of binding. Variable regions with specificity for individual domains (eg, segments of the N-terminal domain) or that can bind to different regions in the same domain are paired on a structural backbone that allows each region to bind simultaneously to separate epitopes or to different regions in the same domain. In one example, for a bispecific agent, heavy chain variable regions (VH) from a binding agent with specificity for one domain are recombined with variable light chain regions (V L ) from a series of binding agents with specificity for a second domain in order to identify non-cognate V L partners that can pair with the original VH without violating the original specificity for that V H . Thus, one V L segment (eg, V L 1) can be combined with two different VH domains (eg, V H 1 and V H 2) to create a bispecific agent consisting of two binding arms (VH1-VL1 and VH2-VL1). The use of a single V L segment reduces system complexity and thereby simplifies and increases efficiency in the cloning, expression and purification processes used to create a bispecific agent (see, for example, USSN13/022759 and US 2010/0331527).
Альтернативно, антитела, которые связывают больше чем один домен и вторую мишень, такую как, но не ограничиваясь этим, например, второе отличающееся антитело против С5, можно получать в биспецифическом формате с использованием способов, описанных в настоящем описании, или других способов, известных специалистам в данной области. Вариабельные области антител, которые связываются с отличающимися областями, можно связывать вместе с вариабельными областями, которые связываются с релевантными участками, например, на внеклеточном домене С5, чтобы придавать двойную антигенную специфичность одной связывающей молекуле. Надлежащим образом разработанные биспецифические средства с этими свойствами выполняют двойную функцию. Вариабельные области со специфичностью к внеклеточному домену комбинируют с вариабельной областью со специфичностью к наружному внеклеточному домену и образуют пары на структурном остове, который позволяет каждой вариабельной области связываться с отдельными антигенами.Alternatively, antibodies that bind more than one domain and a second target, such as, but not limited to, for example, a second distinct anti-C5 antibody, can be generated in a bispecific format using the methods described herein or other methods known to those skilled in the art. in this area. Antibody variable regions that bind to distinct regions can be linked together with variable regions that bind to relevant sites, eg on the C5 extracellular domain, to confer dual antigenic specificity on a single binding molecule. Properly designed bispecific agents with these properties perform a dual function. Variable regions with specificity for the extracellular domain are combined with a variable region with specificity for the outer extracellular domain and paired on a structural backbone that allows each variable region to bind to separate antigens.
Образцовый формат биспецифических антител, который можно использовать в контексте настоящего изобретения, включает использование домена СН3 первого иммуноглобулина (Ig) и второго домена СН3 Ig, где первый и второй домены СН3 Ig отличаются друг от друг по меньшей мере одной аминокислотой и где различие по меньшей мере в одну аминокислоту снижает связывание биспецифического антитела с белком А по сравнению с биспецифическим антителом, не имеющим аминокислотного отличия. В одном из вариантов осуществления первый домен СН3 Ig связывает белок А и второй домен СН3 Ig содержит мутацию, которая снижает или устраняет связывание белка А, такую как модификация H95R (по нумерации экзонов IMGT; H435R по нумерации EU). Второй СН3 дополнительно может содержать модификацию Y96F (по IMGT; Y436F по EU). Дополнительные модификации, которые можно найти во втором СН3, включаютAn exemplary bispecific antibody format that can be used in the context of the present invention includes the use of a first immunoglobulin (Ig) C H 3 domain and a second Ig C H 3 domain, wherein the first and second Ig C H 3 domains differ from each other by at least one amino acid. and wherein the difference of at least one amino acid reduces the binding of the bispecific antibody to protein A compared to a bispecific antibody having no amino acid difference. In one embodiment, the first Ig C H 3 domain binds protein A and the second Ig C H 3 domain contains a mutation that reduces or abolishes protein A binding, such as an H95R modification (by IMGT exon numbering; H435R by EU numbering). The second C H 3 may additionally contain modification Y96F (according to IMGT; Y436F according to EU). Additional modifications that can be found in the second CH3 include
D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (по IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I по EU) в случае антител IgG1;D16E, L18M, N44S, K52N, V57M and V82I (by IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M and V422I by EU) in the case of IgG1 antibodies;
N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I по EU) в случае антител IgG2; иN44S, K52N and V82I (IMGT; N384S, K392N and V422I in EU) for IgG2 antibodies; and
Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (по IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I по EU) в случае антител IgG4.Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q and V82I (by IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q and V422I by EU) in the case of IgG4 antibodies.
Вариации биспецифического формата антител, которые описаны выше, предусмотрены в объеме настоящего изобретения.Variations in the bispecific antibody format as described above are contemplated within the scope of the present invention.
Другие образцовые биспецифические форматы, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, включают, без ограничения, например, основанные на scFv или биспецифические форматы диател, слитые конструкции IgG-scFv, Ig с двойным вариабельным доменом (DVD), квадрому, выступы-во-впадины, обыкновенную легкую цепь (например, обыкновенную легкую цепь с выступамиво-впадины и т.д.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, лейциновую молнию, Duobody, IgG1/IgG2, IgG с двойного действия Fab (DAF) и биспецифические форматы Mab2 (обзор вышеуказанных форматов см., например, в Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11 и цитируемых в них ссылках). Биспецифические антитела также можно конструировать с использованием конъюгации пептидов/нуклеиновых кислот, например, где неприродные аминокислоты с ортогональной химической реакционной способностью используют для того, чтобы создавать сайт-специфические конъюгаты антитело-олигонуклеотид, которые затем самособираются в мультимерные комплексы с определенными составом, валентностью и геометрией. (См.,Other exemplary bispecific formats that can be used in the context of the present invention include, but are not limited to, for example, scFv-based or diabody bispecific formats, IgG-scFv fusions, Ig double variable domain (DVD), quadroma, ridge-in-trough , ordinary light chain (e.g., ordinary light chain with ridges and valleys, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, leucine zipper, Duobody, IgG1/IgG2, IgG with Dual Action Fab (DAF) and bispecific formats Mab2 (for a review of the above formats see, for example, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11 and references cited therein). Bispecific antibodies can also be constructed using peptide/nucleic acid conjugation, for example, where non-natural amino acids with orthogonal chemical reactivity are used to create site-specific antibody-oligonucleotide conjugates, which then self-assemble into multimeric complexes with defined composition, valence, and geometry. . (Cm.,
- 24 039858 например, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).- 24 039858 e.g. Kazane et al., J. Am. Chem. soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).
Терапевтическое введение и составы.Therapeutic administration and formulations.
Изобретение относится к терапевтическим композициям, содержащим антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению. Терапевтические композиции в соответствии с изобретением следует вводить с подходящими носителями, эксципиентами и другими средствами, которые включают в составы для обеспечения усовершенствованного переноса, доставки, переносимости и т. п. Множество подходящих составов можно найти в справочнике, известном всем фармацевтическим химикам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Эти составы включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, жиры, липидсодержащие (катионные или анионные) везикулы (такие как LIPOFECTIN™), ДНК конъюгаты, безводные абсорбционные пасты, эмульсии масло в воде и вода в масле, эмульсии Carbowax (полиэтиленгликоли различных молекулярных масс), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие Carbowax. См. также Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations, PDA (1998), J. Pharm. Sci. Technol. 52:238-311.The invention relates to therapeutic compositions containing antibodies against C5 or their antigen-binding fragments of the present invention. Therapeutic compositions in accordance with the invention should be administered with suitable carriers, excipients and other means, which are included in the formulations to provide improved transfer, delivery, tolerability, and the like. A variety of suitable formulations can be found in the reference book known to all pharmaceutical chemists: Remington's Pharmaceutical Sciences , Mack Publishing Company, Easton, PA. These formulations include, for example, powders, pastes, ointments, jellies, waxes, oils, fats, lipid-containing (cationic or anionic) vesicles (such as LIPOFECTIN™), DNA conjugates, anhydrous absorption pastes, oil-in-water and water-in-oil emulsions, Carbowax emulsions (polyethylene glycols of various molecular weights), semi-solid gels and semi-solid mixtures containing Carbowax. See also Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations, PDA (1998), J. Pharm. sci. Technol. 52:238-311.
Дозу антитела можно варьировать в зависимости от возраста и размеров субъекта, подлежащего введению, целевого заболевания, условий, пути введения и т.п. Когда антитело по настоящему изобретению применяют для лечения заболевания или нарушения у взрослого пациента или для предотвращения такого заболевания, благоприятно вводить антитело по настоящему изобретению, обычно в однократной дозе приблизительно от 0,1 приблизительно до 100 мг/кг массы тела, более предпочтительно приблизительно от 5 приблизительно до 80, приблизительно от 10 приблизительно до 70 или приблизительно от 20 приблизительно до 50 мг/кг массы тела. В зависимости от тяжести состояния, частоту и длительность лечения можно корректировать. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно вводить в виде начальной дозы по меньшей мере приблизительно от 0,1 приблизительно до 800 мг, приблизительно от 1 приблизительно до 600 мг, приблизительно от 5 приблизительно до 500 мг или приблизительно от 10 приблизительно до 400 мг. В определенных вариантах осуществления за начальной дозой может следовать введение второй или множества последующих доз антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в количестве, которое может приблизительно таким же или меньше такового в начальной дозе, где последующие дозы разделяют по меньшей мере 1-3 сутками; по меньшей мере одной неделей, по меньшей мере 2 неделями; по меньшей мере 3 неделями; по меньшей мере 4 неделями; по меньшей мере 5 неделями; по меньшей мере 6 неделями; по меньшей мере 7 неделями; по меньшей мере 8 неделями; по меньшей мере 9 неделями; по меньшей мере 10 неделями; по меньшей мере 12 неделями или по меньшей мере 14 неделями.The dose of the antibody may vary depending on the age and size of the subject to be administered, the target disease, conditions, route of administration, and the like. When an antibody of the present invention is used to treat or prevent a disease or disorder in an adult patient, it is advantageous to administer the antibody of the present invention, typically at a single dose of about 0.1 to about 100 mg/kg body weight, more preferably about 5 up to about 80, about 10 to about 70, or about 20 to about 50 mg/kg of body weight. Depending on the severity of the condition, the frequency and duration of treatment can be adjusted. In certain embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention may be administered as an initial dose of at least about 0.1 to about 800 mg, about 1 to about 600 mg, about 5 to about 500 mg, or about 10 about up to 400 mg. In certain embodiments, the initial dose may be followed by the administration of a second or multiple subsequent doses of the antibody or antigen-binding fragment thereof in an amount that may be approximately the same or less than that of the initial dose, where subsequent doses are separated by at least 1-3 days; at least one week, at least 2 weeks; at least 3 weeks; at least 4 weeks; at least 5 weeks; at least 6 weeks; at least 7 weeks; at least 8 weeks; at least 9 weeks; at least 10 weeks; at least 12 weeks or at least 14 weeks.
Различные системы доставки известны, и их можно применять для того, чтобы вводить фармацевтическую композицию по изобретению, например инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, рецепторопосредованный эндоцитоз (см., например, Wu et al. (1987), J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы введения включают, но не ограничиваясь этим, внутрикожный, трансдермальный, внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и оральный пути. Композицию можно вводить с помощью любого удобного пути, например посредством инфузии или болюсной инъекции, посредством абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые выстилки (например, слизистая оболочка рта, ректальная и кишечная слизистая и т.д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным. Фармацевтическую композицию также можно доставлять в везикуле, в частности липосоме (см., например, Langer (1990), Science, 249:1527-1533).Various delivery systems are known and can be used to administer the pharmaceutical composition of the invention, eg encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing mutant viruses, receptor-mediated endocytosis (see, for example, Wu et al. (1987 ), J Biol Chem 262:4429-4432). Routes of administration include, but are not limited to, intradermal, transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The composition may be administered by any convenient route, such as by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (eg, oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.), and may be administered together with other biologically active means. The introduction can be systemic or local. The pharmaceutical composition can also be delivered in a vesicle, in particular a liposome (see, for example, Langer (1990), Science, 249:1527-1533).
Использование наночастиц для того, чтобы доставлять антитела по настоящему изобретению, также предусмотрено в настоящем описании. Конъюгированные с антителами наночастицы можно использовать как для терапевтических, так и для диагностических применений. Конъюгированные с антителами наночастицы и способы получения и использования описаны подробно в Arruebo, M., et al. 2009 (Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications в J. Nanomat., том 2009, ID статьи 439389, 24 страницы, doi: 10,1155/2009/439389), включенной в настоящее описание посредством ссылки. Наночастицы можно разрабатывать и конъюгировать с антителами, содержащимися в фармацевтических композициях для направленного воздействия на клетки. Наночастицы для доставки лекарственных средств также описаны, например, в US 8257740 или US 8246995, каждый включен в настоящее описание в полном объеме.The use of nanoparticles to deliver the antibodies of the present invention is also contemplated herein. Antibody-conjugated nanoparticles can be used for both therapeutic and diagnostic applications. Antibody-conjugated nanoparticles and methods of preparation and use are described in detail in Arruebo, M., et al. 2009 (Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications in J. Nanomat., vol. 2009, article ID 439389, 24 pages, doi: 10.1155/2009/439389), incorporated herein by reference. Nanoparticles can be designed and conjugated with antibodies contained in pharmaceutical compositions to target cells. Nanoparticles for drug delivery are also described, for example, in US 8257740 or US 8246995, each is included in this description in full.
В определенных ситуациях фармацевтическую композицию можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением. В одном из вариантов осуществления можно использовать насос. В другом варианте осуществления можно использовать полимерные материалы. В еще одном другом варианте осуществления систему с контролируемым высвобождением можно помещать вблизи от мишени композиции, что, таким образом, требует только доли от системной дозы.In certain situations, the pharmaceutical composition may be delivered in a controlled release system. In one embodiment, a pump may be used. In another embodiment, polymeric materials can be used. In yet another embodiment, the controlled release system can be placed close to the target of the composition, thus requiring only a fraction of the systemic dose.
Инъецируемые препараты могут включать дозированные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных, внутричерепных, интраперитонеальных и внутримышечных инъекций, капельных инфузий и т.д. Эти инъецируемые препараты можно получать с помощью общеизвестных способов. Например, инъецируемые препараты можно получать, например, посредством растворения, суспендированияInjectable preparations may include dosage forms for intravenous, subcutaneous, intradermal, intracranial, intraperitoneal and intramuscular injections, drip infusions, and the like. These injectable preparations can be obtained using well-known methods. For example, injectable preparations can be obtained, for example, by dissolving, suspending
- 25 039858 или эмульгирования антитела или его соли, описанных выше, в стерильной водной среде или масляной среде, стандартно используемой для инъекций. В качестве водной среды для инъекций имеют место, например, физиологический солевой раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные средства, и т.д., которые можно использовать в комбинации с подходящим солюбилизирующим средством, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионное поверхностно-активное средство [например, полисорбат 80, НСО-50 (полиоксиэтиленовый (50 моль) продукт присоединения гидрогенизированного касторового масла)] и т.д. В качестве масляной среды используют, например, сезамовое масло, соевое масло и т.д., которые можно использовать в комбинации с солюбилизирующим средством, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Инъекцией, полученной таким образом, предпочтительно заполняют подходящую ампулу.- 25 039858 or emulsifying an antibody or salt thereof as described above in a sterile aqueous or oily medium commonly used for injection. As the aqueous injection medium, there are, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, etc., which can be used in combination with a suitable solubilizing agent such as an alcohol (for example, ethanol), polyhydric alcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), non-ionic surfactant [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)], etc. As the oil medium, for example, sesame oil, soybean oil, etc. are used, which can be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate, benzyl alcohol, etc. The injection thus obtained is preferably filled into a suitable ampoule.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставлять подкожно или внутривенно с использованием стандартных иглы и шприца. Кроме того, в отношении подкожной доставки, устройство доставки по типу ручки без труда находит применения для доставки фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Такое устройство доставки по типу ручки может быть повторно используемым или одноразовым. Повторно используемое устройство доставки по типу ручки в целом использует заменяемый картридж, который содержит фармацевтическую композицию. Когда вся фармацевтическая композиция в картридже введена и картридж пуст, пустой картридж можно легко выбрасывать и заменять на новый картридж, который содержит фармацевтическую композицию. Устройство доставки по типу ручки затем можно повторно использовать. В одноразовом устройстве доставки по типу ручки заменяемый картридж отсутствует. Скорее, одноразовое устройство доставки по типу ручки поступает предварительно заполненным фармацевтической композицией, содержащейся в резервуаре в устройстве. Когда фармацевтическая композиция в резервуаре закончилась, выбрасывают устройство целиком.The pharmaceutical composition of the present invention can be delivered subcutaneously or intravenously using a standard needle and syringe. In addition, with respect to subcutaneous delivery, the pen-type delivery device easily finds applications for delivering the pharmaceutical composition of the present invention. Such a pen-type delivery device may be reusable or disposable. The reusable pen type delivery device generally uses a replaceable cartridge that contains a pharmaceutical composition. When all of the pharmaceutical composition in the cartridge has been introduced and the cartridge is empty, the empty cartridge can be easily discarded and replaced with a new cartridge that contains the pharmaceutical composition. The pen type delivery device can then be reused. There is no replaceable cartridge in the pen-type disposable delivery device. Rather, the pen-type disposable delivery device comes pre-filled with a pharmaceutical composition contained in a reservoir in the device. When the pharmaceutical composition in the tank is over, discard the entire device.
Многие повторно используемые устройства доставки по типу ручки и автоинъектора находят применения для подкожной доставки фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Примеры включают, но определенно без ограничения этим, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), ручку HUMALOG MIX 75/25™, ручку HUMALOG™, ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), ручку BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany), среди прочих. Примеры одноразовых устройств доставки по типу ручки, имеющие применения для подкожной доставки фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают, но определенно без ограничения этим, ручку SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинъектор SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.) и ручку HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL), среди прочих.Many reusable pen and auto-injector delivery devices find use for subcutaneous delivery of the pharmaceutical composition of the present invention. Examples include, but are definitely not limited to, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ handle (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ handle, HUMALOG™ handle, HUMALIN handle 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II and III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ handle (Becton Dickinson , Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ and OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany), among others. Examples of disposable pen-type delivery devices having applications for subcutaneous delivery of the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, the SOLOSTAR™ pen (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), and KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ auto-injector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), and HUMIRA™ pen (Abbott Labs, Abbott Park, IL), among others.
Благоприятно, описанные выше фармацевтические композиции для орального или парентерального использования получают в дозированных формах в стандартной дозе, подобранной так, чтобы соответствовать дозе активных ингредиентов. Такие дозированные формы в стандартной дозе включают, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъекции (ампулы), суппозитории и т.д. Количество содержащегося антитела в целом составляет приблизительно от 5 приблизительно до 500 мг на дозированную форму в стандартной дозе; в частности в форме инъекции предпочтительно антитело составляло приблизительно от 5 приблизительно до 300 мг и приблизительно от 10 приблизительно до 300 мг для других дозированных форм.Advantageously, the above-described pharmaceutical compositions for oral or parenteral use are prepared in unit dosage forms adjusted to match the dosage of the active ingredients. Such unit dosage forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, and the like. The amount of antibody contained is generally from about 5 mg to about 500 mg per unit dosage form; in particular in the form of an injection, preferably the antibody ranged from about 5 to about 300 mg and from about 10 to about 300 mg for other dosage forms.
Терапевтическое использование антител.Therapeutic use of antibodies.
Антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или предотвращения заболевания, или нарушения, или состояния, связанного с С5, и/или для улучшения по меньшей мере одного симптома, связанного с таким заболеванием, нарушением или состоянием. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно вводить в терапевтической дозе пациенту с заболеванием или нарушением или состоянием, связанным с С5.The antibodies of the present invention can be used to treat and/or prevent a disease, or disorder, or condition associated with C5, and/or to improve at least one symptom associated with such a disease, disorder, or condition. In certain embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention may be administered at a therapeutic dose to a patient with a disease or disorder or condition associated with C5.
В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать при лечении или предотвращении симптома или показания атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS). Симптомы и показания при aHUS включают, но не ограничиваясь этим, активацию тромбоцитов, гемолиз, системную тромботическую микроангиопатию (формирование свертков крови в небольших кровеносных сосудах по всему организму), ведущую к инсульту, сердечному приступу, почечной недостаточности и/или гибели, терминальной стадии почечной недостаточности, постоянному повреждению почек, боли в животе, спутанности, отеку, утомлению, тошноте/рвоте, диарее и микроангиопатической анемии.In certain embodiments, the antibodies of the present invention can be used in the treatment or prevention of a symptom or indication of atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS). Symptoms and indications for aHUS include, but are not limited to, platelet activation, hemolysis, systemic thrombotic microangiopathy (formation of blood clots in small blood vessels throughout the body) leading to stroke, heart attack, kidney failure and/or death, end stage renal disease failure, permanent kidney damage, abdominal pain, confusion, edema, fatigue, nausea/vomiting, diarrhea, and microangiopathic anemia.
В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать при лечении или предотвращении симптома или показания при пароксизмальной ночной гемогло- 26 039858 бинурии (PNH). Симптомы и показания при PNH включают, но не ограничиваясь этим, разрушение красных клеток крови, тромбоз (в том числе тромбоз глубоких вен, легочную эмболию), внутрисосудистую гемолитическую анемию, красную окраску мочи, симптомы анемии, такие как усталость, одышка и сердцебиения, боль в животе и затрудненное глотание.In certain embodiments, the antibodies of the present invention can be used in the treatment or prevention of a symptom or indication of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH). Symptoms and indications for PNH include, but are not limited to, red blood cell destruction, thrombosis (including deep vein thrombosis, pulmonary embolism), intravascular hemolytic anemia, red urine, symptoms of anemia such as fatigue, shortness of breath and palpitations, pain in the abdomen and difficulty swallowing.
В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения или предотвращения по меньшей мере одного симптома или показания С5-ассоциированного заболевания или нарушения, выбранных из группы, состоящей из неврологических нарушений, почечных нарушений, рассеянного склероза, инсульта, синдрома Гийена-Барре, травматического повреждения головного мозга, болезни Паркинсона, нарушений ненадлежащей или нежелательной активации комплемента, осложнений гемодиализа, сверхострого отторжения аллотрансплантата, отторжения ксенотрансплантата, индуцированной интерлейкином-2 токсичность во время терапии IL-2, воспалительных нарушений, воспаления при аутоиммунных заболеваниях, болезни Крона, респираторного дистресс-синдрома взрослых, термического повреждения, включая ожоги или обморожения, постишемических реперфузионных состояний, инфаркта миокарда, синдрома повышенной проницаемости капилляров, ожирения, диабета, болезни Альцгеймера, шизофрении, инсульта, эпилепсии, атеросклероза, васкулита, буллезного пемфигоида, С3-гломерулопатии, мембранопролиферативного гломерулонефрита, баллонной ангиопластики, постгемодиализного синдрома при сердечно-легочном шунтировании или почечном шунтировании, гемодиализа, почечной ишемии, реперфузии брыжеечной артерии после реконструкции аорты, инфекционного заболевания или сепсиса, нарушений иммунных комплексов и аутоиммунных заболеваний, диабетической нефропатии, синдрома Альпорта, прогрессирующей почечной недостаточности, протеинурических заболеваний почек, реперфузионного повреждения при почечной ишемии, волчаночного нефрита, гломерулопатии, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (SLE), SLE нефрита, мембранопролиферативного нефрита, гемолитической анемии, оптикомиелита, трансплантата почки, наследственной недостаточности CD59, псориаза и миастении гравис. В определенных других вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения или предотвращения по меньшей мере одного симптома или показания С5-ассоциированного заболевания или нарушения, выбранных из группы, состоящей из заболеваний и нарушений легких, таких как диспноэ, гемоптизис, ARDS, астма, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), эмфизема, легочная эмболия и инфаркт, пневмония, фиброгенные пневмокониозы, повреждения, обусловленные инертной пылью и минералами (например, кремний, угольная пыль, бериллий и асбест), фиброз легких, органические пневмокониозы, химическое повреждение (из-за раздражающих газов и химических соединений, например, хлора, фосгена, диоксида серы, сероводорода, диоксида азота, аммиака и соляной кислоты), повреждение дымом, термическое повреждение (например, ожог, обморожение), астма, аллергия, бронхоконстрикция, пневмонит гиперчувствительности, паразитарные заболевания, синдром Гудпасчера, васкулит легких, наследственный отек Квинке и ассоциированное с иммунными комплексами воспаление.In certain embodiments, the antibodies of the present invention can be used to treat or prevent at least one symptom or indication of a C5 associated disease or disorder selected from the group consisting of neurological disorders, renal disorders, multiple sclerosis, stroke, Guillain-Barré syndrome, traumatic brain injury, Parkinson's disease, inappropriate or unwanted complement activation disorders, complications of hemodialysis, hyperacute allograft rejection, xenograft rejection, interleukin-2-induced toxicity during IL-2 therapy, inflammatory disorders, inflammation in autoimmune diseases, Crohn's disease, respiratory distress - adult syndrome, thermal injury, including burns or frostbite, postischemic reperfusion conditions, myocardial infarction, capillary leak syndrome, obesity, diabetes, Alzheimer's disease, schizophrenia, stroke, ep ilepsy, atherosclerosis, vasculitis, bullous pemphigoid, C3 glomerulopathy, membranoproliferative glomerulonephritis, balloon angioplasty, posthemodialysis syndrome with cardiopulmonary bypass or renal bypass, hemodialysis, renal ischemia, mesenteric artery reperfusion after aortic reconstruction, infectious disease, or sepsis and autoimmune diseases, diabetic nephropathy, Alport syndrome, progressive renal failure, proteinuric kidney disease, reperfusion injury in renal ischemia, lupus nephritis, glomerulopathy, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), SLE nephritis, membranoproliferative nephritis, hemolytic anemia, optomyelitis, kidney transplant, hereditary CD59 deficiency, psoriasis and myasthenia gravis. In certain other embodiments, the antibodies of the present invention can be used to treat or prevent at least one symptom or indication of a C5 associated disease or disorder selected from the group consisting of lung diseases and disorders such as dyspnea, hemoptysis, ARDS, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema, pulmonary embolism and infarction, pneumonia, fibrogenic pneumoconiosis, inert dust and mineral damage (eg, silica, coal dust, beryllium, and asbestos), pulmonary fibrosis, organic pneumoconiosis, chemical damage (from - irritating gases and chemicals, e.g. chlorine, phosgene, sulfur dioxide, hydrogen sulfide, nitrogen dioxide, ammonia and hydrochloric acid), smoke damage, thermal damage (e.g. burns, frostbite), asthma, allergies, bronchoconstriction, hypersensitivity pneumonitis, parasitic diseases, Goodpasture's syndrome, pulmonary vasculitis, inherited native Quincke's edema and immune complex-associated inflammation.
В определенных вариантах осуществления антитела по изобретению можно использовать для лечения субъектов, страдающих глазным заболеванием, таким как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), диабетический отек желтого пятна (DME), диабетическая ретинопатия, глазной ангиогенез (глазная неоваскуляризация, поражающая ткань хориоида, роговицы или сетчатки), географическая атрофия (GA), увеит и оптикомиелит. Антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения или улучшения по меньшей мере одного симптома или показания сухой AMD или влажной AMD. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению можно использовать для предотвращения или снижения скорости потери зрения. В одном из вариантов осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать для уменьшения друз в глазу субъекта с AMD. В одном из вариантов осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать для предотвращения или уменьшения/замедления потери зрения у субъекта с AMD.In certain embodiments, the antibodies of the invention can be used to treat subjects suffering from an ocular disease such as age-related macular degeneration (AMD), diabetic macular edema (DME), diabetic retinopathy, ocular angiogenesis (ocular neovascularization affecting choroid, cornea, or retina), geographic atrophy (GA), uveitis and myelitis optica. The antibodies of the present invention can be used to treat or improve at least one symptom or indication of dry AMD or wet AMD. In some embodiments, the antibodies of the invention can be used to prevent or reduce the rate of vision loss. In one embodiment, the antibodies of the present invention can be used to reduce drusen in the eye of a subject with AMD. In one embodiment, the antibodies of the present invention can be used to prevent or reduce/slow vision loss in a subject with AMD.
Одно или несколько антител по настоящему изобретению можно вводить для облегчения или предотвращения или снижения тяжести одного или нескольких симптомов или состояний/показаний глазного заболевания или нарушения. Антитела можно использовать для того, чтобы улучшать или снижать тяжесть по меньшей мере одного симптома, включая в качестве неограничивающих примеров потерю зрения, визуальное искажение, сложность адаптации с низким уровням осведения, искривленное центральное зрение, увеличение затемнения центрального/общего зрения, присутствие друз (мелкие скопления внеклеточного материала, которые образуются на сетчатке), пигментные изменения, искаженное зрение в форме метаморфопсии, при которой сетка из прямых линий выглядит волнистой и части сетки могут выглядеть пустыми, экссудативные изменения (геморрагии в глаз, обильный экссудат, субретинальное/под пигментным эпителием сетчатки/интраретинальное текучее вещество), медленное восстановление зрительной функции после воздействия яркого света (фотострессовый тест), начальную и географическую атрофию, существенное снижение остроты зрения (на два уровня или больше), например, с 20/20 до 20/80, преимущественные периметрические изменения повышенной остроты зрения (для влажной AMD), расфокусированное зрение, постепенную потерю центрального зрения (у тех, кто имеет не экссудативную дегенерацию желтого пятна, быстрое начало потери зрения (часто обусловленное подте- 27 039858 канием и кровотечением в аномальных кровеносных сосудах у субъекта с экссудативной дегенерацией желтого пятна, центральные скотомы (тени или выпадение полей зрения), трудности при различении цветов, в частности между темными и темными и между светлыми и светлыми, потерю контрастной чувствительности, прямые линии выглядят изогнутыми на сетке Амслера.One or more antibodies of the present invention can be administered to alleviate or prevent or reduce the severity of one or more symptoms or conditions/indications of an ocular disease or disorder. Antibodies can be used to improve or reduce the severity of at least one symptom, including, but not limited to, loss of vision, visual distortion, difficulty adapting to low levels of illumination, distorted central vision, increased obscuration of central/general vision, the presence of drusen (small accumulations of extracellular material that form on the retina), pigmentary changes, distorted vision in the form of metamorphopsia, in which a grid of straight lines looks wavy and parts of the grid may look empty, exudative changes (hemorrhages in the eye, profuse exudate, subretinal / under the retinal pigment epithelium /intraretinal fluid), slow recovery of visual function after exposure to bright light (photostress test), initial and geographic atrophy, significant reduction in visual acuity (two levels or more), for example, from 20/20 to 20/80, predominant perimetric changes increased acute blurred vision (for wet AMD), blurred vision, gradual loss of central vision (in those with non-exudative macular degeneration, rapid onset of vision loss (often due to leakage and bleeding in abnormal blood vessels in a subject with exudative macular degeneration) yellow spots, central scotomas (shadows or loss of visual fields), difficulty in distinguishing colors, in particular between dark and dark and between light and light, loss of contrast sensitivity, straight lines look curved on the Amsler grid.
