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Verfahren zur Diagnose der Tric:omonadeninfektion Zur Erkennung der
Infektion mit Trichomonaden, mikroskopisch kleiner einzelliger Tierchen, die beim
Menschen an Katarrhen der Geschlechtsorgane beteiligt sind, und die bei Rindern
eine die Zucht bedrohende Geschlechtsseuche mit großen wirtschaftlichen Schäden
verursachen, hat man sich bisher in erster Linie der mikroskopischen Untersuchung
bedient. Unter dem Mikroskop kann man die Trichomonaden in Ausscheidungen der infizierten
Organe, z. B. Scheidenschleim, Gebärmuttersekret usw., oder in einer Spülflüssigkeit
finden, mit welcher man zur Gewinnung von Untersuchungsmaterial erkrankte Organe,
z. B. Scheide der Frau, Vorhautsack des Bullen, ausgespült hat und die man zwecks
Untersuchung aufgefangen oder zurückgesaugt hat. Die mikroskopische Untersuchung
auf Trichomonaden ist jedoch nur so lange erfolgversprechend, als diese noch leben
und an ihrer Bewegung erkannt werden. Die mikroskopische Untersuchung selbst ganz
frischen Materials versagt aber sehr oft, wenn von Anfang an im Untersuchungsmaterial
nur sehr wenig Trichomonaden enthalten sind, oder wenn die zur Spülung benutzte
Flüssigkeit die Ausscheidungen des infizierten Organs zu sehr verdünnt hat.
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Man hat daher, wenn man nicht am Standort des Patienten selbst mikroskopieren
konnte, bei Verdacht aus Trichomonadeninfektion des Rindes die Spülflüssigkeit bisher
auf schnellstem Weg in Laboratorien verbracht, dort zentrifugiert, die überstehende
Flüssigkeit abgegossen und einige Tropfen des Bodensatzes mikroskopiert. Beim Zentrifugieren
reichern sich die Trichomonaden im Bodensatz an und sind dann leichter zu finden.
Oft sind aber auch in der ganzen Menge der zentrifugierten Spülflüssigkeit nur so
wenige Trichomonaden enthalten, daß in dem zur Untersuchung entnommenen Tropfen
des
Bodensatzes, der ja nur ein kleiner Teil desselben ist, gar keine Trichomonaden
enthalten sind. Infolgedessen entgeht immer noch ein erheblicher Teil von Trichomonadenausscheidern
der Erkennung und bleibt eine dauernde Ansteckungsquelle, da beim Geschlechtsakt
die Trichomonaden übertragen werden können.
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Schon frühzeitig hat man Trichomonaden aus infiziertem Untersuchungsmaterial
zu züchten versucht und hoffte sie damit so zur Vermehrung zu bringen, daß sie dann
bei der mikroskopischen Untersuchung des Nährbodens leicht gefunden werden. Als
Nährböden wurden unter anderem benutzt: der Nährboden nach Witte (Pferdeserum und
Bouillon), nach Wagner und H e s s (Hühnereiweiß mit Reisstärke und Trypaflavin
auf erstarrtes Pferdeserum geschichtet) nach S ch o op und O e h 1 k e r s (Reisstärke,Rinderserumund
Salze), und S e d 1 m e i e r (Traubenzuckeragar, Peptonbouillon und Pferdeserum).
Die Versuche, die Trichomonaden auf den bekannten Nährböden zu züchten, gelangen
aber nur, wenn das Ausgangsmaterial nicht mit Bakterien verunreinigt war, oder wenn
nur ganz wenige Bakterien einer für Trichomonaden nicht sehr schädlichen Art darin
enthalten waren. Die gleichzeitige Vermehrung von Bakterien verhindert nämlich in
einem Nährboden immer das Wachstum der Trichomonaden. Da fast nie bakterienfreies
und nur selten bakterienarmes Untersuchungsmaterial zu gewinnen ist, mißlang der
Kulturversuch bislang so häufig, daß er zunächst keinen nennenswerten Fortschritt
für die Diagnose brachte. Die Erfolge besserten sich, als man der Spülflüssigkeit
Penicillin oder Streptomycin zusetzte und damit einen Teil der Bakterien in der
Vermehrung hemmen konnte. Die Spülflüssigkeit hielt sich dann 2.4 Stunden, während
welcher sie in ein Laboratorium verbracht und verarbeitet werden konnte. Dort mußte
sie sofort zentrifugiert und ein Teil des Bodensatzes zum Beimpfen flüssiger Nährböden,
d. h. zum Anlegen einer Kultur, verwendet werden. Als Nährböden benutzte H e s s
Bouillon mit io°/o Pferdeserum und je 5oo I.Einheiten Penicillin auf i ccm Lösung
in drei Röhrchen, welchen je i ccm aoo bzw. 300 bzw. 400 y Streptomycin zugesetzt
wurden. Gleichwohl wurden immer noch bei einem Teil der Kulturen die Trichomonaden
von solchen Bakterien, welche den Penicillin- und Streptomycinzusätzen nicht erlagen,
überwuchert und abgetötet; so daß der Kulturversuch oft als mißlungen angesehen
werden mußte. Das Verfahren fand auch keinen Weg in die breite Praxis, da ihm zu
viele Mängel anhaften. Die mit Penicillin und Streptomycin versetzte Flüssigkeit
ist nur einige Tage haltbar, dann werden die Zusätze wirkungslos. Das Verfahren
verteuerte sich auch dadurch, daß das Penicillin und Streptomycin nur in solchen
Mengen im Handel ist, die den Bedarf einer Kultur um das vielfache übersteigen.
