DK150075B - Bleomycinsyre til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af bleomycinsyrens tilsvarende amidderivater med antitumorvirkning samt fremgangsmaade til fremstilling af bleomycinsyren - Google Patents

Description

150075

Den foreliggende opfindelse angår bleomycinsyre til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af bleomycinsyrens tilsvarende amidderivater med antitumorvirkning.

Bleomycin, der er et antitumor-antibiotikum, er et vandopløseligt basisk glycopeptid, der indeholder chelat af divalent kobber, og som frembringes af Streptomyces verticillus. Bleomycinet blev opdaget af Umezawa med flere i 1966, og det er omtalt i Journal of Antibiotics, 19A, side 200, 1966.

16 Typer bleomyciner, herunder 3-dimethylsulfopropylamino-bleomycin (bleomycin A2) og 4-guanidinobytylamino-bleomycii (bleomycin Bg), er blevet fremstillet og isoleret ved hjælp af den almindeligt 150075 2 benyttede dyrkning, der er omtalt i Journal of Antibiotics 19A, side 210, 1966. Blandt de forskellige typer af bleomycin har bleomycin A^, Ag, Ag og Bg været anvendt til behandling af canceroidt, ondartet lymfom og cerebral tumor i form af kompleksforbindelser af bleomyci-nerne.

Ved hydrolyse af bleomycinerne er det hvad angår den kemiske sammensætning af disse blevet bemærket, at de forskellige bleomyciner har samme grundliggende kerne men en forskellig amingrup-pe R, som terminalt er amidbundet i en sidekæde af bleomycinmolekylet.

Bleomycinernes mikrobielle aktivitet, antitumoraktivitet og anden fysiologisk aktivitet er helt forskellig afhængig af typen af aminen R i amidsidekæden.

Når en bleomycinfrembringende actinomycetstamme podes og dyrkes i et næringsmedium, kan bleomycinerne frembringes som en kompleks blanding af bleomycin A^, Ag, Ag, Bg osv.

Når en amin, der svarer til aminen i amidsidekæden i den ønskede type bleomycin, tilsættes som precursor ved denne dyrkning, kan dette bleomycin eventuelt frembringes.

Alt efter biosyntesen er den type amin, der er bundet til den grundliggende kerne i bleomycinet, imidlertid begrænset af strukturen, hvorved det er begrænset, hvilken bleomycintype, der kan opnås.

Hvis den i amidderivatet indgående syre imidlertid forelå som sådan,ville det være muligt at omsætte denne kemisk med udvalgte aminer og derved fremstille hidtil ukendte, syntetiske bleomyciner eller kendte bleomyciner i bedre udbytte ,end det har været muligt at opnå ved den hidtil kendte biosyntese af disse. Som resultat heraf ville der kunne forventes betydelige fremskridt inden for den medicinske anvendelse af bleomyciner, dels som følge af, at hidtil vanskeligt fremstillige bleomyciner ville være til rådighed i større mængde og eventuelt til lavere pris, dels som følge af fremstilling af hidtil ukendte bleomyciner med større antitumorvirkning og/eller mindre (færre) bivirkninger eller med virkning på et bredere spektrum af cancertyper.

Det har nu vist sig muligt at fremstille den i de forskellige bleomyciner indgående syre og opfindelsen angår derfor bleomycinsyre til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af bleomycinsyrens tilsvarende amidderivater med antitumorvirkning, hvilken bleomycinsyre er ejendommelige ved det i krav 1's kendetegnende del anførte.

3 150075

Den hidtil ukendte bleomycinsyre har følgende strukturformel: S 'f2 A. Al H2c )n-ch^ xc 2 Y 2 S o A ϋ

NN CH~ w Q «_/'"OH

ho ch^ A JL iTTT

*®2 T f 0 yf Yso/>HH S— 0H3 I^SrOH-OHj0 ·

OHS ή - Η*^*Ό S y'CHgOH

HirVH

Ved partiel hydrolyse af bleomycin sy ren fremkommer nedenstående bestanddele, hvor R er en OH-gruppe:

NH^-JS—CO - NH - CH - CO - NH - CH'- CH - CH - COOH

MjI n I III

CH - OH CH3 OH CH3

CH - NH - CHp N

i i2 r%

CHp NHp- CH LLneT COOH COOH

ch3 Η0'ίΗ s#0" NH2- CH - CO - NH - CHp- CHp- Mg/

~‘°BT

™ Wcr^TcHpOH

] OCONHp 4 150076

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af bleomycinsyren, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at bleomycin hydrolyseres i nærværelse af en stamme af Fusarium-slægten eller Helminthosporium-slægten eller et enzym eller enzymsystem udvundet heraf.

