EA019319B1 - Method for producing covalent conjugate of polyethyleneglycol with interferon and method of producing activated peg-agent - Google Patents

Method for producing covalent conjugate of polyethyleneglycol with interferon and method of producing activated peg-agent

Info

Publication number
EA019319B1
EA019319B1 EA201100725A EA201100725A EA019319B1 EA 019319 B1 EA019319 B1 EA 019319B1 EA 201100725 A EA201100725 A EA 201100725A EA 201100725 A EA201100725 A EA 201100725A EA 019319 B1 EA019319 B1 EA 019319B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nitrite
aqueous
interferon
acid
organic
Prior art date
Application number
EA201100725A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
EA201100725A1 (en
Inventor
Сергей Викторович Шереметьев
Сергей Анатольевич Коровкин
Владимир Антонович Катлинский
Антон Викентьевич Катлинский
Андрей Викторович Семченко
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт") filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт")
Priority to EA201100725A priority Critical patent/EA019319B1/en
Publication of EA201100725A1 publication Critical patent/EA201100725A1/en
Publication of EA019319B1 publication Critical patent/EA019319B1/en

Links

Abstract

The invention relates to a method for producing a covalent conjugate of polyethyleneglycol with interferon characterized in that: a) free hydroxyl group of monomethoxypolyethyleneglycol is acidated by halogenhydride of nitrobenzoic acid in halogenated organic solvant in the presence of organic base, b) a nitro group of obtained metoxypolyethyleneglycol esterof nitrobenzoic acid is recovered by d-element salt of 4-th period of IV-VI group in low degree in water or water-organic medium with pH from 1.0 to 6.5 or in a medium of polar organic solvent, c) the obtained metoxypolyethyleneglycol ester of aminobenzoic acid is diazotized by nitrite of alkali or alkali-earth metal in the water or water-organic medium or by an organic nitrite in the medium of polar organic solvent with subsequent removing of nitrite excess and obtaining activated pegylated agent, d) the activated pegylated agent is introduced without isolation in the reaction of azocoupling with interferon in water or water-organic medium with pH from 7.0 to 10.0, and e) a mixture of pegylated products is separated by ion-exchange chromatography to obtain monopegylated interferon. A method is also proposed to produce activated PEG-agent. The technical result - expanding interferon spectrum and increasing circulation time in blood flow.

Description

Изобретение относится к способу получения ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с интерфероном, отличающемуся тем, что а) свободную гидроксильную группу монометоксиполиэтиленгликоля ацилируют галогенангидридом нитробензойной кислоты в галогенированном органическом растворителе в присутствии органического основания; The invention relates to a method for producing a covalent conjugate of polyethylene glycol interferon, characterized in that a) a free hydroxyl group is acylated monomethoxypolyethylene nitrobenzoic acid halide in a halogenated organic solvent in the presence of an organic base;

б) нитрогруппу полученного метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты b) the resultant nitro metoksipolietilenglikolevogo nitrobenzoic acid ester

восстанавливают солью d-элемента 4 периода IV-VI группы в низкой степени в водной или водно-органической среде с pH от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя; reduced salt d-member 4 period IV-VI groups in a low degree in an aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 1.0 to 6.5 or in a polar organic solvent;

в) полученный метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента; c) the resulting ether metoksipolietilenglikolevy aminobenzoic acid is diazotized with nitrite of an alkali or alkaline-earth metal in an aqueous or aqueous-organic medium or organic nitrite in a polar organic solvent, followed by removal of excess nitrite and produce activated pegiliruyuschego agent; г) активированный пегилирующий агент без выделения вводят в реакцию азосочетания с интерфероном в водной или водно-органической среде с pH от 7,0 до 10,0 и д) смесь продуктов пегилирования разделяют ионообменной хроматографией с получением монопегилированого интерферона. g) activated pegiliruyuschy agent without isolating the azo coupling reaction is introduced into interferon in aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 7.0 to 10.0 and d) a mixture of PEGylation products were separated by ion exchange chromatography to obtain monopegilirovanogo interferon. Также предлагается способ получения активированного ПЭГ-агента. Also a method of preparing activated PEG-agent. Технический результат: расширение спектра интерферонов с увеличенным временем циркуляции в кровотоке. Technical result: expanding the spectrum of interferons with increased circulation time in the bloodstream.

019319 019319

Изобретение относится к химии полимеров и биотехнологии и обеспечивает способ получения ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с интерфероном, в котором полимер присоединён к интерферону посредством азогруппы. The invention relates to polymer chemistry and biotechnology, and provides a method for covalent conjugate of polyethylene glycol with an interferon, wherein the polymer attached to the interferon via azo group. Также изобретение обеспечивает способ получения активированного пегилирующего агента (ПЭГ-агента). The invention also provides a method for producing activated pegiliruyuschego agent (PEG-agent).

Предшествующий уровень техники BACKGROUND ART

Интерферон альфа-2Ь является ценным противовирусным агентом, который эффективен, в частности, при лечении острых гепатитов В и С и снижении вирусной нагрузки при хроническом течении этих заболеваний. Interferon alfa-2b is a valuable antiviral agent which is effective, in particular in the treatment of acute hepatitis B and C and reducing the viral load in chronic course of these diseases. Однако его недостаточная энзиматическая стабильность в организме и малое время циркуляции в крови приводят к необходимости увеличения дозы и частоты введения препарата, что в ряде случаев сопряжено с побочными эффектами, например аллергией. However, its lack of enzymatic stability in the body and the short circulation in the blood leads to the need to increase the dose and frequency of administration of the drug, which in some cases is associated with side effects such as allergy. Поэтому возникает необходимость в химическом модифицировании молекулы интерферона альфа-2Ь с целью преодоления указанных недостатков. Therefore there is a need for chemical modification of the molecules interferon alfa-2b in order to overcome these disadvantages.

Для модифицирования различных полипептидов известно применение монометоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ), который представляет собой нейтральный полиэфир с различной молекулярной массой [Никитин И.Г. For modifying polypeptides is known to use various monomethoxypolyethylene glycol (mPEG), which is a neutral polyether with different molecular weights [Nikitin IG Пегилированные препараты: современное состояние, проблемы и перспективы / Никитин И.Г., Сторожаков Г.И. Pegylated drugs: current state, problems and prospects / Nikitin IG, Storozhakov GI // Вирусные гепатиты, достижения и перспективы. // Viral hepatitis, achievements and prospects. 2001. № 3 (13), с. 2001. № 3 (13), p. 3-8.]. 3-8.].

В статье Harry LA Janssen et al. The article Harry LA Janssen et al. // Pegylated interferon alfa-2b alone or in combination with lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis B: a randomised trial. // Pegylated interferon alfa-2b alone or in combination with lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis B: a randomised trial. The Lancet. The Lancet. Vol. Vol. 365, Issue 9454. P. 123-129 показано, что монотерапия пегилированным интерфероном a-2b (100 мкг в неделю в течение 52 недель) у HBeAg-положительных пациентов с хроническим гепатитом В приводит к необнаруживаемым концентрациям HBeAg у 35% пациентов по окончании курса. 365, Issue 9454. P. 123-129 shown that monotherapy with pegylated interferon a-2b (100 micrograms per week for 52 weeks) of HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B leads to undetectable concentrations of HBeAg in 35% of patients after the course .

В статье Jaeckel E. et al. The article Jaeckel E. et al. // Treatment of acute hepatitis С with interferon alfa-2b. // Treatment of acute hepatitis C with interferon alfa-2b. New Engl. New Engl. J. Med. J. Med. 2001. Vol. 2001. Vol. 345. No. 345. No. 20. P. 1452-1457 показано, что лечение пациентов с острым гепатитом С (5 млн. ед. интерферона альфа^ подкожно, один раз в сутки в течение 4 недель, затем три раза в неделю в течение следующих 20 недель) предотвращает хроническое инфицирование в 98% случаев. 20. P. 1452-1457 shows that treatment of patients with acute hepatitis C (5 million. U ^ interferon alpha subcutaneously once a day for 4 weeks, and then three times a week for the next 20 weeks) prevents chronic infection in 98% of cases.

Поскольку мПЭГ непосредственно с полипептидами не взаимодействует, то в его молекулу вводят различные функциональные группы с получением соответствующих активированных ПЭГ-агентов [Kozlowski A. Development of Pegylated Interferons for the Treatment of Chronic Hepatitis С / Kozlowski A., Charles SA, Harris JM // BioDrugs. Since mPEG directly interacts with the polypeptides, in its molecule is administered various functional groups to give the corresponding activated PEG agents [Kozlowski A. Development of Pegylated Interferons for the Treatment of Chronic Hepatitis C / Kozlowski A., Charles SA, Harris JM // BioDrugs. 2001. № 15(7). 2001. № 15 (7). P. 419-429.]. P. 419-429.]. К таким ПЭГ-агентам относятся мПЭГальдегиды (US 5990237, опубл. 23.11.1999; RU 2288212, опубл. 20.10.2005), мПЭГ-карбонаты (US 5324844, опубл. 28.06.1994), активированные эфиры ПЭГ (US 5932462, опубл. 03.08.1999), азиды ПЭГ (US 4101380, опубл. 18.07.1978; US 4179337, опубл. 18.12.1979) и др. Such agents include PEG-mPEGaldegidy (US 5,990,237, published on 23.11.1999;. RU 2288212, published on 20.10.2005.), MPEG carbonates (US 5,324,844, published on 28.06.1994.), Activated esters of PEG (US 5,932,462, publ. 03.08.1999), azides PEG (US 4,101,380, published on 18.07.1978;. US 4,179,337, published on 18.12.1979), etc...

Как правило, активированные ПЭГ-агенты взаимодействуют со свободными аминогруппами полипептидов с образованием смеси позиционных изомеров, число которых равно количеству свободных аминогрупп в протеине [Блохин Н.П. Typically, activated PEG agents react with the free amino groups of the polypeptide to form a mixture of positional isomers, the number of which equals the number of free amino groups of the protein [Blohin NP Особенности фармакологической динамики и кинетики пегилированного α-интерферона (40 кДа) "Пегасис": новые возможности терапии хронического гепатита C /Блохин Н.П., Никитин И.Г. Features pharmacological dynamics and kinetics of pegylated α-interferon (40 kD) "Pegasys": new opportunities for treatment of chronic hepatitis C / N. Blokhin, IG Nikitin // Материалы VII Российской конференции "Гепатология сегодня" РЖГГК. // Proceedings of the VII Russian conference "Hepatology Today" RZHGGK. 2002. - 6]. 2002 - 6]. Известно, что позиционные изомеры протеинов имеют различную биологическую активность (US 2004/0223950, опубл. 11.11. 2004). It is known that proteins positional isomers have different biological activity (US 2004/0223950, publ. 11.11. 2004). Это создаёт предпосылки для расширения арсенала таких средств за счёт различных вариантов модифицирования молекул протеинов. This creates conditions for expansion of the arsenal of means at the expense of the various options of modification of protein molecules. Например, изменение положений и способов присоединения ПЭГ к протеину позволяет изменить соотношения позиционных изомеров, а также получить новые типы конъюгатов, в которых, например, не затронуты аминогруппы полипептидов. For example, a change in the terms and methods of attachment of PEG to a protein can change the ratio of positional isomers, as well as to gain new types of conjugates in which, for example, are not affected by the amino group of the polypeptides.

Применение активированных ПЭГ-агентов, содержащих в молекуле фрагмент парафенилендиазония, для модифицирования физиологически активного полипептида, в частности инсулина, раскрыто в публикации US 4179337 (опубл. 18.12.1979). The use of activated PEG agents containing in the molecule fragment parafenilendiazoniya for modifying a physiologically active polypeptide, especially insulin, is disclosed in publication US 4179337 (publ. 18.12.1979). Получаемый таким образом модифицированный полипептид, в частности инсулин, имеет строение аминоазопроизводного формулы The thus obtained modified polypeptide, including insulin, has the structure of formula aminoazoproizvodnogo

где R представляет PEG-O-CH 2 -, PEG-O-CH 2 -CH(OH)-CH 2 -O- или PEG-OC(=O)-; wherein R represents PEG-O-CH 2 -, PEG-O-CH 2 -CH (OH) -CH 2 -O- or PEG-OC (= O) - ; представляет пептидную цепь. It represents a peptide chain.