Также в настоящем описании предусмотрено использование одного или нескольких антител по настоящему изобретению профилактически у субъектов с риском развития дегенерации желтого пятна, таких как субъекты в возрасте старше 50, субъекты с семейным анамнезом дегенерации желтого пятна, курильщики и субъекты с ожирением, высоким холестерином, сердечно-сосудистыми заболеваниями или нездоровой диетой.Also contemplated herein is the use of one or more antibodies of the present invention prophylactically in subjects at risk for developing macular degeneration, such as subjects over the age of 50, subjects with a family history of macular degeneration, smokers, and subjects with obesity, high cholesterol, heart vascular disease or an unhealthy diet.
В дополнительном варианте осуществления изобретения данные антитела используют для получения фармацевтической композиции или лекарственного средства для лечения пациентов, страдающих заболеванием или нарушением, связанным с С5. В другом варианте осуществления изобретения данные антитела используют в качестве вспомогательной терапии с любым другим средством или любой другой терапией, известными специалистам в данной области, которые можно использовать для лечения или улучшения заболевания или нарушения, связанного с С5.In a further embodiment of the invention, these antibodies are used to prepare a pharmaceutical composition or medicament for the treatment of patients suffering from a disease or disorder associated with C5. In another embodiment, these antibodies are used as an adjuvant therapy with any other agent or therapy known to those skilled in the art that can be used to treat or ameliorate a C5 related disease or disorder.
Комбинированная терапия.Combined therapy.
Комбинированная терапия может включать антитело против С5 по изобретению и любое дополнительное терапевтическое средство, которое может быть полезно в комбинации с антителом по изобретению или с биологически активным фрагментом антитела по изобретению. Антитела по настоящему изобретению можно комбинировать синергически с одним или несколькими лекарственными средствами или терапией, которые используют для лечения заболевания или нарушения, связанного с С5. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению можно комбинировать со вторым терапевтическим средством, чтобы улучшать один или несколько симптомов указанного заболевания.Combination therapy may include an anti-C5 antibody of the invention and any additional therapeutic agent that may be useful in combination with an antibody of the invention or a biologically active fragment of an antibody of the invention. The antibodies of the present invention can be combined synergistically with one or more drugs or therapies that are used to treat a disease or disorder associated with C5. In some embodiments, the antibodies of the invention can be combined with a second therapeutic agent to improve one or more symptoms of said disease.
В зависимости от С5-ассоциированного заболевания или нарушения, антитела по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, включая в качестве неограничивающих примеров антикоагулянт (например, варфарин, аспирин, гепарин, фениндион, фондапаринукс, идрапаринукс и ингибиторы тромбина, такие как аргатробан, лепирудин, бивалирудин или дабигатран), противовоспалительное лекарственное средство (например, кортикостероиды и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства), антигипертензивное средство (например, ингибитор ангиотензин-превращающего фермента), иммуносупрессорное средство (например, винкристин, циклоспорин А или метотрексат), фибринолитическое средство (например, анкрод, s-аминокапроновая кислота, антиплазмин-al, простациклин и дефибртид), понижающее липиды средство, такое как ингибитор гидроксиметилглутарил-КоА-редуктазы, средство против CD20, такое как ритуксимаб, средство против TNF, такое как инфликсимаб, противосудорожное средство (например, сульфат магния), ингибитор С3 или антитромботическое средство.Depending on the C5 associated disease or disorder, the antibodies of the present invention may be used in combination with one or more additional therapeutic agents, including but not limited to an anticoagulant (e.g., warfarin, aspirin, heparin, phenindione, fondaparinux, idraparinux, and thrombin inhibitors, such as argatroban, lepirudin, bivalirudin, or dabigatran), an anti-inflammatory drug (eg, corticosteroids and non-steroidal anti-inflammatory drugs), an antihypertensive agent (eg, an angiotensin-converting enzyme inhibitor), an immunosuppressive agent (eg, vincristine, cyclosporine A, or methotrexate), a fibrinolytic agent (eg, ancrod, s-aminocaproic acid, antiplasmin-al, prostacyclin, and defibrtide), a lipid lowering agent such as a hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibitor, an anti-CD20 agent such as rituximab, an anti-TNF agent such as infliximab, an anticonvulsant (eg, magnesium sulfate), a C3 inhibitor, or an antithrombotic.
В определенных вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой другое антитело к белку С5. В настоящем описании предусмотрено использование комбинации (коктейля) антител с широкой нейтрализующей или ингибирующей активностью против С5. В некоторых вариантах осуществления не конкурирующие антитела можно комбинировать и вводить нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах осуществления антитела, содержащиеся в комбинации, связываются с отдельными не перекрывающимися эпитопами на белке. Антитела, содержащиеся в комбинации, могут блокировать связывание С5 с С5-конвертазой и/или могут предотвращать/ингибировать расщепление С5 до С5а и С5Ь. В определенных вариантах осуществления второе антитело может обладать более длительным временем полужизни в сыворотке человека.In certain embodiments, the second therapeutic agent is another antibody to the C5 protein. The present description contemplates the use of a combination (cocktail) of antibodies with broad neutralizing or inhibitory activity against C5. In some embodiments, non-competing antibodies can be combined and administered to a subject in need. In some embodiments, the antibodies contained in the combination bind to separate, non-overlapping epitopes on a protein. The antibodies contained in the combination may block the binding of C5 to C5 convertase and/or may prevent/inhibit the cleavage of C5 to C5a and C5b. In certain embodiments, the implementation of the second antibody may have a longer half-life in human serum.
Как используют в настоящем описании, термин в комбинации с обозначает, что дополнительный терапевтически активный компонент(ы) можно вводить до, одновременно с или после введения антитела против С5 по настоящему изобретению. Термин в комбинации с также включает последовательное или сопутствующее введение антитела против С5 и второго терапевтического средства.As used herein, the term in combination with means that the additional therapeutically active component(s) may be administered before, simultaneously with, or after administration of the anti-C5 antibody of the present invention. The term in combination with also includes the sequential or concomitant administration of an anti-C5 antibody and a second therapeutic agent.
Дополнительный терапевтически активный компонент(ы) можно вводить субъекту перед введением антитела против С5 по настоящему изобретению. Например, первый компонент можно считать подлежащим введению перед вторым компонентом, если первый компонент вводят за 1 неделю перед, 72 ч перед, 60 ч перед, 48 ч перед, 36 ч перед, 24 ч перед, 12 ч перед, 6 ч перед, 5 ч перед, 4 ч перед, 3 ч перед, 2 ч перед, 1 ч перед, 30 мин перед, 15 мин перед, 10 мин перед, 5 мин перед или меньше чем 1 мин перед введением второго компонента. В других вариантах осуществления дополнительный терапевтически активный компонент(ы) можно вводить субъекту после введения антитела против С5 по настоящему изобретению. Например, первый компонент можно считать подлежащим введению после второго компонента, если первый компонент вводят через 1 мин после, 5 мин после, 10 мин после, 15 мин после, 30 мин после, 1 час после, 2 ч после, 3 ч после, 4 ч после, 5 ч после, 6 ч после, 12 ч после, 24 ч после, 36 ч после, 48 ч после, 60 ч после, 72 ч после введения второго компонента. В других вариантах осуществления дополнительный терапевтически активный компонент(ы) можно вводить субъекту одновременно со введением антитела против С5 по настоящему изобретению. Одновременное введение, для целей настоящего изобретения, включает, например, введение антитела против С5 и дополнительногоThe additional therapeutically active ingredient(s) may be administered to the subject prior to administration of the anti-C5 antibody of the present invention. For example, the first component can be considered to be administered before the second component if the first component is administered 1 week before, 72 hours before, 60 hours before, 48 hours before, 36 hours before, 24 hours before, 12 hours before, 6 hours before, 5 h before, 4 h before, 3 h before, 2 h before, 1 h before, 30 min before, 15 min before, 10 min before, 5 min before, or less than 1 min before the administration of the second component. In other embodiments, the additional therapeutically active component(s) may be administered to a subject following administration of an anti-C5 antibody of the present invention. For example, the first component may be considered to be administered after the second component if the first component is administered 1 minute after, 5 minutes after, 10 minutes after, 15 minutes after, 30 minutes after, 1 hour after, 2 hours after, 3 hours after, 4 h after, 5 h after, 6 h after, 12 h after, 24 h after, 36 h after, 48 h after, 60 h after, 72 h after administration of the second component. In other embodiments, the implementation of additional therapeutically active component(s) can be administered to the subject simultaneously with the introduction of antibodies against C5 of the present invention. Simultaneous administration, for purposes of the present invention, includes, for example, administration of an anti-C5 antibody and additional
- 28 039858 терапевтически активного компонента субъекту в одной дозированной форме или в отдельных дозированных формах, вводимых субъекту в пределах приблизительно 30 мин или меньше друг от друга. При введении в отдельных дозированных формах каждую дозированную форму можно вводить через один и тот же путь (например, оба антитела против С5 и дополнительный терапевтически активный компонент можно вводить внутривенно и т.д.); альтернативно, каждую дозированную форму можно вводить через отличающийся путь (например, антитело против С5 можно вводить внутривенно и дополнительный терапевтически активный компонент можно вводить перорально). В любом случае введение компонентов в одной дозированной форме, в отдельных дозированных формах через один и тот же путь или в отдельных дозированных формах через различные пути - все считают одновременным введением для целей настоящего раскрытия. Для целей настоящего раскрытия введение антитела против С5 до, одновременно с или после (как эти термины определяют выше в настоящем описании) введения дополнительного терапевтически активного компонента считают введением антитела против С5 в комбинации с дополнительным терапевтически активным компонентом.- 28 039858 therapeutically active component to the subject in a single dosage form or in separate dosage forms administered to the subject within about 30 minutes or less of each other. When administered in separate dosage forms, each dosage form may be administered via the same route (eg, both anti-C5 antibodies and the additional therapeutically active moiety may be administered intravenously, etc.); alternatively, each dosage form may be administered via a different route (eg, the anti-C5 antibody may be administered intravenously and the additional therapeutically active ingredient may be administered orally). In any case, administration of the components in the same dosage form, in separate dosage forms via the same route, or in separate dosage forms via different routes, are all considered to be simultaneous administration for the purposes of this disclosure. For purposes of this disclosure, administration of an anti-C5 antibody prior to, simultaneously with, or after (as these terms are defined hereinbefore) administration of an additional therapeutically active ingredient is considered to be administration of an anti-C5 antibody in combination with an additional therapeutically active ingredient.
Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, в которых антитело против С5 по настоящему изобретению совместно формулируют с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, как описано в другом месте в настоящем документе.The present invention includes pharmaceutical compositions in which an anti-C5 antibody of the present invention is co-formulated with one or more additional therapeutically active ingredients as described elsewhere herein.
Схемы введения.Introduction schemes.
В соответствии с определенными вариантами осуществления однократную дозу антитела против С5 по изобретению (или фармацевтической композиции, содержащей комбинацию антитела против С5 и любого из дополнительных терапевтически активных средств, указанных в настоящем описании) можно вводить нуждающемуся в этом субъекту. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения множество доз антитела против С5 (или фармацевтической композиции, содержащей комбинацию антитела против С5 и любого из дополнительных терапевтически активных средств, указанных в настоящем описании) можно вводить субъекту в течение определенного периода времени. Способы в соответствии с этим аспектом изобретения включают последовательное введение субъекту нескольких доз антитела против С5 по изобретению. Как используют в настоящем описании, последовательное введение обозначает, что каждую дозу антитела против С5 вводят субъекту в отличающийся момент времени, например в отличающиеся сутки, отделенные предварительно определяемым интервалом (например, часы, сутки, недели или месяцы). Настоящее изобретение включает способы, которые включают последовательное введение пациенту одной начальной дозы антитела против С5, после чего следуют одна или несколько вторичных доз антитела против С5 и, необязательно, после чего следуют одна или несколько третичных доз антитела против С5.In certain embodiments, a single dose of an anti-C5 antibody of the invention (or a pharmaceutical composition comprising a combination of an anti-C5 antibody and any of the additional therapeutically active agents described herein) may be administered to a subject in need thereof. In accordance with certain embodiments of the present invention, multiple doses of an anti-C5 antibody (or a pharmaceutical composition comprising a combination of an anti-C5 antibody and any of the additional therapeutically active agents described herein) may be administered to a subject over a period of time. Methods in accordance with this aspect of the invention include sequentially administering to a subject several doses of an anti-C5 antibody of the invention. As used herein, sequential administration means that each dose of anti-C5 antibody is administered to a subject at a different point in time, eg, on a different day separated by a predetermined interval (eg, hours, days, weeks, or months). The present invention includes methods that include sequentially administering to a patient a single initial dose of anti-C5 antibody, followed by one or more secondary doses of anti-C5 antibody, and optionally followed by one or more tertiary doses of anti-C5 antibody.
Термины начальная доза, вторичные дозы и третичные дозы относятся к хронологической последовательности введения антитела против С5 по изобретению. Таким образом, начальная доза представляет собой дозу, которую вводят в начале схемы лечения (также обозначают как доза базового уровня); вторичные дозы представляют собой дозы, которые вводят после начальной дозы; и третичные дозы представляют собой дозы, которые вводят после вторичных доз. Все начальные, вторичные и третичные дозы могут содержать одно и то же количество антитела против С5, но в целом могут отличаться друг от друга в отношении частоты введения. Однако в определенных вариантах осуществления количество антитела против С5, содержащегося в начальных, вторичных и/или третичных дозах, варьирует от одной к другой (например, корректируют вверх или вниз в зависимости от ситуации) во время курса лечения. В определенных вариантах осуществления две или больше (например, 2, 3, 4 или 5) дозы вводят в начале схемы лечения в качестве загрузочных доз, после чего следуют последующие дозы, которые вводят на менее частой основе (например, поддерживающие дозы).The terms initial dose, secondary doses, and tertiary doses refer to the chronological sequence of administration of the anti-C5 antibody of the invention. Thus, the starting dose is the dose that is administered at the start of a treatment regimen (also referred to as the baseline dose); secondary doses are doses that are administered after the initial dose; and tertiary doses are doses that are administered after secondary doses. All initial, secondary and tertiary doses may contain the same amount of anti-C5 antibody, but in general may differ from each other with respect to the frequency of administration. However, in certain embodiments, the amount of anti-C5 antibody contained in the initial, secondary, and/or tertiary doses varies from one to the other (eg, adjusted up or down as appropriate) during the course of treatment. In certain embodiments, two or more (eg, 2, 3, 4, or 5) doses are administered at the beginning of the treatment regimen as loading doses, followed by subsequent doses that are administered on a less frequent basis (eg, maintenance doses).
В определенных образцовых вариантах осуществления настоящего изобретения каждую вторичную и/или третичную дозу вводят через 1-48 ч (например, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5 или больше) после непосредственно предшествующей дозы. Фраза непосредственно предшествующая доза, как используют в настоящем описании, обозначает, в последовательности из нескольких введений, дозу антитела против С5, которую вводят пациенту перед введением ближайшей следующей дозы в последовательности без промежуточных доз.In certain exemplary embodiments of the present invention, each secondary and/or tertiary dose is administered 1-48 hours apart (e.g., 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5 .5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5 , 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22 , 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5 or more) after the immediately preceding dose. The phrase immediately preceding dose as used herein means, in a multi-dose sequence, the dose of anti-C5 antibody that is administered to a patient prior to the next next dose in the sequence with no intermediate doses.
Способы в соответствии с этим аспектом изобретения могут включать введение пациенту любого числа вторичных и/или третичных доз антитела против С5. Например, в определенных вариантах осуществления пациенту вводят только одну вторичную дозу. В других вариантах осуществления пациенту вводят две или больше (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) вторичных доз. Аналогичным образом, в определенных вариантах осуществления пациенту вводят только одну третичную дозу. В других вариантах осуществления пациенту вводят две или больше (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) третичные дозы.Methods in accordance with this aspect of the invention may include administering any number of secondary and/or tertiary doses of anti-C5 antibody to a patient. For example, in certain embodiments, only one secondary dose is administered to the patient. In other embodiments, two or more (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more) secondary doses are administered to the patient. Similarly, in certain embodiments, only one tertiary dose is administered to the patient. In other embodiments, two or more (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more) tertiary doses are administered to the patient.
В определенных вариантах осуществления частота, с которой вторичные и/или третичные дозы вводят пациенту, может варьировать в ходе схемы лечения. Частоту введения также может корректировать во время хода лечения посредством врача в зависимости от потребностей конкретного пациента, после клинического обследования.In certain embodiments, the frequency with which secondary and/or tertiary doses are administered to a patient may vary over the course of a treatment regimen. The frequency of administration can also be adjusted during the course of treatment by the physician, depending on the needs of the particular patient, after clinical examination.
- 29 039858- 29 039858
Диагностическое использование антител.Diagnostic use of antibodies.
Антитела против С5 по настоящему изобретению можно использовать для того, чтобы обнаруживать и/или измерять С5 в образце, например, для диагностических целей. Некоторые варианты осуществления предусматривают использование одного или нескольких антител по настоящему изобретению в анализах для того, чтобы обнаруживать С5-ассоциированное заболевание или нарушение. Образцовые диагностические анализы для С5 могут включать, например, приведение образца, полученного у пациента, в контакт с антителом против С5 по изобретению, где антитело против С5 метят поддающейся обнаружению меткой или репортерной молекулой или используют в качестве захватываемого лиганда для того, чтобы избирательно выделать С5 из образцов пациентов.Anti-C5 antibodies of the present invention can be used to detect and/or measure C5 in a sample, for example for diagnostic purposes. Some embodiments provide for the use of one or more antibodies of the present invention in assays to detect a C5 associated disease or disorder. Exemplary diagnostic assays for C5 may include, for example, contacting a sample obtained from a patient with an anti-C5 antibody of the invention, where the anti-C5 antibody is labeled with a detectable label or reporter molecule or used as a capture ligand to selectively isolate C5 from patient samples.
Альтернативно, не меченное антитело против С5 можно использовать в диагностических применениях в комбинации со вторичным антителом, которое само метят с возможностью обнаружения. Поддающаяся обнаружению метка или репортерная молекула может представлять собой радиоизотоп, такой как 3Н, 14С, 32Р, 35S или 125I; флуоресцентный или хемилюминесцентный фрагмент, такой как флуоресцеинизотиоцианат или родамин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Конкретные образцовые анализы, которые можно использовать для того, чтобы обнаруживать или измерять С5 в образце, включают твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) и активируемую флуоресценцией сортировку клеток (FACS).Alternatively, an unlabeled anti-C5 antibody can be used in diagnostic applications in combination with a secondary antibody that is itself detectably labeled. The detectable label or reporter molecule may be a radioisotope such as 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, or 125 I; a fluorescent or chemiluminescent moiety such as fluorescein isothiocyanate or rhodamine; or an enzyme such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, horseradish peroxidase or luciferase. Specific exemplary assays that can be used to detect or measure C5 in a sample include ELISA, radioimmunoassay (RIA), and fluorescence-activated cell sorting (FACS).
Образцы, которые можно использовать в С5 диагностических анализах в соответствии с настоящим изобретением, включают любой образец ткани или текучего вещества, получаемый от пациента, который содержит поддающиеся обнаружению количества или белка С5 или его фрагментов, при нормальных или патологических состояниях. В целом, уровни белка С5 в конкретном образце, получаемом от здорового пациента (например, пациента, не пораженного заболеванием, связанным с С5), измеряют для того, чтобы изначально установить базовый или стандартный уровень С5. Этот базовый уровень С5 затем можно сравнивать с уровнями С5, измеренными в образцах, полученных у индивидуумов с подозрением на наличие С5-ассоциированного состояния или симптомами, связанными с таким состоянием.Samples that can be used in C5 diagnostic assays in accordance with the present invention include any tissue or fluid sample obtained from a patient that contains detectable amounts of either C5 protein or fragments thereof, under normal or pathological conditions. In general, C5 protein levels in a particular sample from a healthy patient (eg, a patient not affected by a C5 related disease) are measured to initially establish a baseline or standard C5 level. This baseline C5 level can then be compared with C5 levels measured in samples obtained from individuals suspected of having a C5-associated condition or symptoms associated with such a condition.
Антитела со специфичностью к белку С5 могут не содержать дополнительные метки или фрагменты или они могут содержать N-концевую или С-концевую метку или фрагмент. В одном из вариантов осуществления меткой или фрагментом является биотин. В анализе связывания местоположение метки (если уместно) может определять ориентацию пептида относительно поверхности, с которой связывают пептид. Например, если поверхность покрывают авидином, пептид, содержащий N-концевой биотин, будет ориентирован так, что С-концевая часть пептида будет дистальной относительно поверхности.Antibodies with specificity for the C5 protein may not contain additional tags or fragments, or they may contain an N-terminal or C-terminal tag or fragment. In one embodiment, the label or fragment is biotin. In a binding assay, the location of the label (if appropriate) may determine the orientation of the peptide relative to the surface to which the peptide is bound. For example, if the surface is coated with avidin, the peptide containing the N-terminal biotin will be oriented so that the C-terminal portion of the peptide is distal to the surface.
Избранные варианты осуществления.Selected Embodiments.
Избранные варианты осуществления по настоящему раскрытию включают следующее.Selected embodiments of the present disclosure include the following.
В варианте осуществления 1 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком фактора 5 комплемента (С5), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в С5 (SEQ ID NO: 359), как определяют по водород-дейтериевому обмену.In Embodiment 1, the present invention includes an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a complement factor 5 (C5) protein, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof interacts with one or more amino acids contained in C5 (SEQ ID NO: 359), as determined by hydrogen-deuterium exchange.
В варианте осуществления 2 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в α цепи и/или β цепи С5, как определяют по водород-дейтериевому обмену.In Embodiment 2, the present invention includes the isolated antibody or antigen-binding fragment of Embodiment 1, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof interacts with one or more amino acids contained in the α chain and/or β chain of C5, as determined by hydrogen-deuterium exchange.
В варианте осуществления 3 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по вариантам осуществления 1 или 2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не взаимодействуют с аминокислотой из областью анафилатоксина С5а из С5, как определяют по водород-дейтериевому обмену.In embodiment 3, the present invention includes the isolated antibody or antigen-binding fragment of embodiments 1 or 2, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof does not interact with an amino acid from the C5a anaphylatoxin region of C5, as determined by hydrogen-deuterium exchange.
В варианте осуществления 4 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 360 и/или SEQ ID NO: 361, как определяют по водород-дейтериевому обмену.In Embodiment 4, the present invention includes an isolated antibody or antigen-binding fragment according to any one of embodiments 1 to 3, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof interacts with one or more amino acids contained in SEQ ID NO: 360 and/or SEQ ID NO: 361 , as determined by hydrogen-deuterium exchange.
В варианте осуществления 5 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из:In Embodiment 5, the present invention includes an isolated antibody or antigen-binding fragment according to any one of embodiments 1 to 4, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof interacts with an amino acid sequence selected from the group consisting of:
(а) аминокислот с 591 до 599 из SEQ ID NO: 359;(a) amino acids 591 to 599 of SEQ ID NO: 359;
(b) аминокислот с 593 до 599 из SEQ ID NO: 359;(b) amino acids 593 to 599 of SEQ ID NO: 359;
(с) аминокислот с 775 до 787 из SEQ ID NO: 359;(c) amino acids 775 to 787 of SEQ ID NO: 359;
(d) аминокислот с 775 до 794 из SEQ ID NO: 359 и (е) аминокислот с 779 до 787 из SEQ ID NO: 359.(d) amino acids 775 to 794 of SEQ ID NO: 359; and (e) amino acids 779 to 787 of SEQ ID NO: 359.
В варианте осуществления 6 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 5, где антитело или его анти- 30 039858 генсвязывающий фрагмент взаимодействуют по меньшей мере с пятью аминокислотами, содержащимися в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 360 и 361.In Embodiment 6, the present invention includes an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 1 to 5, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof interacts with at least five amino acids contained in an amino acid sequence selected from the group, consisting of SEQ ID NO: 360 and 361.
В варианте осуществления 7 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 360 и 361.In Embodiment 7, the present invention includes the isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of Embodiments 1 to 5, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof interacts with the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 360 and 361.
В варианте осуществления 8 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком фактора 5 комплемента (С5), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют по меньшей мере с одним из следующих аминокислотных остатков: N591, М592, А593, Т594, G595, М596, D597, S598, W599, W775, Е776, V777, Н778, L779, V780, Р781, R782, R783, К784, Q785, L786, Q787, F788, А789, L790, Р791, D792, S793 или L794 из SEQ ID NO: 359.In Embodiment 8, the present invention includes an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a complement factor 5 (C5) protein, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof interacts with at least one of the following amino acid residues: N591, M592, A593, T594 , G595, M596, D597, S598, W599, W775, E776, V777, H778, L779, V780, P781, R782, R783, K784, Q785, L786, Q787, F788, A789, L790, P791, D792, S793 or L794 from SEQ ID NO: 359.
В варианте осуществления 9 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 8, где антитело обладает одной или несколькими из следующих характеристик:In Embodiment 9, the present invention includes the isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of Embodiments 1 to 8, wherein the antibody has one or more of the following:
(а) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 70 при введении яванскому макаку;(a) has a serum concentration of greater than 10 μg/ml up to day 70 when administered to the cynomolgus monkey;
(b) блокирует классический путь (СР) гемолиза до суток 35 при введении яванскому макаку, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo;(b) blocks the classical pathway (CP) of hemolysis up to day 35 when administered to cynomolgus monkey as measured in an ex vivo hemolysis assay;
(с) блокирует альтернативный путь (АР) гемолиза до суток 35 при введении яванскому макаку, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo;(c) blocks the alternative pathway (AR) of hemolysis up to day 35 when administered to cynomolgus monkey as measured in an ex vivo hemolysis assay;
(d) имеет время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток у яванского макака;(d) has a serum half-life greater than 10 days in the cynomolgus monkey;
(е) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 40 при введении С5-гуманизированным мышам;(e) has a serum concentration greater than 10 μg/ml up to day 40 when administered to C5 humanized mice;
(f) блокирует СР гемолиз до суток 30 при введении С5-гуманизированным мышам, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo; и (g) имеет время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток у С5-гуманизированных мышей.(f) blocks CP hemolysis up to day 30 when administered to C5 humanized mice as measured in an ex vivo hemolysis assay; and (g) has a serum half-life greater than 10 days in C5 humanized mice.
В варианте осуществления 10 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 9, где антитело обладает дополнительной характеристикой, выбранной из группы, состоящей из:In embodiment 10, the present invention includes the isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 1 to 9, wherein the antibody has an additional characteristic selected from the group consisting of:
(а) представляет собой моноклональное антитело полностью человека;(a) is a fully human monoclonal antibody;
(b) связывается с С5 человека с константой диссоциации (KD) меньше чем 0,9 нМ при 25°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(b) binds to human C5 with a dissociation constant (K D ) of less than 0.9 nM at 25° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(с) связывается с С5 человека с KD меньше чем 0,3 нМ при 37°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(c) binds to human C5 with a KD of less than 0.3 nM at 37° C. as measured in a surface plasmon resonance assay;
(d) связывается с С5 обезьяны с KD меньше чем 65 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(d) binds to monkey C5 with a KD of less than 65 nM as measured in a surface plasmon resonance assay;
(е) связывается с вариантом С5 человека R885H (SEQ ID NO: 356) с KD меньше чем 0,5 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(e) binds to human C5 variant R885H (SEQ ID NO: 356) with a K D of less than 0.5 nM as measured in a surface plasmon resonance assay;
(f) связывается с вариантом С5 человека R885C (SEQ ID NO: 357) с KD меньше чем 0,5 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;(f) binds to human C5 variant R885C (SEQ ID NO: 357) with a K D of less than 0.5 nM as measured in a surface plasmon resonance assay;
(g) блокирует опосредованный С5 человека классический путь (СР) гемолиза больше чем на 95% и с IC50 меньше чем 6 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;(g) blocks the human C5-mediated classical pathway (CP) of hemolysis by greater than 95% and with an IC 50 of less than 6 nM as measured in the hemolysis CP assay;
(h) блокирует опосредованный С5 человека альтернативный путь (АР) гемолиза больше чем на 70% и с IC50 меньше чем 165 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза;(h) blocks the human C5 mediated alternative pathway (AR) of hemolysis by more than 70% and with an IC 50 of less than 165 nM as measured by the hemolysis AR assay;
(i) ингибирует опосредованный С5 африканской зеленой мартышки СР гемолиз с IC50 меньше чем 185 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;(i) inhibits African green monkey C5 mediated CP hemolysis with an IC 50 of less than 185 nM as measured in the Hemolysis CP assay;
(j) ингибирует опосредованный С5 африканской зеленой мартышки АР гемолиз с IC50 меньше чем 235 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза;(j) inhibits African green monkey C5-mediated AR hemolysis with an IC 50 of less than 235 nM as measured by the AR hemolysis assay;
(k) ингибирует опосредованный С5 яванского макака СР гемолиз с IC50 меньше чем 145 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза; и (l) ингибирует опосредованный С5 яванского макака АР гемолиз с IC50 меньше чем 30 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза.(k) inhibits cynomolgus C5 mediated CP hemolysis with an IC 50 of less than 145 nM as measured in the CP hemolysis assay; and (l) inhibits cynomolgus C5 mediated AR hemolysis with an IC 50 of less than 30 nM as measured by the AR hemolysis assay.
В варианте осуществления 11 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 10, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области (CDR) тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащиеся в любой одной из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), перечисленных в табл. 1; и три CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в любой одной из последовательностей вариабельной области легкой цепи (LCVR), перечисленных в табл. 1.In Embodiment 11, the present invention includes an isolated antibody or antigen binding fragment according to any one of embodiments 1 to 10, wherein the antibody or antigen binding fragment comprises three heavy chain complementarity determining regions (CDRs) (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) contained in any one of heavy chain variable region (HCVR) sequences listed in Table 1. one; and three light chain CDRs (LCDR1, LCDR2, and LCDR3) contained in any one of the light chain variable region (LCVR) sequences listed in Table 1. one.
В варианте осуществления 12 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его анти- 31 039858 генсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 11, которые содержат:In Embodiment 12, the present invention includes an isolated antibody or anti-gene-binding fragment thereof according to any one of Embodiments 1 to 11, which comprises:
(а) домен HCDR1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 124, 140, 148, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 276, 292,(a) an HCDR1 domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 124, 140, 148, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 276, 292,
308, 324 и 340;308, 324 and 340;
(b) домен HCDR2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 126, 142, 150, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 278, 294, 310, 326 и 342;(b) an HCDR2 domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 126, 142, 150, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 278, 294, 310, 326 and 342;
(с) домен HCDR3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 128, 144, 152, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 280, 296, 312, 328 и 344;(c) an HCDR3 domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 128, 144, 152, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 280, 296, 312, 328 and 344;
(d) домен LCDR1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 116, 132, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 284, 300, 316, 332 и 348;(d) an LCDR1 domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 116, 132, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 284, 300, 316, 332 and 348;
(е) домен LCDR2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 118, 134, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 286, 302, 318, 334 и 350; и (f) домен LCDR3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 120, 136, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 288, 304, 320, 336 и 352.(e) an LCDR2 domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 118, 134, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 286, 302, 318, 334 and 350; and (f) an LCDR3 domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 120, 136, 168, 184, 200, 216, 232, 248 , 264, 288, 304, 320, 336 and 352.
