DK141172B - Fremgangsmåde til fremstilling af virusproteiner af influenzavirus. - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af virusproteiner af influenzavirus. Download PDFInfo
- Publication number
- DK141172B DK141172B DK85775AA DK85775A DK141172B DK 141172 B DK141172 B DK 141172B DK 85775A A DK85775A A DK 85775AA DK 85775 A DK85775 A DK 85775A DK 141172 B DK141172 B DK 141172B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- neuraminidase
- hemagglutinin
- virus
- influenza virus
- suspension
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 12
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title description 11
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 title 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 33
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 33
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 27
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 27
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 27
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 27
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 21
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 11
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 241000187438 Streptomyces fradiae Species 0.000 description 5
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 5
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 5
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 4
- BCMWYYCCTCFRMH-UHFFFAOYSA-M sodium;4-dodecoxy-4-oxobutanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOC(=O)CCC([O-])=O BCMWYYCCTCFRMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 2
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-hydroxy-3-[(4-nitrophenyl)diazenyl]-6-phenyldiazenylnaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=C(N=NC=3C=CC=CC=3)C(O)=C2C(N)=C1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101000613243 Gadus morhua Trypsin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241001500350 Influenzavirus B Species 0.000 description 1
- 102000001621 Mucoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010093825 Mucoproteins Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N barbitone sodium Natural products CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- -1 nicotinyl dodecyl Chemical group 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N sodium;hydrochloride Chemical compound [Na].Cl OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 141172 DANMARK ο») mta»o 12 y/ο* * $1 X 39/1*5 « (21) Ansøgning nr. 857/75 (22) Indleveret den mar. 1975 (23) Lebedag 4. mar. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og ftemlæggelsesskriftet offentliggjort den 28. Jan. 1 980
DIREKTORATET FOR
PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (W) Morttet begæret fra fen
5. mar. 197^ 7^)7352, FR
(71) SCIENCE UNION ET CIE SOCIETE FRANCAISE DE RECHERCHE MEDICARE, 14,
Hue du Val-d’Or, F-92150 Suresnes, ER.
(72) Opfinder: Robert Fontanges, 108 Bd. Pinel, F-69272 Lyon, FR.
(74) Fuldmssgtig under sagens behandling:
Patentbureauet Wibert & Stocklund ApS.
(54) Fremgangsmåde til fremstilling af virusproteiner af influenzavirus.
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af virusproteiner af influenzavirus under indvirkning af et proteolytisk enzym, og fremgangs-, måden er ejendommelig ved det i krav l*e kendetegnende del angivne.
Det er kendt, at hylsteret omkring Myxovirus Influenzae Indeholder i det mindste to specifikke glycoproteiner, som kan isoleres enten ved indvirkning af detergenter eller ved indvirkning af protease eller ved en'·kombineret indvirkning af begge dele.
En publikation af Skehel (Nature - New Biology 258 (1972) 145) har vist, at behandling med proteaeen bromelain, selv om den sikrer adskillelse af disse to bestanddele i virushylsteret, bevirker en fuldstendig nedbrydning af viral neuraminidase. Det andet glycoprotein, hemagglutinin, der fremkommer under disse betingelser, denatureres delvis, skønt det forekommer i krystallinsk form, og mister således sine hæmagglutininegenskaber men ikke de antigeniske^ Det har vist sig meget værdifuldt at kunne isolere og fremstille disse 141172 2 to rensede glycoproteinfraktioner, da de udgør et værdifuldt antigenmateriale, som muliggør vaccinering mod influenza enten ved indgivelse af hæmagglutinin eller viral neuraminidase alene eller ved at kombinere disse to glycoprote-iner til fremstilling af en vaccine med bredere antigene egenskaber.