Недостатком таких производных является их невысокая стабильность в организме и связанные с этим возможности неконтролируемого изменения структуры и отщепления реакционноспособных частиц, в частности диазосоединений. A disadvantage of such derivatives is their low stability in the body and the associated possibility of uncontrolled change in the structure and cleavage of the reactive particles, in particular diazo compounds.

В публикации WO 2006/005667 (опубл. 19.01.2006) раскрыт способ увеличения полупериода нахождения молекулы (например, интерферона) в плазме, включающий ковалентное связывание этой молекулы с гетероциклической изостерой карбоновой кислоты (например, с тетразолом). In the publication WO 2006/005667 (publ. 19.01.2006) discloses a method of increasing the half-cycle of finding molecules (e.g., interferon) in a plasma comprising covalently linking this molecule to a heterocyclic carboxylic acid isostere (e.g., tetrazole). Описание содержит общее указание, что спейсером, связывающим молекулу с тетразольным фрагментом, может быть олиго(этиленгликоль). Description contains a general indication that a spacer linking molecule with tetrazolium moiety may be an oligo (ethylene glycol). В случае, когда полипептиды содержат одно или более тирозиновых звеньев, они могут быть селективно функционализированы азосочетанием с солью арилдиазония, например обработкой тирозинсодержащего полипептида солью арилдиазония с терминальным тетразольным фрагментом. In the case where the polypeptides contain one or more tyrosine units, they may be selectively functionalized to coupling with aryl diazonium salt, for example by treatment with tyrosine polypeptide aryl diazonium salt with tetrazolium terminal fragment.

- 1 019319 - 1 019319

Примеры реализации раскрытого подхода применительно к интерферонам в описании отсутствуют. Embodiments of the disclosed approach in relation to interferons lacking in the description.

Наиболее близким по технической сущности рассматривается способ получения физиологически активной водорастворимой полипептидной композиции из полипептида, изначально обладающего физиологической активностью, раскрытый в US 4179337. Указанный способ включает стадии: (а) взаимодействие по меньшей мере одного концевого атома углерода, несущего гидроксигруппу, по существу, линейного полимера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, имеющего молекулярную массу от 500 до 20000 Да, где полимер является незамещён The closest in technical essence, a method of producing physiologically active water soluble polypeptide composition from a polypeptide originally having physiological activity, as disclosed in US 4179337. This method comprises the steps of: (a) reacting at least one terminal carbon atom bearing the hydroxy substantially linear a polymer selected from the group consisting of polyethylene glycol and polypropylene glycol having a molecular weight of 500 to 20,000 daltons, wherein the polymer is an unsubstituted ым или замещённым алкильными группами, имеющими менее 5 атомов углерода, с сочетающимся агентом с образованием активированного полимера, содержащего реакционноспособную концевую группу; th or substituted by alkyl groups having less than 5 carbon atoms, with a coupling agent to form an activated polymer containing a reactive end group; и (b) взаимодействие физиологически активного полипептида с 10-100 моль указанного активированного полимера путём сочетания полипептида с реакционноспособной концевой группой полимера с образованием физиологически активной водорастворимой полипептидной композиции. and (b) reacting a physiologically active polypeptide with 10-100 moles of said activated polymer by coupling the polypeptide to the reactive terminal group of the polymer to form a water-soluble physiologically active polypeptide composition.

В частности, на стадии (а) паранитробензилхлорид вводят в реакцию с гликолем (подходящим является ПЭГ с молекулярной массой 500-20000 Да) в присутствии щёлочи в безводной среде, например в среде тетрагидрофурана, с получением паранитробензилового эфира ПЭГ, который затем восстанавливают до соответствующего амина. In particular, in step (a) is reacted paranitrobenzilhlorid glycol (PEG suitably with a molecular weight of 500-20000 Da) in the presence of alkali in an anhydrous medium, for example in tetrahydrofuran, to give paranitrobenzilovogo PEG ester, which is then reduced to the corresponding amine . В случае простых бензиловых эфиров ПЭГ восстановление нитрогруппы осуществляют хлоридом титана(111). In the case of benzyl ethers PEG reducing the nitro group of titanium chloride is performed (111). В случае сложных эфиров требуется проведение каталитического гидрирования водородом во избежание гидролиза сложноэфирной группы. In the case of esters requires catalytic hydrogenation with hydrogen in order to avoid hydrolysis of the ester group. Полученный О-ПЭГпарааминофениловый эфир диазотируют азотистой кислотой в водном растворе при 0°C и сочетают с 0,25% раствором инсулина при 0°C в течение 2 ч; The resulting O-PEGparaaminofenilovy ester diazotized in an aqueous solution of nitric acid at 0 ° C and combined with 0.25% solution of insulin at 0 ° C for 2 hours; для выделения целевого продукта реакционную смесь подвергают диализу при 5-10°C, что позволяет получить, по существу, неиммуногенный модифицированный полипептид, сохраняющий значительную часть активности исходного пептида. to isolate the desired product, the reaction mixture was dialyzed at 5-10 ° C, to provide a substantially non-immunogenic modified polypeptide retains a substantial portion of the initial activity of the peptide.

Таким образом, существует потребность в усовершенствованных способах получения стабильных модифицированных полипептидов, а также в способах синтеза промежуточных соединений и активированных агентов, необходимых для их реализации. Thus, a need exists for improved methods for preparing stable modified polypeptides as well as methods of synthesizing intermediates and activated agent necessary for their implementation.

Сущность изобретения SUMMARY OF THE iNVENTION

Авторы изобретения неожиданно установили, что монопегилированный интерферон a-2b высокой степени чистоты может быть эффективно получен способом, заключающимся в том, что: The inventors have surprisingly found that monopegilirovanny interferon a-2b of high purity can be efficiently obtained by a process characterized in that:

а) свободную гидроксильную группу монометоксиполиэтиленгликоля a) The free hydroxyl group of Monomethoxypolyethylene

где n - целое число в интервале от 455 до 1140, where n - an integer in the range from 455 to 1140,

ацилируют хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты в галогенированном органическом растворителе в присутствии органического основания при температуре от 10 до 40°C и молярном отношении хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю от 1:1 до 1000:1 с получением метоксиполиэтиленгликоле во го эфира нитробензойной кислоты acylated chloro- or bromide nitrobenzoic acid in a halogenated organic solvent in the presence of an organic base at a temperature from 10 to 40 ° C and the molar ratio of chlorine or bromide nitrobenzoic acid to monomethoxy from 1: 1 to 1000: 1 in a yield of methoxypolyethylene nitrobenzoic acid ester

где n принимает указанные выше значения, wherein n is as defined above,

который выделяют из реакционной массы осаждением С 48 -простым эфиром или С 68 -алканом; which is isolated from the reaction mixture by precipitation the C 4 -C 8 ether -simple or C 6 -C 8 alkanes;

б) нитрогруппу выделенного метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты восстанавливают солью d-элемента 4 периода IV-VI группы в промежуточной низкой степени окисления в водной или водно-органической среде с pH от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°C с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты b) nitro selected metoksipolietilenglikolevogo nitrobenzoic acid ester salt is reduced d-member 4 period IV-VI group in the intermediate a low degree of oxidation in an aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 1.0 to 6.5 or in a polar organic solvent miscible unlimited with water at a temperature from 10 to 40 ° C to give metoksipolietilenglikolevogo aminobenzoic acid ester

где n принимает указанные выше значения, wherein n is as defined above,

который выделяют из реакционной массы осаждением С 48 -простым эфиром или С 68 -алканом; which is isolated from the reaction mixture by precipitation the C 4 -C 8 ether -simple or C 6 -C 8 alkanes;

в) выделенный метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°C или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°C, молярном отношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 1000:1 и молярном отношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты 3:1 до 10000:1 c) dedicated metoksipolietilenglikolevy ester aminobenzoic acid is diazotized with nitrite of an alkali or alkaline-earth metal in an aqueous or aqueous-organic medium at a temperature of from -2 to 30 ° C or an organic nitrite in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature of from -40 to 30 ° C, a molar ratio of nitrite to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 1.1: 1 to 1000: 1 and the molar ratio of acid to ester metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid 3: 1 to 10,000: 1 с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента; followed by removal of excess nitrite and produce activated pegiliruyuschego agent;

г) активированный пегилирующий агент без выделения из реакционной смеси вводят в реакцию азосочетания с интерфероном a-2b в водной или водно-органической среде с pH от 7,0 до 10,0 при тем- 2 019319 g) activated pegiliruyuschy agent without isolation from the reaction mixture is introduced into the azo coupling reaction with interferon a-2b in an aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 7.0 to 10.0 at tem- 019 319 2

пературе от 0 до 30°C; peratures from 0 to 30 ° C; по достижении степени превращения по меньшей мере 70% реакцию останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей с получением смеси монопегилированного, дипегилированого и немодифицированного интерферона a-2b и блокированного ПЭГ-агента; on reaching a conversion of at least 70% the reaction was stopped by adding thereto a low molecular weight to give a mixture azosostavlyayuschey monopegilirovannogo, dipegilirovanogo and unmodified interferon a-2b, and PEG-capped agent; и and

д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с получением монопегилированого интерферона a-2b. d) the mixture is separated by ion exchange chromatography with an increase in the ionic strength of the eluting buffer to give solutions monopegilirovanogo interferon a-2b.

При реализации заявленного способа обеспечивается повышение выхода пегилированного интерферона a-2b, увеличение времени циркуляции пегилированного интерферона a-2b в кровотоке и повышение устойчивости пегилирующего агента при хранении по сравнению с аналогичными ПЭГ-агентами известного уровня техники. When implementing the claimed method ensures improved yield of pegylated interferon a-2b, pegylated interferon increasing circulation time of a-2b in the bloodstream and increase the stability pegiliruyuschego agent during storage as compared with the same PEG-agents of the prior art.

Повышение выхода пегилированного интерферона a-2b достигается в результате повышения общего выхода активированного пегилирующего агента за счёт получения промежуточного метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты с количественным выходом и промежуточного метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты с выходом 90-100%. Increased yield a-2b pegylated interferon is achieved as a result of increasing the overall yield of activated pegiliruyuschego agent by obtaining intermediate metoksipolietilenglikolevogo nitrobenzoic acid ester in quantitative yield and intermediate metoksipolietilenglikolevogo aminobenzoic acid ester with a yield of 90-100%.

Увеличение времени циркуляции пегилированного интерферона a-2b в кровотоке возможно за счёт способности тирозиновых и гистидиновых звеньев интерферона a-2b вступать в реакцию азосочетания с активными диазосоединениями с образованием биологически активных азопроизводных интерферона. Increased time circulation of pegylated interferon a-2b in the bloodstream may account for the ability of tyrosine and histidine units of interferon a-2b join the azo coupling reaction with the active diazo compounds to form azo derivatives of biologically active interferon.

Повышение устойчивости пегилирующего агента при хранении достигается в результате применения для активации пегилирующего агента органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, что дополнительно позволяет расширить температурный диапазон проведения реакции диазотирования. Increased stability pegiliruyuschego agent during storage is achieved by applying the agent to activate pegiliruyuschego organic nitrite in a polar organic solvent, infinitely miscible with water, which allows to further extend the temperature range of a diazotization reaction.

В предпочтительном варианте изобретения на стадии а) в качестве галогенированного растворителя применяют безводный метиленхлорид, в качестве основания применяют безводный пиридин, ацилирование проводят при комнатной температуре и для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир. In a preferred embodiment, in step a) in an anhydrous halogenated solvent used is methylene chloride, is used as a base, anhydrous pyridine, the acylation is carried out at room temperature to precipitate the product and apply diethyl ether.

В другом предпочтительном варианте изобретения на стадии б) 1 или 2 в качестве растворителя применяют смесь этанола и ледяной уксусной кислоты, для создания и поддержания pH применяют ацетат натрия, в качестве восстановителя применяют TiCl 3 или CrSO 4 , а для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир. In another preferred embodiment, in step b) 1 or 2 as a solvent, a mixture of ethanol and glacial acetic acid to establish and maintain the pH using sodium acetate as a reducing agent is used TiCl 3 or CrSO 4 and diethyl ether used to precipitate the product.