Bleomycinsyren lader sig derimod ikke fremstille ud fra bleomycin under anvendelse af kommercielle eller tilgængelige hydrofyseenzymer såsom peptidase, protease, pepsin, a-chymotrypsin, pronase, fytin og aminosyreacylase, idet amidsidekæden ikke herved lader sig spalte i bleomycinsyre og amin (R).

Stairmen, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er en art af Fungi Imperfecti, der hører til Fusarium-slægten såsom Fusarium roseum Link emend Snyder et Hansen IFO 7189 (ATCC 2o352) (W.C. Snyder, H.N.Hansen, American J. Bot, bind 32, side 657, 666 (1945))3 der alle er tilgængelige, Fusarium roseum Link emend Snyder et Hansen IFO 85o2 (ATCC 2o355) (samme litteraturhenvisning), Fusarium anguioides Sherbakoff IFO 4467 (ATCC 2o351) (H.W. Wollenwe-ber, Die Fusarien side 61, Berlin 1965)osv., og Helminthosporium-slægten såsom Helminthosporium zonatum Ikata et Yoshida IFO 6678 (ATCC 2o353) (Ikata Yoshida BYOGAIchuzasshi, (japan) bind 3o, nr 7, side 2o9, 1943) eller Helminthosporium zonatum Ikata et Yoshida IFO 7521 (ATCC 2o354) (samme litteraturhenvisning).

Denne stamme kan dyrkes aerobt i et medium for skimmelsvampe. Produktionen af enzymet påvirkes ikke synderligt af carbon-kilden eller nitrogenkilden.

For eksempel forøges udbyttet af mycelium og udbyttet af enzym, når stammen dyrkes i et medium med et stort indhold af glucose som carbonkilde og pepton eller maj s støbevæske som nitrogenkilde.

Det er muligt at anvende myceliet eller myceliumdyrkningsmediet til hydrolyse af bleomycinet til opnåelse af bleomycinsyren. Når der anvendes et renset enzym med stor aktivitet kaii dannelsen af urenheder imidlertid formindskes, og substratkoncentratet kan forøges, og reaktionstiden forkortes.

Dyrkningstiden for stammen er fortrinsvis 48-72 timer, og den optimale temperatur er 25~3o°C ved aerob dyrkning under omrøring og lufttilførsel, og det optimale pH er 6,0-7,0.

Ved hydrolysen af bleomycin opslemmes eller opløses ovennævnte mycelium eller enzym i en stødpudeopløsning af kaliumphos- 5 150075 phat.og blandes med en opløsning af bleomycin i en stødpudeopløsning af kaliumphosphat, og blandingen bringes til at reagere i 2-lo timer. De optimale forhold for hydrolyse af bleomycin er ved 25_45°C i o,o5M kaliumphosphatstødpudeopløsning ved en koncentration på 0,1-0,5% af substratet og et pH på 7,0-8,0.

Slutpunktet for hydrolysereaktionen kan undersøges ved reduktion af antimikrobiel aktivitet af substratet af bleomycin målt ved hjælp af ”cup test” under anvendelse af Mycobacterium 6o7 eller ved hjælp af ændring i R^-værdi ved tyndlagskromatografi.

Efter reaktionen fjernes urenheder/ og produktet adsor-beres på en svag sur ionbytterharpiks såsom Amberlite IRC-50H (handelsnavn for firmaet Rohm & Haas Co.), og det vaskes derefter med vand og elueres med fortyndet saltsyre, neutraliseres og deminerali-seres.

Demineraliseringsbehandlingen kan gennemføres ved at adsorbere produktet på aktivt carbon (aktivt carbon til kromatografi) og vaske med vand og derefter eluere med 5ol aeetone-o,o2N-saltsyre.

Demineraliseringsbehandlingen kan også gennemføres ved at adsorbere produktet på en ionbytterharpiks (Amberlite CG-50H, handelsnavn for Rohm & Haas Co.) og vaske det med o.,2# eddikesyre eller vand og derefter eluere med en blanding af 5o% methanol/o,o2N HC1.

