EA002024B1

EA002024B1 - Агент, индуцирующий апоптоз, способ его получения и пищевой продукт, содержащий его

Info

Publication number: EA002024B1
Application number: EA199900450A
Authority: EA
Inventors: Такеси Сакаи; Фу-Гонг Ю; Нобуто Кояма; Йоко Татсуми; Хироаки Сагава; Катсусиге Икаи; Икуносин Като
Original assignee: Такара Сузо Ко., Лтд.
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2001-12-24
Also published as: WO1998020884A1; CN1233961A; CN1380077A; TW482672B; KR20000053108A; ATE268601T1; US20020016299A1; AU4726997A; AU727026B2; EP0941737A4; CA2271705A1; EP0941737A1; DE69729471D1; DE69729471T2; EP0941737B1; CN1100561C; EA199900450A1

Abstract

Описываются индуцирующие апоптоз агенты, содержащие в качестве активного ингредиента глицеролипиды и/или глицерогликолипиды природного происхождения, способ получения данных агентов и пищевой продукт, содержащий агент, индуцирующий апоптоз.

Description

Данное изобретение относится к индуцирующим апоптоз агентам, содержащим физиологически активное вещество в качестве эффективного компонента, происходящее из животных, микроорганизмов или растений, и фармацевтически полезным для улучшения здоровья; к способу его получения и к пищевому продукту, содержащему вышеупомянутое физиологически активное вещество.

Предшествующий уровень техники

В последние годы апоптоз привлекает внимание, связанное с гибелью клеточных тканей.

Полагают, что в отличие от некроза, который является патологической гибелью клеток, апоптоз представляет собой гибель или смерть, которая изначально интегрируется в гене самой клетки. Так, считается, что ген, который программирует апоптоз, активируется, когда некая внешняя или внутренняя причина действует как триггер, происходит индуцированный указанным геном биосинтез белка гена, запрограммированного к смерти, вырабатываемый белок, запрограммированный к гибели, разрушает саму клетку, что приводит к ее смерти.

Если такой апоптоз может экспрессироваться в соответствующих тканях или клетках, возможно, что он будет удалять ненужные или патогенные клетки из живого организма в их естественной форме, и это будет иметь важное значение.

В последние годы привлекает внимание зависимость между апоптозом и сфинголипидом, таким как церамид, и сообщают, что синтез церамида бе ηονο происходит посредством пальмитиновой и стеариновой кислот, что индуцирует апоптоз Цоигпа1 ο£ Βίοίοβίοαΐ Сйетййу, т. 272, стр. 3324-3329 (1997)].

Проблемы, решаемые изобретением

Хотя ожидается, что церамид и свободные жирные кислоты разрабатываются как агенты, индуцирующие апоптоз, индуцирующее апоптоз действие других жирорастворимых веществ, происходящих из живых организмов, весьма сомнительно.

Целью данного изобретения является разработка высокобезопасной экстрагированной фракции, происходящей из растений, микроорганизмов или животных, обладающей индуцирующим апоптоз действием, и предложение агента, индуцирующего апоптоз, содержащего указанную фракцию, функционального пищевого продукта или напитка, содержащего указанную фракцию в качестве составляющего компонента, и способа их производства.

Средства решения проблем

Данные изобретатели провели интенсивные исследования для достижения такой цели и в результате они нашли, что глицеролипид и глицерогликолипид, свободные от фосфатного эфира и фосфонатного эфира в структуре моле кулы, полученные из растений, микроорганизмов или животных, проявляют сильное действие, индуцирующее апоптоз, в результате чего создано настоящее изобретение.

Таким образом, первая особенность настоящего изобретения относится к агенту, индуцирующему апоптоз, и характеризуется содержанием в качестве эффективного компонента(ов) глицеролипида и/или глицерогликолипида, свободного в структуре молекулы от фосфатного эфира и фосфонатного эфира.

Вторая особенность настоящего изобретения относится к способу производства агента согласно первой особенности данного изобретения и характеризуется тем, что указанный способ включает стадию экстракции органическим растворителем глицеролипида и/или глицерогликолипида, происходящего из растений, микроорганизмов или животных.

Третий аспект настоящего изобретения относится к пищевому продукту или напитку для индуцирования апоптоза, в которых содержится (содержатся) глицеролипид и/или глицерогликолипид, свободные от фосфатного эфира и фосфонатного эфира в структуре молекулы, добавленные к пищевому продукту или напитку и/или разбавленные ими.

Четвертая особенность изобретения относится к способу производства пищевого продукта или напитка третьего аспекта, которая характеризуется тем, что указанный способ включает стадию экстракции органическим растворителем глицеролипида и/или глицерогликолипида, происходящих из растений, микроорганизмов или животных.

Краткое объяснение чертежей

Фиг. 1 изображает характер элюирования внутреннего раствора после диализа с помощью колонки с быстрым потоком ДЕАЕ-сефарозы;

фиг. 2 демонстрирует индуцирующее апоптоз действие фракции В и чистого вещества;

фиг. 3 дает графическое изображение спектра ЯМР чистого вещества;

фиг. 4 показывает общую ионную хроматограмму образца А;

фиг. 5 показывает общую ионную хроматограмму образца В;

фиг. 6 дает графическое изображение хроматографии на колонке с сефарозой ЬН-60;

фиг. 7 показывает общую ионную хроматограмму липидного компонента фракции 20;

фиг. 8 показывает общую ионную хрοматограмму липидного компонента фракции № 21;

фиг. 9 показывает общую ионную хроматограмму липидного компонента фракции № 23;

фиг. 10 показывает общую ионную хроматограмму сахарного компонента фракции № 20;

фиг. 11 показывает общую ионную хроматограмму сахарного компонента фракции № 21 ;

фиг. 12 показывает общую ионную хроматограмму сахарного компонента фракции № 23;

фиг. 13 показывает общую ионную хроматограмму липидного компонента фракции, элюируемой хлороформом;

фиг. 14 показывает общую ионную хроматограмму липидного компонента фракции, элюируемой хлороформом и ацетоном в соотношении 80:20;

фиг. 15 показывает общую ионную хроматограмму сахарного компонента фракции, элюируемой хлороформом;

фиг. 16 показывает общую ионную хроматограмму сахарного компонента фракции, элюируемой хлороформом и ацетоном в соотношении 80:20;

фиг. 17 показывает общую ионную хроматограмму липидного компонента пятна, величина подвижности Κί которого составляет приблизительно 0,25;

фиг. 18 является графическим изображением общей ионной хроматограммы углеводного компонента пятна, величина Κί которого составляет примерно 0,25;

фиг. 19 дает графическое изображение общей ионной хроматограммы липидного компонента пятна, величина Κί которого составляет примерно 0,33;

фиг. 20 показывает общую ионную хроматограмму сахарного компонента пятна, величина Κί которого составляет около 0,33;

фиг. 21 показывает общую ионную хроматограмму липидного компонента этанольного экстракта ЬипакН1те_р (ЬуорйуНит и1тапит);

фиг. 22 показывает общую ионную хроматограмму сахарного компонента этанольного экстракта ЬинакНипер;

фиг. 23 показывает общую ионную хроматограмму липидного компонента этанольного экстракта та 1сНа (порошкообразный зеленый чай);

фиг. 24 показывает общую ионную хроматограмму сахарного компонента этанольного экстракта та!сНа;

фиг. 25 показывает общую ионную хроматограмму липидного компонента экстракта отрубей риса в 75% этаноле;

фиг. 26 представляет собой общую ионную хроматограмму сахарного компонента 75% этанольного экстракта рисовых отрубей.

Способ осуществления изобретения

В дальнейшем данное изобретение будет проиллюстрировано конкретно.

Не существует никаких особых ограничений для глицеролипида и/или глицерогликолипида, используемых в данном изобретении, и он/они могут производиться из растений, микроорганизмов или животных или могут синтезироваться химическим путем.

Нет никаких особых ограничений для растений, микроорганизмов или животных, которые могут использоваться в данном изобрете нии, коль скоро они являются продуктами, которые содержат глицеролипид и/или глицерогликолипид. Примерами растений являются овощные культуры, такие как шпинат, морковь и лук; двудольные растения, такие как чай; однодольные растения, такие как ячмень и рис; виды пряностей, такие как перец, мускатный орех, чеснок, лавровый лист, сельдерей, горчица, имбирь, красный перец, тимьян, шафран, коричное дерево, ваниль, все специи, катакИ (японская горчица), кресс водяной, капкНо (японский перец), перилла многолетняя, травянистое растение, иллициум анисовый, базилик, гага (лук-татарка), хмель и теакаЫ (японский хрен); продукты переработки данных растений, такие как зерновые остатки; водоросли, такие как бурые водоросли (РНаеорНусеаке), красные водоросли (КНоборЬусеае), зеленые водоросли (СЫогорНусеае) и одноклеточные зеленые водоросли; микроорганизмы, такие как грибы, дрожжи, гифомицеты (напр. ЛкретдШик) и бактерии (напр. ВасШик паИо и молочно-кислые бактерии) и животные, такие как позвоночные и беспозвоночные.

Термин чай, используемый в настоящем описании, подразумевает все, что обычно называют чаем, и его примеры включают неферментированный чай, такой как зеленый чай, кепсНа (зеленый чай среднего сорта), ЬапсНа (чай низкого сорта), Но|1сНа (обожженный чай) и та!сНа (порошкообразный зеленый чай); полуферментированный чай, такой как ра1рао чай и оолонг чай и паогонг чай; постферментированный чай, такой как мягкий чай. Кроме этого, термин «чай» включает парагвайский (та!е 1еа) чай, кико (китайский свадебный напиток) чай, чай «коикс слезы Иовы» (аб1ау 1еа) и ячменный чай.

Не существует никаких ограничений для грибов, используемых в данном изобретении, хотя предпочитают те грибы, которые обычно считают съедобными, и примерами являются Вак1бютуке1ек, такие как ЬипакН1те_р (ЬуорНу11ит и1татшт), На1акекН1те_р (Ьуорйу11ит бесак!ек), кИйаке (ЬепИпик ебобек), та!ки1аке (Тпс1ю1о\\<1 та!ки1аке), НопкЫтер (Ьуорйу11ит кН1те.р), епокйаке (Иаттийпа уекШрек). патеко (РНойо1а патеко), 1^а1аке (СуторНога екси1еп!а), Ыкитаде (Лштси1апа аштси1а), ктидакабаке (И1с1уорйога тбик1а!а), китйаке (Иаета1о1ота киЬ1а1етйшт), кигока^а (Во1е1орк1к 1еисоте1ак), кои!аке (8агсобоп акрта1ик), кНого (ВЫхородоп гиЬексепк), 1атадобаке (ЛтапИа НетЛарНа), сНюНйаке (Ьас1атшк уо1етик), пага!аке (ЛттШапа те11еа), На1ки1аке (Ьас1апик На1кибаке), Н1га1аке (Р1еито1ик ок1теа1ик), тайаке (6п1о1а кгопбока), та1кио.р (Ьепйпик 1ер1беик), обычный гриб (Лдапсик Ыкротик или подобные); и Лксотусе1ек, такой как 1осйикако (растительные осы или растительные гусеницы).