В ещё одном предпочтительном варианте изобретения на стадии в) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой. In another preferred embodiment, in step c) is carried out diazotization with sodium nitrite in aqueous solution of hydrobromic acid and the excess nitrite was removed sulfamic acid.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии в) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии HCl в тетрагидрофуране. In a further preferred embodiment, in step c) tert-butyl nitrite diazotization is carried out in the presence of HCl in THF.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии г) для создания и поддержания pH применяют боратно-карбонатный буферный раствор, степень превращения интерферона a-2b составляет 80-85%, а в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют тирозин. In a further preferred embodiment, in step d) to create and maintain the pH employed borate-carbonate buffer solution, the degree of conversion of interferon a-2b is 80-85%, and as low molecular weight tyrosine azosostavlyayuschey used.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М NaCl. In a further preferred embodiment, in step d) the mixture is separated by ion exchange chromatography with increasing ionic strength buffer elution solutions of 0.02 to 1.0 M NaCl.

На стадии а) в качестве хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты может быть использован любой из орто-, мета- или пара-изомеров. In step a) as chloro- or bromides nitrobenzoic acid may be any of ortho-, meta- or para-isomers. Предпочтительны мета- и пара-изомеры, наиболее предпочтительны пара-изомеры (хлорангидрид или бромангидрид 4-нитробензойной кислоты). Preferred are meta- and para-isomers, most preferably the para-isomers (acid chloride or acid bromide of 4-nitrobenzoic acid).

Ацилирование свободной гидроксильной группы монометоксиполиэтиленгликоля хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты проводят в галогенированном органическом растворителе в присутствии органического основания при температуре от 10 до 40°C. Acylation of the free hydroxyl groups of Monomethoxypolyethylene chloro- or bromide nitrobenzoic acid is carried out in a halogenated organic solvent in the presence of an organic base at a temperature from 10 to 40 ° C. Молярное отношение хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю составляет от 1:1 до 1000:1, предпочтительно от 5:1 до 20:1. The molar ratio of chlorine or bromide monomethoxy-nitrobenzoic acid to is from 1: 1 to 1000: 1, preferably 5: 1 to 20: 1.

Галогенированный органический растворитель выбирают из метиленхлорида, хлороформа, дихлорэтана или их смеси. Halogenated organic solvent is selected from methylene chloride, chloroform, dichloroethane or mixtures thereof. Органическое основание выбирают из группы алифатических третичных аминов или гетероциклических аминов. The organic base selected from tertiary aliphatic amines or heterocyclic amines. Предпочтительны триэтиламин или N-метилморфолин, особенно предпочтительны пиридин или хинолин. Preferably triethylamine or N-methylmorpholine, particularly preferably pyridine or quinoline. Продукт реакции осаждают из раствора С 48 -простым эфиром или алканом и выделяют фильтрованием или центрифугированием, предпочтительно фильтрованием при пониженном давлении. The reaction product precipitated from solution C 4 -C 8 alkane or -simple ether and isolated by filtration or centrifugation, preferably by filtration under reduced pressure. В качестве С 48 -простого эфира применяют диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, наиболее предпочтительно диэтиловый эфир. As C 4 -C 8 ether -simple used diethyl ether, diisopropyl ether, methyl tert-butyl ether, most preferably diethylether. В качестве алкана применяют пентаны, гексаны, гептаны, петролейный эфир, наиболее предпочтительно гексан или петролейный эфир. As alkane used pentanes, hexanes, heptanes, petroleum ether, most preferably hexane or petroleum ether.

На стадии б) восстановление монометоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты в монометоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты осуществляют солями d-элемента 4 периода IV-VI группы в промежуточной низкой степени окисления, например солями титана(111), ванадия(11) или хрома(11) в водной или водно-органической среде с pH от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°C. In step b) reducing monometoksipolietilenglikolevogo nitrobenzoic acid ester monometoksipolietilenglikolevy ester of aminobenzoic acid is carried salt d-member 4 period IV-VI group in the intermediate a low oxidation state, such as titanium salts of (111), V (11) or chromium (11) in an aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 1.0 to 6.5 or in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature from 10 to 40 ° C.

- 3 019319 - 3 019319

В первом варианте восстановление проводят в водной или водно-органической среде. In the first embodiment, the reduction is performed in an aqueous or aqueous-organic medium. В соответствии с настоящим изобретением термин "водно-органическая среда" обозначает смесь воды с органическим растворителем, таким как метанол, этанол, изопропанол, ацетон, ацетонитрил, в которой содержание воды превышает 50% (об./об.). In accordance with the present invention, the term "aqueous-organic medium" means a mixture of water with an organic solvent such as methanol, ethanol, isopropanol, acetone, acetonitrile, wherein the water content exceeds 50% (vol. / Vol.). Для создания и поддержания pH водной или водно-органической среды применяют органические кислоты, например уксусную кислоту или ее галогенпроизводные, такие как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также щавелевую, лимонную или винную кислоты, или неорганические кислоты, например хлористоводородную, бромисто-водородную или серную кислоты, а также смеси органических и/или неорганических кислот. To create and maintain the pH aqueous or aqueous-organic medium used organic acids such as acetic acid or its halogenated derivatives such as chloroacetic, trichloroacetic, bromoacetic, tribromuksusnaya, trifluoroacetic acid and oxalic, citric or tartaric acid, or inorganic acids such as hydrochloric , hydrobromic or sulfuric acid, and mixtures of organic and / or inorganic acids. Предпочтительно применение буферных смесей с pH от 1,0 до 6,5, более предпочтительно с pH от 4 до 6. Примерами таких смесей являются ацетатные или цитратные буферные растворы. Preferably, the use of buffer mixtures with pH from 1.0 to 6.5, more preferably pH 4 to 6. Examples of such compounds are the acetate or citrate buffer solutions.

В качестве восстановителей применяют хлорид, бромид или сульфат титана(111), сульфаты ванадия(11) или хрома(П). As reducing agents used chloride, bromide or titanium sulfate (111), vanadium sulfate (11) or chromium (II). Предпочтительно применение хлорида или сульфатов титана(Ш) или хрома(П), более предпочтительно применение хлорида титана(Ш) или сульфата хрома(П). Preferably, the use of chloride or titanium sulfate (III) or chromium (II), more preferably the use of titanium chloride (III) or chromium sulphate (n). Для обеспечения полноты протекания реакции восстановления необходимо, чтобы по её завершении наблюдался небольшой избыток соли d-элемента 4 периода IV-VI группы в промежуточной низкой степени окисления. For complete recovery of the reaction requires that for its completion there was a slight excess of salt of d-member 4 period IV-VI group in the intermediate a low oxidation state. Завершение восстановления нитросоединения можно определить визуально по неисчезающей в течение по меньшей мере 5 мин окраске соли d-элемента 4 периода IV-VI группы в промежуточной низкой степени окисления, оттенок которой зависит от выбора соли d-элемента и природы реагента, обеспечивающего поддержание кислотности реакционной массы, что известно среднему специалисту в данной области. Completion nitro recovery can be determined visually by nonvanishing for at least 5 min coloration salt d-member 4 period IV-VI group in the intermediate a low degree of oxidation, the shade of which depends on the choice of salt d-element and the nature of the reagent, thus maintaining the reaction mass pH It is known to the person skilled in the art. Например, при использовании хлорида титана(Ш) реакционная масса в присутствии избытка восстановителя окрашена в зелёный цвет в среде ацетатного буферного раствора и в фиолетовый цвет в солянокислой среде. For example, when using titanium chloride (III), the reaction mass in the presence of an excess of reducing agent is colored green among acetate buffer solution and a purple color in hydrochloric acid medium. Избыток соли хрома(П) в ацетатном буферном растворе определяет красную окраску реакционной массы. Excess chromium salt (II) in acetate buffer solution determines the red color of the reaction mass.

Для осаждения соединения d-элемента в окисленной форме, образовавшегося в результате восстановления нитросоединения, и небольшого избытка исходной соли d-элемента применяют ортофосфаты и полиметафосфаты натрия или калия, а также ортофосфорную кислоту и их смеси. To precipitate the d-element compound in the oxidized form, formed by the reduction of a nitro compound and a slight excess of salt of d-starting element used orthophosphate and sodium or potassium polymetaphosphates, and phosphoric acid, and mixtures thereof. После отделения соединений d-элемента в окисленной форме, например, фильтрованием или центрифугированием, предпочтительно фильтрованием при пониженном давлении, полученное аминосоединение находится в растворе (в надосадочной жидкости или в фильтрате). After separation of the compounds d-element in oxidized form, e.g., by filtration or centrifugation, preferably by filtration under reduced pressure, the resulting amino compound is in solution (a supernatant or filtrate). Для выделения продукта указанный раствор необходимо нейтрализовать до pH около 7 во избежание гидролиза сложноэфирной группы при последующем упаривании, предпочтительно при пониженном давлении. For product isolation, the solution should be neutralized to a pH of about 7 to avoid hydrolysis of the ester group during the subsequent evaporation, preferably under reduced pressure.

Для удаления избыточной воды проводят азеотропную перегонку нейтрализованного раствора с абсолютным этанолом, бензолом или толуолом. To remove excess water carried neutralized solution azeotroped with absolute ethanol, benzene or toluene. Для выделения целевого продукта из реакционной смеси, содержащей соли, выполняют её экстракцию галогенированным органическим растворителем, таким как хлороформ, метиленхлорид, дихлорэтан или их смесью с последующим осаждением С4-С8-простым эфиром или алканом. To isolate the desired product from the reaction mixture containing the salt, its extraction is performed with a halogenated organic solvent such as chloroform, methylene chloride, dichloroethane or a mixture thereof, followed by deposition of C4-C8 alkane or an ether. В качестве С4-С8-простого эфира применяют диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, наиболее предпочтительно диэтиловый эфир. As the C4-C8 ether used diethyl ether, diisopropyl ether, methyl tert-butyl ether, most preferably diethylether. В качестве алкана применяют пентаны, гексаны, гептаны, петролейный эфир, наиболее предпочтительно гексан или петролейный эфир. As alkane used pentanes, hexanes, heptanes, petroleum ether, most preferably hexane or petroleum ether.

Во втором варианте восстановление проводят в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°C. In the second embodiment the reduction is performed in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature from 10 to 40 ° C. В качестве такого растворителя применяют метанол, этанол, изопропанол, ледяную уксусную кислоту или их смеси, предпочтительно смесь этанола с ледяной уксусной кислотой. As a solvent used, methanol, ethanol, isopropanol, glacial acetic acid or mixtures thereof, preferably a mixture of ethanol and glacial acetic acid. Для создания и поддержания pH указанной органической среды применяют органические кислоты, например уксусную кислоту или ее галогенпроизводные, такие как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также щавелевую, лимонную или винную кислоты, или неорганические кислоты, например хлористоводородную или бромисто-водородную кислоты, а также смеси органических и/или неорганических кислот. To create and maintain the pH of said organic medium used organic acids such as acetic acid or its halogenated derivatives such as chloroacetic, trichloroacetic, bromoacetic, tribromuksusnaya, trifluoroacetic acid and oxalic, tartaric or citric acid, or inorganic acids, e.g. hydrochloric or hydrobromic acid, as well as mixtures of organic and / or inorganic acids.

В качестве восстановителей применяют хлорид или бромид титана(Ш). As reducing agents used bromide, chloride or titanium (III). Предпочтительно применение хлорида титана(Ш). Preferably, the use of titanium chloride (III). Для обеспечения полноты протекания реакции восстановления необходимо, чтобы по её завершении наблюдался небольшой избыток соли титана(Ш). For complete course of the reduction reaction it is necessary that on its completion there was a slight excess of titanium salt (III). Завершение восстановления нитросоединения можно определить визуально по неисчезающей в течение по меньшей мере 5 мин окраске соединения титана(Ш), оттенок которой зависит от природы реагента, обеспечивающего поддержание кислотности реакционной массы, что очевидно среднему специалисту в данной области. Completion recovery nitro compounds can be determined visually by nonvanishing for at least 5 min coloring titanium compound (III) whose hue depends on the nature of the reagent, thus maintaining the acidity of the reaction mass, which is obvious to the person skilled in the art. Например, при использовании ацетатно-спиртового буферного раствора избыток восстановителя обусловливает зелёную окраску реакционной массы. For example, using an alcoholic-acetate buffer solution causes the excess reducing green color of the reaction mass.