Det demineraliserede afløb koncentreres, tørres og opløses i o,o5N ammoniumchlorid, og produktet overføres til CM-Sephadex C-25 (handelsnavn for et tørt uopløseligt pulver bestående af mikroskopiske kugler, der består af syntetiske, organiske forbindelser, der er afledt fra polysaccharidet dextran, og som fremstilles og markedsføres af firmaet Pharmacia Pine Chemicals, Inc.) pufret med o,o5M ammoniumchlorid,og o,o5M ammoniumchlorid bringes til at strømme ned herigennem, hvorved kun bleomycinsyren fjernes. Produktet opsamles og demineraliseres ved hjælp af ovennævnte demineraliseringsmetode.Opløsningen koncentreres og tørres ved 4o°C ved formindsket tryk til opnåelse af stort udbytte af rent pulverformigt hydrochlorid af bleomy-cinsyren.

Til identifikation af bleomycinsyren blev følgende forsøg gennemført.

Den opnåede bleomycinsyre blev hydrolyseret ved lo5°C i 24 timer i 6N HC1, og det hydrolyserede produkt blev undersøgt ved hjælp af højspændingspapirelektroforesemetoden og papirkromatografi-metoden.

6 150075

Ved ninhydrinreaktionsprøven på papirkromatogrammet af det syrehydrolyserede produkt af bleomycinsyren konstateredes de ninhydrinpositive bestanddele i samme mønster som for det oprindelige bleomycin B2 med undtagelse af pletten svarende til aminsidekæden. De hydrolyserede produkter består af 2,-(2-aminoethyl)-2,4,-bithiazol-4-carboxylsyre, L-threonin, 4-amino-3-hydroxy-2-methyl-n-valerianesyre, β-hydroxy-histidin og 3-amino-3(4-amino-6-carboxy-5-methylpyrimidin-2-yl)-propionsyre, L-3-aminoalanin, L-gulose og 3-0-earbamoyl-D-manno-se.

Når den resulterende bleomycinsyre blev behandlet med den stærkt sure ionbyttérharpiks (Amberlyst 15, handelsnavn) som katalysator for methanolyse, og produktet derefter blev trimethylsilyleret og undersøgt ved hjælp af gaskromatogråfimetoden, blev det konstateret, at produktet indeholder 1 mol af hver af bestanddelene L-gulose og 3“0-carbamoyl-D-mannose.

Når den resulterende bleomycinsyre blev esterificeret i methanol i nærværelse af saltsyre scan katalysator og derefter reduceret med LiBHjj i vandfri tetrahydrofuran og påfølgende yderligere hydrolyseret i nærværelse af syre, blev den alkohol fundet, der dannes ved at reducere carboxylgruppen i 2,-(2-aminoethyl)-2,4,-bithiazol-4-carboxyl-syre af den endestillede aminosyre i bleomycinsyre.

Den vandige opløsning af resulterende bleomycinsyre (95 mg/2,4ml) blev blandet med 5 ækvivalenter af l-ethyl-3~(3~dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid og lo ækvivalenter agmatinsulfat ved afkøling under is, og blandingen blev indstillet ved pH 7,o og bragt til at reagere ved 5°C natten over. Reaktionsproduktet blev tilført en kolonne pakket med CM-Sephadex C-25 og elueret med o,63_o65M ammonium-chloridopløsning til opnåelse af 8 mg bleomycin med en antibikrobiel aktivitet på 3ol5 U/mg overfor Itycobacterium 6o7·

Efter den kromatografiske adfærd og resultatet af analysen af det surt hydrolyserede produkt, blev det bekræftet, at det resulterende bleomycin er det samme som bleomycin B2> Den antimikrobi-elle aktivitet af bleomycin B2 var 3o95 U/mg. Ved disse resultater blev det bekræftet, at det resulterende produkt er det søgte bleomycins yreprodukt .

Hydrochloridkobberkonplekset af bleanycinsyren er opløselig, i vand, tungtopløselig i methanol, eddikesyre og dimethylsulfoxid og uopløselig i ethanol,ethylacetat, acetone og ether.