Det er også værdifuldt at kunne fremstille en neuraminidase ud fra influenzavirus i tilstrækkelig ren og aktiv form, idet neuraminidase er den mest stabile genetiske fraktion af influenzavirus. Endvidere har anti-neura-minidase-virus-antistoffer, der er dannet under disse betingelser, uden muligheden for inaktivering af influenzavirus, ikke desto mindre den egenskab, at de reducerer alvoren eller strengheden af influenza eller reducerer formeringen af virus. (KUbourne, Journal of Virology £ (1968) 281 og 77S)·
Era dansk patentansøgning nr. 14/75 kendes en fremgangsmåde til isolering af hæmagglutinin- og neuraminidasebestanddele fra et influenzavirus under anvendelse af et kationisk detergent. Herved opnås en fremstilling af en blanding af disse to proteiner, som er ansvarlige for viruspartiklets immuno-genicitet, men denne fremgangsmåde muliggør ikke fremstillingen og isoleringen af hvert protein for sig, den muliggør kun fremstillingen af en opløsning af denne blanding, og der anføres intet om renheden af proteinerne. Endvidere er denne opløsning forurenet med et overskud af kationisk detergent, hvorfor et yderligere trin er nødvendigt til nedsættelse af denne overskydende mængde til en værdi, der er lavere end 0,01 $ ved dialyse eller kromatografi på silikagel.
Det er imidlertid meget betydningsfuldt at kunne udvinde hæmagglutinin og neuraminidase i ren tilstand, navnlig hæmagglutinin, fordi dette glycoprotein meget let nedbrydes og hurtigt mister sin immunogenieitet. Hvert glycoprotein er karakteristisk for hver specifik influenzavirusstamme, og dette er hovedårsagen til, at de fleste proteolytiske enzymer ikke kan anvendes.
Man udvinder neuraminidase og hæmagglutinin fra de ydre fremspring på overfladen af virusmembranen, men de herved fremstillede glycoproteiner er så denaturerede, at de har mistet den største del af deres antigeniske aktivitet.
At udvinde de to virusunderenheder fra Myxovirus influenzae i deres aktive form er meget vanskeligt. Oftest ødelægger den anvendte behandling den ene eller den anden af aktiviteterne. De spændingsaktive midler "Tween 20" og "Triton x 100" begge indeholdende natriumdodecylsuccinat reducerer eller skjuler hæmagglutininaktiviteten, medens de bevarer neuraminidaseaktiviteten, medens resultaterne er modsatte ved et andet spændingsaktivt middel nicotinyldodecyl-nitrat. Ifølge Seto og medarbejdere, Med. Microbiol. Immunol. 159 (1973) nedbryder natriumdodecylsuccinat virkningen af hæmagglutinin og af neuraminidase, medens Hinuma Og medarbejdere, Tirology 50 (1972) 640 angiver, at natrium-deoxycholat muliggør, at de to stoffer bliver frigivet i en biologisk aktiv form.
5 141172
Proteaseindvirkningen gør ligeledes de fremkommende resultater variable. Hæmagglutinin udviser en intens sensibilitet ved tilstedeværelse af pronase, men ved tilstedeværelse af trypsin ændres resultaterne afhængigt af de anvendte stammer. Lignende resultater er opnået med hensyn til neuraminidase.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen muligger isoleringen af hvert protein under opnåelse af et højt udbytte og en renhedsgrad på ca 100
Viruskultureme kan f.eks. være influenzavirus af Hong-Kong-virus Δ^/βθ stammen, MWS-stammen af virus Aq, mutanten af stammen El/5+ af virus og stammen A^-XL af virus Ag, men fremgangsmåden kan også anvendes på andre influenzavirua-Btammer, f.eks. det menneskelige Ag virus/Singapore/l/ 57* virus Ag/England/52/64, virus Ag/England/76/66 eller det kombinerede x-7(f-i).
Går man frem som angivet i krav 2, opnår man de bedste udbytter og den mest hensigtsmæssige måde at gennemføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen på, idet bl.a. en indvirkning af enzymet, der varer længere tid end her anført,, kan føre til destruktion af hæmagglutinin.
Forlænges enzympåvirkningen på viruskultureme, fremkommer der en ned-, brydning af hæmagglutinin, og man får en glycoproteinfraktion bestående i det væsentlige af neuraminidase.
De efterfølgende eksempler belyser fremgangsmåden ifølge opfindelsen nærmere.
EkBemnel 1.
200 hønseæg, der er befrugtede 11 dage tidligere, podes med 0,2 ml af en virussuBpension af A2/Hong-Kong/68 (H^Ig) influenzavirus pr. æg suspenderet ,i en stødpude-saltopløsning eller bedre i en fermenteringsopløsning med navnet trypticase Soja. Influenzavirus*eis koncentration var 1/1000.