Для осаждения титанаДУ), образовавшегося в результате восстановления нитросоединения, и небольшого избытка исходного титана(Ш) применяют ортофосфаты и полиметафосфаты натрия или калия, а также ортофосфорную кислоту и их смеси. To precipitate titanaDU) formed by reduction of the nitro compound and a slight excess of the source of titanium (III) is used and sodium orthophosphate or potassium polymetaphosphates, and phosphoric acid, and mixtures thereof. После отделения соединений титана, например, фильтрованием или центрифугированием полученное аминосоединение находится в растворе. After separation of the titanium compounds, for example by filtration or centrifugation, the resulting amino compound is in solution. Для выделения продукта его осаждают С4-С8-простым эфиром. To isolate the product thereof precipitated C4-C8 ether. В качестве С4-С8-простого эфира применяют диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, наиболее предпочтительно диэтиловый эфир. As the C4-C8 ether used diethyl ether, diisopropyl ether, methyl tert-butyl ether, most preferably diethylether.

- 4 019319 - 4 019319

На стадии в) диазотирование метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты осуществляют прибавлением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°C. In step c) diazotization metoksipolietilenglikolevogo aminobenzoic acid ester is carried out by adding the nitrite of an alkali or alkaline-earth metal in an acidic aqueous or aqueous-organic medium at a temperature of from -2 to 30 ° C.

В первом варианте диазотирования применяют нитрит щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде. In the first embodiment apply nitrite diazotizing an alkali or alkaline earth metal in an acidic aqueous or aqueous-organic medium. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от 0 до 5°C. The most preferred diazotizing temperature range is from 0 to 5 ° C. Кислую среду создают с помощью органических кислот, например с помощью уксусной кислоты или ее галогенпроизводных, таких как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также лимонной или винной кислот, или неорганических кислот, например хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной или фосфорной кислот, а также смесью органических и/или нерганических кислот. The acidic environment is created by means of organic acids such as acetic acid or its halogenated derivatives such as chloroacetic, trichloroacetic, bromoacetic, tribromuksusnaya, trifluoroacetic acid, and citric or tartaric acids or inorganic acids such as hydrochloric, hydrobromic, sulfuric or phosphoric acid, and a mixture of organic and / or nerganicheskih acids. Молярное отношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. The molar ratio of nitrite to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 1.1: 1 to 1000: 1, preferably from 1.1: 1 to 10: 1. Молярное отношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1. The molar ratio of acid to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester is from 3: 1 to 10,000: 1. Реакцию предпочтительно проводят в присутствии катализатора диазотирования, в качестве которого используют бромид-ионы, вносимые в реакционную смесь в виде бромоводородной кислоты или ее растворимых солей, например бромидов щелочных металлов. The reaction is preferably carried out in the presence of a catalyst diazotization, which is used as the bromide ions are introduced into the reaction mixture in the form of hydrobromic acid or its soluble salts, for example alkali metal bromides. Наиболее предпочтительно создавать кислую среду раствором бромисто-водородной кислоты. Most preferably, creating an acidic environment with a solution of hydrobromic acid.

Во втором варианте диазотирование проводят с применением органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°C. In the second embodiment, the diazotization is carried out with the use of an organic nitrite in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature of from -40 to 30 ° C. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от -20 до 0°C. The most preferred diazotizing temperature range is from -20 to 0 ° C. Предпочтительными органическими нитритами являются бутилнитриты или амилнитриты, более предпочтительно трет-бутилнитрит. Preferred organic nitrites are butyl nitrite or amyl nitrite, preferably tert-butyl nitrite. Молярное отношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. The molar ratio of nitrite to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 1.1: 1 to 1000: 1, preferably from 1.1: 1 to 10: 1. Кислую среду в полярной органической среде создают растворами HCl или HBr в алифатическом эфире, например диэтиловом эфире, или циклическом эфире, например диоксане или тетрагидрофуране. The acidic environment in a polar organic medium forming a solution of HCl or HBr in an aliphatic ether such as diethyl ether or cyclic ether, e.g. dioxane or tetrahydrofuran. Молярное отношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1. The molar ratio of acid to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester is from 3: 1 to 10,000: 1.

По завершении диазотирования активированный ПЭГ-агент можно хранить при пониженной температуре в течение не более 2 ч в водной или водно-органической среде или не более 24 ч в полярной органической среде без существенной потери его способности к азосочетанию. Upon completion of the diazotization agent is activated PEG can be stored at low temperature for up to 2 hours in an aqueous or aqueous-organic medium or 24 h in a polar organic medium without substantial loss of its ability to azo coupling. Термин "пониженная температура" означает температуру от -2 до 5°C в случае применения водной или водно-органической среды и от -40 до 0°C в случае применения полярной органической среды. The term "low temperature" means a temperature of from -2 to 5 ° C in the case of an aqueous or aqueous-organic medium and from -40 to 0 ° C in the case of a polar organic medium. Перед применением активированного ПЭГ-агента для пегилирования интерферона требуется удаление избытка нитрит-ионов, для чего к его раствору добавляют мочевину или сульфаминовую кислоту. Before using the activated PEG agent for pegylation of interferon requires the removal of the excess nitrite ions, which solution was added to it urea or sulfamic acid. Альтернативно применяют азиды щелочных или щелочно-земельных металлов. Alternatively, azides used alkali metal or alkaline earth metal.

Пегилирование интерферона a-2b достигается в результате протекания реакции азосочетания диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты с интерфероном a-2b в нейтральной или слабощелочной водной или водно-органической среде при температуре от 0 до 30°C. PEGylation of interferon a-2b is achieved by azo coupling reaction of diazotized metoksipolietilenglikolevogo aminobenzoic acid ester with interferon a-2b in a neutral or weakly alkaline aqueous or aqueous-organic medium at a temperature of from 0 to 30 ° C. Наиболее предпочтительный интервал pH при пегилировании составляет от 9 до 10. Поддержание pH обеспечивают применением подходящего буферного раствора, например боратно-карбонатного буферного раствора. The most preferred range pegylation at pH ranges from 9 to 10. Maintaining provide use of a suitable pH buffer solution, such as borate-carbonate buffer. Выбор раствора находится в рамках компетенции среднего специалиста в данной области. The choice of the solution is within the purview of one of ordinary skill in the art. Молярное отношение диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты к интерферону a-2b составляет от 1:1 до 20:1, наиболее предпочтительно от 3:1 до 8:1. The molar ratio of the ester diazotized metoksipolietilenglikolevogo 4-aminobenzoic acid to interferon a-2b is from 1: 1 to 20: 1, most preferably from 3: 1 to 8: 1.

Контроль процесса пегилирования осуществляют эксклюзионной или обращено-фазовой ВЭЖХ. Pegylation control process performed by size exclusion or reversed-phase HPLC. По достижении требуемой степени превращения интерферона реакцию пегилирования останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей. Upon reaching the desired degree of pegylation of interferon conversion reaction is quenched by adding thereto a low molecular weight azosostavlyayuschey. Для этого в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют вещества фенольной природы или их эфиры, вещества, имеющие природу ароматических аминов, или вещества, имеющие гетероциклическую природу, у которых гетероцикл способен выступать в качестве азосоставляющей в реакции азосочетания. For this purpose, as low-molecular substances are used azosostavlyayuschey phenolic nature, or their esters, substances having the nature of aromatic amines, or a substance having a heterocyclic nature, in which the heterocycle is able to act as azosostavlyayuschey in the azo coupling reaction. Наиболее предпочтительными являются тирозин и гистидин, более предпочтительно тирозин. Most preferred are tyrosine, and histidine, more preferably tyrosine. Предпочтительно степень превращения интерферона, вычисленная по результатам ВЭЖХ-анализа, составляет 80-90%. Preferably the degree of conversion of interferon, calculated from the results of HPLC analysis is 80-90%.

Выделение монопегилированного интерферона a-2b из реакционной смеси осуществляют обычными методами ионообменной хроматографии, последовательно используя буферные растворы с возрастающей ионной силой. Isolation monopegilirovannogo interferon a-2b from the reaction mixture by conventional methods of ion exchange chromatography successively using buffers of increasing ionic strength. Концентрацию интерферона определяют методом ВЭЖХ или спектрофотометрически, используя значение А 280 , равное 1 для раствора с концентрацией интерферона a-2b 1 мг/мл. Interferon concentration is determined spectrophotometrically or by HPLC using a value of A 280 equal to 1 for a solution with a concentration of interferon a-2b 1 mg / ml.

С целью доказательства строения выделенного продукта как полиазосоединения были записаны электронные спектры поглощения (ЭСП) растворов интерферона a-2b и монопегилированного интерферона a-2b. In order to prove the structure of the isolated product was recorded as the poliazosoedineniya electronic absorption spectra (ESP) solutions of interferon a-2b and monopegilirovannogo interferon a-2b. Характеристики максимумов полос поглощения приведены в табл. Characteristics of the maxima of the absorption bands are listed in Table. 1. one.

- 5 019319 - 5 019319

Таблица 1 Table 1

Характеристики максимумов полос поглощения интерферона Characteristics of the maxima of the absorption bands of interferon

а-2Ь и монопегилированного интерферона a-2b (вода, pH 5,1, 11 см) a-2b and monopegilirovannogo interferon a-2b (water, pH 5,1, 11 cm)

Соединение Compound Характеристика Characteristic Значение Value
Интерферон a-2b Interferon a-2b Хыакс, НМ Hyaks, NM 218 218 - - - - - -
pl% £ 1см pl% £ 1cm 89,3 89.3 - - - - - -
Монопегилированный Monopegilirovanny ^-ыакс t ИМ ^ T -yaks MI 222 222 283 283 343 343 406* 406 *
интерферон a-2b interferon a-2b г 1% *4 см g 1% * 4 cm 29,2 29.2 3,94 3.94 3,71 3.71 2,44 2.44

г4%> r4%>

- поглощение 1% (мас./об.) раствора при 11 см. * - проявляется в виде плеча. - absorption of 1% (w / v..) Solution at 11 cm * -. Manifested as a shoulder.

Появление полос поглощения с максимумами при 283, 343 и 406 нм может быть объяснено, например, с позиций теории цветности органических соединений, локальными электронными переходами в хромофорных системах не связанных сопряжением диарилазогрупп, образовавшихся в результате азосочетания ПЭГ -агента с тирозиновыми и гистидиновыми звеньями молекулы интерферона a-2b. The appearance of absorption bands with maxima at 283, 343 and 406 nm can be explained, for example, from the standpoint of color theory of organic compounds, local electronic transitions in systems unrelated chromophore conjugation diarilazogrupp formed as a result azo coupling PEG -agent with tyrosine and histidine units interferon molecule a-2b. Уширение полос обусловлено образованием нескольких позиционных изомеров с близкими энергиями электронноколебательных переходов. Band broadening due to the formation of several positional isomers with similar energies elektronnokolebatelnyh transitions.

Достижение технического результата, заключающегося в получении пегилированного интерферона a-2b с увеличенным временем циркуляции в кровотоке, подтверждается результатами сравнительных исследований in vivo препарата "ПегИнтрон" (ковалентный конъюгат рекомбинантного интерферона альфа^ и монометоксиполиэтиленгликоля со средней молекулярной массой около 31300 Да, состоящий в основном из монопегилированных молекул) производства фирмы Schering и конъюгата в соответствии с изобретением (табл. 2). Achievement of the technical result consisting in the preparation of pegylated interferon a-2b with increased time of circulation in the blood stream, is confirmed by comparative studies in vivo drug "PegIntron" (covalent conjugate of recombinant interferon alpha ^ and monomethoxypolyethylene glycol having an average molecular weight of about 31300 Yes, essentially consisting of monopegilirovannyh molecules) manufactured by Schering, and the conjugate according to the invention (Table. 2).

Таблица 2 table 2

Относительные концентрации конъюгата The relative concentrations of the conjugate

Приведённые данные показывают, что конъюгат интерферона a-2b в соответствии с изобретением обладает большим временем циркуляции в кровотоке по сравнению с препаратом "ПегИнтрон". The given data show that the conjugate of interferon a-2b in accordance with the invention has a large circulation time in the bloodstream as compared to the drug "PegIntron".