Не существует никаких особых ограничений для водорослей, используемых в настоящем описании, и их примерами являются буровые водоросли, такие как Гикигоиоп (Со1ротеша ыпиока), тохнкн (Ыетасуйик бес1р1еи8 и другие виды Скогбайасеае), такотки (Ьаттапа )арошса), дадоте котки (К)е11таше11а сгаккйойа), \\акате Шибала р1ииаййба), агате (Ещеша ρίηиаййба) и 1ιί)ί1<ί (ΗίζίΚίη Гщбогте); красные водоросли, такие как !еиди8а (бейбшт) и ίβίδΐι (Сегатшт коибо1); зеленые водоросли, такие как аока (И1уа рейика), ка\\апол (Рга§ю1а )арои1са) и т1ги (Собшт йадбе); и одноклеточные зеленые водоросли, такие как кигогега (СЫогейа).

Не существует никаких особых ограничений для злаковых остатков, используемых в данном изобретении, и их примеры включают отруби риса, отруби пшеницы, корень ячменя и окага (остатки бобового творога).

В данном изобретении глицеролипид и/или глицерогликолипид предпочтительно получают из указанных видов чая, грибов, водорослей или злаковых остатков и используют в качестве эффективного компонента(ов) для агента, индуцирующего апоптоз, или функционального пищевого продукта или напитка.

Нет никаких особых ограничений для используемых в данном изобретении глицеролипида и глицерогликолипида, характеризующихся индуцирующим (вызывающим) апоптоз действием, и примерами применяемого глицеролипида являются моно-, ди- и триацилглицерин, тогда как примерами применяемого глицерогликолипида являются гликолипиды, содержащие глицерин на гидрофобном фрагменте, такие как глицерогликолипиды, имеющие моноацильную группу, диацильную группу, алкилацильную группу, диалкилацильную группу, алкенилацильную группу, дибифитаниловый эфир или аналогичные в качестве гидрофобной группы. Так, моногалактозил-диацилглицерин, моногликозил-диацилглицерин, дигалактозил-диацилглицерин, дигликозил-диацилглицерин, диманнозил-диацилглицерин, тригликозил-диацилглицерин, тетрагликозил-диацилглицерин, полигликозил-диацилглицерин или аналогичные могут использоваться в качестве нейтрального глицерогликолипида, тогда как ценолипид, сульфохвиновозил-диацилглицерид, глюкулонозил-диацилглицерин, или аналогичные могут использоваться в качестве кислого глицерогликолипида.

Примерами жирных кислот, которые образуют глицеролипид и глицерогликолипид, используемые в данном изобретении, являются насыщенные и/или ненасыщенные жирные кислоты, такие как тетрадекановая кислота (миристиновая кислота, С14:0), гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота, С16:0), тетрадеценовая кислота (миристолеиновая кислота, С14:1), гексадеценовая кислота (пальмитолеиновая кислота, С16:1), октодеценовая кислота (олеиновая кислота, С18:1), цис-9, цис-12октадекадиеновая кислота (линолевая кислота,

С18:2) и 9,12,15-октадекатриеновая кислота (линоленовая кислота, С18:3), тогда как примерами, составляющими сахара, являются фукоза, ксилоза, манноза, галактоза, глюкуроновая кислота, глюкоза, галактоза, маннит и миоинозит. В данном случае, глицерогликолипид охватывает комплекс гликолипида с сахаром и/или белком и др.

Используемые в данном изобретении глицеролипид и/или глицерогликолипид, характеризующиеся индуцирующим апоптоз действием, происходящие из растений, микроорганизмов или животных могут легко производиться по способу, который включает стадию экстракции органическим растворителем, таким как содержащий воду гидрофильный органический растворитель (например, водный этанол). Однако не существует никаких особых ограничений для способа производства вышеупомянутого глицеролипида и/или глицерогликолипида. Так может использоваться, не только просто экстракция водой, но также известные способы, которые могут использоваться для очистки вышеупомянутого глицеролипида и/или глицерогликолипида. Также возможно, чтобы вещество, которое содержит глицеролипид и/или глицерогликолипид, происходящие из растений, микроорганизмов или животных, обрабатывалось химически, физически или энзиматически, а затем очищался требуемый глицеролипид и/или глицерогликолипид. После очистки физикохимические свойства или физиологическая активность (действие, вызывающее апоптоз, и др.) глицеролипида и/или глицерогликолипида могут использоваться в качестве показателя очистки.

В данном изобретении глицеролипид и/или глицерогликолипид, происходящие из растений, микроорганизмов или животных, экстрагируют органическим растворителем, таким как гексан, хлороформ, этилацетат, гидрофильный органический растворитель (например, ацетон, пропанол, этанол и метанол) и смеси их, или смесью этого растворителя с водой и съедобное вещество, содержащее глицеролипид и/или глицерогликолипид, может легко получаться с помощью метода производства, который включает стадию экстракции, например, водным этанолом. При использовании в качестве пищевого продукта или напитка, экстракцию предпочтительно проводят в таких экстрагирующих условиях, при которых органический растворитель, особенно гидрофильный органический растворитель, такой как 10-95% или предпочтительно 20-80% водный этанол используют обычно в течение нескольких минут до нескольких дней или предпочтительно в течение нескольких десятков минут до нескольких десятков часов обычно при 10~70°С или предпочтительно при 20-60°С, после чего эффективно экстрагируют глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) является соединением(ями), вызываю щим апоптоз. Когда глицеролипид и/или глицерогликолипид, происходящие из растений, микроорганизмов или животных, обрабатывают кислотой или щелочью перед экстракцией органическим растворителем или особенно гидрофильным органическим растворителем, возможно, что глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) является соединением(ями), вызывающим апоптоз, может экстрагироваться более эффективно.

Что касается способов сбора чистого глицеролипида и/или глицерогликолипида, используемых(ого) в данном изобретении, существуют известные способы, такие как способ Вйдй-Оует и способ разделения Ро1сй (см. «81ιίη 8е1кадаки йккеп Коха (Иете ТехЛоок оп Е.хрептепБ о Г ВюсйетШту)», уо1ите 4, Ηρίά III, стр. 104-109, 1990, изданный 1арап Вюсйет1са1 8ос1е1у, опубликованный Токуо Кадаки Όριίη) и любой из них, подходящий для нужной цели, может использоваться для экстракции глицеролипида и/или глицерогликолипида, применяемых в данном изобретении.

При очистке глицеролипида и/или глицерогликолипида, применяемых в данном изобретении, вышеупомянутый экстракт подвергают хроматографии, используя гидрофобный носитель, носитель с обращенной фазой и носитель с нормальной фазой и др., при помощи которых может осуществляться более эффективное разделение.

Не существует никаких особых ограничений для гидрофобного носителя и может использоваться любой из известных носителей. Примерами таких носителей являются смолы типа сефакрила, типа сефарозы, типа Тоуореаг1 и так далее, в которые введена бутильная, октильная или фенильная группа и адсобционная смола амберлит ΧΑΌ-1, -2, -4, -200, -7 или -8. Нет никаких ограничений для носителя с обращенной фазой, и может использоваться любой из известных носителей, а примеры такого носителя включают силикагель, в котором ковалентно связана алкильная цепь. Не существует никаких ограничений для носителя с нормальной фазой и может использоваться любой из известных носителей, а примером вышеупомянутого носителя является силикагель. При проведении очистки, физические и химические свойства глицеролипида и/или глицерогликолипида или физиологическая активность, такая как действие, вызывающее апоптоз, и противораковое действие могут использоваться в качестве показателя очистки.

Используемый в данным изобретении глицеролипид и/или глицерогликолипид, происходящий из растений, микроорганизмов или животных, может очищаться, например, из водного этанольного экстракта съедобных растений, микроорганизмов, животных и др., с помощью общепринятых способов обработки на ионооб менной смоле, гидрофобной хроматографии, гельфильтрации и др.

Обычно существует много случаев, когда глицеролипид и/или глицерогликолипид в растениях, микроорганизмах или животных присутствует(ют) в форме высокомолекулярного соединения, связанного с сахаридом и/или белком вблизи мембраны и, например, после экстракции горячей водой может получаться вещество, содержащее глицеролипид и/или глицерогликолипид, в котором глицеролипид и/или глицерогликолипид связан(ы) с сахаридом и/или белком. В данном случае термин «сахарид» означает сахарид, который присутствует в растениях, микроорганизмах или животных, и он охватывает моносахарид, олигосахарид, полисахарид и гликоконъюгаты.

В данном изобретении получаемое высокомолекулярное вещество, содержащее глицеролипид и/или глицерогликолипид, может использоваться как таковое, хотя в зависимости от цели применения, сахарид и/или белок обрабатывают энзиматически, химически и/или физически для очистки и сбора глицеролипида и/или глицерогликолипида, с помощью чего можно получать глицеролипид и/или глицерогликолипид в более очищенном состоянии.

Глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) получают посредством вышеупомянутого способа и используют в данном изобретении, является(ются) в высокой степени безопасным веществом(ами), полученным из естественного источника, и особенно полезным в качестве пищевого продукта и/или напитка.

Когда получающийся глицеролипид и/или глицерогликолипид связывается с лигандом, который распознает клетки-мишени, такие как моноклональные антитела, то возникает возможность специфически индуцировать апоптоз в любых клетках мишенях. Кроме того, когда соединение данного изобретения связывают с носителем, таким как альбумин, может предоставляться вещество, имеющее более высокие абсорбирующие свойства.

Агент, вызывающий апоптоз, данного изобретения может производиться в виде фармацевтического препарата путем объединения глицеролипида и/или глицерогликолипида, который происходит из растений, микроорганизмов или животных и который(ые) является эффективным(ыми) компонентом(ами) с известными фармацевтическими носителями. Обычно вызывающее апоптоз соединение(я) данного изобретения, такое как глицеролипид и/или глицерогликолипид связывают с фармацевтически приемлемым жидким или твердым носителем с последующим, если необходимо, добавлением к нему растворителя, диспергирующего агента, эмульгатора, буфера, стабилизатора, носителя, связующего вещества, дезинтегрирующего агента, смазки и др., после чего могут получаться твердые препараты, такие как таб летки, гранулы, разбавленный порошок, порошкообразный препарат и капсулы и жидкие препараты, такие как обычный жидкий препарат, суспензия и эмульсия. Альтернативно, соединение(я) готовят в виде сухого препарата, который превращают в жидкий добавлением к нему перед фактическим использованием подходящего носителя.

Агент, вызывающий апоптоз, данного изобретения может вводиться в виде любого из оральных и парентеральных средств, таких как средства для инъекции и инстилляции (введения малыми дозами).