Efter 48 timers inkubation opsamles 900 til 1500 ml allantoievæske indeholdende 2050 hæmagglutinin- og 1J0 neuraminidaseenheder pr. ml.
ETeuraminidaseaktivitsten blev bestemt ved den fremgangsmåde, der er angivet af Warren og medarbejdere (j. Mol. Chem. 2^4 (1959) 1971)·
Cellerester og mucoproteiner skillee derefter fra ved centrifugering ved 5000 g i 1/2 time. Den supematante væske centrifugeres yderligere ved IO5.OOO g i 2 timer, medens den indre temperatur af væsken holdes ved ca 4°0.
De fremstillede sedimenter tages op, blandes og suspenderes derefter i en isotonisk saltopløsning.
Den således fremstillede suspension underkastes derefter enten påvirkning af ultralyd (12 kilohertz) i 3 min. eller behandles i en homogenis&tor af vibratortypen. Herved fås en suspension, sete indeholder 12000 hæmagglutinin-enheder og 190 neuraminidaseenheder pr. ml.
Til 20 til 40 ml af denne suspension sættes en proteasesuspension af Streptomyces fradiae med en koncentration på 1 mg pr. ml virussuspension.
4 1A1172
Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer ved 37°G> hvorefter den koncentreres ved diafiltrering på en diaflo-diafiltreringscelle under anvendelse af en membran, der tilbageholder molekyler større end 10.000.
Fra diafiltreringscellen udvindes 9 ml af en koncentreret opløsning indeholdende 280 neuraminidaseenheder og 32.000 hæmagglutininenheder pr. ml.
Af disse 9 ml udtages der tre gange 2 til 2,5 ml» der anbringes i tre' diskontinuerligt anbragte massefyldegradientopløsninger af 28 ml natrium-glutamatopløsninger, hvis koncentrationer varierer fra 5 til 40 $· De 30 ml centrifugeres i 20 timer ved +10°C og med en hastighed på 60.000 g, og viruspartiklerne, neuraminidase og hæmagglutinin, skilles automatisk fra afhængigt af massefyldegradienten. Til bestemmelse af de fraskilte materialer anvendes en iscoanalysator, der automatisk udtager fraktioner på 1,2 ml af hver portion af det centrifugerede materiale og analyserer dem. Der udtages succes-,sivt 25 prøver, der analyseres. Da der er 3 diskontinuerlige massefyldegradienter fås der tre serier på hver 25 prøver ved undersøgelsens afslutning.
De tre serier af prøver analyseres ved hjælp af et automatisk spectrophotometer til bestemmelse af deres optiske absorption ved 280 inju.. Den optiske tæthed ved denne bølgelængde muliggør bestemmelsen af mængden af glycoprotein i hver prøve. Det er således muligt at tegne en almindelig profil af denne adskillelse, der viser tre forskellige absorptionstoppe ved 280 nyU,.
Resultaterne af centrifugeringen er vist i fig. I og II, hvor gradienten i fig. I er natriumglutamat og i fig. II natriumglutamat + 1 $ natrium- dodecylsulfat. HA betyder neuraminidase og HA betyder hæmagglutinin.
stop
Den første absorption/svarer til hæmagglutinin alene, den anden til neuraminidase alene og den tredie absorptionstop viser både hæmagglutinin og neuraminidase.
I begge de på tegningen viste tilfælde er adskillelsen af neuraminidase og hæmagglutinin næsten fuldstændig med undtagelse af en tredie top, der er dannet af en blanding af neuraminidase og hæmagglutinin. Ligemeget hvad teknik der anvendes, så bliver der tilsyneladende altid en ringe mængde af de to glycoproteiner, som forbliver uopløste.
Alle prøverne, der kun indeholder neuraminidase, samles og inddampes under nedsat tryk. De prøver, der indeholder hæmagglutinin behandles på lignende måde.
Έeuraminidaseaktiviteten udtrykt i enheder bestemmes ved måling af mængden af neuraminsyre, der frigives ved fremgangsmåden, der er beskrevet af Warren, J. Biol. Chem. 234 (1959) 1971 under anvendelse af serum fra unge heste som substrat ifølge en modifikation beskrevet af C. Bottex og medarbejdere C. R. Soc. Biol. (1975) 12, 1837-1842.