В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ получения активированного ПЭГагента, заключающийся в том что: In a process for producing activated PEGagenta consisting in that according to the present invention:

а) свободную гидроксильную группу монометоксиполиэтиленгликоля a) The free hydroxyl group of Monomethoxypolyethylene

где n - целое число в интервале от 455 до 1140, where n - an integer in the range from 455 to 1140,

ацилируют хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты в галогенированном органическом растворителе в присутствии органического основания при температуре от 10 до 40°C и молярном отношении хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю от 1:1 до 1000:1 с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты acylated chloro- or bromide nitrobenzoic acid in a halogenated organic solvent in the presence of an organic base at a temperature from 10 to 40 ° C and the molar ratio of chlorine or bromide nitrobenzoic acid to monomethoxy from 1: 1 to 1000: 1 to afford metoksipolietilenglikolevogo nitrobenzoic acid ester

где n принимает указанные выше значения, wherein n is as defined above,

который выделяют из реакционной массы осаждением С4-С8-простым эфиром или С6-С8-алканом; which is isolated from the reaction mixture by precipitation C4-C8 ether or a C6-C8 alkane;

- 6 019319 - 6 019319

б) нитрогруппу выделенного метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты восстанавливают солью d-элемента 4 периода IV-VI группы в промежуточной низкой степени окисления в водной или водно-органической среде с pH от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°C с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты b) nitro selected metoksipolietilenglikolevogo nitrobenzoic acid ester salt is reduced d-member 4 period IV-VI group in the intermediate a low degree of oxidation in an aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 1.0 to 6.5 or in a polar organic solvent miscible unlimited with water at a temperature from 10 to 40 ° C to give metoksipolietilenglikolevogo aminobenzoic acid ester

где n принимает указанные выше значения, wherein n is as defined above,

который выделяют из реакционной массы осаждением С 48 -простым эфиром или С 68 -алканом; which is isolated from the reaction mixture by precipitation the C 4 -C 8 ether -simple or C 6 -C 8 alkanes;

в) выделенный метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°C или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°C, молярном отношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 1000:1 и молярном отношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты 3:1 до 10000:1 c) dedicated metoksipolietilenglikolevy ester aminobenzoic acid is diazotized with nitrite of an alkali or alkaline-earth metal in an aqueous or aqueous-organic medium at a temperature of from -2 to 30 ° C or an organic nitrite in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature of from -40 to 30 ° C, a molar ratio of nitrite to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 1.1: 1 to 1000: 1 and the molar ratio of acid to ester metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid 3: 1 to 10,000: 1 с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента. followed by removal of excess nitrite and produce activated pegiliruyuschego agent.

На стадии а) в качестве хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты может быть использован любой из орто-, мета- или пара-изомеров. In step a) as chloro- or bromides nitrobenzoic acid may be any of ortho-, meta- or para-isomers. Предпочтительны мета- и пара-изомеры, наиболее предпочтительны пара-изомеры (хлорангидрид или бромангидрид 4-нитробензойной кислоты). Preferred are meta- and para-isomers, most preferably the para-isomers (acid chloride or acid bromide of 4-nitrobenzoic acid).

В предпочтительном варианте изобретения на стадии б) в качестве растворителя применяют смесь этанола и ледяной уксусной кислоты, для создания и поддержания pH применяют ацетат натрия, в качестве восстановителя применяют TiCl 3 или CrSO 4 , а для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир. In a preferred embodiment, in step b) is used as a solvent mixture of ethanol and glacial acetic acid to establish and maintain the pH using sodium acetate as a reducing agent is used CrSO TiCl 3 or 4 and diethyl ether used to precipitate the product.

В другом предпочтительном варианте изобретения на стадии в) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой. In another preferred embodiment, in step c) is carried out diazotization with sodium nitrite in aqueous solution of hydrobromic acid and the excess nitrite was removed sulfamic acid.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии в) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии HCl в тетрагидрофуране. In a further preferred embodiment, in step c) tert-butyl nitrite diazotization is carried out in the presence of HCl in THF.

Ацилирование свободной гидроксильной группы монометоксиполиэтиленгликоля хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты проводят в галогенированном органическом растворителе в присутствии органического основания при температуре от 10 до 40°C. Acylation of the free hydroxyl groups of Monomethoxypolyethylene chloro- or bromide nitrobenzoic acid is carried out in a halogenated organic solvent in the presence of an organic base at a temperature from 10 to 40 ° C. Молярное отношение хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю составляет от 1:1 до 1000:1, предпочтительно от 5:1 до 20:1. The molar ratio of chlorine or bromide monomethoxy-nitrobenzoic acid to is from 1: 1 to 1000: 1, preferably 5: 1 to 20: 1.

Галогенированный органический растворитель выбирают из метиленхлорида, хлороформа, дихлорэтана или их смеси. Halogenated organic solvent is selected from methylene chloride, chloroform, dichloroethane or mixtures thereof. Органическое основание выбирают из группы алифатических третичных аминов или гетероциклических аминов. The organic base selected from tertiary aliphatic amines or heterocyclic amines. Предпочтительны триэтиламин или N-метилморфолин, особенно предпочтительны пиридин или хинолин. Preferably triethylamine or N-methylmorpholine, particularly preferably pyridine or quinoline. Продукт реакции осаждают из раствора С 48 -простым эфиром или алканом и выделяют фильтрованием или центрифугированием, предпочтительно фильтрованием при пониженном давлении. The reaction product precipitated from solution C 4 -C 8 alkane or -simple ether and isolated by filtration or centrifugation, preferably by filtration under reduced pressure. В качестве C^Cg-простого эфира применяют диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, наиболее предпочтительно диэтиловый эфир. As a C ^ Cg-ether used diethyl ether, diisopropyl ether, methyl tert-butyl ether, most preferably diethylether. В качестве алкана применяют пентаны, гексаны, гептаны, петролейный эфир, наиболее предпочтительно гексан или петролейный эфир. As alkane used pentanes, hexanes, heptanes, petroleum ether, most preferably hexane or petroleum ether.

На стадии б) восстановление монометоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты в монометоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты осуществляют солями d-элемента 4 периода IV-VI группы в промежуточной низкой степени окисления, например солями титана(Ш), ванадия(П) или хрома(П) в водной или водно-органической среде с pH от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°C. In step b) reducing monometoksipolietilenglikolevogo nitrobenzoic acid ester monometoksipolietilenglikolevy ester of aminobenzoic acid is carried salt d-member 4 period IV-VI group in the intermediate a low oxidation state, such as titanium salts (III), vanadium (II) or chromium (II) in an aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 1.0 to 6.5 or in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature from 10 to 40 ° C.

В первом варианте восстановление проводят в водной или водно-органической среде. In the first embodiment, the reduction is performed in an aqueous or aqueous-organic medium. В контексте настоящего изобретения термин "водно-органическая среда" обозначает смесь воды с органическим растворителем, таким как метанол, этанол, изопропанол, ацетон, ацетонитрил, в которой содержание воды превышает 50% (об./об.). In the present context the term "water-organic medium" means a mixture of water with an organic solvent such as methanol, ethanol, isopropanol, acetone, acetonitrile, wherein the water content exceeds 50% (vol. / Vol.). Для создания и поддержания pH водной или водно-органической среды применяют органические кислоты, например уксусную кислоту или ее галогенпроизводные, такие как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также щавелевую, лимонную или винную кислоты, или неорганические кислоты, например хлористо-водородную, бромисто-водородную или серную кислоты, а также смеси органических и/или неорганических кислот. To create and maintain the pH aqueous or aqueous-organic medium used organic acids such as acetic acid or its halogenated derivatives such as chloroacetic, trichloroacetic, bromoacetic, tribromuksusnaya, trifluoroacetic acid and oxalic, citric or tartaric acid, or inorganic acids such as hydrochloric -vodorodnuyu, hydrobromic or sulfuric acid, and mixtures of organic and / or inorganic acids. Предпочтительно применение буферных смесей с pH от 1,0 до 6,5, более предпочтительно с pH от 4 до 6. Примерами таких смесей являются ацетатные или цитратные буферные растворы. Preferably, the use of buffer mixtures with pH from 1.0 to 6.5, more preferably pH 4 to 6. Examples of such compounds are the acetate or citrate buffer solutions.

В качестве восстановителей применяют хлорид, бромид или сульфат титана(Ш), сульфаты ванадия(П) или хрома(П). As reducing agents used chloride, bromide, sulfate or titanium (III), vanadium sulfate (II) or chromium (II). Предпочтительно применение хлорида или сульфатов титана(Ш) или хрома(П), более предпочтительно применение хлорида титана(Ш) или сульфата хрома(П). Preferably, the use of chloride or titanium sulfate (III) or chromium (II), more preferably the use of titanium chloride (III) or chromium sulphate (n). Для обеспечения полно- 7 019319 To provide full-7 019319

ты протекания реакции восстановления необходимо, чтобы по её завершении наблюдался небольшой You leakage reduction reaction it is necessary that there was a slight on its completion

избыток соли d-элемента 4 периода IV-VI группы в промежуточной низкой степени окисления. excess of salt of d-member 4 period IV-VI group in the intermediate a low oxidation state. Завершение восстановления нитросоединения можно определить визуально по неисчезающей в течение по меньшей мере 5 мин окраске соли d-элемента 4 периода IV-VI группы в промежуточной низкой степени окисления, оттенок которой зависит от выбора соли d-элемента и природы реагента, обеспечивающего поддержание кислотности реакционной массы, что известно среднему специалисту в данной области. Completion nitro recovery can be determined visually by nonvanishing for at least 5 min coloration salt d-member 4 period IV-VI group in the intermediate a low degree of oxidation, the shade of which depends on the choice of salt d-element and the nature of the reagent, thus maintaining the reaction mass pH It is known to the person skilled in the art. Например, при использовании хлорида титана(Ш) реакционная масса в присутствии избытка восстановителя окрашена в зелёный цвет в среде ацетатного буферного раствора и в фиолетовый цвет в солянокислой среде. For example, when using titanium chloride (III), the reaction mass in the presence of an excess of reducing agent is colored green among acetate buffer solution and a purple color in hydrochloric acid medium. Избыток соли хрома(П) в ацетатном буферном растворе определяет красную окраску реакционной массы. Excess chromium salt (II) in acetate buffer solution determines the red color of the reaction mass.

Для осаждения соединения d-элемента в окисленной форме, образовавшегося в результате восстановления нитросоединения, и небольшого избытка исходной соли d-элемента применяют ортофосфаты и полиметафосфаты натрия или калия, а также ортофосфорную кислоту и их смеси. To precipitate the d-element compound in the oxidized form, formed by the reduction of a nitro compound and a slight excess of salt of d-starting element used orthophosphate and sodium or potassium polymetaphosphates, and phosphoric acid, and mixtures thereof. После отделения соединений d-элемента в окисленной форме, например, фильтрованием или центрифугированием, предпочтительно фильтрованием при пониженном давлении, полученное аминосоединение находится в растворе (в надосадочной жидкости или в фильтрате). After separation of the compounds d-element in oxidized form, e.g., by filtration or centrifugation, preferably by filtration under reduced pressure, the resulting amino compound is in solution (a supernatant or filtrate). Для выделения продукта указанный раствор необходимо нейтрализовать до pH около 7 во избежание гидролиза сложноэфирной группы при последующем упаривании, предпочтительно при пониженном давлении. For product isolation, the solution should be neutralized to a pH of about 7 to avoid hydrolysis of the ester group during the subsequent evaporation, preferably under reduced pressure.

Для удаления избыточной воды проводят азеотропную перегонку нейтрализованного раствора с абсолютным этанолом, бензолом или толуолом. To remove excess water carried neutralized solution azeotroped with absolute ethanol, benzene or toluene. Для выделения целевого продукта из реакционной смеси, содержащей соли, выполняют её экстракцию галогенированным органическим растворителем, таким как хлороформ, метиленхлорид, дихлорэтан или их смесь с последующим осаждением С4-С8-простым эфиром или алканом. To isolate the desired product from the reaction mixture containing the salt, its extraction is performed with a halogenated organic solvent such as chloroform, methylene chloride, dichloroethane or a mixture thereof, followed by deposition of C4-C8 alkane or an ether. В качестве С4-С8-простого эфира применяют диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, наиболее предпочтительно диэтиловый эфир. As the C4-C8 ether used diethyl ether, diisopropyl ether, methyl tert-butyl ether, most preferably diethylether. В качестве алкана применяют пентаны, гексаны, гептаны, петролейный эфир, наиболее предпочтительно гексан или петролейный эфир. As alkane used pentanes, hexanes, heptanes, petroleum ether, most preferably hexane or petroleum ether.