Die mit Penicillin und Streptomycin versetzte Spülflüssigkeit konnte in der Praxis
nicht vorrätig gehalten, sondern mußte von Fall zu Fall erst zubereitet werden.
Besonders störend war, daß die Untersuchungsproben wegen ihrer nur 24 Stunden betragenden
Haltbarkeit durch Boten in ein Laboratorium gebracht werden mußten.
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In letzter Zeit arbeitet man zur Diagnose der Trichomonadeninfektion
beim Bullen nach folgendem Verfahren: Man hielt fertige flüssige Nährböden in Kulturröhrchen
mit Wattestopfen verschlossen, bereit, und setzte erst bei Bedarf die erforderlichen,
vorher gelösten Mengen Penicillin und Streptomycin dem Nährboden zu. Die am Patienten
durch Spülung des infizierten Organs gewonnene trichomonadenhaltige Flüssigkeit
wurde baldigst in einer mitgebrachten Handzentrifuge ausgeschleudert, dann die Kultur
vermittels einer sterilen Pipette mit Teilen des Bodensatzes beimpft, zum Schutz
gegen den schädlichen Luftsauerstoff mit flüssigem Paraffin überschichtet und mit
einem sterilen Wattestopfen verschlossen. Für diese Arbeit konnten nur eigens angelernte
Spezialtierärzte verwendet werden. Für den Transport in das Laboratorium war ein
Bote erforderlich; die Kultur durfte ja nicht geschüttelt werden, weil sich sonst
das Paraffin mit der Kulturflüssigkeit vermischt und der Luftsauerstoff wieder Zutritt
gefunden hätte, und sie durfte vor allem beim Transport nicht durch Umfallen auslaufen
können. Unter diesen, für die breite Praxis allerdings nicht tragbaren Voraussetzungen
gelang die Kultur der Trichomonaden zwar nicht immer, weil die tl)erwucherung der
Kulturen durch Bakterien manchmal nicht verhindert werden konnte, sie glückte aber
doch so oft, daß sie sich der mikroskopischen Untersuchung als wichtige Laboratoriumsmethode
ergänzend zur Seite zu stellen begann. Auch die Kultur der Trichomonaden des Menschen
bereitet heute noch so große Schwierigkeiten, daß sie bei der Diagnose der Trichomonadeninfektion
in der humanmedizinischen Praxis noch keine nennenswerte Rolle spielt.
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Die Lösung des Trichomonadenproblems beim Menschen und die erfolgreiche
Bekämpfung der Trichomonadeninfektion bei Tieren werden erst dann möglich sein,
wenn das Diagnoseverfahren so einfach gemacht wird, daß die Kultur auch ohne Sondergeräte
und unter den Verhältnissen in der Praxis von jedem Arzt oder Tierarzt fertig angelegt
werden kann und mit den landesüblichen Transportmitteln einen Transport von mindestens
2 Tagen verträgt, so daß sie dann im Laboratorium nur bebrütet zu werden braucht,
um die Trichomonadenin,fektion nachweisen zu können. Dabei sollen alle im Untersuchungsmaterial
vorhandenen Trichomonaden restlos auf die Kultur übertragen werden können, damit
das Verfahren auch bei schwächster Infektion mit größtmöglicher Sicherheit arbeitet.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren der vorliegenden Anmeldung ist dies möglich.