В варианте осуществления 13 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 12, содержащее HCVR, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей HCVR, перечисленных в табл. 1.In Embodiment 13, the present invention includes an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 1 to 12, comprising an HCVR having an amino acid sequence selected from the group consisting of the HCVR sequences listed in Table 1. one.
В варианте осуществления 14 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 13, содержащие LCVR, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 1.In Embodiment 14, the present invention includes the isolated antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 13, comprising an LCVR having an amino acid sequence selected from the group consisting of the LCVR sequences listed in Table 1. one.
В варианте осуществления 15 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 11 до 14, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 98/114, 122/106, 98/130, 138/106, 146/106, 122/130, 146/114, 146/130, 138/130, 154/162, 170/178, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/258, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330 и 338/346.In Embodiment 15, the present invention includes an isolated antibody or antigen-binding fragment according to any one of Embodiments 11 to 14, comprising an HCVR/LCVR amino acid sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/ 42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 98/114, 122/106, 98/130, 138/106, 146/106, 122/130, 146/114, 146/130, 138/130, 154/162, 170/178, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/258, 274/282, 290/298, 306/314, 322 330 and 338/346.
В варианте осуществления 16 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 11 до 15, содержащие три CDR, содержащиеся в HCVR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, 98, 138 и 202; и три CDR, содержащиеся в LCVR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58, 106 и 210.In embodiment 16, the present invention includes an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of embodiments 11 to 15, comprising three CDRs contained in an HCVR selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 50, 98, 138, and 202; and three CDRs contained in an LCVR selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 58, 106 and 210.
В варианте осуществления 17, настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 16, содержащие CDR, выбранные из группы, состоящей из:In Embodiment 17, the present invention includes the isolated antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 16, comprising CDRs selected from the group consisting of:
(a) SEQ ID NO: 52, 54, 56, 60, 62 и 64;(a) SEQ ID NOs: 52, 54, 56, 60, 62 and 64;
(b) SEQ ID NO: 1000, 102, 104, 108, 110 и 112;(b) SEQ ID NOs: 1000, 102, 104, 108, 110 and 112;
(с) SEQ ID NO: 140, 142, 144, 108, 110 и 112 и (d) SEQ ID NO: 204, 206, 208, 212, 214 и 216.(c) SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 108, 110 and 112; and (d) SEQ ID NOs: 204, 206, 208, 212, 214 and 216.
В варианте осуществления 18 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 17, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCvR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50/58, 98/106, 138/106 и 202/210.In embodiment 18, the present invention includes an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to embodiment 17, comprising an HCvR/LCVR amino acid sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 50/58, 98/106, 138/106, and 202/ 210.
В варианте осуществления 19 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с С5 с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по варианту осуществления 17.In Embodiment 19, the present invention includes an antibody or antigen-binding fragment thereof that competes for binding to C5 with the antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 17.
В варианте осуществления 20 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 17.In embodiment 20, the present invention includes an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same epitope as the antibody or antigen-binding fragment thereof of embodiment 17.
В варианте осуществления 21 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 9 или 10, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, перечисленную в табл. 1, имеющую не больше 5 замен аминокислот.In embodiment 21, the present invention includes the antibody or antigen-binding fragment of embodiment 9 or 10 comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence listed in Table 1. 1 having no more than 5 amino acid substitutions.
В варианте осуществления 22 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 21, которые содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, перечисленную в табл. 1, имеющую не больше 5 замен аминокислот.In Embodiment 22, the present invention includes the antibody or antigen-binding fragment thereof of Embodiment 21, which comprise a light chain variable region comprising the amino acid sequence listed in Table 1. 1 having no more than 5 amino acid substitutions.
- 32 039858- 32 039858
В варианте осуществления 23 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 9 или 10, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с SEQ ID NO: 98.In embodiment 23, the present invention includes the antibody or antigen-binding fragment thereof of embodiment 9 or 10 comprising a heavy chain variable region having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 98.
В варианте осуществления 24 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 23, содержащие вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с SEQ ID NO: 106.In embodiment 24, the present invention includes the antibody or antigen-binding fragment thereof of embodiment 23 comprising a light chain variable region having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 106.
В варианте осуществления 25 настоящее изобретение включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, блокирующие расщепление С5 на С5а и С5Ь, которые содержат три CDR из HCVR, где HCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 122, 138, 146, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 274, 290, 306, 322 и 33 8; и три CDR из LCVR, где LCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 114, 130, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 282, 298, 314, 330 и 346.In Embodiment 25, the present invention includes an isolated monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, that blocks the cleavage of C5 into C5a and C5b, which contain three CDRs from HCVR, wherein the HCVR has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 122, 138, 146, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 274, 290, 306, 322 and 338; and three CDRs from LCVR, wherein the LCVR has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 114, 130, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 282, 298, 314, 330 and 346.
В варианте осуществления 26 настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с С5 в соответствии с любым одним из вариантов осуществления с 1 до 25, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.In Embodiment 26, the present invention includes a pharmaceutical composition comprising an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to C5 according to any one of Embodiments 1 to 25, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
В варианте осуществления 27 настоящее изобретение включает выделенную молекулу полинуклеотида, содержащего полинуклеотидную последовательность, которая кодирует HCVR антитела, как изложено в любом одном из вариантов осуществления с 1 до 25.In Embodiment 27, the present invention includes an isolated polynucleotide molecule comprising a polynucleotide sequence that encodes for an HCVR antibody as set forth in any one of Embodiments 1 to 25.
В варианте осуществления 28 настоящее изобретение включает выделенную молекулу полинуклеотида, содержащую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует LCVR антитела, как изложено в любом одном из вариантов осуществления с 1 до 25.In Embodiment 28, the present invention includes an isolated polynucleotide molecule comprising a polynucleotide sequence that encodes for an LCVR antibody as set forth in any one of Embodiments 1 to 25.
В варианте осуществления 29 настоящее изобретение включает вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность по варианту осуществления 27 или 28.In embodiment 29, the present invention includes a vector containing the polynucleotide sequence of embodiment 27 or 28.
В варианте осуществления 30 настоящее изобретение включает клетку, экспрессирующую вектор по варианту осуществления 29.In Embodiment 30, the present invention includes a cell expressing the vector of Embodiment 29.
В варианте осуществления 31 настоящее изобретение включает способ предотвращения, лечения или улучшения по меньшей мере одного симптома или показания заболевания или нарушения, связанного с С5, способ включает введения антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления с 1 до 25 нуждающемуся в этом субъекту.In Embodiment 31, the present invention includes a method for preventing, treating, or improving at least one symptom or indication of a C5-associated disease or disorder, the method comprising administering an antibody or antigen-binding fragment according to any one of Embodiments 1 to 25 to a subject in need thereof.
В варианте осуществления 32 настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 31, в котором заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из атипичного гемолитикоуремического синдрома (aHUS), пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH), возрастной дегенерации желтого пятна, географической атрофии, увеита, оптикомиелита, рассеянного склероза, инсульта, синдрома Гийена-Барре, травматического повреждения головного мозга, болезни Паркинсона, нарушений ненадлежащей или нежелательной активации комплемента, осложнений гемодиализа, сверхострого отторжения аллотрансплантата, отторжения ксенотрансплантата, индуцированной интерлейкином-2 токсичности во время терапии IL-2, воспалительных нарушений, воспаления при аутоиммунных заболеваниях, болезни Крона, респираторного дистресс-синдрома взрослых, термического повреждения, включая ожоги или обморожения, постишемических реперфузионных состояний, инфаркта миокарда, синдрома повышенной проницаемости капилляров, ожирения, диабета, болезни Альцгеймера, шизофрении, инсульта, эпилепсии, атеросклероза, васкулита, буллезного пемфигоида, С3-гломерулопатии, мембранопролиферативного гломерулонефрита, диабетической нефропатии, синдрома Альпорта, прогрессирующей почечной недостаточности, протеинурических заболеваний почек, реперфузионного повреждения при почечной ишемии, волчаночного нефрита, баллонной ангиопластики, постгемодиализного синдрома при сердечно-легочном шунтировании или почечном шунтировании, гемодиализа, почечной ишемии, реперфузии брыжеечной артерии после реконструкции аорты, инфекционного заболевания или сепсиса, нарушений иммунных комплексов и аутоиммунных заболеваний, почечных нарушений, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (SLE), SLE нефрита, пролиферативного нефрита, гемолитической анемии, астмы, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), эмфиземы, легочных эмболии и инфарктов, пневмонии и миастении гравис.In Embodiment 32, the present invention includes the method of Embodiment 31 wherein the disease or disorder is selected from the group consisting of atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS), paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH), age-related macular degeneration, geographic atrophy, uveitis, optomyelitis, multiple sclerosis, stroke, Guillain-Barré syndrome, traumatic brain injury, Parkinson's disease, inappropriate or unwanted complement activation disorders, hemodialysis complications, hyperacute allograft rejection, xenograft rejection, interleukin-2-induced toxicity during IL-2 therapy, inflammatory disorders, inflammation in autoimmune diseases, Crohn's disease, adult respiratory distress syndrome, thermal injury, including burns or frostbite, post-ischemic reperfusion conditions, myocardial infarction, capillary leak syndrome, obesity, diabetes a, Alzheimer's disease, schizophrenia, stroke, epilepsy, atherosclerosis, vasculitis, bullous pemphigoid, C3 glomerulopathy, membranoproliferative glomerulonephritis, diabetic nephropathy, Alport's syndrome, progressive renal failure, proteinuric kidney disease, reperfusion injury in renal ischemia, lupus nephritis, balloon angioplasty , post-hemodialysis syndrome in cardiopulmonary bypass or renal bypass, hemodialysis, renal ischemia, mesenteric artery reperfusion after aortic reconstruction, infectious disease or sepsis, immune complex disorders and autoimmune diseases, renal disorders, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), SLE nephritis, proliferative nephritis, hemolytic anemia, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema, pulmonary embolism and infarction, pneumonia and myasthenia gravis.
В варианте осуществления 33 настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 31, в котором заболевание или нарушение представляет собой aHUS.In Embodiment 33, the present invention includes the method of Embodiment 31 wherein the disease or disorder is aHUS.
В варианте осуществления 34 настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 31, в котором заболевание или нарушение представляет собой PNH.In Embodiment 34, the present invention includes the method of Embodiment 31 wherein the disease or disorder is PNH.
В варианте осуществления 35 настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 31-34, в котором фармацевтическую композицию вводят профилактически или терапевтически субъекту, нуждающемуся в этом.In Embodiment 35, the present invention includes the method of any one of Embodiments 31-34, wherein the pharmaceutical composition is administered prophylactically or therapeutically to a subject in need thereof.
В варианте осуществления 36 настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления с 31 до 35, в котором фармацевтическую композицию вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством.In Embodiment 36, the present invention includes the method of any one of Embodiments 31 to 35, wherein the pharmaceutical composition is administered in combination with a second therapeutic agent.
- 33 039858- 33 039858
В варианте осуществления 37 настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 36, в котором второе терапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из антикоагулянта, противовоспалительного лекарственного средства, антигипертензивного средства, иммуносупрессорного средства, понижающего липиды средства, средства против CD20, такого как ритуксимаб, средства против TNF, такого как инфликсимаб, противосудорожного средства, ингибитора С3, второго антитела против С5 и антитромботического средства.In Embodiment 37, the present invention includes the method of Embodiment 36, wherein the second therapeutic agent is selected from the group consisting of an anticoagulant, an anti-inflammatory drug, an antihypertensive agent, an immunosuppressive agent, a lipid lowering agent, an anti-CD20 agent such as rituximab, an anti- TNF such as infliximab, an anticonvulsant, a C3 inhibitor, a second anti-C5 antibody, and an antithrombotic agent.
В варианте осуществления 38 настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления с 31 до 37, в котором фармацевтическую композицию вводят подкожно, внутривенно, внутрикожно, интраперитонеально, перорально, внутримышечно или внутрь черепа.In Embodiment 38, the present invention includes the method of any one of Embodiments 31 to 37, wherein the pharmaceutical composition is administered subcutaneously, intravenously, intradermally, intraperitoneally, orally, intramuscularly, or into the skull.
ПримерыExamples
Следующие примеры приведены с тем, чтобы предоставить средним специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как получать и использовать способы и композиции по изобретению, и не предназначены для того, чтобы ограничивать объем того, что авторы изобретения считают своим изобретением. Предприняты усилия к тому, чтобы обеспечить точность в отношении используемых чисел (например, количество, температура и т.д.), но некоторые экспериментальные ошибки и отклонения следует принимать во внимание. Если не указано иное, части представляют собой массовые части, молекулярная масса представляет собой усредненную молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, комнатная температура составляет приблизительно 25°С и давление равно атмосферному или близко к нему.The following examples are provided to provide those of ordinary skill in the art with a full disclosure and description of how to make and use the methods and compositions of the invention, and are not intended to limit the scope of what the inventors consider their invention. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to the numbers used (eg quantity, temperature, etc.), but some experimental errors and deviations should be taken into account. Unless otherwise indicated, parts are parts by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, room temperature is about 25° C., and pressure is at or near atmospheric pressure.
Пример 1. Создание антител человека к белку фактора 5 комплемента (С5).Example 1 Creation of Human Antibodies to Complement Factor 5 (C5) Protein.
Антитела человека к белку С5 создавали у мыши VELOCIMMUNE®, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей к цепи иммуноглобулина человека. Мышей иммунизировали очищенным сывороточным белком С5 человека (Calbiochem № по каталогу 20-4888).Human antibodies to the C5 protein were generated in a VELOCIMMUNE® mouse containing DNA encoding heavy and light chain variable regions for the human immunoglobulin chain. Mice were immunized with purified human serum C5 protein (Calbiochem cat# 20-4888).
Мониторинг антительного иммунного ответа осуществляли посредством С5-специфического иммунологического анализа. Когда достигали желаемого иммунного ответа, спленоциты собирали и сливали с миеломными клетками мыши, чтобы сохранять их жизнеспособность и формировать гибридомные клеточные линии. Осуществляли скрининг и отбор гибридомных клеточных линий для того, чтобы идентифицировать клеточные линии, которые продуцируют С5-специфические антитела. Клеточные линии использовали для получения нескольких химерных антител против С5 (т.е. антител, содержащих вариабельные домены человека и константные домены мыши); образцовые антитела, созданные таким образом, обозначали как H2M11683N и H2M11686N.Monitoring of the antibody immune response was carried out by C5-specific immunoassay. When the desired immune response was achieved, the splenocytes were harvested and fused with mouse myeloma cells to maintain their viability and form hybridoma cell lines. Carried out screening and selection of hybridoma cell lines in order to identify cell lines that produce C5-specific antibodies. The cell lines were used to generate several chimeric anti-C5 antibodies (ie, antibodies containing human variable domains and mouse constant domains); exemplary antibodies thus generated were designated as H2M11683N and H2M11686N.
Антитела против С5 также выделяли непосредственно из антиген-положительных В-клеток мышей без слияния с миеломными клетками, как описано в патенте США 7582298, включенном в настоящее описание конкретно по ссылке в полном объеме. Используя этот способ, получали несколько антител полностью человека против С5 (т.е. антител, содержащих вариабельные домены человека и константные домены человека); образцовые антитела, созданные таким образом, обозначали как Н4Н12159Р, Н4Н12161Р, Н4Н12163Р, Н4Н12164Р, Н4Н12166Р, Н4Н12167Р, Н4Н12168Р, Н4Н12169Р, Н4Н12170Р, Н4Н12171Р, Н4Н12175Р, Н4Н12176Р2, Н4Н12177Р2 и Н4Н12183Р2.Anti-C5 antibodies were also isolated directly from mouse antigen-positive B cells without fusion with myeloma cells, as described in US Pat. No. 7,582,298, incorporated herein by reference in its entirety. Using this method, several fully human anti-C5 antibodies (ie, antibodies containing human variable domains and human constant domains) were generated; образцовые антитела, созданные таким образом, обозначали как Н4Н12159Р, Н4Н12161Р, Н4Н12163Р, Н4Н12164Р, Н4Н12166Р, Н4Н12167Р, Н4Н12168Р, Н4Н12169Р, Н4Н12170Р, Н4Н12171Р, Н4Н12175Р, Н4Н12176Р2, Н4Н12177Р2 и Н4Н12183Р2.
Биологические свойства образцовых антител, созданных в соответствии со способами из этого примера, описаны подробно в примерах, приведенных далее.The biological properties of exemplary antibodies created in accordance with the methods of this example are described in detail in the examples below.
Пример 2. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей.Example 2. Amino acid and nucleotide sequences of the variable regions of the heavy and light chains.
В табл. 1 приведены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и CDR выбранных антител против С5 по изобретению.In table. 1 shows the amino acid sequence identifiers for the heavy and light chain variable regions and CDRs of selected anti-C5 antibodies of the invention.
- 34 039858- 34 039858
Таблица 1Table 1
Идентификаторы аминокислотных последовательностей________Amino acid sequence identifiers_______
Соответствующие идентификаторы последовательностей нуклеиновой кислоты приведены в табл. 2.The corresponding nucleic acid sequence identifiers are shown in Table 1. 2.
- 35 039858- 35 039858
Таблица 2table 2
Идентификаторы последовательностей нуклеиновой кислотыNucleic acid sequence identifiers
Антитела обычно обозначают в настоящем описании в соответствии со следующей номенклатурой:Antibodies are usually designated in the present description in accordance with the following nomenclature:
префикс Fc (например Н4Н, Н2М и т.д.), за которым следует цифровой идентификатор (например 11686, 12166, 12183 и т.д., как показано в табл. 2), за которым следует суффикс Р, Р2 или N. Таким образом, в соответствии с этой номенклатурой антитело можно обозначать в настоящем описании, например, как H2M1168 6N, Н4Н12183Р2, Н4Н12168Р и т.д. Префиксы Н4Н и Н2М в обозначениях антител, используемых в настоящем описании, указывают на конкретный изотип Fc-области антитела. Например, Н4Н антитело имеет Fc IgG4 человека, содержащую мутацию серина в пролин в шарнирной области (S108P), чтобы содействовать стабилизации димера, а Н2М антитело имеет Fc IgG2 мыши (изотип а или b) (все вариабельные области являются полностью человеческими, как обозначено с помощью первой Н в обозначении антитела). Специалист в данной области примет во внимание, что антитело, содержащее Fc конкретного изотипа, можно превращать в антитело с Fc другого изотипа (например, антитело с Fc IgG1 мыши можно превращать в антитело с IgG4 человека и т.д.), но в любом случае вариабельные домены (в том числе CDR), которые обозначены с помощью цифровых идентификаторов, которые представлены в табл. 2, будут оставаться теми же, и ожидают, что свойства связывания с антигеном будут идентичными или по существу схожими, независимо от природы домена Fc.an Fc prefix (e.g. H4H, H2M, etc.) followed by a numeric identifier (e.g. 11686, 12166, 12183, etc., as shown in Table 2) followed by a P, P2, or N suffix. Thus, in accordance with this nomenclature, an antibody can be referred to herein, for example, as H2M1168 6N, H4H12183P2, H4H12168P, etc. The prefixes H4H and H2M in the designations of antibodies used in the present description indicate the specific isotype of the Fc region of the antibody. For example, the H4H antibody has a human IgG4 Fc containing a serine to proline mutation in the hinge region (S108P) to help stabilize the dimer, and the H2M antibody has a mouse IgG2 Fc (isotype a or b) (all variable regions are fully human, as indicated with using the first H in the designation of the antibody). One skilled in the art will appreciate that an antibody containing a particular Fc isotype can be converted into an antibody with another Fc isotype (e.g., an antibody with a mouse IgG1 Fc can be converted into an antibody with a human IgG4, etc.), but in any case variable domains (including CDR), which are designated using digital identifiers, which are presented in table. 2 will remain the same, and antigen binding properties are expected to be identical or substantially similar, regardless of the nature of the Fc domain.
В определенных вариантах осуществления выбранные антитела с Fc IgG1 мыши превращали в ан- 36 039858 титела с Fc IgG4 человека. В одном из вариантов осуществления домен Fc IgG4 содержит две или больше аминокислотные замены, как раскрыто в US 20100331527.In certain embodiments, selected mouse IgG1 Fc antibodies are converted into human IgG4 Fc antibodies. In one embodiment, an IgG4 Fc domain contains two or more amino acid substitutions as disclosed in US 20100331527.
Для того чтобы создавать мутированные антитела, различные остатки в определяющих комплементарность областях (CDR) из Н4Н12166Р мутировали в гистидин для того, чтобы создавать 9 мутированных антител, идентифицированных как от Н4Н12166Р2 до Н4Н12166Р10. Показано, что гистидиновые мутации в CDR придают зависимость от рН связыванию с целевым антигеном, что ведет к усовершенствованной фармакокинетике (Igawa et al. 2010, Nat. Biotechnol. 28:1203-1207).In order to generate mutated antibodies, various residues in the complementarity determining regions (CDRs) of H4H12166P were mutated to histidine in order to generate 9 mutated antibodies identified as H4H12166P2 to H4H12166P10. Histidine mutations in the CDR have been shown to confer pH dependence on binding to the target antigen, leading to improved pharmacokinetics (Igawa et al. 2010, Nat. Biotechnol. 28:1203-1207).
Контрольные конструкции, используемые в следующих примерах.Control constructs used in the following examples.
Следующие контрольные конструкции (антитела против С5) включали в эксперименты, раскрытые в настоящем описании, в целях сравнения: объект сравнения 1, моноклональное антитело против С5 человека, имеющее последовательности VH/VL из антитела h5G1.1 в соответствии с патентом США № 6355245 (Alexion Pharmaceuticals, Inc.); и объект сравнения 2, моноклональное антитело человека против С5 человека, имеющее последовательности VH/VL из антитела 8109 в соответствии с публикацией патентной заявки США № 2013/0022615 (Novartis).The following control constructs (anti-C5 antibodies) were included in the experiments disclosed herein for comparison purposes: Comparator 1, a human anti-C5 monoclonal antibody having the VH/VL sequences from the h5G1.1 antibody according to US Pat. No. 6,355,245 (Alexion Pharmaceuticals, Inc.); and Comparative 2, a human anti-human C5 monoclonal antibody having the VH/VL sequences from antibody 8109 according to US Patent Application Publication No. 2013/0022615 (Novartis).
Пример 3. Связывание антитела с С5, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса.Example 3 Antibody binding to C5 as determined by surface plasmon resonance.
Равновесные константы диссоциации (значения KD) для связывания С5 с очищенными антителами против С5 определяли с использованием биосенсорного анализа поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени на приборе Biacore T200. Поверхность датчика Biacore дериватизировали посредством аминного связывания с моноклональным антителом мыши против Fc человека (GE Healthcare, № BR-1008-39), чтобы захватывать антитела против С5, экспрессируемые с константными областями Fc человека. Исследования связывания Biacore проводили в подвижном буфере HBST (0,01 M HEPES рН 7,4, 0,15М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% об./об. поверхностно-активного средства Р20). С5 человека получали из коммерческого источника (EMD). Другие реактивы С5 экспрессировали с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (впоследствии обозначаемой как C5-mmh). Также экспрессировали реактивы C5-mmh человека, содержащие гистидиновые и цистеиновые точечные мутации по аргинину 885 (впоследствии обозначаемые как С5 R885H-mmh и С5 R885C-mmh соответственно). Различные концентрации С5 человека, С5 человека R885H-mmh (SEQ ID NO: 356), С5 человека R885C-mmh (SEQ ID NO: 357) и C5 обезьяны-mmh (SEQ ID NO: 358) (в диапазоне от 100 до 1,23 нМ, 3-кратные разведения), полученные в подвижном буфере HBST, впрыскивали на поверхность с захваченным антителом против С5 при скорости потока 30 мкл/мин. Осуществляли мониторинг ассоциации всех С5 реактивов с каждым из захваченных моноклональных антител в течение 3 мин и осуществляли мониторинг их диссоциации в подвижном буфере HBST в течение 8 мин. Все эксперименты по кинетике связывания осуществляли при 25 или 37°С. Кинетические константы скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) определяли посредством аппроксимации сенсограмм реального времени к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения аппроксимации кривых Scrubber 2.0с. Равновесные константы диссоциации связывания (KD) и диссоциационное время полужизни (t1/2) вычисляли по кинетическим константам скорости: KD(M) = kd/ka и t1/2 (мин) = ln2/ ( 60xkd).Equilibrium dissociation constants (KD values) for C5 binding to purified anti-C5 antibodies were determined using real-time surface plasmon resonance biosensor analysis on a Biacore T200 instrument. The Biacore sensor surface was derivatized by amine coupling with a mouse anti-human Fc monoclonal antibody (GE Healthcare, no. BR-1008-39) to capture anti-C5 antibodies expressed with human Fc constant regions. Biacore binding studies were performed in HBST running buffer (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v surfactant P20). Human C5 was obtained from a commercial source (EMD). Other C5 reagents were expressed with a C-terminal myc-myc-hexahistidine tag (hereinafter referred to as C5-mmh). Human C5-mmh reagents containing histidine and cysteine point mutations at arginine 885 (hereinafter referred to as C5 R885H-mmh and C5 R885C-mmh, respectively) were also expressed. Different concentrations of human C5, human C5 R885H-mmh (SEQ ID NO: 356), human C5 R885C-mmh (SEQ ID NO: 357), and monkey C5-mmh (SEQ ID NO: 358) (range 100 to 1, 23 nM, 3-fold dilutions) prepared in HBST running buffer was injected onto the surface with captured anti-C5 antibody at a flow rate of 30 μl/min. The association of all C5 reagents with each of the captured monoclonal antibodies was monitored for 3 min and their dissociation was monitored in HBST running buffer for 8 min. All experiments on the kinetics of binding was carried out at 25 or 37°C. The kinetic rate constants of association (k a ) and dissociation (kd) were determined by fitting real time sensorgrams to a 1:1 binding model using Scrubber 2.0c curve fitting software. Binding equilibrium dissociation constants (KD) and dissociation half-life (t 1/2 ) were calculated from the kinetic rate constants: K D (M) = kd/k a and t 1/2 (min) = ln 2 / ( 60xkd).
Кинетические параметры связывания для связывания С5 человека с антителами против С5 при 25 и 37°С представлены в табл. 3 и 4.Binding kinetic parameters for human C5 binding to anti-C5 antibodies at 25 and 37° C. are shown in Table 1. 3 and 4.
Таблица 3Table 3
Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека при 25 °СKinetic Binding Parameters for Anti-C5 Monoclonal Antibodies Binding to Human C5 at 25°C
- 37 039858- 37 039858
Таблица 4Table 4
Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека при 37°СKinetic Binding Parameters for Anti-C5 Monoclonal Antibodies Binding to Human C5 at 37°C
- 38 039858- 38 039858
Связывание С5 обезьяны-mmh с антителами против С5 при 25 и 37°С представлено в табл. 5 и 6.The binding of C5 monkey-mmh with antibodies against C5 at 25 and 37°C is presented in table. 5 and 6.
Таблица 5Table 5
Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 обезьяны-mmh при 25°СKinetic Binding Parameters for Anti-C5 Monoclonal Antibodies Binding to Monkey C5-mmh at 25°C
- 39 039858- 39 039858
N/A - не доступно;N/A - not available;
*SS - анализ устойчивого состояния.*SS - steady state analysis.
Таблица 6Table 6
Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 обезьяны-mmh при 37°СBinding kinetic parameters for anti-C5 monoclonal antibody binding to monkey C5-mmh at 37°C
- 40 039858- 40 039858
Связывание С5 человека R885H-mmh и С5 человека R885C-mmh с антителами против С5 при 25°С представлено в табл. 7 и 8 соответственно.The binding of human C5 R885H-mmh and human C5 R885C-mmh to anti-C5 antibodies at 25° C. is shown in Table 1. 7 and 8, respectively.
Таблица 7Table 7
Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека R885H-mmh при 25°СKinetic Binding Parameters for Anti-C5 Monoclonal Antibodies Binding to Human C5 R885H-mmh at 25°C
Таблица 8Table 8
- 41 039858- 41 039858
Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека R885C-mmh при 25°СKinetic Binding Parameters for Anti-C5 Monoclonal Antibodies Binding to Human C5 R885C-mmh at 25°C
Связывание С5 человека R885H-mmh и С5 человека R885C-mmh с антителами против С5 при 37°С представлено в табл. 9 и 10 соответственно.The binding of human C5 R885H-mmh and human C5 R885C-mmh to anti-C5 antibodies at 37° C. is shown in Table 1. 9 and 10 respectively.
- 42 039858- 42 039858
Таблица 9Table 9
Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека R885H-mmh при 37°СKinetic Binding Parameters for Anti-C5 Monoclonal Antibodies Binding to Human C5 R885H-mmh at 37°C
- 43 039858- 43 039858
Таблица 10Table 10
Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека R885C-mmh при 37°СKinetic Binding Parameters for Anti-C5 Monoclonal Antibodies Binding to Human C5 R885C-mmh at 37°C
При 25°С все 25 антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека со значениями KD в диапазоне от 73 пМ до 8,4 нМ, как показано в табл. 3. При 37°С антитела против С5 по изобретению связывались с С5 человека со значениями KD в диапазоне от 103 пМ до 18,5 нМ, как показано в табл. 4. При 25°С 25 из 25 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 обезьяны-mmh со значениями KD в диапазоне от 133 пМ до 64 нМ, как показано в табл.5. При 37°С 25 из 25 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 обезьяны-mmh со значениями KD в диапазоне от 133 пМ до 118 нМ, как показано в табл.6. При 25°С 16 из 16 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека R885H-mmh со значениями KD в диапазоне от 147 пМ до 10,9 нМ, как показано в табл. 7. При 25°С 16 из 16 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека R885C-mmh со значениями KD в диапазоне от 251 пМ до 190 нМ, как показано в табл. 8. При 37°С 16 из 16 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека R885Hmmh со значениями KD в диапазоне от 1,49 до 69,4 нМ, как показано в табл. 9. При 25°С 16 из 16 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека R885C-mmh со значениями KD в диапазоне от 1,74 до 159 нМ, как показано в табл. 10.At 25° C., all 25 anti-C5 antibodies of the invention bound human C5 with KD values ranging from 73 pM to 8.4 nM, as shown in Table 1. 3. At 37° C., the anti-C5 antibodies of the invention bound human C5 with K D values ranging from 103 pM to 18.5 nM, as shown in Table 3. 4. At 25° C., 25 of the 25 tested anti-C5 antibodies of the invention bound monkey-mmh C5 with KD values ranging from 133 pM to 64 nM, as shown in Table 5. At 37° C., 25 of the 25 tested anti-C5 antibodies of the invention bound monkey-mmh C5 with KD values ranging from 133 pM to 118 nM, as shown in Table 6. At 25° C., 16 of the 16 tested anti-C5 antibodies of the invention bound to human C5 R885H-mmh with KD values ranging from 147 pM to 10.9 nM, as shown in Table 1. 7. At 25° C., 16 out of 16 tested anti-C5 antibodies of the invention bound to human C5 R885C-mmh with KD values ranging from 251 pM to 190 nM, as shown in Table 7. 8. At 37° C., 16 of the 16 anti-C5 antibodies tested according to the invention bound to human C5 R885Hmmh with KD values ranging from 1.49 to 69.4 nM, as shown in Table 8. 9. At 25° C., 16 out of 16 anti-C5 antibodies tested according to the invention bound to human C5 R885C-mmh with KD values ranging from 1.74 to 159 nM, as shown in Table 9. ten.