Hæmagglutininindholdet bestemmes under anvendelse af 0,05 ml af en suspension af kyllingeerythrocyter suspenderet i en 0,05 foxs saltopløsning.
141172 5
Blandingen henstår ved stuetemperatur i 1 time, hvorefter den optiske tæthed måles.
Fremstillingen af den anvendte enzymatiske blanding af Streptomyces ' fradiae er omhandlet i beskrivelsen til dansk patent nr. 132.666.
KLektroforese af en enzymblanding.
Elektroforesen udføres i agargel i en stødpudeopløsning af saltsur natriumveronal (pH = 8,2) på en glasplade. Enzymprøven anbringes 23 mm fra anoden. 10^1 af en vandig suspension af den enzymatiske blanding anvendes hver gang til elektroforeseanalysen. Efter 90 min ved en spænding på 3 volt/em fjernes pladen og farves.
Den proteolytiske virkning synliggøres ved at påføre pladerne en 2,5 opløsning af hæmoglobin. Efter henstand i 1 time ved 37°0 viser proteinerne sig ved farvning med en 0,5 opløsning af Amido Black. Den proteolytiske virkning af de forskellige komponenter i den enzymatiske blanding viser sig ved fremkomsten af 5 til 6 klare pletter på elektro-foresepladens homogene blå baggrund.
Eksempel 2.
Der gås frem let modificeret, som beskrevet i eksempel 1. Man poder under samme betingelser 200 hønseæg med en suspension af influenzavirus (A^Hong^Kong/éS/H^Sfg)· Efter to dages inkubation fås 1500 ml inficeret allantois-væske med et titer på 4000 hæmagglutinin-enheder pr. ml og 350 neuraminidase-enheder pr. ml bestemt ved frigørelse af 0,107 g sialsyre pr. ml, idet sialsyre er fællesbetegnelsen for N-acetyl-neuraminsyre, og bestemmelsen af indholdet af sialsyre er et mål for neuraminidaseaktivi-teten. Man udfører derefter en dobbelt centrifugering, og centrifugalaflejringen suspenderes i en phosphatstødpudeopløening. Man får 500 ml af den rensede virussuspension indeholdende 12.000 hæmagglutinin-enheder pr. ml og 520 neuraminidase-enheder pr. ml, bestemt ved frigørelse af 0,157 g sialsyre pr. ml.
141172 6
Man tager derefter små portioner på ca 5 ml virussuspension og sætter dertil 1 ml enzymopløsning af Streptomyces fradiae og underkaster dem påvirkning i to timer ved 37°C· Portionerne blev derefter forenede og koncentrerede ved diafiltrering til 60 ml. Disse 60 ml blev delt op i seks fraktioner på hver 10 ml og anbragt i 6 diskontinuerligt anbragte massefyldegradientopløsninger af natriumglutamat med koncentrationer fra 5 "til 40 ?&, hvortil der sættes 1 io natriumdodecylsuccinat.
Efter centrifugering ved 60.000 g i 30 timer ved 15°C, får man af seks portioner 144 ml af en suspension med et titer på 1600 hæmagglutininenheder pr. ml, dvs. ialt 228.000 enheder og 48 ml af en suspension indeholdende 3^0 neuraminidaseenhed er pr. ml, dvs. ialt 13.800 neuraminidaseenheder.
Suspensionerne blev derefter delt op på en'Sephadexi'® G 15 søjle til tilbageholdelse af urenheder, såsom natriumglutamat og natriumdodecylsuccinat.
De fremstillede fraktioner besidder på det nærmeste uændrede aktiviteter.
Af 1500 ml inficeret allantois-væske var det således muligt at fremstille renset hæmagglutinin og renset neuraminidase med et stort udbytte.
Analyse af de således fremstillede produkter ved elektroforese på en gel af polyacrylamid afslører ingen forurening af hæmagglutinin med neuraminidase og vice-versa. Det infrarøde spektrum. (EBr) af hvert stof viser karakteristiske bånd i nærheden af 3/4- og 9,5y^ reflekterende den glycoproteinske struktur hos begge stoffer. Det infrarøde spektrum for hæmagglutinin svarer til spektret for neuraminidase, men toppen ved 3>5/1 svarende til båndene for methylengrupper er meget mere fremtrædende end ved neuraminidase.