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Zur Ausschaltung der obengenannten Schwierigkeiten schlägt das erfindungsgemäße
Verfahren folgende :Maßnahmen vor: i. Es hat sich gezeigt, daß Chloromycetin und
Aureomycin bzw. ihre chemischen Verbindungen
in der Lage sind, in
einer Kultur jene schädlichen Keime in der Vermehrung zu hemmen, die dem Penicillin
und Streptomycin widerstehen und daß die Kulturen dann wesentlich sicherer angehen,
wenn man zu den bisherigen bekannten Hemmungsstoffen auch noch diese beiden oder
wenigstens einen der beiden hinzugibt. Es hat sich gezeigt, daß Penicillin und Streptomycin
dadurch teilweise entbehrlich werden, so daß man ganz ohne sie oder jedenfalls mit
geringeren als den bisher üblichen Mengen auskommt.
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z. Es hat sich ferner gezeigt, daß jeder Arzt oder Tierarzt in seiner
Praxis eine für die Kultur von Trichomonaden geeignete Flüssigkeit selbst herstellen
kann, wenn er die erforderlichen Nährstoffe, Mineralstoffe, keimhemmenden Stoffe,
pilzhemmenden Stoffe, in haltbarer Verpackung und in der fertigen Dosierung so geliefert
bekommt, daß er sie nur noch in Wasser oder in einer isotonischen Lösung aufzulösen
braucht. Diese Stoffe können auch schon in einem Kulturröhrchen geliefert werden,
so daß er nur dieses Röhrchen mit der Spülflüssigkeit zu füllen braucht, um eine
fertige Kulturlösung zu haben.
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3. Es wurde ferner gefunden, daß es nicht erforderlich ist, die Spülflüssigkeit
erst zu zentrifugieren und dann nur mit Teilen des Bodensatzes eine Kultur zu beimpfen;
man kann vielmehr den ganzen Bodensatz im Zentrifugenröhrchen belassen, die Kulturflüssigkeit
darüberschichten und die so erhaltene Kultur im selben Zentrifugenröhrchen bebrüten.
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4. Es hat sich gezeigt, daß man schon mit einer ganzen oder teilweise
fertigen Kulturflüssigkeit das infizierte Organ ausspülen kann und mit der zurückgewonnenen
Spülflüssigkeit ein Kulturröhrchen füllen kann, ohne erst zentrifugieren und den
Bodensatz überimpfen zu müssen. Man braucht nur noch die etwa fehlenden Stoffe der
als Spülmittel benutzten Kulturlösung zuzusetzen.
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5. Es hat sich ferner gezeigt, daß alle für die Herstellung einer
Kulturlösung erforderlichen Stoffe, selbst das Blutserum, für die Praxis in haltbarer
Trockenform bereitgehalten werden können, und daß sie nach Auflösung einen vollwertigen
Nährboden ergeben.
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6. Es hat sich gezeigt, daß Trichomonaden zur Erhaltung und Vermehrung
nicht, wie man bisher annahm, die Bestandteile von Fleischbrühe (Bouillonnährboden)
benötigen, sondern daß schon im zugesetzten Serum genügend Eiweiß und Eiweißabbauprodukte
vorhanden sind, und daß daher die sehr hygroskopische und damit schlecht zu handhabende
Trockenbouillon in einem Trockennährboden nicht enthalten sein muß. Dadurch wird
es möglich, alle für die Kultur von Trichomonaden erforderlichen Stoffe in einem
leicht löslichen, nicht verklumpenden Trockennährboden zu vereinigen.
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7. Es hat sich außerdem gezeigt, daß zur Auflösung des Trockennährbodens
auch Brunnenwasser oder destilliertes Wasser benutzt werden kann, wenn dem Trockennährboden
eine entsprechende Menge Natriumchlorid beigesetzt wird oder die Isotonie durch
erhöhten Gehalt an Zuckern erreicht wird. Damit entfällt für den Arzt oder Tierarzt
in der Praxis die Notwendigkeit, physiologische Kochsalzlösung mit sich zu führen.
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B. Es wurde auch gefunden, daß die mit Trichomonaden beimpfte, aus
Trockensubstanzen hergestellte Kulturflüssigkeit, nicht mit Paraffin überschichtet
werden muß, wenn man das Kulturröhrchen mit einem wasserdichten Verschluß, z. B.
Gummipfropfen, paraffinierter Kork, abdichtet. Ein solcher hält auch den Luftsauerstoff
genügend fern. Solche Kulturföhrchen kann man ohne Schaden schütteln und stürzen,
so daß sie voll transportfähig sind.