Пример 4. Связывание антител с С5 при различных рН.Example 4 Antibody binding to C5 at different pH.
Эффект рН, оказываемый на скорость диссоциации рекомбинантного С5 человека, связанного с очищенными моноклональными антителами против С5, определяли с использованием биосенсора поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени на приборе Biacore T200. Поверхность датчика Biacore сначала дериватизировали посредством аминного связывания с моноклональным антителом мыши против Fc человека (GE, № BR-1008-39) для того, чтобы захватывать моноклональные антитела против С5, экспрессируемые с Fc IgG4 человека. Все исследования связывания Biacore осуществляли с использованием двух подвижных буферов PBS-T рН 7,4 (0,01 М Na2HPO4/NaH2PO4, 0,15 М NaCl, 0,05% об./об. Tween-20, рН корректировали до 7,4) и PBS-T рН 6,0 (0,01 М Na2HPO4/NaH2PO4, 0,15 М NaCl, 0,05% об./об. Tween-20, рН корректировали до 6,0). Различные концентрации С5 человека (EMD, № по каталогу 204888) или С5 обезьяны.mmh (полученного в PBS-T рН 7,4 подвижном буфере) в диапаThe effect of pH on the dissociation rate of recombinant human C5 bound to purified anti-C5 monoclonal antibodies was determined using a real-time surface plasmon resonance biosensor on a Biacore T200 instrument. The surface of the Biacore sensor was first derivatized by amine coupling with a mouse anti-human Fc monoclonal antibody (GE, no. BR-1008-39) in order to capture anti-C5 monoclonal antibodies expressed with human IgG4 Fc. All Biacore binding studies were performed using two PBS-T pH 7.4 running buffers (0.01 M Na 2 HPO 4 /NaH 2 PO 4 , 0.15 M NaCl, 0.05% v/v Tween-20 , pH adjusted to 7.4) and PBS-T pH 6.0 (0.01 M Na2HPO4/NaH2PO4, 0.15 M NaCl, 0.05% v/v Tween-20, pH adjusted to 6.0 ). Various concentrations of human C5 (EMD, cat. no. 204888) or monkey C5.mmh (prepared in PBS-T pH 7.4 running buffer) in diapa
- 44 039858 зоне от 100 до 11,11 нМ, 3-кратные разведения впрыскивали на поверхность с захваченным моноклональным антителом против С5 в течение 3 мин при скорости потока 50 мкл/мин и осуществляли мониторинг их диссоциации в двух подвижных буферах PBS-T рН 7,4 и PBS-T рН 6,0 в течение 6 мин. Все эксперименты по кинетике связывания осуществляли при 25 и 37°С. Кинетическую константу диссоциации (kd) определяли посредством аппроксимации сенсограмм реального времени к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения аппроксимации кривых Scrubber 2.0с. Диссоциационное время полужизни (t1/2) при связывании вычисляли по kd как:- 44 039858 zone from 100 to 11.11 nM, 3-fold dilutions were injected onto the surface with captured anti-C5 monoclonal antibody for 3 min at a flow rate of 50 μl/min and their dissociation was monitored in two moving buffers PBS-T pH 7 .4 and PBS-T pH 6.0 for 6 min. All experiments on the kinetics of binding was carried out at 25 and 37°C. The kinetic dissociation constant (kd) was determined by fitting real time sensorgrams to a 1:1 binding model using Scrubber 2.0c curve fitting software. The dissociative half-life (t 1/2 ) upon binding was calculated from kd as:
t1/2(MHH) = ln(2)/60xkd.t1/2(MHH) = ln(2)/60xkd.
Соотношения времени полужизни для связывания С5 человека с различными моноклональными антителами против С5 при 25 и 37°С в двух подвижных буферах PBS-T рН 7,4 и PBS-T рН 6,0 представлены в табл. 11 и 12.Half-life ratios for binding of human C5 to various anti-C5 monoclonal antibodies at 25 and 37° C. in two running buffers PBS-T pH 7.4 and PBS-T pH 6.0 are shown in Table 1. 11 and 12.
Таблица 11Table 11
Соотношения времени полужизни выбранных антител против С5 для С5 человека при 25°СHalf-life ratios of selected anti-C5 antibodies for human C5 at 25°C
IC - неубедительно.IC - unconvincing.
- 45 039858- 45 039858
Таблица 12 Соотношения времени полужизни выбранных антител против С5 для С5 человека при 37 °СTable 12 Half-life ratios of selected anti-C5 antibodies for human C5 at 37°C
IC - неубедительно.IC - unconvincing.
Соотношения времени полужизни для связывания С5 обезьяны с различными моноклональными антителами против С5 при 25 и 37°С в двух подвижных буферах PBS-T рН 7,4 и PBS-T рН 6,0 представлены в табл. 13 и 14.The half-life ratios for monkey C5 binding to various anti-C5 monoclonal antibodies at 25 and 37° C. in two running buffers PBS-T pH 7.4 and PBS-T pH 6.0 are shown in Table 1. 13 and 14.
- 46 039858- 46 039858
Таблица 13Table 13
Соотношения времени полужизни выбранных антител против С5 для С5 обезьяны при 25°С______Half-life ratios of selected anti-C5 antibodies for C5 monkey at 25°C______
IC - неубедительно.IC - unconvincing.
Таблица 14Table 14
Соотношения времени полужизни выбранных антител против С5 для С5 обезьяны при 37°СHalf-life ratios of selected anti-C5 antibodies for C5 monkey at 37°C
IC - неубедительно.IC - unconvincing.
Как показано в табл. 11-14, выбранные антитела против С5 демонстрировали рН-зависимое связывание, как видно по соотношениям t1/2.As shown in Table. 11-14, the selected anti-C5 antibodies exhibited pH dependent binding as seen from the t 1/2 ratios.
- 47 039858- 47 039858
Пример 5. Перекрестная конкуренция Octet между антителами против С5.Example 5 Octet cross-competition between anti-C5 antibodies.
Конкуренцию связывания между моноклональными антителами против С5 (mAb) определяли с использованием анализа интерферометрии биослоев без метки в реальном времени на биосенсоре Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Весь эксперимент осуществляли при 25°С в 0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,05% об./об. поверхностно-активного средства Tween-20, 0,1 мг/мл BSA (буфер Octet HBS-P) при встряхивании пластины на скорости 1000 об./мин. Для того чтобы оценивать, способны ли два антитела конкурировать друг с другом за связывание с соответствующими им эпитопами на С5 человека (hC5, очищенный от плазмы, EMD), приблизительно 1,5 нм mAb против С5 человека сначала захватывали на кончиках биосенсора Octet, покрытых антителом против hFc (Pall ForteBio Corp., № 18-5060), посредством погружения кончиков на 3 мин в лунки, содержащие раствор mAb против С5 человека 50 мкг/мл (далее обозначают как mAb1). Затем кончики биосенсора с захваченными антителами насыщали блокирующим Н4Н изотипическим контрольным mAb (далее обозначают как блокирующее mAb) посредством погружения в лунки, содержащие раствор блокирующего mAb 200 мкг/мл на 4 мин. Затем кончики биосенсора погружали в лунки, содержащие со-комплексный раствор 50 нМ hC5 и 1 мкМ второго mAb против С5 человека (далее обозначают как mAb2), который предварительно инкубировали в течение 2 ч, на 4 мин. Кончики биосенсора промывали в буфере Octet HBS-P между всеми стадиями эксперимента. Мониторинг ответа связывания в реальном времени осуществляли во время хода эксперимента и регистрировали ответ связывания в конце каждой стадии. Ответ связывания С5 человека, предварительно образовавшего комплекс с mAb2, на mAb1 корректировали по фоновому связыванию, сравнивали и определяли конкурентное/неконкурентное поведение различных моноклональных антител против С5.Binding competition between anti-C5 monoclonal antibodies (mAb) was determined using real-time labelless biolayer interferometry analysis on an Octet RED384 biosensor (Pall ForteBio Corp.). The entire experiment was carried out at 25° C. in 0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% v/v. Tween-20 surfactant, 0.1 mg/ml BSA (Octet HBS-P buffer) with plate shaking at 1000 rpm. In order to assess whether two antibodies were able to compete with each other for binding to their respective epitopes on human C5 (plasma-purified hC5, EMD), approximately 1.5 nM anti-human C5 mAb was first captured on antibody-coated Octet biosensor tips. against hFc (Pall ForteBio Corp., no. 18-5060), by immersing the tips for 3 minutes in wells containing a solution of anti-human C5 mAb 50 μg/ml (hereinafter referred to as mAb1). The captured antibody biosensor tips were then saturated with the H4H blocking isotype control mAb (hereinafter referred to as the blocking mAb) by immersion in wells containing a 200 μg/mL blocking mAb solution for 4 min. Then, the biosensor tips were immersed in wells containing a co-complex solution of 50 nM hC5 and 1 μM of the second anti-human C5 mAb (hereinafter referred to as mAb2), which was preincubated for 2 h, for 4 min. The biosensor tips were washed in Octet HBS-P buffer between all stages of the experiment. Real-time monitoring of the binding response was carried out during the course of the experiment and the binding response was recorded at the end of each stage. The binding response of human C5 previously complexed with mAb2 to mAb1 was corrected for background binding, compared, and the competitive/non-competitive behavior of various anti-C5 monoclonal antibodies was determined.
В табл. 15 в явной форме определены зависимости для антител, конкурирующих в обоих направлениях, независимо от порядка связывания.In table. 15 explicitly defines dependencies for antibodies competing in both directions, regardless of the binding order.
Таблица 15Table 15
Перекрестная конкуренция между парами выбранных антител против С5Cross-competition between pairs of selected anti-C5 antibodies
Пример 6. Ингибирование С5-опосредованной комплемент-зависимой цитотоксичности в биоанализе В-клеток.Example 6 Inhibition of C5-Mediated Complement-Dependent Cytotoxicity in a B Cell Bioassay.
В этом примере описан биоанализ для того, чтобы тестировать роль С5 с использованием антитела против CD20 в классическом пути комплемента. Показано, что терапевтические антитела против CD20 кThis example describes a bioassay to test the role of C5 using an anti-CD20 antibody in the classical complement pathway. It has been shown that therapeutic antibodies against CD20 to
- 48 039858 специфическому антигену CD20 клеточной поверхности В-клеток ведут к CDC в В-клетках (Glennie et al. 2007, Mol. Immunol. 44:3823-3837), и ранее описан CDC анализ с использованием клеточных линий, экспрессирующих CD20 (Flieger et al. 2000, Cell. Immunol. 204:55-63). Клетки Daudi, В-клеточную линию человека, экспрессирующую CD20, сыворотку с сохраненным комплементом или истощенную по С5 сыворотку с экзогенными вариантами С5 и антитело против CD20 (антитело, содержащее VH/VL из 2F2 из патента США № 8529902) использовали для того, чтобы оценивать роль активности С5 в CDC.- 48 039858 cell surface specific antigen CD20 of B cells leads to CDC in B cells (Glennie et al. 2007, Mol. Immunol. 44:3823-3837), and CDC analysis using cell lines expressing CD20 has been previously described (Flieger et al 2000, Cell Immunol 204:55-63). Daudi cells, a human B cell line expressing CD20, complement conserved or C5-depleted serum with exogenous C5 variants, and an anti-CD20 antibody (antibody containing VH/VL from 2F2 from US Pat. No. 8,529,902) were used to evaluate the role of C5 activity in CDC.
В биоанализе CDC для С5 клетки Daudi высевали в 96-луночные аналитические планшеты по 10000 клеток/лунка или в RPMI, содержащей 10% FBS, пенициллин/стрептомицин, L-глутамин, пируват натрия и заменимые аминокислоты (полная среда RPMI), или в RPMI, содержащей 1% BSA, пенициллин/стрептомицин и L-глутамин (RPMI/BSA). Все анализы с тестированием мутированных антител против hC5, наряду с тестированием не мутированных антител с С5-содержащей сывороткой человека, проводили в полной среде RPMI, тогда как анализы с тестированием не мутированных антител с сывороткой африканской зеленой мартышки и вариантами С5 человека проводили в среде RPMI/BSA. Для того чтобы измерять CDC с использованием сыворотки человека или обезьяны, антитело против CD20 разводили 1:3 от 100 нМ до 2 пМ (включая контрольный образец, не содержащий антитело) и инкубировали с клетками в течение 10 мин при 25°С, после чего следовало добавление 1,66% сыворотки или 1,66% истощенной по С5 сыворотки и 6,6 нМ вариантов С5 белка. Количество белка С5, добавляемое в истощенную по С5 сыворотку, основано на приводимом значении концентрации С5 в сыворотке человека 0,37 мкМ (Rawal et al. 2008, J. Biol. Chem. 283:7853-7863). Для того чтобы тестировать ингибирование CDC антителом к С5, антитела к С5 разводили 1:3 от 100 нМ до 2 пМ (включая контрольный образец, не содержащий антитело) и инкубировали с 1,66% сывороткой или 1,66% истощенной по С5 сывороткой и 6,6 нМ вариантов С5 белка в течение 30 мин. За 10 мин перед добавлением антител с сывороткой к клеткам антитело против CD20 добавляли к клеткам по 1, 2, 3, 3,5, 7, 10 или 30 нМ. По окончании инкубации с антителом против CD20 смесь антитело/сыворотка добавляли к клеткам. Цитотоксичность измеряли после 3,5 ч инкубации при 37°С и в 5% СО2, после чего следовало 15 мин инкубации при 25°С и добавление реактива CytoTox-Glo™ (Promega, № G9292). CytoTox-Glo™ представляет собой люминесцентный реактив, который измеряет гибель клеток так, что увеличенную люминесценцию наблюдают при увеличенной цитотоксичности (измеряют в относительных световых единицах, RLU). Клетки без обработки в контрольных лунках лизировали посредством обработки дигитонином непосредственно после добавления реактива CytoTox-Glo™ для того, чтобы определять максимальную гибель клеток. Люминесценцию в планшетах считывали с помощью прибора Victor X (Perkin Elmer) через 15 мин после добавления CytoTox-Glo™. Процентную долю цитотоксичности вычисляли с использованием значений RLU, используя следующее уравнение:In the CDC bioassay for C5, Daudi cells were seeded in 96-well assay plates at 10,000 cells/well, or in RPMI containing 10% FBS, penicillin/streptomycin, L-glutamine, sodium pyruvate, and non-essential amino acids (RPMI complete medium), or in RPMI containing 1% BSA, penicillin/streptomycin and L-glutamine (RPMI/BSA). All assays testing for mutated antibodies against hC5, along with testing for non-mutated antibodies with C5-containing human sera, were performed in complete RPMI medium, while assays testing for non-mutated antibodies with African green monkey sera and human C5 variants were performed in RPMI/ B.S.A. In order to measure CDC using human or monkey sera, anti-CD20 antibody was diluted 1:3 from 100 nM to 2 pM (including control sample containing no antibody) and incubated with cells for 10 min at 25°C, followed by addition of 1.66% serum or 1.66% C5-depleted serum and 6.6 nM C5 protein variants. The amount of C5 protein added to C5-depleted serum is based on a reported human serum C5 concentration of 0.37 μM (Rawal et al. 2008, J. Biol. Chem. 283:7853-7863). In order to test CDC inhibition with anti-C5 antibody, anti-C5 antibodies were diluted 1:3 from 100 nM to 2 pM (including a blank control) and incubated with 1.66% serum or 1.66% C5-depleted serum and 6.6 nM protein C5 variants for 30 min. 10 min before adding serum antibodies to cells, anti-CD20 antibody was added to cells at 1, 2, 3, 3.5, 7, 10, or 30 nM. At the end of the incubation with the anti-CD20 antibody, the antibody/serum mixture was added to the cells. Cytotoxicity was measured after 3.5 hours of incubation at 37° C. and 5% CO 2 , followed by 15 minutes of incubation at 25° C. and addition of CytoTox-Glo™ reagent (Promega, no. G9292). CytoTox-Glo™ is a luminescent reagent that measures cell death such that increased luminescence is observed with increased cytotoxicity (measured in relative light units, RLU). Untreated cells in control wells were lysed by digitonin treatment immediately after the addition of CytoTox-Glo™ reagent in order to determine maximum cell death. Luminescence in the plates was read using a Victor X instrument (Perkin Elmer) 15 min after the addition of CytoTox-Glo™. The percentage of cytotoxicity was calculated using the RLU values using the following equation:
% цитотоксичности=100 х (экспериментальный лизис клеток фоновый лизис клеток)/(максимальный лизис клеток - фоновый лизис клеток)% cytotoxicity=100 x (experimental cell lysis background cell lysis)/(maximum cell lysis - background cell lysis)
В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой люминесценцию клеток, которые обрабатывали только средами и сывороткой без какого-либо антитела против CD20, а максимальный лизис клеток представляет собой люминесценцию клеток, которые обрабатывали дигитонином. Результаты, выраженные в виде % цитотоксичности или RLU, анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрическая логистическая) и программного обеспечения Prism 5 (GraphPad), чтобы получать значения ЕС50 и IC50. Ингибирование для антител вычисляли так, что ингибирование от 0 до 100% представляет собой диапазон ингибирования от концентрации антитела против CD20, используемого в анализе, без ингибитора до 0 нМ антитела против CD20.In this equation, background cell lysis is the luminescence of cells that were treated with media and serum alone without any anti-CD20 antibody, and maximum cell lysis is the luminescence of cells that were treated with digitonin. The results, expressed as % cytotoxicity or RLU, were analyzed using non-linear regression (4-parameter logistic) and Prism 5 software (GraphPad) to obtain EC 50 and IC 50 values. Inhibition for antibodies was calculated such that 0 to 100% inhibition is the range of inhibition from the concentration of anti-CD20 antibody used in the assay without inhibitor to 0 nM of anti-CD20 antibody.
Результаты.Results.
Всего 25 антител против С5 человека, 16 не мутированных и 9 мутированных тестировали на их способность ингибировать С5 в CDC анализе с использованием клеток Daudi с антителом против CD20 и сывороток человека (с нормальным hC5 или вариантами С5) или сывороток африканской зеленой мартышки. Различные остатки в определяющих комплементарность областях (CDR) из Н4Н12166Р мутировали в гистидины для того, чтобы создавать 9 мутированных антител, Н4Н12166Р2-Н4Н12166Р10. Показано, что гистидиновые мутации в CDR придают зависимость от рН связыванию с целевым антигеном, что ведет к усовершенствованной фармакокинетике (Igawa et al. 2010, Nat. Biotechnol. 28:1203-1207).A total of 25 anti-human C5 antibodies, 16 unmutated and 9 mutated, were tested for their ability to inhibit C5 in a CDC assay using Daudi cells with anti-CD20 antibody and human sera (with normal hC5 or C5 variants) or African green monkey sera. Various residues in the complementarity determining regions (CDRs) of H4H12166P were mutated to histidines to generate 9 mutated antibodies, H4H12166P2-H4H12166P10. Histidine mutations in the CDR have been shown to confer pH dependence on binding to the target antigen, leading to improved pharmacokinetics (Igawa et al. 2010, Nat. Biotechnol. 28:1203-1207).
- 49 039858- 49 039858
Таблица 16Table 16
Ингибирование CDC не мутированным антителом против hC5 с использованием 1,66% сыворотки и антитела против CD20 в клетках DaudiInhibition of CDC with non-mutated anti-hC5 antibody using 1.66% serum and anti-CD20 antibody in Daudi cells
- 50 039858- 50 039858
*Если не указано иное, везде ингибирование составляет ~100%.*Unless otherwise noted, inhibition is ~100% everywhere.
Как показано в табл. 16 и 17, все 25 антител против hC5 демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной С5, присутствующим в 1,66% сыворотке человека. IC50 для не мутированных антител находились в диапазоне от 1,2 до 3,4 нМ. IC50 мутированных антител находились в диапазоне от 3,0 до 12 нМ. Родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р давало полное ингибирование с IC50 2,6 и 2,9 нМ.As shown in Table. 16 and 17, all 25 anti-hC5 antibodies showed complete inhibition of CDC mediated by C5 present in 1.66% human serum. IC 50 for non-mutated antibodies ranged from 1.2 to 3.4 nm. The IC 50 of the mutated antibodies ranged from 3.0 to 12 nM. The parental non-mutated H4H12166P antibody gave complete inhibition with IC 50s of 2.6 and 2.9 nM.
Таблица 17Table 17
Ингибирование CDC мутированным антителом против hC5 с использованием 1,66% сыворотки и антитела против CD20 в клетках DaudiInhibition of CDC by mutated anti-hC5 antibody using 1.66% serum and anti-CD20 antibody in Daudi cells
- 51 039858- 51 039858
*Если не указано иное, везде ингибирование составляет ~100%.*Unless otherwise noted, inhibition is ~100% everywhere.
не мутированных антител против hC5 демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной С5 африканской зеленой мартышки, с IC50 в диапазоне от 2,0 до 14 нМ.unmutated anti-hC5 antibodies showed complete inhibition of African green monkey C5-mediated CDC with an IC 50 ranging from 2.0 to 14 nM.
из 9 мутированных антител демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной С5 африканской зеленой мартышки, с IC50 в диапазоне от 7,1 до 9,9 нМ. Остальные 6 мутированных антител являются блокаторами с IC50 больше 10 нМ и максимальным ингибированием (при 100 нМ антитела) в диапазоне от 34 до 85%. Родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р давало полное ингибирование с IC50 4,5 и 5,6 нМ.of the 9 mutated antibodies showed complete inhibition of African green monkey C5 mediated CDC with an IC 50 ranging from 7.1 to 9.9 nM. The remaining 6 mutated antibodies are blockers with IC 50 greater than 10 nM and maximum inhibition (at 100 nM antibody) ranging from 34 to 85%. The parental non-mutated H4H12166P antibody produced complete inhibition with IC 50s of 4.5 and 5.6 nM.
Для того чтобы тестировать, ингибируют ли антитела против hC5, варианты С5 человека, R885H и R885C, истощенную по С5 сыворотку человека тестировали с 6,6 нМ каждого варианта С5. Все 25 антител против hC5 демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованное вариантом С5 R885H, с IC50 для не мутированных антител в диапазоне от 0,48 до 4,2 нМ, тогда как IC50 для мутированных антител находились в диапазоне от 1,3 до 7,0 нМ. Родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р давало полное ингибирование с IC50 1/3 и 1,3 нМ.In order to test whether anti-hC5 antibodies inhibit human C5 variants, R885H and R885C, C5-depleted human serum was tested with 6.6 nM of each C5 variant. All 25 anti-hC5 antibodies showed complete inhibition of CDC mediated by R885H variant C5 with IC 50 for unmutated antibodies ranging from 0.48 to 4.2 nM, while IC 50 for mutated antibodies ranged from 1.3 to 7 .0 nM. The parental unmutated H4H12166P antibody gave complete inhibition with an IC 50 of 1/3 and 1.3 nM.
из 16 не мутированных антител против hC5 демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной вариантом С5 R885C, с IC50 в диапазоне от 0,43 до 1,6 нМ. Одно не мутированное антитело демонстрировало слабое ингибирование CDC с максимальным ингибированием 67% (при 100 нМ антитела) и IC50>20 нМ. Все 9 мутированных антител демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной вариантом С5 R885C, с IC50 в диапазоне от 0,77 до 3,5 нМ. Родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р давало полное ингибирование с IC50 0,46 и 0,76 нМ.of 16 non-mutated hC5 antibodies showed complete inhibition of CDC mediated by the C5 R885C variant with an IC 50 ranging from 0.43 to 1.6 nM. One non-mutated antibody showed weak CDC inhibition with a maximum inhibition of 67% (at 100 nM antibody) and an IC 50 >20 nM. All 9 mutated antibodies showed complete inhibition of CDC mediated by the C5 R885C variant, with an IC 50 ranging from 0.77 to 3.5 nM. The parental non-mutated H4H12166P antibody gave complete inhibition with IC 50s of 0.46 and 0.76 nM.
Антитело против CD20 демонстрировало CDC клеток Daudi с 1,66% сывороткой с ЕС50 1,0, 1,4 и 1,9 нМ для сыворотки человека, 2,4 и 2,6 нМ для сыворотки африканской зеленой мартышки, 1,9 и 6,3 нМ для истощенной по hC5 сыворотки с вариантом hC5 R885H и 2,7 и 9,5 нМ для истощенной по hC5 сыворотки с вариантом hC5 R885C. Ни одно из нерелевантных контрольных антител IgG, контрольного mAb1 и контрольного mAb2, не демонстрировало какое-либо ингибирование CDC.Anti-CD20 antibody showed CDC of Daudi cells with 1.66% serum with EC 50 of 1.0, 1.4 and 1.9 nM for human serum, 2.4 and 2.6 nM for African green monkey serum, 1.9 and 6.3 nM for hC5 depleted serum with hC5 R885H variant and 2.7 and 9.5 nM for hC5 depleted serum with hC5 R885C variant. None of the irrelevant control IgG antibodies, control mAb1 and control mAb2, showed any inhibition of CDC.
Пример 7. Ингибирование активности С5а, как определяют посредством люциферазного анализа.Example 7 Inhibition of C5a activity as determined by luciferase assay.
В этом примере описан анализ для тестирования активации С5а через один из его рецепторов, C5aR1. C5aR1 представляет собой сопряженный с G-белком рецептор (GPCR) и может инициировать различные сопряженные с GPCR пути передачи сигнала (Monk et al. 2007, Br. J. Pharmacol. 152:429-448).This example describes an assay for testing C5a activation through one of its receptors, C5aR1. C5aR1 is a G protein coupled receptor (GPCR) and can initiate various GPCR coupled signaling pathways (Monk et al. 2007, Br. J. Pharmacol. 152:429-448).
- 52 039858- 52 039858
Создан биоанализ с использованием клеток HEK293, стабильно трансфицированных C5aR1 человека (№ доступа NP 001727.1) и G16 человека (№ доступа NP_002059.3) наряду с люциферазным репортером [отвечающий элемент NFAT (4X)-люцифераза]. Ga 16 представляет собой относительно неразборчивый G белок, который может связываться с GPCR различных типов, что ведет к активации PLC-β и последующему повышению Са++, который, в свою очередь, активирует транслокацию NFAT и транскрипцию репортерного гена (Kostenis et al. 2005, Trends Pharmacol. Sci. 26:595-602). Результирующая клеточная линия HEK293/hGa16/hC5aR1/NFAT-luc выделена и поддерживается в 10% DMEM, содержащей 10% FBS, NEAA, пенициллин/стрептомицин, 500 мкг/мл G418, 100 мкг/мл гигромицина В и 7 мкг/мл бластицидина.A bioassay was generated using HEK293 cells stably transfected with human C5aR1 (accession no. NP 001727.1) and human G16 (accession no. NP_002059.3) along with a luciferase reporter [NFAT response element (4X)-luciferase]. Ga 16 is a relatively promiscuous G protein that can bind to various types of GPCRs, leading to PLC-β activation and a subsequent increase in Ca ++ , which in turn activates NFAT translocation and reporter gene transcription (Kostenis et al. 2005 , Trends Pharmacol Sci 26:595-602). The resulting HEK293/hGa16/hC5aR1/NFAT-luc cell line was isolated and maintained in 10% DMEM containing 10% FBS, NEAA, penicillin/streptomycin, 500 μg/ml G418, 100 μg/ml hygromycin B, and 7 μg/ml blasticidin.
Для люциферазного биоанализа С5а клетки HEK293/hGa16/hC5aR1/NFAT-luc высевали в 96-луночные аналитические планшеты по 20000 клеток/лунка в OPTIMEM (Invitrogen, № 31985-070) с добавлением 0,5% BSA, пенициллина/стрептомицина и L-глутамина и затем инкубировали при 37°С и 5% СО2 в течение ночи. BSA использовали вместо FBS, поскольку показано, что сыворотка расщепляет и инактивирует hC5a (Klos et al., 2013, Pharmacol. Rev. 65:500-543). На следующее утро hC5a титровали от 100 нМ до 2 пМ (включая контрольный образец, не содержащий hC5a) и добавляли в клетки для того, чтобы определять дозозависимую кривую титрования для клеточной линии. Для того чтобы тестировать ингибирование hC5a антителом к hC5a, 500 пМ hC5a добавляли к клеткам. Непосредственно после этого антитела, разведенные 1:3 от 100 нМ до 2 пМ (включая контрольный образец, не содержащий антитело), добавляли к клеткам. Клетки инкубировали в течение 5,5 ч при 37°С в присутствии 5% СО2. Люциферазную активность обнаруживали после инкубации с реактивом OneGlo™ (Promega, № E6051). OneGlo™ представляет собой люминесцентный реактив, которым измеряют количество люциферазы, присутствующей в клетках. В этом анализе увеличенная активация hC5a ведет к увеличенному образованию люциферазы и люминесценции (измеряют в относительных световых единицах, RLU). Измерение люминесценции осуществляли с использованием прибора Victor X (Perkin Elmer). Результаты анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрической логистической) и программного обеспечения Prism 5 (GraphPad), чтобы получать значения ЕС50 и IC50. Ингибирование антител вычисляли так, что ингибирование от 0 до 100% представляет собой диапазон ингибирования от 500 пМ hC5a без ингибитора до 0 нМ hC5a.For C5a luciferase bioassay, HEK293/hGa16/hC5aR1/NFAT-luc cells were seeded in 96-well assay plates at 20,000 cells/well in OPTIMEM (Invitrogen, no. 31985-070) supplemented with 0.5% BSA, penicillin/streptomycin and L- glutamine and then incubated at 37°C and 5% CO 2 overnight. BSA was used instead of FBS as serum has been shown to cleave and inactivate hC5a (Klos et al., 2013, Pharmacol. Rev. 65:500-543). The next morning, hC5a was titrated from 100 nM to 2 pM (including a control containing no hC5a) and added to the cells in order to determine a dose-dependent titration curve for the cell line. In order to test hC5a inhibition with an anti-hC5a antibody, 500 pM hC5a was added to the cells. Immediately thereafter, antibodies diluted 1:3 from 100 nM to 2 pM (including a control containing no antibody) were added to the cells. Cells were incubated for 5.5 h at 37°C in the presence of 5% CO 2 . Luciferase activity was detected after incubation with OneGlo™ reagent (Promega, no. E6051). OneGlo™ is a luminescent reagent that measures the amount of luciferase present in cells. In this assay, increased hC5a activation leads to increased luciferase production and luminescence (measured in relative light units, RLU). Luminescence was measured using a Victor X instrument (Perkin Elmer). The results were analyzed using non-linear regression (4-parameter logistic) and Prism 5 software (GraphPad) to obtain EC 50 and IC 50 values. Antibody inhibition was calculated such that 0 to 100% inhibition represents a range of inhibition from 500 pM hC5a without inhibitor to 0 nM hC5a.