De fysisk-kemiske egenskaber af forbindelsen er følgende: 15 0-076 7 smeltepunkt 228-23o°C (dekomponerlng) W 436 = '8l>5° (c=°3l. h2°)

Grundstofanalyse: C: 4o.8o52, H: 5.29$, N: 16.4552, D: 24.7852, S: 4,53$, Cl: 3-37$, Cu: 4.78

Det ultraviolette absorptionsspektrum for hydroehloridet af bleomycinsyre er lidt forskellig fra spektret af udgangsmaterialet af bleomycin og er vist på tegningens fig. 1, hvor den maksimale absorption ligger ved 246my og 292 my Og E^ffi er 140,0 henholdsvis 137,5.

Det infrarøde absorptionsspektrum for produktet bestemt som kaliumbromidtablet er vist på tegningens fig. 2, hvor båndene findes ved 335o, 172o, 1670, l64o, 1580, l46o, 1365, I050, 77° (cm-1).

Bleomycinsyren gav positiv reaktion ved Pauly-og Ehrlichrøe&ktionerne og negativ reaktion ved ninhydrinreaktionen,

Sakaguchi-reaktion, Drangendorf-reaktion, Tollens-reaktion, ferrichlo-rid-reaktion, Fehling- og Molisch-reaktionerne.

Bleomycinsyren udviste en R^-værdi på 0,78 ved tyndlagskromatografi under anvendelse af silicagel G og udvikling med et system bestående af 10:9=1 af methanol: lo$ ammoniumacetat: lo$ ammoniak og udviste endvidere en R^-værdi på 0,46 ved tyndlagskromatografi og udvikling med et system af 15:lo:3:12 af n-propanol:pyridin: eddikesyre:vand.

Bleomycinsyren udviste en Rf-værdi på 0,86 ved papirkromatografi under anvendelse af Toyo filterpapir nr. 51 og fremkaldelse med lo$ ammoniumchlorid og udviste endvidere en R^værdi på 0,65 ved papir-elektroforese ved 3000V i 4o minutter, idet der ånvendtes et udviklingssystem bestående af 25:75:900 af myresyre: eddikesyre: vand (Rm for alanin er 1,0).

Ved "cup test" under anvendelse af Mycobacterium 607 var den .antimikrobielle aktivitet af produktet forholdsvis lille og var 159 U/mg sammenlignet med en standard af bleomycin A^ på looo U/mg.

Forskellige hidtil ukendte bleomycinforbindelser kan imidlertid fremstilles under anvendelse af den resulterende bleomycinsyre. F.eks. kan bleomycinsyren bringes til at reagere med ønskede aminer til opnåelse af forskellige typer af hidtil ukendte bleomycinforbindelser med de tilsvarende aminer i sidekæden. Disse hidtil ukendte bleomyciner kan have udmærket antimikrobielaktivitet overfor Mycobacterium 6o7. Bleomycinsyren kan f.eks. bringes til at reagere med benzylamin til opnåelse af benzylamino-bleomycin.

150075

S

Forsøgsresultaterne for biologisk aktivitet af benzyl-amino-bleomycinet (den endestillede aminogruppe R er en benzylamino-gruppe) er anført i det følgende i sammenligning med ovennævnte bleomycin Β2·

Fremstilling af benzylamino-bleomycin.

48.64 mg (0.038 mmol) bleomycinsyre og 45.31 mg (0.38 mmol) benzylamin blev opløst i 1 liter vand, og opløsningen blev nedkølet til 0 til-5°C og blandet med 28.4o mg (o,19 mmol) vandopløseligt carbodiimid. Opløsningen blev indstillet til pH 4,5 med 6N HC1 og bragt til at reagere i 30 minutter under omrøring.

Efter reaktionen blev reaktionsblandingen opbevaret ved o-5°C i 24 timer. Det resulterende benzylamino-bleomycin blev fraskilt og renset for bleornycinsyren i overensstemmelse j.med fremstillingen af bleomycin B2 til opnåelse af 15.2 mg benzylamino-bleomycin med en mikrobiel aktivitet på 3250 mcg/ml overfor Mycobacterium 607. Ifølge de kromatografiske resultater og analysen af syrehydro- lyseprodukterne blev det bekræftet, at produktet var benzylamino-r bleomycin.

Forsøg.

_ Ovennævnte benzylamino-bleomycin eller bleomycin . blev indgivet i ICR-JCL hanmus ved intravenøs injektion på lo mg/kg rihver dag i 10 dage, og musene blev holdt i live i 5 uger efter den afsluttende indgivelse og derpå aflivet og dissekeret til.-opnåelse af snitstykker fra både højre og venstre lunge, som blev underkastet mikroskopisk undersøgelse.