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9. Es hat sich ferner gezeigt, daß derart angesetzte Kulturen bei
gewöhnlicher Außentemperatur nicht nur 24 Stunden, sondern 2 Tage und länger gehalten
und transportiert werden können, dann immer noch gut bewegliche Trichomonaden enthalten
und mit gutem Erfolg bebrütet werden können, so daß sie zu einem 2- bis 3tägigem
Postversand geeignet sind. Solche Kulturen ergeben mehr positive Befunde, als die
bisher üblichen mikroskopischen Untersuchungen am Ort des Patienten.
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Das erfindungsgemäße Verfahren hat die bisher zum Anlegen einer Trichomonadenkultur
notwendigen Tätigkeiten: a) Zentrifugieren der Spüllösung, b) Abgießen der überstehenden
Flüssigkeit, c) Auflösen von Penicillin und Streptomycin, d) Dosierung und Zugabe
derselben zum flüssigen Nährboden mittels steriler Pipette oder graduierter Spritze,
e) Beimpfung des Nährbodens mit dem Zentrifugat mittels einer Pipette, f) Überschichten
der Kultur mit flüssigem Paraffin in einen äußerst einfachen Handgriff zusammengelegt,
nämlich das Auffüllen des vorbereiteten Kulturröhrchens mit der Spülflüssigkeit.
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Diese Technik ist nun so einfach, daß sie ohne Anleitung oder Übung
von jedem Arzt oder Tierarzt beherrscht wird und ihn zeitlich nicht in Anspruch
nimmt. Bei der Haltbarkeit aller notwendigen Zusätze kann sie jeder Arzt und Tierarzt
für etwaigen Bedarf in ausreichender Menge bereithalten. Es kann damit das Verfahren
als praxisreif bezeichnet werden. Der Gebrauch des Kulturverfahrens ermöglicht es
aber jedem Arzt oder Tierarzt, der kein Mikroskop oder keine Zentrifuge besitzt
und damit die bisher in der Praxis einzig brauchbare, aber nicht genügend genaue,
dabei aber sehr zeitraubende Methode der sofortigen mikroskopischen Untersuchung
gewonnenen Materials nicht durchführen konnte, durch Einsendung auf dem Postweg
an ein Laboratorium klare Diagnosen zu erhalten. Durch die Einfachheit und schnelle
Handhabung des Verfahrens wird es möglich sein, auch Reihenuntersuchungen durchzuführen.
Schließlich ist es möglich, die beim einzelnen Praktiker eine gewisse Geübtheit
voraussetzende Untersuchung auf Trichomonadeninfektion
einigen,
dafür besonders eingerichteten und erfahrenen Laboratorien zu überlassen. Die durch
die Vermehrung der Trichomonaden in der bebrüteten Kultur erreichte Anreicherung,
macht die Diagnose leichter als bisher. Es wird auch bei Reihenuntersuchungen das
Untersuchungspersonal wesentlich weniger ermüdet. Anwendungsbeispiele i. Aus der
Scheide einer Frau, bei welcher ermittelt werden soll, ob an ihrem krankhaften Scheidenausfluß
Trichomonaden beteiligt sind, wird etwas Scheidenschleim aus der Tiefe entnommen.
i ccm des Ausflusses werden mit 5 ccm abgekochter physiologischer Kochsalzlösung
in dem mit allen erforderlichen Zusätzen versehenen Kulturröhrchen unter kräftigem
Schütteln bis zur Lösung der Zusätze aufgeschwemmt. Das Kulturröhrchen wird mit
seinem Stopfen verschlossen, beschriftet und mit Begleitschreiben per Post an ein
bakteriologisches Laboratorium geschickt. Dort wird es 48 Stunden bei Körperwärme
bebrütet. In dieser Zeit bildet sich am Grunde des Röhrchens ein Bodensatz, der
mit einer Pipette aufgesogen und unter dem Mikroskop auf Trichomonaden untersucht
wird. Sie sind darin so zahlreich enthalten, daß sie leicht gefunden. werden können.
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z. Bei einem Bullen, der auf Trichomonadeninfektion untersucht werden
soll, werden die Haare an der Vorhautöffnung abgeschoren und diese selbst mit Wasser
und Seife gereinigt. In den Vorhautsack werden vermittels einer Ballonspritze
30 ccm physiologische Kochsalzlösung eingespritzt und dort durch Massage
mit der Hand verteilt. Mit der Ballonspritze wird die Flüssigkeit zurückgesaugt.