Фармацевтические носители могут выбираться в зависимости от вышеупомянутых дозированных форм и форм препаратов. В случае оральных средств могут использоваться крахмал, лактоза, сахароза, маннит, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, неорганические соли и др. При приготовлении оральных средств с ними могут дополнительно компаунироваться связующее, дезинтегрирующий агент, поверхностно-активное вещество, смазочное вещество, промотор текучести, корригент, окрашивающее вещество, отдушка и др.

С другой стороны, в случае парентеральных средств глицеролипид и/или глицерогликолипид, происходящий, например, из растений, микроорганизмов или животных, который является эффективным компонентом данного изобретения, обладающим действием, индуцирующим апоптоз, растворяют или суспендируют в разбавителе, таком как дистиллированная вода для инъекций, физиологический солевой раствор, водный раствор глюкозы, растительное масло для инъекций, кунжутное масло, масло земляного ореха, масло бобов сои, кукурузное масло, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль, с последующим, если необходимо, добавлением к ним бактерицидного агента, стабилизатора, изотонического агента, анестезирующего агента и др.

Вызывающий апоптоз агент данного изобретения может вводиться с помощью соответствующего способа введения в зависимости от форм препарата. Нет никаких особых ограничений также для способа введения и может применяться любой из внутреннего и наружного способов введения и инъекции. Инъекционные препараты могут, например, вводиться внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно и др. Препараты для наружного введения охватывают суппозитории и аналогичные.

Доза вызывающего апоптоз агента данного изобретения может устанавливаться соответствующим образом в зависимости от формы препарата, способа введения и цели введения также, как и возраста, веса тела и симптомов у пациента, которому вводят индуцирующий агент, и не является фиксированной, хотя, обычно количество эффективного компонента, содержащегося в препарате, составляет 0,1-200 мг/кг в день для взрослого пациента. Само собой разумеется, что доза варьирует в зависимости от различных условий и поэтому в некоторых случаях может быть достаточной более низкая доза, чем вышеупомянутый диапазон доз, тогда как в других случаях может быть необходима более высокая доза, чем вышеприведенный диапазон. Фармацевтический агент данного изобретения не только вводят орально в том виде, как он есть, но может также приниматься ежедневно, добавлением его к любой пище или напитку.

Предложенный вызывающим апоптоз агентом данного изобретения способ индукции апоптоза является полезным при исследовании механизма биоиммунитета, иммунной функции или связи с такими заболеваниями, как рак, а также при разработке ингибитора индукции апоптоза. В частности, глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) является вызывающим апоптоз соединением(ями), получаемым из растений, микроорганизмов или животных, имеющих длительную историю употребления в пищу, высоко безопасен при оральном введении. Кроме того, пища или напитки, в которых содержатся глицеролипид и/или глицерогликолипид данного изобретения, такие как получаемые из растений, микроорганизмов или животных, и к которым добавляют эти агенты или разбавляют в них, характеризуются естественно высокой безопасностью и являются полезными в качестве здоровой пищи, благодаря вызывающему апоптоз действию.

Нет никаких особых ограничений для пищевых продуктов или напитков данного изобретения и их примерами являются переработанные продукты сельского хозяйства-лесничества, переработанные продукты домашнего скота, продукты рыбоводства и рыбного промысла и др., включая подвергнутые технологической обработке продукты зерновых, такие как продукты пшеницы, продукты крахмала, переработанные смешанные продукты, лапша, макароны, хлеб, бобовые пасты, хоЬа (японская гречневая лапша), £ц (японский пшенично-клейковинный хлеб), ЬНии (китайские бобовые желейные палочки), Нагихатс (японские желейные палочки из бобов), и упакованный тос1а (рисовый торт), переработанные жиро-масляные продукты, такие как пластические жир-масло, масло для 1стрига (сильно зажаренная пища), прованское масло, майонез и приправы; продукты соевых бобов, такие как 1о£и (творог из бобов сои), тихо (ферментированная паста бобов сои) и иайо (бобы сои после ферментации); переработанные мясные продукты, такие как окорок, бекон, прессованная ветчина и колбаса; продукты рыбной промышленности, такие как замороженный χιιπιηί (измельченное мясо рыбы), катаЬоко (вареная рыбная паста), с1ики\\а (японская рыбная паста, приготовленная в бамбукподобной форме), Натрсп (легкая рыбная лепешка), ха1хитаадс (жареные рыбные шарики), Гхитгге (кипяченная рыбная паста с некоторыми ингредиентами), зир (рыбные продукты), ветчина из рыбного мяса, колбаса, ка1зиойизЫ (сушеный тунец), переработанные продукты икры рыб, консервированные рыбные продукты и 1зикибаш (консервированная рыбная пища, выпаренная в соевом соусе); молочные продукты, такие как молоко, сливки, йогурты, масло, сыр, сгущенное молоко, сухое молоко и мороженное; обработанные растительные фруктовые продукты, такие как пасты, джемы, маринады, фруктовые напитки, овощные напитки и смешанные напитки; кондитерские изделия, такие как шоколад, бисквит, сладкая булочка, торт, тосЫдаз1и (рисовые шарики-пирожное) и рисовый крекер; алкогольные напитки, такие как саке (японское рисовое вино), китайское вино, вино, виски зНосНи (японский дистиллированный ликер), водка, бренди, джин, ром, пиво, легкие алкогольные напитки, фруктовое вино и ликер; столовые изысканные продукты, такие как зеленый чай, черный чай, оолонг чай, кофе, безалкогольные напитки и молочно-кислые напитки; приправы, такие как соевый соус, соус-\Уогссз1сг. уксус и ттп (сладкое саке); специи, такие как экстракты чеснока, перец, красный перец, мускатный орех, имбирь, иллициум анисовый, травы и базилик, консервированная, упакованная в бутылки или пакеты пища, такая как вареный рис, приправленный говядиной, кататезЫ (вареный рис, упакованный в контейнер в форме чайника), зек ί На η (рис, сваренный с красной фасолью). карри и рис и другие готовые пищевые продукты; полувысушенная или концентрированная пища, такая как печеночная паста и другие продукты, которые можно намазывать на хлеб, суп зойа и ибоп (оба являются японской лапшой). и концентрированный суп; сушеные пищевые продукты, такие как лапша быстрого приготовления, карри быстрого приготовления (растворимый). кофе быстрого приготовления, порошкообразный сок, порошкообразный суп, т1зо суп быстрого приготовления, переработанная пища, переработанный напиток и переработанный суп; замороженная пища, такая как зик1уак1, сйатап-тизЫ (тушеное на пару рагу из овощей с мясом), ипад1 кайауак (вареные угри), тонкий рубленый шницель, зНао-пкН (китайские паровые клецки), дуоха (жареный пудинг, фаршированный измельченной свининой) и др., различные виды палочек и фруктовые коктейли; твердая пища, жидкая пища, такая как суп; и специи.

Нет никаких особых ограничений для способа производства пищи или напитков данного изобретения и его примерами являются приготовление пищи, переработка продуктов и общепринятый способ производства пищевых продуктов или напитков, когда при любом используемом способе произведенные пищевые продукты или напитки содержат глицеролипид и/или глицерогликолипид, такой как происхо дящий из растений, микроорганизмов и животных, который(ые) является соединением(ями), вызывающим апоптоз.

Относительно приготовления пищи и переработки продуктов удовлетворит тот продукт, который после вышеупомянутого приготовления пищи или переработки продуктов содержит глицеролипид и/или глицерогликолипид, обладающий индуцирующим апоптоз свойством.

Таким образом, глицеролипид и/или глицерогликолипид, характеризующийся индуцирующим апоптоз свойством, добавляют до, во время и после приготовления пищи или переработки продуктов. Альтернативно, приготовленный или переработанный продукт или сырьевой материал для этого добавляют к веществу, содержащему глицеролипид и/или глицерогликолипид так, чтобы вышеупомянутый глицеролипид и/или глицерогликолипид был разбавлен.

При производстве пищи или напитка глицеролипид и/или глицерогликолипид, проявляющий вызывающее апоптоз действие, может добавляться на любой стадии. Что касается способа добавления может добавляться вышеупомянутый глицеролипид и/или глицерогликолипид, или пища, напиток или материал для этого может добавляться к вышеназванному глицеролипиду и/или глицерогликолипиду так, чтобы разбавлялся вышеназванный глицеролипид и/или глицерогликолипид. Добавление может проводиться или однократно, или несколько раз. Соответственно могут легко производиться пищевые продукты или напитки, оказывающие индуцирующее апоптоз действие. Когда применяют любую из этих стадий, пищу или напиток, содержащие глицеролипид и/или глицерогликолипид, проявляющие индуцирующие апоптоз свойства, или пищу или напиток, к которым добавляют глицеролипид и/или глицерогликолипид данного изобретения или разбавляют в них, определяются как пища (пищевой продукт) или напиток данного изобретения.

Не существует никаких особых ограничений в отношении количества глицеролипида и/или глицерогликолипида данного изобретения, оказывающего действие, вызывающее апоптоз, (такой как глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) является апоптозиндуцирующим соединением(ями) данного изобретения, происходящим из растений, микроорганизмов или животных) в пище, их количество соответственно может выбираться с учетом органолептичности и физиологической активности. Например, количество вышеупомянутого глицеролипида и/или глицерогликолипида составляет не менее чем 10^-9 частей на 100 частей пищи и ввиду органолептичности и физиологического действия в качестве пищи предпочтительно от 10^-8 частей до 5 частей и более предпочтительно от 10^-7 частей до 2 частей.

Нет никаких особых ограничений в отношении количества глицеролипида и/или глице рогликолипида данного изобретения, оказывающего индуцирующее апоптоз действие (такого как глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) является соединением(ями), вызывающими апоптоз, данного изобретения, происходящим из растений, микроорганизмов или животных) в напитке, их количество может соответственно выбираться с учетом органолептичности и физиологической активности. Например, количество вышеупомянутого глицеролипида и/или глицерогликолипида составляет не менее чем 10^-9 частей на 100 частей напитка и ввиду органолептичности и физиологического действия в качестве пищи предпочтительно от 10^-8 частей до 5 частей и более предпочтительно от 10^-7 частей до 2 частей. В данном описании термин часть(и) означает по весу.

Нет никаких особых ограничений для формы или вида пищи или напитка данного изобретения, коль скоро глицеролипид и/или глицерогликолипид данного изобретения, проявляющий индуцирующие апоптоз свойство, содержится в них, добавляется к ним и/или разбавляются ими, они могут охватывать любую форму, которая может приниматься орально, такую как таблетки, гранулы, капсулы, гель и золь (коллоидный раствор).

Пища или напиток данного изобретения содержит большое количество глицеролипида и/или глицерогликолипида, который(ые) является соединением(ями), данного изобретения, вызывающими апоптоз, проявляющим физиологическую активность, и является, в частности, целебной пищей или напитком, полезным для поддержания хорошего состояния желудка и кишечника благодаря индуцирующему апоптоз действию вышеназванного глицеролипида и/или глицерогликолипида.

Глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) является вызывающим апоптоз соединением(ями) данного изобретения, получают из растений, микроорганизмов или животных, и использование глицеролипида и/или глицерогликолипида, особенно полученного из годных в пищу растений, микроорганизмов или животных, для пищи или напитка совершенно безвредно, когда вышеупомянутое индуцирующее апоптоз соединение(я) не проявляет никакой токсичности в отношении животных в концентрациях, необходимых для достижения физиологической функции.

Глицеролипид и/или глицерогликолипид данного изобретения из годных в пищу растений, микроорганизмов или животных, имеет длительную историю применения в качестве пищи, и продукт, содержащий вышеупомянутый глицеролипид и/или глицерогликолипид, получаемое из них, является совершенно безвредным при оральном введении. Таким образом естественно, что пища или напиток, к которым добавлен вышеназванный глицеролипид и/или глицерогликолипид и/или разбавлен в них, являются безопасными.

Теперь ясно, что, как упомянуто выше, глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) является липидом(ами), имеющимся в живом организме, согласно данному изобретению проявляет индуцирующую апоптоз активность и противораковую активность.

Глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) является соединением(ями), вызывающим апоптоз, используемый в данном изобретении, присутствует в больших количествах в мембранных фракциях растений, микроорганизмов или животных и, в частности, они могут производиться с низкой себестоимостью и легко из годных в пищу растений или микроорганизмов. Кроме того, глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) рассматривают как соединение(я), вызывающие апоптоз, может селективно очищаться путем выбора соответствующего растворителя в соответствии со степенью его гидрофобности.

Глицеролипид и/или глицерогликолипид, который(ые) является соединением(ями), индуцирующим апоптоз, применяемым в данном изобретении (такой как получаемым из растений, микроорганизмов или животных) может легко придавать свое индуцирующее апоптоз действие пище или напитку, и глицеролипид и/или глицерогликолипид данного изобретения, характеризующийся вызывающим апоптоз свойством, очень полезен в качестве добавки(ок) к пище или напитку.

Примеры

Данное изобретение более конкретно иллюстрируется посредством следующих примеров, хотя данное изобретение совершенно не ограничивается этими примерами. Термин % в примерах означает по весу.

Пример 1. Получение композиции, характеризующейся действием, вызывающим апоптоз, из морской водоросли.

(1) Садоте кошЬи (К)с11ташс11а стаккбойа) хорошо высушивают и 20 кг высушенного продукта размалывают в дробилке (производство Ыата К1ка1 Зещакикйо).

Дигидрат хлорида кальция (производство Νίρροη Зоба) (7,3 кг) растворяют в 900 л водопроводной воды и затем с ним смешивают 20 кг измельченной дадоте котЬи. Температуру жидкости повышают от 12 до 90°С посредством барботирования в нее пара в течение 40 мин и смесь выдерживают при 90-95°С в течение одного часа при перемешивании и охлаждают, получая 1100 л охлажденного продукта.

Затем охлажденный раствор подвергают разделению твердой-жидкой фаз, используя сепаратор твердой-жидкой фаз (тип ΟΝΆ; производство \Уек11аНег ЗератаФт), получая около 900 л супернатанта после разделения твердойжидкой фаз.

Супернатант (360 л) после разделения твердой и жидкой фаз концентрируют до 20 л, используя РЕ10-РС-РИ8 0382 (фракционирование по молекулярному весу: 30,000) (производство Э;нсе1). Затем туда добавляют 20 л водопроводной воды, смесь концентрируют до 20 л, и такую обработку повторяют пять раз для обессоливания, после чего получают 25 л экстракта дадоте котЬи.

Один литр вышеназванного раствора высушивают при температуре ниже 0°С, получая 13 г сухого продукта.

(2) Экстракт (1,4 л), упомянутый в примере 1-(1), подвергают диализу против 20 мМ ацетатного буфера (рН 6), содержащего 0,2М СаС1₂, получая после диализа внутреннюю жидкость. Колонку быстрого протока с ДЕАЕ-сефарозой (14 см диаметр х 45,5 см высота) уравновешивают тем же самым буфером, наносят на нее внутреннюю жидкость после диализа, промывают тем же буфером и элюируют вышеназванным буфером, содержащим 20М ЫаС1 посредством метода градиента концентрации. Общее количество сахара и уроновой кислоты определяют по способу фенол-серная кислота и способу карбазон-серная кислота, получая фракции А, В и С в порядке элюирования. Фракции диализуют против дистиллированной воды и сушат вымораживанием, получая 760 мг фракции В.

Фракция В проявляет индуцирующую апоптоз активность.

Фиг. 1 представляет характер элюирования экстракта с колонки быстрого протока ДЕАЕсефарозой. Таким образом, фиг. 1 является графическим изображением, которое демонстрирует характер элюирования экстракта, получаемого из морской водоросли, с колонки с ДЕАЕсефарозой (14 см диаметр х 45,5 см высота), на котором ось ординат показывает поглощение при 530 нм, определенное по способу карбазолсерная кислота, и поглощение при 480 нм, выявленное по способу фенол-серная кислота, также как и удельную проводимость (тк/см), тогда как на абсциссе показаны номера фракций. На данном рисунке открытые круги представляют поглощение при 480 нм, установленное по способу фенол-серная кислота, черные точки представляют поглощение при 530 нм, установленное по способу карбазол-серная кислота, и сплошная линия изображает проводимость. Количество жидкости для одной фракции составляет 1000 мл.

(3) Фракцию В, фракционированную по вышеописанному способу, наносят на колонку быстрого протока с фенил-сефарозой 6 (4,4 см диаметр х 20 см высота), которую уравновешивают 1М №1С1. конечную концентрацию ЫаС1 доводят до 1М. Колонку промывают 1М ЫаС1 и получают фракцию, которую элюируют посредством градиента концентрации в воде. Фракцию концентрируют с помощью роторного испари теля и диализуют против дистиллированной воды, получая около 6,5 мл чистой фракции. Чистую фракцию сушат вымораживанием, получая 60 мг чистого продукта. Данный чистый продукт проявляет индуцирующую апоптоз активность.

(4) Определение вызывающего апоптоз действия чистого продукта.

Индуцирующую апоптоз активность вышеописанной фракции В и чистого продукта, упоминаемого в примере 1-(3), определяют следующим образом. Так, 0,5 мл водного раствора фракции В или вышеназванного чистого продукта добавляют к 2,5 х 10⁵ клеток/4,5 мл НЬ-60 (АТСС СЬ-240), культивируемых в среде ΚΡΜΙ1640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и инкубируют при 37°С в течение 48 ч. В то же самое время дистиллированную воду и раствор актиномицина Ό (10 мкг мл), который, как известно, характеризуется индуцирующей апоптоз активностью, добавляют для получения контрольных проб. Образование апоптозных телец, сморщивание клеток и аггрегацию ядер наблюдают невооруженным глазом под микроскопом, при этом подсчитывают число живых клеток.

Когда наблюдают такой феномен и обнаруживают снижение числа живых клеток, то принимают, что тест на индуцирующую апоптоз активность является положительным.

Активность, вызывающая апоптоз, подтверждалась в случае, когда добавляли фракцию В, очищенный продукт или актиномицин Ό. Результат представлен на фиг. 2. Так, фиг. 2 является графическим изображением, которое демонстрирует зависимость между временем инкубации и числом живых клеток в среде, когда фракцию В или чистый продукт добавляют к вышеупомянутой среде НЬ-60 клеток до конечной концентрации 2 мг/мл или 0,9 мг/мл, соответственно. На оси абсцисс представлено время инкубации (часы), тогда как на оси ординат представлено число живых клеток (Х 10⁵/5 мл) в среде. На чертеже открытые квадраты являются контролем, когда добавляют воду, открытые ромбы представляют случай, когда добавлялась фракция В, и открытые круги изображают случай, когда добавлялся чистый продукт.

(5) Физические и химические свойства чистого продукта, оказывающего вызывающее апоптоз действие.

Определяют физические и химические свойства чистого продукта, упомянутого в вышеописанном примере 1-(3).

(ί) ЯМР анализ ¹ Н-ЯМР-спектр измеряют, используя 1ΝΜА500 прибор ядерно-магнитного резонанса (производство Νίρροη ОепкЫ).

Результат показан по спектру 'Н-ЯМР. представленному на фиг. 3. На фиг. 3, на оси ординат показана интенсивность сигнала, тогда как на оси абсцисс показана величина химиче ского сдвига (ррт-частей на миллион). В данном случае, величину химического сдвига в ¹НЯМР выражают таким образом, что величину химического сдвига НОД определяют как 4,65 частей на миллион.

' Н-ЯМР (ДО) δ 0.7 (Н метила на конце жирной кислоты), 1,1 (метилен жирной кислоты и Н метила в положении С-5 фукозы), 3,1-5,6 (Н производное из сахара).

(ίί) СС-М8(ГХ-МС) анализ

5% метанольный раствор НС1 (1 мл) добавляют к 2 мг чистого продукта, упомянутого в примере 1-(3), и смесь плотно закрывают в пробирке и нагревают при 85°С в течение трех часов. После охлаждения смесь экстрагируют 1 мл н-гексана три раза, и полученный экстракт с нгексаном концентрируют до приблизительно 500 мкл в токе азота, получая образец А.

Оставшийся метанольный слой нейтрализуют добавлением к нему углекислого серебра и фильтруют, ток азота пропускают в фильтрат для выпаривания досуха, и остаток сушат в течение 4 ч, используя вакуумный насос. После сушки добавляют к остатку 5 капель реагента ТМ8 (который готовят следующим образом: 2,6 мл гексаметилдисилазана добавляют к 2,0 мл сухого пиридина, затем к нему добавляют 1,6 мл триметилхлорсилана, полученное мутное вещество удаляют центрифугированием и полученный при этом супернатант используют в качестве реагента) и смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 30 мин. После этого смесь нагревают при 50°С в течение 10 мин, охлаждают и перемешивают после добавления 1 мл хлороформа и хлороформный слой промывают 1 мл воды три раза. Полученный хлороформный раствор используют в качестве образца В.

Полученные выше образцы А и В подвергают СС-М8 анализу (газовая хроматографиямасс спектрометрия) в следующих условиях, используя ΌΧ-302 масс-спектрометр (производство Νίρροπ БеизЫ).

Образец А

Колонка: ТС-1 (С.Ь. 8с1еисе), 30 м х 0,25 мм внутренний диаметр

Температура: повышают от 130 до 250°С при скорости 4°С в минуту и выдерживают при 250°С в течение 5 мин

Скорость потока: 1,2 мл газа гелия в минуту

Диапазон масс для измерения массспектра: т/ζ 50-500

Интервалы времени для измерения массспектра: 3 с

Образец В

Колонка: ТС-1 (С.Ь.8с1еисе) 30 м х 0,25 мм внутренний диаметр

Температура: повышают от 130 до 300°С при скорости 4°С в минуту и выдерживают при 300°С в течение 5 мин

Скорость потока: 1,2 мл гелевого газа в минуту

Интервал времени для измерения массспектра: 3 с

Результат заключается в том, что образцы А и В показали общие ионные хроматограммы, представленные на фиг. 4 и фиг. 5 соответственно. На каждом рисунке на оси ординат представлена относительная интенсивность (%), тогда как верхняя и нижняя части оси абсцисс представляют время удерживания (минуты) и число сканирований, соответственно.