Graden af fibrose for lungestykket er vist i nedenstående tabel 1.

9 150075

Tabel 1

Lunge ............Mus..................

- _. ........ 1 2 3 4 5 6 T 8 _____

Bleomycin B^ venstre + /+ /# / - /

" ' højre - / + / ± / ± T

Benzylamino- venstre / - ~ / + ~ •bleomycin type J _ / / /__—

” højre j - i - I - I

Lunge Mus 9 lo 11 12 - 13 14 15 16

Bleomycin Bg venstre ± it' højne ± " · +

Benzylamino - venstre bleomycintype " højre ± ± “ 10 150075

Lunge Mus Total . . ..... '.'ν' ' 17 18 . 19 2α -..+. +..4+.

Bleomycin venstre + - 5 1 3 1 højre - + 4330

Benzylamino - venstre + 8 1 1 0 bleomyeintype ... ...

højre + 83ΟΟ

Toksiciteten af benzylamino-bleomycinet var mindre end for bleomycin Β2·

Forsøg 2.

Benzylamino-bleomycinet og bleomycin B2 udviste følgende hæmningsvirkninger overfor cellekultur af HeLa (S3bb cellelinie)

Koncentrationer Hæmningsvirkning 6 3 1,5 (mcg/ml)

Bleomycin B2 92 64 33

Benzylamino- bleomycin 92 73 38 t? — c hvor hæmnings virkningen = -o-ro- χ ioo, C, - 3 o

Cq: relativt antal af celler den første dag, ty relativt antal af celler den tredie dag efter tilsætning af et bleomycin (3 mcg/ml til slut),

Cy relativt antal celler i negativ kontrolprøve den tredie dag.

11 150075

Benzylamino-bleomycinet og bleomycin B2 blev afprøvet på Yoshida-cellekultur (ved den metode, der er omtalt af M. Hori m.fl. i Journal of Antibiotics Ser. A, bind 16 nr. 1, side 1),

Resultaterne var følgende: Hæmningsvirkning koncentrationer 5 2,5 Ir25 0,625 (mcg/ml)

Bleomycin B2 72,^9 . 56f0 34,0 8,6

Benzylamino- bleomycin 83,5 55/^ 28,2 11,1

Disse resultater viser benzylaminobleomycinets effektivitet overfor tumores.

Opfindelsen vil i det følgende blive omtalt nærmere i forbindelse med visse specielle eksempler.

Eksempel 1

Et medium bestående af 5# glucose, o,4¾ pepton# 0,05# majsstøbevæske, o„o3% njagnesiumsulfat, o,l# kaliumhydrogenphos-phat, o,ol# natriumchlorid, o,ol$ calciumchlorid og o,ool# ferri-chlorid blev indstillet til pH 6,0, og lo ml af dette medium blev fyldt i en loo ml Sakaguchi-kolbe og steriliseret ved 12o°C ved 1 atmosfære i 15 minutter.

Mediet blev podet med et platinøje Fusarium roseum Link emend Snyder et Hansen (IFO 7189) (ATCC 2o352). deponeret i Institute of Fermentation, Osaka, Japan, dyrket på skråsubstrat, og mediet rystedyrkedes ved 27°C i 72 timer.

På den anden side blev loo ml af mediet med samme sammensætning fyldt i 500 ml Sakaguchi-kolbe og speriliseret ved samme betingelser, o,2 ml af det resulterende sporemedium blev sat til mediet, og dette rystedyrkedes.

De dyrkede medier opsamledes 3 dage efter dyrkningens start og filtreredes til opnåelse af 15 g/lit.er myceliummasse, loo g Af myceliummassen blev opslemmet i 2oo ml o,o2M kaliumphosphatstødpudeopløsning med pH 7so,og myceliummassen blev delt ved hjælp af "French press" ved lav temperatur og derefter adskilt ved almindelig fryse-eentrifugaladskillelse ved 19000G.

η 12 150075

Den resulterende overliggende væske blev blandet med fast ammoniumsulfat til opnåelse af en 75# mættet opløsning, og 2,3 g af det udfældede enzym blev opløst i kaliumphosphatstødpudeopløsningen med pH 7 og derefter renset ved dialyse med samme stødpude opløsning til opnåelse af enzymopløsningen.