Во втором варианте восстановление проводят в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°C. In the second embodiment the reduction is performed in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature from 10 to 40 ° C. В качестве такого растворителя применяют метанол, этанол, изопропанол, ледяную уксусную кислоту или их смеси, предпочтительно смесь этанола с ледяной уксусной кислотой. As a solvent used, methanol, ethanol, isopropanol, glacial acetic acid or mixtures thereof, preferably a mixture of ethanol and glacial acetic acid. Для создания и поддержания pH указанной органической среды применяют органические кислоты, например уксусную кислоту или ее галогенпроизводные, такие как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также щавелевую, лимонную или винную кислоты, или неорганические кислоты, например хлористоводородную или бромисто-водородную кислоты, а также смеси органических и/или неорганических кислот. To create and maintain the pH of said organic medium used organic acids such as acetic acid or its halogenated derivatives such as chloroacetic, trichloroacetic, bromoacetic, tribromuksusnaya, trifluoroacetic acid and oxalic, tartaric or citric acid, or inorganic acids, e.g. hydrochloric or hydrobromic acid, as well as mixtures of organic and / or inorganic acids.

В качестве восстановителей применяют хлорид или бромид титана(Ш). As reducing agents used bromide, chloride or titanium (III). Предпочтительно применение хлорида титана(Ш). Preferably, the use of titanium chloride (III). Для обеспечения полноты протекания реакции восстановления необходимо, чтобы по её завершении наблюдался небольшой избыток соли титана(Ш). For complete course of the reduction reaction it is necessary that on its completion there was a slight excess of titanium salt (III). Завершение восстановления нитросоединения можно определить визуально по неисчезающей в течение по меньшей мере 5 мин окраске соединения титана(Ш), оттенок которой зависит от природы реагента, обеспечивающего поддержание кислотности реакционной массы, что очевидно среднему специалисту в данной области. Completion recovery nitro compounds can be determined visually by nonvanishing for at least 5 min coloring titanium compound (III) whose hue depends on the nature of the reagent, thus maintaining the acidity of the reaction mass, which is obvious to the person skilled in the art. Например, при использовании ацетатно-спиртового буферного раствора избыток восстановителя обусловливает зелёную окраску реакционной массы. For example, using an alcoholic-acetate buffer solution causes the excess reducing green color of the reaction mass.

Для осаждения титана(ЧУ). For the precipitation of titanium (NC). образовавшегося в результате восстановления нитросоединения, и небольшого избытка исходного титана(Ш) применяют ортофосфаты и полиметафосфаты натрия или калия, а также ортофосфорную кислоту и их смеси. formed by reduction of the nitro compound and a slight excess of the source of titanium (III) is used and sodium orthophosphate or potassium polymetaphosphates, and phosphoric acid, and mixtures thereof. После отделения соединений титана, например, фильтрованием или центрифугированием полученное аминосоединение находится в растворе. After separation of the titanium compounds, for example by filtration or centrifugation, the resulting amino compound is in solution. Для выделения продукта его осаждают С4-С8-простым эфиром. To isolate the product thereof precipitated C4-C8 ether. В качестве С4-С8-простого эфира применяют диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, наиболее предпочтительно диэтиловый эфир. As the C4-C8 ether used diethyl ether, diisopropyl ether, methyl tert-butyl ether, most preferably diethylether.

На стадии в) диазотирование метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты осуществляют прибавлением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°C. In step c) diazotization metoksipolietilenglikolevogo aminobenzoic acid ester is carried out by adding the nitrite of an alkali or alkaline-earth metal in an acidic aqueous or aqueous-organic medium at a temperature of from -2 to 30 ° C.

В первом варианте диазотирования применяют нитрит щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде. In the first embodiment apply nitrite diazotizing an alkali or alkaline earth metal in an acidic aqueous or aqueous-organic medium. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от 0 до 5°C. The most preferred diazotizing temperature range is from 0 to 5 ° C. Кислую среду создают с помощью органических кислот, например с помощью уксусной кислоты или ее галогенпроизводных, таких как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также лимонной или винной кислот, или неорганических кислот, например хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной или фосфорной кислот, а также смесью органических и/или нерганических кислот. The acidic environment is created by means of organic acids such as acetic acid or its halogenated derivatives such as chloroacetic, trichloroacetic, bromoacetic, tribromuksusnaya, trifluoroacetic acid, and citric or tartaric acids or inorganic acids such as hydrochloric, hydrobromic, sulfuric or phosphoric acid, and a mixture of organic and / or nerganicheskih acids. Молярное отношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. The molar ratio of nitrite to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 1.1: 1 to 1000: 1, preferably from 1.1: 1 to 10: 1. Молярное отношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру амино- 8 019319 The molar ratio of acid to amino ester metoksipolietilenglikolevomu 8 019319

бензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1. benzoic acid is from 3: 1 to 10,000: 1. Реакцию предпочтительно проводят в присутствии катализатора диазотирования, в качестве которого используют бромид-ионы, вносимые в реакционную смесь в виде бромоводородной кислоты или ее растворимых солей, например бромидов щелочных металлов. The reaction is preferably carried out in the presence of a catalyst diazotization, which is used as the bromide ions are introduced into the reaction mixture in the form of hydrobromic acid or its soluble salts, for example alkali metal bromides. Наиболее предпочтительно создавать кислую среду раствором бромисто-водородной кислоты. Most preferably, creating an acidic environment with a solution of hydrobromic acid.

Во втором варианте диазотирование проводят с применением органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°C. In the second embodiment, the diazotization is carried out with the use of an organic nitrite in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature of from -40 to 30 ° C. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от -20 до 0°C. The most preferred diazotizing temperature range is from -20 to 0 ° C. Предпочтительными органическими нитритами являются бутилнитриты или амилнитриты, более предпочтительно трет-бутилнитрит. Preferred organic nitrites are butyl nitrite or amyl nitrite, preferably tert-butyl nitrite. Молярное отношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. The molar ratio of nitrite to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 1.1: 1 to 1000: 1, preferably from 1.1: 1 to 10: 1. Кислую среду в полярной органической среде создают растворами HCl или HBr в алифатическом эфире, например диэтиловом эфире, или циклическом эфире, например диоксане или тетрагидрофуране. The acidic environment in a polar organic medium forming a solution of HCl or HBr in an aliphatic ether such as diethyl ether or cyclic ether, e.g. dioxane or tetrahydrofuran. Молярное отношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1. The molar ratio of acid to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester is from 3: 1 to 10,000: 1.

По завершении диазотирования активированный ПЭГ-агент можно хранить при пониженной температуре в течение не более 2 ч в водной или водно-органической среде или не более 24 ч в полярной органической среде без существенной потери его способности к азосочетанию. Upon completion of the diazotization agent is activated PEG can be stored at low temperature for up to 2 hours in an aqueous or aqueous-organic medium or 24 h in a polar organic medium without substantial loss of its ability to azo coupling. Термин "пониженная температура" означает температуру от -2 до 5°C в случае применения водной или водно-органической среды и от -40 до 0°C в случае применения полярной органической среды. The term "low temperature" means a temperature of from -2 to 5 ° C in the case of an aqueous or aqueous-organic medium and from -40 to 0 ° C in the case of a polar organic medium. Перед применением активированного ПЭГ-агента требуется удаление избытка нитрит-ионов, для чего к его раствору добавляют мочевину или сульфаминовую кислоту. Before using the activated PEG agent requires removing the excess of nitrite ions, which solution was added to it urea or sulfamic acid. Альтернативно применяют азиды щелочных или щелочноземельных металлов. Alternatively, azides used alkali or alkaline earth metals.

Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, подтверждающими возможность его осуществления с достижением указанного в описании технического результата. The invention will be illustrated by the following examples, confirming the possibility of implementation with achieving said technical result in the description.

Пример 1. Монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-нитробензойной кислоты (М.м. 30 кДа). EXAMPLE 1 Monometoksipolietilenglikolevy ester of 4-nitrobenzoic acid (Mw 30 kDa).

К раствору 30 г (1 ммоль) монометоксиполиэтиленгликоля (М.м. 30 кДа) в 100 мл безводного метиленхлорида прибавляют 2 мл безводного пиридина и вносят 1,9 г (10 ммоль) 4-нитробензоилхлорида. To a solution of 30 g (1 mmol) of monomethoxypolyethylene glycol (Mw 30 kDa) in 100 ml of anhydrous methylene chloride is added 2 ml of anhydrous pyridine and introduce 1.9 g (10 mmol) of 4-nitrobenzoyl chloride. Полученный раствор перемешивают 12 ч при комнатной температуре, упаривают на роторном испарителе до половины объема и продукт реакции осаждают добавлением диэтилового эфира. The resulting solution was stirred for 12 hours at room temperature, evaporated on a rotary evaporator to half volume and the product precipitated by addition of diethyl ether. Осадок отфильтровывают под вакуумом, промывают несколько раз диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме. The precipitate is filtered off with suction, washed several times with diethyl ether and dried in vacuo. Выход 30 г (100%). Yield 30 g (100%).

Пример 2. Монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа). EXAMPLE 2 Monometoksipolietilenglikolevy ester of 4-aminobenzoic acid (Mw 30 kDa).

К раствору 3,0 г (0,1 ммоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-нитробензойной кислоты (М.м. 3 0 кДа), полученного в соответствии с примером 1, приливают 20 мл ледяной уксусной кислоты, а затем прибавляют 3 г ацетата натрия. To a solution of 3.0 g (0.1 mmol) monometoksipolietilenglikolevogo ester 4-nitrobenzoic acid (Mw 3 0 kDa) prepared in accordance with Example 1, 20 ml of glacial acetic acid, then add 3 g of sodium acetate. Раствор перемешивают до полного растворения ацетата натрия и приливают 1 мл 20% TiCl 3 в 3% HCl. The solution was stirred until complete dissolution of sodium acetate and 1 ml of 20% TiCl 3 in 3% HCl. Реакционную смесь перемешивают 15 мин, приливают 0,5 мл 4 М NaH2PO4 и отфильтровывают выпавший осадок. The reaction mixture was stirred for 15 min, poured 0.5 ml of 4 M NaH2PO4 and the precipitate filtered off. К фильтрату приливают диэтиловый эфир, отфильтровывают монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты, промывают эфиром и высушивают в вакууме. To the filtrate was poured in diethyl ether, filtered monometoksipolietilenglikolevy ester of 4-aminobenzoic acid, washed with ether and dried in vacuo. Выход 3,0 г (100%). Yield 3.0 g (100%).

Пример 3. Монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа). EXAMPLE 3 Monometoksipolietilenglikolevy ester of 4-aminobenzoic acid (Mw 30 kDa).

К раствору 3,0 г (0,1 ммоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-нитробензойной кислоты (М.м. 3 0 кДа), полученного в соответствии с примером 1, в 30 мл цитратного буфера с pH 5,5 приливают 1 мл 20% TiCl 3 в 3% HCl. To a solution of 3.0 g (0.1 mmol) monometoksipolietilenglikolevogo ester 4-nitrobenzoic acid (Mw 3 0 kDa) prepared in accordance with Example 1, in 30 ml citrate buffer pH 5,5 1 ml of 20% TiCl 3 in 3% HCl. Реакционную смесь перемешивают 10 мин и прибавляют Na 2 HPO 4 до pH 7, отфильтровывают выпавший осадок. The reaction mixture was stirred for 10 minutes and added Na 2 HPO 4 up to pH 7, filtered the precipitate. Фильтрат упаривают под вакуумом на роторном испарителе при 65°C, к остатку приливают толуол и снова упаривают. The filtrate was evaporated in vacuo on a rotary evaporator at 65 ° C, the residue poured in toluene and evaporated again. Полученный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты растворяют в метиленхлориде, фильтруют, продукт из фильтрата осаждают эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром и высушивают в вакууме. Monometoksipolietilenglikolevy resulting ester of 4-aminobenzoic acid was dissolved in methylene chloride, filtered, product precipitated from the filtrate with ether, filtered, washed with ether and dried in vacuo. Выход 2,8 г (93%). Yield 2.8 g (93%).