Подтверждение пиков на полученных хроматограммах от образцов А и В проводят посредством анализа масс-спектра каждого из пиков.

Метиловые эфиры каждой из тетрадекановой кислоты (миристиновая кислота) (пик 2), гексадекановой кислоты (пальмитиновая кислота) (пик 3) и тетрадеценовой кислоты (пик 1) подтверждались в качестве главных компонентов образца А.

В случае образца В подтверждался пик (пик 1), производный глицерина, пики (пики 2, 3 и 4), производные фукозы, пики (пики 5 и 6), производные ксилозы, пик (пик 7), производный маннозы, пики (8, 9 и 10), производные галактозы и пик (пик 11), производный глюкуроновой кислоты.

Соответственно обнаружено, что вышеупомянутый чистый продукт содержит глицеролипид и/или глицерогликолипид.

Пример 2.

(1) Измельченный продукт (2 кг) высушенной дадоте котЬи суспендируют в 20 л 80% этанола, перемешивают при 25°С в течение 3 ч и фильтруют для удаления растворимых веществ. Полученный остаток суспендируют в 20 л буфера (рН 8,2), который содержит 1,5 единиц полисахарида, содержащего эндосульфатированную фукозу (см. \УО 97/26896), 10% этанола, 100 мМ хлористого натрия и 50 мМ хлористого кальция и перемешивают при 25°С в течение 24 ч. Затем этот перемешанный раствор фильтруют и остаток промывают 10% этанолом, содержащим 50 мМ хлористого натрия. Промытый остаток суспендируют в 40 л буфера (рН 6,6), содержащего 4 г лиазы альгиновой кислоты (производство №да§е 8е1кадаки Кодуо), 100 мМ первичного кислого фосфорно-кислого натрия, 100 мМ хлорида натрия и 10% этанола и перемешивают при 25°С в течение 96 ч. Раствор центрифугируют и полученную супернатантную жидкость концентрируют, используя ультрафильтр, снабженный полым волокном, имеющим эксклюзионную молекулярную массу 100000 и заменяют 10% этанолом, содержащим

100 мМ хлористого натрия. К этому раствору добавляют 0,4М раствор уксусно-кислого кальция в том же объеме, смесь перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют и полученную супернатантную жидкость подвергают ультрафильтрации при тех же условиях, как описано выше, и заменяют 100 мМ хлористого натрия. К этому раствору добавляют хлористый натрий для установления его концентрации 1М, а рН доводят до 8,0, после чего получают 1,4 л экстракта дадоте котЬи.

Экстракт обрабатывают на колонке с 2,9 л фенилцеллюлофина (микрокристаллической фенилцеллюлозы) (производство 8е1кадаки Кодуо) и элюируют 6 л 1М хлористого натрия, 6 л воды и 8 л этанола в данном порядке.

Индуцирующее апоптоз действие каждой из элюированных фракций измеряют по способу, упомянутому в примере 1-(4), после чего обнаруживают индуцирующее апоптоз действие во фракции, элюируемой этанолом.

Фракцию, элюированную этанолом, концентрируют и выпаривают досуха, остаток растворяют в этаноле, получая 175 мл раствора, 58 мл полученного раствора пропускают через колонку с 1 130 мл сефарозы ЬН-60 (производство Рйаттас1а), предварительно уравновешенной этанолом, колонку элюируют этанолом и собирают каждые 60 мл элюата.

Характер элюирования представлен на фиг. 6. Таким образом, фиг. 6 является графическим изображением, который показывает результат хроматографии на колонке сефарозы ЬН-60, на оси ординат которого представлено поглощение при 230 нм, тогда как на оси абсцисс представлены номера фракций.

Активность, вызывающую апоптоз, каждой фракции определяли по способу, упомянутому в примере 1 -(4), после чего было обнаружено, что фракции из фракций №№ 8-15 и 27-49 не имеют никакой активности, тогда как фракции из фракций №№ 16-21 и 22-26 оказывают действие, индуцирующее апоптоз.

Из этих фракций, проявляющих сильную активность, для трех фракций (фракции №№ 20, 21 и 23) проводят анализ компонентов по способу, описанному в примере 1.

Фиг. 7, 8, 9, 10, 11 и 12 показывают общие ионные хроматограммы липидных компонентов или сахарных компонентов каждой из фракций №№ 20, 21 и 23. Таким образом, фигуры 7, 8 и 9 являются графическими изображениями общих ионных хроматограмм липидных компонентов каждой из фракций №№ 20, 21 и 23, в то время как фигуры 10, 11 и 12 являются изображениями общих ионных хроматограмм сахарных компонентов каждой из фракций №№ 20, 21 и 23. На каждом из рисунков, ось ординат представляет относительную интенсивность (%), тогда как на верхней и нижней частях абсциссы представлено время удерживания (минуты) и число сканирований соответственно.

На фиг. 7 и 10 показано, что во фракции из фракции № 20 обнаружены (детектированы) пики метиловых эфиров каждой из тетрадекановой кислоты (миристиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 7), гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 3 на фиг. 7), гексадеценовой кислоты (пик 2 на фиг. 7) и октадеценовой кислоты (олеиновой кислоты) (пик 4 на фиг. 7), пик, полученный от глицерина (пик 1 на фиг.

10) , и пики, полученные от галактозы (пики 2, 3 и 4 на фиг. 10). Далее фиг. 8 и 11 показывают, что во фракции из фракции № 21 обнаружены пики метиловых эфиров каждой из тетрадекановой кислоты (миристиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 8), гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 3 на фиг. 8), гексадеценовой кислоты (пик 2 на фиг. 8) и октадеценовой кислоты (олеиновой кислоты) (пик 4 на фиг. 8), пик, полученный от глицерина (пик 1 на фиг.

11) , и пики, полученные от галактозы (пики 2, 3 и 4 на фиг. 11).

Кроме того, фиг. 9 и 12 показывают, что во фракции из фракции № 23 обнаружены пики метиловых эфиров каждой из гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 9) и октадеценовой кислоты (олеиновой кислоты) (пик 2 на фиг. 9), пик, полученный от глицерина (пик 1 на фиг. 12), и пики, полученные от галактозы (пики 2, 3 и 4 на фиг. 12).

Таким образом, подтверждено, что вышеописанные фракции содержат глицеролипид и/или глицерогликолипид, и выяснено, что глицеролипид и/или глицерогликолипид проявляет активность, вызывающую апоптоз.

(2) Фракции №№ 1 6-26 из фракций, элюированных с колонки с сефарозой ЬН-60, как описано в примере 2-(1 ), собирают, концентрируют и выпаривают досуха, высушенный остаток растворяют в хлороформе, раствор подвергают хроматографии на колонке с 200 мл 1а1тоЬеабк 6КБ-8060 (производство 1а1гоп). предварительно уравновешенной хлороформом, и колонку элюируют хлороформом, а затем последовательно элюируют смесью хлороформа с ацетоном в соотношениях 80:20, 60:40, 40:60 и 20:80. В результате подтверждалось, что фракции, элюированные хлороформом и смесью хлороформа с ацетоном 80:20, проявляют сильную индуцирующую апоптоз активность.

Фракции, в которых подтверждалась активность, индуцирующая апоптоз, подвергались анализу компонентов по способу, упомянутому в примере 1.

Фиг. 13, 14, 15 и 16 демонстрируют общие ионные хроматограммы липидных и сахарных компонентов в каждой из фракций, элюированных хлороформом и смесью хлороформа и ацетона 80:20. Таким образом, фиг. 13 и 14 являются изображениями общих ионных хроматограмм липидных компонентов каждой из фракций, элюированных хлороформом и смесью хлороформа и ацетона 80:20, тогда как фиг. 15 и 16 являются графическими изображениями общих ионных хроматограмм сахарных компонентов каждой из фракций, элюированных хлороформом и смесью хлороформа с ацетоном 80:20. На каждом из рисунков на оси ординат представлена относительная интенсивность (%), тогда как на верхней и нижней части абсциссы указано время удерживания (минуты) и число сканирований, соответственно.

На фиг. 13 и 15 показано, что во фракции, элюированной хлороформом, обнаружен пик метилового эфира гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 13) и пик, полученный от глицерина (пик 1 на фиг. 15), тогда как на фиг. 14 и 16 показано, что из фракции, элюированной смесью хлороформа и ацетона 80:20, обнаружены пики метиловых эфиров каждой из тетрадекановой кислоты (миристиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 14) и гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 2 на фиг. 14) и пик, полученный от глицерина (пик 1 на фиг. 16).

Таким образом подтверждалось, что вышеупомянутые фракции содержат глицеролипид, и найдено, что глицеролипид проявляет активность, индуцирующую апоптоз.

Пример 3.

(1) . Добавляют воду к 230 мл 40-кратного концентрата экстракта, полученного из дадоше кошЬи, упомянутого в примере 1-(1), до получения 910 мл, затем к смеси добавляют 490 мл этанола и смесь перемешивают в течение 2 ч и центрифугируют, получая соединение, растворимое в 35% этаноле. Вещество, растворенное в 35% этаноле, концентрируют и выпаривают досуха, добавляют 100 мл воды, затем добавляют 400 мл смеси хлороформа и ацетона 2:1, смесь хорошо перемешивают и получают отделенную таким образом супернатантную жидкость. Нижнюю фазу органического растворителя выпаривают, добавляют воду до получения 100 мл и эти операции повторяют три раза. Полученный верхний слой раствора концентрируют и выпаривают досуха и добавляют к нему 10 мл хлороформа, получая вещество, которое растворимо в хлороформе. Это растворимое в хлороформе вещество концентрируют и подвергают хроматографии на колонке с 260 мл 1а1тоЬеабк 6К.88060 (производство 1а1гоп). предварительно уравновешенной хлороформом, колонку элюируют хлороформом, а затем последовательно смесями хлороформа и ацетона в соотношениях 90:10, 70:30, 40:60 и 20:80.

В результате подтверждалась сильная активность, вызывающая апоптоз, во фракциях, элюированных хлороформом и смесью хлороформа и ацетона 40:60.

(2) Фракцию, элюированную хлороформом, наносят пятнами на пластину силикагеля 60Т₂₅₄ (производство Мегск) и подвергают тонкослойной хроматографии, используя смесь 9:1 гексана и эфира в качестве проявителя, после чего единственное пятно, проявляющее активность, вызывающую апоптоз, детектируют в положении, в котором величина КТ составляет около 0,25.

Проводят анализ различных компонентов для данного пятна по способу, упомянутому в примере 1.