Endvidere er der et bånd ved 3>6z/, , der viser tilstedeværelsen af frie carboxylgrupper, idet neuraminidase er et glycoprotein, som indeholder 16 aminosyrer, hvoraf nogle har frie carboxylgrupper, men dette bånd ved 3>6/l-> der skyldes hydroxyradikalerne i carboxylgrupperne, må som det fremgår ved infrarød spektroskop! være bundet til andre funktioner, muligvis aminogrupper, idet hydroxygrupper sædvanligvis giver bånd ved 3/u-til 3>5/A"
Eksempel 3·
Proteolytiske enzymers aktivitet til frigørelse af MA og HA fra A^Hong Kong virus (MA = neuraminidase og HA = hæmagglutinin)
Resultaterne angiver mængderne af HA og MA, der er frigjorte i forhold til titer af udgangsvirus og for en optimal kontakttid mellem virus og protease, og symbolet X i anden kolonne i den efterfølgende tabel angiver, at den specifikke aktivitet i forbindelserne, der er skilt fra ved uLtracentrifugering, er 12 gange, 2 gange, 8 gange, 3 gange, 5 gange eller 10 gange større end i de originale kulturer.
7 141172
frigjort Så $ frigjort NA
bromelain X 12 .1 $
4°C
bromelain X 2 1 ^
37°C
trypsin X 8 5 $
37°C
alfa-chymotrypsin X 3 2 $
37°C
råenzymer fremstillede ud fra S. fradiae 37°C X 5 5 $ rensede enzymer fremstillede ud fra S. fradiae 37°C X 10 8 $
Af denne tabel fremgår det, at enzymerne fremstillede ud fra kulturer af Streptomyces fradiae muliggør opnåelsen af de højeste koncentrationer af neuraminidase og hæmagglutinin fra virus.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR7407352A FR2262962B1 (da) | 1974-03-05 | 1974-03-05 | |
| FR7407352 | 1974-03-05 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK85775A DK85775A (da) | 1975-11-03 |
| DK141172B true DK141172B (da) | 1980-01-28 |
| DK141172C DK141172C (da) | 1980-07-14 |
Family
ID=9135822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK85775AA DK141172B (da) | 1974-03-05 | 1975-03-04 | Fremgangsmåde til fremstilling af virusproteiner af influenzavirus. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4136168A (da) |
| JP (1) | JPS50160487A (da) |
| BE (1) | BE826275A (da) |
| CA (1) | CA1052306A (da) |
| CH (1) | CH595106A5 (da) |
| DE (1) | DE2508396A1 (da) |
| DK (1) | DK141172B (da) |
| ES (1) | ES435323A1 (da) |
| FR (1) | FR2262962B1 (da) |
| GB (1) | GB1469901A (da) |
| NL (1) | NL7502623A (da) |
| ZA (1) | ZA751357B (da) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI790483A (fi) * | 1978-02-16 | 1979-08-17 | Science Union & Cie | Foerfarande foer framstaellning av ett enzym av bakteriellt ursprung och farmaceutiska kompositioner innehaollande detsamma |
| CA1122527A (en) * | 1979-05-15 | 1982-04-27 | Karen K. Brown | Influenza vaccine production in liquid cell culture |
| US4365187A (en) * | 1980-05-15 | 1982-12-21 | Rotron Incorporated | Brushless D.C. motor |
| US4537769A (en) * | 1982-04-06 | 1985-08-27 | American Cyanamid Company | Stabilization of influenza virus vaccine |
| JPS59163313A (ja) * | 1983-03-09 | 1984-09-14 | Teijin Ltd | 経鼻投与用ペプチドホルモン類組成物 |
| US6398774B1 (en) | 1999-09-29 | 2002-06-04 | Heska Corporation | Intranasal delivery system |
| US7678087B2 (en) * | 1999-09-29 | 2010-03-16 | Heska Corporation | Equine intranasal delivery system |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4029763A (en) * | 1974-08-05 | 1977-06-14 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Influenza vaccine containing purified neuraminidase antigen and method of using the same |
-
1974
- 1974-03-05 FR FR7407352A patent/FR2262962B1/fr not_active Expired
-
1975
- 1975-02-26 US US05/553,293 patent/US4136168A/en not_active Expired - Lifetime
- 1975-02-26 DE DE19752508396 patent/DE2508396A1/de not_active Withdrawn
- 1975-03-03 GB GB874375A patent/GB1469901A/en not_active Expired
- 1975-03-04 JP JP50026445A patent/JPS50160487A/ja active Pending
- 1975-03-04 CA CA221,238A patent/CA1052306A/fr not_active Expired
- 1975-03-04 BE BE153990A patent/BE826275A/xx unknown