Пример 4. Монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа). EXAMPLE 4 Monometoksipolietilenglikolevy ester of 4-aminobenzoic acid (Mw 30 kDa).

А) Приготовление раствора сульфата хрома(11). A) Preparation of chromium sulfate solution (11).

К 100 мл 5% раствора K2Cr2O7 в 20% H2SO4 порциями около 0,5 г вносят цинковую пыль до приобретения реакционной массой зеленого цвета, после чего к реакционной массе приливают 30 мл петролейного эфира и продолжают вносить цинковую пыль до приобретения реакционной массой синей окраски. To 100 ml of a 5% K2Cr2O7 solution in 20% H2SO4 in portions of about 0.5 g of zinc dust is made to acquire the green reaction mass, after which the reaction mass is poured into 30 ml of petroleum ether and continue to zinc dust to acquire a blue color of the reaction mass. В процессе восстановления следят, чтобы среда оставалась кислой. The recovery process monitor that the medium remains acidic. Раствору дают отстояться, после чего переливают в сосуд для хранения, прибавляют несколько гранул металлического цинка и, если требуется, еще петролейного эфира, снабжают гидрозатвором и оставляют на ночь. The solution was allowed to stand, and then poured into a storage vessel, added a few granules of metallic zinc and, if required, further petroleum ether, is provided with a hydraulic lock and left overnight. На следующий день темно-синий раствор сульфата хрома(П) CrSO 4 полностью готов к применению в качестве восстановителя и остается пригодным для этого в течение примерно 1 месяца. The next day, a dark blue solution of chromium sulfate (II) CrSO 4 is ready for use as a reducing agent and is suitable for this purpose for about 1 month.

Б) Восстановление монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-нитробензойной кислоты. B) Recovery monometoksipolietilenglikolevogo ester of 4-nitrobenzoic acid.

К раствору 3,0 г (0,1 ммоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-нитробензойной кислоты (М.м. 30 кДа), полученного в соответствии с примером 1, в 20 мл ацетатного буфера с pH 6 приливают избыток сульфата хрома(П), реакционная смесь тут же приобретает карминово-красный цвет, сосуд To a solution of 3.0 g (0.1 mmol) monometoksipolietilenglikolevogo ester 4-nitrobenzoic acid (Mw 30 kDa) prepared in accordance with Example 1, in 20 ml of acetate buffer, pH 6, poured excess chromium sulphate (n) the reaction mixture immediately becomes carmine-red color, a vessel

- 9 019319 - 9 019319

плотно закрывают крышкой и перемешивают 5 мин, при этом красный оттенок должен сохраниться. tightly capped and stirred for 5 min, the red color should persist. Далее водную фазу пятикратно экстрагируют равными порциями метиленхлорида (около 30 мл каждая). The aqueous phase was extracted five times equal portions of methylene chloride (about 30 ml each). Органические экстракты объединяют и упаривают под вакуумом на роторном испарителе при 40°C до 1/5 от первоначального объема, после чего полученный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты осаждают диэтиловым эфиром, отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме. The organic extracts were combined and evaporated in vacuo on a rotary evaporator at 40 ° C up to 1/5 of the initial volume, after which the resulting monometoksipolietilenglikolevy ester of 4-aminobenzoic acid was precipitated with diethyl ether, filtered, washed with diethyl ether and dried in vacuo. Выход 2,8 г (93%). Yield 2.8 g (93%).

Пример 5. Диазотированный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (активированный ПЭГ-агент с м.м. 30 кДа). EXAMPLE 5 monometoksipolietilenglikolevy ester diazotized 4-aminobenzoic acid (activated PEG agent M.W. 30 kDa).

К охлажденному до 1°C раствору 0,077 г (2,5 мкмоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа), полученного в соответствии с любым из примеров 2-4, в 1 мл 0,1 М HBr приливают 1 мл охлажденного 0,01 М NaNO 2 и выдерживают в ледяной бане 20 мин, после чего приливают 1 мл 0,01 М NH2SO3H и сразу же используют для пегилирования или хранят в холодильнике не более 2 ч. Cooled to 1 ° C solution of 0.077 g (2.5 mmol) monometoksipolietilenglikolevogo ester of 4-aminobenzoic acid (Mw 30 kDa) prepared in accordance with any of Examples 2-4 in 1 mL of 0.1 M HBr poured 1 mL of 0.01 M NaNO 2 and kept in an ice bath for 20 minutes, after which 1 ml of 0.01 M NH2SO3H and immediately used for pegylation or stored in the refrigerator for 2 hours.

ЭСП (вода, pH 4) λ, нм (lg ε): 203 (4,86), 256 (4,51), 275 (4,43, плечо). ESR (water, pH 4) λ, nm (lg ε): 203 (4.86) 256 (4.51) 275 (4.43, shoulder).

Пример 6. Диазотированный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (активированный ПЭГ-агент с м.м. 30 кДа). Example 6 monometoksipolietilenglikolevy ester diazotized 4-aminobenzoic acid (activated PEG agent M.W. 30 kDa).

К охлажденному до -35°C раствору 0,077 г (2,5 мкмоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (М.м 30 кДа), полученного в соответствии с любым из примеров 2-4, в 0,5 мл 0,2 М раствора HCl в тетрагидрофуране приливают 0,5 мл 0,01 М трет-бутилнитрита в тетрагидрофуране и оставляют при -35°C не менее чем на 30 мин (но не более чем на 24 ч), после чего прибавляют 0,5 мл To a cooled -35 ° C solution of 0.077 g (2.5 mmol) monometoksipolietilenglikolevogo ester of 4-aminobenzoic acid (MM 30kDa) obtained in accordance with any of Examples 2-4, in 0.5 ml of 0.2 M HCl solution in tetrahydrofuran are poured 0.5 ml of 0.01 M tert-butyl nitrite in tetrahydrofuran and left at -35 ° C for at least 30 minutes (but not more than 24 hours), after which is added 0.5 ml

0,01 М NH2SO3H и сразу же используют для пегилирования. NH2SO3H 0.01 M and was used directly for PEGylation.

Пример 7. Получение монопегилированного интерферона a-2b. Example 7. Preparation monopegilirovannogo interferon a-2b.

К охлажденному до 3°C раствору 10 мг (0,5 мкмоль) интерферона a-2b в боратно-карбонатном буфере с pH 9,5 приливают охлажденный раствор 0,077 г (2,5 мкмоль) диазотированного монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (М.м. 30 кДа), полученный в соответствии с примером 5 или 6, поддерживая pH реакционной смеси 9,5±0,3. Cooled to 3 ° C solution of 10 mg (0.5 mmol) of interferon a-2b in borate-carbonate buffer with pH 9,5 poured cooled solution of 0.077 g (2.5 mmol) monometoksipolietilenglikolevogo ester diazotized 4-aminobenzoic acid (M. m. 30 kDa), obtained according to example 5 or 6, maintaining the pH of the reaction mixture was 9.5 ± 0.3. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают приблизительно 3 ч, контролируя протекание превращений обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка Kromasil 300-5C4, 250x4,6 мм, спектрофотометрическое детектирование при 220, 280, 340 и 400 нм, градиентное элюирование: от 30% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ до 80% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ). The reaction mixture was stirred under cooling with about 3 hours, controlling the flow of transformations reverse phase HPLC (Kromasil 300-5C4, 250x4,6 mm spectrophotometric detection at 220, 280, 340 and 400 nm, gradient elution: 30% acetonitrile + aq. 0.2% TFA to 80% aq. acetonitrile + 0.2% TFA). По достижении степени превращения интерферона a-2b, равной 80-85%, приливают раствор тирозина, перемешивают 5 мин и уксусной кислотой доводят pH до 5,0-6,5. Upon reaching a conversion of interferon a-2b, of 80-85%, the solution was poured tyrosine, stirred for 5 minutes and acetic acid pH adjusted to 5.0-6.5. Далее реакционную смесь, содержащую смесь дипегилированого, монопегилированного и немодифицированного интерферона a-2b, a также блокированный пегилирующий агент, разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М NaCl. The reaction mix comprising dipegilirovanogo, monopegilirovannogo and unmodified interferon a-2b, a blocked also pegiliruyuschy agent separated by ion exchange chromatography with increasing ionic strength buffer elution solutions of 0.02 to 1.0 M NaCl. Выход очищенного монопегилированного интерферона a-2b 4,8 мг (48%, считая на интерферон a-2b). Yield of purified monopegilirovannogo interferon a-2b 4,8 mg (48%, based on interferon-a-2b). ЭСП (вода, pH 5,1, ESR (water, pH 5,1,

, F 1% i , F 1% i

11,0 см), Х макс /НМ < £ 1см ); 11.0 cm) X max / HM 1cm); 222 (29,2), 283 (3,94), 343 (3,71), 406 (2,44). 222 (29.2), 283 (3.94) 343 (3.71) 406 (2.44).

Пример 8. Определение времени циркуляции монопегилированного интерферона a-2b в крови на мышиной модели. Example 8. Determination circulation time monopegilirovannogo a-2b interferon in blood in a mouse model.

Самцам мышей линии СВА внутримышечно вводят по 1 мкг конъюгата в соответствии с изобретением (30 кДа), после чего собирают кровь в первый день через 2 ч после инъекции и далее через каждые 24 ч в течение 10 дней. Male CBA mice injected intramuscularly with 1 mg of the conjugate according to the invention (30 kDa), after which blood was collected on the first day after 2 h after injection and then every 24 hours for 10 days. В качестве контроля используют препарат "ПегИнтрон" (производства Schering, 31 кДа), который вводят по той же схеме. As a control drug "PegIntron" (manufactured by Schering, 31 kDa), which is administered by the same scheme. Взятые пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°C, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°C, полученную сыворотку центрифугируют и сохраняют при -65°C до проведения тестов. Taken blood samples were incubated for 45 min at 37 ° C, after which thrombus is separated and re-incubated at 4 ° C, centrifuged and the resulting serum stored at -65 ° C prior to testing. Содержание интерферона (пг/мл) в сыворотках крови определяют с помощью иммуноферментного анализа, результаты усредняют. interferon Content (pg / ml) in sera were determined by ELISA, the results are averaged. Вычисляют относительное содержание интерферона (в %), при этом за 100% принимают среднюю максимальную концентрацию белка в крови в каждой группе животных. Calculate the relative content of interferon (in%), wherein 100% is a mean maximum concentration of the protein in blood in each group. Данные представлены в табл. Data are shown in Table. 2. 2.