Фиг. 17 и 18 представляют общие ионные хроматограммы липидных компонентов или сахарных компонентов пятна, когда величина КТ составляла около 0,25. Таким образом, фиг. 17 является графическим изображением общей ионной хроматограммы липидных компонентов пятна, когда величина КТ была около 0,25, тогда как фиг. 18 является графическим изображением общей ионной хроматограммы сахарных компонентов пятна, когда величина КТ составляла около 0,25. На каждом из рисунков на ординате представлена относительная интенсивность, в то время как на верхней и нижней части абсциссы представлено время удерживания (минуты) и число сканирований, соответственно.

На фиг. 17 и 18 показано, что в пятне, величина КТ которого составляла около 0,25, обнаружены пики метиловых эфиров каждой из тетрадекановой кислоты (миристиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 17), гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 2 на фиг. 17) и октодеценовой кислоты (олеиновой кислоты) (пик 3 на фиг. 17) и пик, полученный от глицерина (пик 1 на фиг. 18).

(3) Фракцию, элюированную смесью хлороформа и ацетона 40:60, подвергали тонкослойной хроматографии, используя смесь хлороформа и метанола 95:12 в качестве проявителя, после чего обнаруживалось пятно, характеризующееся активностью, индуцирующей апоптоз, и подавляющей рост раковых клеток активностью, когда величина КТ составляла около 0,33.

Фиг. 19 и 20 представляют общую ионную хроматограмму липидных компонентов или сахарных компонентов пятна, когда величина КТ которого составляла около 0,33. Таким образом, фиг. 19 является графическим изображением общей ионной хроматограммы липидных компонентов пятна, величина КТ которого составляет около 0,33, тогда как фиг. 20 является изображением общей ионной хроматограммы сахарных компонентов пятна, величина КТ которого составляет около 0,33. На каждом из рисунков на оси ординат представлена относительная интенсивность, в то время как на верхней и нижней частях оси абсцисс представлено время удерживания (минуты) и число сканирований, соответственно.

Фиг. 19 и 20 показывают, что из пятна, когда величина КТ составляет около 0,33, обнару жены пики метаноловых эфиров каждой из тетрадекановой кислоты (миристиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 19) и гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 2 на фиг. 19), пики, полученные от галактозы (пики 2, 3 и 4 на фиг. 20), и пик, полученный от глицерина (пик 1 на фиг. 20).

Подтверждено, что пятна, упомянутые в вышеприведенном примере 3-(2) и примере 3- (3) , содержат глицеролипид и глицерогликолипид, и установлено, что глицеролипид и глицерогликолипид проявляют вызывающую апоптоз активность.

Пример 4.

Добавляют 10-кратный объем воды к 2,5 кг высушенной дадоте котЬи, измельченной на 1 мм кубики и после набухания кусочков вышеупомянутой морской водоросли супернатантную жидкость удаляют центрифугированием. К набухшей морской водоросли добавляют этанол и воду так, что, в конце концов, получают 10кратный объем 60% этанола, в затем смесь перемешивают при 37°С в течение 3 ч и центрифугируют, получая супернатантную жидкость. Супернатант концентрируют, затем к 750 мл водного раствора его добавляют хлороформ и метанол, при этом соотношение хлороформ:метанол:вода устанавливалось 2:4:0,8, смесь хорошо перемешивают и отделяют органическую фазу раствора, которая является нижним слоем.

Раствор нижнего слоя концентрируют и выпаривают досуха, из него готовят растворимое в хлороформе вещество и обрабатывают на колонке 200 мл с 1а1гоЬеаб§ 6К8-8060 (производство 1а1гоп), предварительно уравновешенной хлороформом, и колонку элюируют хлороформом, а затем последовательно смесью хлороформа и ацетона (40:60), ацетона и метанола.

Каждую из элюированных фракций концентрируют и наносят пятнами на пластину силикагеля 60Е₂₅₄ и проводят детекцию гликолипида, используя каждый из примулин-реагента (субстантивный тиазиновый краситель) и орцин-сульфатного реагента, при этом подтверждалось наличие гликолипида(ов) в обеих фракциях. В результате устанавливают, что фракция, элюированная растворителем с более низкой полярностью, содержит более высокие количества липидов и проявляет более сильную активность в виде действия, индуцирующего апоптоз.

Пример 5.

Сухую дадото котЬи размалывают с помощью миксера. К 5 г полученного порошка морской водоросли добавляют 25 мл (1) 60 мМ НС1, (2) 1М уксусной кислоты, (3) 1% ЫаНСО₃, (4) 1% Ыа₂сО₃, (5) 1% Ыа₂СО₃, (6) смесь хлороформа и метанола 2:1, (7) 75% водный раствор этанола, (8) 0,1% 8Ό8 (додецил сульфат натрия) или (9) 0,01% 8Ό8 и экстракцию проводят в течение 3 ч при 60°С для (1), (2), (3), (4) и (7) или при 37°С для всех остальных. В дальнейшем растворы (1)-(9) будут называться первичными экстрактами. (1) и (2) нейтрализуют №ьСО₃. (4) и (5) нейтрализуют НС1 и все остальные растворы центрифугируют такими, как они есть, а затем подвергают следующим операциям.

A. К осадку добавляют 25 мл 75% водного раствора этанола, экстракцию проводят при 60°С в течение 2 ч, супернатант после центрифугирования концентрируют и выпаривают досуха, а остаток растворяют в 1 мл 75% водного раствора этанола.

B. К 10 мл супернатанта добавляют 30 мл этанола с последующим смешением, супернатантную жидкость после центрифугирования концентрируют и выпаривают в вакууме досуха и остаток растворяют в 0,4 мл 75% водного раствора этанола.

C. Супернатант выпаривают в вакууме досуха и остаток растворяют в 1 мл 75% водного раствора этанола.

Полученный экстракт как таковой разбавляют 75% водным раствором этанола, каждые 5 мкл разбавленного экстракта добавляют в каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета и сушат на воздухе, добавляют туда 100 мкл ΚΡΜΙ 1640 среды, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и добавляют 5000 клеток НЬ-60 и измеряют активность подавления роста раковых клеток с помощью способа МТТ, описанного в примере 7, который представлен ниже.

Получался результат, приведенный в табл. 1. Таким образом, табл. 1 показывает зависимость между способом экстракции и активностью подавления роста раковых клеток, где цифры в таблице показывают степень разведения разбавленного раствора, проявляющего активность подавления роста раковых клеток. Перед экстракцией 75% водным раствором этанола, порошкообразную морскую водоросль обрабатывают кислым ((1)А) или щелочными ((3)А, (4)А, (5)А) растворами для первичного экстракта, после чего экстрагируют вещество, имеющее в два раза более высокую активность подавления роста раковых клеток по сравнению с необработанным случаем ((7)С). Кроме того, индуцирующую апоптоз активность этих фракций измеряют по способу, описанному в примере 8, который будет приведен ниже, для подтверждения индуцирующего апоптоз действия фракций, обладающих активностью в отношении подавления роста раковых клеток.

Таблица 1

Первичный экстракт	А	В	С
(1)	8	<2
(2)	4	4
(3)	8	-
(4)	8	4
(5)	8	2
(6)			8

(7)		4
(8)	2
(9)	<2

Пример 6.

(1) Каждый из промышленно доступных ЬипакЫшер, 11а1акск1птср. шайаке, епокйаке, кЫйаке и пашеко сушат при температуре ниже 0°С и затем полученные высушенные вымораживанием продукты размалывают для получения измельченных продуктов.

75% водный этанол (25 мл) добавляют к каждым 0,5 г полученных выше измельченных продуктов и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 2 ч. После получения экстракта центрифугированием, вышеназванный экстракт концентрируют и выпаривают в вакууме досуха, получая сухой продукт. Данный сухой продукт растворяют в 1 мл воды, получая этанольный экстракт.

(2) Измеряют подавляющую рост раковых клеток активность этанольного экстракта, упомянутого в вышеприведенном примере 6-(1).

Каждый из этанольных экстрактов стерилизуют фильтрованием через фильтр ΟΌ/Χ РЕ8 (производство \У11а1тап) и готовят серию разбавлений, используя стерилизованную воду. Каждые 10 мкл разбавленного раствора помещают в каждую лунку 96-луночного, микротитрационного планшета, добавляют туда 100 мкл среды ВМР1 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и содержащей 5000 клеток НЬ-60 и проводят инкубацию при 37°С в течение 48 ч в присутствии 5% углекислого газа. За формой клеток наблюдают под оптическим микроскопом, добавляют 10 мкл забуференного фосфатом водного физиологического раствора, содержащего 5 мг/мл 3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ; производство 8щша), инкубацию продолжают в течение еще 4 ч и за состоянием роста клеток наблюдают под микроскопом. Тем временем добавляют 100 мкл 2-пропилового спирта, содержащего 0,04Ν НС1, с последующим тщательным перемешиванием и измеряют поглощение при 590 нм и принимают в качестве степени роста клеток.

Что касается активности этанольных экстрактов грибов по торможению роста раковых клеток, обнаружено, что клетки гибнут под действием 30-кратного раствора ЬуорйуЦиш и1шагшш и 10-кратного разбавленного раствора ЬуорйуПиш бесайек, при этом отмечена высокая активность подавления роста раковых клеток и обнаружены апоптозные тельца. В случае 3кратного разбавленного раствора шайаке, епокйаке, кЫйаке и пашеко, клетки погибали, в случае 1 0-кратно разбавленных растворов обнаруживались апоптозные тельца, при чем каждый из этанольных экстрактов этих грибов показал сильную активность по подавлению роста раковых клеток и индуцирующее апоптоз действие.

3) В отношении этанольных экстрактов ЬуорйуПиш и1шапиш анализ компонентов осуществлялся по способу, упомянутому в примере

1.

Фиг. 21 и 22 представляют общие ионные хроматограммы липидных компонентов или сахарных компонентов в этанольном экстракте ЬуорйуПиш и1шапиш. Так, фиг. 21 является графическим изображением общей ионной хроматограммы липидных компонентов в этанольном экстракте ЬуорйуПиш и1шагшш, тогда как фиг. 22 является изображением общей ионной хроматограммы сахарных компонентов в этанольном экстракте ЬуорйуПиш и1шапиш. На каждом из рисунков на оси ординат представлена относительная интенсивность (%), в то время как на верхней и нижней частях оси абсцисс представлено время удерживания (минуты) и число сканирований, соответственно.

Фиг. 21 и 22 показывают, что в этанольном экстракте ЬуорйуПиш и1шапиш обнаружены пики метиловых эфиров каждой из гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 21) и цис-9,цис-12-октодекадиеновой кислоты (линолевой кислоты) (пик 2 на фиг. 21), пики, полученные от глюкозы (пики 2, 3 и 4 на фиг. 22), пик, полученный от маннита (пик 5 на фиг. 22), и пик, полученный от глицерина (пик 1 на фиг. 22).

Присутствие глицеролипида и/или глицерогликолипида подтверждалось также в этанольных экстрактах других грибов.

Пример 7.