Четыре антитела против hC5 тестировали на их способность ингибировать hC5a активацию его рецептора, hC5aR1, посредством измерения степени ингибирования для 500 пМ hC5a активации клеток HEK293/hGal6/hC5aR1/NFAT-luc.Four anti-hC5 antibodies were tested for their ability to inhibit hC5a activation of its receptor, hC5aR1, by measuring the degree of inhibition for 500 pM hC5a activation of HEK293/hGal6/hC5aR1/NFAT-luc cells.
Таблица 18Table 18
Ингибирование антителом против hC5 для 500 пМ hC5a в клетках HEK293/Ga16/hC5aR1/NFAT-lucInhibition by anti-hC5 antibody for 500 pM hC5a in HEK293/Ga16/hC5aR1/NFAT-luc cells
Как показано в табл. 18, все 4 антитела по изобретению демонстрировали полное ингибирование для 500 пМ hC5a с IC50 в диапазоне от 0,035 до 0,46 нМ. Нерелевантное контрольное антитело IgG, контрольное mAb3, не демонстрировало какое-либо ингибирование hC5a. hC5a активировал клетки HEK293/Ga16/hC5aR1/NFAT-luc с ЕС50 0,39 нМ.As shown in Table. 18, all 4 antibodies of the invention showed complete inhibition for 500 pM hC5a with an IC 50 ranging from 0.035 to 0.46 nM. The irrelevant control IgG antibody, control mAb3, did not show any inhibition of hC5a. hC5a activated HEK293/Ga16/hC5aR1/NFAT-luc cells with an EC 50 of 0.39 nM.
Пример 8. Биоанализ гемолиза.Example 8 Hemolysis Bioassay.
Анализ классического пути гемолиза (СН) и анализ альтернативного пути гемолиза (АН) разрабатывали для того, чтобы тестировать активность антител.The classical hemolysis pathway (CH) assay and the alternative hemolysis pathway (AH) assay were developed to test antibody activity.
СН представляет собой скрининговый анализ активации классического пути комплемента, который чувствителен к снижению, отсутствию и/или неактивности любого компонента пути. В СН тестируют функциональную способность сывороточных компонентов классического пути комплемента лизировать красные клетки крови овцы (SRBC), предварительно покрытые антителом кролика против красных клеток крови овцы (гемолизин). Когда покрытые антителом SRBC инкубируют с тестовой сывороткой, активируют классический путь комплемента и результатом является гемолиз. Если компонент комплемента отсутствует, СН уровень будет нулевым; если один или несколько компонентов классического пути снижены, СН будет снижен. (Nilsson et al. 1984, J. Immunol. Meth. 72:49-59). Этот анализ используют для определения характеристик и скрининга высокоаффинных антител против С5 человека.SN is a screening assay for classical complement pathway activation that is sensitive to the reduction, absence and/or inactivity of any component of the pathway. In CH, the functional ability of serum components of the classical pathway to complement lyse sheep red blood cells (SRBC) pre-coated with rabbit anti-sheep red blood cell antibody (hemolysin) is tested. When antibody-coated SRBCs are incubated with test serum, the classical complement pathway is activated and the result is hemolysis. If the complement component is absent, the CH level will be zero; if one or more components of the classical pathway are reduced, SN will be reduced. (Nilsson et al. 1984, J. Immunol. Meth. 72:49-59). This assay is used to characterize and screen for high affinity anti-human C5 antibodies.
- 53 039858- 53 039858
Способы.Ways.
(А) Анализ гемолиза по классическому пути комплемента.(A) Analysis of hemolysis by the classical complement pathway.
Желаемое число красных клеток крови овцы (SRBC) промывали в буфере GVB++ и ресуспендировали по 1х109 клеток/мл. Для сенсибилизации SRBC смешивали с равным объемом разведенного 1:50 гемолизина кролика против овцы (1,5 мг/мл) при 37°С в течение 20 мин. Сенсибилизированные клетки SRBC разводили до 2±108 клеток/мл в GVB++ перед использованием в анализе гемолиза. Нормальную сыворотку человека или сыворотку яванского макака разводили до 2 или 10% в буфере GVB++. Для того чтобы тестировать ингибирование опосредованной С5 гемолитической активности, тестовые антитела предварительно инкубировали в течение 20 мин при 4°С в концентрациях в диапазоне от 0,6 до 800 нМ в 2-10% нормальной сыворотке человека или 10% сыворотке яванского макака или сыворотке африканской зеленой мартышки. Круглодонные 96-луночные планшеты использовали для того, чтобы измерять гемолитическую активность. Всего 100 мкл сенсибилизированных RBC овцы (2х108 клеток/мл) высевали в 96-луночный планшет, после чего следовало добавление 100 мкл соответствующих образцов сыворотки, которые предварительно инкубировали с тестовыми антителами. Клетки аккуратно смешивали и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. По истечении времени инкубации клетки осаждали центрифугированием при 1250xg и 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96-плоскодонный планшет и считывали при 412 нм на считывателе микропланшетов Spectramax. Гемолитическую активность вычисляли при конечной концентрации в сыворотке 1-5% для обработок.The desired number of sheep red blood cells (SRBC) was washed in GVB++ buffer and resuspended at 1 x 10 9 cells/ml. For sensitization, SRBC was mixed with an equal volume of 1:50 diluted rabbit anti-sheep hemolysin (1.5 mg/ml) at 37° C. for 20 minutes. Sensitized SRBC cells were diluted to 2±10 8 cells/ml in GVB++ prior to use in the hemolysis assay. Normal human serum or cynomolgus monkey serum was diluted to 2% or 10% in GVB++ buffer. In order to test inhibition of C5-mediated hemolytic activity, test antibodies were pre-incubated for 20 min at 4°C at concentrations ranging from 0.6 to 800 nM in 2-10% normal human serum or 10% cynomolgus or African monkey serum. green monkey. Round bottom 96 well plates were used to measure hemolytic activity. A total of 100 µl of sensitized ovine RBCs (2×10 8 cells/ml) were seeded into a 96-well plate, followed by the addition of 100 µl of the appropriate serum samples, which had been pre-incubated with test antibodies. Cells were mixed gently and incubated at 37°C for 60 min. After the incubation time, the cells were pelleted by centrifugation at 1250xg and 4°C. A total of 100 μl of the supernatant was transferred to a fresh 96-flat bottom plate and read at 412 nm on a Spectramax microplate reader. Hemolytic activity was calculated at a final serum concentration of 1-5% for the treatments.
Процент гемолиза вычисляли следующим образом:The percentage of hemolysis was calculated as follows:
% гемолиза = 100 х (экспериментальный лизис клеток - фоновый лизис клеток)/(максимальный лизис клеток - фоновый лизис клеток).% hemolysis = 100 x (experimental cell lysis - background cell lysis)/(maximum cell lysis - background cell lysis).
В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от клеток, инкубированных в буфере GVB++, только не содержащем сыворотку. Максимальный лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от клеток, которые обрабатывали водой. Результаты, выраженные в виде % гемолиза, анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрической логистической) и программного обеспечения Prism 5 (GraphPad) для получения значений IC50- Данные представляли в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.In this equation, background cell lysis is the OD at A412 nm from cells incubated in GVB++ buffer only containing no serum. Maximum cell lysis is the OD at A412 nm from cells that were treated with water. The results, expressed as % hemolysis, were analyzed using non-linear regression (4-parameter logistic) and Prism 5 software (GraphPad) to obtain IC 50 values - Data were presented as mean ± standard error of the mean.
(В) Анализ альтернативного комплемента.(B) Alternative complement analysis.
Желаемое число красных клеток крови кролика (RbRBC) промывали в буфере GVB-Mg2+/EGTA и ресуспендировали по 2х108 клеток/мл. Нормальную сыворотку человека или сыворотку яванского макака разводили до 10% в буфере GVB-Mg2+/EGTA. Для того чтобы тестировать ингибирование опосредованной С5 гемолитической активности, антитела в концентрациях в диапазоне от 3 до 800 нМ предварительно инкубировали в течение 20 мин при 4°С в 5-10% нормальной сыворотке человека или сыворотке яванского макака. Круглодонные 96-луночные планшеты использовали для того, чтобы измерять гемолитическую активность. Всего 100 мкл RbRBC (2х108 клеток/мл) высевали в 96-луночный планшет, после чего следовало добавление 100 мкл 10% нормальной сыворотки человека или сыворотки яванского макака или сыворотки африканской зеленой мартышки, которую предварительно инкубировали с антителами против С5. Клетки мягко перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. По истечении времени инкубации клетки осаждали центрифугированием на 1250xg при 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96 плоскодонный планшет и считывали при 412 нм на считывателе микропланшетов Spectramax. Гемолитическую активность вычисляли при конечной концентрации сыворотки 5% сыворотки.The desired number of rabbit red blood cells (RbRBC) was washed in GVB-Mg 2+ /EGTA buffer and resuspended at 2x10 8 cells/ml. Normal human serum or cynomolgus monkey serum was diluted to 10% in GVB-Mg 2+ /EGTA buffer. In order to test inhibition of C5 mediated hemolytic activity, antibodies at concentrations ranging from 3 to 800 nM were pre-incubated for 20 minutes at 4° C. in 5-10% normal human serum or cynomolgus monkey serum. Round bottom 96 well plates were used to measure hemolytic activity. A total of 100 µl of RbRBC (2 x 10 8 cells/ml) was plated in a 96-well plate followed by the addition of 100 µl of 10% normal human serum or cynomolgus monkey serum or African green monkey serum, which had been preincubated with anti-C5 antibodies. Cells were gently mixed and incubated at 37°C for 60 min. After the incubation time, the cells were pelleted by centrifugation at 1250xg at 4°C. A total of 100 µl of the supernatant was transferred to a fresh 96 flat bottom plate and read at 412 nm on a Spectramax microplate reader. Hemolytic activity was calculated at a final serum concentration of 5% serum.
Процент гемолиза вычисляли следующим образом:The percentage of hemolysis was calculated as follows:
% гемолиза = 100 х (экспериментальный лизис клеток - фоновый лизис клеток)/(максимальный лизис клеток - фоновый лизис клеток).% hemolysis = 100 x (experimental cell lysis - background cell lysis)/(maximum cell lysis - background cell lysis).
В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от клеток, которые инкубировали в буфере GVB-Mg/EGTA, не содержащем только сыворотку, или без какого-либо антитела против С5. Максимальный лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от клеток, которые обрабатывали водой. Ингибирование посредством антител против С5 значения IC50 вычисляли с использованием нелинейной регрессии (4-параметрической логистической) и программного обеспечения Prism 6 (GraphPad).In this equation, background cell lysis is the OD at A412 nm from cells that were incubated in GVB-Mg/EGTA buffer containing no serum alone or without any anti-C5 antibody. Maximum cell lysis is the OD at A412 nm from cells that were treated with water. Inhibition by anti-C5 antibodies IC 50 values were calculated using non-linear regression (4-parameter logistic) and Prism 6 software (GraphPad).
Результаты.Results.
(А) Ингибирование гемолиза, опосредованного С5 человека.(A) Inhibition of human C5 mediated hemolysis.
Всего 25 антител против С5 человека (hC5), 16 не мутированных и 9 мутированных, тестировали на их способность ингибировать С5 из нормальной сыворотки человека (NHS) в анализе СН50 с использованием сенсибилизированных красных клеток крови овцы (SRBC) и анализе АН50 с использованием красных клеток крови кролика (RRBC).A total of 25 anti-human C5 (hC5) antibodies, 16 non-mutated and 9 mutated, were tested for their ability to inhibit C5 from normal human serum (NHS) in the CH50 assay using sensitized sheep red blood cells (SRBC) and the AH50 assay using red cells rabbit blood (RRBC).
- 54 039858- 54 039858
Таблица 19Table 19
Ингибирование СР и АР активности антителом против hC5 в 1 или 5% нормальной сыворотке человека (NHS)Inhibition of CP and AR activity by anti-hC5 antibody in 1% or 5% normal human serum (NHS)
Как показано в табл. 19, 16 антител против hC5 по данному изобретению демонстрировали больше чем 94% ингибирование гемолиза по классическому пути (СР), опосредованному с помощью С5, присутствующего в 1% сыворотке человека. IC50 для антител находились в диапазоне от 2,1 до 5,9 нМ, и процент ингибирования находился в диапазоне 95-99%. Все 16 антител против С5 демонстрировали больше чем 60% ингибирование (за исключением Н4Н12169Р) в анализе гемолиза по альтернативному пути (АР), который опосредован с помощью С5, присутствующего в 5% NHS. IC50 для антител находились в диапазоне от 13 до 160 нМ, и процент ингибирующей активности находился в диапазоне от 44 до 81%.As shown in Table. 19, 16 anti-hC5 antibodies of the invention exhibited greater than 94% inhibition of classical pathway (CP) hemolysis mediated by C5 present in 1% human serum. IC 50 for antibodies were in the range from 2.1 to 5.9 nm, and the percentage of inhibition was in the range of 95-99%. All 16 anti-C5 antibodies showed more than 60% inhibition (with the exception of H4H12169P) in an alternative pathway (AP) hemolysis assay that is mediated by C5 present in 5% NHS. IC 50 for antibodies were in the range from 13 to 160 nm, and the percentage of inhibitory activity was in the range from 44 to 81%.
Таблица 20Table 20
Ингибирование СР и АР активности антителом против hC5 в 5% нормальной сыворотке человека (NHS)Inhibition of CP and AR activity by anti-hC5 antibody in 5% normal human serum (NHS)
Как показано в табл. 20, все 9 мутированных антител против hC5 демонстрировали ингибирование СР и АР гемолитической активности, опосредованной с помощью С5, присутствующего в 5% сыворотке человека. В анализе СР гемолиза родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р демонстрировало больше чем 98% ингибирование с IC50 10,9 нМ. 8 мутированных антител против hC5 демонстрировали больше чем 90% ингибирование с IC50 в диапазоне от 10,3 до 24,3 нМ. Мутированное антитело против С5 12166Р10 демонстрировало частичное ингибирование 74%. В анализе АР гемолиза родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р демонстрировало больше чем 85% ингибирование с IC50 20,9 нМ.As shown in Table. 20, all 9 mutated hC5 antibodies showed inhibition of CP and AR hemolytic activity mediated by C5 present in 5% human serum. In the hemolysis CP assay, the parental unmutated H4H12166P antibody showed greater than 98% inhibition with an IC 50 of 10.9 nM. The 8 mutated hC5 antibodies showed greater than 90% inhibition with an IC 50 ranging from 10.3 to 24.3 nM. The mutated anti-C5 antibody 12166P10 showed a partial inhibition of 74%. In the hemolysis AP assay, the parental non-mutated H4H12166P antibody showed greater than 85% inhibition with an IC 50 of 20.9 nM.
- 55 039858- 55 039858
Мутированные антитела против hC5 демонстрировали ингибирование в диапазоне 72-83%, и IC50 антител находились в диапазоне от 28 нМ до 0,15 мкМ.Mutated antibodies against hC5 showed inhibition in the range of 72-83%, and IC 50 antibodies ranged from 28 nm to 0.15 μm.
(В) Ингибирование гемолиза, опосредованного С5 обезьяны.(B) Inhibition of monkey C5-mediated hemolysis.
Всего 25 антител против С5 человека (hC5), 16 не мутированных и 9 мутированных, тестировали на их способность ингибировать С5 яванского макака и африканской зеленой мартышки в СН50 анализе с использованием сенсибилизированных красных клеток крови овцы (SRBC) и АН50 анализе с использованием красных клеток крови кролика (RRBC).A total of 25 anti-human C5 (hC5) antibodies, 16 unmutated and 9 mutated, were tested for their ability to inhibit cynomolgus monkey and African green monkey C5 in CH50 assay using sensitized sheep red blood cells (SRBC) and AH50 assay using red blood cells rabbit (RRBC).
Таблица 21Table 21
Ингибирование СР и АР активности антителом против hC5 в 5% нормальных сыворотках африканской зеленой мартышки (AGM)Inhibition of CP and AR activity by anti-hC5 antibody in 5% normal African green monkey (AGM) sera
Как показано в табл. 21, антитела против hC5 демонстрировали различные уровни ингибирования СР или АР гемолитической активности в 5% сыворотках африканской зеленой мартышки. В СР анализе 2 из 16 антител против hC5 не демонстрировали ингибирование гемолитической активности. 14 антител демонстрировали ингибирование в диапазоне 43-94% с IC50 в диапазоне от 25 до 180 нМ. В анализе АР гемолиза 13 из 17 антител демонстрировали ингибирование активность в диапазоне 17-93% с IC50 в диапазоне от 22,5 до 233 нМ.As shown in Table. 21, anti-hC5 antibodies showed varying levels of inhibition of CP or AR hemolytic activity in 5% African green monkey sera. In the SR analysis, 2 of 16 anti-hC5 antibodies did not show inhibition of hemolytic activity. The 14 antibodies showed inhibition in the range of 43-94% with an IC 50 ranging from 25 to 180 nM. In the hemolysis AP assay, 13 of 17 antibodies showed inhibitory activity ranging from 17-93% with an IC 50 ranging from 22.5 to 233 nM.
- 56 039858- 56 039858
Таблица 22Table 22
Ингибирование СР и АР активности антителом против hC5 в 5% нормальных сыворотках обезьян Cynomolgus (Cyno)Inhibition of CP and AR activity by anti-hC5 antibody in 5% normal sera from Cynomolgus monkeys (Cyno)
Как показано в табл. 22, антитела против hC5 (за исключением Н4Н12183Р2, которое демонстрировало 64% ингибирование СР) демонстрировали больше чем 90% ингибирование в анализе СР или АР гемолиза в 5% сыворотке яванского макака. В анализе СР гемолиза IC50 антител находились в диапазоне от 7,15 до 142 нМ. В анализе АР гемолиза IC50 антител находились в диапазоне от 5,4 до 29,6 нМ.As shown in Table. 22, anti-hC5 antibodies (with the exception of H4H12183P2, which showed 64% inhibition of CP) showed greater than 90% inhibition in the CP or AP assay of hemolysis in 5% cynomolgus serum. In the hemolysis CP assay, the IC 50s of the antibodies ranged from 7.15 to 142 nM. In the analysis of AP hemolysis IC 50 antibodies ranged from 5.4 to 29.6 nm.
(C) Ингибирование гемолиза, опосредованного вариантом С5 человека.(C) Inhibition of hemolysis mediated by human variant C5.
Выбранные антитела против С5 тестировали на их способность ингибировать вариант С5 человека (см. пример 3 в настоящем описании) из истощенной по С5 сыворотки человека в СН50 анализе. В истощенной по С5 сыворотке человека с добавлением экзогенного варианта С5 R885H, Н4Н12166Р и объект сравнения 2 блокировали СР гемолиз со значениями IC50 6,0 и 4,4 нМ соответственно и значениями IC80 7,6 и 5,5 нМ соответственно. Для варианта R885C, Н4Н12166Р и объект сравнения 2 блокировали СР гемолиз в истощенной по С5 сыворотке человека с экзогенными вариантами С5 с IC50 9,3 и 6,8 нМ соответственно и значениями IC80 11 и 8,2 нМ соответственно. Как ожидали, объект сравнения 1 не блокировал гемолитическую активность вариантов С5 человека.Selected anti-C5 antibodies were tested for their ability to inhibit the human C5 variant (see Example 3 herein) from C5-depleted human serum in a CH50 assay. In C5-depleted human serum supplemented with exogenous C5 variant R885H, H4H12166P and Comparator 2 blocked CP hemolysis with IC 50 values of 6.0 and 4.4 nM, respectively, and IC 80 values of 7.6 and 5.5 nM, respectively. For the R885C variant, H4H12166P and Comparator 2 blocked CP hemolysis in C5 depleted human serum with exogenous C5 variants with IC 50s of 9.3 and 6.8 nM, respectively, and IC 80 values of 11 and 8.2 nM, respectively. As expected, Comparator 1 did not block the hemolytic activity of human C5 variants.
(D) Ингибирование комплекса С5Ь-6 человека.(D) Inhibition of the human C5b-6 complex.
Выбранные антитела против С5 тестировали на их способность ингибировать комплекс С5Ь-6 человека из истощенной по С5 сыворотки человека в СН50 анализе. Н4Н12166Р сильно блокировало СР гемолиз в истощенной по С5 сыворотке человека с добавлением экзогенного комплекса huC5b-6 с IC50 3,8 нМ и значением IC80 5,8 нМ. В отличие от этого, объект сравнения 1 блокировал опосредованный комплексом С5Ь-6 гемолиз с меньшей силой, со значениями IC50 5,0 нМ и значением IC80 46 нМ соответственно. Объект сравнения 1 ингибировал только 70% общего гемолиза при наивысших тестируемых концентрациях. Объект сравнения 2 не блокировал гемолитическую активность комплекса С5Ь-6 человека.Selected anti-C5 antibodies were tested for their ability to inhibit the human C5b-6 complex from C5-depleted human serum in the CH50 assay. H4H12166P strongly blocked CP hemolysis in C5-depleted human serum supplemented with exogenous huC5b-6 complex with an IC 50 of 3.8 nM and an IC 80 value of 5.8 nM. In contrast, Comparator 1 blocked C5b-6 complex-mediated hemolysis with less force, with IC 50 values of 5.0 nM and IC 80 values of 46 nM, respectively. Comparator 1 only inhibited 70% of total hemolysis at the highest concentrations tested. Comparison 2 did not block the hemolytic activity of the human C5b-6 complex.
Пример 9. Антитела против С5 блокируют образование С5а в анализе СР гемолиза.Example 9 Antibodies against C5 block the formation of C5a in the hemolysis CP assay.
Для того чтобы оценивать, ингибируют ли антитела против С5 образование С5а, супернатанты из анализа классического пути (СР) гемолиза анализировали на уровни С5а с помощью ELISA.To assess whether anti-C5 antibodies inhibit C5a production, supernatants from the classical pathway (CP) hemolysis assay were analyzed for C5a levels by ELISA.
С5а, образуемый в результате расщепления С5, представляет собой белковый фрагмент из 74 аминокислот. С5а быстро метаболизируется карбоксипептидазами сыворотки до более стабильной менее активной формы из 73 аминокислот С5а des-Arg посредством удаления С-концевого аргинина. Количественное определение С5а des-Arg, следовательно, обеспечивает надежное измерение для мониторинга образования С5а in vivo и in vitro. В соответствии с информацией, предоставляемой производителем, используемый здесь набор MicroVue C5a ELISA позволяет обнаруживать С5а des-Arg. Предварительные эксперименты (данные не приведены) показывают, что также обнаруживают первичную форму С5а из 74C5a, resulting from the cleavage of C5, is a protein fragment of 74 amino acids. C5a is rapidly metabolized by serum carboxypeptidases to a more stable, less active 73 amino acid form of C5a des-Arg via removal of the C-terminal arginine. Quantification of C5a des-Arg therefore provides a reliable measurement for monitoring C5a formation in vivo and in vitro. According to the information provided by the manufacturer, the MicroVue C5a ELISA kit used here is capable of detecting C5a des-Arg. Preliminary experiments (data not shown) show that they also detect the primary form C5a from 74
- 57 039858 аминокислот. В целях этого примера обе формы в совокупности обозначают как С5а.- 57039858 amino acids. For the purposes of this example, both forms are collectively referred to as C5a.
Уровни белка С5а определяли в супернатантах из анализа СР гемолиза с использованием нормальной сыворотки человека (NHS) с сохраненным комплементом, которую предварительно инкубировали с Н4Н12166Р или изотипическим контрольным антителом, как описано в примере 8. Уровни белка С5а измеряли с использованием набора MicroVue C5a ELISA по инструкциям производителя. В кратком изложении, образцы разводили и инкубировали в планшетах, предварительно покрытых захватывающим антителом (мышиным против С5а со специфичностью к неоэпитопу на С5 человека). Белок С5а человека, предоставленный производителем, использовали в качестве стандарта для калибровки. С5а в супернатантах обнаруживали посредством HRP-конъюгированного идентифицирующего антитела (моноклональное антитело мыши к области С5а из С5). Хромогенный субстрат HRP 3-, 3'-, 5-, 5'-тетраметилбензидин (ТМВ) добавляли для того, чтобы обнаруживать активность HRP. Использовали раствор 1н. соляной кислоты для того, чтобы останавливать реакцию, и измеряли оптическую плотность при 450 нм (OD450) на считывателе планшетов SpectraMax. Данные анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрическая логистическая) в GraphPad Prism. Концентрацию С5а выражали в нг/мл супернатанта.C5a protein levels were determined in supernatants from the hemolysis CP assay using normal human serum (NHS) with complement conserved that had been preincubated with H4H12166P or an isotype control antibody as described in Example 8. C5a protein levels were measured using the MicroVue C5a ELISA kit as instructed manufacturer. Briefly, samples were diluted and incubated in pre-coated plates with capture antibody (mouse anti-C5a with specificity for human C5 neoepitope). Human C5a protein provided by the manufacturer was used as a calibration standard. C5a in the supernatants was detected with an HRP-conjugated identifying antibody (mouse monoclonal antibody to the C5a region of C5). The chromogenic HRP substrate 3-, 3'-, 5-, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) was added in order to detect HRP activity. Used a solution of 1N. hydrochloric acid in order to stop the reaction, and measured the optical density at 450 nm (OD 450 ) on a plate reader SpectraMax. Data was analyzed using non-linear regression (4-parameter logistic) in GraphPad Prism. The concentration of C5a was expressed in ng/ml of the supernatant.
В анализе с использованием 5% NHS, H4H12166P сильно блокировал увеличение уровней белка С5а в зависимости от дозы с IC50 8,5 нМ, тогда как изотипическое контрольное антитело не оказывало эффекта на уровни С5а (фиг. 1). Максимальное блокирование при наивысшей тестированной концентрации Н4Н12166Р (267 нМ) вело к ~10-кратному снижению уровней С5а до 3,8 нг/мл (0,3 нМ) по сравнению с 34 нг/мл (2,8 нМ), которые наблюдали при наименьшей тестированной концентрации Н4Н12166Р (1 нМ) в 5% сыворотке. Концентрация С5а, которую наблюдали для максимального блокирования, близка к базовому уровню С5а 2,3 нг/мл (0,2 нМ) в необработанной 5% NHS.In an assay using 5% NHS, H4H12166P strongly blocked the increase in C5a protein levels in a dose dependent manner with an IC 50 of 8.5 nM, while the isotype control antibody had no effect on C5a levels (FIG. 1). Maximum blocking at the highest concentration of H4H12166P tested (267 nM) resulted in ~10-fold reduction in C5a levels to 3.8 ng/mL (0.3 nM) compared to 34 ng/mL (2.8 nM) seen with lowest tested concentration of H4H12166P (1 nM) in 5% serum. The C5a concentration observed for maximum blocking is close to the C5a baseline of 2.3 ng/mL (0.2 nM) in untreated 5% NHS.
Пример 10. Определение характеристик фармакокинетики и фармакодинамики антител против С5 у яванского макака.Example 10 Characterization of the pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-C5 antibodies in the cynomolgus monkey.
В этом примере описано определение характеристик фармакокинетики (PK) и фармакодинамики (PD) выбранных антител против С5, которое проводили у самцов яванского макака. Эндогенные уровни С5 определяли перед дозированием антитела против С5 и использовали для стратификации групп животных по дозе.This example describes the characterization of pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD) of selected antibodies against C5, which was performed in male cynomolgus monkeys. Endogenous C5 levels were determined prior to anti-C5 antibody dosing and used to stratify animal groups by dose.
Общие циркулирующие уровни С5 у яванского макака определяли с использованием Human Complement C5 ELISA (Abeam, № по каталогу ab125963), который осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. Определяли, что усредненные концентрации белка С5 у обезьян составляют 90,85±19,17 мкг/мл.Total circulating levels of C5 in the cynomolgus monkey were determined using the Human Complement C5 ELISA (Abeam, cat# ab125963) performed according to the manufacturer's recommendations. The mean C5 protein concentrations in monkeys were determined to be 90.85±19.17 µg/ml.
Для каждого антитела против С5 каждому из 4 яванских макаков вводили одну внутривенную (IV) инъекцию в дозе 15 мг/кг. Образцы крови брали у каждого животного перед дозой и до 1680 ч (70 суток), получали сыворотку и замораживали при -80°С до анализа на PK и PD.For each anti-C5 antibody, each of 4 cynomolgus monkeys received one intravenous (IV) injection at a dose of 15 mg/kg. Blood samples were taken from each animal pre-dose and up to 1680 hours (70 days), serum was obtained and frozen at -80°C until analysis for PK and PD.
Анализ общего уровня антител IgG с помощью иммунологического анализа ELISA.Analysis of the total level of IgG antibodies using immunoassay ELISA.
Общие концентрации антител в образцах сыворотки обезьяны измеряли с использованием не валидированного прямого ELISA. В процедуре ELISA использовали микротитровальный планшет, покрытый моноклональным антителом мыши против Fc IgG1/IgG4 человека. В планшет различные антитела против С5 добавляли и антитела против С5, захваченные на планшете, обнаруживали с использованием биотинилированного моноклонального антитела мыши против Fc IgG4 человека, после чего следовал нейтравидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (нейтравидин-HRP). Затем добавляли субстрат на основе люминола со специфичностью к пероксидазе, чтобы получать интенсивность сигнала, которая пропорциональна концентрации общего захваченного антитела против С5. Измерения калибровочных стандартов в относительных световых единицах (RLU) и соответствующие им номинальные концентрации аппроксимировали с использованием взвешенного 4-параметрического логистического уравнения для того, чтобы создавать калибровочное уравнение, которое описывает зависимость концентрации антител против С5 и ответа в анализе. Нижний предел количественного определения (LLOQ) составлял 1,56 нг/мл в анализе (2% сыворотка обезьяны) и 78 нг/мл в чистой сыворотке обезьяны.Total antibody concentrations in monkey serum samples were measured using a non-validated direct ELISA. The ELISA procedure used a microtiter plate coated with a mouse monoclonal antibody against human Fc IgG1/IgG4. Various anti-C5 antibodies were added to the plate and anti-C5 antibodies captured on the plate were detected using a biotinylated monoclonal mouse anti-human Fc IgG4 antibody, followed by horseradish peroxidase conjugated neutravidin (Neutravidin-HRP). A peroxidase specific luminol substrate was then added to obtain a signal intensity that is proportional to the concentration of total captured anti-C5 antibody. Measurements of the calibration standards in relative light units (RLU) and their corresponding nominal concentrations were approximated using a weighted 4-parameter logistic equation in order to create a calibration equation that describes the dependence of the concentration of antibodies against C5 and the response in the analysis. The lower limit of quantification (LLOQ) was 1.56 ng/ml in the assay (2% monkey serum) and 78 ng/ml in pure monkey serum.
Определение PK параметров.Determination of PK parameters.