- 1975-03-04 DK DK85775AA patent/DK141172B/da unknown
- 1975-03-05 CH CH279375A patent/CH595106A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1975-03-05 NL NL7502623A patent/NL7502623A/xx not_active Application Discontinuation
- 1975-03-05 ES ES435323A patent/ES435323A1/es not_active Expired
- 1975-03-05 ZA ZA00751357A patent/ZA751357B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS50160487A (da) | 1975-12-25 |
| FR2262962B1 (da) | 1977-11-04 |
| DK141172C (da) | 1980-07-14 |
| US4136168A (en) | 1979-01-23 |
| CH595106A5 (da) | 1978-01-31 |
| ES435323A1 (es) | 1976-12-16 |
| CA1052306A (fr) | 1979-04-10 |
| AU7878175A (en) | 1976-09-09 |
| DK85775A (da) | 1975-11-03 |
| DE2508396A1 (de) | 1975-10-23 |
| NL7502623A (nl) | 1975-09-09 |
| BE826275A (fr) | 1975-09-04 |
| GB1469901A (en) | 1977-04-06 |
| FR2262962A1 (da) | 1975-10-03 |
| ZA751357B (en) | 1976-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101190932B1 (ko) | 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법 | |
| RU2496519C2 (ru) | Способ получения препарата, содержащего вирусные антигены, и применение препарата | |
| Brecher et al. | Cathepsin cleavage potentiates the Ebola virus glycoprotein to undergo a subsequent fusion-relevant conformational change | |
| Kendal | A comparison of “influenza C” with prototype myxoviruses: Receptor-destroying activity (neuraminidase) and structural polypeptides | |
| EP1725581B1 (en) | Novel assay for the separation and quantification of hemagglutinin antigens | |
| US8173021B2 (en) | Method for the preparation of sulfated cellulose membranes and sulfated cellulose membranes | |
| EP3395826B1 (en) | Methods of making and using influenza virus hemagglutinin complexes | |
| Buffin et al. | Influenza A and B virus-like particles produced in mammalian cells are highly immunogenic and induce functional antibodies | |
| Weigel et al. | A membrane-based purification process for cell culture-derived influenza A virus | |
| DK141172B (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af virusproteiner af influenzavirus. | |
| Bissinger et al. | Towards integrated production of an influenza A vaccine candidate with MDCK suspension cells | |
| US20220267738A1 (en) | Method For Purifying An Enveloped Virus | |
| He et al. | Downstream processing of Vero cell-derived human influenza A virus (H1N1) grown in serum-free medium | |
| Hawksworth et al. | Proteomics as a tool for live attenuated influenza vaccine characterisation | |
| Hamilton et al. | Acquisition of a novel eleven amino acid insertion directly N-terminal to a tetrabasic cleavage site confers intracellular cleavage of an H7N7 influenza virus hemagglutinin | |
| Li et al. | Protein organization in Newcastle disease virus as revealed by perturbant treatment | |
| US4195076A (en) | Process for the preparation of hemagglutinin from viral sources and methods of utilizing same | |
| Bosch et al. | Simple and rapid separation of ortho-and paramyxovirus glycoproteins | |
| Breuning et al. | A reassortant between influenza A viruses (H7N2) synthesizing an enzymatically inactive neuraminidase at 40° which is not incorporated into infectious particles | |
| Shirvan et al. | Preparation of neuraminidase-specific antiserum from the H9N2 subtype of avian influenza virus | |
| Liu et al. | Construction and comparison of different source neuraminidase candidate vaccine strains for human infection with Eurasian avian-like influenza H1N1 virus | |
| Barroso et al. | Inactivation of avian influenza viruses by hydrostatic pressure as a potential vaccine development approach | |
| Geno et al. | Rapid and efficient purification of ficolin-2 using a disposable CELLine bioreactor | |
| KR102546626B1 (ko) | 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험 | |
| Scheid | Activation of parainfluenza viruses through host-dependent cleavage of an envelope glycoprotein |