Замороженный, измельченный ЬуорйуПиш и1шагшш (5 г), упомянутый в примере 6, суспендируют в 250 мл 75% водного раствора этанола и суспензию встряхивают при комнатной температуре в течение 2 ч, разделяют ее центрифугированием на супернатантную жидкость и осадок, после чего получают экстракт. Экстракт концентрируют и выпаривают досуха, используя роторный испаритель (30°С) и остаток повторно растворяют в 20 мл 75% водного раствора этанола, получая концентрированный экстракт ЬуорйуПиш и1шагшш. К части этого концентрированного экстракта ЬуорйуПиш и1шапиш добавляют половинный объем воды и такой же объем хлороформа и полученную суспензию оставляют стоять для фракционирования на верхний и нижний слои. Каждый из фракционированных слоев, верхний и нижний, концентрируют и выпаривают досуха, остаток повторно растворяют в половинном объеме (от использованного концентрированного экстракта Еуорйу11иш и1шапиш) 75% водного раствора этанола, и активность подавления роста раковых клеток каждой из фракций определяют следующим образом.

Готовят серию разбавлений повторно растворенного раствора каждой из фракций в 75% водном этаноле, используя 75% водный раствор этанола. Каждые 5 мкл разбавленных растворов помещают в лунки 96-луночного микротитрационного планшета и сушат, добавляют туда по 100 мкл среды ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и содержащей 5000 клеток НЬ-60 (АТСС ССЬ-240), и проводят инкубацию при 37°С в течение 48 ч. После того, как исследуют форму клеток под оптическим микроскопом, добавляют 10 мкл забуференного водного солевого (физиологического) раствора, содержащего 5 мг/мл МТТ, проводят инкубацию в течение еще 4 ч и за состоянием роста клеток наблюдают под микроскопом. Тем временем добавляют 100 мкл 2-пропилового спирта, содержащего 0,04Ν НС1, с последующим тщательным перемешиванием и измеряют поглощение при 590 нм и принимают в качестве показателя степени роста клеток (способ МТТ).

В результате найдено, что клетки гибнут под действием 20-кратного разбавленного раствора вышеописанной фракции из нижнего слоя, при этом подтверждалась высокая активность подавления роста раковых клеток и обнаружены апоптозные тельца. Данный концентрированный экстракт Иу ορίιν 11ит и1тагшт подвергают фракционированию хлороформом таким же способом, повторно растворяют в подвижной фазе для хроматографии на колонке силикагеля вместо растворения в 75% водном растворе этанола и подвергают хроматографии на колонке силикагеля. Хроматографию на колонке силикагеля проводят при двух условиях, используя подвижную фазу, состоящую из хлороформа:метанола:воды=65:25:4 (условие № 1), и подвижную фазу, состоящую из хлороформа:метанола=65:25 (условие № 2), независимо. После хроматографии на колонке силикагеля каждую фракцию концентрируют и выпаривают досуха, остаток повторно растворяют в 75% водном растворе этанола в 1/20 первоначального объема жидкости, измеряют их активность подавления роста раковых клеток с помощью того же способа МТТ, как описано выше, и фракцию, для которой подтверждалась активность, анализируют посредством ТСХ (хлороформ:метанол:вода=65:25:4). В результате найдено, что при условии № 1 активность имеется во фракции А, где присутствуют пятна, способные реагировать с примулиновым реагентом, (липиды), пятна, способные реагировать с нингидриновым реагентом (аминогруппа), пятна, способные реагировать с орцин-сульфатным реагентом (сахара), и пятна, способные реагировать с реагентом Диттмера (БШтег) (фосфолипиды), и во фракции В, в которой присутствуют пятна, реакционноспособные по отношению к примулиновому реагенту, и пятна, способные реагировать с орцин-сульфатным реагентом. При условии № 2 активность имеется во фракции С, в которой присутствуют пятна, реакционноспособные к орцин-сульфатному реагенту, во фракции Ό, в которой присутствуют пятна, реакционноспособные к примулиновому реа генту, и пятна, реакционноспособные к орцинсульфатному реагенту, и во фракции Е, в которой имеются пятна, реакционноспособные к примулиновому реагенту, пятна, реакционноспособные к нингидриновому реагенту, и пятна, реакционноспособные по отношению к орцинсульфатному реагенту. Далее фракцию А по условию № 1 , собирают, концентрируют и выпаривают досуха, растворяют в подвижной фазе и подвергают хроматографии на колонке силикагеля. Смесь хлороформа и метанола в соотношении 95:5 используют в качестве подвижной фазы (условие № 3). Каждую из фракций анализируют по способу МТТ таким же образом, как ранее, и фракции, в которых подтверждалась активность, анализировались с помощью ТСХ (хлороформ:метанол=95:5). В результате установлено, что при условии № 3 активность имеется во фракции Е, в которой присутствуют пятна, реакционноспособные к примулиновому реагенту, во фракции С, в которой присутствуют пятна, реакционноспособные к примулиновому реагенту, и пятна, реакционноспособные к орцин-сульфатному реагенту, и во фракции Н, в которой имеются пятна, реакционноспособные к орцин-сульфатному реагенту. Индуцирующая апоптоз активность этих фракций, которые активны в отношении подавления роста раковых клеток, подтверждается образованием апоптозных телец.

Пример 8.

Измельченный, высушенный при температуре ниже 0°С продукт (1 г) Κνορίιν 11ит и1тагшт, упомянутый в примере 6, суспендируют в 50 мл 75% водного раствора этанола или 50% водного раствора этанола, встряхивают при 37°С в течение 2 ч и центрифугируют для разделения на супернатант и осадок, после чего получают каждый экстракт. Каждый из экстрактов концентрируют и выпаривают досуха, используя роторный испаритель (30°С), и повторно растворяют в 8 мл 75% водного раствора этанола или 50% водного раствора этанола, получая концентрированный экстракт Иу ορίιν 11ит и1тапит.

Каждый из концентрированных экстрактов Γνορίινίΐιιιη и1тагшт разбавляют 75% или 50% водным раствором этанола. Разбавленный раствор анализируют с помощью способа МТТ, упомянутого в примере 7. Гибель клеток обнаруживают в том случае, когда раствор экстракта разбавляют в 10 раз 75% или 50% водным раствором этанола, и подтверждается активность в отношении торможения роста раковых клеток. Таким образом подтверждается, что при условиях экстракции 75% водным раствором этанола и 50% водным раствором этанола, экстрагируются вещества, которые активны в подавлении роста раковых клеток. Далее оценивают вызывающую апоптоз активность, используя концентрированные экстракты Иу-юрИу 11ит и1тагшт. Так, 25 мл каждого из вышеупомянутых концентрированных экстрактов используют в качестве образца, выпаривают оттуда этанол, остаток добавляют к 2,5 х 10⁵ НЬ-60 клеток/4,5 мл, которые инкубируют в среде ΕΡΜΙ 1640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, и проводят инкубацию при 37°С в течение 48 ч. В то же самое время контрольные образцы готовят добавлением дистиллированной воды и раствора актиномицина Ό (10 мкг/мл), который, как известно, проявляет активность, вызывающую апоптоз. Образование апоптозных телец, сморщивание клеток и аггрегацию ядер наблюдают невооруженным глазом под оптическим микроскопом и подсчитывают число живых клеток. Когда наблюдают такое явление и отмечают снижение числа живых клеток, то считается, что образец имеет индуцирующую апоптоз активность. В результате устанавливают, что экстракты с 75% водным раствором этанола и 50% водным раствором этанола содержат вещество, вызывающее апоптоз.

Пример 9.

(1) 75% водный раствор этанола (25 мл) добавляют к 0,5 г каждого из высушенных при температуре ниже 0°С порошков промышленно доступного Ыга1аке (Р1еиго1ик ок1геа1ик) и обычного гриба (Адапсик Ыкрогик или подобных) и экстракцию проводят при 37°С в течение 2 ч. Супернатант после центрифугирования концентрируют и выпаривают под вакуумом досуха, остаток растворяют в 1 мл 75% водного раствора этанола и раствор разбавляют 75% водным раствором этанола. К 1 мкл разбавленного раствора добавляют 100 мкл среды ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и 5000 клеток НЬ-60 и смеси анализируют на активность по подавлению роста раковых клеток с помощью способа МТТ, упомянутого в примере

7, а также измеряют индуцирующую апоптоз активность по способу, упомянутому в примере

8. В результате обнаружено, что разбавленный в 2 раза раствор 1пга1аке и неразбавленный раствор обычного гриба проявляют обе активности.

(2) К 40 г ЬипаЧнтср (Ьуорйу11ит и1таг1ит), упомянутому в примере 6, добавляют 0 (0%), 50 (25%), 100 (50%) или 150 мл (75%) этанола и 160, 110, 60 или 10 мл воды, смесь гомогенизируют в течение 30 с в миксере, встряхивают при комнатной температуре в течение 2 ч и фильтруют, получая экстракт. Экстракт разбавляют 75% водным раствором этанола, и измеряют активность торможения роста раковых клеток и активность, индуцирующую апоптоз, по способу МТТ, упомянутому в примере 7, и по способу, упомянутому в примере 8, соответственно. В результате установлено, что обе активности имеются в растворе экстрактов, разбавленных в два раза 0, 25 и 50% водными растворами этанола, а также в растворах, с разбавлением в 5 раз 75% водным раствором этанола.

К 40 г вышеупомянутого ЬипаЧптср. нарезанного на 3-5 мм кубики, добавляют 50 (25%), 100 (50%) или 150 мл (75%) этанола и 110, 60 или 10 мл воды, и смесь встряхивают при комнатной температуре в течение 2 ч и фильтруют, получая экстракт. Экстракт разбавляют 75% водным раствором этанола и измеряют его активность торможения роста раковых клеток по способу МТТ, описанному в примере 7, в то время как его активность, индуцирующую апоптоз, измеряют по способу, упомянутому в примере 8. В результате обнаружено, что обе активности обнаружены в первоначальном (неразбавленном) растворе экстракта с 25% этанолом и в растворах экстрактов, разбавленных в два раза 50% и 75% этанолом.

(3) Промышленно доступный кЫйаке (СойшеШик кЫйаке) сушат вымораживанием и размельчают, и полученный порошок экстрагируют в течение 2 ч в условиях, упомянутых в табл. 2.

_____________________________________Таблица 2

8Ыйаке порошок	Концентрация этанола	Количество жидкости для экстракции	Температура экстракции
(1) 0,5 г	25%	20 мл	60°С
(2) 0,5 г	75%	10 мл	комнатная температура
(3) 0,5 г	50%	10 мл	комнатная температура
(4) 0,5 г	75%	25 мл	комнатная температура

После экстракции нерастворимые частицы удаляют центрифугированием и супернатант концентрируют и выпаривают в вакууме досуха и растворяют в 1 мл водного раствора этанола той же концентрации, что используют для экстракции. Раствор разбавляют 75% водным раствором этанола и активность его в отношении торможения роста раковых клеток измеряют по способу МТТ, упомянутому в примере 7, тогда как активность, индуцирующую апоптоз, измеряют по способу, упомянутому в примере 8, при этом обе активности имеются в растворе, разбавленном в десять раз (1), в разбавленном в два раза растворе (2), в разбавленном в пять раз растворе (3) и разбавленном в пять раз растворе (4).