5 g bleomycin B^ blev opløst i o,o5M kaliumphosphat-stødpudeopløsning og blandet med enzymopløsningen til en samlet mængde opløsning på 5oo ml. Blandingen blev bragt til at reagere ved 35°C i 2 timer og blev overført til en kolonne med en diameter på 2 cm og en længde på 5o cm pakket med en ionbytter i form af Amberlite IRC-50H (handelsnavn) til adsorption af produktet. Efter vask med vand blev produktet elueret med o,2N-HCl, og produktstrømmen blev neutraliseret og derefter indført i en kolonne med en diameter på 2 cm og en længde på 2o cm, der var pakket med aktivt kromatografi- · carbon til adsorption af produktet.

Efter vask med vand blev produktet elueret med en blanding af 5o# acetone/o,o2N HC1, og produktstrømmen blev koncentreret og tørret ved 4o°C under formindsket tryk. Resten blev opløst i en ringe mængde o,o5M ammoniumchlorid og adsorberet på CM-Sephadex C-25 (handelsnavn), der var pufret med o,o5M ammoniumchlorid. o,o5M Ammoniumchlorid blev ført gennem laget til fraskillelse af bleomycin-syre. Bleomycinsyreopløsningen blev opsamlet og demineraliseret og koncentreret samt tørret ved 4o°C ved formindsket tryk til opnåelse af 9oo mg pulverformigt hydrochlorid af bleomycin syr en med et smeltepunkt på 228-23o°C (dekomponering).

Eksempel 2

Helminthosporium zonatum Ikata et Yoshida (IFO 7521) (ATCC 2o354), der er deponeret i Institute of Fermentation, Osaka,

Japan, blev dyrket ifølge fremgangsmåden ifølge eksempel 1 til opnåelse af en myceliummasse.

2oo g Af myceliummassen og lo g bleomycin B^ blev blandet med 25o ml ΙΜ-kaliumphosphatstødpudeopløsning med et pH på 7,5,og lo ml toluen og vand blev tilsat blandingen til opnåelse af en samlet mængde opløsning på 500 ml. Blandingen blev omrørt og henstod derefter ved 37°C i 12 timer. Reaktionsopløsningen blev filtreret under reduceret tryk-og vasket med vand, og filtratet blev overført til en kolonne med en diameter på 2,6 cm og en længde på 7o cm pakket med en ionbytterharpiks i form af Amberlite IRC-50H (handelsnavn) til adsorption af produktet.

13 150075

Efter vask med vand blev produktet elueret med o,2N HC1, og produktstrømmen blev Indstillet på pH 7 og blev overført til en kolonne med en diameter på 2,6 cm og en længde på 7. o cm pakket med én ionbytterharpiks i form af Amberlite CG5oH (handelsnavn) til adsorption af produktet. Efter vask med o,2% eddikesyre, blev produktet elueret med en blanding af methanol/o,o2N HC1. Produktstrømmen blev koncentreret og tørret ved 4o°C ved formindsket tryk. Resten blev opløst i o,o5M ammoniumchlorid og adsorberet på CM-Sephadex C-25 (handelsnavn).

o,o5M Ammoniumchlorid blev ført gennem laget til opsamling af bleomycinsyreopløsning. Opløsningen blev koncentreret og tørret ved formindsket tryk til opnåelse af 3,5 g pulverformigt hydro-chlorid af bleanycinsyren med et smeltepunkt på 228-23o°C (dekompone-ring)·

Eksempel 3

Fusarium anguioides Sherbakoff (IFO 4467) (ATCC 20351) deponeret i Institute for Fermentation, Osaka, Japan, blev dyrket i overensstemmelse med den fremgangsmåde, der er omtalt i eksempel 1 til opnåelse af lo g myceliummasse pr. 1 liter dyrket medium.

loo g Af myceliummassen og 5 g bleomycinkompleks blev opløst i 2,5 liter o,o5M kaliumphosphatstødpudeopløsning og blandet med 5 ml toluen og omrørt tilstrækkeligt, hvorefter blandingen fik lov til at henstå ved 4o°C i 12 timer. De uopløselige stoffer blev fjernet fra reaktionsopløsningen til opnåelse af et klart filtrat.

Filtratet blev renset ifølge fremgangsmåden ifølge eksempel 2 til opnåelse af 1,1 g pulverformigt hydrochlorid af bleomy-cdnsyren et smeltepunkt på 228-23o°C (dekomponering).