- 10 019319 - 10 019319

Claims (12)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ CLAIM
    1. Способ получения монопегилированного интерферона a-2b, отличающийся тем, что: 1. A process for preparing monopegilirovannogo interferon a-2b, characterized in that:
    а) свободную гидроксильную группу монометоксиполиэтиленгликоля a) The free hydroxyl group of Monomethoxypolyethylene
    где n - целое число в интервале от 455 до 1140, where n - an integer in the range from 455 to 1140,
    ацилируют хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты в галогенированном органическом растворителе в присутствии органического основания при температуре от 10 до 40°C и молярном отношении хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю от 1:1 до 1000:1 с получением метоксиполиэтиленгликоле во го эфира нитробензойной кислоты acylated chloro- or bromide nitrobenzoic acid in a halogenated organic solvent in the presence of an organic base at a temperature from 10 to 40 ° C and the molar ratio of chlorine or bromide nitrobenzoic acid to monomethoxy from 1: 1 to 1000: 1 in a yield of methoxypolyethylene nitrobenzoic acid ester
    где n принимает указанные выше значения, wherein n is as defined above,
    который выделяют из реакционной массы осаждением С4-С8-простым эфиром или С6-С8-алканом; which is isolated from the reaction mixture by precipitation C4-C8 ether or a C6-C8 alkane;
    б) нитрогруппу выделенного метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты восстанавливают солью, выбранной из соли титана(Ш), соли ванадия(П) или соли хрома(П), в водной или водно-органической среде с pH от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°C с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты b) The nitro ester selected metoksipolietilenglikolevogo nitrobenzoic acid is reduced with a salt selected from salts of titanium (III) salts, vanadium (II) or chromium salts (II) in aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 1.0 to 6.5 or a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature from 10 to 40 ° C to give metoksipolietilenglikolevogo aminobenzoic acid ester
    где n принимает указанные выше значения, wherein n is as defined above,
    который выделяют из реакционной массы осаждением С4-С8-простым эфиром или С6-С8-алканом; which is isolated from the reaction mixture by precipitation C4-C8 ether or a C6-C8 alkane;
    в) выделенный метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°C или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°C, молярном отношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 1000:1 и молярном отношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 3:1 до 10 c) dedicated metoksipolietilenglikolevy ester aminobenzoic acid is diazotized with nitrite of an alkali or alkaline-earth metal in an aqueous or aqueous-organic medium at a temperature of from -2 to 30 ° C or an organic nitrite in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature of from -40 to 30 ° C, a molar ratio of nitrite to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 1.1: 1 to 1000: 1 and the molar ratio of acid to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 3: 1 to 10 000:1 с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента; 000: 1 followed by removal of excess nitrite and produce activated pegiliruyuschego agent;
    г) активированный пегилирующий агент без выделения из реакционной смеси вводят в реакцию азосочетания с интерфероном a-2b в водной или водно-органической среде с pH от 7,0 до 10,0 при температуре от 0 до 30°C; g) activated pegiliruyuschy agent without isolation from the reaction mixture is introduced into the azo coupling reaction with interferon a-2b in an aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 7.0 to 10.0 at a temperature of from 0 to 30 ° C; по достижении степени превращения по меньшей мере 70% реакцию останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей, выбранной из группы, состоящей из фенола, ароматического амина и гетероциклического соединения, у которого гетероцикл способен к азосочетанию, с получением смеси монопегилированного, дипегилированого и немодифицированного интерферона a-2b и блокированного ПЭГ -агента; on reaching a conversion of at least 70% the reaction was stopped by the addition thereto of low molecular azosostavlyayuschey selected from the group consisting of phenol, an aromatic amine and heterocyclic compounds whose heterocycle capable to azo coupling to give monopegilirovannogo mixture dipegilirovanogo and unmodified interferon a- PEG 2b and blocked -agent; и and
    д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с получением монопегилированого интерферона a-2b. d) the mixture is separated by ion exchange chromatography with an increase in the ionic strength of the eluting buffer to give solutions monopegilirovanogo interferon a-2b.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии а) в качестве галогенированного растворителя применяют безводный метиленхлорид, в качестве основания применяют безводный пиридин, ацилирование проводят при комнатной температуре и для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир. 2. A method according to claim 1, characterized in that in step a) as the halogenated solvent used is methylene chloride, anhydrous, as the base used, anhydrous pyridine, the acylation is carried out at room temperature and diethyl ether was used to precipitate the product.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на стадии б) в качестве растворителя применяют смесь этанола и ледяной уксусной кислоты, для создания и поддержания pH применяют ацетат натрия, в качестве восстановителя применяют TiCl3 или CrSO4, а для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир. 3. A method according to claim 1 or 2, characterized in that in step b) is used as a solvent mixture of ethanol and glacial acetic acid to establish and maintain the pH using sodium acetate as a reducing agent is used TiCl3 or CrSO4, and to precipitate the product diethyl ether is used.
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что на стадии в) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой. 4. A method according to any one of claims 1-3, characterized in that in step c) is carried out diazotization with sodium nitrite in aqueous solution of hydrobromic acid and the excess nitrite was removed sulfamic acid.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что на стадии в) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии HCl в тетрагидрофуране. 5. A method according to any one of claims 1-3, characterized in that in step c) tert-butyl nitrite diazotization is carried out in the presence of HCl in THF.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что на стадии г) для создания и поддержания pH применяют боратно-карбонатный буферный раствор, степень превращения интерферона a-2b составляет 80-85%, а в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют тирозин. 6. A method according to any one of claims 1-5, characterized in that in step d) to create and maintain the pH employed borate-carbonate buffer solution, the degree of conversion of interferon a-2b is 80-85%, and as low molecular weight is used azosostavlyayuschey tyrosine.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что на стадии д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М 7. A method according to any one of claims 1-6, characterized in that in step d) the mixture is separated by ion exchange chromatography with increasing ionic strength buffer elution solutions of 0.02 to 1.0 M
    - 11 019319 - 11 019319
    NaCl. NaCl.
  8. 8. Способ получения активированного ПЭГ-агента, отличающийся тем, что: 8. A process for preparing activated PEG-agent, characterized in that:
    а) свободную гидроксильную группу монометоксиполиэтиленгликоля a) The free hydroxyl group of Monomethoxypolyethylene
    где n - целое число в интервале от 455 до 1140, where n - an integer in the range from 455 to 1140,
    ацилируют хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты в галогенированном органическом растворителе в присутствии органического основания при температуре от 10 до 40°C и молярном отношении хлор- или бромангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю от 1:1 до acylated chloro- or bromide nitrobenzoic acid in a halogenated organic solvent in the presence of an organic base at a temperature from 10 to 40 ° C and the molar ratio of chlorine or bromide nitrobenzoic acid to monomethoxy from 1: 1 to
    1000:1 с получением метоксиполиэтиленгликоле во го эфира нитробензойной кислоты о 1000: 1 in a yield of methoxypolyethylene nitrobenzoic acid ester of
    где n принимает указанные выше значения, wherein n is as defined above,
    который выделяют из реакционной массы осаждением С 48 -простым эфиром или С 68 -алканом; which is isolated from the reaction mixture by precipitation the C 4 -C 8 ether -simple or C 6 -C 8 alkanes;
    б) нитрогруппу выделенного метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты восстанавливают солью, выбранной из соли титана(111), соли ванадия(11) и соли хрома(11), в водной или водно-органической среде с pH от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°C с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты b) The nitro ester selected metoksipolietilenglikolevogo nitrobenzoate reduced salt selected from titanium salts of (111), of vanadium salt (11) and chromium salts (11), in an aqueous or aqueous-organic medium with a pH of 1.0 to 6.5 or a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature from 10 to 40 ° C to give metoksipolietilenglikolevogo aminobenzoic acid ester
    где n принимает указанные выше значения, wherein n is as defined above,
    который выделяют из реакционной массы осаждением С4-С8-простым эфиром или С6-С8-алканом; which is isolated from the reaction mixture by precipitation C4-C8 ether or a C6-C8 alkane;
    в) выделенный метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°C или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°C, молярном отношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 1000:1 и молярном отношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 3:1 до 10 c) dedicated metoksipolietilenglikolevy ester aminobenzoic acid is diazotized with nitrite of an alkali or alkaline-earth metal in an aqueous or aqueous-organic medium at a temperature of from -2 to 30 ° C or an organic nitrite in a polar organic solvent, infinitely miscible with water at a temperature of from -40 to 30 ° C, a molar ratio of nitrite to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 1.1: 1 to 1000: 1 and the molar ratio of acid to metoksipolietilenglikolevomu aminobenzoic acid ester of from 3: 1 to 10 000:1 с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента. 000: 1 followed by removal of excess nitrite and produce activated pegiliruyuschego agent.
  9. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что на стадии а) в качестве галогенированного растворителя применяют безводный метиленхлорид, в качестве основания применяют безводный пиридин, ацилирование проводят при комнатной температуре и для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир. 9. A method according to claim 8, characterized in that in step a) as the halogenated solvent used is methylene chloride, anhydrous, as the base used, anhydrous pyridine, the acylation is carried out at room temperature to precipitate the product and apply diethyl ether.
  10. 10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что на стадии б) в качестве растворителя применяют смесь этанола и ледяной уксусной кислоты, для создания и поддержания pH применяют ацетат натрия, в качестве восстановителя применяют TiCl3 или CrSO4, а для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир. 10. The method of claim 8 or 9, characterized in that in step b) is used as a solvent mixture of ethanol and glacial acetic acid to establish and maintain the pH using sodium acetate as a reducing agent is used TiCl3 or CrSO4, and to precipitate the product diethyl ether is used.
  11. 11. Способ по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что на стадии в) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой. 11. A method according to any of claims 8-10, characterized in that in step c) is carried out diazotization with sodium nitrite in aqueous solution of hydrobromic acid and the excess nitrite was removed sulfamic acid.
  12. 12. Способ по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что на стадии в) диазотирование проводят трет-бутилнитритом в присутствии HCl в тетрагидрофуране. 12. The method according to any of claims 8-10, characterized in that in step c) is carried out diazotization tert-butyl nitrite in the presence of HCl in THF.
EA201100725A 2011-06-06 2011-06-06 Method for producing covalent conjugate of polyethyleneglycol with interferon and method of producing activated peg-agent EA019319B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201100725A EA019319B1 (en) 2011-06-06 2011-06-06 Method for producing covalent conjugate of polyethyleneglycol with interferon and method of producing activated peg-agent

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201100725A EA019319B1 (en) 2011-06-06 2011-06-06 Method for producing covalent conjugate of polyethyleneglycol with interferon and method of producing activated peg-agent

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201100725A1 EA201100725A1 (en) 2012-10-30
EA019319B1 true EA019319B1 (en) 2014-02-28

Family

ID=47136896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100725A EA019319B1 (en) 2011-06-06 2011-06-06 Method for producing covalent conjugate of polyethyleneglycol with interferon and method of producing activated peg-agent

Country Status (1)

Country Link
EA (1) EA019319B1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
RU2298560C2 (en) * 2004-04-30 2007-05-10 Открытое Акционерное Общество "Верофарм" Conjugates of protein and polyethylene glycol derivative, pharmaceutical composition, method for control of viral infection

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
RU2298560C2 (en) * 2004-04-30 2007-05-10 Открытое Акционерное Общество "Верофарм" Conjugates of protein and polyethylene glycol derivative, pharmaceutical composition, method for control of viral infection

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUSTERLE, MATEJA et al. Size of Pegylated Protein Conjugates Studied by Various Methods ActaChim Slov., 2008, 55, p. 594-601, реферат, с, 595, кол. 1, абз. 3-4, с. 596, кол. 1, абз. 3-4 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201100725A1 (en) 2012-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6709679B2 (en) Antineoplastic conjugates of transferin, albumin and polyethylene glycol
FI111947B (en) A process for therapeutically useful 5-oxo- [1,4] oxazino [3,4-b] [1,3] oxazepine and for the preparation of thiazepine-7-carboxylic acid
CN1039015C (en) Polyethylene glycol-interferon conjugates
RU2676324C2 (en) Prodrug containing self-cleavable linker
JP5121068B2 (en) n as linker in the polymer conjugation prodrug, n- bis - (2-hydroxyethyl) glycinamide
JP4416184B2 (en) Long-acting drugs and pharmaceutical compositions containing them
US5457114A (en) Amidinophenylalanine derivatives, a process for the preparation thereof, use thereof and agents containing these as anticoagulants
EP2564862B1 (en) Substituted amino acids for preparing triazole linked macrocyclic peptides
FI102843B (en) The method essentially purified insulin derivative manufactured by the ramp up
ES2581902T3 (en) N-terminal derivatization with polysialic acid insulin
KR101113726B1 (en) Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
US8932828B2 (en) Method for preparing recombinant granulocyte colony stimulating factor cysteine muteins
CA2227891C (en) Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations
US6011007A (en) Acylated insulin
US20020045731A1 (en) Peptide derivatives
US20090137454A1 (en) Insulin Derivatives
US5750497A (en) Acylated insulin
CA1306212C (en) Insulin analogues and process for their preparation
US4748232A (en) Peptide production and use thereof
US5286637A (en) Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
AU2009261441B2 (en) Oligosaccharide chain added glp-1 peptide
EP2505593A1 (en) Compositions comprising an acylated insulin and zinc and method of making the said compositions
US6869930B1 (en) Acylated insulin
FI67865C (en) Foerfarande Foer framstaellning of a composition of the sulfatgrupper innehaollande polysackarider
AU612141B2 (en) Novel insulin derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
PZ4A Registration of pledge of rights to a eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM KG MD TJ TM

PZ4A Registration of pledge of rights to a eurasian patent
PZ4A Registration of pledge of rights to a eurasian patent
NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): AM KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM KG MD TJ TM

PZ4A Registration of pledge of rights to a eurasian patent