PK параметры определяли посредством некомпартментного анализа (NCA) с использованием программного обеспечения Phoenix®WinNonlin® (версия 6.4, Certara, L.P.) и модели IV болюсного дозирования.PK parameters were determined by non-compartmental analysis (NCA) using Phoenix®WinNonlin® software (version 6.4, Certara, L.P.) and an IV bolus dosing model.
Все PK параметры получали из соответствующих средних значений концентраций, в том числе наблюдаемой максимальной концентрации в сыворотке (Cmax), времени наблюдаемой пиковой концентрации (tmax) и наблюдаемого оценочного времени полужизни (T1/2). Для каждого антитела площадь под кривой зависимости концентрации от времени вплоть до последней измеряемой концентрации (AUClast) и экстраполированную от нулевого момента времени до бесконечности (AUCinf) определяли с использованием правила линейных трапеций с линейной интерполяцией и равномерными весами.All PK parameters were derived from the respective mean concentrations, including observed maximum serum concentration (C max ), time of observed peak concentration (t max ) and observed estimated half-life (T 1/2 ). For each antibody, the area under the concentration-time curve up to the last measured concentration (AUC last ) and extrapolated from time zero to infinity (AUC inf ) was determined using the linear trapezoidal rule with linear interpolation and uniform weights.
PD анализ посредством анализа гемолиза ex vivo.PD analysis by ex vivo hemolysis assay.
Фармакодинамику выбранных антител против С5 анализировали с использованием анализов клас- 58 039858 сического пути и альтернативного пути гемолиза ex vivo.The pharmacodynamics of selected anti-C5 antibodies were analyzed using classical pathway and alternative ex vivo hemolysis pathway assays.
Анализ классического пути гемолиза: красные клетки крови овцы (SRBC) промывали в буфереAnalysis of the classical pathway of hemolysis: Sheep red blood cells (SRBC) were washed in buffer
GVB++ (желатин-вероналовый буфер с CaCl2 и MgCl2) (Boston BioProducts) и ресуспендировали поGVB++ (gelatin-veronal buffer with CaCl2 and MgCl2) (Boston BioProducts) and resuspended in
1х109 клеток/мл. Чтобы сенсибилизировать SRBC, всего 1х109 SRBC/мл смешивали с равным объемом разведенного 1:50 гемолизин кролика против овцы (1,5 мг/мл) при 37°С в течение 20 мин.1x10 9 cells/ml. To sensitize SRBC, a total of 1 x 10 9 SRBC/ml was mixed with an equal volume of 1:50 diluted rabbit anti-sheep hemolysin (1.5 mg/ml) at 37° C. for 20 minutes.
Сенсибилизированные SRBC разводили до 2х108 клеток/мл в буфере GVB++ перед использованием в анализе гемолиза. Кровь у яванских макаков брали перед дозированием и через 5 мин, 4 и 8 ч и 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 и 70 суток после дозы для PD анализа. Сыворотку получали и замораживали до дальнейшего использования. В сутки анализа сыворотку Cynomolgus из соответствующих моментов времени разводили до 10% в буфере GVB++. Круглодонные 96-луночные планшеты использовали для того, чтобы измерять гемолитическую активность. Всего 100 мкл сенсибилизированных SRBC (2х108 клеток/мл) высевали в 96-луночный планшет при 37°С, после чего следовало добавление 100 мкл 10% сыворотки яванского макака из соответствующих моментов времени. SRBC мягко перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 10 мин. По истечении времени инкубации клетки центрифугировали на 1250xg при 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96 плоскодонный планшет и считывали при 412 нм на считывателе микропланшетов Spectramax. Гемолитическую активность вычисляли при конечной концентрации сыворотки 5%. Процент гемолиза вычисляли с использованием значений поглощения и следующего уравнения:Sensitized SRBCs were diluted to 2x10 8 cells/ml in GVB++ buffer prior to use in the hemolysis assay. Blood was taken from cynomolgus monkeys before dosing and 5 min, 4 and 8 h and 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 and 70 days after dosing. doses for PD analysis. Serum was obtained and frozen until further use. On the day of analysis, Cynomolgus sera from the respective time points were diluted to 10% in GVB++ buffer. Round bottom 96 well plates were used to measure hemolytic activity. A total of 100 μl of sensitized SRBCs (2x10 8 cells/ml) were plated in a 96-well plate at 37°C followed by the addition of 100 μl of 10% cynomolgus monkey serum from the appropriate time points. SRBC was gently mixed and incubated at 37°C for 10 min. After the incubation time, the cells were centrifuged at 1250xg at 4°C. A total of 100 µl of the supernatant was transferred to a fresh 96 flat bottom plate and read at 412 nm on a Spectramax microplate reader. Hemolytic activity was calculated at a final serum concentration of 5%. Percent hemolysis was calculated using absorbance values and the following equation:
% гемолиза = 100 х (экспериментальный лизис клеток - фоновый лизис клеток)/(максимальный лизис клеток - фоновый лизис клеток).% hemolysis = 100 x (experimental cell lysis - background cell lysis)/(maximum cell lysis - background cell lysis).
В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой OD при А412 нм для SRBC, которые инкубировали в буфере GVB++, только не содержащем сыворотку. Максимальный лизис клеток представляет собой OD при А412 нм для SRBC, которые обрабатывали водой. Результаты, выраженные в виде % гемолиза, анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрической логистической) и программного обеспечения Prism 5 (GraphPad) для получения значений IC50. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.In this equation, background cell lysis is the OD at A412 nm for SRBCs that were incubated in GVB++ buffer containing no serum. Maximum cell lysis is the OD at A412 nm for SRBCs that were treated with water. The results, expressed as % hemolysis, were analyzed using non-linear regression (4-parameter logistic) and Prism 5 software (GraphPad) to obtain IC 50 values. Data are presented as mean ± standard error of the mean.
Анализ альтернативного пути гемолиза: желаемое число красных клеток крови кролика (RbRBC) промывали в буфере GVB-Mg2+/EGTA и ресуспендировали по 2х108 клеток/мл. Кровь у яванских макаков брали перед дозированием и через 5 мин, 4 и 8 ч и 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42 и 49 суток после дозы для PD анализа. Сыворотку получали и замораживали до дальнейшего использования. Круглодонные 96-луночные планшеты использовали для того, чтобы измерять гемолитическую активность. Всего 100 мкл RbRBC (2х108 клеток/мл) высевали в 96-луночный планшет при 37°С, после чего следовало добавление 100 мкл 10% сыворотки яванского макака из соответствующих моментов времени, перечисленных выше. RbRBC мягко перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. По истечении времени инкубации, клетки центрифугировали на 1250χg при 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96-плоскодонный планшет, который считывали при 412 нм на считывателе микропланшетов Spectramax. Гемолитическую активность вычисляли для конечной концентрации в сыворотке 5% и выражали в виде процентной доли от общего гемолиза RBC с использованием воды. Процент гемолиза вычисляли, как описано выше.Alternate hemolysis pathway assay: Desired number of rabbit red blood cells (RbRBC) were washed in GVB-Mg 2+ /EGTA buffer and resuspended at 2x10 8 cells/ml. Blood was taken from cynomolgus monkeys before dosing and 5 min, 4 and 8 h and 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42 and 49 days post-dose for PD analysis. Serum was obtained and frozen until further use. Round bottom 96 well plates were used to measure hemolytic activity. A total of 100 μl of RbRBC (2x10 8 cells/ml) were plated in a 96-well plate at 37° C. followed by the addition of 100 μl of 10% cynomolgus serum from the respective time points listed above. RbRBC was gently mixed and incubated at 37°C for 60 min. After the incubation time, the cells were centrifuged at 1250χg at 4°C. A total of 100 μl of the supernatant was transferred to a fresh 96-flat bottom plate, which was read at 412 nm on a Spectramax microplate reader. Hemolytic activity was calculated for a final serum concentration of 5% and expressed as a percentage of total RBC hemolysis using water. The percentage of hemolysis was calculated as described above.
Результаты.Results.
Выбранные антитела против С5 (перечислено в табл. 1) тестировали в начальных экспериментах на пролонгированные фармакокинетические профили у яванского макака и С5-гуманизированных мышей (описано в примере 10). Н4Н12166Р и Н4Н12161Р отбирали в качестве обладающих высокой аффинностью в сочетании с пролонгированной PK и использовали в последующих экспериментах в настоящем описании с объектом сравнения 1 и объектом сравнения 2.Selected anti-C5 antibodies (listed in Table 1) were tested in initial experiments for prolonged pharmacokinetic profiles in cynomolgus monkey and C5 humanized mice (described in Example 10). H4H12166P and H4H12161P were selected as having high affinity in combination with prolonged PK and used in subsequent experiments in the present description with the object of comparison 1 and the object of comparison 2.
Яванским макакам вводили одну 15 мг/кг IV болюсную дозу Н4Н12166Р, Н4Н12161Р или объекта сравнения 2. Концентрации всех антител в сыворотке и процент активности классического пути (СР) гемолиза определяли в 19 моментов времени в течение 70-суточного прижизненного периода. Альтернативный путь (АР) гемолиза определяли в 17 моментов времени в течение 50-суточного прижизненного периода. В табл. 23 сведены средние концентрации антител для всех трех антител. Профили средних общих концентраций антител в зависимости от времени приведены на фиг. 2. Средние параметры PK описаны в табл. 24.Cynomolgus monkeys were administered a single 15 mg/kg IV bolus dose of H4H12166P, H4H12161P, or Comparator 2. Serum antibody concentrations of all and percent classical pathway (CP) hemolysis activity were determined at 19 time points over a 70-day lifetime. The alternative pathway (AR) of hemolysis was determined at 17 time points during a 50-day life span. In table. 23 summarizes the mean antibody concentrations for all three antibodies. Profiles of mean total antibody concentrations versus time are shown in FIG. 2. The average PK parameters are described in Table. 24.
- 59 039858- 59 039858
Таблица 23Table 23
Средние концентрации общего IgG в сыворотке после одной 15 мг/кг внутривенной инъекции выбранных антител против С5 самцам яванского макакаMean serum total IgG concentrations after a single 15 mg/kg intravenous injection of selected anti-C5 antibodies in male cynomolgus monkeys
SD - стандартное отклонение;SD - standard deviation;
BLQ - ниже предела количественного определения.BLQ - below the limit of quantitation.
После IV введения болюса определяли характеристики профилей зависимости концентрации общих IgG от времени для Н4Н12166Р, Н4Н12161Р и объекта сравнения 2 с помощью начальной короткой фазы распределения, после которой следует одна фаза элиминации на всем протяжении прижизненного периода. Пиковые концентрации Н4Н12166Р, Н4Н12161Р и объекта сравнения 2 хорошо поддавались сравнению, поскольку соответствующие значения Cmax/дозы среди всех антител находились в пределах 1,1 раза (29,7, 30,4 и 30,6 [(мкг/мл)/(мг/кг)] соответственно) (табл. 24).Following IV bolus administration, total IgG concentration versus time profiles for H4H12166P, H4H12161P and Comparator 2 were characterized by an initial short distribution phase followed by a single elimination phase throughout the lifetime. The peak concentrations of H4H12166P, H4H12161P and Comparator 2 were well comparable as the respective Cmax/dose values among all antibodies were within 1.1 times (29.7, 30.4 and 30.6 [(µg/mL)/(mg /kg)] respectively) (Table 24).
- 60 039858- 60 039858
Таблица 24Table 24
Средние фармакокинетические параметры для концентраций общих IgG в сыворотке после одной внутривенной инъекции выбранных антител против С5 15 мг/кг самцам яванского макакаMean pharmacokinetic parameters for serum total IgG concentrations following a single intravenous injection of selected anti-C5 antibodies 15 mg/kg in male cynomolgus monkeys
IV - внутривенно;IV - intravenously;
n - число животных;n is the number of animals;
Cmax - пиковая концентрация;C max - peak concentration;
Со - начальная концентрация, определяемая посредством экстраполяции;Co - initial concentration, determined by extrapolation;
tmax - время до Cmax;tmax - time to Cmax;
AUC - площадь под кривой концентрации-времени;AUC - area under the concentration-time curve;
AUClast - AUC, вычисленная от нулевого момента времени до времени последней положительной концентрации;AUC last - AUC calculated from time zero to the time of the last positive concentration;
AUCinf - AUC от нулевого момента времени и экстраполированная до бесконечности;AUCinf - AUC from time zero and extrapolated to infinity;
CL - общий клиренс организма;CL - total body clearance;
Vss - объем распределения в устойчивом состоянии;V ss is the volume of distribution at steady state;
t1/2 - время полужизни;t 1/2 - half-life;
SD - стандартное отклонение.SD - standard deviation.
Note - tmax выражают в номинальных часах.Note - t max is expressed in nominal hours.
Оценка профилей концентрация-время показывала, что Н4Н12166Р демонстрировало самую медленную элиминацию с конечными концентрациями антител >10 мкг/мл до суток 71 исследования. Кинетика у Н4Н12161Р и объекта сравнения 2 была схожей; оба демонстрировали более быструю элиминацию, чем Н4Н12166Р, с концентрациями mAb >10 мкг/мл к суткам 22 и 29 соответственно.Evaluation of concentration-time profiles showed that H4H12166P showed the slowest elimination with final antibody concentrations >10 μg/ml up to day 71 of the study. The kinetics of H4H12161P and Comparator 2 were similar; both showed faster elimination than H4H12166P, with mAb concentrations >10 µg/mL by days 22 and 29, respectively.
Следовательно, нормализованные по дозе экспозиции (AUQast/доза) показывали, что Н4Н12166Р имело самую высокую экспозицию 339 сутокх(мкг/мл)/(мг/кг), тогда как Н4Н12161Р и объект сравнения 2 имели приблизительно в 2 раза меньшую экспозицию, 157 и 187 сутокх(мкг/мл)/(мг/кг) соответственно, чем Н4Н12166Р.Therefore, dose-normalized exposures (AUQast/dose) indicated that H4H12166P had the highest exposure of 339 days(µg/mL)/(mg/kg), while H4H12161P and comparator 2 had approximately 2-fold lower exposure, 157 and 187 days (µg/ml)/(mg/kg), respectively, than H4H12166P.
Время полужизни антитела (t1/2), вычисленное во время фазы элиминации, находилось в диапазоне от 5,5 до 15,6 суток среди групп доз и также коррелировало с экспозицией, где Н4Н12166Р имело соответственно самое высокое t1/2 15,6 суток, тогда как Н4Н12161Р и объект сравнения 2 имели значения t1/2 5,5 и 5,9 суток соответственно.The half-life of the antibody (t 1/2 ) calculated during the elimination phase ranged from 5.5 to 15.6 days among dose groups and also correlated with exposure, where H4H12166P had the highest t 1/2 of 15.6, respectively. days, while H4H12161P and the object of comparison 2 had t 1/2 values of 5.5 and 5.9 days, respectively.
Фармакологические эффекты антител против С5 из образцов сыворотки яванского макака определяли ex vivo посредством гемолиза по классическому пути комплемента (СР) с использованием сенсибилизированных красных клеток крови овцы (SRBC) и альтернативного пути (АР) гемолиза красных клеток крови кролика (RbRBC). Ингибирование гемолитической активности вычисляли для конечной концентрации в сыворотке 5% и выражали в виде процентной доли общего гемолиза RBC с использованием воды. В табл. 25 сведена активность 3 антител ex vivo, как определяют по среднему проценту гемолиза.The pharmacological effects of anti-C5 antibodies from cynomolgus monkey serum samples were determined ex vivo by classical complement (CP) pathway hemolysis using sensitized sheep red blood cells (SRBC) and the alternative pathway (AR) rabbit red blood cell (RbRBC) hemolysis. Inhibition of hemolytic activity was calculated for a final serum concentration of 5% and expressed as a percentage of total RBC hemolysis using water. In table. 25 summarizes the activity of 3 antibodies ex vivo, as determined by the average percentage of hemolysis.
- 61 039858- 61 039858
Таблица 25Table 25
Процент активности гемолиза по классическому и альтернативному пути ex vivo для выбранных антител против С5Percentage of classical and alternative pathway hemolysis activity ex vivo for selected anti-C5 antibodies
- 62 039858- 62 039858
Время - время в часах после инъекции одной дозы;Time - time in hours after injection of a single dose;
SEM стандартная ошибка среднего;SEM standard error of the mean;
BLQ - ниже предела количественного определения;BLQ - below the limit of quantification;
NC - не вычисляли.NC - not calculated.
Как показано в табл. 25 и на фиг. 2, PD эффекты измеряли с помощью СР комплемента (инкубация 10 мин) к суткам 70. Н4Н12166Р блокировало больше чем 95% СР гемолитической активности до суток 35. Активность возвращалась к максимальным уровням гемолиза до исследования к суткам 70. Объект сравнения 2 блокировал приблизительно 95% СР гемолитической активности до суток 10, и активность быстро возвращалась к максимальным уровням гемолиза до исследования к суткам 18.As shown in Table. 25 and in FIG. 2, PD effects were measured with complement CP (10 min incubation) by day 70. H4H12166P blocked more than 95% of CP of hemolytic activity until day 35. Activity returned to pre-study maximum hemolysis levels by day 70. Comparator 2 blocked approximately 95% CP of hemolytic activity up to day 10, and the activity quickly returned to the maximum levels of hemolysis before the study by day 18.
PD эффекты также измеряли посредством анализа гемолиза по АР пути комплемента (инкубация 60 мин) до суток 49. Как показано в табл. 25 и на фиг. 3, Н4Н12166Р блокировало 80% общей АР гемолитической активности до суток 18, и активность возвращалась к максимальному уровню гемолиза до исследования к суткам 50. Н4Н1216Р и объект сравнения 2 блокировали 90% АР гемолитической активности до суток 7, и активность возвращалась к максимальным уровням гемолиза до исследования к суткам 21.PD effects were also measured by complement AR pathway hemolysis assay (60 min incubation) up to day 49. As shown in Table. 25 and in FIG. 3, H4H12166P blocked 80% of the total AR of hemolytic activity until day 18, and the activity returned to the maximum level of hemolysis before the study by day 50. H4H1216P and comparator 2 blocked 90% of the AR of hemolytic activity until day 7, and the activity returned to the maximum levels of hemolysis until research by day 21.
Пример 11. Определение характеристик PK/PD для антител против С5 у С5-гуманизированных мышей.Example 11 Characterization of PK/PD for anti-C5 antibodies in C5 humanized mice.
В этой группе экспериментов фармакокинетику и фармакодинамику выбранных антител против С5In this group of experiments, the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the selected antibodies against C5
- 63 039858 оценивали у мышей, гуманизированных для того, чтобы экспрессировать белок С5 человека с использованием технологии Velocigene® (Valenzuela et al. 2003, Nat. Biotechnol. 21:652-659). Создавали гуманизированных мышей с заменой экзонов 2-41 гена С5 мыши на экзоны 2-42 гена С5 человека (раскрыто в публикации патентной заявки США 2015/0313194, включенной в настоящее описание в полном объеме).- 63 039858 was evaluated in mice humanized to express human C5 protein using Velocigene® technology (Valenzuela et al. 2003, Nat. Biotechnol. 21:652-659). Humanized mice were created with the replacement of exons 2-41 of the mouse C5 gene with exons 2-42 of the human C5 gene (disclosed in US Patent Application Publication 2015/0313194, incorporated herein in its entirety).
Общие уровни циркулирующего С5 человека определяли с использованием Human Complement С5 ELISA (Abcam, № по каталогу ab125963), который осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя.Total human circulating C5 levels were determined using the Human Complement C5 ELISA (Abcam, cat# ab125963) performed according to the manufacturer's recommendations.
Определение общего уровня лекарственного средства в сыворотке с помощью ELISA.Determination of the total drug level in serum using ELISA.
Концентрации циркулирующих антител против С5, как связанных с С5, так и не связанных, определяли по анализ общих антител человека с использованием ELISA. В кратком изложении поликлональное антитело козы против IgG человека 1 мкг/мл в PBS иммобилизовали на 96-луночных планшетах в течение ночи; планшеты промывали для того, чтобы удалять не связанный IgG, и затем блокировали с использованием 5% BSA. Серийные разведения образцов сыворотки, содержащей антитела против С5 (6 точек) и эталонные стандарты (12 точек) для соответствующих антител, переносили в планшеты, покрытые против IgG человека, и инкубировали в течение 1 ч. Затем связанные с планшетом антитела против С5 обнаруживали с использованием поликлонального антитела козы против IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшеты проявляли с использованием субстрата ТМВ в соответствии с рекомендованным протоколом производителя, и сигналы оптической плотности (OD) при 450 нм регистрировали с использованием считывателя планшетов Perkin Elmer Victor Х4 Multimode. Концентрации антител против С5 в сыворотке вычисляли на основе калибровочной кривой эталонных стандартов, созданной с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.The concentrations of circulating anti-C5 antibodies, both associated with C5 and not, were determined by analysis of total human antibodies using ELISA. Briefly, goat anti-human IgG polyclonal antibody 1 μg/ml in PBS was immobilized in 96-well plates overnight; plates were washed to remove unbound IgG and then blocked with 5% BSA. Serial dilutions of serum samples containing anti-C5 antibodies (6 points) and reference standards (12 points) for the respective antibodies were transferred to anti-human IgG-coated plates and incubated for 1 hour. Then, anti-C5 antibodies bound to the plate were detected using goat anti-human IgG polyclonal antibody conjugated with horseradish peroxidase. The plates were developed using TMB substrate according to the manufacturer's recommended protocol, and optical density (OD) signals at 450 nm were recorded using a Perkin Elmer Victor X4 Multimode plate reader. Serum anti-C5 antibody concentrations were calculated from a calibration curve of reference standards generated using GraphPad Prism software.
Определение PK параметров.Determination of PK parameters.
PK параметры определяли с использованием некомпартментного анализа (NCA) и программного обеспечения Phoenix®WinNonlin® (версии 6.3, Certara, L.P.) и модель внесосудистого дозирования. Используя соответствующие средние значения концентраций для каждого антитела, все PK параметры, в том числе наблюдаемое оценочное время полужизни (t1/2) и площадь под кривой зависимости концентрации от времени вплоть до последней измеряемой концентрации (AUClast), определяли с использованием правила линейных трапеций с линейной интерполяцией и равномерными весами.PK parameters were determined using non-compartmental analysis (NCA) and Phoenix®WinNonlin® software (version 6.3, Certara, LP) and an extravascular dosing model. Using the respective mean concentrations for each antibody, all PK parameters, including the observed estimated half-life (t 1/2 ) and the area under the concentration versus time curve up to the last measured concentration (AUC last ), were determined using the linear trapezoid rule. with linear interpolation and uniform weights.
PD анализ посредством анализа гемолиза.PD analysis by haemolysis assay.
Фармакодинамику для выбранных антител против С5 определяли с использованием анализа гемолиза по классическому пути комплемента. Красные клетки крови овцы (SRBC) (кровь овцы в растворе Олсвера) промывали в буфере GVB++ (желатин-вероналовый буфер с CaCl2 и MgCl2) (Boston BioProducts) и ресуспендировали по 1x109 клеток/мл. Для сенсибилизации 1x109 SRBC/мл смешивали с равным объемом разведенного 1:50 гемолизина кролика против овцы (1,5 мг/мл) при 37°С в течение 20 мин. Сенсибилизированные SRBC разводили до 2x108 клеток/мл в GVB++ перед использованием в анализе гемолиза. Образцы сывороток от получавших предварительные дозы животных или гуманизированных С5 мышей, которым дозировали антитела против С5, которые брали в сутки 10, 20, 30, 40 и 50 после дозы, разводили до 20% в буфере GVB++. Всего 100 мкл сенсибилизированных SRBC (2x108 клеток/мл) высевали в 96-луночные круглодонные планшеты при 37°С, после чего следовало добавление 100 мкл 20% сыворотки, в которую добавляли 160-180 мкг/мл белка 3 комплемента человека (huC3). Клетки мягко перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После инкубации клетки центрифугировали на 1250xg при 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96-плоскодонный планшет и считывали на А412 нм в считывателе микропланшетов Spectramax. Процент гемолиза вычисляли с использованием значений поглощения и следующего уравнения:Pharmacodynamics for selected anti-C5 antibodies were determined using a classical complement pathway hemolysis assay. Sheep red blood cells (SRBC) (sheep blood in Olswer's solution) were washed in GVB++ buffer (gelatin-veronal buffer with CaCl 2 and MgCl 2 ) (Boston BioProducts) and resuspended at 1x109 cells/ml. For sensitization, 1x109 SRBC/ml was mixed with an equal volume of 1:50 diluted rabbit anti-sheep hemolysin (1.5 mg/ml) at 37°C for 20 minutes. Sensitized SRBCs were diluted to 2x10 8 cells/ml in GVB++ prior to use in the hemolysis assay. Serum samples from pre-dose animals or humanized C5 mice dosed with anti-C5 antibodies taken on days 10, 20, 30, 40 and 50 post-dose were diluted to 20% in GVB++ buffer. A total of 100 µl of sensitized SRBCs (2x10 8 cells/ml) were plated in 96-well round bottom plates at 37°C followed by the addition of 100 µl of 20% serum supplemented with 160-180 µg/ml of human complement protein 3 (huC3) . The cells were gently mixed and incubated at 37°C for 1 hour. After incubation, the cells were centrifuged at 1250xg at 4°C. A total of 100 µl of the supernatant was transferred to a fresh 96-flat bottom plate and read at A412 nm in a Spectramax microplate reader. Percent hemolysis was calculated using absorbance values and the following equation:
% гемолиза = 100 x (экспериментальный лизис клеток - фоновый лизис клеток)/(максимальный лизис клеток - фоновый лизис клеток).% hemolysis = 100 x (experimental cell lysis - background cell lysis)/(maximum cell lysis - background cell lysis).
В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от SRBC, которые инкубировали в буфере GVB++, только не содержащем сыворотку. Максимальный лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от SRBC, которые обрабатывали водой. Результаты, выраженные в виде % гемолиза, анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрическая логистическая) в программном обеспечении Prism 6 (GraphPad) для получения значений IC50. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.In this equation, the background lysis of cells is the OD at A412 nm from SRBCs that were incubated in GVB++ buffer only containing no serum. Maximum cell lysis is the OD at A412 nm from SRBCs that were treated with water. The results, expressed as % hemolysis, were analyzed using non-linear regression (4-parameter logistic) in Prism 6 software (GraphPad) to obtain IC 50 values. Data are presented as mean ± standard error of the mean.
Эксперимент 1.Experiment 1
В этом эксперименте фармакокинетику и фармакодинамику образцового антитела Н4Н12166Р оценивали в сравнении с объектом сравнения 1 и объектом сравнения 2 у гуманизированных С5 мышей. Общие уровни циркулирующего С5 человека определяли с использованием Human Complement C5 ELISA (Abcam, № по каталогу ab125963), который осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. Определяли, что усредненные концентрации С5 человека у мышей составляют 39,73±17,82 мкг/мл. Имело место различие между самцами (55,4±1,7 мкг/мл, n=47) и самками (24,7±0,6 мкг/мл, n=49) мышей.In this experiment, the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the exemplary H4H12166P antibody were compared with Comparator 1 and Comparator 2 in humanized C5 mice. Total human circulating C5 levels were determined using the Human Complement C5 ELISA (Abcam, cat# ab125963) performed according to the manufacturer's recommendations. The mean human C5 concentrations in mice were determined to be 39.73±17.82 μg/ml. There was a difference between male (55.4±1.7 µg/ml, n=47) and female (24.7±0.6 µg/ml, n=49) mice.
Перед дозированием антител самцов и самок гуманизированных С5 мышей стратифицировали в со- 64 039858 ответствии с уровнями С5 человека, которые усредненно составляли 40 мкг/мл. Для каждого антитела против С5, когорты из 22 мышей получали одну дозу Н4Н12166Р, объекта сравнения 1 или объекта сравнения 2 15 мг/кг посредством подкожной (s.c.) инъекции. У всех мышей брали кровь перед дозой и в сутки 1 после инъекции для PK анализа. Кроме того, через 10, 20, 30, 40 и 50 суток после инъекции группы из 4 или 5 мышей из каждой когорты умерщвляли и собирали терминальный образцы крови для PK и PD анализа. Образцы сыворотки в сутки 1 представляли собой среднее для всей когорты из 22 мышей. Из крови получали сыворотку и замораживали ее при -80°С до анализа.Prior to antibody dosing, male and female humanized C5 mice were stratified according to human C5 levels, which averaged 40 μg/ml. For each anti-C5 antibody, a cohort of 22 mice received a single dose of H4H12166P, Comparator 1 or Comparator 2 15 mg/kg via subcutaneous (s.c.) injection. All mice were bled pre-dose and day 1 post-injection for PK analysis. In addition, 10, 20, 30, 40 and 50 days after injection, groups of 4 or 5 mice from each cohort were sacrificed and terminal blood samples were collected for PK and PD analysis. Serum samples on day 1 were the average of the entire cohort of 22 mice. Serum was obtained from blood and frozen at -80°C until analysis.
Общие концентрации антител определяли в 7 моментов времени и процент активности гемолиза определяли в 6 моментов времени за 50-суточный прижизненный период. Все концентрации антител против С5 сведены в табл. 26. Профили средних общих концентраций антител в зависимости от времени приведены на фиг. 4. Средние PK параметры описаны в табл. 27.Total antibody concentrations were determined at 7 time points and percent hemolysis activity was determined at 6 time points over a 50-day lifetime. All concentrations of antibodies against C5 are summarized in table. 26. Profiles of mean total antibody concentrations versus time are shown in FIG. 4. Average PK parameters are described in Table. 27.
Таблица 26Table 26
Средние концентрации общего IgG в сыворотке после одной подкожной инъекции антител против С5 15 мг/кг гуманизированным С5 мышамMean serum total IgG concentrations after a single subcutaneous injection of 15 mg/kg anti-C5 antibody in humanized C5 mice
Время - время в часах после инъекции одной дозы;Time - time in hours after injection of a single dose;
сутки -сутки исследования;day-day of research;
SD - стандартное отклонение;SD - standard deviation;
SEM стандартная ошибка среднего;SEM standard error of the mean;
ND - не обнаруживали;ND - not detected;
NS - нет образцов.NS - no samples.
*Для объекта сравнения 2 в сутки 50 n=3 из-за невозможности анализа одного образца в силу технических проблем.*For object of comparison 2 per day 50 n=3 due to the impossibility of analyzing one sample due to technical problems.
Таблица 27Table 27
PK параметрыPC parameters
Cmax - пиковая концентрация;C max - peak concentration;
AUC - площадь под кривой концентрации-времени;AUC - area under the concentration-time curve;
AUClast - AUC, вычисленная от нулевого момента времени и до времени последней положительной концентрации;AUC last - AUC calculated from time zero to the time of the last positive concentration;
ti/2 - наблюдаемое оценочное время полужизни.ti/2 is the observed estimated half-life.