(4) Коммерчески или промышленно доступный кЫйаке разделяют на шляпки и ножки. Каждые из них отдельно сушат при температуре ниже 0°С и измельчают. К 0,5 г полученного порошка добавляют 25 мл 75% водного раствора этанола с последующей экстракцией при 37°С в течение 2 ч. Супернатант после центрифугирования концентрируют и выпаривают под вакуумом досуха, остаток растворяют в 1 мл 75% водного раствора этанола и полученный раствор разбавляют 75% водным раствором этанола. Активность в отношении подавления роста раковых клеток и активность, индуцирующую апоптоз, каждого разбавленного раствора измеряют по способу МТТ, упомянутому в примере 7, и способу, упомянутому в примере 8, соответственно, после чего обнаруживают, что обе активности имеются в растворе экстракта шляпок, разбавленного в два раза, и в растворе экстракта ножек, разбавленном в 20 раз. Высушенный китайский хНШакс высшего сорта, а также шляпки и ножки китайского хЫйакс среднего сорта, также измельчают в миксере и проводят аналогичную экстракцию и такое же измерение активности, индуцирующей апоптоз, после чего обнаруживают, что разбавленные в пять раз растворы всех экстрактов хЫйакс высшего сорта и шляпок и ножек среднего сорта проявляют обе активности.

Пример 10.

(1) К 0,5 г коммерчески доступного ша1с11а (порошкообразный зеленый чай) добавляют 25 мл воды и 75% водный раствор этанола и смесь встряхивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Экстракт центрифугируют и супернатант концентрируют и выпаривают под вакуумом досуха и остаток растворяют в 1 мл воды.

Экстракт разбавляют в виде серии разбавлений от 1- до 1 00-кратного. Десять мкл каждого из разбавленных растворов и 100 мкл среды ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и 5000 клеток НЬ-60, добавляют в каждую из лунок 96-луночного микротитрационного планшета и инкубируют в течение 48 ч и за состоянием роста клеток наблюдают под оптическим микроскопом. В результате обнаружено, что клетки погибают в случаях всех из разбавленных растворов обоих экстрактов, разбавленных водой и 75% водным раствором этанола, и как водный, так и этанольный экстракт чая проявляют сильную активность торможения роста раковых клеток. Кроме того, подтверждалось их индуцирующее апоптоз действие вследствие образования апоптозных телец.

(2) Анализ различных компонентов в этанольном экстракте шайка, упомянутого в примере 10-(1), проводят по способу, упомянутому в примере 1.

Фиг. 23 и 24 представляют общие ионные хроматограммы липидных компонентов или сахарных компонентов этанольного экстракта шайка. Так, фиг. 23 является графическим изображением общей ионной хроматограммы липидных компонентов этанольного экстракта таГсйа, тогда как фиг. 24 представляет общую ионную хроматограмму сахарных компонентов этанольного экстракта ша1с11а. На каждом из рисунков на оси ординат представлена относительная интенсивность (%), а на верхней и нижней частях оси абсцисс представлено время удерживания (минуты) и число сканирований, соответственно.

Фиг. 23 и 24 показывают, что в этанольном экстракте тайка обнаружены пики метиловых эфиров гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 23) и 9,12,15октадекатриеновой кислоты (линоленовой кислоты) (пик 2 на фиг. 23), пики, полученные от глюкозы (пики 3 и 4 на фиг. 24), и пик, полу ченный от глицерина (пик 1 на фиг. 24), что подтверждает присутствие глицеролипида и/или глицерогликолипида. Также обнаружен пик, полученный от миоинозита (пик 5 на фиг. 24) и пик, полученный от хинной кислоты (пик 2 на фиг. 24).

Пример 11.

(1) К 0,5 г рисовых отрубей добавляют воду, 75% водный раствор этанола или 90% водный раствор этанола с последующим встряхиванием при комнатной температуре в течение 2 ч. Экстракт центрифугируют, супернатант концентрируют и выпаривают под вакуумом досуха и остаток растворяют в 1 мл воды. В случае экстракта с 90% водным раствором этанола нерастворимые в воде вещества растворялись в этаноле. Эти образцы разбавляют и определяют их активность подавления роста раковых клеток и активность, индуцирующую апоптоз по способу МТТ, описанному в примере 7, и способу, представленному в примере 8, соответственно. Найдено, что обе активности имеются в разбавленном в пять раз растворе водного экстракта, в неразбавленном растворе 75% этанольного экстракта и в разбавленном в десять раз растворе растворимой в этаноле фракции экстракта с 90% этанолом, при этом этанольные экстракты отрубей риса показали сильное действие по подавлению роста раковых клеток и действие, индуцирующее апоптоз.

(2) Анализ различных компонентов в экстракте рисовых отрубей с 75% этанолом, упомянутом в примере 11-(1), проводят по способу, упомянутому примере 1.

Фиг. 25 и 26 представляют общие ионные хроматограммы липидных компонентов или сахарных компонентов 75% этанольного экстракта рисовых отрубей. Так, фиг. 25 является графическим изображением общей ионной хроматограммы липидных компонентов рисовых отрубей, тогда как фиг. 26 является изображением общей ионной хроматограммы сахарных компонентов 75% этанольного экстракта рисовых отрубей. На каждом из рисунков на оси ординат представлена относительная интенсивность (%), а на верхней и нижней частях абсциссы указано время удерживания (минуты) и число сканирований, соответственно.

На фиг. 25 и 26 показано, что в 75% этанольном экстракте рисовых отрубей обнаружены пики метиловых эфиров гексадекановой кислоты (пальмитиновой кислоты) (пик 1 на фиг. 25), октадеценовой кислоты (олеиновой кислоты) (пик 3 на фиг. 25) и цис-9,цис-12октадекадиеновой кислоты (линолевой кислоты) (пик 2 на фиг. 25), пики, полученные от глюкозы (пики 2 и 3 на фиг. 26), и пик, полученный от глицерина (пик 1 на фиг. 26), что подтверждает присутствие глицеролипида и/или глицерогликолипида.

Пример 13.

Моногалактозилдиглицерид (производство Аако Риге Сйеш1са1), происходящий из шпината, моногалактозилдиглицерид (производство БииакокЫ) пшеницы, и дигалактозилдиглицерид пшеницы, суспендируют в небольшом количестве н-декана, далее суспензию диспергируют с помощью ультразвуковой обработки и добавляют к ней этанол для достижения соотношения н-декан:этанол=2:98. Раствор разбавляют до 50кратного разбавления средой КРМ1 1640, 0,5 мл раствора добавляют к 4,5 мл среды, содержащей 2,5 х 10⁵ клеток НЬ-60, которые инкубировались в КРМ1 1640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Смесь инкубируют при 37°С в течение 48 ч и измеряют индуцирующее апоптоз действие с помощью способа, упомянутого в примере 1-(4), в результате подтверждалось сильное индуцирующее апоптоз действие и активность в отношении подавления роста раковых клеток.

Пример 14.

Коммерчески доступные капусту, кожуру баклажана, очищенный от кожуры баклажан и листья шпината сушат вымораживанием, измельчают, экстрагируют таким же образом, как в примере 9-(4), и проводят измерение активности подавления роста раковых клеток и активности, индуцирующей апоптоз, по способу МТТ, описанному в примере 7, и способу, упомянутому в примере 8, соответственно, в результате обнаружено, что разбавленные в два раза растворы экстрактов капусты, кожуры баклажана и листьев шпината и разбавленный в пять раз раствор экстракта очищенного от кожуры баклажана проявляют обе активности.

Преимущества изобретения

Согласно данному изобретению предоставляется индуцирующий апоптоз агент, в котором глицеролипид и/или глицерогликолипид (такой как глицеролипид и/или глицерогликолипид, проявляющий сильное индуцирующее апоптоз действие и происходящий из растений, микроорганизмов или животных) является(ются) эффективным компонентом(ами). Вышеупомянутый глицеролипид и/или глицерогликолипид присутствует в изобилии в мембранных компонентах растений, микроорганизмов или животных и может эффективно экстрагироваться водным этанолом или аналогичным, в результате чего может быть легко получен эффективный компонент данного изобретения. Перед экстракцией растворителем может проводиться кислая или щелочная обработка, вследствие чего эффективность экстракции может быть улучшена. Далее полярность экстрагирующего растворителя, хроматографический носитель для разделения и др. могут выбираться в зависимости от их гидрофобности, а в результате может селективно получаться требуемый глицеролипид и/или глицерогликолипид. Пищевые продукты или напитки, содержащие глице ролипид и/или глицерогликолипид, который является индуцирующим апоптоз соединением данного изобретения, экстрагируемым, в частности, из съедобных растений, микроорганизмов или животных и/или подверженным очистке и добавляемым к пищевым продуктам или напиткам или разбавленным ими, являются очень полезными в качестве здоровой пищи, так как ее ежедневный прием улучшает здоровье.

Claims

1. Агент, индуцирующий апоптоз, который содержит в качестве эффективного компонента глицеролипид и/или глицерогликолипид, свободный в своей молекулярной структуре от фосфатного эфира и фосфонатного эфира.

2. Агент по п.1, в котором вышеупомянутый глицеролипид и/или глицерогликолипид происходит из природных источников, например растений, микроорганизмов или животных.

3. Агент по п.2, в котором вышеупомянутыми природными источниками являются чай, грибы, водоросли или зерновые остатки.

4. Способ получения агента, индуцирующего апоптоз и содержащего глицеролипид и/или глицерогликолипид, свободный в молекулярной структуре от фосфатного и фосфонатного эфира, который включает стадию экстракции органическим растворителем глицеролипида и/или глицерогликолипида из источника природного происхождения, например растений, микроорганизмов или животных.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что перед экстракцией органическим растворителем осуществляют обработку кислотой или щелочью.

6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что после стадии экстракции продукт выделяют с помощью способа, выбранного из гидрофобной хроматографии, хроматографии с обращенной фазой или нормальной фазой.

7. Способ по любому из пп. 4-6, в котором используют глицеролипид и/или глицерогликолипид, происходящий из чая, грибов, водорослей или зерновых остатков.

8. Пищевой продукт, в котором содержится или к которому добавлен и/или разбавлен агент, индуцирующий апоптоз, заявленный в любом из пп. 1-3 и представляющий собой глицеролипид и/или глицерогликолипид, свободный в молекулярной структуре от фосфатного эфира и фосфонатного эфира.

9. Пищевой продукт по п.8, представляющий собой напиток.

10. Пищевой продукт по п.8 или 9, в котором вышеупомянутый глицеролипид и/или глицерогликолипид происходит из природных источников, например растений, микроорганизмов или животных.

11. Пищевой продукт по любому из пп.810, в котором вышеназванный глицеролипид и/или глицерогликолипид происходит из чая, грибов, водорослей или зерновых остатков.