5 ccm der Flüssigkeit werden in ein Kulturröhrchen in dem sich die erforderlichen
Zusätze befinden, gegeben, verschlossen, beschriftet und mit der Post an ein Laboratorium
versandt. Dort kann, wenn die Diagnose eilt, das Röhrchen zentrifugiert und eine
kleine Probe des Bodensatzes unter dem Mikroskop sofort untersucht werden. Fällt
diese Vorprobe negativ aus, so wird das Kulturröhrchen mit dem Rest 48 Stunden bei
Körpertemperatur bebrütet und dann erneut untersucht. Wenn auch nur einige wenige
Trichomonaden im Ausgangsmaterial vorhanden waren, so sind sie jetzt zahlreich,
und leicht zu finden.
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3. Bei einem Bullen, der auf Trichomonadeninfektion untersucht werden
soll, wird die Vorhautöffnung wie oben behandelt, dann mit einer Ballonspritze
30 ccm Kochsalzlösung wie oben eingespritzt und zurückgesaugt. Mit der rückgewonnenen
Spülflüssigkeit wird ein Kulturröhrchen mit den erforderlichen Zusätzen zu 2/3 seiner
Höhe (Füllmarke bei 5 ccm) gefüllt und wie unter in ein Laboratorium zur Untersuchung
gesandt. 1lit dem Rest werden zwei Zentrifugenröhrchen gefüllt und zentrifugiert.
Der Bodensatz des einen kann dann, wie es bisher üblich war, sofort mikroskopisch
auf Trichomonaden untersucht werden. Das andere Zentrifugenröhrchen wird abgegossen
und auf den Bodensatz io ccm Kulturflüssigkeit, hergestellt durch Auflösung des
Inhalts einer Gel atinekapsel in welcher die für io ccm Nährlösung erforderlichen
Zusätze in Trockenform enthalten sind, übergossen. Das Zentrifugenröhrchen wird
verkorkt, beschriftet und mit dem zuerst angesetzten an ein Laboratorium versandt.
Dort kann ein Röhrchen zur Vorprobe benutzt, das andere zur Bebrütung gebracht werden.
Ebenso gut kann aber auch im zweiten Zentrifugenröhrchen nur der Inhalt einer solchen
Gelatinekapsel durch Schütteln gelöst werden.
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4. Bei einem Bullen, der auf Trichomonadeninfektion untersucht werden
soll, wird nach Vorbereitung der Vorhautöffnung mit einer Ballonspritze -o ccm aus
Trockensubstanz hergestellte Kulturflüssigkeit eingespritzt. Diese Lösung wird im
Vorhautsack des Bullen durch Massage verteilt. Mit der Ballonspritze wird davon
etwa die Hälfte wieder zurückgesaugt, die andere im Vorhautsack zur dortigen Anreicherung
von Trichomonaden belassen. Mit der zurückgesaugten Flüssigkeit werden zwei Kulturröhrchen,
welche die erforderlichen Zusätze enthalten, bis zur Füllmarke aufgefüllt, verkorkt,
beschriftet und an ein Laboratorium übersandt. Dort wird ein Röhrchen sofort bebrütet,
das andere wieder zur Vorprobe benutzt. Nach 48 Stunden kann die bebrütete Kultur
geprüft werden. Beim Bullen wird nach a Tagen Sekret aus dem Vorhautsack, z. B.
vermittels eines Pinselkatheters, entnommen und unter dem Mikroskop auf Trichomonaden
untersucht. Fällt auch diese Probe negativ aus, oder fehlt dem Praktiker ein Mikroskop,
so beschickt er ein mit allen Zusätzen versehenes Kulturröhrchen mit 5 ccm physiologischer
Kochsalzlösung, entnimmt gegebenenfalls erneut mit dem Pinselkatheter eine Sekretprobe,
schneidet mit der Schere die Haare des Pinsels so ab, daß sie in das gefüllte Kulturröhrchen
fallen. Dieses verschickt er an ein Laboratorium, welches nun auch das Ergebnis
der Provokationsuntersuchung ermitteln kann. Auf diese `''eise wird auch bei einem
Bullen, der erst frisch infiziert oder vorbehandelt ist, und der besonders arm an
Trichomonaden ist, die Infektion erkannt (Provokationsmethode).
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5. Bei einer Kuh, die auf Trichomonadeninfektion untersucht werden
soll, wird mit einem Tupferkatheter Scheidenschleim entnommen. Der Tupfer wird in
ein Kulturröhrchen geworfen, in welchem sich die erforderlichen Zusätze, darunter
o,o45 g Natriumchlorid zur Herstellung der Isotonie befinden und die mit 5 ccm abgekochtem
Brunnenwasser gelöst worden waren. Das Röhrchen wird zur Bebrütung und Weiterbehandlung
an ein Laboratorium gesandt.