Профили средней концентрации в зависимости от времени в сутки 1 показывают, что три антитела Н4Н12166Р, объект сравнения 1 и объект сравнения 2 имели сравнимые концентрации в сыворотке 178, 229 и 164 мкг/мл соответственно. Объект сравнения 1 имел профиль элиминации, схожий с Н4Н12166Р, вплоть до суток 30, но в сутки 40 и 50 демонстрировал быстрое увеличение клиренса по сравнению с Н4Н12166Р. В сутки 50 Н4Н12166Р имел усредненную концентрацию антитела в сыворотке приблизительно 9 мкг/мл, тогда и как объект сравнения 1 и объект сравнения 2 имели в 30 раз сниженную усредненную концентрацию антитела в сыворотке 0,3 мкг/мл. Объект сравнения 2 демонстрировал наименьшую экспозицию из трех тестированных антител, приблизительно с 2-кратно более низкой AUClast (1408 суткихмкг/мл) по сравнению с Н4Н12166Р (2801 суткихмкг/мл) и объектом сравнения 1Mean concentration versus time profiles on day 1 show that the three antibodies H4H12166P Comparator 1 and Comparator 2 had comparable serum concentrations of 178, 229 and 164 μg/mL, respectively. Comparator 1 had an elimination profile similar to H4H12166P up to day 30, but on days 40 and 50 showed a rapid increase in clearance compared to H4H12166P. On day 50, H4H12166P had a mean serum antibody concentration of approximately 9 μg/ml, while both Comparator 1 and Comparator 2 had a 30-fold reduced mean serum antibody concentration of 0.3 μg/ml. Comparator 2 showed the lowest exposure of the three antibodies tested, with approximately 2-fold lower AUC last (1408 days xmcg/mL) compared to H4H12166P (2801 days xmcg/ml) and Comparator 1
- 65 039858 (2708 суткихмкг/мл).- 65 039858 (2708 days hmcg/ml).
Фармакологические эффекты антител против С5 Н4Н12166Р, объекта сравнения 1 и объекта сравнения 2 из образцов сыворотки гуманизированных С5 мышей с добавлением С3 человека измеряли до суток 50 и определяли ex vivo по гемолизу сенсибилизированных SRBC по классическому пути комплемента (СР). Средний процент гемолиза для каждого антитела против С5 приведен в табл. 28 и профиль среднего процента гемолиза в зависимости от времени представлен на фиг. 5.The pharmacological effects of anti-C5 antibodies H4H12166P, Comparator 1 and Comparator 2 from humanized C5 mouse sera samples supplemented with human C3 were measured up to day 50 and determined ex vivo by classical complement pathway (CP) sensitized SRBC hemolysis. The average percentage of hemolysis for each antibody against C5 is given in table. 28 and the profile of the mean percent hemolysis versus time is shown in FIG. 5.
Таблица 28Table 28
Процент активности гемолиза по классическому пути для антител против С5 человека ex vivoPercentage of classical pathway hemolysis activity for anti-human C5 antibodies ex vivo
Время - время в часах после инъекции одной дозы;Time - time in hours after injection of a single dose;
сутки - сутки исследования;day - day of research;
SEM - стандартная ошибка среднего;SEM - standard error of the mean;
ND - не обнаруживали;ND - not detected;
NS - нет образцов.NS - no samples.
*Для объекта сравнения 2 в сутки 50 n=3 из-за невозможности анализа одного образца в силу технических проблем.*For object of comparison 2 per day 50 n=3 due to the impossibility of analyzing one sample due to technical problems.
Н4Н12166Р, объект сравнения 1 и объект сравнения 2 ингибировали терминальную гемолитическую активность комплемента, по-видимому, коррелирующую с экспозициями антител. Н4Н12166Р блокировало больше чем 85% гемолитической активности до суток 30 с возвращением активности к базовым уровням перед дозой к суткам 50. Объект сравнения 1 и объект сравнения 2 блокировали приблизительно 80% гемолитической активности до суток 20 и суток 10 соответственно с возвращением активности к базовым уровням к суткам 30 для обоих.H4H12166P, Comparator 1 and Comparator 2 inhibited terminal hemolytic complement activity, apparently correlated with antibody exposures. H4H12166P blocked more than 85% of hemolytic activity up to day 30 with activity returning to baseline levels before dose by day 50. Comparator 1 and Comparator 2 blocked approximately 80% of hemolytic activity up to day 20 and day 10, respectively, with activity returning to baseline levels by day 50. 30 days for both.
Эксперимент 2.Experiment 2
В этом эксперименте фармакокинетику и фармакодинамику антител против С5 Н4Н12166Р, Н4Н12161Р, объекта сравнения 1 и изотипического контроля оценивали у гуманизированных С5 мышей (мышей, гомозиготных по экспрессии С5 человека). Общие уровни циркулирующего С5 определяли с использованием Human Complement C5 ELISA (Abcam, № по каталогу ab125963), который осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. Определяли, что усредненные концентрации С5 человека у мышей составляют 48,98 ±15,1 мкг/мл.In this experiment, the pharmacokinetics and pharmacodynamics of antibodies against C5 H4H12166P, H4H12161P, reference 1 and isotype control were evaluated in humanized C5 mice (mice homozygous for human C5 expression). Total circulating C5 levels were determined using the Human Complement C5 ELISA (Abcam, catalog # ab125963) performed according to the manufacturer's recommendations. The mean human C5 concentrations in mice were determined to be 48.98±15.1 µg/mL.
Перед дозированием антител самцов и самок гуманизированных С5 мышей стратифицировали в соответствии с уровнями С5 человека, которые усредненно составляли 50 мкг/мл. Для каждого mAb против С5, когорты из 5 мышей получали одну подкожную (s.c.) инъекцию 15 мг/кг Н4Н12166Р, Н4Н12161Р, объекта сравнения 1 или изотипического контроля. У всех мышей брали кровь перед дозой, через 6 ч, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 13, 21, 30 и 45 суток после инъекции для PK анализа. Кроме того, в сутки 59 всех мышей из каждой когорты умерщвляли и брали терминальные образцы крови для PK и PD анализа. Из крови получали сыворотку, которую замораживали при -80°С до анализа.Prior to antibody dosing, male and female humanized C5 mice were stratified according to human C5 levels, which averaged 50 μg/ml. For each anti-C5 mAb, a cohort of 5 mice received one subcutaneous (s.c.) injection of 15 mg/kg H4H12166P, H4H12161P, Comparator 1, or isotype control. All mice were bled pre-dose, 6 hours, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 13, 21, 30 and 45 days post-injection for PK analysis. In addition, on day 59, all mice from each cohort were sacrificed and terminal blood samples were taken for PK and PD analysis. Serum was obtained from the blood, which was frozen at -80°C until analysis.
Общие концентрации антител определяли в 12 моментов времени и процент активности гемолиза определяли в 1 момент времени в течение 59-суточного прижизненного периода. Общие сывороточные концентрации антител для каждого антитела против С5 сведены в табл. 29. Профили средних общих концентраций антител в зависимости от времени приведены на фиг. 6. Средние PK параметры описаны в табл. 30.Total antibody concentrations were determined at 12 time points and percent hemolysis activity was determined at 1 time point over a 59-day lifetime. Total serum antibody concentrations for each anti-C5 antibody are summarized in Table 1. 29. Profiles of mean total antibody concentrations versus time are shown in FIG. 6. Average PK parameters are described in Table. thirty.
- 66 039858- 66 039858
Таблица 29Table 29
Средние концентрации общего IgG в сыворотке после одной подкожной инъекции выбранных антител против С5 15 мг/кг гуманизированным С5 мышамMean serum total IgG concentrations after a single subcutaneous injection of selected anti-C5 antibodies 15 mg/kg in humanized C5 mice
Время - время в часах после инъекции одной дозы;Time - time in hours after injection of a single dose;
сутки - сутки исследования;day - day of research;
SD - стандартное отклонение;SD - standard deviation;
SEM стандартная ошибка среднего;SEM standard error of the mean;
ND - не обнаруживали;ND - not detected;
NS - нет образцов.NS - no samples.
Таблица 30Table 30
PK параметрыPC parameters
Cmax - пиковая концентрация;C max - peak concentration;
AUC - площадь под кривой концентрации-времени;AUC - area under the concentration-time curve;
AUClast - AUC, вычисленная от нулевого момента времени и до времени последней положительной концентрации;AUClast - AUC calculated from time zero to the time of the last positive concentration;
Т1/2 - наблюдаемое оценочное время полужизни.T 1/2 - observed estimated half-life.
Профили средних концентраций в зависимости от времени показывают, что Н4Н12166Р, Н4Н12161Р, объект сравнения 1 и изотипический контроль достигали максимальной концентрации в сыворотке (Cmax) между сутками 1 и 3, при сравнимых значениях Cmax в пределах 1,3 крат (178, 225, 183 и 221) мкг/мл соответственно. Н4Н12166Р и изотипический контроль имели схожие профили элиминации, при уровнях остающихся лекарственных средств приблизительно 4 мкг/мл в сутки 59. Н4Н12161Р демонстрировало более быстрый клиренс, чем Н4Н12166Р и изотипический контроль, но выводилось более медленно, чем объект сравнения 1. В сутки 59 Н4Н12161Р имело средний сывороточный уровень лекарственного средства 0,6 мкг/мл, тогда как объект сравнения 1 имел почти неподдающийся обнаружению уровень лекарственного средства 0,08 мкг/мл.Mean concentration-time profiles show that H4H12166P, H4H12161P, reference 1, and isotype control reached maximum serum concentration ( Cmax ) between days 1 and 3, with comparable Cmax values within 1.3-fold (178, 225 , 183 and 221) µg/mL, respectively. H4H12166P and isotype control had similar elimination profiles, with residual drug levels of approximately 4 µg/mL on day 59. H4H12161P showed faster clearance than H4H12166P and isotype control, but was cleared more slowly than comparator 1. On day 59, H4H12161P had an average serum drug level of 0.6 μg/ml, while Comparator 1 had an almost undetectable drug level of 0.08 μg/ml.
Изотипический контроль, Н4Н12166Р и Н4Н12161Р демонстрировали сравнимые значения экспозиции (AUClast) в пределах 1,3 крат (4080, 3490 и 3040 суткихмкг/мл соответственно), тогда как объект сравнения 1 проявлял в 1,6 раза более низкую экспозицию (2240 суткихмкг/мл) по сравнению с Н4Н12166Р.The isotype control, H4H12166P and H4H12161P showed comparable exposure values (AUC last ) within 1.3 times (4080, 3490 and 3040 days xmcg/ml, respectively), while the object of comparison 1 showed a 1.6 times lower exposure (2240 days xmcg/ml, respectively). ml) compared with H4H12166P.
Пример 12. Анализ на основе LC-MRM-MS для определения концентрации общего С5 человека.Example 12 LC-MRM-MS based assay for determination of human total C5 concentration.
В этом примере концентрации общего С5 человека в сыворотке определяли с использованием жидкостной хроматографии в сочетании со способом масс-спектрометрического мониторинга множества реакций (LC-MRM-MS) в исследовании фармакокинетики/фармакодинамики антитела против С5 Н4Н12166Р.In this example, human total C5 serum concentrations were determined using liquid chromatography in combination with a multi-reaction mass spectrometric monitoring (LC-MRM-MS) method in a pharmacokinetic/pharmacodynamic study of the anti-C5 antibody H4H12166P.
Концентрации общего С5 человека в сыворотке определяли посредством измерения концентрацииSerum human total C5 concentrations were determined by measuring the concentration
- 67 039858- 67 039858
10-аминокислотного пептида LQGTLPVEAR (а. о. 1129-1138 в SEQ ID NO: 359), содержащегося в последовательности С5, в качестве посредника для С5. Теоретически этот способ также позволяет обнаруживать С5Ь - продукт расщепления С5. Однако из-за нестабильности свободного С5Ь концентрации С5Ь в сыворотке в целом низки, а большинство С5Ь связано с клеточными поверхностями в форме комплексов MAC (Cooper & Muller-Eberhard, 1970, J. Exp. Med. 132:775-93; Hadders et al. 2012, Cell Rep. 1:200-7). Следовательно, обработанные образцы сыворотки, которые анализировали здесь, вероятно содержат только несущественные количества продукта С5Ь, если вообще содержат.The 10-amino acid peptide LQGTLPVEAR (a.o. 1129-1138 in SEQ ID NO: 359) contained in the C5 sequence as a C5 mediator. Theoretically, this method also allows the detection of C5b, a C5 cleavage product. However, because of the instability of free C5b, serum C5b concentrations are generally low, and most C5b is bound to cell surfaces in the form of MAC complexes (Cooper & Muller-Eberhard, 1970, J. Exp. Med. 132:775-93; Hadders et al 2012, Cell Rep. 1:200-7). Therefore, the processed serum samples analyzed here probably contain only insignificant amounts of the C5b product, if at all.
Способы.Ways.
Для PK/PD исследования мыши получали одну дозу Н4Н12166Р 15 мг/кг посредством подкожной (s.c.) инъекции. У всех мышей брали кровь перед дозой и в сутки 1 после инъекции для PK анализа. Кроме того, через 10, 20, 30, 40, 50 и 60 суток после инъекции мышей умерщвляли и брали терминальные образцы крови для PK и PD анализа.For the PK/PD study, mice received a single dose of H4H12166P 15 mg/kg via subcutaneous (s.c.) injection. All mice were bled pre-dose and day 1 post-injection for PK analysis. In addition, 10, 20, 30, 40, 50 and 60 days after injection, mice were sacrificed and terminal blood samples were taken for PK and PD analysis.
С5 человека использовали в качестве эталонного стандарта для калибровки и пептид С5 человека, полученный с использованием С-концевого остатка аргинина, меченного стабильным изотопом, использовали в качестве внутреннего стандарта (LQGTLPVEAR-13C615N4). Эталонный стандарт использовали в концентрациях в диапазоне от 3,9 до 250 мкг/мл (серийные разведения 1:2) в сыворотке от самостоятельно созданных мышей с нокаутом С5, у которых удаляли ген С5 мыши (С5-/-). Сыворотку от С5-/- мышей также использовали в качестве отрицательного контроля (пустая проба). Калибровочные стандарты, пустые пробы и исследуемые образцы сыворотки (10 мкл кажд.) сушили и затем денатурировали в 100 мкл буфера из 8 М мочевины/20 мМ трис-(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) при 37°С в течение 1 ч. Затем 10 мкл 25 нМ внутреннего стандарта добавляли во все образцы. Образцы алкилировали с использованием 10 мМ 2-йодацетамида при комнатной температуре в течение 30 мин и разводили с использованием 50 мМ бикарбоната аммония до конечного объема 500 мкл. Затем образцы расщепляли трипсином (1:20 мас./мас.) в течение ночи при 37°С. Триптический пептид LQGTLPVEAR, происходящий из С5, обнаруживали и определяли количественно с помощью LC-MRM-MS, используя Waters Xevo TQ-S с системой ACQUITY UPLC. Каждый обработанный образец (10 мкл) инъецировали в предварительно уравновешенную колонку ACQUITY UPLC ВЕН С18. Скорость потока составляла 0,6 мл/мин (подвижная фаза А: вода:муравьиная кислота/100:0,1 [об./об.] и подвижная фаза В: ацетонитрил:муравьиная кислота/100:0,1 [об./об.]). Время удержания и площадь пика определяли с использованием программного обеспечения Masslynx Analyst Data (Waters). Концентрации анализируемого вещества С5 вычисляли по калибровочной кривой, которую создавали посредством построения графика соотношения площадей пиков для эталонного стандарта С5 (не меченный пептид С5 LQGTLPVEAR-12C614N4, созданный триптическим расщеплением hC5) и внутреннего стандарта (пептид С5, меченный стабильным изотопом) в зависимости от номинальной концентрации эталонного стандарта С5. Концентрации вычисляли с использованием линейной регрессии. Наименьшая концентрация эталонного стандарта С5 (3,9 мкг/мл) находилась в динамическом диапазоне анализа, и ее определяли в качестве LLOQ анализа.Human C5 was used as a reference standard for calibration, and human C5 peptide prepared using a stable isotope labeled C-terminal arginine residue was used as an internal standard (LQGTLPVEAR-13C615N4). The reference standard was used at concentrations ranging from 3.9 to 250 μg/ml (1:2 serial dilutions) in sera from self-generated C5 knockout mice that had the mouse C5 gene deleted (C5 -/- ). Serum from C5 −/− mice was also used as a negative control (blank). Calibration standards, blanks and test serum samples (10 µl each) were dried and then denatured in 100 µl of 8 M urea/20 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) buffer at 37°C for 1 hour. Then 10 μl of 25 nM internal standard was added to all samples. Samples were alkylated with 10 mM 2-iodoacetamide at room temperature for 30 min and diluted with 50 mM ammonium bicarbonate to a final volume of 500 µl. The samples were then digested with trypsin (1:20 w/w) overnight at 37°C. The C5-derived tryptic peptide LQGTLPVEAR was detected and quantified by LC-MRM-MS using a Waters Xevo TQ-S with an ACQUITY UPLC system. Each treated sample (10 μl) was injected into a pre-equilibrated ACQUITY UPLC BEN C18 column. The flow rate was 0.6 ml/min (mobile phase A: water:formic acid/100:0.1 [v/v] and mobile phase B: acetonitrile:formic acid/100:0.1 [v/v]). about.]). Retention time and peak area were determined using Masslynx Analyst Data (Waters) software. C5 analyte concentrations were calculated from a calibration curve that was generated by plotting the peak area ratio of the C5 reference standard (LQGTLPVEAR- 12 C6 14 N4 unlabeled C5 peptide generated by tryptic digestion of hC5) and the internal standard (C5 peptide labeled with a stable isotope) in depending on the nominal concentration of the C5 reference standard. Concentrations were calculated using linear regression. The lowest concentration of the C5 reference standard (3.9 μg/mL) was within the dynamic range of the assay and was determined as an LLOQ assay.
Результаты.Results.
Концентрации общего С5 человека в сыворотке оценивали для взятых образцов и через взятие крови из хвоста перед дозированием (перед дозой) и через терминальное взятие крови в сутки 10, 30 и 35 у соответствующих животных. Общие концентрации hC5 после дозирования Н4Н12166Р были схожими (в пределах от ~1 до 0,9 крат) с уровнями перед дозой в сутки 10, 30 и 35 после дозирования. Наблюдаемые небольшие различия не были статистически значимыми, как оценивали с помощью критерия МаннаУитни, используя программное обеспечение GraphPad Prism. Анализ молярного соотношения С5/Н4Н12166Р демонстрировал, что Н4Н12166Р оставался в молярном избытке относительно С5 до суток 35 после дозирования (табл. 31).Human total C5 serum concentrations were assessed for samples taken from both pre-dose tail blood draws (pre-dose) and terminal blood draws on days 10, 30 and 35 in the respective animals. Total hC5 concentrations post-dosing with H4H12166P were similar (ranging ~1 to 0.9-fold) to pre-dose levels on days 10, 30, and 35 post-dosing. The small differences observed were not statistically significant as assessed by the Mann-Whitney test using GraphPad Prism software. Molar ratio analysis of C5/H4H12166P showed that H4H12166P remained in molar excess relative to C5 until day 35 post dosing (Table 31).
Таблица 31Table 31
Сводка PD характеристик для Н4Н12166РSummary of PD characteristics for H4H12166R
- 68 039858 a Процентную долю ингибирования СР гемолитической активности вычисляли по средним значениям % СР гемолиза в указанные сутки после дозирования относительно среднего значения % СР гемолиза в сутки 0.- 68 039858 a The percentage of CP inhibition of hemolytic activity was calculated from the average % CP hemolysis on the indicated day after dosing relative to the average % CP hemolysis on day 0.
b Кратность изменения - терминальный (указанные сутки после дозирования) С5:С5 перед дозой. b Frequency rate of change - terminal (indicated days after dosing) C5:C5 before the dose.
SD - стандартное отклонение.SD - standard deviation.
МАНА - антитело мыши против человека. n/d - не определяли.MANA is a mouse anti-human antibody. n/d - not determined.
Животных с данными, на которые влияли МАНА, полностью исключали из вычислений (2х сутки 30, 1х сутки 35, 2х сутки 40 и все 4 мыши в сутки 50).Animals with data affected by MANA were completely excluded from the calculations (2x day 30, 1x day 35, 2x day 40 and all 4 mice on day 50).
Пример 13. Картирование эпитопов для связывания Н4Н12166Р с С5 по водород-дейтериевому обмену.Example 13 Mapping of epitopes for binding H4H12166P to C5 by hydrogen-deuterium exchange.
Картирование эпитопов по H/D обмену с масс-спектрометрией осуществляли для того, чтобы определять аминокислотные остатки hC5 (аминокислоты М1-С1676 из SEQ ID NO: 359), с которыми взаимодействует Н4Н12166Р. Общее описание способа H/D обмена приведено, например, в Ehring (1999), Analytical Biochemistry, 267(2):252-259; and Engen and Smith (2001), Anal. Chem. 73:256A-265A.Epitope mapping by H/D exchange with mass spectrometry was performed in order to determine the hC5 amino acid residues (M1-C1676 amino acids of SEQ ID NO: 359) with which H4H12166P interacts. A general description of the H/D exchange method is given, for example, in Ehring (1999), Analytical Biochemistry, 267(2):252-259; and Engen and Smith (2001), Anal. Chem. 73:256A-265A.
HDX-MS эксперименты осуществляли на интегрированной платформе Waters HDX/MS, состоящей из системы Leaptec HDX PAL для мечения дейтерием, Waters Acquity M-Class (Auxiliary solvent manager) для расщепления образцов и загрузки, Waters Acquity M-Class (p,Binary solvent manager) для градиента аналитической колонки и масс-спектрометр Synapt G2-Si для измерения масс пептических пептидов.HDX-MS experiments were performed on an integrated Waters HDX/MS platform, consisting of a Leaptec HDX PAL system for deuterium labeling, Waters Acquity M-Class (Auxiliary solvent manager) for sample digestion and loading, Waters Acquity M-Class (p,Binary solvent manager ) for the analytical column gradient and a Synapt G2-Si mass spectrometer for measuring the masses of peptic peptides.
Раствор для мечения получали в 10 мМ буфере PBS в D2O при pD 7,0 (эквивалент рН 6,6). Для мечения дейтерием 3,8 мкл С5 (6 пмоль/мкл) или С5, предварительно смешанный с антителом в молярном соотношении 1:1, инкубировали с 56,2 мкл D2O раствора для мечения для различных моментов времени (например, не дейтерированный контроль = 0 с, метили в течение 1 и 20 мин). Дейтерирование гасили посредством переноса 50 мкл образца в 50 мкл предварительно охлажденного гасящего буфера (0,2 М ТСЕР, 6 М хлорид гуанидина в 100 мМ фосфатном буфере, рН 2,5) и смешанный образец инкубировали при 1,0°С в течение 2 мин. Затем погашенный образец впрыскивали в Waters HDX Manager для встроенного расщепления пепсином/протеазой XIII. Расщепленные пептиды улавливали на предколонке ACQUITY UPLC ВЕН С18 VanGuard 1,7-мкм, 2,1 х5 мм при 0°С и элюировали в аналитическую колонкуThe labeling solution was prepared in 10 mM PBS buffer in D2O at pD 7.0 (equivalent to pH 6.6). For deuterium labeling, 3.8 µl of C5 (6 pmol/µl) or C5 premixed with antibody at a 1:1 molar ratio was incubated with 56.2 µl of D2O labeling solution for various time points (e.g., non-deuterated control = 0 s, labeled for 1 and 20 min). Deuteration was quenched by transferring 50 µl of the sample to 50 µl of pre-chilled quenching buffer (0.2 M TCEP, 6 M guanidine chloride in 100 mM phosphate buffer, pH 2.5) and the mixed sample was incubated at 1.0°C for 2 min . The quenched sample was then injected into the Waters HDX Manager for inline pepsin/protease XIII digestion. Cleaved peptides were captured on an ACQUITY UPLC VEN C18 VanGuard 1.7-µm, 2.1 x5 mm guard column at 0°C and eluted onto an analytical column.
ACQUITY UPLC ВЕН С18 1,7-мкм, 1,0х50 мм в течение 9-минутного градиентного разделения 5-40% В (подвижная фаза А: 0,1% муравьиная кислота в воде, подвижная фаза В: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле). Масс-спектрометр настраивали на напряжение на конусе 37 В, время сканирования 0,5 с и диапазон масса/заряд 50-1700 единиц Томсона (Th).ACQUITY UPLC VEN C18 1.7-µm, 1.0x50 mm for 9-minute gradient separation 5-40% B (mobile phase A: 0.1% formic acid in water, mobile phase B: 0.1% formic acid in acetonitrile). The mass spectrometer was set to a 37 V cone voltage, a scan time of 0.5 s, and a mass/charge range of 50-1700 Thomson units (Th).
Для идентификации пептидов из С5 человека данные LC-MSE от недейтерированного образца обрабатывали и проводили поиск в базе данных, содержащей С5 человека, пепсин и их рандомизированные последовательности через программное обеспечение Waters ProteinLynx Global Server (PLGS).To identify peptides from human C5, LC-MSE data from a non-deuterated sample were processed and searched in a database containing human C5, pepsin and their randomized sequences via Waters ProteinLynx Global Server (PLGS) software.
Идентифицированные пептиды импортировали в программное обеспечение DynamX и осуществляли фильтрацию по двум критериям: (1) минимум продуктов на аминокислоту = 0,3 и (2) порог файлов репликации = 3. Затем программное обеспечение DynamX автоматически определяло захват дейтерия для каждого пептида на основе времени удержания и высокой точности массы (<10 ч./млн) для множества моментов времени с тремя повторениями для каждого времени.The identified peptides were imported into the DynamX software and filtered by two criteria: (1) minimum products per amino acid = 0.3 and (2) replication files threshold = 3. The DynamX software then automatically determined the deuterium uptake for each peptide based on the retention time and high mass accuracy (<10 ppm) for multiple time points with three repetitions for each time.
Используя встроенную колонку с пепсином/протеазой XIII, сопряженную с регистрацией данных MSE, всего 189 пептидов из С5 человека идентифицировали в отсутствии или присутствии антитела, что представляет покрытие последовательности 62%. В табл. 32 проиллюстрированы пять пептидов, которые имели значительно сниженный захват при дейтерировании (центроидные дельта-значения >0,9 Да с р-значениями <0,05), когда связаны с Н4Н12166Р.Using an inline pepsin/protease XIII column coupled to MSE data recording, a total of 189 peptides from human C5 were identified in the absence or presence of antibody, representing a sequence coverage of 62%. In table. 32 illustrates five peptides that had significantly reduced deuteration uptake (centroid delta values >0.9 Da with p values <0.05) when bound to H4H12166P.
Таблица 32Table 32
Дейтерирование пептидов С5 человека при связывании с Н4Н12166РDeuteration of human C5 peptides upon binding to H4H12166P
- 69 039858- 69 039858
Зарегистрированная масса пептида соответствует усредненному значению центроидной МН+ массы из трех повторений. Эти пептиды, соответствующие аминокислотам 591-599 и 775-794, имели более низкую скорость дейтерирования при связывании с Н4Н12166Р. Эти идентифицированные остатки также соответствуют остаткам 591-599 и 775-794 в С5 человека, как определено с помощью записи Uniprot P01031 (CO5_HUMAN; SEQ ID NO: 359).The registered mass of the peptide corresponds to the average value of the centroid MH+ mass from three repetitions. These peptides, corresponding to amino acids 591-599 and 775-794, had a lower rate of deuteration when bound to H4H12166P. These identified residues also correspond to residues 591-599 and 775-794 in human C5 as determined by Uniprot entry P01031 (CO5_HUMAN; SEQ ID NO: 359).
Пример 14. Эффект антител против С5, оказываемый на воспаление глаза в экспериментальном аутоиммунном увеите у мышей.Example 14 Effect of anti-C5 antibodies on ocular inflammation in experimental autoimmune uveitis in mice.
Данное исследование проводили для того, чтобы оценивать роль С5 в экспериментальном аутоиммунном увеите (EAU). Использовали как генетический [нокаут С5 (KO), мыши с двойным С3/С5 KO], так и фармакологический (антитело против С5) экспериментальные подходы.This study was conducted to evaluate the role of C5 in experimental autoimmune uveitis (EAU). Both genetic [C5 knockout (KO), dual C3/C5 KO mice] and pharmacological (anti-C5 antibody) experimental approaches were used.
Способы.Ways.
Использовали взрослых мышей C57BL/6J (n=25, Jackson labs), мышей с С5 KO (n=13) и С3/С5 KO (n=8) (Regeneron Pharmaceuticals Inc.). EAU индуцировали посредством подкожной инъекции пептида межфоторецепторного ретиноид-связывающего белка человека (IRBP, New England Peptide) в полном адъюванте Фрейнда и интраперитонеальной инъекции токсина коклюша. mAb против С5 мыши или mAb изотипического контроля вводили через подкожные инъекции каждые 3 суток от суток 5 до суток 28. Антитело против С5 мыши, использованное в этом исследовании (M1M17628N), содержало HCVR/LCVR из SEQ ID NO: 362/363. SPECTRALIS® HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Inc.) использовали для того, чтобы оценивать уровни воспаления в сутки -1, 7, 14, 21 и 28. Всех животных умерщвляли в сутки 28 для взятия глаз и крови. Анализ гемолиза с/без С3 человека осуществляли для валидации ингибирования комплемента. Данные анализировали посредством ANOVA.Adult C57BL/6J mice (n=25, Jackson labs), C5 KO (n=13) and C3/C5 KO (n=8) mice (Regeneron Pharmaceuticals Inc.) were used. EAU was induced by subcutaneous injection of human interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP, New England Peptide) peptide in complete Freund's adjuvant and intraperitoneal injection of pertussis toxin. The anti-mouse C5 mAb or isotype control mAb was administered via subcutaneous injection every 3 days from day 5 to day 28. The anti-mouse C5 antibody used in this study (M1M17628N) contained the HCVR/LCVR of SEQ ID NO: 362/363. SPECTRALIS® HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Inc.) was used to assess inflammation levels on days -1, 7, 14, 21 and 28. All animals were sacrificed on day 28 for eye and blood sampling. A hemolysis assay with/without human C3 was performed to validate complement inhibition. Data was analyzed by ANOVA.
Результаты.Results.
По сравнению с мышами дикого типа возникновение воспаления (30-50%) и число клеточных кластеров стекловидного тела были значительно снижены у С5 KO мышей (р<0,01). Оценки оптической когерентной томографии (ОСТ) у С5 KO мышей также значительно снижены 50% на неделе 3 (р<0,0001). Интересно, что у мышей с двойным С3/С5 KO значительно больше клеточных кластеров стекловидного тела и выше оценки заболевания к суткам 28 по сравнению с мышами дикого типа (р<0,05). У животных, которые получали Ab против mC5 (50 мг/кг), заболеваемость воспалением и клеточные кластеры стекловидного тела значительно снижены по сравнению с отсутствием лечения или изотипической контрольной группой к суткам 21 (р<0,01). В недели 3 и 4 оценки ОСТ в группе лечения антителом против С5 значительно ниже по сравнению с отсутствием лечения или изотипическим контролем (р<0,0001), (фиг. 7) Анализ гемолиза с/без С3 человека подтверждал эффект ингибирования антителом против С5 в неделю 4 (фиг. 8).Compared to wild-type mice, the occurrence of inflammation (30-50%) and the number of vitreous cell clusters were significantly reduced in C5 KO mice (p<0.01). Optical coherence tomography (OCT) scores in C5 KO mice were also significantly reduced by 50% at week 3 (p<0.0001). Interestingly, dual C3/C5 KO mice have significantly more vitreous cell clusters and higher disease scores at day 28 compared to wild-type mice (p<0.05). In animals that received anti-mC5 Ab (50 mg/kg), the incidence of inflammation and vitreous cell clusters were significantly reduced compared to no treatment or isotype control group by day 21 (p<0.01). At weeks 3 and 4, the OCT scores in the anti-C5 antibody treatment group were significantly lower compared to no treatment or isotype control (p<0.0001), (Fig. 7). week 4 (Fig. 8).
Заключение.Conclusion.
Воспаление глаз из-за EAU смягчали посредством ингибирования активности С5, через генетическую делецию или фармакологическое ингибирование с использованием специфического антитела против С5. Истощение С5 задерживало возникновение EAU и снижало ОСТ оценку заболевания. Эти результаты показывают, что С5 является потенциальной терапевтической мишенью при аутоиммунном увеите. Антитело против С5 оказывает защитный эффект при заболевании EAU у мышей дикого типа. Находки авторов изобретения также подсказывают, что С3 может быть полезен для заболевания EAU у мышей.Eye inflammation due to EAU was alleviated by inhibition of C5 activity, through genetic deletion, or pharmacological inhibition using a specific anti-C5 antibody. Depletion of C5 delayed the onset of EAU and reduced the OST score of the disease. These results indicate that C5 is a potential therapeutic target in autoimmune uveitis. The anti-C5 antibody has a protective effect on EAU disease in wild-type mice. The inventors' findings also suggest that C3 may be beneficial for EAU disease in mice.
Пример 15. Эффект антител против С5 человека, оказываемый на экспериментальный аутоиммунный увеит.Example 15 Effect of anti-human C5 antibodies on experimental autoimmune uveitis.
В этом примере описаны эффекты антител к С5 против С5 человека в модели экспериментального аутоиммунного увеита (EAU) на мышах. Мышей, которых использовали в этом исследовании, гуманизировали для того, чтобы экспрессировать белок С5 человека, используя технологию Velocigene® (Valenzuela et al. 2003, Nat. Biotechnol. 21:652-659). Создавали гуманизированных мышей с заменой экзонов 2-41 гена С5 мыши на экзоны 2-42 гена С5 человека (раскрыто в публикации патентной заявки США 2015/0313194, включенной в настоящее описание в полном объеме).This example describes the effects of anti-human C5 antibodies in an experimental autoimmune uveitis (EAU) mouse model. The mice used in this study were humanized to express human C5 protein using Velocigene® technology (Valenzuela et al. 2003, Nat. Biotechnol. 21:652-659). Humanized mice were created with the replacement of exons 2-41 of the mouse C5 gene with exons 2-42 of the human C5 gene (disclosed in US Patent Application Publication 2015/0313194, incorporated herein in its entirety).
Способы.Ways.
Взрослых самцов мышей иммунизировали подкожно в каждое бедро с использованием 150 мкг пептида 1-20 (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD) (SEQ ID NO: 364) межфоторецепторного ретиноидсвязывающего белка (IRBP) человека (Avichezer et al. 2000, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41:127-131) в 0,2 мл эмульсии CFA, с добавлением штамма Mycobacterium tuberculosis H37RA до 2,5 мг/мл. Затем мы- 70 039858 шам интраперитонеально инокулировали 1,0 мкг токсина коклюша (РТХ) для того, чтобы содействовать индукции клеточно-опосредованного аутоиммунитета, содействуя Thi-поляризации иммунного ответа (Thurau et al. 1997, Clin. Exp. Immunol. 109:370-376; Silver et al. 1999, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40:28982905). Мониторинг массы тела животных осуществляли два раза в неделю.Adult male mice were immunized subcutaneously in each thigh with 150 μg of peptide 1-20 (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD) (SEQ ID NO: 364) human interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP) (Avichezer et al. 2000, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41: 127-131) in 0.2 ml CFA emulsion, supplemented with Mycobacterium tuberculosis H37RA strain up to 2.5 mg/ml. Mice were then intraperitoneally inoculated with 1.0 μg of pertussis toxin (PTX) to help induce cell-mediated autoimmunity by promoting Thi polarization of the immune response (Thurau et al. 1997, Clin. Exp. Immunol. 109:370 -376; Silver et al. 1999, Invest Ophthalmol Vis Sci 40:28982905). The body weight of the animals was monitored twice a week.
Офтальмологические осмотры осуществляли в сутки -1, перед индукцией EAU и в сутки 7, 14, 21 и 28. Мышей анестезировали кетамином (120 мг/кг, IP) и ксилазином (5 мг/кг, IP). Зрачки расширяли с использованием 0,5% офтальмологического раствора тропикамида и исследовали дно глаза с использованием контактной линзы с фундус-камерой в системе платформы ангиографии сетчатки (HRA) Spectralis Heidelberg+OCT (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, USA).Ophthalmic examinations were performed on day -1, before EAU induction and on days 7, 14, 21 and 28. Mice were anesthetized with ketamine (120 mg/kg, IP) and xylazine (5 mg/kg, IP). Pupils were dilated with 0.5% tropicamide ophthalmic solution and the fundus of the eye was examined using a fundus camera contact lens in the Spectralis Heidelberg+OCT retinal angiography (HRA) platform system (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, USA).
Серию из 61 латерального оптического разреза получали для каждого глаза с использованием ОСТ функции в системе Spectralis HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, USA). Область ОСТ визуализации центровали на оптическом диске, делая возможной равную визуализацию над и под головкой зрительного нерва. Толщину сетчатки измеряли как расстояние между нижней частью слоя RPE и внутренней пограничной мембраной глаза. Измерения выполняли в 1500 мкм от диска зрительного нерва и значения из четырех различных квадратов сетчатки (например, верхнего, нижнего, височного и носового) усредняли для получения средней толщины сетчатки глаза.A series of 61 lateral optical sections were obtained for each eye using the OCT function in the Spectralis HRA+OCT system (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, USA). The OCT imaging area was centered on the optical disc, allowing equal visualization above and below the optic nerve head. Retinal thickness was measured as the distance between the bottom of the RPE layer and the inner limiting membrane of the eye. Measurements were taken at 1500 µm from the optic nerve head and values from four different retinal squares (eg, superior, inferior, temporal, and nasal) were averaged to obtain an average retinal thickness.
Также на ОСТ изображениях тяжесть инфильтрации стекловидного тела воспалительными клетками ранжировали посредством оценки усредненного числа воспалительных клеточных кластеров в стекловидном теле, в четырех латеральных ОСТ сканированиях, которые пересекали зрительный нерв, на каждый глаз.Also on OCT images, the severity of vitreous infiltration with inflammatory cells was ranked by assessing the average number of inflammatory cell clusters in the vitreous, in four lateral OCT scans that crossed the optic nerve, for each eye.
Разрабатывали шкалу из 4 степеней для оценки тяжести заболевания на ОСТ изображениях (ОСТ оценки) (табл. 33).A 4-degree scale was developed to assess disease severity on OCT images (OST scores) (Table 33).
Таблица 33Table 33
Оценка EAU in vivo с использованием оптической когерентной томографии (ОСТ)EAU assessment in vivo using optical coherence tomography (OCT)
- 71 039858- 71 039858
Статистический анализ.Statistical analysis.
Статистический анализ параметрических данных (масса тела, воспалительные клеточные кластеры в стекловидном теле и толщина сетчатки) осуществляли посредством однофакторного дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Тьюки. Для непараметрических данных (оценки ОСТ и гистологические оценки) анализ осуществляли посредством критерий Краскела-Уоллиса и критерия Данна с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 5.0d в отношении изотипического контроля или групп без лечения. Данные представляют средние значения ± SEM. р-значения меньше 0,05 считали статистически значимыми.Statistical analysis of parametric data (body weight, inflammatory cell clusters in the vitreous body and retinal thickness) was performed by one-way analysis of variance and Tukey's multiple comparison test. For non-parametric data (OCT scores and histological scores), analysis was performed by Kruskal-Wallis test and Dunn test using GraphPad Prism version 5.0d software against isotype controls or no treatment groups. Data represent means ± SEM. p-values less than 0.05 were considered statistically significant.
Результаты.Results.
В первом исследовании (исследование А) мышей лечили подкожно каждые 3 суток от суток 5 изотипическим контрольным антителом (50 мг/кг) или 10 мг/кг, или 50 мг/кг Н4Н12170Р. Лечение с использованием 10 мг/кг Н4Н12170Р вело к снижению воспаления и повреждения сетчатки (фиг. 9). Мыши, которых лечили с использованием 10 мг/кг Н4Н12170Р, также демонстрировали статистически значимое снижение оценок ОСТ к суткам 21 и суткам 28 (фиг. 10).In the first study (study A), mice were treated subcutaneously every 3 days from day 5 with isotype control antibody (50 mg/kg) or 10 mg/kg or 50 mg/kg H4H12170P. Treatment with 10 mg/kg H4H12170P led to a reduction in inflammation and retinal damage (FIG. 9). Mice treated with 10 mg/kg H4H12170P also showed a statistically significant decrease in OCT scores by day 21 and day 28 (FIG. 10).
Во втором исследовании (исследование В) мышей лечили подкожно каждые 3 суток от суток 6 с использованием изотипического контроля (10 мг/кг), 3 мг/кг или 10 мг/кг Н4Н12166Р или с использованием объекта сравнения 2 (см. пример 2 в настоящем описании; контрольные конструкции, используемые в следующих примерах). Лечение с использованием Н4Н12166Р или по 3 мг/кг, или по 10 мг/кг вызывало дозозависимое снижение оценок ОСТ, которое было статистически значимым в сутки 14-28 (фиг. 11). Лечение с использованием 10 мг/кг Н4Н12166Р у С5 гуманизированных мышей начиная с 6 суток после индукции EAU вело к дозозависимому снижению воспаления и повреждения сетчатки, как определяют посредством ОСТ, проведенной в сутки 14-28 (фиг. 12).In the second study (study B), mice were treated subcutaneously every 3 days from day 6 using an isotype control (10 mg/kg), 3 mg/kg or 10 mg/kg H4H12166P or using comparator 2 (see Example 2 herein). description; control constructs used in the following examples). Treatment with either H4H12166P at either 3 mg/kg or 10 mg/kg caused a dose-dependent decrease in OCT scores that was statistically significant on days 14-28 (FIG. 11). Treatment with 10 mg/kg H4H12166P in C5 humanized mice from day 6 post-EAU induction resulted in a dose-dependent reduction in inflammation and retinal damage as measured by OCT performed on days 14-28 (FIG. 12).
Для обоих исследований неинвазивная прижизненная оценка с помощью ОСТ демонстрировала прогрессирующее развитие воспаления, увеличение толщины сетчатки и морфологические аномалии у контрольных животных после иммунизации с использованием IRBP.For both studies, non-invasive ante-mortem evaluation with OCT demonstrated progressive inflammation, increased retinal thickness, and morphological abnormalities in control animals after immunization with IRBP.
Заключение.Conclusion.
Эти эксперименты предоставляют дополнительное фармакологическое свидетельство того, что С5 играет роль в патогенезе аутоиммунного увеита. Фармакологическое истощение С5 человека с помощью антитела полностью человека против С5 человека отсрочивало заболеваемость EAU и снижало тяжесть заболевания, подтверждая эффект этих антител при аутоиммунном увеите.These experiments provide additional pharmacological evidence that C5 plays a role in the pathogenesis of autoimmune uveitis. Pharmacological depletion of human C5 with a fully human anti-human C5 antibody delayed the incidence of EAU and reduced disease severity, confirming the effect of these antibodies in autoimmune uveitis.
Пример 16. Эффект антител против С5, оказываемый на реперфузионное повреждение при почечной ишемии.Example 16 Effect of anti-C5 antibodies on reperfusion injury in renal ischemia.
Данное исследование осуществляли для того, чтобы оценивать роль С5 при реперфузионном повреждении при почечной ишемии. Использовали как генетический (с использованием мышей с нокаутом С3 и нокаутом С5), так и фармакологический подходы (с использованием антител против С5). Модель реперфузии при ишемии создавали посредством билатерального пережатия ножек сосудов почек наThis study was carried out in order to evaluate the role of C5 in reperfusion injury in renal ischemia. Both genetic (using C3 knockout and C5 knockout mice) and pharmacological approaches (using anti-C5 antibodies) were used. The model of reperfusion during ischemia was created by bilateral clamping of the legs of the renal vessels on
- 72 039858 мин, после чего следовало 48 ч реперфузии. Имитация лапаротомии служила в качестве контроля. Антитело против С5 вводили по 50 мг/кг внутривенно в однократной дозе непосредственно после ишемии (лечебная) или подкожно в виде двух доз, в сутки -1 и сутки 1 хирургического вмешательства (профилактически). В этом исследовании использовали антитело против С5 M1M17628N, содержащее HCVR/LCVR из SEQ ID NO: 362/363. Маркеры азот мочевины в крови (BUN) и креатинин сыворотки использовали для того, чтобы оценивать у мышей уровни заболевания и зашиты.- 72 039858 min, followed by 48 hours of reperfusion. A simulated laparotomy served as a control. Anti-C5 antibody was administered at 50 mg/kg intravenously in a single dose immediately after ischemia (therapeutic) or subcutaneously in two doses, on day -1 and day 1 of surgery (prophylactically). In this study, the anti-C5 antibody M1M17628N containing HCVR/LCVR of SEQ ID NO: 362/363 was used. Markers blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine were used to assess disease and protection levels in mice.
Таблица 34Table 34
Процент изменения уровней азота мочевины в крови мышей, которых лечили антителом против С5 (M1M17628N) в профилактическом и терапевтическом режимахPercent change in blood urea nitrogen levels in mice treated with anti-C5 antibody (M1M17628N) in prophylactic and therapeutic regimens
Таблица 35Table 35
Процент изменения уровней креатинина сыворотки у мышей, которых лечили антителом против С5 (M1M17628N) в профилактическом и терапевтическом режимахPercent change in serum creatinine levels in mice treated with anti-C5 antibody (M1M17628N) in prophylactic and therapeutic regimens
По сравнению с мышами дикого типа мыши с нокаутом С3 и С5 демонстрировали значительную функциональную защиту в RIRI модели острого повреждения почек, о чем свидетельствовало снижение уровней азота мочевины в крови и креатинина сыворотки. Антитело против С5 демонстрировало функциональную защиту в RIRI модели как в профилактическом, так и в терапевтическом режимах (табл. 34, 35).Compared to wild-type mice, C3 and C5 knockout mice showed significant functional protection in the RIRI model of acute kidney injury, as evidenced by reduced levels of blood urea nitrogen and serum creatinine. The anti-C5 antibody showed functional protection in the RIRI model in both prophylactic and therapeutic regimens (Tables 34, 35).
Пример 17. Эффект антител против С5, оказываемый на волчаночный нефрит.Example 17 Effect of anti-C5 antibodies on lupus nephritis.
В этом примере описан эффект антител против С5 при лечении волчаночного нефрита в модели на мышах.This example describes the effect of anti-C5 antibodies in the treatment of lupus nephritis in a mouse model.
Системная красная волчанка (SLE) представляет собой аутоиммунное нарушение, обусловленное утратой толерантность к собственным антигенам, образованием аутоантител и отложением иммунных комплексов (IC), фиксирующих комплемент, в пораженных тканях. SLE отличается широким диапазоном клинических манифестаций и целевых органов, причем волчаночный нефрит является одним из наиболее серьезных осложнений. Активация комплемента в почках пациентов с волчаночным нефритом вносит вклад в воспаление и повреждение ткани. Эффект антител против С5 при лечении волчаночного нефрита изучали у мышей NZBWF1, спонтанной мышиной модели волчаночного нефрита (Yang et al. 1996, PNAS). У мышей возникает аутоиммунное заболевание наподобие SLE человека, аутоантитела к ядерным антигенам и белкам клеточной мембраны, гипергаммаглобулинемия, альбуминурия, протеинурия, начинается гломерулонефрит иммунных комплексов и гибель от почечной недостаточности и терминальная стадия почечной недостаточности в возрасте от 35 до 50 недель.Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder caused by loss of tolerance to self antigens, production of autoantibodies, and deposition of complement-fixing immune complexes (ICs) in affected tissues. SLE is characterized by a wide range of clinical manifestations and target organs, with lupus nephritis being one of the most serious complications. Complement activation in the kidneys of patients with lupus nephritis contributes to inflammation and tissue damage. The effect of anti-C5 antibodies in the treatment of lupus nephritis was studied in NZBWF1 mice, a spontaneous mouse model of lupus nephritis (Yang et al. 1996, PNAS). Mice develop an autoimmune disease similar to human SLE, autoantibodies to nuclear antigens and cell membrane proteins, hypergammaglobulinemia, albuminuria, proteinuria, immune complex glomerulonephritis and death from renal failure and end-stage renal disease between 35 and 50 weeks of age.
Для этого исследования мышей NZBWF1 в возрасте 25 недель подкожно лечили с использованием 30 мг/кг изотипического контроля или антител против С5 два раза в неделю в течение 8 недель, затем три раза в неделю в течение 10 недель. Для этого исследования использовали антитела против С5 мыши M1M17628N и M1M17627N, которые содержат HCVR/LCVR из SEQ ID NO: 362/363 и 365/366 соответственно.For this study, 25 week old NZBWF1 mice were treated subcutaneously with 30 mg/kg isotype control or anti-C5 antibody twice a week for 8 weeks, then three times a week for 10 weeks. Anti-mouse C5 antibodies M1M17628N and M1M17627N were used for this study, which contain HCVR/LCVR of SEQ ID NOs: 362/363 and 365/366, respectively.
Лечение антителами против С5 значительно усовершенствовало коэффициент выживаемости у мышей (фиг. 13). Оба антитела усовершенствовали альбуминурию на 8-14 неделях лечения (фиг. 14) и уровни азота мочевины в крови на 12-16 неделях лечения (фиг. 15).Treatment with antibodies against C5 significantly improved the survival rate in mice (Fig. 13). Both antibodies improved albuminuria at 8-14 weeks of treatment (FIG. 14) and blood urea nitrogen levels at 12-16 weeks of treatment (FIG. 15).
Пример 18. Эффект антител против С5, оказываемый на гибель клеток астроцитов.Example 18 Effect of Anti-C5 Antibodies on Astrocyte Cell Death.
Оптикомиелит (NMO) представляет собой аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (CNS), которое преимущественно поражает зрительный нерв и спинной мозг. При NMO аутоантитела против аквапорина-4 (AQP4-Ab) вызывают повреждение астроцитов посредством активации комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Цели этого исследования состояли в том, чтобы оценивать роль системы комплемента в прогрессировании NMO и использовании антитела против белка комплемента в качестве потенциального терапевтического лечения для NMO.Optocomyelitis optica (NMO) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) that predominantly affects the optic nerve and spinal cord. In NMO, anti-aquaporin-4 autoantibodies (AQP4-Ab) cause damage to astrocytes through activation of complement-dependent cytotoxicity (CDC). The objectives of this study were to evaluate the role of the complement system in the progression of NMO and the use of anti-complement antibody as a potential therapeutic treatment for NMO.
- 73 039858- 73 039858
Первичные корковые астроциты крысы получали из коры больших полушарий головного мозга постнатальных детенышей крыс и культивировали с AQP4-Ab (антитело rAb-53 из публикации патентной заявки США 2014/0170140; Bennett et al 2009, Ann. Neurol. 66: 617-629) и белками комплемента для того, чтобы демонстрировать клеточно-опосредованную цитотоксичность. Затем эксперименты повторяли с добавлением антитела против С5 для того, чтобы демонстрировать блокирование разрушения клеток астроцитов.Rat primary cortical astrocytes were obtained from the cerebral cortex of postnatal rat pups and cultured with AQP4-Ab (antibody rAb-53 from US Patent Application Publication 2014/0170140; Bennett et al 2009, Ann. Neurol. 66: 617-629) and complement proteins in order to demonstrate cell-mediated cytotoxicity. Then the experiments were repeated with the addition of antibodies against C5 in order to demonstrate the blocking of the destruction of astrocyte cells.
Для того чтобы количественно определять гибель клеток, осуществляли люминесцентный цитотоксический анализ CytoTox-Glo™. В анализе использовали различные концентрации антитела против С5 (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 или 1000 мкг/мл) или изотипическое контрольное антитело.In order to quantify cell death, a CytoTox-Glo™ fluorescent cytotoxic assay was performed. Various concentrations of anti-C5 antibody (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 or 1000 μg/ml) or an isotype control antibody were used in the assay.
Для того чтобы определять, может ли антитело против С5 блокировать CDC, индуцированную AQP4-Ab, высевали астроциты и повторяли цитотоксический анализ CytoTox-Glo™, чтобы находить оптимальную дозу AQP4-Ab для этого посева. Обнаруживали, что оптимальная концентрация AQP4-Ab составляет 50 мкг/мл, и в следующем эксперименте использовали постоянную дозу AQP4-Ab (50 мкг/мл), тогда как дозу антитела против С5 варьировали. Как показано на фиг. 16, наблюдали снижение в RLU (от усредненно 300 тыс. до усредненно 100 тыс.) с увеличением количества антитела против С5, что демонстрирует, что антитело против С5 блокировало гибель клеток астроцитов. Для обоих экспериментов RLU не изменялись в зависимости от изотипического контрольного антитела. Как показано на фиг. 16, антитела против С5 ингибировали индуцированную AQP4-Ab цитотоксичность на первичных корковых астроцитах с IC50 15-17 нМ.In order to determine if anti-C5 antibody could block CDC induced by AQP4-Ab, astrocytes were seeded and the CytoTox-Glo™ cytotoxic assay was repeated to find the optimal dose of AQP4-Ab for this seeding. The optimal concentration of AQP4-Ab was found to be 50 μg/ml, and in the following experiment, a constant dose of AQP4-Ab (50 μg/ml) was used, while the dose of anti-C5 antibody was varied. As shown in FIG. 16, a decrease in RLU was observed (average 300k to average 100k) with increasing anti-C5 antibody, demonstrating that anti-C5 blocked astrocyte cell death. For both experiments, RLU did not change depending on the isotype control antibody. As shown in FIG. 16, anti-C5 antibodies inhibited AQP4-Ab induced cytotoxicity on primary cortical astrocytes with an IC 50 of 15-17 nM.
В будущем исследовании антитело против AQP4 и антитело против С5 следует инъецировать в головной мозг крысы для того, чтобы оценивать терапевтический эффект, оказываемый на комплементопосредованную цитотоксичность в отношении астроцитов в CNS.In a future study, anti-AQP4 antibody and anti-C5 antibody should be injected into the rat brain in order to assess the therapeutic effect on complement-mediated cytotoxicity against astrocytes in the CNS.
Пример 19. Анализ эндотелия.Example 19 Endothelial Analysis.
В этом примере описан анализ эндотелия клубочков in vitro для исследования блокирования отложения С5Ь-9 и С3 антителом против С5.This example describes an in vitro glomerular endothelial assay to investigate blocking of C5b-9 and C3 deposition by an anti-C5 antibody.
Воспроизводимые способы оценки ингибирующих эффектов кандидатов в лекарственных средствах, оказываемых на активацию комплемента, важны для доклинических испытаний. Из-за сложности путей активации комплемента в анализе следует использовать релевантные клетки и конечные точки для заданного терапевтического показания. Здесь, используя иммортализованную линию клеток эндотелия клубочков человека (HGEC), валидировали модель отложения С3 и С5 комплемента для использования в оценке блокирующей активности mAb против С3 или С5.Reproducible methods for evaluating the inhibitory effects of drug candidates on complement activation are important for preclinical testing. Due to the complexity of complement activation pathways, the assay should use relevant cells and endpoints for a given therapeutic indication. Here, using an immortal human glomerular endothelial cell line (HGEC), a C3 and C5 complement deposition model was validated for use in assessing the blocking activity of an anti-C3 or C5 mAb.
Способы.Ways.
Первичные клетки эндотелия клубочков почки человека (HGEC; Cell Biologies) высевали на ночь в полную среду в покрытые коллагеном I черные 96-луночные планшеты с чистым дном. Клетки обрабатывали или с использованием PBS (контроль) или активировали в течение 10 мин с использованием 10 мкМ ADP. После промывания в PBS 50% сыворотку человека (с сохраненным комплементом, истощенную по С3 или истощенную по С5) добавляли на 4 ч. Антитела против С5 добавляли по 1 мг/мл в сыворотку перед лечением. Клетки промывали, фиксировали и исследовали антителами против СЗЬ (Thermofisher) и/или антителами против C5b-9 (Abcam), вторичными антителами и докрашивали с использованием DAPI. Захватывали изображения на ImagExpress и использовали многопараметрический анализ изображения для того, чтобы количественно определять флуоресцентное окрашивание для каждого изображения и усредненно для каждого условия.Primary human renal glomerular endothelial cells (HGEC; Cell Biologies) were seeded overnight in complete medium in collagen I-coated black 96-well clean-bottomed plates. Cells were treated with either PBS (control) or activated for 10 min with 10 μM ADP. After washing in PBS, 50% human serum (complement conserved, C3-depleted, or C5-depleted) was added for 4 hours. Anti-C5 antibodies were added at 1 mg/ml to the serum before treatment. Cells were washed, fixed and examined with anti-C3b antibodies (Thermofisher) and/or anti-C5b-9 antibodies (Abcam), secondary antibodies and counterstained with DAPI. Images were captured on ImagExpress and multiparametric image analysis was used to quantify fluorescent staining for each image and averaged for each condition.
Результаты.Results.
Отложение С3 и С5Ь-9 наблюдали у ADP-активированных HGEC, на которые воздействовали нормальной сывороткой человека, но не у не активированных HGEC (С3: 1,5χ107±1,0χ107; C5: 7,9χ106±6,6χ106, Р<0,05 против не ADP-активированных HGEC). Отложения С3 и С5Ь-9 значительно снижали у ADP-активированных HGEC, на которые воздействовали истощенной по С3 или С5 сывороткой (С3: 3,3χ105±4,8χ104; C5: 1,5χ106±6,0χ105, Р<0,05). Добавление блокирующего mAb против С5 значительно снижало отложение С5Ь-9 из нормальной сыворотки человека на ADP-активированных HGEC, отложение сравнимо с истощенными по С5 сыворотками (С5 mAb: 1,02χ106±6,0χ105, контрольное mAb 3,7χ106±1,6χ106, Р<0,05 против контрольного mAb).Deposition of C3 and C5b-9 was observed in ADP-activated HGEC exposed to normal human serum, but not in non-activated HGEC (C3: 1.5χ10 7 ±1.0χ10 7 ; C5: 7.9χ10 6 ±6.6χ10 6 , P<0.05 vs. non-ADP-activated HGECs). C3 and C5b-9 deposits were significantly reduced in ADP-activated HGEC exposed to C3 or C5 depleted serum (C3: 3.3χ105±4.8χ10 4 ; C5: 1.5χ10 6 ±6.0χ10 5 , P<0 .05). The addition of a blocking anti-C5 mAb significantly reduced deposition of C5b-9 from normal human serum on ADP-activated HGECs, deposition comparable to C5-depleted sera (C5 mAb: 1.02χ10 6 ±6.0χ10 5 , control mAb 3.7χ10 6 ±1 .6χ10 6 , P<0.05 vs control mAb).
Заключение.Conclusion.
Эти данные демонстрируют полезность анализа эндотелия клубочков человека in vitro для моделирования отложения С3 и С5 комплемента. В дополнение к скринингу in vitro, этот анализ обладает потенциалом в качестве трансляционной модели для того, чтобы оценивать стратегии против комплемента при заболевании почек, используя образцы сывороток, полученные у пациентов.These data demonstrate the utility of in vitro human glomerular endothelial analysis for modeling complement C3 and C5 deposition. In addition to in vitro screening, this assay has the potential as a translational model for evaluating anti-complement strategies in kidney disease using patient-derived sera.
Объем настоящего изобретения не подлежит ограничению конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем описании. В действительности, различные модификации изобретения в дополнение к тем, что описаны в настоящем документе, будут видны специалистам в данной области из приведенного выше описания и сопроводительных фигур. Предусмотрено, что такие модификации входят в объем приложенной формулы изобретения.The scope of the present invention is not to be limited by the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the invention in addition to those described herein will become apparent to those skilled in the art from the above description and accompanying figures. Such modifications are intended to be within the scope of the appended claims.
- 74 039858- 74 039858
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM
Claims (22)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662422107P | 2016-11-15 | 2016-11-15 | |
PCT/US2017/037226 WO2017218515A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-06-13 | Anti-c5 antibodies and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201990022A1 EA201990022A1 (en) | 2019-06-28 |
EA039858B1 true EA039858B1 (en) | 2022-03-21 |
Family
ID=66998683
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201990022A EA039858B1 (en) | 2016-11-15 | 2017-06-13 | Anti-c5 antibodies and uses thereof |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
EA (1) | EA039858B1 (en) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014047500A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Screening assays for complement component c5 antagonists |
EP2328616B1 (en) * | 2008-08-05 | 2015-04-29 | Novartis AG | Compositions and methods for antibodies against complement protein c5 |
-
2017
- 2017-06-13 EA EA201990022A patent/EA039858B1/en unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2328616B1 (en) * | 2008-08-05 | 2015-04-29 | Novartis AG | Compositions and methods for antibodies against complement protein c5 |
WO2014047500A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Screening assays for complement component c5 antagonists |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
EDWIN K.S. WONG, DAVID KAVANAGH: "Anticomplement C5 therapy with eculizumab for the treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and atypical hemolytic uremic syndrome", TRANSLATIONAL RESEARCH, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 165, no. 2, 1 February 2015 (2015-02-01), NL , pages 306 - 320, XP055358380, ISSN: 1931-5244, DOI: 10.1016/j.trsl.2014.10.010 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EA201990022A1 (en) | 2019-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11479602B2 (en) | Methods of treating C5-associated diseases comprising administering anti-C5 antibodies | |
AU2018202814B2 (en) | Anti-PDGFR-beta antibodies and uses thereof | |
CA2904644C (en) | Human antibodies to grem1 | |
US12037401B2 (en) | Anti-TrkB monoclonal antibodies and methods of use | |
JP2023526233A (en) | ANTI-GLP1R ANTAGONIST ANTIBODY AND METHODS OF USE THEREOF | |
EA039858B1 (en) | Anti-c5 antibodies and uses thereof | |
BR122022016127B1 (en) | POLYNUCLEOTIDE MOLECULES ENCODING AN ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF THAT SPECIFICALLY BINDS TO C5 AND VECTORS | |
BR122022016112B1 (en) | USES OF AN ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF WHICH SPECIFICALLY BINDS C5 | |
BR112018075875B1 (en) | ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF THAT SPECIFICALLY BINDS TO C5 AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THEM | |
NZ789069A (en) | Anti-C5 antibodies and uses thereof | |
CA3205846A1 (en) | Anti-pdgf-b antibodies and mehods of use for treating pulmonary arterial hypertension (pah) |